ES2565779T3 - Epítopos CD133 - Google Patents
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Abstract
Un inmunógeno aislado que consiste en un péptido aislado de 30 restos de aminoácido o menos que comprende la secuencia amino ILSAFSVYV (SEC ID N.º 1) con dos o menos sustituciones de aminoácido, en el que el inmunógeno es capaz de unirse a antígeno de leucocitos humanos (HLA), en el que el inmunógeno está unido opcionalmente a uno cualquiera de: un vehículo inmunogénico, un agonista del receptor tipo Toll, un péptido inmunogénico que se sabe que estimula una respuesta inmunitaria del tipo de células T auxiliares, una citoquina, un anticuerpo, un ligando de receptor, un lípido, un péptido antigénico múltiple, polietilenglicol, una secuencia líder, una secuencia de secreción, o una secuencia empleada para la purificación del péptido.
Description
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tecnología de ADN recombinante, o pueden aislarse de fuentes naturales tales como células tumorales que expresan el producto proteico original.
Los polipéptidos y oligopéptidos descritos en este documento pueden sintetizarse en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Están disponibles en el mercado diversos sintetizadores automatizados de péptidos y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Grant, G. A., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1992, W. H. Freeman and Company, Nueva York; Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science, 1999, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. También pueden sintetizarse fragmentos de polipéptidos descritos en este documento como intermedios en la síntesis de un polipéptido más grande.
Puede emplearse tecnología de ADN recombinante donde una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o polipéptido inmunogénico de interés se inserta en un vector de expresión, se transforma o transfecta en una célula hospedadora apropiada, y se cultiva en condiciones adecuadas para su expresión. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica para los expertos en la materia, como se describe en Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Immunology, 2006, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. Por tanto, pueden usarse péptidos o polipéptidos producidos de forma recombinante como los inmunógenos descritos en este documento.
También pueden sintetizarse las secuencias codificantes de péptidos de la longitud contemplada en este documento en sintetizadores automatizados de ADN disponibles en el mercado usando protocolos que son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Grant, G. A., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1992, W. H. Freeman and Company, Nueva York; Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science, 1999, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Las secuencias codificantes también pueden modificarse de modo que se produzca un péptido o polipéptido que incorpore una sustitución deseada de aminoácido. La secuencia codificante puede estar provista de enlazadores apropiados, puede ligarse en vectores adecuados de expresión que están habitualmente disponibles en la técnica, y la molécula resultante de ADN o ARN puede transformarse o transfectarse en hospedadores adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Están disponibles varios de estos vectores y sistemas hospedadores adecuados, y su selección se deja al experto en la materia. Para la expresión de las proteínas de fusión, la secuencia codificante puede estar provista de codones de inicio y parada unidos de forma funcional, regiones promotoras y terminadoras, y un sistema de replicación para proporcionar un vector de expresión para la expresión en la célula hospedadora deseada. Por ejemplo, pueden proporcionarse secuencias promotoras compatibles con hospedadores bacterianos en plásmidos que contienen sitios convenientes de restricción para la inserción de la secuencia codificante deseada. Los vectores de expresión resultantes se transforman en hospedadores bacterianos adecuados. También pueden usarse células hospedadoras de levadura, insecto y mamífero, empleando vectores y secuencias de control adecuadas.
Pueden modificarse por ingeniería genética células hospedadoras (por ejemplo, transducirse, transformarse, o transfectarse) con los vectores descritos en este documento que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células hospedadoras modificadas por ingeniería pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según lo apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula hospedadora seleccionada para expresión, y serán evidentes para los expertos en la materia.
La presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias ampliamente descritas anteriormente. Las construcciones incluyen un vector, tal como un plásmido o vector viral, en que se ha insertado una secuencia descrita en este documento, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción incluye adicionalmente secuencias reguladoras incluyendo, por ejemplo, un promotor, unidas de forma funcional a la secuencia. Los expertos en la materia conocen grandes cantidades de vectores y promotores adecuados, y están disponibles en el mercado.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen las construcciones descritas anteriormente. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede lograrse por transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Dichas células pueden utilizarse de forma rutinaria para ensayar la actividad CTL obteniendo dichas células hospedadoras modificadas por ingeniería genética o recombinantes que expresan los péptidos inmunogénicos descritos en este documento.
También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo celular de mamífero para expresar proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos renales de mono, descritas por Gluzman, 1981, Cell, 23:175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por
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ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero incluirán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados, y también cualquier sitio necesario de unión al ribosoma, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de ayuste, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Pueden usarse secuencias de ADN derivadas del ayuste de SV40, y sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.
Los polipéptidos pueden recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, y cromatografía con lectina. Pueden usarse etapas de re-plegamiento proteico, si fuera necesario, para completar la configuración de los péptidos y proteínas maduras. Puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas finales de purificación.
Típicamente se incuban células presentadoras de antígeno que tienen que usarse para estimular una respuesta CTL con un péptido de una longitud óptima, por ejemplo, un nanopéptido, que permite la unión directa del péptido a la molécula MHC clase I sin procesamiento adicional. Oligopéptidos y polipéptidos más grandes generalmente son ineficaces en la unión a moléculas MHC clase I ya que no se procesan de forma eficaz en un péptido de tamaño apropiado en el medio extracelular. Se conoce en la técnica una diversidad de enfoques, sin embargo, que permiten que los oligopéptidos y polipéptidos se adquieran de forma exógena por una célula, que después permite su posterior procesamiento y presentación por una molécula MHC clase I. Ejemplos representativos pero no limitantes de dichos enfoques incluyen electroporación de las moléculas en la célula (Harding, 1992, Eur. J. Immunol., 22:1865-69), encapsulación de las moléculas en liposomas que se fusionan a las células de interés (Reddy et al., 1991, J. Immunol. Methods, 141:157-163), o choque osmótico en que las moléculas se captan mediante pinocitosis (Moore et al., 1988, Cell, 54:777-785). Por tanto, pueden proporcionarse oligopéptidos y polipéptidos que incluyen uno o más de los péptidos descritos en este documento a células presentadoras de antígeno de tal modo que se suministren al citoplasma de la célula, y se procesen posteriormente para permitir la presentación de los péptidos.
También pueden prepararse células presentadoras de antígeno adecuadas para estimular una respuesta CTL in vitro que sea específica para uno o más de los péptidos descritos en este documento introduciendo vectores polinucleotídicos que codifican las secuencias en las células. Estos polinucleótidos pueden diseñarse de modo que expresen solamente un único péptido, múltiples péptidos, o incluso una pluralidad de péptidos. Se conoce en la técnica una diversidad de enfoques que permiten introducir polinucleótidos y expresarlos en una célula, proporcionando por tanto uno o más péptidos descritos en este documento a la ruta de unión de la molécula MHC clase I. Ejemplos representativos pero no limitantes de dichos enfoques incluyen la introducción de ADN plasmídico a través de transferencia génica mediada por partículas o electroporación (Tuting et al., 1998, J. Immunol., 160:1139-47), o la transducción de células con un adenovirus que expresa el polinucleótido de interés (Perez-Diez et al., 1998, Cancer Res., 58:5305-09). Por tanto, pueden proporcionarse oligonucleótidos que codifican uno o más de los péptidos descritos en este documento a células presentadoras de antígeno de tal modo que los péptidos se asocien con moléculas MHC clase I y se presenten en la superficie de la célula presentadora de antígeno y, por consiguiente, estén disponibles para estimular una respuesta CTL.
En ciertas realizaciones, los métodos descritos en este documento incluyen un método para inducir una respuesta CTL in vitro que es específica para una célula tumoral que expresa una molécula de los supertipos A1, A2, o A3 (A11 es un miembro del supertipo A3), mediante lo cual el método incluye poner en contacto un linfocito precursor de CTL con una célula presentadora de antígeno que se ha unido a un inmunógeno que comprende uno o más de los péptidos descritos en este documento.
En realizaciones específicas, los métodos descritos en este documento incluyen un método para inducir una respuesta CTL in vitro que es específica para una célula tumoral que expresa una molécula de los supertipos A1, A2, o A3, mediante lo cual el método incluye poner en contacto un linfocito precursor de CTL con una célula presentadora de antígeno que ha adquirido de forma exógena un oligopéptido o polipéptido inmunogénico que incluye uno o más de los péptidos descritos de acuerdo con la invención.
Una realización adicional más descrita en este documento se refiere a un proceso para inducir una respuesta CTL in vitro que es específica para una célula tumoral que expresa una molécula de los supertipos A1, A2, o A3, que comprende poner en contacto un linfocito precursor de CTL con una célula presentadora de antígeno que está expresando un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en este documento, y donde dicho polinucleótido está unido de forma funcional a un promotor.
Existe una diversidad de técnicas para ensayar la actividad de CTL. Estas técnicas incluyen el marcaje de células diana con radionúclidos tales como Na251CrO4 o 3H-timidina, y medir la liberación o retención de los radionúclidos desde las células diana como índice de muerte celular. Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica. Como alternativa, se sabe que los CTL liberan una diversidad de citoquinas cuando se estimulan por una célula diana apropiada, tal como una célula tumoral que expresa la molécula MHC clase I relevante y el péptido correspondiente. Ejemplos no limitantes de dichas citoquinas incluyen IFN-γ, TNF-α, y GM-CSF. Ensayos para estas citoquinas son bien conocidos en la técnica. La metodología para medir tanto la muerte de células diana como la liberación de
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citoquinas como una medida de la reactividad de CTL se da en Coligan, J. E. et al. (Current Protocols in Immunology, 1999, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
Después de la expansión de los CTL específicos de antígeno, éstos últimos pueden entonces transferirse de nuevo al paciente, donde destruirán su célula diana específica. La utilidad de dicha transferencia adoptiva se demuestra en North et al. (199, Infect. Immun., 67:2010-12) y Riddell et al. (1992, Science, 257:238-241). En la determinación de la cantidad de células a reinfundir, los expertos en la materia se verán guiados por la cantidad total de células disponibles, la actividad de los CTL medida in vitro, y el estado del paciente. Típicamente, se infunden de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1012 (por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1011 o de aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1010) CTL específicos de péptido. Los métodos para reinfundir células T en un paciente son bien conocidos y se ejemplifican en la patente de Estados Unidos n.º 4.844.893 de Honski, et al., y la patente de Estados Unidos n.º 4.690.915 de Rosenberg.
Los CTL específicos de péptido pueden purificarse a partir de las células estimuladoras antes de su infusión en el paciente. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales dirigidos hacia la proteína de superficie celular CD8, presente en CTL, junto con una diversidad de técnicas de aislamiento tales como panning de anticuerpos, clasificación por citometría de flujo, y separación con perlas magnéticas para purificar los CTL específicos de péptido de cualquier linfocito no específico de péptido restante o de las células estimuladoras. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Debe apreciarse que la generación de CTL específicos de péptido de este modo, obvia la necesidad de estimular los CTL en presencia de tumor. Por tanto, no hay posibilidad de reintroducir de forma accidental células tumorales en el paciente.
Por tanto, una realización de la presente invención se refiere a un proceso para tratar a un sujeto que tiene cáncer caracterizado por células tumorales que expresan complejos una molécula de los supertipos A1, A2, o A3, por ejemplo, HLA-A1, HLA-A2, o HLA-A11, mediante lo cual se administran CTL producidos in vitro de acuerdo con los métodos descritos en este documento en una cantidad suficiente para destruir las células tumorales a través de lisis directa o para lograr la destrucción de las células tumorales indirectamente a través de la elaboración de citoquinas.
Otra realización de la presente invención se refiere a un proceso para tratar a un sujeto con cáncer caracterizado por células tumorales que expresan cualquier molécula MHC clase I y un epítopo de la SEC ID N.º 1-13, mediante lo cual se producen CTL in vitro y son específicos para el epítopo o proteína original y se administran en una cantidad suficiente para destruir las células tumorales a través de lisis directa o para lograr la destrucción de las células tumorales indirectamente a través de la elaboración de citoquinas.
Los CTL generados ex vivo pueden usarse para identificar y aislar moléculas de receptor de células T específicas para el péptido. Los genes que codifican las cadenas alfa y beta del receptor de células T pueden clonarse en un sistema de vector de expresión y transferirse y expresarse en células T vírgenes de sangre periférica, células T de ganglios linfáticos, o células progenitoras de linfocitos T de médula ósea. Estas células T, que después estarían expresando un receptor de células T específico de péptido, tendrían entonces reactividad anti-tumoral y podrían usarse en terapia adoptiva de cánceres.
Métodos de detección y diagnóstico
Además de su uso para propósitos terapéuticos o profilácticos, los péptidos inmunogénicos descritos en este documento son útiles como agentes de detección y diagnóstico. Por tanto, los péptidos inmunogénicos descritos en este documento, junto con técnicas modernas de detección génica, hacen posible seleccionar pacientes por la presencia de genes que codifican dichos péptidos en células obtenidas por biopsia de tumores detectados en dichos pacientes. Los resultados de dicha detección pueden ayudar a determinar la eficacia de continuar con el régimen de tratamiento descrito en este documento usando los inmunógenos descritos en este documento.
Como alternativa, los péptidos inmunogénicos descritos en este documento, así como homólogos funcionalmente similares de los mismos, pueden usarse para seleccionar una muestra por la presencia de CTL que reconocen específicamente los epítopos correspondientes. Los linfocitos a detectar en este ensayo normalmente se obtendrán de la sangre periférica, pero pueden obtenerse linfocitos de otras fuentes, incluyendo ganglios linfáticos, bazo, tumores, y líquido pleural. Los péptidos descritos en este documento pueden entonces usarse como herramienta de diagnóstico para evaluar la eficacia de los tratamientos inmunoterapéuticos descritos en este documento. Por tanto, la generación in vitro de CTL como se ha descrito anteriormente se usaría para determinar si los pacientes tienen probabilidad de responder al péptido in vivo. Asimismo, la generación in vitro de CTL podría hacerse con muestras de linfocitos obtenidos del paciente antes y después del tratamiento con los péptidos. La generación satisfactoria de CTL in vivo entonces debe reconocerse mediante una capacidad correspondientemente más fácil de generar CTL específicos de péptido in vitro a partir de linfocitos obtenidos después del tratamiento en comparación con aquellos obtenidos antes del tratamiento.
Los oligopéptidos descritos en este documento, tales como las SEC ID N.º 1-13, también pueden usarse para preparar multímeros, que pueden usarse, por ejemplo, junto con citometría de flujo, para cuantificar la frecuencia de CTL específicos de péptido que están presentes en una muestra de linfocitos de un individuo. Por ejemplo, podrían
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Además, los inmunógenos descritos en este documento pueden usarse para estimular la producción de anticuerpos para su uso en inmunoterapia pasiva, para su uso como reactivos de diagnóstico, y para su uso como reactivos en otros procesos tales como cromatografía de afinidad.
La presente invención también se refiere a anticuerpos que reaccionan con inmunógenos, tal como un polipéptido que comprende uno o más de los péptidos epitópicos de las SEC ID N.º 1-13 como se describe en este documento. También se contemplan específicamente fragmentos activos de dichos anticuerpos. Dichos anticuerpos, y fragmentos activos de dichos anticuerpos, por ejemplo, y estructuras Fab, pueden reaccionar con, incluyendo cuando son altamente selectivo o específicos para, una estructura inmunogénica que comprende 2, 3, 4 o más de los péptidos epitópicos descritos en este documento.
Con la llegada de métodos de biología molecular y tecnología recombinante, ahora es posible que los expertos en la materia produzcan moléculas de anticuerpos por medios recombinantes y de ese modo generen secuencias génicas que codifican secuencias específicas de aminoácidos encontradas en la estructura polipeptídica de los anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden producirse clonando las secuencias génicas que codifican las cadenas polipeptídicas de dichos anticuerpos o por síntesis directa de dichas cadenas polipeptídicas, con ensamblaje in vitro de las cadenas sintetizadas para formar estructuras tetraméricas activas (H2L2) con afinidad por epítopos y determinantes antigénicos específicos. Esto ha permitido la fácil producción de anticuerpos que tienen secuencias características de anticuerpos neutralizantes de diferentes especies y fuentes.
Independientemente de la fuente de los anticuerpos o nanocuerpos, o el modo en que el experto en la materia elige producir dichos anticuerpos o nanocuerpos, incluyendo construidos de forma recombinante o sintetizados, in vitro o in vivo, usando animales transgénicos, tales como vacas, cabras y ovejas, o usando cultivos celulares en biorreactores, o por síntesis química directa empleando organismos no vivos en cualquier fase del proceso, todos los anticuerpos y nanocuerpos tienen regiones capaces de interaccionar con una diana antigénica estructuralmente complementaria. Las regiones que interaccionan con la diana se mencionan como regiones "variables" o "V" y se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos de anticuerpos de diferente especificidad antigénica.
Los anticuerpos también pueden ser completamente sintéticos, donde las cadenas polipeptídicas de los anticuerpos se sintetizan y, posiblemente, se optimizan para la unión a los polipéptidos descritos en este documento como si fueran receptores. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos o humanizados y pueden ser de estructura completamente tetramérica, o pueden ser diméricos e incluir solamente una única cadena pesada y una única cadena ligera. Dichos anticuerpos también pueden incluir fragmentos, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, capaces de reaccionar con y unirse a cualquiera de los polipéptidos descritos en este documento como si fueran receptores.
En este documento se describe además un método para inducir una respuesta CTL en un sujeto, que comprende administrar a sujetos que expresan antígenos del supertipo HLA A1, A2 o A3 una cantidad eficaz (es decir, estimuladora de CTL) de un inmunógeno descrito en este documento, por ejemplo, una cantidad suficiente para inducir una respuesta CTL contra células tumorales que expresan al menos HLA-A1 o HLA-A2, según sea el caso, provocando de este modo una respuesta celular contra dichas células tumorales.
Una realización adicional más de la presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta CTL en un sujeto, donde el inmunógeno está en forma de un polinucleótido. En un ejemplo no limitante, el método incluye administrar a sujetos que expresan HLA-A2 al menos un epítopo CTL, donde dicho epítopo o epítopos se seleccionan entre un grupo que comprende los péptidos descritos en este documento, y están codificados dentro de una secuencia polinucleotídica que no incluye la región codificante completa de la proteína, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta CTL contra células tumorales que expresan HLA-A2.
Los péptidos e inmunógenos descritos en este documento también pueden incluir mutaciones (por ejemplo, mutaciones internas) que los vuelven "superantígenos" o "superagonistas" para estimulación de células T. Pueden generarse péptidos superantígenos detectando células T con una biblioteca combinatoria de péptidos sintéticos de exploración posicional (PS-CSL) como se describe en Pinilla et al., 1992, Biotechniques, 13:901-5; Borras et al., 2002, J. Immunol. Methods, 267:79-97; el documento US 2004/0072246; y Lustgarten et al., 2006, J. Immun., 176:1796-1805. Cuando se conoce un epítopo de célula T virgen, se encuentra que aproximadamente el 25 % de los miméticos de epítopo identificados son superagonistas. Se ha informado de miméticos de epítopo superagonistas que son 3 órdenes de magnitud más eficaces que el ligando nativo (Hemmer et al., 2000, J. Immunol., 164: 861-871; La Rosa et al., 2001, Blood, 97:1776-86).
Pueden usarse bibliotecas combinatorias sintéticas de exploración posicional (PS-SCL) que representan trillones de péptidos de diferentes longitudes como fuentes imparciales de antígenos peptídicos en ensayos de activación de células T para la identificación de epítopos de células T. Las PS-SCL (Pinilla et al., 1992, Biotechniques, 13:901-905) están compuestas de mezclas organizadas sistemáticamente. En el caso de PS-SCL definida de posición única, cada compuesto presente en una mezcla dada tiene un aminoácido individual común en una posición dada, mientras que las posiciones restantes están compuestas de mezclas de los 19 L-aminoácidos naturales (cisteína omitida). Los
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datos de detección de una PS-SCL dada permiten la identificación de restos clave en cada posición del péptido. Es importante observar, sin embargo, que la actividad encontrada para una mezcla se debe a la presencia de uno o más péptidos activos específicos dentro de la mezcla, y no a los aminoácidos individuales como entidades diferentes. La combinación de todos los aminoácidos definidos en las mezclas más activas condice a los compuestos individuales activos.
Las respuestas inmunitarias celulares específicas de antígeno de sujetos vacunados pueden controlarse por varios ensayos diferentes, tales como ensayos de tetrámeros, ELISPOT, y PCR cuantitativa. Las siguientes secciones proporcionan ejemplos de protocolos para detectar respuestas con estas técnicas. Están disponibles métodos y protocolos adicionales. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Coligan, J. et al., Eds., (John Wiley & Sons, Inc.; Nueva York, N.Y.).
Pueden usarse tetrámeros compuestos de moléculas MHC recombinantes en complejo con péptido para identificar poblaciones de células T específicas de antígeno. Para detectar células T específicas para antígenos tales como CD133, se sintetizan y proporcionan complejos tetraméricos de péptido específico marcado con fluorocromo (por ejemplo, ficoeritrina (PE)-tHLA) que contienen péptidos de estos antígenos por Beckman Coulter (San Diego, California). Se resuspenden células CD8 de clon CTL específico a 105 células/50 µl de tampón FACS (tampón fosfato más tampón FCS inactivado al 1 %). Se incuban las células con 1 µl de tHLA durante 30 minutos a temperatura ambiente y se continúa la incubación durante 30 minutos a 4 ºC con 10 µl de mAb anti-CD8 (Becton Dickinson, San Jose, CA). Las células se lavan dos veces en 2 ml de tampón FACS frío antes del análisis por FACS (Becton Dickinson).
Pueden usarse ensayos ELISPOT para detectar células secretoras de citoquinas, por ejemplo, para determinar si hay células en un paciente vacunado que secretan citoquina en respuesta a antígeno, demostrando de este modo si se han provocado respuestas específicas de antígeno. Se suministran kits de ensayo ELISPOT de R & D Systems (Minneapolis, Minnesota) y se realizan como se describe por las instrucciones del fabricante. Se siembran 1 x 105 células PBMC de pacientes respondedores (R) de antes y después de la vacunación en placas de 96 pocillos con insertos de membrana de nitrocelulosa recubiertos con Ab de captura. Se añaden células estimuladoras (S) (células T2 TAP-deficientes pulsadas con antígeno) a la relación R:S de 1:1. Después de una incubación de 24 horas, las células se retiran lavando las placas 4 veces. Se añade Ab de detección a cada pocillo. Las placas se incuban a 4 ºC durante una noche y se repetirán las etapas de lavado. Después de una incubación de 2 horas con estreptavidina-AP, se lavan las placas. Se añaden alícuotas (100 µl) de cromógeno BCIP/NBT a cada pocillo para revelar las manchas. La reacción se detiene después de 60 min lavando con agua. Las manchas se exploran y cuentan con análisis de imágenes asistido por ordenador (Cellular Technology Ltd, Cleveland, Ohio). Cuando los valores experimentales son significativamente diferentes de la cantidad media de manchas frente a células T2 no pulsadas (valores de fondo), determinada por un ensayo de suma de rango de Wilcoxon bilateral, se sustraen los valores de fondo de los valores experimentales.
La PCR cuantitativa es otro medio para evaluar respuestas inmunitarias. Para examinar la producción de IFN-γ en pacientes por PCR cuantitativa, se descongelan PBMC crioconservadas de muestras pre-vacunación y postvacunación de los pacientes y células dendríticas autólogas en medio de cultivo RPMI DC con suero del paciente al 10 %, se lavan y se cuentan. Se siembran PBMC a 3 x 106 PBMC en 2 ml de medio en placa de 24 pocillos; se siembran células dendríticas a 1 x 106/ml y se pulsan 24 horas con 10 µg/ml de péptido tumoral en 2 ml en cada pocillo en placa de 24 pocillos. Se recogen las células dendríticas, se lavan, y se cuentan, y se diluyen hasta 1 x 106/ml, y se añaden 3 x 105 (es decir, 300 µl de solución) a los pocillos con PBMC (DC:PBMC = 1:10). Se añaden 2,3 µl de IL-2 (300 UI/ml) cada 3-4 días, y las células se recogen entre el día 10 y el día 13 después del inicio del cultivo. Las células recogidas después se estimulan con células tumorales o PBMC autólogas pulsadas con 10 µg/ml de péptido tumoral durante 4 horas a 37 ºC. En los días 11-13, se recogen los cultivos, se lavan dos veces, después se dividen en cuatro pocillos diferentes, dos pocillos que se usan para el control (sin diana); y otros dos pocillos de CTL co-cultivados con células tumorales (1:1) si hay células tumorales disponibles. Si no hay células tumorales disponibles, se añaden 10 µg/ml de lisado tumoral a los CTL. Después de 4 horas de estimulación, se recogen las células, se extrae el ARN, y se evalúa la expresión de ARNm de IFN-γ y CD8 con un sistema de termociclador/cámara de fluorescencia. La eficacia de amplificación por PCR sigue la progresión logarítmica natural, demostrando los análisis de regresión lineal coeficientes de correlación en exceso de 0,99. En base al análisis empírico, se interpreta una diferencia de un ciclo como una diferencia de factor dos en la cantidad de ARNm, y se determinan cantidades de IFN-γ normalizadas a CD8. Un aumento de > 1,5 veces en IFN-γ post-vacuna respecto a pre-vacuna es la norma establecida para sensibilidad a vacuna de tipo I positiva.
Puede usarse el siguiente protocolo para producir CTL específicos de antígeno in vitro a partir de PBMC derivadas de pacientes. Para generar células dendríticas, se cultivan las células adherentes al plástico a partir de PBMC en medio AIM-V suplementado con GM-CSF humano recombinante e IL-4 humana recombinante a 37 ºC en una incubadora humidificada de CO2 (5 %). Seis días después, se estimulan las células dendríticas inmaduras en los cultivos con TNF-α humano recombinante para la maduración. Después se recogen las células dendríticas maduras en el día 8, se resuspenden en PBS a 1 x 106 por ml con péptido (2 µg/ml), y se incuban durante 2 horas a 37 ºC. Se enriquecen las células T CD8+ autólogas a partir de PBMC usando microperlas magnéticas (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Las células T CD8+ (2 x 106 por pocillo) se co-cultivan con 2 x 105 por pocillo de células dendríticas
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inmunógeno o células dendríticas cargadas con los antígenos como se describe en este documento. El material de embalaje generalmente tiene una etiqueta externa que indica los contenidos y/o el propósito del kit y/o sus componentes.
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos son ilustrativos y no limitantes.
Ejemplo 1. Epítopos CD133 HLA-A2 restringidos
Se identificó un epítopo HLA-A2 de CD133 humano, ILSAFSVYV (SEC ID N.º 1). Para demostrar que el péptido se une a moléculas HLA-A2, se incubaron células T2 durante una noche con 100 µM de cada péptido identificado en la Tabla 1. Las células después se incubaron con Brefeldina A (Sigma, St. Louis, MO) a 10 µg/ml durante 1 hora, se lavaron, se incubaron a 37 ºC durante 0, 3, o 6 horas en presencia de Brefeldina A (0,5 µg/ml), y después se tiñeron con mAb BB7.2. Para cada punto temporal, se calculó la expresión de HLA-A*0201 inducida por péptido (MFI) como: fluorescencia media de células T2 pre-incubadas con péptido -fluorescencia media de células T2 tratadas en condiciones similares en ausencia de péptido. La CD50 se definió como el tiempo necesario para la pérdida del 50 % de los complejos HLA-A*0201/péptido estabilizados a t = 0. La SEC ID N.º 1 se unió fuertemente a las moléculas HLA-A2.
Tabla 1. Unión de péptidos a HLA-A2
- MFI
- Péptido
- Secuencia SEC ID N.º 0 horas 3 horas 6 horas CD50
- CD133-117
- LLFIILMPLV 2 5,5 7,5 1,01
- CD133-301
- SLNDPLCLV 3 10,69 14,3 13,3
- CD133-405
- ILSAFSVYV 1 79,69 69,26 44,5 >6 h
- CD133-708
- GLLERVTRI 4 13,07 14,81 1,3
- CD133-804
- FLLPALIFAV 5 89 67,59 34,7
- gp100-209-2M
- IMDQVPFSV 15 49,41 32,13 30,5
Para generar CTL específicos de péptido, se aislaron células T CD8 (+) de donantes sanos, después se estimularon por DC autólogas pulsadas con péptido. Se generaron células T específicas después de estimular las PBMC por DC autólogas pulsadas con células madre cancerosas apoptóticas (CSC) irradiadas. Se sintetizaron HLAA*0201/tetrámeros peptídicos conjugados con ficoeritrina. Las células se tiñeron con tetrámeros (5 ng/ml) en PBS + suero AB humano al 0,5 % durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron una vez en el mismo tampón, se tiñeron con mAb anti-CD8 humana-FITC (BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 ºC seguido por análisis de citometría de flujo. Se descubrió que había un 3,72 % de células Tetrámero 405 positivas (SEC ID N.º 1), que era mucho mayor (FIG. 1) que los otros cuatro péptidos ensayados (las FIG. 2, 3, 4 y 5 muestran los resultados de los péptidos de las SEC ID N.º 2, 3, 4, y 5, respectivamente).
También se ensayó la unión de los CTL preparados con péptido a células humanas HLA-A2 positivas. Para generar células dendríticas, se cultivaron células adherentes al plástico a partir de PBMC en medio AIM-V suplementado con GM-CSF humano recombinante e IL-4 humana recombinante a 37 ºC en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. Seis días después, se estimularon las células dendríticas inmaduras con TNF-alfa humano recombinante para la maduración. Después se recogieron las células dendríticas maduras el día 8, se re-suspendieron en PBS a 1 x 106/ml con los péptidos indicados (2 µg/ml), y se incubaron durante 2 horas a 37 ºC. Se co-cultivaron PBMC autólogas (2 x 106 por pocillo) con 2 x 105 por pocillo de células dendríticas pulsadas con péptido en 2 ml/pocillo de medio AIM-V suplementado con suero AB humano al 5 % y 10 unidades/ml de rhIL-7 (Cell Sciences) en cada pocillo de placas de cultivo tisular de 24 pocillos.
En el siguiente día y después cada 3 días después de ello, se añadieron 300 UI/ml de IL-2 al medio. En el día 7, se re-estimularon los linfocitos con células dendríticas autólogas en medio AIM-V suplementado con suero AB humano al 5 %, rhIL-2, y rhIL-7 (10 unidades/ml cada una). Para generar CTL específicos de péptido, se aislaron células T CD8 (+) de donantes sanos, después se estimularon por DC autólogas pulsadas con péptido. Después de tres ciclos de estimulación, estos CTL pudieron reconocer de forma eficaz tanto HLA-A2 como células madre cancerosas CD133 positivas, medido por la cantidad de IFN-γ (pg/ml) en sobrenadante detectado por ELISA (Tabla 2). Sin embargo, no pudieron reconocer las células madre neurales normales CD133 positivas debido a su ausencia de expresión de MHC. Estos hallazgos demostraron que epítopos derivados de CD133 podían procesarse de forma natural y presentarse por sus MHC autólogos en la superficie celular.
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simultánea (Houghten, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5131-35). La pureza e identidad de cada péptido se caracterizan usando un espectrómetro de masas por electronebulización que interactúa con un sistema de cromatografía líquida.
Para ensayar la capacidad estimuladora de los péptidos, se cultivan 25.000 células T en presencia de 50.000 LCL autólogos irradiados y cada uno los péptidos individuales a una concentración final de 10 y 1 µg/ml. La actividad estimuladora de los péptidos positivos se determina con experimentos de titulación de dosis para determinar la concentración que produce una actividad estimuladora del 50 % (CE-50).
Estos estudios identifican péptidos superagonistas derivados del CD133 descrito en este documento. Se identifican péptidos agonistas fuertes reconocidos con valores de CE-50 en el intervalo nanomolar.
Ejemplo 3. Inmunización con péptidos CD133
Se ensaya la vacunación con péptidos y superagonistas del epítopo CD133 A2 para la eliminación de tumores en ratones transgénicos HLA A2 humanizados. Se ensaya la eficacia de la vacunación con epítopo CD133 y su superagonista con respecto a citotoxicidad periférica, infiltración en tumor intracraneal, y supervivencia.
En resumen, se inmunizan ratones HHD con CD133-405 o con cada uno de los superagonistas peptídicos descritos en este documento emulsionados en adyuvante incompleto de Freund y antígeno auxiliar. Se ensayan poblaciones en masa de esplenocitos para la citotoxicidad específica contra las células EL4-HHD pulsadas con CD133405, células EL4-HHD sin pulsar de control, o células EL4-HHD-CD133405. Se realiza la medición de la unión y estabilidad del complejo péptido/HLA-A2. Se compara la supervivencia de animales vacunados con superagonistas de epítopo CD133 con la de ratones inmunizados de forma simulada.
Se sintetizan péptidos y superagonistas de CD133 por química de N-(9-fluorenil) metoxicarbonilo a pureza >95 % como se indica por cromatografía líquida de alto rendimiento analítica y análisis espectrométrico de masas. Los péptidos se disuelven en PBS/DMSO al 10 % a una concentración de 2 mg/ml y se almacenan a -20 ºC hasta su uso.
Los péptidos se ensayan en ratones HHD, que están humanizados con respecto a la expresión de HLA-A2 (Pascolo et al., 1997, J. Exp. Med., 185:2043-51). Los ratones HHD usados son nulos para microglobulina Dbcβ2 y transgénicos para la cadena individual de microglobulina HLA-A*0201-β2 (HHD) (Eguchi et al., 2006, Cancer Res., 66:5883-91; Gross et al., 2004, J. Clin. Invest., 113:425-433).
Se crea una línea de células tumorales HHD-singénica que expresa CD133. El fragmento de ADNc de CD133 humana de longitud completa se genera por PCR de transcripción inversa usando cebadores directos (AGTATGGCTTTCGTTTGCTTGGC; SEC ID N.º 16) e inversos (TACCGAGCTCGGATCCACTAGT; SEC ID N.º 17) y ARN total derivado de células madre cancerosas de glioblastoma multiforme CSC1. El ADNc de CD133 después se clona en el plásmido de expresión pEF6/vector V5-His-TOPO (Invitrogen) para generar pEF6/V5-CD133. Las células EL4-HHD después se transfectan con pEF6/V5-CD133 usando el kit Cell Line Nucleofector T (Amaxa, Gaithersburg, Mariland), y se selecciona el clon resistente a blasticina que expresa de forma estable el nivel más alto de CD133 en base a la citometría de flujo usando mAb contra CD133 (Tessa) (EL4-HHD-CD133) para uso adicional.
Las células se tiñen con tetrámeros HLA-A*0201/SEC ID N.º 1 conjugados con ficoeritrina (10 µg/ml) en PBS que contiene albúmina sérica bovina al 1 % durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavan una vez, y se tiñen con anticuerpo anti-CD8 humano o anti-CD8 de ratón conjugado con FITC (BD Biosciences, San Diego, CA). Se realizan análisis de citometría de flujo usando un citómetro Coulter EPICS (Beckman Coulter, Fullerton, California).
Para medir la unión y estabilidad del complejo péptido/HLA-A2, se incuban células T2 (1 x 106 células/ml) con diversas concentraciones (0,1-100 nmol/l) de péptidos en RPMI 1640 libre de suero a 37 ºC durante una noche en una atmosfera que contiene CO2 al 5 %. Las células después se lavan dos veces con PBS y tiñen con el mAb BB7.2 durante 30 minutos a 4 ºC. Después del lavado, se usa anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con FITC (Caltag, Burlingame, California) como anticuerpo secundario. Se examinan los niveles de expresión en superficie de HLA-A2 por citometría de flujo. Se evalúa la unión del péptido determinando la intensidad de fluorescencia media (MFI).
Se vacunan ratones HHD (en los días 0 y 7) con inyecciones s.c. de 100 µg de CD133-405 o con cada uno de los superagonistas péptidos emulsionados en adyuvante incompleto de Freund (IFA; Difco, Detroit, Michigan) en presencia de 140 µg del epítopo T auxiliar VHBcore128 I-Ab-restringido, que estimula una respuesta de células T auxiliares CD4+. Los animales de control reciben IFA que contiene péptido auxiliar HBV solamente. En el día 11 después de la segunda inmunización, se sacrifican los animales, y se estimulan 5 x 107 esplenocitos in vitro con el mismo péptido que se usa para la estimulación in vivo (10 µmol/l). En el día 6 de cultivo, se ensayan poblaciones en masa para citotoxicidad específica contra células EL4-HHD o EL4-HHD-CD133-405.
Para evaluar la inmunidad protectora sistémica contra exposición a tumor i.c., en el día 7 después de la segunda
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