ES2249907T3 - Anticuerpos de union cd40 y peptidos ctl para el tratamiento de tumores. - Google Patents

Anticuerpos de union cd40 y peptidos ctl para el tratamiento de tumores.

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Abstract

La invención incluye anticuerpos de enlace CD40 junto con péptidos activadores de CTL, incluyendo antígenos tumorales, en una composición farmacéutica. Dicha composición sirve para aumentar el efecto antitumoral de un vacuna tumoral a base de péptidos, o al contrario para la activación de CTLs de tal forma que las CTLs activadas puedan actuar contra las células tumorales o infectadas. Los ligandos CD40 incluyen moléculas de anticuerpo, que incluyen fragmentos de inmunoglobulina como los Fab, (Fab¿)2 y Fv, los péptidos activadores de CTL incluyen el péptido E1A derivado de un adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC ID NO:2), y el péptido E7 del HPV16 derivado de un papilomavirus humano de tipo 16, que posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID NO:3). El anticuerpo de enlace CD40 y el péptido activador de CTL puede ser administrado a un paciente mediante medios adecuados, incluyendo una inyección, o se pueden administrar construcciones genéticas que codifiquen tal molécula y péptido, lamolécula y el péptido siendo producidos de ese modo in vivo o ex vivo. Dicha terapia genética se realiza según unos métodos muy conocidos en la técnica. Si la transfección o infección de las construcciones genéticas es efectuada ex vivo, las células infectadas o modificadas pueden ser administradas al paciente, o estas fases pueden ser realizadas in vivo por lo que el anticuerpo y el péptido son producidos endógenamente. La transfección o infección, si es efectuada ex vivo, puede ser realizada mediante métodos convencionales, incluyendo electroporación, transfección de fosfato cálcico, microinyección o incorporando las construcciones genéticas en liposomas adecuados. Vectores, incluyendo un vector de retrovirus, adenovirus o de parvovirus, o plásmidos, pueden ser utilizados para incorporar las construcciones genéticas, que son expresadas posteriormente in vivo o ex vivo.

Description

Anticuerpos de unión CD40 y péptidos CTL para el tratamiento de tumores.
Campo de la invención
La invención incluye ligandos CD40 junto con péptidos activadores de CTL, incluyendo antígenos tumorales, en una composición farmacéutica.
Antecedentes de la invención
Muchos tumores escapan a la vigilancia de nuestra sistema inmunitario. En pacientes cancerosos existe claramente una carencia cuantitativa y/o cualitativa de mecanismos específicos del sistema inmunológico para eliminar células tumorales. Uno de estos mecanismos está provisto por las células citotóxicas T (CTL) que pueden reconocer y matar las células infectadas por un virus o transformadas en células cancerosas. Previamente se postuló que las células dendríticas (DC) estimulan las células T cooperadoras que, a su vez, proporcionan cooperación para la activación de CTL. Los presentes inventores han demostrado que la célula T cooperadora no provee señales cooperadoras directamente a las CTL (por secreción de IL2), sino más bien, la célula T cooperadora provee una señal a las DC que induce una superficie de célula aún no caracterizada y/o moléculas solubles que pueden activar las CTL en ausencia de células T cooperadoras. La señal proporcionada por la célula T cooperadora a las DC es mediada por una interacción de CD40L-CD40. Este nuevo resultado ha aportado una oportunidad única para la inmunoterapia cancerosa.
El sistema inmunitario es capaz de matar células autólogas cuando éstas son infectadas por un virus o cuando se transforman en células cancerosas. Este mecanismo potencialmente peligroso debe estar, evidentemente, bajo control estricto. El sistema inmunológico de CTL circula como precursores inactivos. Para ser activada, la célula asesina T precursora debe reconocer su péptido antígeno específico, que se presenta en forma de moléculas MCH de clase I en APC profesionales. No obstante, con el fin de preparar estas células T, las APC también necesitan que el antígeno esté presente en un contexto coestimulador apropiado provisto por, entre otras, las moléculas de superficie coestimuladoras B7.1 y B7.2 y por la linfoquina IL-12.
Hasta hace poco se ha considerado que una célula T cooperadora que reconoce el mismo antígeno en la misma APC necesita activar completamente las CTL. La célula T cooperadora específica va a proporcionar citoquinas tales como la IL-2 necesaria para la activación de las CTL. Guerder y Matzinger (J. Exp. Med. 176:553 (1992)), sin embargo, propusieron el modelo "de licencia" para una activación de CTL. En este modelo se ha sugerido que la célula T cooperadora, cuando reconoce su antígeno en una APC profesional, emita una señal de activación a las APC y el resultado es que sería capaz de activar posteriormente una CTL sin necesitar la presencia de la célula T cooperadora. Fue sólo muy recientemente, cuando se averiguó el mecanismo molecular del modelo de licencia. Schoenberger et al. (Nature 393:480 (1998)), describieron el papel de la vía de CD40L-CD40 en el modelo de licencia. Una interacción entre una célula T cooperadora y DC a través de la fijación de CD40-CD40L produce una activación de la DC, y permite así que la DC cebe de manera eficiente la CTL naive.
Las DC circulan por los tejidos de nuestro cuerpo y de esta manera pueden recoger, procesar y presentar antígenos. Después de la recogida de antígenos, éstas migran hacia los ganglios linfáticos de drenaje donde presentan antígenos a las células T. Se conoce el hecho de que una DC necesita ser activada para actuar de manera óptima. Las DC latentes sólo expresan niveles modestos de MCH y de moléculas coestimuladoras y son unos estimuladores pobres de células T. Las DC pueden ser activadas por citoquinas inflamatorias y productos bacterianos, con los que se consigue una sobrerregulación de las MCH y de las moléculas coestimuladoras. La activación de las DC en DC totalmente maduras, que expresan unos niveles óptimos de moléculas MCH, moléculas coestimuladoras y linfoquinas tales como la IL-12, requiere una estimulación adicional de estas células a través del receptor CD40. Por consiguiente, con la combinación de citoquinas inflamatorias en el lugar de absorción de antígeno y la interacción de CD40L-CD40 durante la interacción de una célula T cooperadora se consigue una capacidad óptima para permitir a la DC la activación de las CTL.
Muchos tumores escapan a la vigilancia inmunológica mediante unos mecanismos específicos de las CTL. Si las DC reúnen antígenos tumorales en condiciones no inflamatorias el número de células T cooperadoras que son activadas puede ser demasiado inferior para inducir suficientes CTL que activar para inducir una reacción antitumoral apropiada. Este concepto ha incitado a los investigadores a ayudar al sistema inmunitario mediante la administración de citoquinas tales como IL-2 y IL-12 que estimulan directamente la actividad de las CTL o intensificando la presentación de antígenos mediante la administración de células tumorales transfectadas con GM-CSF. Estas estrategias han producido resultados variables pero alentadores.
Resulta evidente que todavía existe una gran necesidad de encontrar formas para generar y/o mejorar las reacciones protectoras antitumorales que impliquen una inmunidad celular y humoral. La vía de activación de CD40 resultó ser una vía inmunorreguladora más importante para la generación de reacciones inmunológicas humorales primarias y celulares. En el modo descrito anteriormente, la vía de CD40 en DC es responsable de la inducción de reacciones antitumorales de las CTL. Además, la activación de la vía de CD40 en macrófagos estimula una fuerte actividad tumoricida.
Resumen de la invención
La invención incluye anticuerpos de enlace CD40 junto con péptidos activadores de CTL, incluyendo antígenos tumorales, en una composición farmacéutica. Dicha composición sirve para aumentar el efecto antitumoral de un vacuna tumoral a base de péptidos, o al contrario para la activación de CTLs de tal forma que las CTLs activadas puedan actuar contra las células tumorales o infectadas. Los ligandos CD40 incluyen moléculas de anticuerpo, que incluyen fragmentos de inmunoglobulina como los Fab, (Fab')_{2} y Fv, los péptidos activadores de CTL incluyen el péptido E1A derivado de un adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC ID NO:2), y el péptido E7 del HPV16 derivado de un papilomavirus humano de tipo 16, que posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID NO:3).
El anticuerpo de enlace CD40 y el péptido activador de CTL puede ser administrado a un paciente mediante medios adecuados, incluyendo una inyección, o se pueden administrar construcciones genéticas que codifiquen tal molécula y péptido, la molécula y el péptido siendo producidos de ese modo in vivo o ex vivo. Dicha terapia genética se realiza según unos métodos muy conocidos en la técnica. Si la transfección o infección de las construcciones genéticas es efectuada ex vivo, las células infectadas o modificadas pueden ser administradas al paciente, o estas fases pueden ser realizadas in vivo por lo que el anticuerpo y el péptido son producidos endógenamente. La transfección o infección, si es efectuada ex vivo, puede ser realizada mediante métodos convencionales, incluyendo electroporación, transfección de fosfato cálcico, microinyección o incorporando las construcciones genéticas en liposomas adecuados. Vectores, incluyendo un vector de retrovirus, adenovirus o de parvovirus, o plásmidos, pueden ser utilizados para incorporar las construcciones genéticas, que son expresadas posteriormente in vivo o ex vivo.
Aquí se demuestra que la célula T cooperadora para el cebado de CTL es mediada por interacciones del ligando CD40-CD40 (CD40L), y que la carencia de cebado de CTL en ausencia de células CD4^{+} T pueden ser restituida por un anticuerpo monoclonal (mAb) mediado por una activación de CD40 de APC derivada de la médula ósea en presencia de péptidos activadores de CTL incluyendo antígenos tumorales. Además, un bloqueo de CD40L, expresado por células CD4^{+} T, produce un fracaso del aumento de la inmunidad de CTL. Este defecto puede ser superado por una estimulación in vivo de CD40. La estimulación in vivo de CD40 puede mejorar notablemente la eficacia de las vacunas antitumorales a base de péptidos, o al contrario activar las CTLs para conseguir una reacción de la célula antitumoral o antiinfectada.
También se debe tener en cuenta que un péptido activador de CTL puede volverse tolerogénico, lo que significa que la reacción huésped contra las células de expresión de dicho péptido es inhibida en ausencia de anti-CD40. No obstante, dicho péptido combinado con un anticuerpo anti-CD40 activador convierte la tolerización en una activación fuerte de CTL. Además, como se indicó anteriormente, una ligación de CD40 puede proporcionar una vacuna protectora a base de péptido específica del tumor que puede inducir una inmunidad de CTL terapéutica en ratones con tumor.
Estos descubrimientos juntos demuestran que el par de ligando CD40-CD40 actúa como un interruptor que determina si las CTL periféricas naives son cebadas o toleradas. En consecuencia los agentes de enlace de CD40 tales como anticuerpos monoclonales y otros ligandos estimuladores pueden ser utilizados de manera eficaz en combinación con un péptido activador de CTL.
Breve descripción de las figuras
Figura 1
El cebado cruzado de CTLs E1B específico requiere células T cooperadoras de CD4\pm
Unos esplenocitos de ratones normales (a) o ratones B6 con reducción de CD4 (b) inmunizados con MECs de Ad5E1-BALB/c fueron sometidos a unas pruebas con varias proporciones efector/diana para determinar una tisis de células singénicas MEC cargadas con el peptido E1B_{192-200} (líneas continuas), que es derivado de un adenovirus humano y posee la secuencia VNIRNCCYI (SEC ID NO:1) o un péptido restringido D^{d} de control HPV-16 E_{749-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados representan un experimento de tres realizados con resultados similares.
Figura 2
La activación de CD40 reemplaza las células T cooperadoras de CD4\pm
Uno esplenocitos de ratones B6 con reducción de CD4 (a, b) o ratones bloqueados con deficiencia de I-Ab de clase II (KO) (c, d) fueron inmunizados con MECs de Ad5E1-BALB/c y tratados con o bien el anticuerpo FGK45 (a, c) activador de CD40 (Ab) o un anticuerpo isotipo de control (b, d). Estos esplenocitos fueron evaluados para determinar una actividad de CTL E1B específico en células singénicas asignadas MEC cargadas o bien con el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas) o con el péptido de control HPV-16E_{749-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un único ratón. Los datos indicados provienen de dos experimentos independientes. Proporción E/T, proporción efector/diana.
\newpage
Figura 3
Las células B no son esenciales como APCs de cebado cruzado o para el restablecimiento mediado por anti-CD40 de cebado cruzado
Se extrajeron unos espenocitos de unos ratones B6 MT no tratados (a), deficientes de célula B con reducción de CD4 (b, c), que fueron inmunizados con MECs de Ad5E1-BALB/C y que recibieron o bien un anticuerpo isotipo de control (b) o el anticuerpo FGK45 activador de CD40 (c). Estos esplenocitos fueron evaluados para determinar una actividad CTL E1B específico en células diana singénicas MEC cargadas con o bien el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas) o el péptido de control HPV E7_{49-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados representan un experimento de dos realizados con resultados similares.
Figura 4
El bloqueo de CD40L impide el cebado cruzado de CTLs E1B específico
Se extrajeron unos esplenocitos de ratones B6 inmunizados con MECs de Ad5E1-BALB/c y tratados con el anticuerpo MR-1 de bloqueo CD40L (a), o anticuerpo de control (b), o de ratones tratados con el anticuerpo MR-1 de bloqueo de CD40L en combinación con el anticuerpo FGK45 activador de CD40 (c) 24 h después de la inmunización. Estos esplenocitos fueron evaluados para determinar la actividad de CTL E1B específico en células diana singénicas MEC cargadas con el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas) o el peptido de control HPV-16 E7_{49-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados representan un experimento de tres realizados con resultados similares. Proporción E/T, proporción efector/diana.
Figura 5
Los ratones inyectados s.c. con el péptido E1A ya son no capaces de alcanzar la CTL E1A específica
Unos ratones C57BL/6 fueron inyectados s.c. dos veces (en un intervalo de una semana) con 20 \mug de péptido E1A (a, b) o péptido de control (c, d) en IFA, y con un provocador i.p. 1 día más tarde con SAMB7 (b, d), una línea celular de expresión de cantidades elevadas de péptido E1A. Unos cultivos masivos derivados de estos ratones fueron evaluados para determinar la citotoxicidad específica en células diana de E1A pulsadas con el péptido E1A (-\blacksquare-) o el péptido HPV16 E7 (-\medcirc-). Se muestra una tisis específica de cultivos masivos representativos en distintas proporciones de efector a diana (E/T). Este experimento ha sido repetido 4 veces con resultados comparables.
Figura 6
La tolerización del péptido E1A es rápidamente distribuida sistémicamente después de una inyección s.c. en IFA
Unas células de bazo derivadas de ratones no tratados C57BL/6 (-), o de ratones inyectados s.c. 16 horas antes con 100 \mug de péptido HPV16 E1A o E7 en IFA fueron utilizadas como células estimuladoras para un clon de CTL E1A específico. Se muestra la incorporación (cpm) de timidina [^{3}H] +/- S.E.M para distintos efectores de concentraciones estimuladoras, sin sustracción de contenidos anteriores. Los resultados son representativos de 5 experimentos independientes.
Fiqura 7
La inducción de tolerancia de CTL es revertida en cebado de CTL después de una estimulación de CD40 in vivo
Un tipo de ratones salvajes C57BL/6 (a, b) y de ratones H-2^{b} CD404^{-/-} (c, d) fueron inyectados s.c. con 20 \mug de péptido E1A en IFA solo (c), en combinación con un anticuerpo de control de rata IgG2a (a), o en combinación con el mAb anti-CD40 FGK-45 (b, d). Los cultivos masivos de estos ratones fueron evaluados para determinar la citotoxicidad específica de E1A en células diana pulsadas con el péptido E1A (-\blacksquare-), el peptido HPV16 E7 (-\medcirc-) o células tumorales transformadas Ad5E1 (-\blacklozenge-). Se muestra una lisis específica de cultivos masivos representativos de diferentes proporciones E/T. Este experimento ha sido repetido 18 veces (ratones B6) y 2 veces (ratones CD40-/-), respectivamente, con resultados comparables. En (e) se muestra el % de tisis específico de 23 respectivamente 37 cultivos masivos de CTL derivados de ratones B6 inyectados con péptido E1A en IFA solo (izquierda) o en combinación con el mAb anti-CD40 (derecha) en un E/T de 60. Se muestra una desviación media más estándar de cada grupo (E1A contra E1A+anti-CD40: p<0.01, prueba T de Student).
Figura 8
Terapia de células transformadas HPV16 E6 y E7 por tratamiento combinatorio de un péptido junto con una activación in vivo de CD40
Unos ratones fueron inyectados s.c. con 25.000 células singénicas transformadas (TC-1) HPV16. Unos ratones C57BL/6 permanecieron sin tratamiento (-\medcirc-) o después de 6 días recibieron 100 \mug de péptido HPV16 E7 i.p. en IFA (-\square-), 100 \mug de peptido HPV16 E7 i.p. en IFA en combinación con el mAb FGK-45 anti-CD40 (-\blacksquare-) o un péptido de control i.p. en IFA en combinación con el mAb FGK-45 anti-CD40 (-\medbullet-). El porcentaje de ratones con tumores está indicado para distintos grupos de tratamiento (n=10) en (a). Las diferencias entre el grupo tratado con el péptido HPV16 más el mAb anti-CD40, y los otros tres grupos eran estadísticamente significantes (p<0.01) (prueba Log-Rank). En (b) se muestra el porcentaje de animales supervivientes (grupo tratado con péptido E7 contra grupo tratado con péptido E7 más anti-CD40: p = 0.002, prueba Log-Rank).
Realización y uso de la invención
Los anticuerpos de enlace CD40 de la invención pueden ser formados mediante una producción convencional y técnicas de selección. Los anticuerpos monoclonales de CD40 anti-ratón de rata y de hámster ("Mabs") están descritos cada uno en Nature 393: 474-77 (1998) y están disponibles comercialmente (Pharmingen, Inc., CA). El MAb de CD40 anti-ratón, designado por FGK45, que es utilizado en los experimentos descritos a continuación, está descrito por Rolink. A. et al., Inmunity 319-330 (1996). Los MAbs de CD40 anti-humano puede ser formados con las técnicas siguientes muy conocidas en la técnia, y descritas por G. Köhler y C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497). Los MAbs pueden ser cultivados inmunizando roedores (por ejemplo ratones, ratas, hámsters y conejillos de India) o bien con CD40 naive tal como se expresan en células o purificados a partir de plasma o de orina humanos, o de CD40 recombinante o de sus fragmentos, expresados en un sistema eucariótico o procariótico. Se pueden utilizar otros animales para la inmunización, por ejemplo primates no humanos, ratones transgénicos que expresen inmunoglobulinas humanas y ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) transplantados con limfocitos humanos B. Se pueden generar hibridomas mediante procedimientos convencionales por medio de una fusión de limfocitos B de animales inmunizados con células de mieloma (por ejemplo Sp2/0 y NS0), tal como está descrito por G. Köhler y C. Milstein Id. Además, los MAbs anti-CD40 pueden ser generados mediante un filtrado de bibliotecas monocatenarias recombinantes Fv o Fab de limfocitos humanos B en sistemas expresados en fagos. La especificidad de los MAbs con respecto a las CD40 pueden ser evaluada mediante un ensayo immunoenzimático ligado a enzimas (ELISA), inmunoimpresión occidental, u otras técnicas inmunoquímicas. La actividad activadora de los anticuerpos en CTLs, en combinación con un péptido activador de CTL, puede ser determinada mediante los ensayos descritos en los ejemplos más abajo.
Para tratar seres humanos, los MAbs anti-CD40 son usados preferiblemente en forma quimérica, desinmunizada, humana o como anticuerpos humanos. Estos anticuerpos pueden reducir la inmunogenicidad y de esta manera evitar una reacción humana al anticuerpo anti-ratón (HAMA). Se prefiere que el anticuerpo IgG4, IgG2, u otro IgG o IgM mutado genéticamente no aumente la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (S.M. Canfield y S.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491) y complemente una citolisis mediada (Y.Xu et al., J. Biol. Chem., 1994: 269: 3468-3474; V.L. Pulito et al., J. Immunol., 1996; 156: 2840-2850).
Los anticuerpos quiméricos son producidos mediante procesos recombinantes conocidos en la técnica, y poseen una región variable animal y un región constante humana. Los anticuerpos humanos presentan un grado superior de secuencias péptidas humanas que los anticuerpos quiméricos. En un anticuerpo humano, sólo las regiones determinantes complementarias (CDRs) que son responsables del enlace antígeno y de la especificidad son derivados animales y poseen una secuencia de aminoácidos que corresponde al anticuerpo animal, y sustancialmente todas las partes restantes de la molécula (excepto, en algunos casos, las porciones pequeñas de las regiones de estructura situadas dentro de la región variable) son derivados humanos y corresponden a una secuencia aminoácida de un anticuerpo humano. Ver L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, United States Patent No. 5,225,539; C.Queen et al., Patente US No. 5,530,101.
Los anticuerpos desinmunizados son anticuerpos en los que los epítopos de células T y B han sido eliminados, como se describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT/GB98/01473. Estos reducen la inmunogenicidad cuando son aplicados in vivo.
Se pueden formar anticuerpos humanos de distintas maneras, incluyendo el uso de bibliotecas de expresión de la inmunoglobulina humana (Stratagene Corp., La Jolla, California) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (VH, VL, Fv, Fd, Fab, o (Fab')_{2}, y utilizar estos fragmentos para construir anticuerpos humanos completos utilizando técnicas similares a las que se utilizan para producir anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos también en ratones transgénicos con un genoma de inmunoglobulina humana. Dichos ratones son comercializados por Abgenix, Inc., Fremont, California, y Medarex, Inc., Annandale, New Jersey.
También se pueden crear ligandos individuales de cadena de péptidos en las que unas regiones Fv de cadena pesada y ligera están conectadas. Los anticuerpos de cadena simple ("ScFv") y su método de construcción están descritos en la Patente U.S. N°. 4.946.778. De manera alternativa, los Fab pueden ser construidos y expresados por medios similares (M.J. Evans et al., J.Immunol.Meth., 1995; 184: 123-138). Todos los anticuerpos humanos completa y parcialmente son menos inmunogénicos que los MAbs murinos completos, y los fragmentos y anticuerpos de cadena simple son menos inmunogénicos también. Todos estos tipos de anticuerpos por lo tanto tienen menos probabilidades de producir una reacción inmunológica o alérgica. En consecuencia, son más apropiados para una administración in vivo en seres humanos que los anticuerpos animales al completo, especialmente cuando se necesita una administración repetida o a largo plazo. Además, el tamaño más pequeño del fragmento de anticuerpo puede ayudar a mejorar la biodisponibilidad de un tejido, que puede ser fundamental para una mejor acumulación de dosis en casos de enfermedad grave, tal como para el tratamiento de tumores.
En base a las estructuras moleculares de las regiones variables de los mAbs anti-CD40 o de los péptidos activadores de CT conocidos, se puede utilizar un diseño molecular modelado y molecular racional para generar y seleccionar las moléculas que imitan las estructuras moleculares de la región de enlace de los anticuerpos o de los péptidos, respectivamente, y activadores de CTLs. Estas pequeñas moléculas pueden ser péptidos, peptidomiméticos, oligonucleótidos, u otros compuestos orgánicos. Las moléculas imitadoras pueden ser usadas para el tratamiento de cánceres e infecciones. De manera alternativa, se pueden usar procedimientos de selección a gran escala comúnmente usados en este campo para aislar las moléculas apropiadas de bibliotecas de compuestos.
La dosificación de los anticuerpos de enlace CD40 de la invención puede ser determinada fácilmente mediante una extrapolación a partir de pruebas y ensayos in vitro descritos a continuación, o de experimentos animales o a partir de procesos clínicos humanos. Los anticuerpos de la invención serán preferiblemente administrados por inyección, los ensayos y pruebas que demuestran la eficacia de la invención están descritos a continuación.
Ejemplo 1 La señalización a través de CD40 puede reemplazar las células T cooperadoras de CD4\pm en un cebado de CTL
Se utilizó un sistema de modelo bien caracterizado para probar el mecanismo de cooperación de las células T para la activación primaria de las respuestas de CD8+CTL in vivo. Unos ratones C57BL/6 (con el complejo principal de histocompatibilidad (MCH) H-2^{b}) inmunizados con unas células embrionarias de ratón (MECs) alogénicas BALB/C (H-2^{d}) de expresión de una región temprana 1 de un adenovirus humano de tipo 5 (MECs Ad5EI- BALB/C) generaron fuertes reacciones de CTL contra un epítopo restringido H-2D^{b} de la proteina de adenovirus EIB (EIB_{192-200}) (Figura 1a). Puesto que las moléculas de MHC alogeneicas H-2^{d} expresadas por los MECs Ad5EI-BALC/c no pueden cebar los CTLs huésped restringidos de H-2^{b}, la generación de CTLs específicas de E1B debe requerir un cebado cruzado, que es, la incorporación y representación restringida de H-2^{b} de antígeno por los APCs huésped. Un cebado cruzado de CTLs E1B específico es estrictamente cooperador-dependiente (Figura 1b), puesto que los ratones con reducción de células (T_{h})T cooperadoras de CD4+ antes de la inmunización ya no alcanzaban una reacción de CTL E1B específico.
Para investigar si la transmisión a través de CD40 puede reemplazar las células T cooperadoras de CD4+ en un cebado de CTL, se redujeron in vivo unas células T de CD4+ en ratones antes de la inmunización con MECs Ad5E1BALB/c. Un día después de la inmunización, los ratones recibieron una única inyección del anticuerpo activador de CD40 anti-ratón mAb FGK45, o un anticuerpo de control conjugado de isotipo. La administración de FGK45 a ratones inmunizados pobres de CD4, produjo el restablecimiento eficiente de las reacciones de CTL E1B específico (Figura 2a) mientras que éstas no se produjeron durante el tratamiento con los anticuerpos de control (Figura 2b). El cebado de CTLs E1B específico no fue detectado en ratones naives tratados con FGK45 solo (no mostrado). Para tratar la posibilidad de que el efecto de FGK45 fuera mediado a través de células D4+ latentes que no fueron reducidas por el tratamiento con el anticuerpo anti-CD4, unos ratones bloqueados B6 I-A^{b}, con reducción de células T periféricas de CD4+ funcional maduras, fueron inmunizados con MECs Ad5EI-BALB/C. La reacción a la inmunización en estos ratones refleja lo que se ha podido ver en los ratones pobres en CD4, en los que las CTLs E1B específico sólo podían ser detectadas en ratones que recibieron el anticuerpo activador de CD40 (Figura 2c), y no en los que recibieron el anticuerpo de control (Figura 2d).
También se estudió si la necesidad de anticuerpos anti-CD40 para el cebado de CTLs en ratones pobres en CD4 puede ser reemplazada por lipopolisacarido bacteriano (LPS) (50 \mug por intravenosa), un inductor potente de citoquinas proinflamatorias, o por administración de IL-2 (1 x 10^{5} unidades en un adyuvante incompleto Freund, subcutáneo) seguido de una inmunización con MECs Ad5EI-BALB/c. Mientras que los ratones pobres en CD4 tratados con FGK45 presentaron una fuerte actividad de CTL E1B específico, ni el tratamiento de LPS o el de IL-2 produjeron un cebado de CTL detectable (no mostrado).
La ligación de CD40 en células B regula su actividad coestimuladora, lo que sugiere una función para estas células en el restablecimiento de un cebado de CTL mediante el tratamiento con unos anticuerpos activadores de CD40. Para tratar esta cuestión, unos ratones B6 MT, presentando una deficiencia de células maduras B, fueron inmunizados con los MECs alogeneicos Ad5EI-BALB/c. El cebado cruzado de CTLs E1B específico no requería las células maduras B (Figura 3a). No obstante, cuando eran pobres en células CD4+, los ratones con deficiencia de células B no generaban una reacción de CTL E1B específico (Figura 3b). La activación a través de CD40 con el anticuerpo monoclonal FGK45 restituía completamente la capacidad de los ratones MT pobres en CD4 para cebar los CTLs E1B específico (Figura 3c). De esta manera no se necesitaron células B tales como APCs o células secundarias para el cebado cruzado en este sistema modelo, ni tampoco fueron necesarias para el restablecimiento mediado por CD40 del cebado cruzado de CTLs en ausencia de células T cooperadoras de CD4+. Estos resultados demuestran que la activación de APC derivado de una médula ósea a través de CD40 puede desviarse del requisito de las células T cooperadoras de CD4+ en el cebado cruzado de CTLs E1B específico.
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Ejemplo 2 El bloqueo de la capacidad de las células T cooperadoras de CD4\pm para interactuar con APC a través de la vía CD40L-CD40 impide las reacciones de CTL específicas de antígeno en ratones normales
Si la interacción CD40L-CD40 representa la vía fisiológica utilizada por células T cooperadoras de CD4+ para cooperar con las CTLs, el bloqueo de la capacidad de las células T de CD4+ para interactuar con APC a través de una interacción CD40L-CD40 será deseada con el fin de disminuir el cebado de las reacciones de CTL E1B específico en ratones normales. Unos ratones B6 fueron inmunizados con MECs Ad5E1-BALB/c y posteriormente tratados con, o bien el anticuerpo MR1 de bloqueo de CD40L o el anticuerpo de control. El bloqueo de CD40L produce unas reacciones de CTL E1B específico drásticamente reducidas (Figura 4a) en comparación con la eficiencia del cebado de CTL que se ha visto en ratones que han recibido los anticuerpos de control (Figura 4b). La falta de cebado inducido por un bloqueo de CD40L fue completamente restablecida después de la transmisión de CD40 por FGK45 (Figura 4c). Por lo que, la falta de cebado de CTL inducido por el bloqueo de CD40L reside en la deficiencia de las células T_{H} para transmitir, mejor que recibir, señales mediadas por CD40L.
Ejemplo 3 Falta de respuesta de CTL E1A específico después de una administración de péptidos
Un sistema modelo descrito previamente ha sido utilizado (Toes et al., J. Immunol. 156:3911 (1996)). Se ha mostrado que la vacunación s.c. con el epítopo de CTL derivado de Ad5E1A de SGPSNTPPEI (SEC ID NO: 2) en IFA impide controlar en ratones la excrecencia de tumores de expresión de Ad5E1A. Esto indica que la vacuna E1A/IFA indujo más bien una supresión que una inducción de la inmunidad de CTL E1A específico. Además, la administración de la vacuna E1A/IFA en ratones transgénicos (TCR) receptores de células T, que expresa las cadenas TCR \alpha y \beta de un clon de CTL E1A específico, elimina esencialmente una inmunidad mediada por CTL específica de un tumor. Estos experimentos examinaron los efectos de una administración de péptidos en una población monoclonal de CTL. Para establecer si una vacunación s.c. de péptidos E1A induce también una tolerancia de CTL E1A específico en el nivel policlonal de CTL, unos ratones de tipo salvaje C57BL/6 (wt) fueron inyectados con o bien el peptido E1A (Figura 5a y 5b) o con un péptido de control (Figura 5c y 5d). Un día más tarde los ratones fueron estimulados con una línea celular singénica expresando altos niveles de del péptido E1A en su superficie (Figura 5b y 5d). Una inyección de esta línea celular en ratones cebados con el péptido de control induce fácilmente una inmunidad específica de E1A (Figura 5d). No obstante, la capacidad de los ratones para alcanzar respuestas de CTL E1A específico fue anulada después de una vacuna de E1A/IFA (Figura 5b). Estos datos indican que una inyección del péptido E1A conduce no sólo a una tolerancia específica de E1A en ratones transgénicos TCR sino también en ratones de expresión de un repertorio de células T E1A específico policlonal.
Puesto que una inyección s.c. de una vacuna E1A/IFA conduce a una tolerancia sistémica de CTL, se investigó si el péptido E1A es dispersado sistémicamente y presentado al CTL precursor en la periferia. En consecuencia, unos ratones fueron inyectados s.c. con el peptido E1A o el péptido de control derivado de E7 del Virus de Papiloma Humano (HPV) 16 emulsionado en IFA. Las células de bazo de estos ratones fueron aisladas 16 h más tarde y utilizadas como células estimuladoras in vitro para producir un clon de CTL E1A específico. Unos esplenocitos de ratones a los que se inyectó el péptido E1A s.c. indujeron una proliferación específica, mientras que los esplenocitos de ratones a los que se inyectó s.c. el péptido E7 no lo consiguieron (Figura 6). Además, no proliferó un clon de control de CTL en las células de bazo derivadas de ratones a los que se inyectó E1A (datos no mostrados). Por lo tanto, estos datos indican que el péptido E1A inyectado s.c. en IFA es sistémicamente presentado en la periferia por, entre otros, esplenocitos.
En vista de los efectos de tolerancia descritos anteriormente de la vacuna de péptidos E1A, se cuestionó el hecho de saber si una estimulación de CD40 in vivo era suficiente para prevenir una tolerización periférica de CTL y restablecer el cebado de CTL. En consecuencia, se investigó si la inyección de péptidos de tolerancia combinados con la estimulación de CD40 in vivo podía prevenir la inducción de una tolerancia de CTL periférica conduciendo a la inmunidad de CTL específica de un tumor.
En los ejemplos 1 y 2 se ha mostrado que la estimulación de CD40 in vivo puede reemplazar la necesidad de células T cooperadoras de CD4+ en el cebado de respuestas de CTL cooperador-dependiente. Puesto que una actividad de célula T cooperadora mediada por CD4+ está implicada en la prevención de la inducción de una tolerancia periférica de CTL, los inventores se cuestionan sobre el hecho de saber si una activación de CD40 in vivo es suficiente para prevenir una tolerización de CTL E1A específico periférico. Para este fin, unos ratones fueron inyectados con una vacuna de E1A/IFA en combinación con el mAb FGK-45 activador de anti-CD40. Los ratones que recibieron esta combinación alcanzaron unas fuertes respuestas de CTL E1A específico (Figura 7b y 7e), mientras que los ratones que recibieron la vacuna de E1A/IFA (Figura 7e) o de mAb solo no las alcanzaron (no mostrado). Con la combinación de vacuna E1A/IFA y de mAb anti-CD40 no se consiguió generar CTL en ratones con deficiencia de CD40 (Figura 7c y 7d). Además, con una co-inyección de la vacuna E1A/IFA con un mAb de control conjugado de isotipo (Figura 6a) o IL-2 no se consiguió convertir una tolerancia de CTL inducida por la vacuna E1A/IFA en un cebado de CTL (no mostrado). La gama y variación de respuestas al epítopo E1A en el péptido E1A solo, o el péptido E1A más anti-CD40 de los animales vacunados, son mostradas en la figura 7e. De esta manera, la activación sistémica de CD40 puede convertir una tolerancia de CTL periférica inducida con péptidos en una inmunidad mediada por CTL específica del tumor y de los péptidos.
La inducción de una inmunidad específica de E1A se correlacionó estrechamente con la presencia de células T de CD8+ en el bazo de ratones vacunados teñidas con tetrámeros H-2-D^{b} conjugados de PE conteniendo el péptido E1A (D^{b}/E1A). 10 días después de la vacunación, células T de CD8+ teñidas con tetrámeros Db/E1A pueden ser detectadas por medio de una citometría de flujo en ratones inyectados con péptidos E1A y el mAb anti-CD40, pero no en ratones inyectados con péptidos E1A solo (no mostrado). En los ratones inyectados con péptidos E1A, el porcentaje de células CD8+ teñidas con los tetrámeros Db/E1A era de aproximadamente 3%. En ratones vacunados con un adenovirus completo, induciendo una inmunidad potente específica de E1A, se detectaron cantidades comparables de células de bazo CD8+ reactivas con tetrámero D^{b}/E1A. Estos resultados indican que la expansión de células T de CD8+ E1A específico en ratones que recibieron la vacuna E1A/IFA en combinación con el mAb anti-CD40 fue sustancial y equivalente a la que se identificó en animales vacunados con virus.
Ejemplo 4 La estimulación de CD40 aumenta fuertemente la eficacia de las vacunas anticanceríaenas a base de péptidos
Aunque los descubrimientos descritos anteriormente muestran que la provisión de cooperación a través de la estimulación de CD40 es suficiente para prevenir la tolerización de CTL después de la administración de una vacuna de péptidos tolerogénicos, éstos no tratan la cuestión sobre si la eficacia de las vacunas anticancerígenas que normalmente inducen una inmunidad protectora, en vez de una tolerancia, puede ser mejorada mediante una activación a través de CD40. Se examinó si una estimulación de CD40 in vivo beneficiaba los resultados de la vacunación con un péptido derivado de HPV16 E7. Una vacunación con este péptido induce una inmunidad mediada por CTL protectora contra un provocador con células tumorales transformadas de HPV16. Además, este péptido puede ser utilizado en un ámbito terapéutico cuando es cargado en DC activadas in vitro sugiriendo que la resistencia de la respuesta antitumoral es mejorada cuando es presentada por DC activadas.
Unos ratones recibiendo el péptido E7 en combinación con una estimulación de CD40 alcanzaron una respuestas más potente de CTL en comparación con ratones tratados con péptido E7 sólo (datos no mostrados), lo que indica que una estimulación de CD40 aumenta también la eficacia de la vacuna de péptidos HPV16 E7 y confirma los resultados descritos anteriormente con el péptido E1A. Además, los ratones tratados 6 días después con una inyección s.c. de HPV16E6/E7 negativo de CD40 transformaron las células tumorales con el péptido HPV16 E7 solo (cuadrados abiertos) son capaces de retrasar el crecimiento tumoral, aunque con el tiempo la mayoría de los animales mueren por el tumor (Figura 8). No obstante, cuando se combinaba una vacunación de péptidos HPV 16 E7 con una inyección de mAb anti-CD40, el crecimiento tumoral se reducía de forma notable y 7 de 10 ratones rechazaron el tumor, mientras que los animales inyectados con un péptido de control y el mAb anti-CD40 eran incapaces de controlar el crecimiento del tumor. Estos resultados muestran que el efecto de los regímenes de vacunación puede ser mejorado de forma notable cuando la inmunización es combinada con una estimulación de CD40 in vivo. Estos datos proporcionan la base para el desarrollo de vacunas antitumorales extremadamente potentes y nuevas para pacientes cancerosos.
<110> CENTRO UNIVERSITARIO MÉDICO DE LEIDEN
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<120> Ligandos CD40 y Péptidos CTL para el tratamiento de Tumores
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<130> E 2774 EP
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<140> PCT/US99/11419
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<141> 1999-05-21
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<150> 60/086,625
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<151> 1998-05-23
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<160> 3
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<170> FastSEQ para Versión Windows 4.0
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> ratón
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<220>
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<400> 1
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\sa{Val Asn Ile Arg Asn Cys Cys Tyr Ile}
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<210> 2
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> ratón
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<400> 2
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\sa{Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile}
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<210> 3
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> virus de papiloma
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<400> 3
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\sa{Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe}
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Claims (11)

1. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de enlace CD40 y un péptido activador de CTL.
2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 donde el anticuerpo de enlace CD40 es un fragmento del anticuerpo seleccionado del grupo consistente en fragmentos V_{H}, V_{L}, Fv, Fd, Fab, (Fab)_{2} y scFv.
3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2 donde el anticuerpo de enlace modificado CD40 es humano, humanizado, quimérico o desinmunizado.
4. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el péptido activador de CTL es el péptido E1A derivado de un adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC ID NO: 2), o el péptido HPV16 E7 derivado del papilomavirus de humano de tipo 16, que posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID NO: 3).
5. Uso de un anticuerpo de enlace CD40 según las reivindicaciones 1 a 3 y de un péptido activador de CTL tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores o de enfermedades infecciosas.
6. Uso según la reivindicación 5 en el que una composición farmacéutica es adecuada para ser directamente administrada al tumor.
7. Uso de construcciones genéticas codificantes para un anticuerpo de enlace CD40 según las reivindicaciones 1 a 3 y un péptido activador de CTL tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores o de enfermedades infecciosas.
8. Uso según la reivindicación 7 en el que las construcciones genéticas son incorporadas en un vector de etrovirus, adenovirus o parvovirus, o en el que las construcciones genéticas, incorporadas opcionalmente en un vector viral o plásmido, son incorporadas en un liposoma adecuado.
9. Uso según las reivindicaciones 7 u 8 donde el péptido activador de CTL es el péptido E1A derivado de un adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC ID NO: 2), o el péptido HPV 16 E7 derivado del papilomavirus humano de tipo 16, que posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID NO: 3).
10. Célula aislada que comprende las construcciones genéticas según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Uso de una célula según la reivindicación 10 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores o de enfermedades infecciosas.
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