ES2330017T3 - Ligandos de cd40 y peptidos de ctl para tratar tumores. - Google Patents

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Abstract

Uso de un anticuerpo anti-CD40 activador para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor, donde el tratamiento comprende además la administración de un péptido de CTL activador y donde el anticuerpo anti-CD40 activador y el péptido de CTL activador no son administrados en una composición comprendiendo ambos el anticuerpo anti-CD40 activador y el péptido de CTL activador.

Description

Ligandos de CD40 y péptidos de CTL para tratar tumores.
Campo de la invención
La invención se refiere al uso de un anticuerpo activador anti-CD40 y a péptidos activadores de CTL, que incluyen antígenos tumorales, en una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor, donde estos componentes no son administrados en una composición comprendiendo a ambos.
Antecedentes de la invención
Muchos tumores escapan a la vigilancia de nuestra sistema inmunitario. En pacientes cancerosos existe claramente una carencia cuantitativa y/o cualitativa en mecanismos específicos del sistema inmunológico para eliminar células tumorales. Uno de estos mecanismos está provisto por las células citotóxicas T (CTL) que pueden reconocer y matar las células infectadas por un virus o transformadas en células cancerosas. Previamente se determinó que unas células dendríticas (DC) estimulan unas células colaboradoras T que, a su vez, proporcionan una colaboración para la activación de CTL. Los presentes inventores han demostrado que la célula colaboradora T no provee señales colaboradoras directamente a las CTL (por secreción de IL2), sino más bien, la célula colaboradora T provee una señal a las DC que induce una superficie de célula aún no caracterizada y/o unas moléculas solubles que pueden activar las CTL en la ausencia de células colaboradoras T. La señal proporcionada por la célula colaboradora T a las DC es mediada por una interacción de CD40L-CD40. Este nuevo resultado ha aportado una oportunidad única para la inmunoterapia cancerosa.
El sistema inmunitario es capaz de matar células autólogas cuando éstas son infectadas por un virus o cuando se transforman en células cancerosas. Este mecanismo potencialmente peligroso debe estar, evidentemente, bajo control estricto. El sistema inmunológico de CTL circula en forma de precursores inactivos. Para ser activada, la célula asesina T precursora debe reconocer su péptido antígeno específico, que se presenta en forma de moléculas MCH de clase I en APC profesional. No obstante, con el fin de cebar estas células T, las APC también necesitan que el antígeno esté presente en un contexto coestimulador apropiado provisto por, entre otras, las moléculas de superficie coestimuladora B7.1 y B7.2 y por la linfoquina IL-12.
Hasta recientemente se ha considerado que una célula colaboradora T que reconoce el mismo antígeno en la misma APC necesita activar completamente las CTL. La célula colaboradora T específica va a proporcionar citoquinas tales como la IL-2 necesaria para la activación de las CTL. Guerder y Matzinger (J. Exp. Med. 176:553 (1992)), sin embargo, propusieron el modelo "otorgante" para una activación de CTL. En este modelo se ha sugerido que la célula colaboradora T, cuando reconoce su antígeno en una APC profesional, emite una señal de activación a las APC y el resultado es que sería capaz de activar posteriormente una CTL sin necesitar la presencia de la célula colaboradora T. Fue sólo muy recientemente, cuando se averiguó el mecanismo molecular del modelo otorgante. Schoenberger et al. (Nature 393:480 (1998)), describieron la función de la vía de CD40L-CD40 en el modelo otorgante. Una interacción entre una célula colaboradora T y DC a través de la fijación de CD40-CD40L produce una activación de la DC, y permite así a la DC cebar de manera eficiente la CTL original.
Las DC circulan por los tejidos de nuestro cuerpo y de esta manera pueden recoger, procesar y presentar antígenos. Después de la recogida de antígenos, éstas migran hacia los ganglios linfáticos de drenaje donde presentan antígenos a las células T. Se conoce el hecho de que una DC necesita ser activada para actuar de manera óptima. Las DC restantes sólo expresan niveles modestos de MCH y de moléculas coestimuladoras y son unos estimuladores pobres de células T. Las DC pueden ser activadas por citoquinas inflamatorias y productos bacterianos, con los que se consigue una mayor regulación de MCH y de moléculas coestimuladoras. La activación de las DC en DC totalmente maduras, que expresan unos niveles óptimos de moléculas MCH, moléculas coestimuladoras y linfoquinas tales como la IL-12, requiere una activación adicional de estas células a través del receptor de CD40. Por consiguiente, con la combinación de citoquinas inflamatorias en el sitio de absorción de antígeno y la interacción de CD40L-CD40 durante la interacción de una célula colaboradora T se consigue una capacidad óptima para permitir a la DC para una activación de CTL.
Muchos tumores escapan a la vigilancia inmunológica mediante unos mecanismos específicos de CTL. En caso de antígenos tumorales de DC reunidos en condiciones no inflamatorias el número de células colaboradoras T que son activadas puede ser demasiado inferior para inducir suficientes CTL que activar para inducir una reacción antitumoral apropiada. Este concepto ha incitado a los investigadores a ayudar al sistema inmunitario mediante la administración de citoquinas tales como IL-2 y IL-12 que estimulan directamente la actividad de CTL o mediante la estimulación de una presentación de antígeno mediante la administración de células tumorales modificadas con GM-CSF. Estas estrategias han producido resultados variables pero alentadores.
Resulta evidente que todavía existe una gran necesidad de encontrar formas para generar y/o mejorar las reacciones protectoras antitumorales que implican una inmunidad celular y humoral. La vía de activación de CD40 resultó ser una vía inmunoreguladora más importante para la generación de reacciones inmunológicas humorales primarias y celulares. Como se ha descrito anteriormente, la vía de CD40 en DC es responsable de la inducción de reacciones antitumorales de CTL. Además, la activación de la vía de CD40 en macrófagos estimula una fuerte actividad tumoricida.
Resumen de la invención
La invención se refiere al uso de un anticuerpo activador anti-CD40 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor donde el tratamiento comprende además la administración de un péptido activador de CTL y donde el anticuerpo activador anti-CD40 y el péptido activador de CTL no son administrados en una composición comprendiendo ambos el anticuerpo activador anti-CD40 y el péptido activador de CTL.
La invención describe el anticuerpo ligando de CD40 junto con los péptidos activadores de CTL, incluyendo antígenos tumorales, en una composición farmacéutica. Dicha composición sirve para aumentar el efecto antitumoral de un vacuna tumoral de péptidos, o al contrario para la activación de CTL de tal forma que las CTL activadas puedan actuar contra células tumorales o infectadas. Los ligandos CD40 incluyen moléculas de anticuerpo, que incluyen fragmentos de inmunoglobulina como los Fab, (Fab')_{2} y Fv. Los péptidos activadores de CTL incluyen el péptido E1A derivado de un adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC ID NO:2), y el péptido E7 del HPV16 derivado de un virus de papiloma humano de tipo 16, que posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID NO:3).
El anticuerpo ligando de CD40 y el péptido activador de CTL puede ser administrado a un paciente mediante medios adecuados, incluyendo una inyección, o se pueden administrar constructos genéticos que codifiquen tal molécula y péptido, y la molécula y el péptido son producidos de ese modo in vivo o ex vivo. Dicha terapia genética es realizada según métodos muy conocidos en la técnica. Si la transfección o infección de las construcciones genéticas es efectuada ex vivo, las células infectadas o transfectadas pueden ser administradas al paciente, o estas fases pueden ser realizadas in vivo por lo que el anticuerpo y el péptido son producidos endogenamente. La transfección o infección, si es efectuada ex vivo, puede ser realizada mediante métodos convencionales, incluyendo electroporación, transfección de fosfato cálcico, microinyección o incorporando los constructos genéticos en liposomas adecuados. Unos vectores, que incluyen un vector de retrovirus, adenovirus o de parvovirus, o unos plásmidos, pueden ser utilizados para incorporar los constructos genéticos, que son expresados posteriormente in vivo o ex vivo.
Se ha demostrado en la presente que la célula colaboradora T para cebar CTL es mediada a través de interacciones del ligando de CD40-CD40 (CD40L), y que la carencia de cebado de CTL en ausencia de células T CD4^{+} puede ser restituida por la activación de CD40 mediada con el anticuerpo monoclonal (mAb) de APC derivada de la médula ósea en presencia de péptidos activadores de CTL incluyendo antígenos tumorales. Además, el bloqueo de CD40L, expresado por células T CD4^{+}, produce un fallo en el aumento de la inmunidad de CTL. Este defecto puede ser superado por una activación in vivo de CD40. La activación in vivo de CD40 puede mejorar notablemente la eficacia de las vacunas antitumorales a base de péptidos, o al contrario activar las CTL para conseguir una reacción celular antitumoral o antiinfectada.
También se debe tener en cuenta que un péptido activador de CTL puede volverse tolerogénico, lo que significa que la reacción huésped contra las células de expresión de dicho péptido es inhibida, en la ausencia de anti-CD40. No obstante, dicho péptido combinado con un anticuerpo activador anti-CD40 convierte una tolerización en una activación fuerte de CTL. Además, como se ha indicado anteriormente, una ligación de CD40 puede proporcionar una vacuna protectora de péptidos específicos del tumor que puede inducir una inmunidad de CTL terapéutica en ratones que poseen un tumor.
Estos resultados demuestran juntos que el par de ligandos CD40-CD40 actúa en forma de interruptor determinando si las CTL periféricas originales son cebadas o toleradas. Por lo tanto, agentes ligandos CD40 tales como anticuerpos monoclonales y otros ligandos estimuladores pueden ser utilizados de manera eficaz en combinación con un péptido activador de CTL.
Breve descripción de las figuras
Figura 1
El cebado cruzado de CTL específicos de 1B requiere células T colaboradoras de CD4+
Se sometieron esplenocitos de ratones normales (a) o ratones B6 con reducción de CD4 (b) inmunizados con MEC de Ad5E1-BALB/c a unas pruebas con varias proporciones efector/diana para determinar una tisis de células diana MEC singénicas cargadas con el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas), derivado de un adenovirus humano y con la secuencia VNIRNCCYI (SEC ID NO:1) o un péptido restringido D^{d} de control HPV-16 E7_{49-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados representan un experimento de tres realizados con resultados similares.
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Figura 2
La activación de CD40 reemplaza células T colaboradoras de CD4+
Se inmunizaron esplenocitos de ratones B6 con reducción de CD4 (a, b) o ratones bloqueados con deficiencia de I-Ab de clase II (KO) (c, d) con MEC de Ad5E1-BALB/c y tratados con o bien el anticuerpo FGK45 (a, c) activador del anticuerpo anti-CD40 (Ab) o un anticuerpo isotipo de control (b, d). Estos esplenocitos fueron probados para determinar una actividad de CTL específicos de E1B en células diana MEC singénicas cargadas o bien con el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas) o con el péptido de control HPV-16 E7_{49-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un único ratón. Los datos indicados provienen de dos experimentos independientes. Proporción E/T, proporción efector/diana.
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Figura 3
Las células B no son esenciales como APC de cebado cruzado o para el restablecimiento mediado con anti-CD40 de cebado cruzado
Se extrajeron espenocitos de ratones B6 MT no tratados (a), deficientes de célula B con reducción de CD4 (b, c), que fueron inmunizados con MEC de Ad5E1-BALB/C y que recibieron o bien un anticuerpo isotipo de control (b) o el anticuerpo FGK45 activador de CD40 (c). Estos esplenocitos fueron probados para determinar una actividad CTL específicos de E1B en células diana MEC singénicas cargadas con o bien el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas) o el péptido de control HPV E7_{49-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados representan un experimento de dos realizados con resultados similares.
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Figura 4
El bloqueo de CD40L impide el cebado cruzado de CTL específicos de E1B
Se extrajeron esplenocitos de ratones B6 inmunizados con MEC de Ad5E1-BALB/c y tratados con el anticuerpo MR-1 de bloqueo CD40L (a), o anticuerpo de control (b), o de ratones tratados con el anticuerpo MR-1 de bloqueo de CD40L en combinación con el anticuerpo FGK45 activador de CD40 (c) 24 h después de la inmunización. Estos esplenocitos fueron probados para determinar una actividad de CTL específicos de E1B en células diana MEC singénicas cargadas con el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas) o el péptido de control HPV-16 E7_{49-57} (líneas discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados representan un experimento de tres realizados con resultados similares. Proporción E/T, proporción efector/diana.
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Figura 5
Los ratones inyectados s.c. con el péptido E1A va no son capaces de alcanzar CTL específicos de E1A
Unos ratones C57BL/6 fueron inyectados s.c. dos veces (en un intervalo de una semana) con 20 \mug de péptido E1A (a, b) o péptido de control (c, d) en IFA, y con un provocador i.p. 1 día más tarde con SAMB7 (b, d), una línea celular de expresión de cantidades elevadas de péptido E1A. Se probaron cultivos masivos derivados de estos ratones para determinar la citotoxicidad específica en células diana de E1A pulsadas con el péptido E1A (-\blacksquare-) o el péptido HPVI6 E7 del (-\medcirc-). Se muestra una tisis específica de cultivos masivos representativos en distintas proporciones de efector a diana (E/T). Este experimento ha sido repetido 4 veces con resultados comparables.
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Figura 6
La tolerización del péptido E1A es rápidamente distribuida sistémicamente después de una inyección s.c. en IFA
Unas células de bazo derivadas de ratones no tratados C57BL/6 (-), o de ratones inyectados s.c. 16 horas antes con 100 \mug de péptido E1A o HPV16 E7 en IFA fueron utilizadas como células estimuladoras para un clon de CTL específicos de E1A. La incorporación (cpm) de [^{3}H]-timidina +/- S.E.M es mostrada para distintos efectores de concentraciones estimuladoras, sin sustracción de contenidos anteriores. Los resultados son representativos de 5 experimentos independientes.
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Figura 7
La inducción de tolerancia de CTL es transformada en cebado de CTL después de una activación de CD40 in vivo
Un tipo de ratones salvajes C57BL/6 (a, b) y de ratones H-2^{b} CD404^{-/-} (c, d) fueron inyectados s.c. con 20 \mug de péptido E1A en IFA solo (c), en combinación con un anticuerpo de control de rata IgG2a (a), o en combinación con el mAb anti-CD40 FGK-45 (b, d). Se probaron cultivos masivos de estos ratones para determinar una citotoxicidad específica de E1A en células diana pulsadas con el péptido E1A (-\blacksquare-), el péptido HPV16 E7 (-\medcirc-) o células tumorales transformadas Ad5E1 (-\blacklozenge-). Se muestra una tisis específica de cultivos masivos representativos de diferentes proporciones E/T. Este experimento ha sido repetido 18 veces (ratones B6) y 2 veces (ratones CD40^{-/-}), respectivamente, con resultados comparables. En (e) se muestra el % de tisis específico de 23 respectivamente 37 cultivos masivos de CTL derivados de ratones B6 inyectados con péptido E1A en IFA solo (izquierda) o en combinación con el mAb anti-CD40 (derecha) en una E/T de 60. Se muestra una desviación media más estándar de cada grupo (E1A contra E1A+anti-CD40: p<0,01, prueba T de Student).
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Figura 8
Terapia de células transformadas HPV16 E6 y E7 por tratamiento combinatorio de un péptido junto con una activación in vivo de CD40
Unos ratones fueron inyectados s.c. con 25.000 células singénicas transformadas (TC-1) HPV16. Unos ratones C57BL/6 permanecieron sin tratamiento (-\medcirc-) o después de 6 días recibieron 100 \mug de péptido HPV16 E7 i.p. en IFA (-\boxempty-), 100 \mug de péptido HPV16 E7 i.p. en IFA en combinación con el mAb FGK-45 anti-CD40 (-\blacksquare-) o un péptido de control i.p. en IFA en combinación con el mAb FGK-45 anti-CD40 (-\medbullet-). El porcentaje de ratones con tumores está indicado para distintos grupos de tratamiento (n=10) en (a). Las diferencias entre el grupo tratado con el péptido HPV16 más el mAb anti-CD40, y los otros tres grupos eran estadísticamente significantes (p<0,01) (prueba Log-Rank). En (b) se muestra el porcentaje de animales supervivientes (grupo tratado con péptido E7 contra el grupo tratado con péptido E7 más anti-CD40: p = 0,002, prueba Log-Rank).
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Realización y uso de la invención
Los anticuerpos ligandos de CD40 descritos en la invención pueden hacerse mediante técnicas de producción y de selección convencionales. Unos anticuerpos monoclonales de CD40 anti-ratón de rata y de hámster ("Mabs") son descritos cada uno en Nature 393: 474-77 (1998) y están disponibles comercialmente (Pharmingen, Inc., CA). El MAb de CD40 anti-ratón, designado por FGK45, que es utilizado en los experimentos descritos a continuación, está descrito por Rolink. A. et al., Inmunity 319-330 (1996). Los MAbs de CD40 anti-humano pueden ser formados según técnicas muy conocidas en el arte, y descritas por G. Köhler y C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497). Los MAbs puede ser aumentados inmunizando roedores (por ejemplo ratones, ratas, hámsters y conejillos de India) o bien con CD40 original expresado en células o purificado de plasma o de orina humanos, o de CD40 recombinante o de sus fragmentos, expresados en un sistema eucariótico o procariótico. Se pueden utilizar ostros animales para la inmunización, por ejemplo primates no humanos, ratones transgénicos que expresen inmunoglobulinas humanas y ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) transplantados con linfocitos humanos B. Se pueden generar hibridomas mediante procedimientos convencionales por medio de una fusión de linfocitos B de animales inmunizados con células de mieloma (por ejemplo Sp2/0 y NS0), tal como está descrito por G. Köhler y C. Milstein Id. Además, los MAbs anti-CD40 pueden ser generados mediante un filtrado de bibliotecas monocatenarias recombinantes Fv o Fab de linfocitos humanos B en sistemas de expresión bacteriófagos. La especificidad de los MAbs con respecto a las CD40 pueden ser probada mediante un ensayo immunoenzimático ligado a enzimas (ELISA), inmunoimpresión occidental, u otras técnicas inmunoquímicas. La actividad activadora de los anticuerpos en CTL, en combinación con un péptido activador de CTL, puede ser determinada mediante los ensayos descritos en los ejemplos más abajo.
Para tratar seres humanos, los MAbs anti-CD40 son usados preferiblemente como anticuerpos quiméricos, desinmunizados, humanizados o humanos. Estos anticuerpos pueden reducir la inmunogenicidad y de esta manera evitar una reacción humana al anticuerpo anti-ratón (HAMA). Se prefiere el anticuerpo IgG4, IgG2, u otro mutado genéticamente IgG o IgM, que no aumenta la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (S.M. Canfield y S.L. Morrison, J Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491) y complementa una citolisis mediada (Y.Xu et al., J. Biol. Chem., 1994: 269: 3468-3474; V.L. Pulito et al., J Immunol., 1996; 156: 2840-2850).
Los anticuerpos quiméricos son producidos mediante procesos recombinantes conocidos en la técnica, y poseen un región variable animal y un región constante humana. Los anticuerpos humanos presentan un grado superior de secuencias péptidas humanas que los anticuerpos quiméricos. En un anticuerpo humano, sólo las regiones determinantes complementarias (CDR) que son responsables de ligar los antígenos y de la especificidad son derivados animales y poseen una secuencia de aminoácidos que corresponde al anticuerpo animal, y sustancialmente todas las partes restantes de la molécula (excepto, en algunos casos, las porciones pequeñas de las regiones de estructura situadas en el interior de la región variable) son derivados humanos y corresponden a una secuencia aminoácida de un anticuerpo humano. Ver L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, Patente de Estados Unidos No. 5,225,539; C.Queen et al., Patente U.S. número 5,530,101.
Los anticuerpos desinmunizados son anticuerpos en los que los epítopos de célula T y B han sido eliminados, como se describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT/GB98/01473. Estos reducen la inmunogenicidad cuando son aplicados in vivo.
Se pueden hacer anticuerpos humanos de distintas maneras, incluyendo el uso de bibliotecas de expresión de la inmunoglobulina humana (Stratagene Corp., La Jolla, California) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (VH, VL, Fv, Fd, Fab, o (Fab')_{2}, y utilizar estos fragmentos para construir anticuerpos humanos completos utilizando técnicas similares a las que se utilizan para producir anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos también en ratones transgénicos con un genoma de inmunoglobulina humana. Dichos ratones son comercializados por Abgenix, Inc., Fremont, California, y Medarex, Inc., Annandale, New Jersey.
También se pueden crear ligandos individuales de cadenas de péptidos en las que las se conecten regiones Fv de cadena pesada y ligera. Los anticuerpos monocatenarios individuales ("ScFv") y su método de construcción están descritos en la Patente U.S. Nº. 4.946.778. De manera alternativa, los Fab pueden estar construidos y expresados por medios similares (M.J. Evans et al., J Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138). Todos los anticuerpos humanos completa y parcialmente son menos inmunogénicos que los MAbs murinos completos, y los fragmentos y anticuerpos monocatenarios son menos inmunogénicos también. Todos estos tipos de anticuerpos por lo tanto tienen menos probabilidades de producir una reacción inmunológica o alérgica. En consecuencia, son más apropiados para una administración in vivo en seres humanos que los anticuerpos animales al completo, especialmente cuando se necesita una administración repetida o a largo plazo. Además, el tamaño más pequeño del fragmento de anticuerpo puede ayudar a mejorar la biodisponibilidad de un tejido, que puede ser fundamental para una mejor acumulación de dosis en casos de enfermedad grave, tal como para el tratamiento tumoral.
En base a las estructuras moleculares de las regiones variables de los mAbs anti-CD40 o de los péptidos activadores de CT conocidos, se puede utilizar un diseño molecular modelado y molecular racional para generar y filtrar las moléculas que imitan las estructuras moleculares de la región de ligación de los anticuerpos o de los péptidos, respectivamente, y activadores de CTL. Estas pequeñas moléculas pueden ser péptidos, peptidomiméticos, oligonucleótidos, u otros compuestos orgánicos. Las moléculas imitadoras pueden ser usadas para el tratamiento de cánceres e infecciones. De manera alternativa, se pueden usar procedimientos de selección a gran escala comúnmente usados en este campo para aislar moléculas apropiadas de bibliotecas de compuestos.
La dosificación de los anticuerpos ligandos de CD40 de la invención puede ser determinada fácilmente por extrapolación de pruebas y ensayos in vitro descritos a continuación, o de experimentos animales o a partir de procesos clínicos humanos. Los anticuerpos de la invención serán de preferencia administrados por inyección, los ensayos y pruebas que demuestran la eficacia de la invención están descritos a continuación.
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Ejemplo 1
La señalización a través de CD40 puede reemplazar las células T colaboradoras de CD4^{+} en un cebado de CTL
Se utilizó un sistema de modelo bien caracterizado para probar el mecanismo de células T colaboradoras de la activación primaria de las reacciones de CD8^{+} CTL in vivo. Se inmunizaron ratones C57BL/6 (con el complejo principal de histocompatibilidad (MCH) H-2^{b}) con células embrionarias de ratón (MEC) de BALB/C alogénico (H-2^{d}) de expresión de una región temprana 1 de un adenovirus humano de tipo 5 (MEC Ad5EI-BALB/C) generaron fuertes reacciones de CTL contra un epítopo restringido H-2D^{b} de la proteína de adenovirus E1B (E1B_{192-200}) (Figura 1a). Puesto que las moléculas MHC alogeneicas H-2^{d} expresadas por los MEC Ad5EI-BALC/c no pueden cebar los CTL huéspedes restringidos de H-2^{b}, la generación de CTL específicos de E1B debe requerir un cebado cruzado, esto es, la incorporación y representación restringida de H-2^{b} de antígeno por los APC huéspedes. Un cebado cruzado de CTL específicos de E1B es estrictamente colaborador-dependiente (Figura 1b), puesto que los ratones con reducción de células (T_{h}) colaboradoras T CD4^{+} antes de la inmunización ya no alcanzaban una reacción de CTL específicos de E1B.
Para investigar si la señalización a través de CD40 puede reemplazar las células T colaboradoras de CD4^{+} en un cebado de CTL, se redujeron in vivo unas células T CD4^{+} en ratones antes de la inmunización con MEC Ad5E1BALB/c. Un día después de la inmunización, los ratones recibieron una única inyección del anticuerpo activador de CD40 anti-ratón mAb FGK45, o un anticuerpo de control conjugado de isotipo. La administración de FGK45 a ratones inmunizados con reducción de CD4, produjo el restablecimiento eficiente de las reacciones de CTL específicos de E1B (Figura 2a) mientras que éstas no se produjeron durante el tratamiento con los anticuerpos de control (Figura 2b). El cebado de CTL específicos de E1B no fue detectado en ratones originales tratados con FGK45 solo (no mostrado). Para obtener la posibilidad de que el efecto de FGK45 fuera mediado a través de células D4^{+} restantes que no fueron reducidas por el tratamiento con el anticuerpo anti-CD4, se inmunizaron ratones bloqueados B6 I-A^{b}, con reducción de células T periféricas de CD4^{+} funcional maduro, con MECs Ad5El-BALB/C. La reacción a la inmunización en estos ratones refleja lo que se ha podido ver en los ratones con deficiencia de CD4, en los que los CTL específicos de E1B sólo podían ser detectados en ratones que recibieron el anticuerpo activador de CD40 (Figura 2c), y no en los que recibieron el anticuerpo de control (Figura 2d).
También se estudió si la necesidad de anticuerpos anti-CD40 para el cebado de CTL en ratones con reducción de CD4 puede ser reemplazada por lipopolisacáridos bacterianos (LPS) (50 \mug por intravenosa), un inductor potente de citoquinas proinflamatorias, o por administración de IL-2 (1 x 10^{5} unidades en un adyuvante incompleto Freund, subcutáneo) seguido de una inmunización con MEC Ad5EI-BALB/c. Mientras que los ratones con reducción de CD4 tratados con FGK45 presentaron una fuerte actividad de CTL específicos de E1B, ni el tratamiento de LPS o el de IL-2 produjeron un cebado de CTL detectable (no mostrado).
La ligadura de CD40 en células B regula su actividad coestimuladora, lo que sugiere una función para estas células en el restablecimiento de un cebado de CTL mediante el tratamiento con anticuerpos activadores de CD40. Para tratar esta cuestión, se inmunizaron ratones B6 MT, presentando una deficiencia de células maduras B, con los MEC Ad5EI-BALB/c alogeneicos. El cebado cruzado de CTL específicos de E1B no requería las células maduras B (Figura 3a). No obstante, cuando tenían una reducción de células CD4^{+}, los ratones con deficiencia de células B no generaban una reacción de CTL específicos de E1B (Figura 3b). La activación a través de CD40 con el anticuerpo monoclonal FGK45 restituía completamente la capacidad de los ratones MT con reducción de CD4 para cebar los CTL específicos de E1B (Figura 3c). De esta manera no se necesitaron células B tales como APC o células secundarias para el cebado cruzado en este sistema modelo, ni tampoco fueron necesarias para el restablecimiento mediado por CD40 del cebado cruzado de CTL en ausencia de células T colaboradoras de CD4^{+}. Estos resultados demuestran que la activación de APC derivado de una médula ósea a través de CD40 puede desviarse del requisito de las células T colaboradoras de CD4^{+} en el cebado cruzado de CTLs específicos de E1B.
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Ejemplo 2
El bloqueo de la capacidad de las células T colaboradoras de CD4^{+} para interactuar con APC a través de la vía CD40L-CD40 impide las reacciones de CTL específicos de,antígenos en ratones normales
Si la interacción CD40L-CD40 representa la vía fisiológica utilizada por células T colaboradoras de CD4^{+} para colaborar con los CTL, el bloqueo de la capacidad de las células T de CD4^{+} para interactuar con APC a través de una interacción CD40L-CD40 será deseada para disminuir el cebado de las reacciones de CTL específicos de E1B en ratones normales. Se inmunizaron ratones B6 con MEC Ad5E1-BALB/c y posteriormente se trataron con, o bien el anticuerpo MR1 de bloqueo de CD40L o el anticuerpo de control. El bloqueo de CD40L produce reacciones de CTL específicos de E1B drásticamente reducidas (Figura 4a) en comparación con la eficiencia del cebado de CTL que se ha visto en ratones que han recibido los anticuerpos de control (Figura 4b). La falta de cebado inducido por un bloqueo de CD40L fue completamente restablecida después de la transmisión de CD40 por FGK45 (Figura 4c). Por lo que, la falta de cebado de CTL inducido por el bloqueo de CD40L reside en la deficiencia de las células T_{H} para transmitir, mejor que recibir, señales mediadas de CD40L.
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Ejemplo 3
Incapacidad de reacción de CTL específicos de E1A después de una administración de péptidos
Un sistema modelo descrito previamente ha sido utilizado (Toes et al., J. Immunol. 156:3911 (1996)). Se ha mostrado que la vacunación s.c. con el epítopo de CTL derivado de Ad5E1A de SGPSNTPPEI (SEC ID NO: 2) en IFA permite controlar el crecimiento en ratones de tumores de expresión de Ad5E1A. Esto indica que la vacuna E1A/IFA induce más bien una supresión que una inducción de la inmunidad de CTL específicos de E1A. Además, la administración de la vacuna E1A/IFA en ratones transgénicos (TCR) receptores de una célula T, que expresa las cadenas TCR \alpha y \beta de un clon de CTL específicos de E1A, suprime esencialmente la inmunidad mediada por CTL específicos de un tumor. Estos experimentos examinaron los efectos de una administración de péptidos en una población monoclonal de CTL. Para establecer si una vacunación s.c. de péptidos E1A induce también una tolerancia de CTL específicos de E1A en el nivel policlonal de CTL, unos ratones C57BL/6 de tipo salvaje (wt) fueron inyectados con o bien el péptido E1A (Figura 5a y 5b) o con un péptido de control (Figura 5c y 5d). Un día más tarde los ratones fueron estimulados con altos niveles de expresión de línea celular singénica del péptido E1A en su superficie (Figura 5b y 5d). Una inyección de esta línea celular en ratones cebados con el péptido de control induce fácilmente una inmunidad específica de E1A (Figura 5d). No obstante, la capacidad de los ratones para alcanzar reacciones de CTL específicas de E1A fue anulada después de una vacuna de E1A/IFA (Figura 5b). Estos datos indican que una inyección del péptido E1A conduce no sólo a una tolerancia específica de E1A en ratones transgénicos TCR sino también en ratones de expresión de un repertorio policlonal de células T específicas de E1A.
Puesto que una inyección s.c. de una vacuna E1A/IFA conduce a una tolerancia sistémica de CTL, se investigó si el péptido E1A está disperso sistémicamente y presentado al CTL precursor en la periferia. En consecuencia, unos ratones fueron inyectados s.c. con el péptido E1A o el péptido de control derivado de E7 del Virus de Papiloma Humano (HPV) 16 emulsionado en IFA. Las células de bazo de estos ratones fueron aisladas 16h más tarde y utilizadas como células estimuladoras in vitro para producir un clon de CTL específicos de E1A. Los esplenocitos de los ratones a los que se inyectó el péptido E1A s.c. indujeron una proliferación específica, mientras que los esplenocitos de ratones a los que se inyectó s.c. el péptido E7 no lo consiguieron (Figura 6). Además, no se reprodujo un clon de control de CTL en las células de bazo derivadas de ratones a los que se inyectó E1A (datos no mostrados). Por lo tanto, estos datos indican que el péptido E1A inyectado s.c. en IFA es sistémicamente presentado en la periferia por, entre otros, esplenocitos.
En vista a los efectos de tolerancia descritos anteriormente de la vacuna de péptido E1A, se cuestionó el hecho de saber si una activación de CD40 in vivo era suficiente para prevenir una tolerización periférica de CTL y restablecer el cebado de CTL. Por lo tanto, se investigó si la inyección de péptidos de tolerancia combinados con la activación de CD40 in vivo podía prevenir la inducción de una tolerancia de CTL periférica que conduce a la inmunidad de CTL específicos de un tumor.
En los Ejemplos 1 y 2 se ha mostrado que la activación de CD40 in vivo puede reemplazar la necesidad de células T colaboradoras de CD4^{+} en el cebado de reacciones de CTL colaborador-dependiente. Puesto que la actividad colaboradora mediada por las células T CD4^{+} está implicada en la prevención de la inducción de una tolerancia periférica de CTL, los inventores se cuestionan sobre el hecho de saber si una activación de CD40 in vivo es suficiente para prevenir una tolerización de CTL específicos de E1A periférico. Para este fin, unos ratones fueron inyectados con una vacuna de E1A/IFA en combinación con el mAb FGK-45 activador de anti-CD40. Los ratones que recibieron esta combinación alcanzaron unas fuertes reacciones de CTL específicos de E1A (Figura 7b y 7e), mientras que los ratones que recibieron la vacuna de E1A/IFA (Figura 7e) o de mAb solo no las alcanzaron (no mostrado). Con la combinación de vacuna E1A/IFA y de mAb anti-CD40 no se consigue extraer CTL en ratones con deficiencia de CD40 (Figura 7c y 7d). Además, con una co-inyección de la vacuna E1A/IFA con un mAb de control conjugado de isotipo (Figura 6a) o IL-2 no se consigue convertir una tolerancia de CTL inducida por la vacuna E1A/IFA en un cebado de CTL (no mostrado). La gama y variación de las reacciones del epítopo E1A en el péptido E1A sólo, o animales vacunados con péptido E1A más anti-CD40, son mostradas en la figura 7e. De esta manera, la activación sistémica de CD40 puede convertir una tolerancia de CTL periférica inducida con péptido en una inmunidad mediada por el péptido y CTL específicos del tumor.
La inducción de una inmunidad específica de E1A se correlacionaba con la presencia de células T CD8^{+} en el bazo de ratones vacunados teñidas con tetrámeros H-2-D^{b} conjugados de PE conteniendo el péptido E1A (D^{b}/E1A). 10 días después de la vacunación, las células T CD8^{+} teñidas con tetrámeros D^{b}/E1A pueden ser detectadas por medio de una citometría de flujo en ratones inyectados con péptido E1A y el mAb anti-CD40, pero no en ratones inyectados con péptido E1A solo (no mostrado). En los ratones inyectados con péptido E1A, el porcentaje de células CD8^{+} teñidas con los tetrámeros D^{b}/E1A era de aproximadamente el 3%. En ratones vacunados con un adenovirus completo, que induce una inmunidad potente específica de E1A, se detectaron cantidades comparables de células de bazo CD8^{+} reactivas con el tetrámero D^{b}/E1A. Estos resultados indican que la expansión de células T CD8^{+} específicas de E1A en ratones que recibieron la vacuna E1A/IFA en combinación con el mAb anti-CD40 fue sustancial y equivalente a la que se identificó en animales vacunados con virus.
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Ejemplo 4
La activación de CD40 aumenta fuertemente la eficacia de las vacunas anticáncer a base de péptidos
Aunque los resultados descritos anteriormente muestran que la provisión de colaboradores a través de una activación de CD40 es suficiente para prevenir la tolerización de CTL después de la administración de una vacuna de péptidos tolerogénicos, éstos no tratan el problema sobre si la eficacia de las vacunas anticáncer que normalmente inducen una inmunidad protectora, en vez de una tolerancia, puede ser mejorada mediante una activación a través de CD40. Esto fue examinado con el fin de determinar si una activación de CD40 in vivo era apropiada con respecto a los costos de vacunación con un péptido E7 derivado del HPV16. Una vacunación con este péptido induce una inmunidad mediada protectora de CTL contra un provocador con células tumorales transformadas de HPV16. Además, este péptido puede ser utilizado en un ámbito terapéutico cuando es cargado en DC activado in vitro lo que sugiere que la resistencia de la reacción antitumoral es mejorada cuando es presentada por DC activado.
Los ratones que recibieron el péptido E7 en combinación con una activación de CD40 alcanzaban una reacción más potente de CTL en comparación con los ratones tratados con péptido E7 sólo (datos no mostrados), lo que indica que una activación de CD40 aumenta también la eficacia de la vacuna de péptido E7 del HPV16 y confirma los resultados descritos anteriormente con el péptido E1A. Además, los ratones tratados 6 días después con una inyección s.c. de células tumorales transformadas de HPV16E6/E7 con CD40 negativo con el péptido E7 del HPV16 solo (cuadrados abiertos) son capaces de retrasar el crecimiento tumoral, aunque con el tiempo la mayoría de los animales mueren por el tumor (Figura 8). No obstante, cuando se combinaba una vacunación de péptido E7 del HPV 16 con una inyección de mAb anti-CD40, el crecimiento tumoral se reducía de forma notable y 7 de 10 ratones rechazaron el tumor, mientras que los animales inyectados con un péptido de control y el mAb anti-CD40 eran incapaces de controlar el crecimiento del tumor. Estos resultados muestran que el efecto de los regímenes de vacunación puede ser mejorado de forma notable si se combina la inmunización con una activación de CD40 in vivo. Estos datos proporcionan la base para el desarrollo de vacunas antitumorales extremadamente potentes y nuevas para pacientes con cáncer.
La descripción anterior, términos, expresiones y ejemplos son solamente ejemplares y no limitadores. La invención está limitada sólo por las reivindicaciones que seguirán y no por ninguna declaración en cualquier otra parte de este documento o en cualquier otra fuente.
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Documentos citados en la descripción
Esta lista de documentos citados por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet US 5225539 A [0024]
\bullet US 5530101 A, C.Queen [0024]
\bullet GB 9801473 W [0025]
\bullet US 4946778 A [0027]
\bullet US 06086625 A [0043]
Literatura no patente citada en la descripción
\bulletGuerder Matzinger J. Exp. Med, 1992, vol. 176, 553- [0004]
\bulletSchoenberger et al. Nature, 1998, vol. 393, 480- [0004]
\bulletNature, 1998, vol. 393, 474-77 [0022]
\bulletRolink. A. et al. Immunity, 1996, vol. 5, 319-330 [0022]
\bullet G. Köhler C. Milstein Nature, 1975, vol. 256, 495-497 [0022]
\bullet S.M. Canfield S.L. Morrison J. Exp. Med., 1991, vol. 173, 1483-1491 [0023]
\bullet Y. Xu et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 3468-3474 [0023]
\bullet V.L. Pulito et al. J. Immunol., 1996, vol. 156, 2840-2850 [0023]
\bullet L. Riechmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0024]
\bullet M.J. Evans et al. J. Immunol. Meth., 1995, vol. 184, 123-138 [0027]
\bulletToes et al. J. Immunol., 1996, vol. 156, 3911- [0035]
<110> Cornelis J. M. Melief
\hskip1cm
Rienk Offinga 
\hskip1cm
Rene Toes 
\hskip1cm
Stephen P. Schoenberger 
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<120> Ligandos de CD40 y Péptidos de CTL para Tratar Tumores
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<130> 98-4
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 06/086,625
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<151> 1998-05-23
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<160> 2
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<170> FastSEQ para Versión Windows 3.0
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> ratón
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<220>
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> ratón
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<400> 2
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2

Claims (2)

1. Uso de un anticuerpo anti-CD40 activador para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor, donde el tratamiento comprende además la administración de un péptido de CTL activador y donde el anticuerpo anti-CD40 activador y el péptido de CTL activador no son administrados en una composición comprendiendo ambos el anticuerpo anti-CD40 activador y el péptido de CTL activador.
2. Uso según la reivindicación 1 en el que el péptido de CTL activador es un péptido derivado de un tumor.
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