KR20240010693A

KR20240010693A - mRNA 백신 및 치료제의 제조를 위한 변형된 RNA

Info

Publication number: KR20240010693A
Application number: KR1020230085334A
Authority: KR
Inventors: 홍선우; 김경미; 강영규; 이재진
Original assignee: 엠큐렉스 주식회사
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2023-06-30
Publication date: 2024-01-24

Abstract

본 출원은 mRNA 백신 및 치료제의 제조를 위한 변형된 RNA에 관한 것으로서, 일 양상에 따른 변형 RNA는 특정 화학적 변형과 유전적 변형을 포함함에 따라, RNA의 투여로 인해 야기되는 선천성 면역 반응의 유도를 현격하게 낮출 수 있을 뿐만 아니라, 우수한 단백질 발현 또는 번역 효율을 나타낸 바, 치료제 및 백신 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

mRNA 백신 및 치료제의 제조를 위한 변형된 RNA {Modified RNA for preparing mRNA vaccines and therapeutics}

본 출원은 mRNA 백신 및 치료제의 제조를 위한 변형된 RNA에 관한 것이다.

최근 핵산 기반의 치료제 및 백신의 중요성이 대두되고 있는 가운데, DNA 기반 유전자 치료제 및 백신과는 대조적으로, mRNA는 핵으로 수송될 필요 없이 세포질에서 단백질로 직접 번역이 되므로, 잠재적인 삽입 돌연변이 유발의 위험을 피할 수 있어 더 안전할 뿐만 아니라, 대량 생산이 용이하다는 장점이 있고, 최근 감염성 질환으로 인한 팬데믹 상황에서 이러한 장점이 더 부각됨에 따라 mRNA 제재는 향후 치료제 및 백신 플랫폼으로 널리 활용될 것이 기대되고 있다.

한편, 이러한 mRNA 기반 치료제 및 백신은 자연적인 mRNA 구조를 모방하여 제작된 인공적인 mRNA 분자를 유효성분으로 포함하며, 상기 mRNA 분자에 암호화된 단백질을 체내에서 발현시켜　개체의 면역 계통의　후천성 면역을 강화하거나, 특정 질환의 완화, 예방, 치료 등에 있어 유익하거나 필요한 작용에 기여하는 것을 주요 목표로 한다. 다만, 이러한 mRNA 제제는 RNA 분자의 불안정성으로 인해 세포질로의 전달을 위한 기술적 요소가 필수적으로 필요하다는 점, 세포질로 RNA 분자가 전달된 후, 과다한 선천성 면역반응으로 인한 RNA 분자의 손상 또는 번역 효율 저하를 최소화하여야 한다는 점 등이 그 한계점으로 지적되어 왔으며, 목적하는 단백질의 번역 효율이 높으면서도 선천성 면역반응은 최소화할 수 있는 mRNA 서열 및 화학적 변형을 확보하는 것이 mRNA 신약 개발에 있어 중요한 요소로 대두되고 있다.

이러한 기술적 배경 하에서, 의약적으로 사용되는 mRNA 분자의 효용성을 향상시키기 위한 다각적인 연구가 진행되고 있으나 (PCT 공개특허 WO2012075040A2), 아직은 미비한 실정이다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 RNA 백신 또는 치료제의 유효 성분으로 사용될 수 있는 변형 RNA를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변형 RNA를 유효성분으로 포함하는 약학적 또는 면역원성 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나 이상의 단백질을 암호화하는 변형 RNA를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 변형 RNA의 뉴클레오티드 배열을 조작하는 단계를 포함하는, 변형 RNA가 암호화하는 적어도 하나 이상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적어도 하나 이상의 단백질을 암호화하는 변형 RNA로, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위(5'-untranslated region: 5'-UTR)의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위(3'-untranslated region: 3'-UTR)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 우리딘(U)에 대신하여, N1-에틸-슈도우리딘(N1-ethyl-pseudouridine: Et1Ψ) 또는 N1-프로필-슈도우리딘(N1-propyl-pseudouridine: Pro1Ψ)을 포함하며, 상기 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열은 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열(alignment)의 코돈(codon)을 포함하지 않는 것인, 변형 RNA를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 변형 RNA를 유효 성분으로 포함하는 약학적 또는 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나 이상의 단백질을 암호화하는 변형 RNA를 제조하는 방법으로, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계는, 상기 단백질을 암호화하는 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, 상기 뉴클레오티드 서열 내 우리딘을 N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘으로 치환하고, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 뉴클레오티드의 배열을 조작하여, 변형 RNA를 수득하는 단계를 포함하는, 변형 RNA를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 변형 RNA의 뉴클레오티드 배열을 조작하는 단계를 포함하는, 변형 RNA가 암호화하는 적어도 하나 이상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 우리딘에 대신하여, N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘을 포함하며, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 배열을 조작하는 단계는 상기 단백질을 암호화하는 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계를 포함하는, 단백질의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

일 양상에 따른 변형 RNA는 특정 화학적 변형과 유전적 변형을 포함함에 따라, RNA의 투여로 인해 야기되는 선천성 면역 반응의 유도를 현격하게 낮출 수 있을 뿐만 아니라, 우수한 단백질 발현 또는 번역 효율을 나타낸 바, 치료제 및 백신 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 5' 캡, 5' -비번역 부위, 오픈 리딩 프레임, 3' -비번역 부위, 및 폴리A 테일을 포함하는 일 실시예에 따른 mRNA의 구조를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 mRNA (SCoV2 S 01_Et1Ψ)를 BALB/c 마우스에 정맥 내 주사한 후, 상기 마우스의 혈청 내 IFN-α, MCP-1, CXCL10, 및 MIP-1β의 수준을 정량화한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 mRNA (SCoV2 S 01_Et1Ψ)를 BALB/c 마우스에 정맥 내 주사한 후, 상기 마우스의 혈청 내 IFN-γ, IL-6, MIP-1α, 및 TNF-α의 수준을 정량화한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 mRNA (hEPO 01_Et1Ψ)를 BALB/c 마우스에 피하 주사한 후, 상기 마우스의 혈청 내 IFN-α, MCP-1, CXCL10, 및 IL-6의 수준을 정량화한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 mRNA (SCoV2 S 02_Et1Ψ, SCoV2 S 03_Et1Ψ, 또는 SCoV2 S 05_Et1Ψ)를 HeLa 세포에 형질주입한 후, SCoV2 S 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 mRNA (Fluc 02_Et1Ψ)를 HEK293 세포에 형질주입한 후, Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (SCoV2 S 01_Et1Ψ, SCoV2 S 06_Et1Ψ, 또는 SCoV2 S 07_Et1Ψ)를 HeLa 세포에 형질주입한 후, SCoV2 S 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (SCoV2 S 01_Et1Ψ, 또는 SCoV2 S 04_Et1Ψ)를 HeLa 세포에 형질주입한 후, SCoV2 S 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 01_Et1Ψ, Fluc 03_Et1Ψ 또는 Fluc 04_Et1Ψ)를 HeLa 세포에 형질주입한 후, Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 01_Et1Ψ, Fluc 03_Et1Ψ 또는 Fluc 04_Et1Ψ)를 HEK293T 세포에 형질주입한 후, Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 01_Et1Ψ)를 HeLa 세포에 형질주입한 후, Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 12는 일 실시예에 따른 Pro1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (SCoV2 S 01_Pro1Ψ, SCoV2 S 06_Pro1Ψ, 또는 SCoV2 S 07_Pro1Ψ)를 HeLa 세포에 형질주입한 후, SCoV2 S 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 13은 일 실시예에 따른 Pro1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 01_Pro1Ψ, Fluc 03_Pro1Ψ 또는 Fluc 04_Pro1Ψ)를 HeLa 세포에 형질주입한 후, Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 14는 일 실시예에 따른 Pro1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 01_Pro1Ψ, Fluc 03_Pro1Ψ 또는 Fluc 04_Pro1Ψ)를 HEK293T 세포에 형질주입한 후, Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 15는 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 05_Et1Ψ)를 BALB/c 마우스에 정맥 내 주사한 후, 6 시간 째에 IVIS Spectrum In Vivo Imaging System 을 이용하여 살아있는 동물의 bioluminescence signal을 촬영한 결과이다.
도 16은 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 01_Et1Ψ)의 효능을 기존의 화학적 변형 (m1Ψ)이 도입된 mRNA와 비교한 것으로서, 형질주입된 각각의 THP-1 세포 내 Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화한 결과이다.
도 17은 일 실시예에 따른 Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA (Fluc 01_Et1Ψ)의 효능을 기존의 화학적 변형 (m1Ψ)이 도입된 mRNA와 비교한 것으로서, 형질주입된 각각의 THP-1 세포로부터 산출한 상대적인 IRF 활성도를 나타낸 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 양상은 적어도 하나 이상의 단백질을 암호화하는 변형 RNA로서, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위(5'-untranslated region: 5'-UTR)의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위(3'-untranslated region: 3'-UTR)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 우리딘(U)에 대신하여, N1-에틸-슈도우리딘(N1-ethyl-pseudouridine: Et1Ψ) 또는 N1-프로필-슈도우리딘(N1-propyl-pseudouridine: Pro1Ψ)을 포함하며, 상기 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열은 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열(alignment)의 코돈(codon)을 포함하지 않는 것인, 변형 RNA를 제공하는 것이다.

본 명세서에서 용어, "RNA"는 복수의 뉴클레오티드 단위체를 포함하는 고분자 물질로서, 구체적으로, 복수의 뉴클레오티드 단위체가 당/포스페이트 기본 골격의 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 연결되어 있는 폴리머를 지칭한다. 상기 RNA는 용어, "리보핵산", "리보핵산 분자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 RNA는 생명체에 필수적인 생체 고분자로서, 고유의 염기 서열을 통해 유전적 정보를 코딩할 수 있으며, 예를 들어, mRNA(messenger RNA)일 수 있다.

본 명세서에서 용어, “변형 RNA(modified RNA)”는 목적하는 단백질을 발현할 수 있는 임의의 후보 RNA 서열을 대상으로 목적 단백질의 발현을 향상시키거나, 선천성 면역 반응의 유도 수준을 감소시키는 등 후보 RNA 서열의 적어도 하나의 특성을 향상시키기 위한 인위적인 변형이 도입된 RNA를 지칭할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 인위적인 변형은 뉴클레오티드를 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 치환하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "mRNA (Messenger RNA)"는 DNA 주형으로부터 전사되고, DNA의 유전 정보를 세포질 안의 리보솜으로 전달하는 RNA를 지칭한다. 진핵 유기체에서의 전사 과정은 세포의 핵 내에서 진행되며, 미성숙 RNA (Premature RNA)를 가공하는 과정을 포함한다. 구체적으로, 이러한 과정을 전사 후 변형(Post-transcriptional modification)이라 일컬으며, 스플라이싱 (Splicing), 5'-캡핑 (Capping), 폴리아데닐레이션(Polyadenylation), 핵 또는 미토콘드리아로부터 유출 (Export) 등의 과정을 포함한다. 이러한 과정이 진행된 결과, 특정 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 성숙 mRNA (Mature mRNA)를 생성한다. 일반적으로, 상기 성숙 mRNA는 선택적으로, 5'-캡, 5'-UTR, 오픈 리딩 프레임, 3'-UTR, 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다. 상기 mRNA는 여러 가지 공지의 방법 중 임의의 것을 따라 합성될 수 있고, 예를 들어, 상기 mRNA는 시험관 내 전사(in vitro transcription; IVT)를 통해 합성될 수 있다. 상기 시험관 내 전사는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNase I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNase 억제제를 사용하여 수행될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "오픈 리딩 프레임 (Open reading frame, ORF)"은 일반적으로 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드 트리플렛 (triplets)의 서열, 즉, 발현시키고자 하는 목적 단백질을 암호화하는 여러 뉴클레오티드 트리플렛의 서열일 수 있으며, 용어, "단백질 코딩 영역"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 오픈 리딩 프레임은 이의 5' 말단으로부터 시작되는 후속 영역 (subsequent region)에 바람직하게 시작 코돈, 즉, 아미노산 메티오닌을 코딩하는 3개의 뉴클레오티드 서열의 조합 (ATG 또는 AUG)을 포함하며, 3' 말단 방향의 영역에 바람직하게 번역의 종결을 지시하는 정지 코돈 (예를 들어, TAA, TAG, TGA, 또는 UAA, UAG, UGA)을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 오픈 리딩 프레임은 RNA 백신 및 치료제 조성물의 유효성분인 항원성 단백질(antigenic protein)이나 치료용 단백질(therapeutic protein)로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드 트리플렛의 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "암호화된 단백질(encoded protein)"은 해당 RNA에 암호화된 단백질을 지칭하는 것으로, 상기 암호화된 단백질은 백신 또는 치료제 등 그 목적에 따라 항원성 단백질(antigenic protein) 또는 치료용 단백질(therapeutic protein)일 수 있으며, 용어 "RNA-암호화된 단백질(RNA-encoded protein) 또는 "목적 단백질(protein of interest)"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "5'-비번역 부위 (5'-Untranslated region)"는 상기 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치하는 영역, 구체적으로, 개시 코돈으로부터 상류에 있는 mRNA 영역을 지칭하는 것으로, 상기 5'-비번역 부위는 상기 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 5'-비번역 부위는 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소를 포함할 수 있으며, 이를 위하여, 상기 5'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열은 안정한 mRNA 분자 (예컨대, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤, 또는 시트르산 회로 효소)로부터 유래될 수 있다. 일례로서, 5'-비번역 부위 서열은 CMV 극초기(immediate-early) 1(IE1) 유전자의 부분 서열, 또는 이의 단편을 포함하여, 뉴클레아제 내성을 개선시키고/시키거나 폴리뉴클레오티드의 반감기를 개선시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어, "3'-비번역 부위 (3'-Untranslated region: 3'-UTR)"는 상기 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 위치하는 영역, 구체적으로, 정지 코돈으로부터 하류에 있는 mRNA 영역을 지칭하는 것으로, 상기 3'-비번역 부위는 상기 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 3'-비번역 부위는 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위 중 하나 이상, 또는 mRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있으며, 전술한 5'-비번역 부위와 동일한 방식을 채용하여 3'-비번역 부위 서열을 설계할 수 있다. 일례로서, 3'-비번역 부위 서열은 인간 성장 호르몬(hGH)을 코딩하는 서열 또는 이의 단편의 서열을 포함하여, 폴리뉴클레오티드의 안정성 및/또는 약동학적 성질 (예컨대, 반감기)을 개선시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 하나의 기능이 다른 것에 의하여 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 뉴클레오티드 서열들이 연결된 것을 나타낼 수 있다.

본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드 서열의 위치와 관련하여 달리 언급이 없으면, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로 연결되거나 위치하는 것을 나타낸다.

본 발명의 목적은 RNA 백신 또는 치료제의 유효 성분으로 사용될 수 있는 변형 RNA를 제공하기 위한 것으로, 이를 위해서는 ⅰ) 목적하는 단백질을 코딩하는 자연적인 mRNA의 구조를 성공적으로 모사하여 체내 세포의 번역 시스템을 활성화시킬 수 있되, 번역 효율을 극대화시킬 수 있어야 하며, 이와 함께, ⅱ) 투여되는 RNA로부터 야기되는 선천성 면역 반응이 과다하게 유도되지 않도록 조절하여야 한다. 이에, 본 발명에서는 우리딘이 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 치환되고, 목적 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임 뉴클레오티드 서열에서 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 조작된, 변형 RNA를 제작하였으며, 이러한 기술적 구성을 통해 종래의 기술적 문제점을 해결하고자 하였다.

일 구체예에서, 상기 변형 RNA는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 변형 RNA는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 포함되지 않은 RNA에 비해, 선천성 면역 반응의 유도 수준이 낮은 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 변형 우리딘(modified uridine)일 수 있으며, 상기 변형 우리딘은 슈도우리딘(pseudouridine), 예를 들어, N1-에틸-슈도우리딘(N1-ethyl-pseudouridine) 또는 N1-프로필-슈도우리딘(N1-propyl-pseudouridine: Pro1Ψ)일 수 있다. 일 양상에 따른 상기 변형 RNA는 적어도 하나의 변형 우리딘을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열에 포함된 전체 우리딘을 기준으로 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 우리딘이 N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘으로 치환된 것일 수 있고, 바람직하게는, 100%의 우리딘이 N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘으로 치환된 것일 수 있다. 따라서, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열에 포함된 우리딘은 모두 변형 우리딘, 예를 들어, N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘일 수 있다.

하기 표에 제시된 바와 같이, 본원 명세서에서 Et1Ψ은 N1-에틸-슈도우리딘, Pro1Ψ은 N1-프로필-슈도우리딘으로 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 변형 RNA는 전술한 변형 우리딘을 포함하지 않은 RNA에 비해 선천성 면역 반응의 유도 수준이 낮은 것일 수 있다. 낮은 수준의 선천성 면역 반응 유도는 세포질 내 번역 효율을 증가시키는데 기여할 수 있으며, 궁극적으로는 유효한 수준의 후천성 면역 반응을 자극하는데 기여할 수 있다. 또한, 상기 선천성 면역 반응은 전술한 변형 우리딘이 포함되지 않은 RNA에 비해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상 감소하는 것을 지칭할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변형 RNA는 전술한 변형 우리딘을 포함하지 않은 RNA에 비해 낮은 수준의 IRF 활성도를 갖는 것일 수 있다. 상기 IRF 활성도는 전술한 변형 우리딘이 포함되지 않은 RNA에 비해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상 감소하는 것을 지칭할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, N1-에틸-슈도우리딘)의 도입은 낮은 수준의 선청성 면역 반응을 유도함과 동시에, 암호화된 단백질 또는 목적 단백질의 발현을 감소시킬 우려가 있다. 따라서, 상기의 화학적 변형과 함께, 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전적 변형, 예를 들어, 특정 코돈의 배열을 조작/변경함으로써, 선천성 면역 반응 감소 및 유효한 수준의 단백질 발현을 유도할 수 있다. 여기서, 상기의 코돈의 배열에 대한 조작/변경은 상기 목적하는 단백질의 아미노산 서열이 동일하게 유지되는 범위에서 수행되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변형 RNA는 전술한 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하는 RNA에 비해 암호화된 단백질의 발현 수준이 높은 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드가 치환된 것일 수 있으며, 예를 들어, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 배열을 조작하는 것일 수 있다. 또한, 상기 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열은 단백질의 아미노산 서열 중 페닐알라닌을 암호화하는 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 Et1Ψ-Et1Ψ-C 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-C 배열의 코돈으로 치환하는 것일 수 있고, 예를 들어, 단백질의 아미노산 서열 중 페닐알라닌은 모두 Et1Ψ-Et1Ψ-C 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-C 배열의 코돈으로만 암호화된 것일 수 있다. 상기 단백질 발현은 전술한 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하는 RNA에 비해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상 증가하는 것을 지칭할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 변형 RNA는 상기와 같은 화학적 변형 및 유전적 변형 외에도 암호화하는 단백질의 발현을 증가시키기 위한 적어도 하나의 변형을 더 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나의 변형은 우리딘 (U) 함량의 감소를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변형 RNA는 상기 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 5'캡을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "5'캡 (5'Cap)"은 RNA의 안정성 및 발현 효율에 영향을 미치는 5'말단 영역에 위치하는 구조물로서, 일반적으로 변형된 뉴클레오티드, 특히 구아닌 뉴클레오티드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 5'캡은 m⁷Gppp, Gppp, m⁷(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m⁷(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, G(5')ppp(5')G, m⁷G(5')ppp(5')G, 3´-O-Me-m⁷G(5')ppp(5')G, m⁷G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m⁷G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, 또는 m⁷G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU 중 어느 하나일 수 있으나, 상기와 동일한 기능성을 갖는 공지의 5'캡이 비제한적으로 적용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변형 RNA는 3'-UTR에 작동 가능하게 연결된 폴리A 테일 (PolyA tail)를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "폴리A 테일 (PolyA tail)"은 Exoribonuclease의 분해 과정을 지연시키고, RNA의 안정성과 생체 내 반감기를 연장시켜 발현 효율에 영향을 미치는 3'말단 영역에 위치하는 구조물로서, 일반적으로 복수 개의 아데닌 뉴클레오티드 서열에 의해 형성될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 폴리A 테일은 20 내지 200개의 아데닌으로 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 20 내지 190개, 20 내지 170개, 20 내지 150개, 20 내지 130개, 20 내지 110개, 20 내지 90개, 20 내지 70개, 20 내지 50개, 20 내지 30개, 30 내지 190개, 30 내지 170개, 30 내지 150개, 30 내지 130개, 30 내지 110개, 30 내지 90개, 30 내지 70개, 또는 30 내지 50개의 반복적인 아데닌 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

일 실시예에 따른 변형 RNA 또는 유전적 작제물은 낮은 수준의 선천성 면역 반응 유도와 함게, 암호화하는 단백질을 높은 수준으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 변형 RNA는 목적하는 질환에 대한 RNA 백신 조성물 또는 RNA 치료용 조성물 등의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

다른 양상은 상기 변형 RNA를 유효성분으로 포함하는, 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물에 언급된 용어 또는 요소 중 상기 변형 RNA에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다.

일 구체예에 있어서, 상기 변형 RNA에 의해 암호화된 단백질은 치료용 단백질(therapeutic protein)일 수 있으며, 이 경우 상기 조성물은 약학적 조성물, 구체적으로, 암호화된 단백질의 발현과 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물일 수 있다. 상기 암호화된 단백질의 발현과 연관된 질환은 해당 단백질의 결핍 또는 부족으로 인한 질환이거나, 해당 단백질의 발현이 특정 질병의 완화 또는 치유에 있어 유익하거나 필요한 작용에 기여할 수 있는 질환 등 그러한 단백질의 발현을 필요로 하는 질환을 모두 포함하는 것일 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 변형 RNA에 의해 암호화된 단백질은 항원성 단백질(antigenic protein)일 수 있으며, 이 경우 상기 조성물은 면역원성 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "면역원성 조성물"은 특정 병원체 또는 질환에 대하여 대상체에서 특정한 정도의 면역성을 유도하는 데 효과적인 활성 성분, 또는 이의 유효량을 함유하는 물질을 지칭하며, 용어, "백신", "백신 제제", "백신 조성물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 면역원성 조성물은 질환 또는 병원체에 의한 감염과 연관된 증상의 중증도, 지속 시간 또는 다른 징후의 저하를 유도하는 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역원성 조성물은 목적하는 항원 단백질에 대한 후천성 면역 반응을 자극하기 위한 것 또는 목적하는 항원 단백질을 갖는 병원체의 침투로 발병되는 감염성 질환을 예방하기 위한 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "면역원"은 면역 반응을 자극할 수 있는 물질을 지칭하며, 통상적으로 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질일 수 있다. 상기 면역원은 전술한 변형 RNA에 대한 번역의 산물을 지칭하며, 후천적 면역 반응을 자극하는 물질일 수 있다.

상기 약학적 또는 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 염, 계면활성제, 저온보호물질 등을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 투여되는 특정 조성물에 따라 부분적으로 결정될 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 따라 부분적으로 결정될 수 있다. 따라서, 상기 약학적 또는 면역원성 조성물의 적합한 제형이 매우 다양하며, 예를 들어, 상기 약학적 또는 면역원성 조성물은 비경구(즉, 근육내, 피내, 또는 피하) 투여 또는 비인두 (즉, 비강내) 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일반적으로, 비경구 투여용 제형은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 올레산에틸과 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 비롯하여 물, 알코올/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구용 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스 (Ringer's dextrose), 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유를 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가물은 또한 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스 등으로 존재할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "유효성분"은 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 유효량의 성분을 의미한다. 구체적으로는, 유효량의 제제, 활성제, 또는 핵산 분자를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "유효량"은 특정 병원체 또는 질환에 감염될 확률 또는 감염의 심각성을 상당히 감소시킬 수 있을 정도의 항체를 유발하는데 필요한 투여량이거나, 치료제로서 특정 질환의 완화 또는 치료에 유익하거나 필요한 작용을 유도할 수 있는 투여량을 의미할 수 있다.

일 실시예에 따른 변형 RNA는 약물 전달체 시스템 (Drug Delivery System: DDS)으로 제형화된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 변형 RNA에 대한 약물 전달 시스템으로는 당업계 공지의 지질 성분을 사용한, 지질 나노입자 (Lipid nanoparticle, LNP)로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 제형화에 사용되는 지질로는 MC3, Lipid 319, C12-200, 5A2-SC8, 306Oi10, Moderna Lipid 5, Acuitas A9, SM-102, ALC-0315, Arcturus Lipid 2,2 (8,8) 4C CH3, Genevant CL1, 폴리라이신, 폴리오르니틴, 및/또는 폴리아르기닌과 같은 양이온성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1,2 디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(DSPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 콜레스테롤과 같은 스테롤 또는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 같은 비양이온성 리피드를 포함하는 지질 나노입자로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000(PEG2000-DMG), 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide(ALC-0159), polyethylene glycol dimethacrylate(PEG-DMA)와 같은 PEG-리피드를 포함하는 지질 나노입자로 제형화될 수 있다. 또한 상기 지질 나노입자는 양이온성 지질, 인지질, 콜레스테롤과 같은 스테롤, PEG-지질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 지질 나노 입자는 PEG-변형된 리피드, 비양이온성 리피드, 스테롤, 및 이온화 가능한 리피드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

다른 양상은 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나 이상의 단백질을 암호화하는 변형 RNA를 제조하는 방법으로서, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열은, 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계는, 상기 단백질을 암호화하는 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, 상기 뉴클레오티드 서열 내 우리딘을 N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘으로 치환하고, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 뉴클레오티드의 배열을 조작하여, 변형 RNA를 수득하는 단계를 포함하는, 변형 RNA를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 변형 RNA를 제조하는 방법에 포함된 기술적 구성은 앞서 설명한 발명에 포함되는 구성과 동일하므로, 전술한 설명에서 언급된 사항은 본 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "제1 RNA"는 변형 RNA를 제조하기 위한 참조 서열 (reference sequenece) 또는 대조 프로파일(control profile)로서, 목적 단백질을 암호화하는 mRNA 서열 또는 오픈 프레임 서열을 지칭하며, 천연적으로 존재하는 야생형 RNA 또는 비천연적으로 발생된 RNA가 모두 포함될 수 있다. 상기 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나 이상의 U-U-U, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ, 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하는 것일 수 있으며, 단백질 또는 펩타이드의 종류에 따라 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 수득할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 제1 RNA 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열과 동일한 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계는 페닐알라닌을 암호화하는 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 Et1Ψ-Et1Ψ-C 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-C 배열의 코돈으로 치환하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계는 상기 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, 오픈 리딩 프레임 내 U-U-U 배열의 코돈을 U-U-C 배열의 코돈으로 치환시켜 변형 RNA의 배열을 설계하는 단계일 수 있으며, 상기 설계하는 단계는 당업계 공지의 서열 정렬 프로그램 또는 데이터베이스 시스템을 포함하는 컴퓨터 상에서 수행되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계는, 상기 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, 오픈 리딩 프레임 내 U-U-U 배열의 코돈을 U-U-C 배열의 코돈으로 치환시켜 변형 RNA의 배열을 설계(Designing)하는 단계; 상기 변형 RNA의 배열을 기초로 이에 상보적인 서열을 갖는 cDNA(Complementary DNA)를 합성하는 단계; 상기 cDNA가 삽입된 선형의 DNA 플라스미드를 수득하는 단계; 상기 수득된 선형의 DNA 플라스미드를 주형으로 하여 시험관 내 전사(in vitro transcription; IVT)를 수행하는 단계;를 포함하고, 상기 시험관 내 전사는 N1-에틸-슈도우리딘 3인산 또는 N1-프로필-슈도우리딘 3인산, 아데노신 3인산 (ATP), 사이티딘 3인산 (CTP), 및 구아노신 3인산 (GTP)을 첨가하여 수행하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "플라스미드"는 적합한 숙주 세포 내에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 양상에 따른 플라스미드는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 선형화된 플라스미드일 수 있으며, 상기 선형화된 플라스미드는 제한 효소가 인식 부위에서 플라스미드 DNA를 절단하고, 플라스미드 구조를 파괴하는 적합한 조건 하에서, 플라스미드 DNA를 제한 효소와 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 또한, 상기 플라스미드에서 플라스미드의 종류, 제한효소 인식 부위 등의 요소는 당업계의 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다.

본 명세서에서 용어, “시험관 내 전사 (in vitro transcription; IVT)”는 목적 mRNA 분자가 무세포 시스템(시험관 내)에서 합성되는 과정으로서, 바람직하게, 플라스미드를 구성하는 DNA가 mRNA 전사체 생성을 위한 주형으로 사용될 수 있고, RNA 중합 효소는 시험관 내 전사 과정을 제어하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 시험관내 RNA 전사에서 RNA를 위한 DNA 주형은 시험관내 전사되는 각각의 RNA에 상응하는 특정 cDNA의 클로닝 및 이를 RNA 시험관내 전사를 위한 적합한 벡터, 예를 들어, 플라스미드에 도입함으로써 수득될 수 있다.

다른 양상은 변형 RNA의 뉴클레오티드 배열을 조작하는 단계를 포함하는, 변형 RNA가 암호화하는 적어도 하나 이상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열은, 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 우리딘에 대신하여, N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘을 포함하며,

상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 배열을 조작하는 단계는, 상기 단백질을 암호화하는 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계를 포함하는, 단백질의 발현을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암호화된 단백질 발현과 연관된 질환을 예방 또는 치료하는 방법; 및 암호화된 단백질의 발현과 연관된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 상기 변형 RNA의 의약적 용도를 제공하는 것이다.

상기 개체에서 암호화된 단백질 발현과 연관된 질환을 예방 또는 치료하는 방법 및 상기 변형 RNA의 의약적 용도에 언급된 용어 또는 요소 중 상기 변형 RNA에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다.

본 명세서에서 용어, "개체"는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 원숭이, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 목적하는 단백질의 발현을 필요로 하거나, 목적하는 단백질의 발현에 따른 특정 반응의 유도, 예를 들어, 후천성 면역 반응 자극 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.

용어 "투여하는"은 일 구체예에 따른 RNA 분자의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 RNA 분자의 배치를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "예방 (prevention)"은 질환의 발생을 미리 차단하거나, 질환을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 예를 들어, 질환 또는 이의 특징적인 특성의 발생을 막거나, 발생을 방해하거나, 질환 또는 이의 특징적인 특성의 발생으로부터 방어 또는 보호하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 용어, "치료 (treatment)"는 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 예를 들어, 질환 또는 이의 특징적인 특성을 감소 또는 개선하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 면역반응을 자극하는 방법 또는 감염성 질환을 예방하는 방법; 및 면역 반응을 자극하기 위한 백신의 제조를 위한 상기 변형 RNA의 의약적 용도를 제공하는 것이다.

상기 개체에서 면역반응을 자극하는 방법 또는 감염성 질환을 예방하는 방법 및 상기 변형 RNA의 의약적 용도에 언급된 용어 또는 요소 중 상기 변형 RNA에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다.

상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계는 백신 접종을 지칭하는 것으로서, 상기 면역원을 코딩하는 변형 RNA의 투여를 통해 백신을 접종하는 단계를 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 면역원성 조성물은 개체의 신체 또는 개체의 분리된 세포에 투여/처리될 수 있다. 신체의 특정 세포의 형질전환에 따라, 또는 분리된 세포의 형질전환에 따라, 상기 면역원은 그들 세포에 의해 발현될 수 있고 이후에 후천성 면역 반응, 즉 항원-특이적 면역 반응을 유발하는 면역 시스템에 제시될 수 있다. 따라서, 상기 백신 접종은 변형 RNA, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 조성물을 개체에, 바람직하게는 환자에게, 또는 생체 내 (in vivo)/생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 환자의 세포의 형질전환을 초래하는 개체, 바람직하게는 환자의 분리된 세포에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 투여 경로는 근육내, 복강내, 피내, 또는 피하 경로를 통한 주사가 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 화학적 변형이 도입된 mRNA의 선천성 면역 반응 감소 효과 분석

본 실시예에서는 일 실시예에 따른 N1-에틸-슈도우리딘 (N1-ethyl-pseudouridine, 이하 Et1Ψ으로 표시)의 도입이 비특이적 선천성 면역 반응에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

1-1. 화학적 변형이 도입된 mRNA의 제작

사스-코로나바이러스 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질 (Spike protein: S protein) 또는 인간 에리트로포이에틴 (Human Erythropoietin: hEPO)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 플라스미드를 제작한 후, 이를 주형으로 하여 시험관 내 전사 (in vitro transcription, IVT)를 수행하여 mRNA를 합성하였다. 상기 mRNA는 도 1에 도시한 바와 같이, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로 ⅰ) 5' 캡, ⅱ) 5' -비번역 부위, ⅲ) 오픈 리딩 프레임(ORF), ⅳ) 3' -비번역 부위, 및 ⅴ) 폴리A 테일이 작동 가능하게 순차적으로 연결되도록 설계하였다. 이를 위하여, 하기 표 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는, 각각의 cDNA (Complementary DNA)를 T7 RNA 중합 효소 프로모터가 포함된 벡터 (pUC57-kan, GenScript)에 삽입하여, 원형의 DNA 플라스미드를 제작하였다. 이후, 제한효소를 이용하여 상기 DNA 플라스미드를 선형화한 후, 이를 PCR purification kit(Qiagen)로 정제하여 시험관 내 전사(in vitro transcription; IVT)를 위한 DNA 주형을 수득 및 준비하였다. 이후, 상기 DNA 주형을 사용한 시험관 내 전사 과정, 즉, RNA 분자를 합성하는 과정은 당업계에서 알려진 방식을 채용하여 수행하였다(Curr Protoc . 2021 Feb;1(2):e39. 참조).

구체적으로, 튜브에 5 mM의 ATP (Thermo Fisher), 5 mM의 CTP(Thermo Fisher), 5mM의 GTP (Thermo Fisher), 5 mM의 N1-에틸-슈도우리딘, 그리고, 4 mM의 CleanCap® Reagent AG (TriLink)를 첨가하였다. 이후, 상기 혼합물에 pH 8.0, 400 mM의 Tris·HCl(invitrogen), 165 mM의 magnesium acetate(sigma), 100 mM의 dithiothreitol (sigma), 20 mM의 spermidine, 0.2% (v/v) Triton X-100(sigma)가 포함된, 10X in vitro transcription buffer를 1X가 되도록 첨가하여 혼합한 후, 여기에, 선형화된 DNA template (25 μg/mL), murine RNase inhibitor(NEB) (1 U/μL), Inorganic pyrophosphatase(NEB) (0.002 U/μL) 및 T7 RNA 중합효소 (NEB) (8 U/μL)를 첨가하고, 37℃ 조건에서 1-2 시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 혼합물에 DNase I (NEB)를 처리하여 37℃ 조건에서 15분 이상 반응시켜, 시험관 내 전사 반응 후 남아있는 DNA 주형을 제거하였다. 이후, RNeasy kit (Qiagen)을 사용하여 제조사 프로토콜을 따라 정제하여, mRNA 분자 내 모든 우리딘 (U)이 Et1Ψ으로 치환된 일 실시예에 따른 mRNA 분자를 최종적으로 수득하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

[표 1]

1-2. 선천성 면역 반응과 연관된 사이토카인의 수준 평가

상기 실시예 1-1의 mRNA를 마우스에 투여한 후, 상기 마우스로부터 수득한 혈청 시료를 대상으로 선천성 면역 반응과 연관된 사이토카인의 농도를 ELISA 및 Luminex assay를 통해 측정하였다. 구체적으로, microfluidic mixer (Precision Nanosystems)를 이용하는 당업계에서 알려진 방법(Mol Ther. 2018 Jun 6;26(6):1509-1519.)을 따라 LNP로 각각의 mRNA를 제제화한 후, SCoV2 S 01 mRNA 제제는 BALB/c 마우스에 개체 당 0.5mg/kg 용량으로 정맥 내 주사하였고, hEPO 01 mRNA 제제는 BALB/c 마우스에 개체 당 0.5mg/kg 용량으로 피하 주사하였다. 상기 정맥 내 주사 또는 피하 주사로부터 6시간 경과 후, 상기 마우스의 혈청 시료를 수득하고, 사이토카인의 농도를 ELISA kit (PBL Biomedical Labs, 42115 1) 및 Luminex assay (BioLegend)를 사용하여 측정하였다. 본 실시예에서 대조군은 vehicle control 투여군 (VC)을 사용하였고, 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 투여군 (이하 U로 표시), 및/또는 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 N1-메틸-슈도우리딘 (N1-methyl-pseudouridine, 이하 m1Ψ으로 표시)으로 치환된 mRNA 투여군을 사용하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, SCoV2 S 01_Et1Ψ가 투여된 마우스의 혈청 내 IFN-α, MCP-1, CXCL10, MIP-1β, IFN-γ, IL-6, MIP-1α, 및 TNF-α는 외래 mRNA가 투여되었음에도 불구하고, 대조군과 유사하게 낮은 수준으로 검출되었다. 특히, 이러한 검출 수준은 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 투여군, 및 m1Ψ이 도입된 mRNA 투여군에 비해 현저한 것이었다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 오픈 리딩 프레임 서열이 hEPO로 변경된 경우에도 (hEPO 01_Et1Ψ), 마우스의 혈청 내 IFN-α, MCP-1, CXCL10, 및 IL-6는 상기와 동일하게 낮은 수준을 보여주었다. 상기 결과는 일 실시예에 따른 Et1Ψ이 도입된 mRNA는 기존의 문제점으로 지적되어 온 과다한 선천성 면역 반응을 감소 또는 회피하는데 기여할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 2: Et1Ψ이 도입된 mRNA의 단백질 발현 양상 분석

본 실시예에서는 일 실시예에 따른 Et1Ψ의 도입이 단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

2-1. 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 발현 양상 평가

2-1-1. 화학적 변형이 도입된 mRNA의 제작

상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 사스-코로나바이러스 2 야생형 또는 베타 변이체의 스파이크를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 합성하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 여기서, SCoV2 S 02 (서열번호 2), SCoV2 S 03 (서열번호 3), 및 SCoV2 S 05 (서열번호 7)에서, 각각의 오픈 리딩 프레임 서열 내 우리딘 함량 (U contents)은 19.1%, 15.5%, 및 16.9%이었다.

[표 2]

2-1-2. 시험관 내( in vitro ) 단백질 발현 수준 평가

상기 실시예 2-1-1의 mRNA를 세포 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 0.5㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 HeLa 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 cell lysate을 수득하여 western blotting으로 SCoV2 S 단백질 발현 수준을 정량화하였다. 한편, 본 실시예에서 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 처리군 (U), 및 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 m1Ψ으로 치환된 mRNA 처리군 (m1Ψ)을 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, SCoV2 S 02_Et1Ψ, SCoV2 S 03_Et1Ψ, 또는 SCoV2 S 05_Et1Ψ으로 형질주입된 각각의 세포에서는 항원 단백질의 발현 수준이 다른 비교군 (U, m1Ψ)에 비해 낮고, 그 발현 수준이 현격하게 감소되었음을 확인하였다.

2-2. 반딧불이 루시퍼레이즈 단백질의 발현 양상 평가

2-2-1. 화학적 변형이 도입된 mRNA의 제작

상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 반딧불이 루시퍼레이즈 (Firefly Luciferase; Fluc) 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 합성하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 여기서, Fluc 02 (서열번호 10)에서, 오픈 리딩 프레임 서열 내 우리딘 함량은 23.9% 이었다.

[표 3]

2-2-2. 시험관 내( in vitro ) 단백질 발현 수준 평가

상기 실시예 2-1-1의 mRNA를 세포 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, 반딧불이 루시퍼레이즈 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 0.25㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 HEK293 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 cell lysate을 수득하여 Luciferase assay를 통해 Fluc 단백질 발현 수준을 정량화하였다. 한편, 본 실시예에서 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 처리군 (U), 및 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 m1Ψ으로 치환된 mRNA 처리군 (m1Ψ)을 사용하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 결과와 마찬가지로, Fluc 02_Et1Ψ으로 형질주입된 세포에서는 항원 단백질의 발현 수준이 다른 비교군 (U, m1Ψ)에 비해 낮고, 그 발현 수준이 현격하게 감소되었음을 확인하였다.

상기의 결과를 종합하면, Et1Ψ이 도입된 mRNA에 대한 통상적인 제조 방식만으로는 mRNA 기반 치료제 및 백신으로서의 효용성이 저하됨을 알 수 있었다. 즉, 상기 결과는 Et1Ψ의 도입에 의한 선천성 면역 반응 회피 효과를 활용하기 위해서는 단백질 발현 수준을 증진시킬 수 있는 추가적인 기술 요소가 접목되어야 함을 나타내는 것이다.

실시예 3: 단백질 발현 증진을 위한 Et1Ψ 뉴클레오티드의 재배열

본 실시예에서는 일 실시예에 따른 오픈 리딩 프레임 내 Et1Ψ의 재배열이 단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

3-1. 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 발현 수준 평가

3-1-1. Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA의 제작

상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 사스-코로나바이러스 2 야생형 또는 베타 변이체의 스파이크를 암호화하는, Et1Ψ이 도입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 합성하였다. 여기서, 오픈 리딩 프레임 서열은 코돈 최적화 기술을 적용하여, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2-1의 mRNA와 동일 또는 유사한 우리딘 함량 및 각기 다른 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈 개수 (Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ을 Et1Ψ-Et1Ψ-C로 치환하는 방식으로 수행함.)를 갖도록 설계하여, mRNA의 번역 효율을 비교하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.

[표 4]

[표 5]

3-1-2. 시험관 내( in vitro ) 단백질 발현 수준 평가

상기 실시예 3-1-1의 mRNA를 세포 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 0.5㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 HeLa 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 cell lysate을 수득하여 western blotting으로 SCoV2 S 단백질의 발현 수준을 정량화하였다. 한편, 본 실시예에서 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 처리군 (unmodified, U), 및 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 m1Ψ으로 치환된 mRNA 처리군 (m1Ψ)을 사용하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈을 포함하지 않은 SCoV2 S 01 mRNA (Et1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 항원 단백질의 발현 수준이 높게 유지된 반면, 적어도 1개 이상의 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈을 포함하는 SCoV2 S 06 또는 SCoV2 S 07 mRNA (Et1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 상기 실시예 2-2과 마찬가지로 발현 수준이 현격하게 감소됨을 확인하였다. 특히, 상기 SCoV2 S 01, SCoV2 S 06, 및 SCoV2 S 07 mRNA는 각각의 우리딘 함량이 동일하게 조작되었다는 점에서, Et1Ψ이 도입된 mRNA의 단백질 발현 수준은 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈의 유무가 주요한 인자로 작용함을 나타내는 것이다. 또한, 이러한 단백질의 발현 양상은 다른 비교군 (unmodified, m1Ψ)과는 명백하게 구분되는 것이었다.

추가적으로, 상기 실험 결과에 기초하여, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈을 포함하지 않은 SCoV2 S 01_Et1Ψ, 및 SCoV2 S 04_Et1Ψ으로 형질주입된 세포에서의 단백질 발현 수준을 재차 검증하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 결과와 마찬가지로, SCoV2 S 01_Et1Ψ, 및 SCoV2 S 04_Et1Ψ 처리군은 모두 비교군과 유사한 단백질 발현 수준을 보여주었다.

3-2. 반딧불이 루시퍼레이즈 단백질의 발현 수준 평가

3-2-1. Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA의 제작

상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 반딧불이 루시퍼레이즈 단백질을 암호화하는, Et1Ψ이 도입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 합성하였다. 여기서, 오픈 리딩 프레임 서열은 코돈 최적화 기술을 적용하여, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 동일 또는 유사한 우리딘 함량 및 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈 개수(Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ을 Et1Ψ-Et1Ψ-C로 치환하는 방식으로 수행함.)를 갖도록 설계하여, mRNA의 번역 효율을 비교하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.

[표 6]

[표 7]

3-2-2. 시험관 내( in vitro ) 단백질 발현 수준 평가

상기 실시예 3-2-1의 mRNA를 세포 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, Fluc 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 0.5㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 HeLa 세포 또는 HEK293T 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 cell lysate을 수득하여 western blotting으로 Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화하였다. 한편, 본 실시예에서 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 처리군 (unmodified, U), 및 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 m1Ψ으로 치환된 mRNA 처리군 (m1Ψ)을 사용하였다.

그 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포 및 HEK293T 세포 모두에서, Fluc 01 mRNA (Et1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 항원 단백질의 발현 수준이 높게 유지된 반면, 적어도 1개 이상의 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈을 포함하는 Fluc 03 또는 Fluc 04 mRNA (Et1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 단백질의 발현 수준이 현격하게 감소됨을 확인하였다. 특히, 본 실시예에서도, 상기 실시예 3-1-2과 마찬가지로, Et1Ψ이 도입된 mRNA의 단백질 발현 수준은 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈의 유무가 주요한 인자로 작용하며, 이러한 단백질의 발현 양상은 다른 비교군 (unmodified, m1Ψ)과는 명백하게 구분되는 것임을 재차 확인하였다.

추가적으로, 상기 실험 결과에 기초하여, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈을 포함하지 않은 Fluc 01_Et1Ψ으로 형질주입된 Hela 세포에서의 단백질 발현 수준을 재차 검증하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 결과와 마찬가지로, Fluc 01_Et1Ψ 처리군은 모두 비교군과 유사한 단백질 발현 수준을 보여주었다.

상기의 결과를 종합하면, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 코돈이 포함되지 않도록 오픈 리딩 프레임 내 뉴클레오티드 서열을 재배열 함으로써, Et1Ψ의 도입에 의한 단백질의 발현 저하를 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 단백질 발현 증진을 위한 Pro1Ψ 뉴클레오티드의 재배열

본 실시예에서는 상기 실시예 3의 실험 결과에 기초하여, 일 실시예에 따른 오픈 리딩 프레임 내 Pro1Ψ의 재배열 역시 단백질의 발현 수준을 증진시킴에 기여할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

4-1. 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 발현 수준 평가

4-1-1. Pro1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA의 제작

상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 사스-코로나바이러스 2 야생형의 스파이크를 암호화하는, Pro1Ψ이 도입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 합성하였다. 상기 실시예 3-1-1과 동일하게 우리딘 함량 및 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 코돈 개수를 설계하여 mRNA의 번역 효율을 비교하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 8에 나타낸 바와 같다.

[표 8]

4-1-2. 시험관 내(in vitro) 단백질 발현 수준 평가

상기 실시예 4-1-1의 mRNA를 세포 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 0.5㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 HeLa 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 cell lysate을 수득하여 western blotting으로 SCoV2 S 단백질의 발현 수준을 정량화하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 코돈을 포함하지 않은 SCoV2 S 01 mRNA (Pro1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 항원 단백질의 발현 수준이 높게 유지된 반면, 적어도 1개 이상의 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 코돈을 포함하는 SCoV2 S 06 또는 SCoV2 S 07 mRNA (Pro1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 상기 실시예 2-2 및 실시예 3-1-2과 마찬가지로 단백질의 발현 수준이 현격하게 감소됨을 확인하였다.

4-2. 반딧불이 루시퍼레이즈 단백질의 발현 수준 평가

4-2-1. Pro1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 mRNA의 제작

상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 반딧불이 루시퍼레이즈 단백질을 암호화하는, Pro1Ψ이 도입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 합성하였다. 상기 실시예 3-2-1과 동일하게 우리딘 함량 및 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 코돈 개수를 설계하여 mRNA의 번역 효율을 비교하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 9에 나타낸 바와 같다.

[표 9]

4-2-2. 시험관 내(in vitro) 단백질 발현 수준 평가

상기 실시예 4-2-1의 mRNA를 세포 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, Fluc 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 0.5㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 HeLa 세포 또는 HEK293T 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 cell lysate을 수득하여 western blotting으로 Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화하였다.

그 결과, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포 및 HEK293T 세포 모두에서, Fluc 01 mRNA (Pro1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 항원 단백질의 발현 수준이 높게 유지된 반면, 적어도 1개 이상의 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 코돈을 포함하는 Fluc 03 또는 Fluc 04 mRNA (Pro1Ψ modified mRNA)로 형질주입된 세포에서는 상기 실시예 3-2-2와 마찬가지로 단백질의 발현 수준이 현격하게 감소됨을 확인하였다.

상기의 결과를 종합하면, Et1Ψ 뿐만 아니라, Pro1Ψ이 도입된 뉴클레오티드에서도, Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 코돈이 포함되지 않도록 오픈 리딩 프레임 내 뉴클레오티드 서열을 재배열 함으로써, Pro1Ψ의 도입에 의한 단백질의 발현 저하를 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5: 동물 모델을 이용한 생체 내 ( in vivo ) 단백질 발현 수준 평가

본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 확인한 단백질의 발현 증진 효과를 생체 내 조건에서 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 하기 표 10의 조건을 만족하는 Et1Ψ이 도입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 합성하였다. 본 실시예에서 합성한 mRNA에 대한 서열 정보는 하기 표 11에 나타낸 바와 같다.

[표 10]

[표 11]

이후, TransIT mRNA reagent (Mirus Bio, MIR 2250)를 이용하여 각각의 mRNA를 제제화한 후, Fluc 05 mRNA 제제를 BALB/c 마우스에 개체 당 0.05mg/kg 용량으로 정맥 내 주사하였다. 상기 정맥 내 주사로부터 6시간 경과 후, 상기 마우스의 혈청 시료를 수득하고, IVIS Spectrum In Vivo Imaging System을 이용하여 살아있는 동물의 bioluminescence signal을 촬영하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 PBS 투여군 (PBS)을 사용하였고, 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 투여군 (U), 및 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 m1Ψ으로 치환된 mRNA 투여군 (m1Ψ)을 사용하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 상기 결과와 마찬가지로, Fluc 05_Et1Ψ 투여군은 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 투여군 및 m1Ψ이 도입된 mRNA 투여군에 비해, 우수한 단백질 발현 수준을 보여주었다.

실시예 6: m1Ψ이 도입된 mRNA와의 효능 비교

본 실시예에서는 인터페론조절인자(IRF)-유도성 루시퍼레이즈(luciferase) 리포터를 포함하는 THP-1 리포터 세포를 대상으로, Et1Ψ 뉴클레오티드 서열이 재배열된 일 실시예에 따른 mRNA와 기존의 화학적 변형 (m1Ψ)이 도입된 mRNA간 효능을 비교하였다.

6-1. 시험관 내 ( in vitro ) 단백질 발현 수준 평가

상기 실시예 3-2-1의 mRNA (Fluc 01_U, Fluc 01_m1Ψ, Fluc 01_Et1Ψ)를 THP-1 세포 (인간 단핵구, InvivoGen) 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, Fluc 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 2㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 THP-1 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 cell lysate을 수득하여 Luciferase assay를 통해 Fluc 단백질의 발현 수준을 정량화하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015) 만을 처리한 군 (mock)을 사용하였고, 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 처리군 (U), 및 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 m1Ψ으로 치환된 mRNA 처리군 (m1Ψ)을 사용하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, Fluc 01_Et1Ψ으로 형질주입된 세포에서의 항원 단백질의 발현 수준은 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA로 형질주입된 세포에 비해 현저한 것이었으며, Fluc 01_m1Ψ으로 형질주입된 세포에 비해서도 높게 검출되었다.

6-2. 상대적인 IRF (Interferon regulatory factor) 활성도 평가

상기 실시예 3-2-1의 mRNA (Fluc 01_U, Fluc 01_m1Ψ, Fluc 01_Et1Ψ)를 THP-1 세포 (인간 단핵구, InvivoGen) 내로 형질주입한 후, 인터페론 시그널링 활성화 수준을 평가하였다. 구체적으로, 2㎍/mL 농도의 mRNA를 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 THP-1 세포에 형질주입한 후, 24 시간 째에 배양 상층액을 수득한 뒤, 인터페론조절인자(IRF)-유도성 루시퍼레이즈 리포터의 활성화 정도를 측정하여, 별도의 처리/첨가 없이 배양한 THP-1 세포의 배양 상층액 대비 상대적인 IRF 활성도를 산출하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 Lipofectamine MessengerMax reagent (Invitrogen, LMRNA015)만을 처리한 군 (mock), 양성 대조군은 0.1㎍/mL의 LPS를 처리한 군(LPS)을 사용하였고, 비교군으로는 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 처리군 (U), 및 mRNA 분자 내 모든 우리딘이 m1Ψ으로 치환된 mRNA 처리군 (m1Ψ)을 사용하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리한 군 및 화학적 변형이 도입되지 않은 mRNA 처리군에서 IRF 리포터 활성화 수준이 크게 증가하여 높은 수준의 선천성 면역 반응이 유도된 반면, Fluc 01_Et1Ψ으로 형질주입된 세포에서의 IRF 리포터 활성은 상대적으로 낮은 수준으로 검출되었다. 또한, 이러한 선천성 면역 반응 감소 효과는 Fluc 01_m1Ψ으로 형질주입된 세포에 비해서도 우수한 것이었다.

상기 결과를 종합하면, 일 실시예에 따라 화학적 변형된 뉴클레오티드 서열(Et1Ψ, Pro1Ψ)이 재배열된 변형 mRNA는 선천성 면역 반응 감소 및 유효한 수준의 단백질 발현을 유도할 수 있었다. 특히, 전술한 효과는 기존의 화학적 변형 (m1Ψ)이 도입된 mRNA에 비해서도 우수한 것으로서, 상기 변형 mRNA는 mRNA 기반 치료제 및 백신으로서의 효용성을 증대시킬 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

적어도 하나 이상의 단백질을 암호화하는 변형 RNA로서,
상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위(5'-untranslated region: 5'-UTR)의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위(3'-untranslated region: 3'-UTR)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 우리딘(U)에 대신하여, N1-에틸-슈도우리딘(N1-ethyl-pseudouridine: Et1Ψ) 또는 N1-프로필-슈도우리딘(N1-propyl-pseudouridine: Pro1Ψ)을 포함하며,
상기 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열은 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열(alignment)의 코돈(codon)을 포함하지 않는 것인, 변형 RNA.
청구항 1에 있어서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 페닐알라닌(Phe)은 상기 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열 내 Et1Ψ-Et1Ψ-C 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-C 배열의 코돈으로 암호화된 것인, 변형 RNA.
청구항 1에 있어서, 상기 변형 RNA는 상기 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 5'캡 (5'Cap)을 추가로 포함하는, 변형 RNA.
청구항 3에 있어서, 상기 5′캡은 m⁷Gppp, Gppp, m⁷(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m⁷(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, G(5')ppp(5')G, m⁷G(5')ppp(5')G, 3´-O-Me-m⁷G(5')ppp(5')G, m⁷G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m⁷G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, 또는 m⁷G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU 중 어느 하나인 것인, 변형 RNA.
청구항 1에 있어서, 상기 변형 RNA는 3' -UTR에 작동 가능하게 연결된 폴리A 테일 (PolyA tail)를 추가로 포함하는, 변형 RNA.
청구항 5에 있어서, 상기 폴리A 테일은 20 내지 200개의 아데닌으로 이루어진 것인, 변형 RNA.
청구항 1에 있어서, 상기 변형 RNA는 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하는 RNA에 비해 암호화된 단백질의 발현 수준이 높은 것인, 변형 RNA.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 따른 변형 RNA를 유효 성분으로 포함하는, 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 변형 RNA는 약물 전달체 시스템(drug Delivery System: DDS)으로 제형화된 것인, 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 변형 RNA에 의해 암호화된 단백질은 치료용 단백질(therapeutic protein)이고, 상기 조성물은 약학적 조성물인, 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 변형 RNA에 의해 암호화된 단백질은 항원성 단백질(antigenic protein)이고, 상기 조성물은 면역원성 조성물인, 조성물.
RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나 이상의 단백질을 암호화하는 변형 RNA를 제조하는 방법으로서,
상기 RNA의 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열, 5' -비번역 부위의 뉴클레오티드 서열 및 3' -비번역 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계는,
상기 단백질을 암호화하는 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 수득하는 단계; 및
상기 수득된 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, 상기 뉴클레오티드 서열 내 우리딘을 N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘으로 치환하고, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 뉴클레오티드의 배열을 조작하여, 변형 RNA를 수득하는 단계를 포함하는, 변형 RNA를 제조하는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나 이상의 U-U-U 배열의 코돈을 포함하는, 변형 RNA를 제조하는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 제1 RNA 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열과 동일한 것인, 변형 RNA를 제조하는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계는 페닐알라닌을 암호화하는 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 배열의 코돈을 Et1Ψ-Et1Ψ-C 배열의 코돈으로 치환하거나, Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 Pro1Ψ-Pro1Ψ-C 배열의 코돈으로 치환하는 것을 포함하는, 변형 RNA를 제조하는 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계는,
상기 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, 오픈 리딩 프레임 내 U-U-U 배열의 코돈을 U-U-C 배열의 코돈으로 치환시켜 변형 RNA의 배열을 설계(designing)하는 단계;
상기 변형 RNA의 배열을 기초로 이에 상보적인 서열을 갖는 cDNA(complementary DNA)를 합성하는 단계;
상기 cDNA가 삽입된 선형의 DNA 플라스미드를 수득하는 단계; 및
상기 수득된 선형의 DNA 플라스미드를 주형으로 하여 시험관 내 전사(in vitro transcription; IVT)를 수행하는 단계;를 포함하고,
상기 시험관 내 전사는 N1-에틸-슈도우리딘 3인산 또는 N1-프로필-슈도우리딘 3인산, 아데노신 3인산(ATP), 사이티딘 3인산(CTP), 및 구아노신 3인산(GTP)을 첨가하여 수행하는 것인, 변형 RNA를 제조하는 방법.
변형 RNA의 뉴클레오티드 배열을 조작하는 단계를 포함하는, 변형 RNA가 암호화하는 적어도 하나 이상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서,
상기 RNA의 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열, 5'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열 및 3'-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 서열은 우리딘에 대신하여, N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-프로필-슈도우리딘을 포함하며,
상기 변형 RNA의 뉴클레오티드 배열을 조작하는 단계는,
상기 단백질을 암호화하는 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 수득하는 단계; 및
상기 수득된 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 또는 Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 포함하지 않도록 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계를 포함하는, 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계는 페닐알라닌을 암호화하는 Et1Ψ-Et1Ψ-Et1Ψ 배열의 코돈을 Et1Ψ-Et1Ψ-C 배열의 코돈으로 치환하거나, Pro1Ψ-Pro1Ψ-Pro1Ψ 배열의 코돈을 Pro1Ψ-Pro1Ψ-C 배열의 코돈으로 치환하는 것을 포함하는, 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 배열을 조작하는 단계는 상기 제1 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로, 오픈 리딩 프레임 내 U-U-U 배열의 코돈을 U-U-C 배열의 코돈으로 치환시켜 변형 RNA의 배열을 설계하는 단계를 포함하는, 단백질의 발현을 증가시키는 방법.