ES2205209T3 - Procedimientos de seleccion y de produccion de epitopos peptidicos de linfocitos t y vacunas que contienen los indicados epitopos seleccionados. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LA BIOLOGIA MOLECULAR Y LA INMUNOLOGIA. EN PARTICULAR, CONCIERNE A VACUNAS Y PROCEDIMIENTOS PARA PROPORCIONAR VACUNAS QUE PROVOCAN RESPUESTAS INMUNES CUANDO SE ADMINISTRAN A UN MAMIFERO, EN PARTICULAR UN SER HUMANO. LA RESPUESTA INMUNE PROVOCADA PREFERIDA ES UNA RESPUESTA DE LAS CELULAS T, INDUCIDA POR EPITOPES DE LAS CELULAS T PEPTIDICAS. ESTAS VACUNAS PUEDEN APLICARSE EN MUCHOS CAMPOS, QUE VAN DEL TRATAMIENTO DEL CANCER AL TRATAMIENTO O LA PROFILAXIS DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS TALES COMO EL SIDA. LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA NUEVOS PROCEDIMIENTOS PARA ELEGIR LAS SECUENCIAS DE PEPTIDOS A PARTIR DE UN ANTIGENO INTACTO QUE LLEVA A UNA ADECUADA RESPUESTA INMUNE (CELULA T) A SU ADMINISTRACION EN UN VEHICULO O EXCIPIENTE APROPIADO. LOS EPITOPES Y LAS VACUNAS, NATURALMENTE, FORMAN TAMBIEN PARTE DE LA PRESENTE INVENCION.

Description

Procedimientos de selección y de producción de epitopos peptídicos de linfocitos T y vacunas que contienen los indicados epitopos seleccionados.

\NAK1 Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular y de la inmunología. En particular, se relaciona con vacunas y métodos para obtener vacunas que provocan respuestas inmunes cuando se administran a un mamífero, en particular a un humano. La respuesta inmune provocada preferida es una respuesta de las células T, provocada por los epitopos peptídicos de las células T. Estas vacunas hallan su aplicación en muchos campos, que van desde los tratamientos del cáncer hasta los tratamientos o la profilaxis de enfermedades infecciosas tales como el SIDA. La presente invención proporciona nuevos métodos para seleccionar las secuencias peptídicas de un antígeno intacto que conducirán a una apropiada respuesta inmune (células T) tras administración en un vehículo adecuado. Los epitopos y las vacunas forman, por supuesto, también parte de la presente invención.

\NAK2 Antecedentes de la invención

Virtualmente ninguna vacuna de las que se dispone actualmente está diseñada de un modo racional en el sentido de un conocimiento detallado de los epitopos esenciales mínimos y de las reglas del procesamiento y presentación de antígenos. Más bien, las vacunas disponibles se basan en un conocimiento empírico de protección. Un objeto principal de la presente invención es desarrollar una nueva generación de vacunas diseñadas de un modo más racional que sean efectivas, seguras, fáciles de fabricar y de estandarizar, estables, baratas y asociadas a protección de larga duración. Se consigue este objetivo empleando nuestro conocimiento sobre la bioquímica del procesamiento y presentación de antígenos en general y en las células dendríticas en particular, en la selección de epitopos peptídicos. A continuación, los epitopos peptídicos seleccionados son incorporados a varios tipos de vacunas y estudiados en cuanto a su eficacia en, por ejemplo, modelos de ratones transgénicos HLA.

La selección de epitopos peptídicos para una combinación dada de antígeno y molécula HLA de clase I según la invención puede dividirse en las siguientes etapas subsiguientes:

1.

Predicción por ordenador de péptidos dentro de las secuencias primarias del antígeno que tienen la mayor probabilidad de unirse a la molécula HLA de clase I en cuestión, en comparación con el motivo relevante para la unión del MHC clase I (1).

2.

Medición de la unión real de los péptidos seleccionados a la molécula MHC en cuestión usando ensayos que determinan la unión HLA-péptido y la estabilidad del complejo HLA-péptido (2, 3) (Ejemplos 1 y 2 dados aquí).

3.

Estudio selectivo de los péptidos (seleccionados mediante las etapas 1 y 2) y sus secuencias flanqueantes (en el contexto del antígeno intacto) en cuanto a su adecuación a las reglas de escisión por proteosomas de las secuencias proteicas naturales (4).

4.

Estudio selectivo de los péptidos (seleccionados mediante las etapas 1 y 2) y sus secuencias flanqueantes (en el contexto del antígeno intacto) en cuanto a su adecuación con las reglas de transporte peptídico efectivo y de carga en moléculas HLA de la clase I (5).

Los epitopos peptídicos seleccionados (véanse las etapas 1-4) son incorporados a los siguientes prototipos de vacunas, cuya eficacia se compara en el modelo apropiado de ratón transgénico HLA.

i.

Mezcla de péptidos sintéticos en adyuvantes.

ii.

Mezcla de péptidos sintéticos cargados en células dendríticas.

iii:

Proteína recombinante, sintetizada en, y purificada a partir de, E. coli, consistente en una Redistribución de epitopos peptídicos en perlas encadenadas, los cuales se separan entre sí por sitios de escisión proteolítica. Proteína administrada en adyuvantes.

iv.

Proteína recombinante (véase iii; manosilada) cargada en células dendríticas.

v.

Constructo de ADN recombinante (ADN desnudo) que codifica para perlas encadenadas de epitopos peptídicos que se separan por sitios de escisión proteolítica.

vi.

Virus de la viruela del canario recombinante que codifica para perlas encadenadas de epitopos peptídicos que se separan por sitios de escisión proteolítica.

vii.

Adenovirus humano recombinante que codifica para perlas encadenadas de epitopos peptídicos que se separan por sitios de escisión proteolítica.

Se estudia la eficacia de diversos protocolos de vacunación por reestimulación en cultivos de linfocitos mixtos de células esplénicas de animales inmunizados con blastos de células B LPS autólogas que se cargan con el(los) péptido(s) relevante(s), seguido de medición de la reactividad de los cultivos resultantes de células T frente a células diana que presentan péptidos sintéticos o los epitopos procesados de manera natural.

Los epitopos peptídicos son también usados para la inducción de la actividad de células T específicas de antígeno en cultivos de linfocitos mixtos transgénicos HLA in vitro. Con ese fin, se cargan el(los) péptido(s) de elección sobre blastos de células B LPS singeneicas o sobre células dendríticas. Estas células son irradiadas y usadas como células estimuladoras con células esplénicas pasadas por lana de nilón de ratones transgénicos HLA. Tras estimulación in vitro durante una o dos semanas, se puede medir la reactividad de las poblaciones de células T resultantes frente a células diana que presentan péptidos sintéticos o los epitopos procesados de forma natural.

El diseño racional de vacunas tiene claras ventajas. La seguridad es una de ellas. Por ejemplo, las vacunas de vectores de ADN o víricos para HPV16 E6 y E7 son intrínsecamente inseguras si dichas vacunas contienen oncogenes funcionales, pero seguras si el vector de ADN o vírico codifica para perlas encadenadas de epitopos, una realización preferida de la presente invención. Son ventajas adicionales la efectividad y la simplicidad. Sólo se incluyen componentes eficazmente inmunizantes. Se eliminan las secuencias irrelevantes, facilitando la fabricación y la estandarización, aumentando la estabilidad y reduciendo el coste.

El diseño de vacunas efectivas de epitopos de células T depende de la selección precisa de péptidos inmunogénicos. Por medio de la presente invención (un método que analiza la estabilidad de los complejos péptido-MHC sobre la superficie de células presentadoras de antígeno), hemos mejorado considerablemente el procedimiento de selección. Más aún, también hemos mejorado significativamente el procedimiento mediante el cual las vacunas que contienen poli-epitopos de células T inducen fuertes respuestas inmunes antitumorales y antivíricas.

La presente invención proporciona, por lo tanto, un método para la selección de epitopos peptídicos de células T presentes en antígenos polipeptídicos, que consiste en la identificación de péptidos en la secuencia primaria del antígeno que tienen un motivo de unión y tamaño para unirse a una molécula HLA de la clase I, midiendo la unión de dichos péptidos identificados a las moléculas MHC de la clase I, mediante lo cual se mide la estabilidad del complejo del péptido y la molécula MHC de clase I sobre células intactas que llevan dicha molécula MHC de clase I en sus superficies. Más aún, la presente invención proporciona un nuevo método para la aplicación de epitopos identificados de células T, consistente en la incorporación de una multitud de epitopos de células T en un constructo de cadena de perlas, en donde los epitopos de células T se unen preferiblemente entre sí por una secuencia espaciadora que asegura el procesamiento eficaz y la presentación de los epitopos de células T relevantes.

\NAK3 Resumen de la invención

La unión peptídica a MHC en condiciones fisiológicas está gobernada por el equilibrio dinámico entre la asociación y la disociación de los complejos MHC-péptido. Tanto la capacidad de un péptido para unirse a una molécula MHC como la estabilidad del complejo MHC-péptido resultante a lo largo del tiempo determinarán la cantidad de un complejo péptido-MHC dado en la superficie de una célula diana/estimuladora y, por lo tanto, la posibilidad de que esta configuración sea detectada por linfocitos T respondedores. Se han establecido diversos ensayos para medir estos parámetros en el contexto del sistema inmune humano y murino. Estos ensayos son especialmente adecuados para medir la unión peptídica y la estabilidad de los complejos péptido-MHC en el contexto de diversas moléculas HLA de clase I:

i.

El ensayo T2, que mide la unión de péptidos a moléculas MHC de clase I vacías en la superficie de la línea celular defectiva en procesado 174CEM.T2 (T2) (2).

ii.

Un ensayo que mide la unión de péptidos a moléculas MHC de clase I solubles que han sido aisladas de líneas celulares apropiadas (6).

iii.

Un ensayo que mide la unión de péptidos a moléculas MHC de clase I solubles que han sido aisladas como proteínas recombinantes de cultivos de E. coli que sobreexpresan estas proteínas (7, 8).

iv.

Un ensayo de unión peptídica a HLA clase I basado en la competición por la unión a moléculas de la clase I sobre células B humanas intactas (3) (Ejemplo 1 aquí).

v.

Un ensayo de unión peptídica a HLA clase I que mide la estabilidad de los complejos MHC clase I-péptido sobre células B humanas intactas (un objeto principal de la presente invención; véanse los Ejemplos 2 y 3 aquí).

En la presente invención, se facilita el último ensayo: un nuevo ensayo que mide la estabilidad del complejo MHC clase I-péptido en células intactas portadoras de dicha molécula MHC de clase I en su superficie. La afinidad de unión de los péptidos a las moléculas MHC en condiciones fisiológicas es un equilibrio dinámico entre asociación y disociación del complejo trimolecular de péptido, cadena pesada de MHC clase I y \beta2-microglobulina. Actualmente, la afinidad de los péptidos por una molécula de clase I dada se basa en ensayos que emplean moléculas MHC clase I unidas a células o moléculas MHC clase I "libres de células" purificadas. Se mide la afinidad por la capacidad comparativa de los péptidos para regular de modo creciente las moléculas MHC de clase I en la superficie de células defectivas en procesado (2) por su capacidad para competir con los péptidos de referencia de alta afinidad (3, 9, 10). Sin embargo, estos ensayos apenas tienen en cuenta la estabilidad de los complejos péptido-MHC en condiciones fisiológicas debido al corto tiempo de incubación, a la presencia continua de altas concentraciones de péptido exógeno o la reducida temperatura. Recientemente, hemos medido el destino de los complejos existentes MHC-péptido a lo largo del tiempo en condiciones fisiológicas. Los péptidos que exhibían afinidades de unión comparables medidas mediante los ensayos previos mostraron marcadas diferencias con respecto a la estabilidad de los complejos péptido-MHC. Más aún, la estabilidad del complejo péptido-MHC guardaba una mejor correlación con la inmunogenicidad del péptido que la afinidad de unión (véanse los Ejemplos 2 y 3 de esta solicitud de patente).

Son ejemplos de péptidos que exhiben una baja afinidad de unión que representan epitopos de células T inmunogénicos los péptidos derivados de MART-1 (AAGIGILTV/ILTVILGVL) (11), PmeI17/gp100 (YLEPGPVTA) (12) y p53 (LLGRNSFEV) (13). Estos péptidos fueron enmarcados en esta categoría en base a los resultados obtenidos en ensayos de unión clásicos. Sin embargo, la medición de la estabilidad de los complejos relevantes péptido-MHC reveló que la estabilidad de estos complejos es comparable con la de epitopos conocidos de origen vírico (véanse los ejemplos 2 y 3 de esta solicitud de patente). Por lo tanto, estos péptidos, aunque algo lentos al montar la molécula MHC, no han de ser considerados como exhibidores de una baja afinidad por la molécula MHC presentadora. Esta noción confirma que, además de la afinidad de unión peptídica, la estabilidad del complejo péptido-MHC es un parámetro importante para la identificación de epitopos peptídicos inmunogénicos. Como la estabilidad del complejo MHC-péptido guarda una incluso mejor correlación con la inmunogenicidad del péptido que la afinidad de unión, los ensayos que miden la estabilidad del complejo representan una nueva etapa importante e indispensable en la secuencia de los procedimientos utilizada para identificar epitopos peptídicos inmunogénicos a partir de secuencias primarias de aminoácidos.

Otra realización importante de la presente invención es aportada por el método innovador que induce la reactividad de las células T frente a múltiples epitopos de células T preseleccionados por inmunización con un vector de adenovirus recombinante (rAd) que contiene múltiples epitopos de células T a modo de perlas encadenadas, en donde los epitopos de células T se unen entre sí por sitios de escisión proteolítica. La unión de los epitopos de células T por secuencia espaciadoras asegura que los epitopos de células T sean eficientemente procesados y presentados a la célula T. Por lo tanto, la incorporación de múltiples epitopos de células T espaciados por secuencias ligantes preferiblemente en adenovectores recombinantes representa una importante y potente nueva aproximación para la inducción de una fuerte inmunidad de células T antivírica y antitumoral que se dirige contra múltiples blancos de células T.

\NAK4 Descripción detallada de la invención

Describimos aquí un ensayo que mide la estabilidad de los complejos péptido-MHC en la superficie de líneas de células B humanas. Este ensayo, que se utiliza para identificar epitopos peptídicos inmunogénicos, constituye una etapa principal hacia delante en el camino hacia el diseño racional de vacunas. La nueva metodología aquí descrita es base en un ensayo de unión que mide la unión peptídica en células B humanas intactas. Este ensayo está, por lo tanto, descrito por separado en el siguiente párrafo (\NAK4.1). Este ensayo de unión ha sido publicado con anterioridad. El ensayo de estabilidad, que utiliza una combinación innovadora de etapas, está descrito después (\NAK4.2). La parte de la solicitud de patente que describe una estrategia de vacunación utilizando rAd que alberga constructos de perlas encadenadas codificantes de varios epitopos de células T preseleccionados está dada en \NAK4.5.

\NAK4.1 Un ensayo de unión HLA clase I-péptido basado en la competición por la unión a moléculas de clase I sobre células B humanas intactas

Los ensayos de unión de péptidos emplean moléculas MHC de clase I unidas a células (2, 3) o moléculas MHC de clase I "libres de células" (6). Los ensayos que se basan en moléculas MHC de clase I unidas a células se basan en la regulación creciente (2) o en la reconstitución de moléculas MHC de clase I (3), según se detecta por medio de anticuerpos específicos para la conformación de MHC clase I. Los ensayos que se basan en moléculas MHC clase II unidas a células están también descritos en la técnica. Por ejemplo, Nelson y col. (75) describen un ensayo de unión de péptidos para MHC clase II que hace uso de células intactas en combinación con péptidos radiomarcados. Los sistemas libres de células son cuantitativos y pueden hacer uso de moléculas MHC purificadas a las que unen péptidos de referencia marcados en un montaje competitivo (6). Parker y col. (76) describen un método para comparar las propiedades de unión de diferentes péptidos a la molécula MHC de clase I humana HLA-A2. Con este fin, se usa un sistema libre de células, en donde se reconstituye el complejo de clase I a partir de la cadena pesada de clase I, del péptido y de \beta2m. Se detecta la unión peptídica midiendo la incorporación de \beta2-microglobulina marcada con ^{125}I al complejo de clase I, que puede ser analizada mediante geles de enfoque isoeléctrico nativos. La purificación de las moléculas MHC de clase I, sin embargo, es laboriosa y se pueden producir cambios conformacionales durante la purificación y/o el almacenamiento. El ensayo de unión de péptidos que empleamos para identificar pépticos que se unen a diversas moléculas HLA de clase I utiliza péptidos de referencia marcados con fluoresceína que se unen a moléculas HLA de clase I en líneas de células B homozigóticas para HLA, de las que se han eliminado los péptidos unidos por tratamiento con ácido débil. El uso de células B humanas intactas como herramientas en los ensayos de unión de péptidos tiene varias ventajas claras:

\text{*}

Las células B transformadas con EBV pueden crecer fácilmente a elevados números sin el uso de medios de cultivo de tejidos exclusivos (= caros) o factores de crecimiento.

\text{*}

Las células B transformadas con EBV expresan altos niveles de MHC de clase I; no se necesita ningún tratamiento con linfokinas, tales como IFN\gamma, para alcanzar estos elevados niveles de expresión.

\text{*}

Las células B sometidas a tratamiento con ácido débil son fácilmente preparadas, incluyendo la recogida de las células B de los cultivos, la cantidad de células B purificadas necesarias para un ensayo medio estará lista para su uso en 30 minutos.

\text{*}

Se dispone de un repertorio casi infinito de líneas de células B humanas transformadas con EBV, que expresan varias combinaciones de moléculas MHC de clase I, en muchos laboratorios de todo el mundo.

\text{*}

Cuando sea necesario, se pueden preparar fácilmente nuevas líneas de células B transformadas con EBV en un mes. La transformación con EBV de células B humanas es un procedimiento muy sencillo que se realiza rutinariamente en muchos laboratorios de todo el mundo.

Hemos mostrado que la unión de péptidos marcados con fluoresceína a estas moléculas HLA de clase I liberadas de péptido es específica y permite la determinación semicuantitativa de la capacidad de unión de los péptidos. La cinética de la unión peptídica a estas moléculas HLA de clase I liberadas de péptido es comparable a la de las moléculas HLA de clase I solubles e independiente de la biosíntesis de nuevas moléculas HLA de clase I. Este ensayo fue optimizado y validado con péptidos de capacidad de unión conocida a HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-A*1101 o HLA-A*2401 (3, 6) (nuestros datos no publicados adicionales). Más aún, esta ensayo fue aplicado, entre otros, en la identificación de epitopos CTL conservados restringidos en HLA-A0301 potenciales derivados de la polimerasa de HIV-1 (3).

Ejemplo 1 Validación de un ensayo de unión de péptidos que emplea las moléculas HLA-A0201 y A0301 sobre células B humanas intactas (adaptado de (3) Materiales y métodos Líneas celulares

Las líneas celulares B transformadas con EBV (B-LCL) usadas para los ensayos competitivos son JY (tipo HLA: A*0201, B7, Cw7, DR4, DRw6, DPw2) y EKR (tipo HLA: A3, B7, DR7, DQw2).

Las B-LCL usadas para confirmar la unión específica de los péptidos de referencia son B109, BRM, D100, D110, K97, ML, NL, P98, S59 y S99. En la fig. 1, se da el tipo HLA de estas líneas celulares.

Péptidos

Se sintetizaron péptidos de referencia marcados con fluoresceína (FL) como derivado Cys. Se realizó el marcaje con 4-(yodoacetamido)fluoresceína (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza) a pH 7,5 (Na-fosfato en agua/acetonitrilo 1:1). Se desalaron los péptidos marcados sobre Sephadex G-10 y se purificaron además por RP-HPLC C18. Se caracterizaron los péptidos marcados por MALDI-MS (Lasermat, Finnigan, Reino Unido). El péptido de referencia usado para la unión de HLA-A*0301 era KVFPC(FL)ALINK (MH^{+} calculado = 1521,8, MH^{+} medido = 1521,4). El péptido de referencia para HLA-A*0201 era FLPSDC(FL)FPSV (MH^{+} calculado = 1500,6, MH^{+} medido = 1500,1).

Los péptidos de referencia usados para la unión a HLA-A*0301 o HLA-A*0201 fueron publicados por Sette y col. (14). En ambos péptidos, estos investigadores introdujeron una tirosina, que utilizaron para aportar un marcaje radiactivo al péptido. Hemos substituido esta tirosina por una cisteína. La cisteína permitía la conjugación de la 4-(yodoacetamido)fluoresceína.

Las secuencias de aminoácidos de la polimerasa de 14 cepas víricas diferentes de HIV-1 secuenciadas en toda su longitud: LAI, MN, NL43, OYI, SF2, RF, MAL, D31, CAM1, HAN, ELI, NDK, JRCSF y JRFL (15) fueron estudiadas en cuanto a posibles epitopos CTL restringidos en HLA-A*0301 usando un sistema de puntuación (1). El motivo HLA-A*0301 usado se basaba en los estudios de Kubo y col. (16) y Engelhard (17). En el anclaje en la posición 2, se prefería un L, I, V o M, y en el anclaje C-terminal, un K, R o Y. Se sintetizaron péptidos que contenían los residuos mencionados en ambas posiciones de anclaje y se conservaron completamente entre las 14 cepas de HIV-1.

Se sintetizaron péptidos por estrategias de fase sólida en un sintetizador de múltiples péptidos automatizado (Abimed AMS 422, Langenfeld, Alemania) usando química Fmoc. Se analizaron los péptidos por HPLC de fase inversa, se disolvieron en 20 \mul de sulfóxido de dimetilo (DMSO), se diluyeron en NaCl al 0,9% a una concentración peptídica de 5 mg/ml y se guardaron a -20ºC antes de su uso.

\newpage

Tratamiento con ácido débil de B-LCL

Se realizó el tratamiento con ácido débil de HLA-A2 o HLA-A3 sobre B-LCL según la modificación de Bremers (18) del procedimiento de Storkus y col. (19). Resumiendo, se lavaron las células dos veces con PBS y se pusieron luego a reposar sobre hielo durante 5 minutos. Se trataron entonces las células durante 90 segundos con tampón de ácido cítrico-Na_{2}HPO_{4} (mezcla igual volumen de ácido cítrico 0,263 M y Na_{2}HPO_{4} 0,123 M) (20). Para HLA-A3, se ajustó el tampón a pH = 2,9 y a pH = 3,2 para HLA-A2; estas diferencias de pH son esenciales para la óptima elución de los péptidos unidos y la reconstitución de la molécula MHC de clase I con el péptido exógeno añadido (18). Inmediatamente a continuación, se tamponaron las células eluidas con medio de Dulbecco modificado de ISCOVE (IMDM) frío, se lavaron con IMDM y se resuspendieron a 700.000 células/ml en IMDM + 1,5 \mug/ml de \beta2m (Sigma, St. Louis, EE.UU.).

Ensayo competitivo de péptidos

Para los ensayos competitivos, se incubaron 25 \mul del péptido de referencia marcado con FL (conc. final: 150 nM en PBS) con 25 \mul de péptido competidor (diferentes concentraciones finales en PBS) en una placa de 96 pocillos de fondo en U (Costar, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.). Se añadieron 100 \mul de la B-LCL tratada con ácido débil (A2:JY, A3:EKR) a estos pocillos.

Se incubó la mezcla durante 3 ó 24 h a 4ºC o a 26ºC, se lavó dos veces con PBS que contenía un 1% de BSA (PBA al 1%), se resuspendió en PBA al 1% que contenía un 0,5% de paraformaldehído y se analizó en un FACscan (Becton-Dickinson, Etten-Leur, Países Bajos).

Se consideró el valor de fluorescencia media (FM) obtenido en el experimento sin péptido competidor como la unión máxima y se equiparó al 0% de inhibición; la FM obtenida del experimento sin péptido de referencia fue equiparada al 100% de inhibición.

Se calculó el % de inhibición de la unión usando la siguiente fórmula:

(1-(FM

 \ 

150

 \ 

nM

 \ 

péptido

 \ 

de

\ 

referencia

 \ 

y

 \ 

competidor - FM

 \ 

sin

 \ 

péptido

 \ 

de

 \

referencia) - (FM

 \ 

150

 \ 

nM

\ 

péptido

 \ 

de

 \ 

referencia-FM

 \ 

sin

 \ 

péptido

 \ 

de

 \ 

referencia))

 \

x

 \ 

100%

En experimentos donde no se añadió péptido competidor, se calculó el índice de fluorescencia (IF) para indicar cuánta fluorescencia se medía por encima del fondo (sin péptido de referencia). El IF = (FM muestra - FM fondo)/FM fondo.

Para bloquear la síntesis proteica en B-LCL, se usó una concentración final de 100 \muM de emetina (Sigma, St. Louis, EE.UU.), tal como se mostró previamente (20).

Resultados Sensibilidad y especificidad de la unión de los péptidos de referencia marcados con FL a HLA clase I

Los péptidos de referencia que se unen a HLA-A*0201 y HLA-A*0301 fueron descritos y utilizados en un ensayo de unión molecular por Sette y col. (14). En ambos péptidos, se usó una tirosina para dotar de un marcaje radiactivo al péptido. Substituimos esta tirosina con cisteína, a la que se conjugó 4-(yodoacetamido)fluoresceína.

Se estableció la cantidad de péptido fluorescente necesaria para elensayo competitivo. Con este fin, se realizó una titulación del péptido. Tras una incubación de tres horas a 26ºC, se midió la fluorescencia media (FM). A concentraciones de 2 nM a 100 nM, se halló un aumento brusco en la FM para el péptido de referencia HLA-A*0201 y de 2 nM a 150 nM para el péptido de referencia HLA-A*0301 (datos no mostrados). El tratamiento con ácido débil de las células B antes de la incubación con el péptido de referencia marcado con FL dio lugar a un mayor máximo de fluorescencia y también a un aumento más brusco de la FM a las concentraciones bajas de péptido (fig. 7).

Con objeto de investigar si se producía una unión no específica de péptido a los componentes celulares, incluyendo otros alelos de HLA clase I, en la superficie de la línea celular usada, se incubaron 10 líneas de células B-LCL diferentes con 0 ó 150 nM de péptido de referencia marcado con FL (HLA-A*0201 o HLA-A*0301). Se calculó el IF para cada línea celular y se equipararon los IF obtenidos al 100% de unión. Para relacionar la unión del péptido de referencia marcado con FL a las 10 líneas celulares diferentes con la unión del péptido de referencia marcado con FL a JY o EKR, se determinaron los porcentajes de unión peptídica relativos. Se calcularon los porcentajes de unión peptídica relativos de los péptidos de referencia marcados con FL a cada línea celular como: (IF línea celular/IF línea celular de referencia) x 100%. Para ambos péptidos de referencia marcados con FL, la unión no específica a otros componentes celulares de las líneas celulares usadas en el ensayo competitivo no excedía nunca del 20% (fig. 6). Dado que el motivo de unión a péptidos de HLA-A*0301 es muy similar al motivo de unión de HLA-A11 (16), se observó también la unión del péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0301 a las líneas celulares B-LCL que expresan este alelo (fig. 6). La línea celular NL se une al péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0301. Ésta expresa el alelo HLA-A28, dos subtipos del cual, HLA-Aw6801 y HLA-Aw6803, comparten el motivo de unión a péptidos con HLA-A*0301 (A. Sette, comunicación personal).

Cinética de la unión de péptidos a moléculas HLA de clase I tratadas con ácido débil

Para estudiar el efecto de la unión de péptidos a diferentes temperaturas, se eluyeron células EKR y se incubaron con péptido marcado con FL durante diferentes períodos de tiempo a 4ºC, 26ºC o 37ºC, respectivamente. A 4ºC, el péptido se une inicialmente con rapidez y luego aumenta de forma estable a lo largo del tiempo (fig. 7). La unión del péptido a 26ºC es más rápida (fig. 7). La cantidad de péptido unido después de 6 horas a 26ºC no difería de la cantidad de péptido unido a 4ºC. El péptido se une rápidamente a 37ºC, pero no se ve ningún aumento del péptido unido cuando se incuba durante más tiempo (fig. 7). La falta de aumento en el péptido unido a 37ºC es probablemente debida a dos fenómenos. Las moléculas HLA de clase I, presentes sobre la superficie de la célula a la que no se unió el péptido, se desintegran a esta temperatura (21). En segundo lugar, la disociación de los péptidos es dramáticamente más rápida a 37ºC en comparación con la disociación de los péptidos cuando se incuban a 4ºC (22).

La unión a moléculas de clase I tratadas con ácido débil no depende de la síntesis de proteínas de novo

Para caracterizar la interacción de péptidos con moléculas HLA tratadas con ácido débil asociadas a células, se incubaron células EKR liberadas de péptidos con péptido marcado con FL durante diferentes períodos de tiempo a 4ºC o a 26ºC. Tal como se muestra en la figura 7, el marcaje fluorescente a 4ºC de las células aumenta de forma estable en el tiempo. El uso de 100 \muM de inhibidor de la síntesis proteica emetina durante 1 hora antes de la elución disminuyó la cantidad de péptido unido a 26ºC, pero no a 4ºC (fig. 7).

De este modo, la unión de un péptido a moléculas HLA de clase I tratadas con ácido débil a 4ºC no resultaba afectada por el uso de un fármaco inhibidor de la síntesis de proteínas. Como los procesos metabólicos se reducen a 4ºC, la unión de péptidos a las moléculas HLA de clase I eluidas depende únicamente de la disponibilidad de las moléculas HLA de clase I ya presentes en la superficie externa de la célula.

Ensayo competitivo

La representación de la FM frente a la concentración de los péptidos de referencia marcados con FL dio lugar a una curva con forma log. Elegimos 150 nM de péptido de referencia marcado con FL como concentración estándar en todos los experimentos competitivos. El uso de 150 nM de péptido de referencia marcado con FL dio como resultado una FM de aproximadamente 4-5 veces el fondo (no mostrado). Se tituló el péptido de referencia no marcado en 150 nM de péptido de referencia marcado con FL, se calculó el porcentaje de inhibición y se representó frente a la concentración del péptido no marcado (fig. 5). En un ensayo competitivo de 24 horas a 4ºC, el péptido de referencia HLA-A*0201 o HLA-A*0301 no marcado necesitaba aproximadamente 3-5 veces (respectivamente, 0,4 \muM y 0,7 \muM) la concentración usada del péptido de referencia marcado con FL para inhibir la unión del péptido marcado con FL al 50% (CI_{50}) (Tabla 1).

Para determinar las condiciones experimentales óptimas y para validar el ensayo, estudiamos péptidos derivados de proteínas HPV16 E6 y E7 con propiedades de unión conocidas a HLA-A*0201 o HLA-A*0301 (6, 10) a diferentes concentraciones durante 3 ó 24 horas a 4ºC o a 26ºC (Tabla 1). Cuando se incubaban las células durante 24 horas, se necesitaba menos péptido (Tabla 1). Se necesitó la menor cantidad de péptido competidor cuando se incubaron las células durante 24 horas a 4ºC (Tabla 1). No se observó diferencia entre un tiempo de incubación de 24 horas o de 48 horas a 4ºC (no mostrado). Esto implica que la prueba es más sensible cuando se alcanza el equilibrio. Probablemente, debido a una más rápida asociación del péptido de referencia marcado con FL, se necesita más péptido competidor para alcanzar la CI_{50} en incubaciones cortas. Ordenando los péptidos por sus CI_{50} se ve que, cuando se incuban las células a 4ºC durante 24 horas, su orden es comparable al hallado por Kast y col. (6) usando el ensayo de unión molecular (Tabla 1). Todos los péptidos que no poseían el motivo de unión descrito mostraban una baja afinidad de unión. Tomando en conjunto estos resultados y los resultados de la unión de péptidos a moléculas HLA de clase I en células tratadas con emetina, concluimos que el ensayo competitivo es llevado a cabo mejor a 4ºC con un tiempo de incubación de al menos 24 horas.

Competición con epitopos CTL conocidos

Se usaron cinco epitopos CTL restringidos en HLA-A*0201, un epitopo CTL restringido en HLA-A*0301 y dos péptidos HLA-A*0301, identificados por secuenciación de pool de péptidos, para determinar los valores de la CI_{50} de péptidos de unión de alta afinidad. Los cinco péptidos estudiados para la unión a HLA-A*0201 cometían todos muy bien, con una CI_{50} \leq 1,7 \muM (Tabla 2). Se estudió el conocido epitopo CTL restringido en HLA-A*0301 derivado de HIV. El péptido, derivado de HIV-nef, se unía con una CI_{50} de 0,5 \muM. Los dos péptidos, que fueron identificados por secuenciación de pool de péptidos, se unían con una CI_{50} \leq 15 \muM (Tabla 2). Por lo tanto, concluimos que los péptidos que compiten con una CI_{50} \leq 5 \muM deben ser considerados como epitopos CTL potenciales.

Unión de secuencias de HIV-1pol conservadas a HLA-A*0301

Se seleccionaron veinte péptidos de 8-11 aminoácidos de longitud en base al motivo de unión HLA-A*0301 y a su conservación en los productos génicos de polimerasa de diferentes cepas de HIV-1. Se estudiaron los péptidos en el ensayo competitivo durante 24 horas a 4ºC. Nueve péptidos mostraron unirse a HLA-A*0301. Cuatro péptidos se unían con afinidad intermedia y competían con una CI_{50} \leq 5 \muM (Tabla 3) y los otros cinco péptidos (marcados con un asterisco, *) se unían con alta afinidad y competían con una CI_{50} \leq 3,0 \muM. Considerando la CI_{50} obtenida con los epitopos CTL conocidos, especialmente estos cinco péptidos pueden ser epitopos CTL candidatos.

Comentarios

Para una extensa discusión de estos resultados véase (3). Este ejemplo muestra que este ensayo funciona bien con respecto a péptidos de capacidad de unión conocida a HLA-A*0201 o HLA-A*0301. Las cinéticas de la unión peptídica en este ensayo mostraron ser comparables a la de los ensayos que emplean moléculas HLA de clase I solubles. Más aún, la aplicación del ensayo en la búsqueda de epitopos CTL restringidos en HLA-A*0301 potenciales, derivados de la polimerasa de HIV-1, dio lugar a la identificación de cinco péptidos con unión de alta afinidad. El ensayo es fácil de realizar, ya que no hay necesidad de purificar moléculas HLA de clase I o de transfectar células con moléculas HLA de clase I y no se usa marcaje radiactivo. Más aún, se dispone de grandes paneles de líneas de células B humanas con tipificación HLA como herramientas para la unión de péptidos a una amplia gama de moléculas HLA. Actualmente, el sistema es usado también con éxito para la identificación de péptidos que se unen a HLA-A*0101 y HLA-B7.

Leyendas de las figuras del ejemplo 1 Figura 1 Especificidad de los péptidos de referencia marcados con FL

Se trató la línea celular de referencia EKR (HLA-A*0301) con ácido débil a pH = 2,9. Se trató la línea celular de referencia JY (HLA-A*0201) con ácido débil a pH = 3,2 y se trataron las otras 10 líneas diferentes B-LCL con ácido débil a pH = 2,9 cuando se las sometió a incubación con el péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0301, o a pH = 3,2 cuando se las incubó con el péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0201. Se incubaron las células EKR con 150 nM del péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0201 (barras rayadas) y se incubaron las otras 10 líneas diferentes B-LCL con 150 nM del péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0301 (barras en blanco) o HLA-A*0201 (barras rayadas) durante 4 h a 26ºC. Se calculó el índice de fluorescencia (IF) para cada línea celular y se equipararon el IF del péptido de referencia marcado con FL unido a EKR (para la unión a HLA-A*0301) y el IF del péptido de referencia marcado con FL unido a JY (para la unión a HLA-A*0201) al 100% de unión. Mediante la fórmula: (IF línea celular/IF línea celular de referencia)*100%, se calcularon los porcentajes relativos de unión de péptidos de las 10 líneas B-LCL diferentes. El lado izquierdo superior muestra el tipo HLA completo de las líneas celulares de referencia, junto con el solapamiento del tipo HLA de otras líneas celulares. El lado izquierdo inferior muestra las 10 líneas B-LCL con su tipo HLA completo.

Figura 2 Unión de péptidos sobre moléculas HLA de clase I eluidas frente a no eluidas

Se incubaron células JY (símbolos rellenos) y células JY cuyas moléculas HLA de clase I fueron tratadas con ácido débil (símbolos en blanco) con cantidades crecientes (nM) del péptido marcado con FL HLA-A*0201. Se incubaron las células durante 3 horas a 26ºC, se lavaron y se midió la fluorescencia media (Fm) en un FACScan. Las líneas mostradas son el resultado del análisis de regresión logarítmica de la concentración del péptido de referencia marcado con FL frente a la Fm.

Figura 3 Cinética de la unión de péptidos a moléculas HLA de clase I tratadas con ácido débil

Se trataron células EKR con ácido débil y se incubaron con 150 nM de péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0301 durante diferentes períodos de tiempo a 4ºC (triángulos), 26ºC (cuadrados en blanco) o 37ºC (cuadrados rellenos). Se midió la unión del péptido marcado con FL a los 10, 20, 40, 90, 180 y 360 minutos. Se da la unión como el índice de fluorescencia (IF). Las líneas mostradas para 4ºC y 26ºC son el resultado de análisis de regresión respectivamente lineal o logarítmica.

Figura 4 Unión de péptido marcado con FL a células tratadas con fármacos inhibidores de la síntesis de proteínas

Se trataron células EKR con 10^{-4} M de emetina (barras en blanco) o no (barras rayadas) durante 1 hora antes del tratamiento con ácido débil (20). Se añadieron 150 nM de péptido de referencia marcado con FL HLA-A*0301 y se monitorizó la unión a 1, 3 ó 4,5 horas de incubación. Se incubaron las células a 26ºC o a 4ºC.

Figura 5 Competición del péptido de referencia no marcado con el péptido de referencia marcado con FL

Se incubaron células EKR (izquierda) o células JY (derecha) con 150 nM de péptido de referencia marcado con FL, kvfpC(FL)alink o flpsdC(FL)fpsv, respectivamente, y cantidades crecientes (\muM) de péptido de referencia no marcado. Se calculó la inhibición de la unión y se mostró en relación a la cantidad de péptido de referencia no marcado usado.

\NAK4.2 Un ensayo de unión HLA clase I-péptido que mide la estabilidad de los complejos péptido-MHC en la superficie de células B humanas intactas

La afinidad de unión de los péptidos a moléculas MHC en el equilibrio es el resultado de la continua asociación y disociación del complejo trimolecular de péptido, molécula MHC de clase I y \beta2m. La velocidad de disociación de los péptidos unidos a MHC clase I no está influenciada por la presencia de péptidos competidores (23) ni por la concentración de los péptidos competidores (24). Por otra parte, la cantidad de sitios libres de unión MHC-péptido resulta influenciada y limitada por la velocidad de disociación del péptido previamente unido (24). Por lo tanto, un péptido con una baja velocidad de disociación formará probablemente, una vez unido, un complejo MHC-péptido estable en RE, será transportado a la superficie celular y persistirá allí durante un tiempo suficiente como para permitir el reconocimiento de las células T.

Con objeto de investigar la correlación entre estabilidad del complejo péptido-MHC e inmunogenicidad, hemos determinado la velocidad de disociación de un grupo de péptidos de unión a MHC clase I. Este ensayo mide la estabilidad de los complejos péptido-MHC en la superficie de células B homozigóticas para HLA intactas. La comparación de la correlación entre inmunogenicidad y afinidad de unión de péptidos por una parte y entre inmunogenicidad y la velocidad de disociación del péptido de las moléculas MHC de clase I por la otra ha mostrado que la inmunogenicidad guarda una mejor correlación con la velocidad de disociación que con la afinidad de unión de péptidos.

Como este ensayo de estabilidad de los complejos utiliza células B humanas intactas, comparte las ventajas descritas para el ensayo de afinidad de unión de péptidos (véase \NAK4.1).

Ejemplo 2 La inmunogenicidad de péptidos unidos a moléculas MHC de clase I guarda una buena correlación con la estabilidad del complejo MHC-péptido. Material y métodos Líneas celulares

Se cultivó la línea de células B transformadas con EBV: JY (tipo HLA: A*0201, B7, Cw7, DR4, DRw6, DPw2) en medio de cultivo completo consistente en la modificación alemana del RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, Escocia) suplementada con un 10% de FCS, antibióticos (100 UI/ml de penicilina (Brocades Pharma, Leiderdorp, Países Bajos) y 100 \mug/ml de kanamicina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y 20 \muM de 2-ME (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37ºC en aire humidificado que contenía un 5% de CO_{2}.

Las células Jurkat_A*0201K^{b} son transfectantes estables de la línea de leucemia de células T humana, Jurkat, que expresan el producto del gen quimérico HLA-A*0201K^{b} (25). Se cultivan en medio de cultivo completo en presencia de 200 \mug/ml de G418 sulfato.

Péptidos

Se sintetizaron péptidos por estrategias de fase sólida en un sintetizador de múltiples péptidos automatizado (Abimed AMS 422, Langenfeld, Alemania) usando química Fmoc. Se analizaron los péptidos por HPLC de fase invertida, se disolvieron en 20 \mul de DMSO, se diluyeron en NaCl al 0,9% hasta una concentración de péptidos de 5 mg/ml y se guardaron a -20ºC antes de su uso.

Se sintetizaron péptidos marcados con fluoresceína (FL) usados en el ensayo competitivo de unión a HLA clase I, se marcaron y se caracterizaron como se ha descrito anteriormente (3). La secuencia del péptido de referencia usado para HLA-A*0201 era FLPSDYFPSV (14), donde substituimos la tirosina con una cisteína para unir un grupo fluoresceína al péptido: FLPSDC(FL)FPSV (3).

Ratones transgénicos

Los ratones transgénicos HLA-A*0201K^{b} fueron gentilmente proporcionados por el Dr. L. Sherman (Scripps Laboratories, San Diego, EE.UU., a través del proveedor de animales Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, EE.UU.). Se mantuvo a los ratones en condiciones limpias convencionales. Los ratones transgénicos expresan el producto del gen quimérico HLA-A*0201K^{b}, en donde el dominio a3 de la cadena pesada se ha substituido por el correspondiente dominio murino H-2 K^{b} dejando inalterados los dominios HLA-A*0201 y a2 (25). Esto permite que la molécula CD8 murina en las células T CD8+ murinas interaccione con el dominio a3 singénico de la molécula híbrida MHC de clase I.

Inmunizaciones in vivo y cultivos de células T murinas

Se inyectaron grupos de 3-6 ratones transgénicos HLA-A*0201K^{b} subcutáneamente en la base de la cola con 100 \mug de péptido emulsionado en IFA en presencia de 140 \mug del epitopo de las células T "helper" derivado de antígeno nuclear de HBV restringido en H-21-A^{b} (128-140, secuencia TPPAYRPPNAPIL) (26). A los 11 días, se sacrificó a los ratones y se reestimularon las células del bazo (30x10^{6} células en 10 ml) in vitro con linfoblastos de células B estimuladas con LPS irradiadas singénicas (razón 3:1) y 1 \mug/ml de péptido en medio de cultivo completo en matraces T25 (Falcon, New Jersey, EE.UU.). El día 6 de cultivo, se estudió la citotoxicidad de estas masas en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cromo (^{51}Cr) de 5 horas.

Ensayo de citotoxicidad de ^{51}Cr

Se midió la actividad CTL en un ensayo estándar de liberación de cromo según se ha descrito previamente (27). Se sensibilizaron las células diana con 10 \mug/ml de péptido durante 30 minutos a 37ºC. Se añadieron las células diana a diversos números de células efectoras en un volumen final de 100 \mul de medio de cultivo completo en placas de microtitulación de fondo en U de 96 pocillos. Después de 5 horas de incubación a 37ºC, se recogieron los sobrenadantes. Se calculó el porcentaje medio de lisis específica de pocillos por triplicado como sigue:

% \ lisis \ espec\text{í}fica = ((liberación \ experimental-liberación \ espontánea)/(liberación \ máxima-liberación \ espontánea)) \ x \ 100

El porcentaje de lisis específica se expresa en UL30%/10^{6} células, en donde 1 UL30% corresponde al número de células efectoras necesarias para inducir un 30% de liberación de ^{51}Cr a partir de 2.000 células diana Jurkat A*0201/K^{b} durante un ensayo de 5 h.

"Liberación" del péptido por tratamiento con ácido débil y ensayo competitivo de unión HLA clase I-péptido

Véase el Ejemplo 1.

Medición de la estabilidad del complejo MHC-péptido a 37ºC

Se incubaron células JY a una concentración de 1-2 millones de células/ml con 10^{-4} M de emetina (Sigma, St. Louis, EE.UU.) durante 1 hora a 37ºC para detener la síntesis de proteínas y, por lo tanto, la emergencia de moléculas de clase I sintetizadas de novo en la superficie celular (20). Se lavaron las células dos veces con PBS y se liberaron de péptido (véase lo anterior). Se añadieron un millón de células a 200 \mug de péptido en 1 ml y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las células dos veces con IMDM helado y se resuspendieron en 1 ml de IMDM. A continuación, se incubaron las células durante 0, 2, 4 y 6 horas a 37ºC y luego se fijaron por resuspensión en PBA al 1% que contenía un 0,5% de paraformaldehído. Se analizaron las células por FACscan. Se calculó el índice de fluorescencia (IF) como IF = (fluorescencia media de la muestra - fluorescencia media del fondo)/fluorescencia media del fondo (sin péptido). Se estudiaron las muestras por duplicado y la variación entre ambas muestras era siempre menor del 10%.

Se calculó el porcentaje de moléculas HLA-A2 residuales equiparando para cada péptido el IF de t = 0 con el 100% y utilizando luego la fórmula: % restante = (IF_{t = n}/IF_{t = 0}) x 100%. Como la disociación de péptidos de MHC es un proceso lineal, se midió la estabilidad de los complejos péptido-MHC como el tiempo necesario para que decaigan el 50% de las moléculas (TD50%). Hemos utilizado t = 2 horas a 37ºC como punto de partida por la razón de que desde este punto temporal sólo se determinan los TD50% de péptidos que son capaces de formar complejos péptido-MHC estables.

Estadística

Utilizando la prueba de Fisher para 2 por 2 tablas (prueba exacta de 2 colas de Fisher), se correlacionó la velocidad de disociación (TD50%) de los péptidos a 37ºC con la inmunogenicidad de los péptidos. No se pudo correlacionar la afinidad de unión con la inmunogenicidad usando una prueba de Chi cuadrado debido al relativamente pequeño número de péptidos. Por lo tanto, comparamos los péptidos de unión de alta afinidad con los péptidos de unión de baja afinidad para establecer la correlación más fuerte entre afinidad e inmunogenicidad usando la prueba de Fisher para 2 por 2 tablas.

Resultados Estabilidad de las moléculas MHC de clase I acomplejadas con péptidos derivados de HBV o HPV16 de afinidad de unión e inmunogenicidad conocidas en ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}

Para estudiar la relación entre la disociación de péptidos unidos a moléculas MHC de clase I y su capacidad para inducir una respuesta CTL, utilizamos 9 péptidos derivados de la polimerasa (pol) de HBV y 8 péptidos de HPV16 cuya afinidad de unión relativa e inmunogenicidad en ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b} fueron descritas con anterioridad (6, 10, 29). Para mostrar que los 17 péptidos se unían realmente a HLA-A*0201, estudiamos su afinidad en un ensayo competitivo de unión a HLA-clase I previamente descrito (3). HBVpol-635, HPV16E7-11 y HPV16E7-86 se unían con una afinidad relativamente alta (< 5 \muM). Catorce péptidos se unían con afinidad intermedia (entre 5 y 15 \muM) o baja (> 15 \muM, Tabla I). Las afinidades de unión de los péptidos medidas y la clasificación de la afinidad de unión de los péptidos en alta, intermedia y baja son comparables a las afinidades y clasificaciones de Sette y col. (10) y Kast y col. (6).

Posteriormente al uso de un anticuerpo anti-HLA-A2 específico de conformación, se monitorizó la cantidad de complejos peptídicos HLA-A*0201 residuales en el tiempo. La pérdida de moléculas HLA-A*0201 estabilizadas con péptido en la superficie celular representa la disociación del péptido con respecto a la molécula de clase I a la que el péptido está unido. La estabilidad se presenta entonces por el tiempo necesario para que se destruyan un 50% de las moléculas (TD50%). Los tres péptidos de unión de alta afinidad y tres de los péptidos de unión de afinidad intermedia, HBVpol-996, HBVpol-1076 y HPV16E7-82 mostraron un TD50% de más de 3 horas (Tabla I). Los otros cuatro péptidos de afinidad intermedia, HBVpol-1344, HPV16E6-18, HPV16E6-52 y HPV16E7-7, mostraron un DT50% de entre 1 y 2 horas (Tabla I). Los péptidos de unión de baja afinidad mostraron un DT50% de 1 hora o menos. En la Tabla II, mostramos una comparación entre la velocidad de disociación, la afinidad de unión y la inmunogenicidad de estos péptidos. Todos los péptidos de unión de alta afinidad forman complejos MHC-péptido estables y son inmunogénicos, mientras que el grupo de péptidos de afinidad intermedia contiene péptidos que son inmunogénicos y forman complejos MHC-péptido estables o que no son inmunogénicos y no forman complejos MHC-péptido estables, como muestran sus altas velocidades de disociación (Tabla II).

Estabilidad de moléculas MHC de clase I acomplejadas con epitopos CTL humanos conocidos

Se estudiaron diecisiete péptidos de unión a HLA-A*0201 descritos anteriormente como inmunogénicos (por ejemplo, encontrados como epitopo CTL o capaces de inducir una respuesta primaria) (6, 12, 27, 30-40) en cuanto a su afinidad de unión a HLA-A*0201. Ocho péptidos se unían con alta afinidad, 7 péptidos se unían con afinidad intermedia y 2 péptidos se unían con baja afinidad (Tabla III). Las velocidades de disociación fueron determinadas y virtualmente todos los péptidos mostraron un DT50% > 4 horas, excepto los péptidos HPV11E7-4 y HIV-1pol-267. Los epitopos CTL HPV11E7-4 y HIV-1pol-267, ambos encontrados por inducción CTL primaria usando péptido sintético o células que expresan cantidades extremadamente altas de antígeno, se disociaban más rápidamente (DT50% > 2 horas; Tabla III). Es interesante el hecho de que la secuencia del péptido HCV1 core-131 [ADLMGYIPLV] no se corresponde con precisión con el motivo HLA-A*0201. El péptido HCVcore-132 que carece de la alanina N-terminal [DLMGYIPLV] se adapta mejor al motivo HLA-A*0201. Esto se refleja también en la mayor afinidad de este péptido más corto (CI_{50} = 5,0 \muM), pero el péptido se disocia dramáticamente más rápido (Fig. 1) que el péptido HCVcore-131.

La inmunogenicidad se correlaciona con la velocidad de disociación

Existe una correlación significativa entre la inmunogenicidad de un péptido y la velocidad de disociación. De los péptidos inmunogénicos con restricción HLA-A*0201 conocidos investigados, 21 de 23 mostraron un TD50% > 3 horas, mientras que ninguno de los 11 péptidos no inmunogénicos mostró un TD50% > 3 horas (p = 0000003, Tabla IV). Esta correlación es más estrecha que la que existe entre la afinidad de unión peptídica y la inmunogenicidad (p = 0,0005, Tabla IV) y confirma la tendencia visible en la Tabla II. Cuando se investigó la correlación entre inmunogenicidad y velocidad de disociación para péptidos que se unen con afinidad intermedia o baja, existía una correlación aún mayor (p = 0,00007, Tabla V) con la inmunogenicidad que con la afinidad (0 = 0,04). Esto implica que es probable que los péptidos que son procesados y transportados al retículo endoplásmico y que son capaces de formar complejos MHC-péptido estables sean epitopos CTL.

Inmunogenicidad en ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b} de péptidos derivados de HIV-1 con afinidad y velocidad de disociación conocidas

Para valorar la inmunogenicidad in vivo de los péptidos cuya afinidad de unión y velocidad de disociación fueron medidas, se vacunaron ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b} con dos péptidos de control (HPV16E7-86 y HBVcore-18; FLPSDDFPSV) y cuatro péptidos derivados de HIV-1 (Tabla VI). La derivación de estos ratones transgénicos (25) y su uso para analizar la inmunogenicidad in vivo han sido descritos con anterioridad (10, 29). El HIV-1pol-468 (ILKEPVHGV) es un epitopo CTL y se une con afinidad intermedia. El péptido HIV-1pol-267 (VLDVGDAYFSV) resultó ser inmunógeno en una inducción CTL primaria humana después de simulaciones repetidas con dosis relativamente altas de péptido (27). Para estudiar el valor predictivo de la estabilidad de los complejos MHC-péptido medida in vitro, determinamos la afinidad de unión y la velocidad de disociación de los otros dos péptidos HIV-1pol (HIV-1pol-343, YMDDLYVGSDL, y HIV-1pol-576 LLWKGEGAV) (Tabla VI). Se detectaron ambos péptidos cuando se estudiaron las regiones altamente conservadas de HIV-1pol en cuanto a aminoácidos en ratones con todos los péptidos. El conjunto de CTL derivados de ratones vacunados con los péptidos de control lisaban específicamente las células Jurkat A*0201/K^{b} sensibilizadas con péptido (Fig. 2, Tabla VI). Tal como se esperaba, todos los péptidos con una baja velocidad de disociación producían una respuesta CTL (Fig. 2, Tabla VI), mientras que los dos péptidos con velocidades de disociación relativamente altas no inducían una respuesta CTL (Fig. 2, Tabla VI). Así, se predijo perfectamente la inmunogenicidad de estos péptidos gracias a sus velocidades de disociación.

Comentarios

Este ejemplo muestra que la medición de la estabilidad del complejo MHC-péptido es altamente valiosa al identificar epitopos potenciales de células T. Los péptidos inmunogénicos recién definidos formaban complejos MHC-péptido relativamente estables, tal como muestran sus bajas velocidades de disociación, mientras que los péptidos no inmunogénicos mostraban altas velocidades de disociación. Más aún, vimos que la inmunogenicidad de los péptidos derivados de HIV-1 puede ser predicha con mayor exactitud por su velocidad de disociación que por la afinidad de unión a MHC de clase I. Encontramos una correlación más estrecha entre la velocidad de disociación de un péptido y la inmunogenicidad (p = 0000003) que entre la afinidad de unión y la inmunogenicidad (p = 0,0005). Se consigue la mayor correlación en el grupo de péptidos que se unen con afinidad intermedia o baja. En conclusión, la selección de péptidos en base a la afinidad y a sus velocidades de disociación conduce a una identificación más precisa de epitopos CTL candidatos que la selección basada sólo en la afinidad.

Obsérvese que este ensayo requiere MAbs (anticuerpos monoclonales) específicos del tipo HLA que pueden discriminar entre moléculas vacías y cargadas de péptido. Aunque se dispone actualmente de dichos Abs para HLA-A*0201 y -A*0301, se necesita identificar o aislar Abs adicionales para definir la estabilidad de los complejos de péptido-MHC en el contexto de otras moléculas HLA de clase I. Las aproximaciones para aislar dichos Abs incluyen:

\text{*} Estudio de Abs disponibles (ATCC, otros laboratorios) en cuanto a las características deseadas).

\text{*} Selección de Abs apropiados frente a una línea de células B humanas que expresan la molécula HLA relevante a partir de una librería de exhibición de anticuerpos de fago sintética (en colaboración con el Dr. T. Lochtenberg, University Hospital Utrecht, Países Bajos, (41)).

\text{*} Generación de Abs monoclonales o selección de anticuerpos de fago frente a moléculas MHC cargadas con péptido purificadas (6).

Leyendas de las figuras. Ejemplo 2 Figura 6 Afinidad de unión y velocidad de disociación del péptido HCV1core-131 y la variante más corta sin la alanina N-terminal

Se estudió la afinidad de unión (izquierda) y la velocidad de disociación (derecha) del epitopo CTL restringido en HLA-A*0201 HCV1core-131 [símbolos rellenos, ADLMGYIPLV] (31) y de la variante más corta [símbolos en blanco, DLMGYIPLV], que se corresponde con más precisión al motivo HLA-A*0201, (véase material y métodos). A la izquierda se muestra la inhibición media del péptido de referencia a cada concentración del péptido competidor, obtenida en dos experimentos independientes. La figura de la derecha muestra el porcentaje de moléculas de péptido-MHC residuales para ambos péptidos en cada punto temporal (media de dos experimentos independientes). Se estableció el porcentaje de moléculas presentes a t = 2 horas en el 100%. Las líneas son el resultado de un análisis de regresión lineal.

Figura 7 Citotoxicidad específica de péptidos inducida por vacunación de ratones transgénicos HLA-A*0201K^{b}

Un experimento representativo, en el que se vacunaron ratones transgénicos HLA-A*0201K^{b} con el péptido indicado que exhibía una baja velocidad de disociación (A,B,E) o una alta velocidad de disociación (C,D), en combinación con un epitopo "T helper" codificado por HBV core en IFA (véase material y métodos). Se estudiaron cultivos CTL en masa derivados de células de bazo de estos ratones en cuanto a la especificidad peptídica en ensayos de citotoxicidad en células diana Jurkat A*0201K^{b} pulsadas con (símbolos en blanco) o sin (símbolos rellenos) péptido específico. Se muestra la lisis específica media de la totalidad de los CTL de 3-6 animales, indicando la desviación estándar. La lisis específica está representada a una razón E/T que varía entre 1,5 y 100.

Ejemplo 3 Identificación de péptidos inmunogénicos asociados a melanoma usando un ensayo que mide la estabilidad del complejo MHC-péptido Materiales y métodos

La mayor parte de los procedimientos han sido descritos en los Ejemplos 1 y 2. La inducción de CTL estimulando linfocitos T humanos con células dendríticas ("DC") cargadas de péptido fue realizada como sigue: Se aislaron fracciones de monocitos de sangre periférica humana ("PBMC") enriquecidos en monocitos por adherencia a plástico de los PBMC totales de donantes sanos con subtipificación HLA-A*0201. Se cultivaron las células adherentes durante 5-7 días con RPMI/L-glutamina/antibióticos/10% de FCS o 10% de suero humano ("HS") y 500 U/ml de rHuIL-4 y 800 U/ml de rHuGM-CSF. Se repuso el medio de cultivo con citokinas cada dos días. Se trataron los cultivos durante 24 h con 50 U/ml de rHuIL-1a y 200 U/ml de g-IFN y se pulsaron con 50 \mug/ml de péptido en RPMI/L-glutamina/antibióticos/1% de FCS durante 4 h. Se irradiaron los estimuladores pulsados con péptido (2.500 Rads) y se lavaron dos veces. En cada pocillo de una placa de 24 pocillos, se dispensó 1 ml de RPMI/L-glutamina/antibióticos/5% de HS que contenía 1-2x10^{4}/ml de células estimuladoras.

Se enriquecieron las células respondedoras autólogas en cuanto a células T (CD8+) por adherencia a placas de plástico, seguido de depleción de las células CD4+ usando Dynabeads (Dynal, Olso, Noruega). Se mezcló el total de respondedoras PBMC con las células no adherentes enriquecidas en CD8 para llevar la población respondedora final a aproximadamente un 10% de células T CD4+. Se mezclaron los respondedoras con estimuladores en una razón de 1:10 a 1:20 a un total de 2x10^{6} respondedoras por pocillo. Se añadió rHuIL-7 a 5 ng/ml. Se repuso el medio + rHuIL-7 después de 7 días. El día 12, se reestimularon las respondedoras con PBMC adherentes pulsados con péptidos autólogos (según se ha descrito previamente (42)). Se añadió rHuIL-2 a una concentración final de 120 UI/ml. De forma similar, se reestimularon los cultivos CTL semanalmente. Se subclonaron los cultivos CTL en placas de 96 pocillos de fondo en U por dilución limitante usando la línea celular de melanoma FM3 que expresa HLA-A*0201+, MelanA/MART-1 (5.000/pocillo (43)) y una mezcla de PBMC alogénicos de seis donantes (100.000/pocillo) y tres HLA-A*0201+ B-LCL (5.000/pocillo) en RPMI/L-glutamina/antibióticos/5% HS + 120 UI/ml de rHuIL-2. Los clones fueron reestimulados semanalmente.

Resultados

Se estudió el antígeno de melanoma Melan-A/MART-1 en cuanto a la presencia de epitopos CTL de unión a HLA-A*0201 potenciales usando tres ensayos de unión de péptidos: el ensayo de unión a T2 (2), un ensayo de unión que utiliza moléculas HLA-A*0201 sobre células B humanas intactas (véase el Ejemplo 1) y un ensayo que mide la estabilidad de los complejos MHC-péptido (véase el Ejemplo 2). La comparación de los datos de unión (véase la Tabla IX) muestra que el péptido nonamérico AAGIGILTV, que representa un epitopo peptídico inmunodominante previamente descrito presentado por las células de melanoma positivas a HLA-A*0201 (44), se une pobremente a las células T2 y sólo muestra una unión modesta a HLA-A*0201 en células B humanas intactas. La variante 10-mérica de este péptido (EAAGIGILTV), sin embargo, muestra una considerable unión a HLA-A*0201 en ambos ensayos de unión. Paradójicamente, la comparación de estos dos péptidos con respecto a la estabilidad de los complejos péptido-MHC muestra que el péptido 9-mérico, cuando se une a HLA-A*0201, forma complejos péptido-MHC estables, mientras que los complejos con el péptido 10-mérico son inestables.

Se produjo inmunidad CTL específica de péptido in vitro estimulando linfocitos de sangre periférica de donantes sanos positivos para a HLA-A*0201 con células dendríticas autólogas, que fueron cargadas con cualquiera de los dos péptidos. Se estudió la reactividad de los CTL resultantes frente a células T2 cargadas con los péptidos relevantes, así como frente a células de melanoma humano HLA-A*0201- y MART-1 positivas. Estos experimentos demostraron claramente que la actividad CTL específica de tumores que reaccionaba tanto frente a células T2 cargadas con péptido como frente a células de melanoma se obtenía solamente después de estimulación de los linfocitos donantes con el péptido 9-mero AAGIGILTV (estos experimentos serán descritos en alguna otra parte; Van den Elsas y col., manuscrito en preparación). Estos datos demuestran claramente que la inmunogenicidad de un epitopo peptídico guarda una fuerte correlación con la estabilidad del correspondiente complejo péptido-MHC, mientras que la unión a MHC de un péptido medida sobre células T2 o células B intactas no asegura que este péptido (i) forme complejos MHC-péptido estables y (ii) resulte mostrar inmunogénicamente una unión fuerte y estable a HLA-A*0201 en los tres ensayos (véase la Tabla IX). También frente a estos dos péptidos se pudieron producir CTL que reaccionaban tanto frente a células T2 cargadas con péptidos como frente a células de melanoma HLA-A*0201-/MART-1 positivas (Van den Elsas y col., manuscrito en preparación).

Tomados en conjunto, estos resultados muestran que la selección de péptidos inmunogénicos basados en la estabilidad del complejo MHC-péptido es una valiosa herramienta en la identificación de epitopos de células T asociados a tumores.

\NAK4.3 Identificación de péptidos inmunógenos

La presente invención proporciona una nueva técnica para identificar péptidos de unión a MHC que pueden servir como blanco para una respuesta inmunoterapéutica de células T. Este método será aplicado junto con otras etapas de selección (véase \NAK1) para estudiar la secuencia primaria de proteínas que se expresan, por ejemplo, por tumores para péptidos que tienen probabilidad de ser procesados y presentados por las células tumorales y que constituirán un blanco inmunogénico para el sistema inmune de células T.

En nuestros estudios, se incluyen epitopos peptídicos derivados de los siguientes antígenos:

\text{*} Proteína E6 del virus del papiloma humano tipo 16 y 18 (HPV16, HPV18).

\text{*} Proteína E7 del virus del papiloma humano tipo 16 y 18 (HPV16, HPV18).

\text{*} Proteínas Gag, Pol y Env del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV).

\text{*} Antígeno de melanoma humano MAGE-2.

\text{*} Antígeno de melanoma humano tirosinasa.

\text{*} Antígeno de melanoma Melan-A/MART-1.

\text{*} Oncoproteína humana p21Ras.

\text{*} Oncoproteína humana p53.

\text{*} Antígeno carcinoembrionario ("CEA") humano.

\text{*} Molécula de adhesión de células epiteliales ("EpCAM") humanas.

\text{*} Proteína específica de células B humanas CD19.

\text{*} Proteína específica de células B humanas CD20.

\text{*} Glicoproteína de la superficie celular CD44.

\text{*} Los dominios variables de inmunoglobulinas (Ig) de las cadenas pesadas y ligeras de Ig expresadas por linfomas de células B.

Las secuencias de las proteínas antes mencionadas son estudiadas en cuanto a péptidos que tienen probabilidad de representar epitopos de células T inmunogénicos en el contexto de las siguientes moléculas HLA de clase I:

\text{*} HLA-A*0101

\text{*} HLA-A*0201

\text{*} HLA-A*0301

\text{*} HLA-A*1101

\text{*} HLA-A*2401

\text{*} HLA-B7

\NAK 4.4 Lista de péptidos estudiados en un ensayo de estabilidad por haber pasado por los procedimientos de preselección

Tal como se ilustra en \NAK 4.3 Ejemplos 2 y 3, la selección de péptidos inmunogénicos mejora grandemente en exactitud cuando se estudian los péptidos no sólo en cuanto a la unión a las moléculas MHC en cuestión, sino también en cuanto a la estabilidad de los complejos péptido-MHC resultantes. En publicaciones previas, hemos descrito múltiples péptidos inmunogénicos potenciales derivados de varios antígenos (por ejemplo, tumorales). Estos péptidos fueron seleccionados en base a un procedimiento de dos etapas, consistente en (i) predicción por ordenador y (ii) ensayos de unión que no tienen en cuenta la estabilidad de los complejos péptido-MHC. El experto en la técnica puede ahora aplicar, así también validar, nuestro nuevo ensayo para medir la estabilidad de los complejos péptido-MHC con respecto a estos péptidos. Se da una lista de estos péptidos en las Tablas X-XX.

\NAK 4.5 Vacunación con adenovirus recombinantes que albergan varios epitopos de células T definidos en constructos de perlas encadenadas

Se puede inducir inmunidad mediada por células T hacia virus o tumores de dos maneras: pasiva, por transferencia de células T específicas de virus o de tumores, o activa, por exposición a antígeno. En el último caso, se puede dar el antígeno al hospedador de muchas formas diferentes, que van desde virus completos atenuados o células tumorales hasta proteínas aisladas. En virtualmente todos estos casos, las vacunas no están diseñadas de un modo racional, en el sentido de que se conozcan los epitopos de células T esenciales mínimos. Por lo tanto, la inmunización en estos casos puede no conducir siempre al efecto deseado. Por ejemplo, la inmunización con virus atenuados, como vaccinia, puede inducir efectos colaterales no deseados o dar lugar a inmunidad de células T hacia epitopos que están sometidos a variación antigénica por el virus de tipo salvaje. Igualmente, la inmunización con una sola proteína puede ser ineficaz, ya que puede inducir sólo respuesta de las células T hacia los epitopos de células T inmunodominantes, sin inducir respuestas de células T hacia otros epitopos de células T subdominantes, o puede no contener suficientes epitopos CTL para cubrir toda la población objeto. En parte, estos inconvenientes pueden ser solucionados explotando otras estrategias de vacunación.

Actualmente, se están desarrollando estrategias de vacunación que utilizan virus recombinantes que expresan los antígenos de elección. En el caso del desarrollo de vacunas antitumorales, varios antígenos asociados a tumores, como MART1 y gp100, son buenos candidatos para la incorporación en un vector vírico recombinante. Sin embargo, la administración de genes enteros codificantes de antígenos asociados a tumores por vectores víricos recombinantes como forma de evocar inmunidad antitumoral podría no ser segura cuando estos antígenos asociados a tumores se hallan implicados en la carcinogénesis. Por ejemplo, las vacunas de vectores víricos para el tratamiento y la prevención del carcinoma cervical positivo a HPV16 son intrínsecamente peligrosas si tales vacunas contienen los oncogenes del virus del papiloma humano de tipo 16 (HPV16) E6 y E7 funcionales. Esto mismo es cierto cuando el vector vírico codifica para la oncoproteína HER2/neu, la kinasa 4 dependiente de cíclica, las proteínas de fusión aberrantes BCR-ABL o las proteínas Ras y p53 mutadas, ya que estos genes están implicados en el desarrollo del cáncer. De igual modo, la incorporación de los genes pertenecientes a la familia de antígenos asociados a tumores MAGE, GAGE o BAGE en vectores víricos debería ser evitada, ya que su función no ha sido hasta ahora identificada. Sin embargo, introduciendo sólo las secuencias que codifican para epitopos de células T derivados de dichos antígenos asociados a tumores en vectores víricos recombinantes, tendría que ser factible dirigir la respuesta inmune hacia esos objetivos sin introducir riesgos potenciales, como la transformación de células somáticas infectadas con vectores.

Recientemente, se han publicado estudios que describen el uso satisfactorio de una vacuna de vaccinia recombinante que expresa varios epitopos CTL a modo de perlas encadenadas en ratones (48), (49). Estos estudios muestran la potencia del uso de vacunas de perlas encadenadas para la inducción de inmunidad antivírica y antitumoral. Sin embargo, debido a los riesgos potenciales asociados a vaccinia y a la menor o ausente (en individuos más jóvenes) inmunidad hacia poxvirus debido a la abolición del programa de vacunación con poxvirus, no se pueden usar vacunas de vaccinia recombinante en humanos. Más aún, en estos estudios, los epitopos CTL estaban directamente unidos entre sí y no contenían secuencias espaciadoras que dirigieran el procesamiento eficiente y preciso y la presentación de los epitopos CTL. Por estas razones, rAd, que alberga varios epitopos CTL a modo de perlas encadenadas con sitios de escisión proteolítica entre los epitopos CTL, lo que conduce al óptimo procesamiento y presentación de los epitopos CTL incorporados, inducirá respuestas CTL más fuertes sin inducir efectos colaterales perjudiciales.

Se han usado adenovirus recombinantes, que albergan antígenos asociados a tumores completos, para inducir inmunidad protectora antitumoral (50-52), (53, 54), lo que ilustra la posibilidad de usar rAd para la inducción de inmunidad protectora específica de tumores.

Por incorporación de minigenes que contienen múltiples epitopos de células T y sitios de escisión proteolítica entre estos epitopos de células T en un rAd, hemos desarrollado ahora un método nuevo e innovador para la inducción de respuestas protectores de células T frente a virus y tumores.

Ejemplo 4 Un rAd que expresa varios epitopos CTL definidos a modo de perlas encadenadas induce inmunidad protectora antitumoral. Materiales y métodos Líneas celulares

Se mantuvieron células embrionarias de ratón ("MEC"), MEC transformadas con Ad5E1, Ad5E1 + MEC transformadas con rac, MEC transformadas con HPV16 y células COS en medio de Dulbecco modificado de Iscove (Biocrom KG, Seromed, Berlín, Alemania) suplementado con un 4% de FCS (Hyclone Laboratories, Logan, Utah), penicilina (110 UI/ml, Brocades Pharma, Leiderdorp, Países Bajos) y 2-mercaptoetanol (20 \muM) a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}. Se cultivaron los clones CTL como se ha descrito en algún otro lado (55, 56), (1057). Se hizo crecer al clon CTL restringido en HLA-A*0201 específico para la matriz de la influenza sobre líneas de células B transformadas con EBV positivas a HLA-A*0201 irradiadas con 30 Gy en RPMI. 911 células crecieron como se ha descrito en (58).

Generación de rAd

Se insertaron el minigén 1 o el minigén 2 (véase la Fig. 8) en el vector lanzadera pMad5. El pMAd5 (R. Hoeben, sin publicar) fue derivado de pMLP10 (73) a través de las siguientes etapas: (i) deleción del fragmento SalI/BamHI, (ii) inserción de una secuencia poliligante (ClaI, MluI, SnaBI, SpeI, AsuII, MunI) en el sitio único Hind III, directamente aguas abajo del promotor tardío mayor Ad5 (MLP) y de las secuencias líder tripartitas Ad2, (iii) inserción en el sitio MunI de un fragmento BglII/XhoI del genoma Ad5, que permite la recombinación homóloga de las secuencias pMad5 con secuencias de pJM17 (véase a continuación). La inserción de los minigenes 1 y 2 fue realizada en dos etapas. Primeramente, se escindió pMad5 con enzimas SpeI y MluI y se desfosforilaron los extremos 5'. Se ligaron los oligonucleótidos de doble hebra hibridados y fosforilados 1a/b y 2a/b (véase la Tabla A) en este vector, lo que dio lugar a un pequeño marco abierto de lectura consistente en una metionina, un espaciador con la secuencia NASYATS y la secuencia c-myc humana SEQKLISEEDLNN. Esta última secuencia corresponde a un epitopo que puede ser reconocido por el anticuerpo monoclonal apropiado (74). Como resultado de la estrategia de clonación, se destruyeron los sitios SpeI y MluI originales de pMad5, mientras que se crearon nuevos sitios SpeI y MluI entre el codon de iniciación y la secuencia codificante del epitopo c-myc. En una segunda etapa de clonación, se insertaron las secuencias codificantes de los epitopos CTL en la cassette. Se escindió el vector cassette con enzimas SpeI y MluI y se ligaron los oligonucleótidos de doble hebra hibridados y no fosforilados 3a/b y 4a/b en el vector abierto (minigén 1). Alternativamente, se ligaron los oligonucleótidos de doble hebra hibridados y no fosforilados 5a/b y 4a/b en el vector abierto (minigén 2). A continuación, se extrajeron los oligonucleótidos no ligados de la mezcla de ligación por purificación en columna Sephacryl 400. Se añadió el ADN eluido a una reacción de ligación que contenía los oligonucleótidos de doble hebra hibridados y fosforilados 6a/b y 7a/b (minigén 1) o los oligonucleótidos de doble hebra fosforilados 8a/b y 9a/b (minigén 2). Como resultado, se obtuvieron dos plásmidos derivados de pMad5 (pMad5-1, pMad5-2) que codificaban para las proteínas recombinantes representadas en la Fig. 8. Se construyeron los rAd por transfección de la línea celular 911 positiva a Ad5E1 (58) con el plásmido pMad5-1 o con el pMad5-2 junto con el plásmido pJM17, que contiene la secuencia del mutante Ad5 d1309 (59). Se cotransfectaron 911 células con 10 \mug del plásmido pMad5-1 linealizado, respectivamente pMad5-2 y 10 \mug del plásmido pJM17. Los rAd resultantes, que surgieron de la recombinación homóloga entre pMAd5 y pJM17, fueron purificados 3 veces por placa y posteriormente propagados en 911 células, purificados por doble centrifugación por densidad con cloruro de cesio y dializados extensamente. Se comprobó rutinariamente la presencia de reversiones por infección de células HEP-G2. Se guardaron los stocks víricos en alícuotas con un 10% de glicerol a -80ºC y se titularon por ensayo de placa usando 911 células.

Transfección de células COS-7

Se realizó una transfección transitoria en células COS-7 según se ha descrito en algún otro lado (60). Resumiendo, se transfectaron 100 ng de plásmidos codificantes de Ad5E1, HPV16 E7, p53 murino o la proteína de la matriz de la influenza junto con 100 ng de un plásmido codificante de H-2D^{b}, H-2Kb o HLA-A*0201 por el método de DEAE-dextrano-cloroquina en 1x10^{4} células COS-7. Se incubaron las células COS transfectadas en 100 \mul de medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía un 8% de FCS durante 48 h a 37ºC, después de lo cual se añadieron 1.500-500 CTL en 25 \mul de medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía 50 Unidades Cetus de interleukina-2 recombinante (rIL-2, Cetus Corp., Emeryville, CA, EE.UU.). A las 24 h, se recogió el sobrenadante y se determinó su contenido en factor de necrosis tumoral ("TNF") midiendo su efecto citotóxico en células WEHI-164 clon 13 como se ha descrito con anterioridad (60).

Infección de MEC con rAd

Se infectaron MEC B6 con rAd diluido en 1 ml de medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía un 0,5% de seroalbúmina bovina. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía un 10% de FCS. Se escogió una multiplicidad de infección ("MOI") (para MEC B6, se usó un mol de 50) que diera al menos un 80% de células infectadas. Se determinó esto por infección con Ad.RSV\beta-Gal portador del gen LacZ de Escherichia coli, codificante de \beta-galactosidasa bajo el control del promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, seguido de tinción con X-gal 48 horas más tarde.

Generación de cultivos en masa de CTL

Se cocultivaron 5x10^{6} células esplénicas por pocillo, derivadas de ratones B6 y recogidas 2 semanas o más antes de la inmunización intraperitoneal con 1x10^{8} unidades formadoras de placa ("PFU") de rAd o del mutante Ad5 defectivo en replicación Ad5 ts 149 durante 6 días con un 10% de células estimuladoras tratadas con IFN-\gamma (10 unidades/ml) irradiadas (25 Gy) en placas de 24 pocillos. A continuación, se recogieron las células efectoras y se retiraron las células muertas por centrifugación de densidad sobre Lympholyte M. Se usaron estas células en un ensayo de citotoxicidad de linfocitos mediada por células.

Citotoxicidad de linfocitos mediada por células

Se realizaron los procedimientos experimentales para medir la citotoxicidad mediada por células en un ensayo de liberación de Europio (Eu^{3+}) según se ha descrito en algún otro lado (56). Resumiendo, se añadieron números variables de células efectoras a 10^{3} células diana marcadas con Eu^{3+} en 0,15 ml de medio de cultivo en placas de 96 pocillos de fondo en U. Después de 4 horas de incubación a 37ºC, se recogieron los sobrenadantes y se mezclaron con Enhancer Solution® (Wallac, Turku, Finlandia). La medición de las muestras tuvo lugar en un fluorómetro 1234 Deifia® (Wallac). Se calculó el porcentaje medio de lisis específica de pocillos por triplicado como sigue:

% \ Lisis \ espec\text{í}fica = [(cpm \ liberación \ experimental - cpm \ liberación \ espontánea)/(cpm \ liberación \ máxima - cpm \ liberación \ espontánea)] \ x \ 100

Péptidos

Se generaron péptidos por estrategias de fase sólida en un sintetizador de múltiples péptidos (Abimed AMS 422) como se ha descrito con anterioridad (61).

Inoculación de células tumorales

Se inmunizaron ratones C57BL/6 intraperitonealmente con 1x10^{8} unidades formadoras de placa (PFU) de rAd o del mutante Ad5 defectivo en replicación Ad5 ts 149 en 0,25 ml de PBS/BSA. Dos semanas después, se inoculó a los ratones subcutáneamente con 0,4x10^{6} células Ad5E1A + ras en 0,25 ml de PBS. Se midieron los volúmenes tumorales con un calibre. Se sacrificó a los animales cuando sus tumores crecieron más de 1.000 mm^{3} para evitar un sufrimiento innecesario.

Resultados Inserción de las secuencias codificantes de varios epitopos CTL en pMad5

La vacunación con virus recombinantes codificantes de oncoproteínas intactas es intrínsecamente peligrosa, ya que puede dar lugar a transformación de las células infectadas con los virus recombinantes. Por lo tanto, nos dispusimos a montar dos minigenes codificantes de varios epitopos CTL diferentes, los cuales fueron clonados por detrás del promotor tardío mayor del vector pMad5. Como nos dispusimos a estudiar si se podían usar rAd que expresaban varios epitopos CTL a modo de perlas encadenadas con fines de vacunación, los epitopos CTL usados para la construcción del minigén fueron seleccionados en base a la disponibilidad de clones CTL reconocedores de epitopos CTL y/o de células tumorales que expresan los epitopos CTL. En base al conocimiento actual del procesamiento y la presentación de antígenos, se separaron los epitopos CTL entre sí por un espaciador de tres alaninas. La incorporación del sitio de escisión proteolítica de tres alaninas asegura que los epitopos CTL codificados sean apropiadamente procesados (62). La disponibilidad de los clones CTL reconocedores del epitopo CTL codificado por el minigén es importante para determinar si el minigén es traducido y si los epitopos CTL codificados se presentan en el contexto de la molécula MHC de clase I apropiada. De igual modo, los modelos tumorales murinos de los que se dispone pueden ser usados como lectura para determinar si los rAd construidos son capaces, tras la vacunación, de inducir inmunidad anticancerosa mediada por CTL respectivamente terapéutica protectora.

En base a estas consideraciones, generamos dos adenovirus recombinantes codificantes de dos minigenes sintéticos (Fig. 8). Los minigenes sintéticos codificantes de los epitopos CTL representados en la figura 8 fueron clonados en el plásmido pMad5 según se ha descrito en la sección de materiales y métodos. Todos los epitopos CTL codificados por pMad5-1 y dos de los cuatro epitopos CTL codificados por pMad-2 mostraron ser procesados y presentados por CTL específicos de tumores, como muestran los experimentos de transfección transitoria (Fig. 9 y Fig. 10). El procesamiento y la presentación de los epitopos CTL derivados de HPV16 y restringidos en HLA-A2 incorporados en pMad5-2 no pudieron ser estudiados debido a que no se dispone actualmente de clones CTL específicos para estos péptidos. No obstante, nuestros datos indican que estos péptidos se expresan y muy probablemente se procesan, ya que el último epitopo CTL (derivado de Ad5E1B) en el constructo se traduce, procesa y presenta a CTL específicos de Ad5E1B. Por lo tanto, concluimos que todos los epitopos CTL codificados por pMad5-1 y pMad5-2 son traducidos, procesados y presentados a los clones CTL.

Como la introducción de los minigenes en células da lugar a presentación de los epitopos CTL deseados en el contexto de las moléculas de restricción MHC apropiadas, los plásmidos pMad5-1 y pMad5-2 que albergan el minigén 1 ó 2 han sido usados para generar rAd defectivos en replicación.

Los epitopos CTL codificados por los rAd construidos son procesados y presentados a CTL específicos de tumores

Con objeto de analizar si los rAD generados son capaces, tras la infección, de activar clones CTL específicos de tumores, se infectaron MEC B6 con los rAd construidos. Estas MEC infectadas con rAd fueron usadas como células estimuladoras en un ensayo de activación de células T usando la producción de TNF como lectura. Por razones de conveniencia, enfocamos estos experimentos hacia los epitopos CTL codificados por H-2^{b} derivados de virus. Tras la infección con el rAd codificante del minigén 1 (rAd-1), los epitopos derivados de CTL Ad5E1A, HPV16E7 y Ad5E1B son presentados a los CTL apropiados, ya que estos CTL se activaban cuando se incubaban con MEC B6 infectadas con el virus, pero no cuando se incubaban con MEC B6 infectadas con un rAd control (Fig. 11). Mediante la infección de MEC derivadas de ratones "knock-out" en p53, pudimos demostrar que también el epitopo CTL derivado de p53 se procesaba eficientemente y se presentaba a CTL específicos de p53 (datos no mostrados). De igual modo, el rAd codificante del minigén 2 (rAd-2) es capaz de procurar el epitopo CTL derivado de Ad5E1B, ya que la infección de MEC B5 con este virus conduce a activación de CTL específicos de Ad5E1B (Fig. 11). Así, los rAd construidos son capaces de procurar todos los epitopos CTL preseleccionados a CTL específicos de tumores.

5. La vacunación de ratones B6 con rAd induce actividad CTL reactivos con tumores

Dado que los rAd son capaces de procurar los tres epitopos CTL víricos restringidos en H-2, hemos analizado si la vacunación con estos virus induce actividad CTL frente a estos epitopos CTL. Ciertamente, los cultivos en masa de CTL derivados de ratones B6 inmunizados con el rAd-1 muestran una alta actividad CTL contra los epitopos CTL codificados por Ad5E1A, HPV16 E7 y Ad5E1B (Fig. 12 y Fig. 13). Más aún, estos cultivos en masa de CTL también lisan las células tumorales que llevan los epitopos CTL relevantes, lo que muestra que los CTL inducidos exhiben una fuerte actividad antitumoral. De forma similar, la vacunación de ratones B6 con rAd-2 inducía actividad CTL específica de Ad5E1B, que tenía reacción cruzada sobre células tumorales que expresan Ad5E1B (Fig. 12). Tomados en conjunto, estos datos muestran que los rAd que albergan minigenes sintéticos codificantes de diversos epitopos CTL a modo de perlas encadenadas son capaces de inducir, tras la vacunación, fuertes respuestas CTL específicas de tumores frente a los epitopos CTL de elección.

La inmunización con rAd-1 induce inmunidad protectora frente a una inoculación con células tumorales transformadas con Ad5E1A + ras

Los datos antes descritos muestran que la inmunización con rAd-1 o rAd-2 induce una fuerte actividad CTL reactivos con tumores contra todos los epitopos CTL estudiados. Para estudiar si los ratones vacunados con rAd están también protegidos frente a una inoculación letal con células tumorales, inoculamos a estos ratones con células tumorales transformadas por la región Ad5E1A y un oncogén ras activado (53). Estas células tumorales sólo expresan el epitopo CTL codificado por Ad5E1A y se anticipa, por lo tanto, que sólo rAd-1, pero no rAd-2, es capaz de inducir inmunidad protectora frente a este tumor tras la vacunación. Ciertamente, los ratones inmunizados con rAd-1, pero no los ratones inmunizados con rAd-2 o PBS/BSA sólo, estaban protegidos frente al sobrecrecimiento de células tumorales que expresan Ad5E1A + ras (Fig. 14). Más aún, la protección inducida por la vacunación con rAd-1 es mejor que la obtenida por vacunación con células tumorales irradiadas, lo que muestra que la vacunación con rAd es superior en comparación con otros regímenes de vacunación. Así, la vacunación con rAd que alberga diversos epitopos CTL unidos a un sitio de escisión proteolítica es una forma poderosa de inducir inmunidad protectora dirigida contra epitopos de células T preseleccionados de elección.

Comentarios

Este ejemplo muestra que los rAd codificantes de epitopos CTL definidos a modo de perlas encadenadas, donde los epitopos CTL están unidos entre sí por secuencias que aseguran un procesamiento y una presentación eficientes de los epitopos CTL, son muy potentes para inducir respuestas CTL protectoras frente a tumores. Todos los epitopos CTL codificados por los rAd fueron procesados y presentados a CTL específicos de tumores y de virus, lo que ilustra que se pueden administrar múltiples epitopos CTL al hospedador mediante una sola vacunación, dando lugar a respuestas CTL potentes y protectoras. Los rAd son fáciles de fabricar y no causan efectos colaterales cuando se usan para vacunación, contrariamente a otros vehículos, como vaccinia. Por lo tanto, este método de vacunación es muy efectivo y seguro y está siendo actualmente utilizado para administrar otros epitopos CTL descritos en esta invención.

Ejemplo 5

Del mismo modo que como se ha descrito en el Ejemplo 4, se preparará una vacuna en la que se incorporan los epitopos CTL descritos en las Tablas X-XX. La vacuna es preparada con las siguientes características:

a. la vacuna contiene varios epitopos de células T unidos entre sí por un espaciador,

b. los espaciadores contienen sitios de escisión proteolítica,

c. el epitopo de células T que contiene constructo es administrado mediante un adenovirus recombinante o es incorporado a los tipos de vacuna descritos en los puntos iii-vii en la página 3.

Se prepara una vacuna para melanoma que alberga los péptidos mencionados en la Tabla XI; se prepara una vacuna para el carcinoma de colon que alberga los péptidos mencionados en las Tablas XII y XX; se prepara una vacuna para el carcinoma cervical que alberga los péptidos mencionados en las Tablas XIII-XVI, y se prepara una vacuna para el HIV que alberga los péptidos mencionados en la Tabla XIX. Cuando sea apropiado, se incorporan epitopos peptídicos de células T distintos de los enlistados en las Tablas X-XX en estas vacunas multiepitópicas. Los epitopos de células T presentes en estas vacunas están unidos entre sí por los siguientes sitios de escisión proteolítica (o parte de estos sitios de escisión proteolítica):

AAA como se describe en (62);

QGW*FEG, WFE*GLF, FEG*LFN, FTT*LIS, TTL*IST, TLI*STI, FNK*SPW, EGL*FNK, TTL*IST, TLI*STI, FNR*SPW como se describe en (63);

VSG*LEQ, SII*NFE, INF*EKL, LTE*WTS, IIN*FEK, GLE*QLE, EQL*ESI;

NFE*KLT, QLE*SII, EKL*TEW, VVR*FDK, STR*TQI, TQI*NKV;

KVV*RFD, VVR*FDK, VRF*DKL, RFD*KLP, DKL*PGF, FGD*SIE;

VSG*LEQ, QLE*KVV, FDK*LTE, KLT*EWT como se describe en (64, 65);

LMY*DMY, SEK*RVV, KRV*WMS, DMY*PHF, TNL*GPS, LMY*DMY como se describe en (66);

LYE*NKP como se describe en (67);

VNQ*HLC, SHL*VEA, LVE*ALY, EAL*YLV, LYL*VCG como se describe en (68);

VNQ*HLC, QHL*CGS, LVE*ALY, EAL*YLV, ALY*LVC, LYL*VCG;

YLV*CGE, LVC*GER, RGF*FYT, GFF*YTP, FFY*TPK, FYT*PKA;

YTP*KA, TPK*A como se describe en (69);

donde * representa el sitio después del cual se escinde el complejo proteosómico.

Se aplican vacunas rAd portadoras de constructos de múltiples epitopos como se ha descrito antes en el marco clínico apropiado como sigue:

Dosis: entre 10^{5} y 10^{11} pfu.

Diluyente: solución isotónica: 100-1.000 \mul.

Administración: una a tres veces, a intervalos de dos a cuatro semanas.

Sitios posibles: subcutánea, intraperitoneal, intramuscular.

Evaluaciones clínicas: inhibición del crecimiento tumoral, regresión de tumores/metástasis existentes.

Evaluación inmunológica: Medición de las respuestas de las células T frente a los epitopos peptídicos de células T relevantes y a los controles antes y después de la vacunación.

Leyendas de las figuras del ejemplo 4

Fig. 8. Minigenes codificantes de diversos epitopos CTL unidos por un espaciador de tres alaninas.

El primer minigén (rAd-1) codifica para un epitopo CTL codificado por Ad5E1A_{234-243} y restringido en H-2D^{b} (55), un epitopo CTL codificado por HPV16E7_{49-59} y restringido en H-2D^{b} (70), un epitopo CTL codificado por p^{53}_{158-166} y restringido en H-2K^{b} (resultados no publicados), un epitopo CTL codificado por Ad5E1B_{192-200} y restringido en H-2D^{b} (56) y un marcaje Myc.

El segundo minigén (rAd-2) codifica para un epitopo CTL codificado por HPV16 E7_{86-93} y restringido en HLA-A*0201 (71), un epitopo CTL de matriz Flu_{58-66} restringido en HLA-A*0201 (72), un epitopo CTL codificado por HPV16 E711-20 y restringido en HLA-A*0201 (71), un epitopo CTL codificado por Ad5E1B_{192-200} y restringido en H-2D^{b} (56) y un marcaje Myc.

Fig. 9. Los epitopos CTL codificados por el minigén 1 son presentados a clones CTL específicos de tumores. Se transfectó pMad5-1, junto con un plásmido codificante del elemento de restricción apropiado, en células COS-7. Después de 48 horas, se estudiaron las células COS-7 transfectadas en cuanto a la expresión de los epitopos CTL en su capacidad para producir liberación de TNF por los CTL relevantes. La presencia de TNF en el sobrenadante del cultivo fue medida por el efecto citotóxico sobre células WEHI-164 clon 13.

Se activaron todos los CTL relevantes mediante células COS-7 transfectadas con un plásmido codificante del minigén 1 (pero no un plásmido de control irrelevante), junto con un plásmido codificante de la molécula de restricción apropiada. Así, el minigén 1 es traducido en proteína y los epitopos CTL codificados son procesados y presentados en el contexto de la molécula MHC apropiada a los CTL específicos de tumores.

Fig. 10. Los epitopos CTL derivados de Flu y derivados de Ad5E1B son presentados a CTL específicos respectivamente de Flu y de Ad5E1B por el minigén 2. Se transfectó pMad5-2, junto con un plásmido codificante del elemento de restricción apropiado, en células COS-7. Después de 48 horas, se estudiaron las células COS-7 transfectadas en cuanto a la expresión de los epitopos CTL en su capacidad para producir liberación de TNF por los CTL relevantes. Se midió la presencia de TNF en el sobrenadante del cultivo por el efecto citotóxico sobre células WEHI-164 clon 13. Se activaron los CTL relevantes por células COS-7 transfectadas con este plásmido (pero no con un plásmido de control irrelevante) y con un plásmido codificante de la molécula de restricción apropiada. Se traduce así el minigén 2 en proteína y se procesan los epitopos CTL codificados y se presentan en el contexto de la molécula MHC apropiada a los CTL específicos.

Fig. 11. Se procesan epitopos CTL codificados por rAdV y se presentan a CTL específicos de tumores. Se dejaron las MEC B6 sin infectar o se infectaron con rAd-1 que albergaba el minigén 1, rAd-2 que albergaba el minigén 2 o el gen de galactosidasa (RAdV-LAC-Z) a una multiplicidad de infección de 50. Dos días después, se usaron estas células en un ensayo de producción de TNF como se ha descrito anteriormente. Las MEC B6 infectadas con el rAd-1 que albergaba epitopos CTL derivados de Ad5E1A, HPV16E7 y Ad5E1B y restringidos en H-2D^{b} son capaces de activar los clones CTL específicos para estos epitopos CTL, mientras que las MEC 6 infectadas con el rAd-2 que albergaba un CTL derivado de Ad5E1B sólo activan los CTL específicos de Ad5E1B. Los CTL no son activados tras incubación con MEC no infectados o MEC infectados con un rAd control.

Fig. 12. La vacunación con rAdV conduce a inducción de actividad de los CTL reactivos con tumores frente a los epitopos CTL codificados por Ad5E1. Se dejaron ratones B6 sin inmunizar, se inmunizaron con rAd-1 que albergaba el minigén 1 o se inmunizaron con rAd-2 que albergaba el minigén 2. Dos semanas más tarde, se recogieron los bazos de estos animales y se reestimularon con células tumorales transformadas con Ad5E1 para propagar CTL específicos de Ad5E1A y Ad5E1B. Se estudió la actividad lítica de cultivos de CTL en masa 6 días después sobre MEC Ad5E1 y MEC B6 cargadas con el epitopo CTL de control codificado por el virus de Sendai FAPGNYPAL o el epitopo CTL codificado por Ad5E1A SGPSNTPPE1 o el epitopo CTL codificado por Ad5E1B VNIRNCCYI o el epitopo CTL codificado por HPV16 E7 RAHYNIVTF. Los ratones inmunizados con rAd-1 reconocen los epitopos CTL codificados por Ad5E1A y Ad5E1B, así como las células tumorales que presentan endógenamente el epitopo Ad5E1A y el Ad5E1B. Los ratones inmunizados con rAd-2 reconocen el epitopo Ad5E1B, así como las células tumorales que presentan endógenamente el epitopo CTL codificado por Ad5E1B, mientras que los ratones no inmunizados no exhiben reactividad frente a las células diana. Se muestra el % de lisis específica a diferentes razones de efector a células diana.

Fig. 13. La vacunación con rAdV conduce a la inducción de actividad de CTL reactivos con tumores dirigida contra el epitopo CTL HPV16 E7 restringido en H-2D^{b}. Se dejaron ratones B6 sin inmunizar, se les inmunizó con rAd-1 que albergaba el minigén 1 o se les inmunizó con rAd-2 que albergaba el minigén 2. Dos semanas más tarde, se recogieron los bazos de estos animales y se reestimularon con células tumorales transformadas con HPV16 para propagar CTL H-2D^{b} específicos de HPV16 E7. Se estudió la actividad lítica de cultivos de CTL en masa 6 días después sobre MEC HPV16 y MEC B6 cargadas con el epitopo CTL de control codificado por el virus de Sendai FAPGNYPAL o el epitopo CTL codificado por Ad5E1A SGPSNTPPE1 o el epitopo CTL codificado por Ad5E1B VNIRNCCYI o el epitopo CTL codificado por HPV16 E7 RAHYNIVTF. Los ratones inmunizados con rAd-1 reconocen los epitopos CTL codificados por HPV16 E7, así como las células tumorales que presentan endógenamente el epitopo HPV16 E7. Los ratones no inmunizados y los ratones inmunizados con rAd-2 no muestran reactividad frente a células diana positivas al péptido HPV16 E7. Se muestra el % de lisis específica a diferentes razones de efecto a células diana.

Fig. 14. La vacunación con rAd-1 induce inmunidad protectora frente a una inoculación letal con células tumorales que expresan Ad5E1A. Se inmunizaron ratones B6 intraperitonealmente con rAd-1, rAd-2 y el mutante Ad5 (positivo a Ad5E1A), Ad5ts 149, y subcutáneamente con 10 x células tumorales transformadas con Ad5E1A + ras irradiadas OI, o se les inyectó PBS/BSA solamente. Dos semanas después, los ratones recibieron una carga subcutánea de 0,4x10^{6} células Ad5E1A + ras. Los ratones inmunizados con rAd-1 y Ad5ts 149 estaban protegidos frente al sobrecrecimiento de células Ad5E1A + ras, lo que muestra que la inmunización con rAd induce inmunidad protectora frente a tumores.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

TABLA II

3

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TABLA III

4

La capacidad de unión de los péptidos es mostrada como el rango de la concentración de péptido necesaria para inhibir la unión del péptido marcado con FL en un 50% (CI_{50} en \muM). Se considera que los péptidos marcados con un asterisco (*) son epitopos CTL potenciales.

5

6

TABLA V

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TABLA VII

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TABLA X

14

La siguiente tabla presenta péptidos preseleccionados derivados de la proteína tirosina asociada al melanoma humano capaces de regular de forma creciente las moléculas HLA-A*0201 en células T2.

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TABLA XI

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TABLA XII

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17

Péptidos preseleccionados que tienen una secuencia de aminoácidos derivada de la proteína HPV16/18, donde dicha secuencia de aminoácidos tiene capacidad para unirse al alelo HLA-A2.1 del MHC de clase I humano y es seleccionada entre el grupo consistente en:

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TABLA XIII

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TABLA XIV

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TABLA XV

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TABLA XVI

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TABLA XVII

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TABLA XVIII

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TABLA XIX

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TABLA XX

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TABLA A Oligonucleótidos usados en estos estudios para generar rAdV que codifican para epitopos CTL a modo de perlas encadenadas, unidos a sitios de escisión proteolítica que dirigen el procesamiento de los epitopos CTL

26

Claims (19)

1. Un método para la selección de epitopos peptídicos de células T inmunogénicos presentes en antígenos polipeptídicos, consistente en la identificación de péptidos en la secuencia primaria del antígeno que tienen un motivo de unión y tamaño para unirse a una molécula de HLA clase I y la medición de la unión de dichos péptidos identificados a moléculas de MHC clase I, gracias a lo cual se mide la estabilidad del complejo del péptido y la molécula de MHC clase I en células intactas portadoras de dicha molécula de MHC clase I en su superficie.

2. Un método según la reivindicación 1, donde las células intactas son células B.

3. Un método según la reivindicación 2, donde las células B son células B humanas.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye una etapa más de selección de péptidos, donde los péptidos y sus secuencias flanqueantes en el antígeno intacto son estudiados en cuanto a su adecuación a las reglas de la escisión proteosómica de las secuencias polipeptídicas naturales.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los péptidos y sus secuencias flanqueantes en el antígeno intacto son estudiados en cuanto a su adecuación a las reglas del transporte peptídico y/o de la carga de péptidos en moléculas de HLA clase I.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además incluye un ensayo más de unión para la unión de péptidos identificados a moléculas de MHC clase I.

7. Un método según la reivindicación 6, donde el ensayo adicional de unión mide la unión de péptidos identificados a moléculas de MHC clase I vacías en la superficie de una línea celular defectiva en procesamiento de antígenos.

8. Un método según la reivindicación 7, donde la línea celular defectiva en procesamiento es la línea celular T2.

9. Un método para la producción de una vacuna para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad asociada a la presencia de un antígeno polipeptídico, consistente en seleccionar epitopos peptídicos de células T de dicho antígeno polipeptídico mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, preparar epitopos peptídicos seleccionados y mezclar dichos epitopos peptídicos con un vehículo adecuado para la administración.

10. Un método para producir una vacuna según la reivindicación 9 donde se añade un adyuvante a la vacuna.

11. Un método para producir una vacuna según la reivindicación 9 ó 10, donde el epitopo peptídico contiene un péptido sintético.

12. Un método según la reivindicación 11, donde la vacuna comprende una mezcla de diferentes péptidos sintéticos.

13. Un método según la reivindicación 11 ó 12, donde el péptido sintético es cargado sobre una célula dendrítica.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde los epitopos peptídicos están presentes en una conformación de perlas encadenadas.

15. Un método según la reivindicación 14, donde las cadenas contienen sitios de escisión proteolítica.

16. Un métodos según la reivindicación 9 ó 10, donde se provee un epitopo peptídico como parte de una proteína recombinante.

17. Un método según la reivindicación 16, donde la proteína recombinante tiene una conformación de perlas encadenadas donde las perlas son epitopos peptídicos.

18. Un método según la reivindicación 17, donde las cadenas consisten en sitios de escisión proteolítica.

19. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 16-18, donde la proteína recombinante es cargada sobre una célula dendrítica.