JPS6363381A - 組換えワクチニアウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えワクチニアウィルスに関し、さらに詳し
くは、ウサギ腎細胞において高温増殖性を示さずｑ化鶏
卵漿尿膜上でのボックサイズが小さい弱毒性リスター温
度感受性変異ワクチニアウィルス株をベクターとする組
換えワクチニアウィルスに関する。

（従来の技術） 近年、ワクチニアウィルスに外来性ＤＮＡを組み込んだ
組み換えワクチニアウィルスの構築法が考案され、外来
性ＤＮＡとして、例えば感染症病原体抗原コードＤＮＡ
を用いた組み換えワクチニアウィルスを生ワクチンとし
て利用する方法が提案されるようになった（例えば特開
昭５８−１２９９７１号、特公表昭６０−５００５１８
号など）。

この方法は、例えば次のような手順に従って行われる（
第１図参照）。すなわち、まず初めにワクチニアウィル
スの増殖に必須でないＤＮＡ９Ｊ［Ｍから制限酵素を用
いて適当なりＮＡを切り出し、これをプラスミドに組み
込んで第１のハイブリッドプラスミドを調製する０次い
で、このハイブリッドプラスミドのワクチニアウィルス
ＤＮＡ部分に外来性ＤＮＡを組み込み、第２のハイブリ
ッドプラスミドを調製する。

一方、予めワクチニアウィルスに感染させた動物細胞を
準備しておき、これに第２のハイブリッドプラスミドを
導入すると、感染動物細胞内でワクチニアウィルスと第
２のハイブリッドプラスミドとの間の相同組換えが起こ
り、外来性ＤＮＡを取り込んだ組換えワクチニアウィル
スが形成される（例えば前記公報、細胞工学ＶＯＬ、　
２．　ｍ９、第８４〜８７頁、１９８３年など）。

この方法によれば、目的に応じて種々の外来性ＤＮＡを
組み込むことが可能であり、新しい生ワクチンの製法と
して有望視されている。

しかし、従来法において用いられているワクチニアウィ
ルスはＷＲ株が殆どであり　（前記公報、ジャーナル・
オブ・ヴアイロロジー、ＶＯＬ、　４９　。

Ｐ８５７〜８６４．１９８４年など）、これらは種痘後
の副作用が強（種痘後脳炎・脳症の発生が多く見られる
ことから、安全性の面でその実用化は困難な状況にあっ
た。

そこで本発明者らはより安全性の高い生ワクチンを開発
すべく研究を行った結果、ＷＲ株に代えて弱毒性リスタ
ー温度感受性変異株（すなわちウサギ腎細胞において高
温増殖性を示さず苛化鶏卵禁尿膜上でのボックスサイズ
が小さい弱毒性のリスター温度感受性変異ワクチニアウ
ィルス株）をベクターとして用いることが有効なことを
見い出し、先に特許出願を行った（特願昭６０−１８５
９０号）。

しかし、この方法で得られた組換え体は安全性の点では
優れているが、ワクチニアウィルスゲノムに組み込まれ
た外来性ＤＮＡがワクチニアウィルスの非必須Ｄ　Ｎ　
Ａ　領域に内在しているプロモーターによって支配され
ているため発現効率が充分でなく、とくに哺乳動物に接
種した場合、外来性ＤＮＡ由来蛋白による免疫が得にく
いという問題があった。

（発明が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、かかる従来技術の欠点を克服すべ
く鋭意検討を進めた結果、弱毒性リスター温度感受性変
異株にプロモーター機能を有するＤＮＡと外来性ＤＮＡ
とを近接して組み込むことが有効なことを見い出し、本
発明を完成するに到った・ （問題点を解決するための手段） か（して本発明によれば、ウサギ腎細胞において高温増
殖性を示さず孵化鶏卵漿尿膜上でのボックスサイズが小
さい弱毒性リスター温度感受性変異ワクチニアウィルス
株の非必須Ｄ　Ｎ　Ａ領域に、プロモーター機能を有す
るＤＮＡ及びその支配下で発現可能な外来性ＤＮＡが近
接して組み込まれた組換えワクチニアウィルスが提供さ
れる。

本発明において外来性ＤＮＡを組み込むために供される
ワクチニアウィルスは、リスター株ウィルスの弱毒性温
度感受性変異株であって、孵化鶏卵漿尿膜上でのボック
サイズが３重１以下、好ましくは１１１以下とりスター
親株に比較して小さく、ウサギ腎臓細胞での増殖不能温
度が４１℃、好ましくは４０．５℃のものである。

ここで弱毒性とは、ウサギやサルの中枢神経系病原性が
リスター親株に比較して著しく弱く、かつマウスの末梢
感染による中枢神経系への侵聾性が実質的に認められな
いことをいい（特願昭６０−１８４５９０号の実施例４
参照）、と（に２．０〜２．５　ｋｇの日本内色種ウサ
ギに対して５．８　（ｌｏｇ＋。

ＴＣＩＤＳＯ／　ｄｏｓｅ）を接種し、６日間経過後、
１０％脳乳剤から回収されるウィルス量（ｌｏｇ＋　＠
ＴＣＩＤＳ。／ｌｌ１）が２以下、さらには１以下のも
のが好ましい。

かかる弱毒性温度感受性変異株は、例えば、リスター株
を３０℃においてウサギ腎細胞で継代培養し、プラーク
純化を行ったのち、４０’Ｃにおけ゛るベロ（Ｖｅｒｏ
）細胞での増殖性の極めて悪いものを選択することで得
ることができ、さらに、こうして得た株を孵化鶏卵漿尿
膜上でポックを形成させ、ポックの比較的小さいクロー
ンを選択することにより得ることができる。

本発明で用いられる弱毒性温度感受性変異株の具体例と
しては、以下の方法に従って作出されるＬＡ株やＬＢ株
（ＣＮＴＭ−１−４２３）などが例示される。

１）ＬＡ株の作出 原株のりスター株を３０℃においてウサギ腎細胞で３６
代継代後、プラーク純化を３回行い、５゜クロンを分離
した。その５ｏクロンのうち４０’Ｃにおいてミドリザ
ル腎細胞から樹立されたベロ細胞に最も増殖の悪い温度
感受性変異株を選択した。

この温度感受性変異株を原株と比較したところ、ウサギ
皮層増殖性は原株よりよいが、ウサギ中枢神経系増殖性
は悪く、サルの中枢神経系病原性はＤｌｓ株（大連１株
から作出された微小ポック弱毒変異株）と同程度で原株
と比べて著しく弱いことが確認されたので、少数例の接
種試験を実施した。

その結果、発熱率は１４％で全身反応は軽いが、施皮形
成が遅れる傾向がみられたので、支店増殖性の悪いクロ
ンを分離することを試みた。クロン分離のマーカーとし
て孵化鶏卵漿尿膜上のポックの大きさを用いた。すなわ
ち上述の温度感受性変異株をウサギ腎細胞で６代納代後
プラーク純化を２回行い、孵化鶏卵漿尿膜上のポックの
比較的小さく　（２〜３鶴）均一なりロンを分離し、こ
れをＬＡ株と命名した。この株の増殖不能温度は４１℃
であり、親株に比較してはるかに弱毒性であった。

２）ＬＢ株の作出 ＬＡ株をさらに３０℃においてウサギ腎細胞で３伏縫代
後、孵化鶏卵漿尿膜上のポックの極めて小さい（１鶴以
下）クローンを分離し、これをＬＢ株と命名した。この
株の増殖不能温度は４０．５℃であり、ＬＡ株よりもさ
らに弱毒性であった。

なお、親株として用いたりスター株とＬＢ株の性質の比
較は表１に示すとうりである。

表１　リスター株とＬＢ株の比較 リスター株　ＬＢ株 ボックサイズ　　　　　　大（４，０ｉｎ）　　小（０
，９鶴）卿化鶏卵景尿膜での増殖性　　＋１＋　　　　
÷ベロ細胞での増殖性　　　　　惜　　　　十（注１）
ヒト　　　　　　　　　セ　　　＋ 注１：両者の間に２ｆＯｇ＋ｏ程の差がある。

注２７１０６″’ＴＣＩＤｓｏのウィルスを脳内接種後
、６日目におけるウィルス回収量による。

注３　：　１０’−５ＴＣＩＤ、。のウィルスを視床内
接種による。

これらワクチニアウィルス温度感受性変異株にプロモー
ター機能を有するＤＮＡを連結した外来性ＤＮＡを組み
込む方法に関しては常法に従えばよく、例えば、ワクチ
ニアウィルスＤ　Ｎ　Ａ　領域のうち欠失してもなんら
ウィルスとしての増殖性に根本的な影響を及ぼさない非
必須Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｈ域を利用することにより達成できる
。

すなわち前記の非必須Ｄ　Ｎ　Ａ　ｊＩ域の一部あるい
は全てを含む第１の組換えベクターを構築し、さらに第
１の組換えベクターに組み込まれた非必須ＤＮＡ領域に
、プロモーター機能を有するＤＮＡを連結した外来性Ｄ
ＮＡが挿入された第２の組み換えベクターを構築し、あ
らかじめ前述の温度感受性ワクチニア変異株を感染させ
た動物細胞に第２の組換えベクターをリン酸カルシウム
法などの常法で導入させれば、感染動物細胞内で該ＤＮ
Ａ領域を介しての相同組換えが起こり、プロモーター機
能を有するＤＮＡ及び外来性ＤＮＡが組み込まれた組み
換えワクチニアウィルスが得られる（例えば特公表昭６
０−５００５１８号、　Ｎａｔｕｒｅ。

ＶＯＬ　３０２．７．　Ａｐｒｉｌｌ　９　Ｂ　３年、
Ｐ４９０〜４９５　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ＶＯＬＴ　９　。

Ｐ７４１５〜７４１９．１９８２年など）。

本発明で用いられる前記の非必須Ｄ　Ｎ　Ａ　’ＤＢ域
は増殖性に本質的な影響を及ぼさない部分であればいず
れでもよ（、その具体例として、例えばチミジンキナー
ゼ（ＴＫ）をコードするＤ　Ｎ　Ａ　ＳＩ域、赤血球凝
集素（ＨＡ）をコードするＤＮＡ領域、特開昭５８−１
２９９７１号に見られるようなりＮＡ領領域どが例示さ
れる。

一方、第１の組換えベクターを構築するために用いられ
るベクターは、非必須ＤＮＡを挿入しうるちのであれば
とくに制限されるものではなく、その具体例として、例
えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５゜ｐＢＲ３２７、ｐＢ
Ｒ３２Ｂ　、ｐＵｃ７　、ｐＵｃ８　、ｐｌＪｃ９など
のごときプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなど
のごときファージ、ｐＨｃ７９（ジーン、土工。

２９１．１９８０年）などのごときコスミドが例示され
る。

第１の組換えベクターの構築は常法に従って実施すれば
よく、例えば、ワクチニアウィルスＤＮＡを適当な制限
酵素で完全分解した後、非必須領域に相当するＤＮＡ断
片を分離精製し、該制限酵素切断末端と同じ接着末端を
ＤＮＡに生じさせることのできる制限酵素で切断したベ
クターと酵素的に結合させれば良い。

目的のベクターが首尾良く得られたかどうかは、切断ベ
クターと酵素的に結合させた組換えベクターを含むＤＮ
Ａ混合物で、例えば大腸菌のごとき細菌を形質転換（ま
たは形質導入）し、得られる形質転換株（または形質導
入株）の中から目的の非必須領域ＤＮＡが挿入されたベ
クターを保持する株を選択する等の方法で確認すればよ
い。

本発明においては、かくして得られた第１の組換えベク
ターとプロモーター機能を有するＤＮＡを連結した外来
性ＤＮＡとから、第２の組換えベクターが構築される。

本発明で言うプロモーター機能を有するＤＮＡとは、合
成・天然を問わずワクチニアウィルスが保有する転写の
系でプロモーターとして有効に機能し得るものなら如何
なる塩基配列のものでも良く、例えばＪｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５ｅｐｔ、　１９８４　。

Ｐ２Ｓ５−６６９に例示されるようなワタチニアウィル
スゲノム中に認められるプロモーターＤＮＡ配列、具体
的には７．５Ｋポリペプチドをコードするワクチニアウ
ィルス遺伝子のプロモーター、１９にポリペプチドをコ
ードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモーター、４
２にポリペプチドをコードするワクチニアウィルス遺伝
子のプロモーター、チミジンキナーゼをコードするワク
チニアウィルス遺伝子のプロモーター、２８にポリペプ
チドをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモー
ターなどが例示される。

また、用いられる外来性ＤＮＡはとくに制限されないが
、生ワクチンの開発が期待されている感染症病原体（例
えばウィルス、細菌、寄生虫、原虫など）の抗原タンパ
クをコードするＤＮＡであることが好ましく、その具体
例として、例えばヘルペスウィルス、水庖性口内炎ウィ
ルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス、口蹄疫ウィルス、ポリオウィルス、狂
犬病ウィルス、日本脳炎ウィルス、コレラ菌、サルモネ
ラ菌、破傷風菌、マラリア原虫、住血吸虫などの抗原タ
ンパクをコードするＤ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域などが例示され
る。

本発明においては、第２の組換えベクターの構築に先立
ち、プロモーター機能を有するＤＮＡと外来性ＤＮＡを
予め連結することが必要となる。

そのための方法は第１の組み換えベクターの構築法に準
ずればよ（、例えばプロモーター機能を有するＤＮＡを
ベクターに組み入れた後、プロモータ一部位の下流にＤ
ＮＡを読み取り方向をそろえて外来性ＤＮＡを挿入し、
その後、改めて適当な制限酵素で必要なり　Ｎ　Ａ　ｔ
Ｊ（域だけを該ベクターから切り出せば良い。

この際、プロモーター機能を有するＤＮＡと外来性ＤＮ
Ａを近接して結合することが重要であり、通常はプロモ
ータ一部位中に存在する転写開始部位から外来性ＤＮＡ
中に存在する最初の翻訳開始部位までの距離を２００塩
基対以内、好ましくは１００塩基対以内に調整する。

かくして得られたプロモーター機能を有するＤＮＡに直
結した外来性ＤＮＡと第１の組み換えベクターから第２
の組み換えベクターが作成されるが、その場合にも常法
によって処理すれば良く、例えば第１の組換えベクター
に挿入されたワクチニアウィルス非必須Ｄ　Ｎ　Ａ　領
域に切断部位を持つ制限酵素で該ベクターを切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした後、同じ＜ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理により平滑末端としたプロモーター
機能を有するＤＮＡと直結した外来性ＤＮＡ断片を酵素
的に結合させればよい。

目的とする第２の組換えベクターの取得は、第１の組換
えベクターの場合と同様にして行うことができる。

本発明においては、次いで予めワクチニアウィルスを感
染させた動物細胞に第２の組換えベクターを導入するこ
とによって、組換えワクチニアウィルスが形成される。

ここで用いられる動物細胞はワクチニアウィルスが増殖
可能なものであればよく、その具体例として、例えばＴ
Ｋ−１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ（ヒト羊膜由来）
　、Ｈｅ１ａ　（ヒト子宮頚部癌由来）、ＫＢ（ヒト鼻
咽喉癌由来）、ＣＪ−１（サル腎由来）、Ｂ５Ｃ−１（
サル腎由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由来）、Ｌ９２９（
マウス結合組織由来）、ＣＥ（鶏胚）細胞、ＣＥＦ　（
鶏胎児繊維芽細胞）などが例示される。

また組換えベクターを動物細胞中に４人する手法は常法
に従えばよ（、例えばリン酸カルシウム法、リポソーム
法、マイクロインジェクション法などによって行うこと
ができる。

構築された組換えワクチニアウィルスの選択も常法に従
って行えばよく、例えば非必須Ｄ　Ｎ　Ａ　領域がチミ
ジンキナーゼをコードするＤ　Ｎ　Ａ　９ｉ域である場
合には、感染動物細胞にチミジンキナーゼ欠損株を用い
、相同組換えを起した組換えワクチニアウィルスのプラ
ーク形成用培地として２５μｇ／糟βの５−）゛ロモデ
オキシウリジン（ＢＵｄＲ）を含む細胞培養培地を用い
て３日間培養し、組み換えワクチニアウィルスの形成す
るプラークを選択することにより得ることができる。

しかし、リスター温度感受性変異ワクチニアウィルス株
として増殖不能温度が４０．５℃の株を用いる場合には
、組換えワクチニアウィルスの取得が著しく困難であり
、ＢＵｄＲの濃度を低くした培地を用いて５日以上培養
することによって初めて組換えワクチニアウィルスのプ
ラークを選択することができる。

（発明の効果） このようにして得られた組換えワクチニアウィルスは、
本発明者らが先に構築したプロモーター機能を有するＤ
ＮＡを組み込んでいない組換え体に比較してｉｎ　Ｖｉ
ｔｒｏにおいて数百倍又はそれ以上もの高い発現活性を
有する（後記実施例３参照）。

このような発現活性の改良効果は、ＷＲ株を親株とする
場合の改良効果に比較してはるかに顕著なものである（
特公昭６０−５００５１８号参照）。また本発明の組換
え体は、ＷＲ株を親株とする場合に比較してウィルス感
染価が低いにも拘らず、感染細胞当りの外来性タンパク
産生量はきわめて大である。

また本発明の組換え体は、プロモーター機能を有するＤ
ＮＡを組み込んでいない組換え体とほぼ同等の増殖性を
有し、さらにウサギの中枢神経病原性の面ではより優れ
た性能を有している。

かくして本発明によれば、ウサギ腎細胞において高温増
殖性を示さず孵化鶏卵漿尿膜上でのボックサイズが小さ
いリスター温度感受性変異ワクチニアウィルス株の非必
須Ｄ　Ｎ　Ａ　領域にプロモーター機能を有するＤＮＡ
に直結゛した外来性ＤＮＡを組み込むことにより、哺乳
動物に接種した場合においても増殖性を失なわず、かつ
、十分な外来性ＤＮＡの発現が確保でき、その抗体産生
が可能で、しかも安全性に優れた組み換えワタチニアウ
ィルスを得ることができる。また感染細胞当りの外来性
タンパク産生量が増大することから、試験等において使
用する細胞の量を減少できるという利点を有する。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

比較例１ （１）　　ワクチェアウィルスＴＫ遺伝子を含む第１の
の組換えベクター（プラスミドｐｃＺＯ２）の作製（第
２図参照） ５ｇｇのｐＢＲ３２８をＥｃｏＲＩで消化したのち、フ
ェノール・クロロホルム（１：　１）で抽出し、エタノ
ール沈殿により開裂したｐＢＲ３２８を回収し、次いで
Ｓ１酵素で処理することにより両端を平滑末端とした。

このＤＮＡ断片をライゲーションし、ＥｃｏＲＩ切断部
位を持たないプラスミド（ｐｃＺＯｌ）を得た。ｐｃＺ
Ｏｌの選択はコンピテントな大腸菌Ｃ６００株を連結さ
れたＤＮＡで形質転換し、クロラムフェニコール感受性
の形質転換株を選択することによって実施した。

次いでプラスミドｐｃＺ０１５μｇを旧ｎｄｌで処理し
、フェノール・クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿
後、ＤＮＡを回収した。５′末端リン酸をアルカリフォ
スターゼ処理によって除去し、ＤＮＡを再びフェノール
・クロロホルム抽出後エタノール沈殿によって回収した
。開裂した０、５μｇのｐｃＺＯＩＤＮＡを、ワクチニ
アウィルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含む０．
ＩＩＩｇの精製ワクチニアウィルス（ＷＲ株）　Ｂｉｎ
ｄｎ［Ｊ断片に連結し、得られたハイブリッドプラスミ
ドをｐｃＺＯ２と命名した。

ｐｃＺＯＺ中にワクチニアウィルスＴＫ遺伝子が存在す
ることの確認は、以下の手順によって行った。すなわち
、連結されたＤＮＡでコンピテントな大腸菌Ｈ８１０１
株を形質転換し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性の菌を選択し、次いでビルンボイム（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ）とドーリ−（Ｄｏｌｙ）の方法〔ヌクレイツク
・アシッド・リサーチ、１゜１５１３〜．　　（１９７
９年）〕でププラストを抽出し、旧ｎｄｌＩ［で消化し
たのち電気泳動によってもとのワクチニアウィルス旧ｎ
ｄｍＪ断片と同じ長さの断片が存在するかどうかを調べ
ることによって確認した。

（２１ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子を含む第２の組換えベク
ター（プラスミドｐｃＺＯ３）の作製（第２図参照）Ｂ
型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＢＲＨＢａｄｒ７２　　（ヌクレイツク
・アシ−）ド・リサーチ、ＶＯＬＩ　１．　隘ｌ　３．
４６０１〜４６１０．１９８３年）１０μｇをＢａｍＨ
ＩとＸｈｏ　１で消化したのち低融点アガロース電気泳
動（４０ボルト、１６時間）で約１．２７ｋｂのＤＮＡ
断片を分離した。次いでエチジウムブロマイド染色でＤ
ＮＡ断片を確認後、ゲルを切り出し、フェノール抽出し
たのち、エタノール沈殿によりＨＢｓＡｇ遺伝子を含む
約１．２７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。

回収したＤＮＡ断片は１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　
（ｐＨ８，０）１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液１０ｔ
ｔｌに溶解し、ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端
にしたのちフェノール・クロロホルムで抽出しエタノー
ル沈殿により回収した。

一方、ＥｃｏＲＩリンカ−１ｇｇを、カイネーションバ
ンファー中、１０ユニツトのキナーゼで５′末端をリン
酸化し、（３７℃、３０分）、これに先のＨＢｓＡｇ　
Ｄ　Ｎ　Ａ断片を加えライゲーションした（１２℃、１
６時間）。反応物をフェノール・クロロホルム処理し、
エタノール沈殿でＤＮＡを回収した後、さらに２０ユニ
ツトのＥｃｏＲＩを加えて消化した後、フェノール・ク
ロロホルム処理し、エタノール沈殿を行った。

一方、プラスミドｐｃＺＯ２を緩衝液中で２単位Ｅｃｏ
ＲＩ／μｇ　ＤＮＡで３７℃、２時間処理することによ
り直線化した。直線化されたプラスミドを５　Ｏｎ＋Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１！（ｐＨ９，０）　、１ｗＭ　ＰＬ
ｇ（１ｇ、０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ　ｆｆ１ｔ　１　ｍＭ
スパミジンを含む緩衝液中で０．１単位ウシ小腸アルカ
リフォスターゼで３７℃、３０、分装置することによっ
てプラスミド５′端末を脱リン酸化した。等容量のフェ
ノール・クロロホルムで抽出しエタノール沈殿によって
ＤＮＡを回収した。この直鎖状プラスミド０．１ｇｇを
６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）　　、６
．６ｍＭ　ＭｇＣ！ｌｚ、１０ｍＭ口ＴＴ、　０．５　
ｔａＭＡＴＰ中で１２℃、１５時間処理したのち、ｌＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む１．２７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片０、
２μｇと結合した。このプラスミドを大腸菌）１８１０
１株を形質転換するのに用い、形質転換された大腸菌を
１．５％寒天、５０．ｃ！ｇ／ｍＩ！アンピシリン加Ｌ
Ｂ培地で３７℃、１５時間培養した。寒天上に生育した
形質転換大腸菌を５０ｐｇ　７ｃｍ　１アンピシリン加
ＬＢ液体培地で３７℃、１５時間培養し、前記Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ　＆　Ｄｏｌｙの方法で精製した。

それぞれＤＮＡ試料１０％を緩衝液中で、５単位のＥｃ
ｏＲ１で３７℃で１時間消化し、アガロース電気泳動に
よってプラスミドＤＮＡの１．２７　ｋｂＥｃｏＲＩ断
片をスクリーニングした−１．２７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ
　Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡ断片は、それぞれのプラスミ
ド内で正又はその逆の方向に挿入されうるので、挿入遺
伝子の方向性をスクリーニングした。スクリーニングは
プラスミドｐｃＺＯ２から誘導されたプラスミドを緩衝
液中でＸｈｏ　Ｉで１時間消化し、生成したＤＮＡ断片
をアガロース電気泳動で分析し、その長さを比較するこ
とによって行った＊　ｌＢｓＡｇ遺伝子がワクチニアウ
ィルスＴＫ遺伝子プロモーターに対し正方向に挿入され
ているプラスミドをｐｃＺＯ３、逆の方向に挿入されて
いるプラスミドをｐｃＺＯ４と命名した。

（３）　　Ｍｉ換えワクチニアウィルスの作出６ｃｔｍ
のペトリ皿に培養されたＲＫ−１３細胞を弱毒症そうウ
ィルス株（弱毒症そう株ＬＡ、ウサギ腎細胞における増
殖不能温度４１℃、孵化鶏卵漿尿膜上でのホックサイズ
２〜３＋ｕ、親株からの取得法は前述のとうり）　０．
１　ｐｆｕ／Ｉ！ｔｌ胞で接種４５分後、ワクチニアウ
ィルスＴＫ遺転子中に）ｌＢｓＡｇ遺伝子を挿入された
プラスミドｐｃＺ０３１２μｇを２．２ｍＪの滅菌水で
溶かし、樋高ら（蛋白、核酸、酵素、２７，３４０．１
９８５）の方法によってＤＮＡ−リン酸カルシューム共
沈物をつくり、その０．５ｍｆを感染ＲＫ−１３細胞上
に滴下した。

３０分間、３７℃、５％ＣＯｔインキュベーターに静置
し、１０％牛脂児血清を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ）Ｍ
ＥＭ　４．５　ａｌｌを加えた。その３時間後培養液を
交換し、４８時間培養後、培養細胞ごと３度凍結融解し
、超音波処理（１分）した。

組換え体のｌＢｓＡｇ遺伝子挿入を確認するため、６ｃ
ｆｆｉのペトリ皿に培養されたＴＫ陰性（ＴＫ−）１４
３細胞に上記プラーク形成ウィルスを接種し、４５分後
１％寒天、１２％牛脂児血清、２５ｐｇ／　ｍｊ！ＢＵ
ｄＲｍＥａｇｌｅ　ＭＥＭを積層し、３日間培養後感染
細胞を０．０１％中性紅で染色した。ブラック形成率は
約ｏ、　ｏ　ｏ　ｓ％であった。ペトリ皿より寒天培地
を除去し４℃に保存しペトリ皿の底に残った細胞表面に
滅菌したナイロンメンブレンを押えつけてウィルスを移
し、０．５　Ｎ　ＮａＯＨで１０分、ＬＭ）リス塩酸緩
衝液で５分の処理を３回繰返した後、１．５　Ｍ　Ｎａ
Ｃｊ’　０．５　Ｍ　）リス塩酸緩衝液で５分処理した
。２倍５ＳＣ（１倍ＳＳＣ，０，１５Ｍ　ＮａＣｊ！　
。

０、０１５　Ｍ　ＣＪ４（ＯＨ）（ＣＯＯＮａ）＋）で
会包和させ、８０℃、２時間焼きつけた。４倍５ＥＴ（
０，６Ｍ　ＮａＣｌ　。

０．０８Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｊ！、　　４ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　ｐＨ７，８）　　１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ　−０，
１％ＳＤＳで６８℃、２時間処理し７　た。４倍５ＥＴ
−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ　−０，１％ＳＤＳ　−０，
１％Ｎａ＊ＰｚＯｔ−５０９ｇ　／　ｍｌ変性サケ精子
ＤＮＡとニソクトランスレーシッンによって２２ｐで標
識したＢ型肝炎ＤＮＡを入れて６８℃、１４時間ハイプ
リダイジェイションした。洗浄後、ナイロンメンプラン
とＸ線フィルムを重ね、オートラジオグラフィを行い、
スポットの存在を確認し、４℃に保存してあった寒天に
Ｘ線フィルムを重ねスポットと合致するプラークがｌＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む組換え体（ｒＬＡ株）と同定しＭｆ
ｆｌパスツールピペットで単離した。

比較例２ リスター温度感受性変異ワクチニアウィルスとして弱毒
症そう株ＬＢ株（ウサギ腎細胞における増殖不能温度４
０．５℃、卿化鶏卵漿尿股上でのボックサイズ約０．９
ｆｌ、ＣＮＣＭ−１−４２３）を用いること、及び組換
えワクチニアウィルスの選択法を以下のごとく変更する
こと以外は比較例１に準じて実験を行い、ｌＢｓＡｇ遺
伝子を含む組換え体（ｒＬＢ株）を得た。

組換え体の選択法： ６■のペトリ皿に培養されたＴＫ陰性（ＴＫ−）１４３
細胞に上記プラーク形成ウィルスを接種し、４５分抜機
％寒天、１２％牛脂児血清、１５μｇ／ｍＩ！ＢＵｄＲ
加Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭを積層し、３日間培養後、同じ組
成のＭＥＭを積層し、さらに３日間培養した。

その後、感染細胞を０．０１％中性紅で染色し、以下、
比較例１と同様に処理した。

実施例１ ＜１１　　ワクチニアウィルスＴＫ遺伝子を含む第１の
組換えベクター（プラスミドｐｕＮＺ３４）の作製（第
３図参照） ５μｇのｐｕｃ　９を旧ｎｄｌＩ［で消化したのち、フ
ェノール・クロロホルム（１：　１）で抽出し、エタノ
ール沈殿により開裂したｐｕｃ　９を回収した。５′末
端リン酸をアルカリフォスターゼ処理によって除去し、
ＤＮＡを再びフェノール・クロロホルム抽出後、エタノ
ール沈殿により回収した。開裂した０、５μｇのｐ［Ｉ
ｃ９ＤＮＡを、０．１μｇの精製ワクチニアウィルス（
前記ＬＢ株）　Ｈｉｎｄｌ［［Ｋ断片（約５．０　ｋｂ
ｐ）に連結し、得られたハイブリッドプラスミドをｐＵ
ＮＺ３４と命名した。なお、リスター株の旧ｎｄｌＩ［
Ｋ断片はＷＲ株の旧ｎｄｌ［ＩＪ断片に相当することが
知られており　（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｖｏｌ、↓ｉ。

Ｐ、６８３．１９７９年）、この断片中にＴＫ遺伝子が
存在すると信じられる。

ｐＬＩＮＺ３４中にＨｉｎｄＩｌ［Ｋ断片が存在するこ
との確認は、コンピテントな大腸菌ＪＭ１０３株を形質
転換し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド（０，００３％）、イソプロ
ピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（０，０３ｍＭ）４
０μｇ／１ＩＩｌアンピシリン加のＬＢ寒天培地でコロ
ニーを出させ、白コロニーについて比較例１と同様にＤ
ＮＡを抽出し確認した。

（２１７，５Ｋポリペプチドをコードする初期ワクチニ
アウィルス遺伝子のプロモーターを含むプラスミド（ｐ
ＬＩＷＰ−１）の作製（第４図参照）ワクチニアウィル
ス（ＷＲ株）のＤＮＡ　（約１８　ｏｋｂｐ）　５　μ
ｇを制限酵素ＢｉｎｄＩＩＩで消化したのち、低融点ア
ガロースゲル電気泳動（４０ポルト、１６時間）で約２
１ｋｂｐのＨＬｎｄＩｌ［Ｃ断片を分離した０次いでエ
チジウムブロマイド染色でＤＮＡ断片を確認後、ゲルを
切り出し、フェノール処理したのち、エタノール沈殿に
より旧ｎｄｌｌｌｃ断片を回収した。次にこの）ｌｉｎ
ｄｌＩ［ｃ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し同様の条
件で約９．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　Ａ断片を分離し、上
記の方法でゲルより抽出、エタノール沈殿によりＥｃｏ
ＲＩ　Ａ断片を回収した。さらにこのＥｃｏＲＩ　Ａ断
片を制限酵素５ａｌｌで消化した。一方５μｇのｐＵｃ
　９で５ａＩｔｌで消化したのちフェノール・クロロホ
ルム（１：１）抽出しエタノール沈殿により回収した。

この開裂したｐｕｃ　９に先に調製した５ａｉｌによる
消化断片をライゲーションし、得られた７、５Ｋポリペ
プチドをコードするワクチニアウィルスのプロモーター
領域を含むハイブリッドプラスミドをｐＵＷＨＥｓ−１
と命名した。

先のＥｃｏＲＩ　Ａ断片中には４ケ所の５ａＩｌｌ認識
部位が存在し、５ａ１１で消化した場合、プロモーター
領域を含む断片と含まない断片とがほぼ同じ長さで生成
する（Ｍｏｓｓら、Ｃｅ１１．　ＶＯＬ、　１２５　、
Ｐ８０５〜８１３．１９８１年参照）。そのため、プロ
モーター領域を含まない断片が挿入されたプラスミド（
ｐｔｌＷＨＥＳ−２）も同時に生成するが、この断片中
には旧ｎｃＩ［の認識部位が存在するので、この点を利
用することによって両者の区別が可能となる。

すなわち得られたプラスミドでコンピテントな大腸菌Ｊ
Ｍ１０３株を形質転換し、比較例２の＋１１と同様にし
てプラスミドを抽出したのち、制限酵素ＨｉｎｃＩ［で
消化し、アガロース電気泳動で約０．９ｋｂの断片が得
られるものを選択することによってｐｕｔＩｉ）ＩＥｓ
−１をスクリーニングした。

次いでプラスミドｐＵＷＨＥｓ−１５μｇを制限酵素Ｓ
ａｉ！Ｉで消化したのち、低融点アガロースゲル電気泳
動により約０．９　ｋｂｐの７．５Ｋプロモーター領域
を含むＤＮＡ断片を１μｇ回収した。このＤＮＡ断片ｌ
ＩＪｇを制限酵素Ｒｓａ　Ｉで消化したのち低融点アガ
ロースゲル電気泳動により約０．３　ｋｂｐの７．５Ｋ
プロモーター領域を含むＤＮＡ断片（第４図中の黒い部
分）を０．２μＣ回収した。

一方０．５μｇのｐｕｃ　９をＳａｌ！ｌとＳｍａ　Ｉ
で消化したのちフェノールクロロホルム（１：　１）で
抽出し、エタノール沈殿により回収した０次いで、この
ＤＮＡ断片と７．５Ｋプロモーター領域を含むＤＮＡ断
片と連結し、得られたハイブリッドプラスミドをｐＵＷ
Ｐ−１と命名した。ｐＵＷＰ−１中にワクチニアウィル
ス７．５Ｋプロモーター遺伝子が存在することは、この
プラスミドでコンピテントな大腸菌ＪＭ１０３株を形質
転換し、以下比較例２の（１）と同様に操作しプラスミ
ドを抽出、制限酵素５ａｉｌとＥｃｏＲＩで消化しアガ
ロース電気泳動で約０．３　ｋｂｐの断片が得られるこ
とにより確認した。

（３１７，５Ｋポリペプチドをコードする初期ワクチニ
アウィルス遺伝子のプロモーターと直結したＨＢｓＡｇ
遺伝子を含む（プラスミドｐｌＪＷＰＨＢｓ−１）の作
製（第５図参照） プラスミドｐＵＷＰ−１１，３ｕｇをｔ！ｃｏＲＩで処
理し、フェノール・クロロホルムで抽出してエタノール
沈殿後、ＤＮＡを回収した。５′末端リン酸をアルカリ
フォスターゼ処理によって除去し、ＤＮＡを再びフェノ
ール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によって回
収した。開裂した１、３μｇのｐＵＷＰ−Ｉ　Ｄ　Ｎ　
Ａを、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺
伝子を含む約１．２７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡ断
片（比較例１で用いたものと同じ）に連結した。

ＥｃｏＲＩ　Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡ断片（第５図中の
斜線部分）はそれぞれのプラスミド内で組み込まれたプ
ロモーターに対して正又はその逆の方向に挿入されうる
ので、挿入遺伝子の方向性をスクリーニングした。スク
リーニングはプラスミドｐｕｗｐ−１から誘導されたプ
ラスミドを緩衝液中でＨｉｎｃｌＩで消化し、生成した
ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で分析し、その長さを
比較することによって行った。ＨＢｓＡｇ遺伝子がワク
チニアウィルス７５Ｋプロモーター遺伝子に対し正方向
に挿入されているプラスミドをｐＵＷＰＨＢｓ−１、逆
の方向に挿入されているプラスミドをｐＵＷＰＨＢｓ−
２と命名した。プラスミドｐＬＩＷＰＩＩＢｓ−１に組
み込まれたプロモータ一部位中の転写開始部位とＥｃｏ
ＲＩ　　ＨＢｓＡｇ　ＤＮＡ断片中の翻訳開始部位との
距離は約６０ｂｐであった。

＋４１　７．５　Ｋポリペプチドをコードする初期ワク
チニアウィルス遺伝子のプロモーターと連結したＨＢｓ
Ａｇ遺伝子を含む第２の組み換えベクター（プラスミド
ｐＵＮＺＥｎ）の作製（第６図参照）（１）で得たプラ
スミドｐＵＮＺ３４　５　ｐｇをＥｃｏＲＩで消化した
のち、フェノール・クロロホルム（１：１）で抽出し、
エタノール沈殿により開裂したｐＵＮＺ３４を回収した
。

次いで（３）で調製したプラスミドｐＵＷＰＨＢｓ−１
１０μｇをＨｐａ　ｎで消化したのち、低融点アガロー
ス電気泳動（４０ポルト、１６時間）で約１．２　ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を分離した。次いでエチジウムブロマイ
ド染色でＤＮＡ断片を確認後、ゲルを切り出し、フェノ
ール抽出したのち、エタノール沈殿によりワクチニア７
．５Ｋプロモーター遺伝子、及びＨＢｓＡｇ遺伝子を含
む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これに先の開
裂したｐＵＮＺ３４を加えＤＮＡポリメラーゼで処理し
て平滑末端にしたのちフェノール・クロロホルムで抽出
しエタノール沈殿により回収した。このＤＮＡ断片をラ
イゲーションし、得られた７、５Ｋプロモーターと直結
したＨＢｓＡｇ遺伝子を含むハイブリッドプラスミドを
ｐＵＮＺＥｎと命名した。

ｐＵＮＺＥｎが目的のプラスミドであることの確認はプ
ラスミドを、Ｘｈｏ　Ｉで消化したのち、生成したＤＮ
Ａ断片をアガロース電気泳動で分析し、その長さを比較
することによって行った。

（５）組換えワクチニアウィルスの作出比較例１で用い
たプラスミドｐｃＺＯ３に代えて（４）で調製したプラ
スミドｐＵＮＺＥｎを用いること以外は比較例１の（３
）に記載した方法と同様にして実験を行い、７．５Ｋプ
ロモーター遺伝子とＨＢｓＡｇ遺伝子を含む組換え体（
ｒＬＡ　−Ｐ株）を得た。

実施例２ 比較例２で用いたプラスミドｐｃＺＯ３に代えて実施例
１の（４）で調製たプラスミドｐＵＮＺＥｎを用いるこ
と以外は比較例２に記載した方法と同様にして実験を行
い、７．５Ｋプロモーター遺伝子とＨＢｓＡｇ遺伝子を
含む組換え体（ｒＬＢ　−Ｐ株）を得た。

実施例３ 組換え体の細胞での発現 短試験管に培養したＲＫ−１３細胞（約５×１０’個）
に、ｍ、ｏ、ｉ　２８．２〜３２．３の本発明ウィルス
株（ｒＬＡ　−Ｐ、　ｒＬＢ　−Ｐ）及び対照として７
．５Ｋプロモーターの挿入されていないウィルス株（ｒ
ＬＡ、　ｒＬＢ）を同時に接種し、３７℃、１時間吸着
後ウィルス液を抜き取り、細胞をイーグルＭＥＭで洗Ｈ
１）シ、２％子牛血清を含むイーグルＭＥＭを加えた。

ＨＢｓＡｇ及びＨＢｓＡｇ産生時のワクチニアウィルス
感染価を測定するため、培養後２４時間及び４８時間目
の培養上清及び細胞抽出液を採取した。細胞抽出液は短
試験管の培養上清を採取後、等量の２％子牛血清を含む
イーグルＭＥＭを加え、２回凍結融解したものである。

ＨＢｓＡｇの測定はそれぞれの培養上清及び細胞抽出液
について酵素抗体法（ＥＩＡ法、Ｄｙｎａｐｏｔ社；オ
ースザイム）で実施し、波長４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ
４ｑｚ）の数値で示した。

ワクチニアウィルス力価の測定は以下の方法で実施した
。各採取時の培養上清及び細胞抽出液をイーグルＭＥＭ
を用いて１０進法で希釈し、各希釈０．１ｍｊｉずつを
４本の短試験管に培養したＲＫ−１３細胞に接種し、３
７℃、１時間吸着させた。

吸着後接種ウィルス液を抜きとり、０．５ｎ＋Ａの２％
子牛血清を含むイーグルＭＥＭを加え、３７℃で７日間
回転培養し、ＣＰＨの出現を認めたものを感染とみなし
、ｌ　ａａｌ中のＴＣＩＤｓ。を算出した。

その結果、本発明の組換え体であるｒＬＡ　−Ｐ又はｒ
ＬＢ　−Ｐウィルスは、７．５Ｋプロモーターの挿入さ
れていないｒＬＡまたはｒＬＢウィルスに較べて、培養
時間２４時間及び４８時間のいずれの時点においてもＨ
ＢｓＡｇ産生量は、培養上清及び細胞抽出液とも数百信
条（％’　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＨＢｓＡｇ発現率が格
段に改良されていた。なお両持間のＨＢｓＡｇ測定時の
ウィルス感染価は、それぞれのウィルス株とも１０５・
’　”８・’ＴＣＩＤＳＯ／　ａａｌであり、いずれの
場合にも差は認められなかった。

実施例４ ウサギに対するワクチニアウィルス組換え体の接種 前記実施例もしくは比較例で調製したワクチニアウィル
ス組換え体又はその親株５　ＸＩＯ”　ＴＣＩＤ、。

を日本内色種ウサギの耳部静脈内（ｉｖ）又は７ケ所の
背部皮肉（ｉｄ）に分割し接種することによって感染さ
せた。接種後、２日こ゛とに１４日までウサギの耳静脈
から採血し、その血清を分離して一２０℃で凍結保存し
た。

接種されたウサギは１４日間の観察期間中いずれも異常
を示さなかった。

凍結した血清は室温で放置することによって融解し、エ
ンザイム・イムノ・アッセイ（ＡＵＳＡＢ　ＥＩＡ。

アボットラボラトリーズ、サンプル量０．２ｎ＋４りに
よってＨＢｓＡｇに対する抗体価を測定した。結果を表
３に示す。

なお表３中の抗体価は、血清を順次希釈して試験に供し
、陽性を示す希釈倍率で表示されている。

表３ｍ換えワクチニアウィルスを接種されたウサギによ
る抗ＨＢｓＡｇ抗体価 この結果から、親株（ＬＢ株）や比較例２で得た組換え
体（ｒＬＢ株）に比較して本発明のＵ換え体はｉｎ　ｖ
ｉｖｏにおける抗体産生誘導能が飛躍的に増加している
ことがわかる。

実施例５ ワクチニアウィルス組換え体のウサギ体内士の増殖 実施例４で得た血清を赤血球凝集抑制（Ｈｌ）試験（ウ
ィルス実験学総論改訂二版Ｐ２１７〜国立予防衛生研究
所学友会編、丸善、昭和４８年６月発行）に供し、ワク
チニアウィルスに対する抗体価を調べた。試験は血清の
２倍希釈系列を作成する（すなわち２″倍に希釈）こと
によって実施し、赤血球凝集抑制作用を示す血清の最終
希釈濃度をｎの値で表示した。結果を表４に示す。

表４ この結果から、本発明の組換え体はウサギ体内で親株と
ほぼ同等の増殖性を有することがわかる。

実施例６ ウサギ中枢神経系病原性試験 本発明の組換え体（ｒＬＡ　−Ｐ、　ｒＬＢ　−Ｐ）の
中枢神経系病原性と７．５Ｋプロモーターが挿入されて
いない組換え体（ｒＬＡ、　ｒＬＢ）またはＷＲ株のそ
れとを比較するためウサギの脳内接種試験を実施した。

２．０〜２．５　ｋｇの健康な日本内色種ウサギに、各
に侵入し、そこで増殖し、髄膜・脈絡叢に炎症変化を起
すことによってその発生機序が説明されてきた。上記動
物実験はウィルスの中枢神経病原性を知るための一つの
モデル系と考えられ、中枢神経系病原性の弱い本発明組
換え体は安全性の高いウィルスと考えられ、生ワクチン
として利用することも可能であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換えワクチニアウィルスを作成する手順の概
略を示し、第２図は比較例１における操イ乍手順を示し
、第３〜６図は実施例１における操作手順を示す。 代理人　弁理士　　和　１）端　部 第１図 ワクチニアウ４ルス団株ＤＮＡ 第３図 第５図 第６図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウサギ腎細胞において高温増殖性を示さず孵化鶏卵
   漿尿膜上でのボックスサイズが小さい弱毒性リスター温
   度感受性変異ワクチニアウィルス株の非必須ＤＮＡ領域
   に、プロモーター機能を有するＤＮＡ及びその支配下で
   発現可能な外来性ＤＮＡが近接して組み込まれた組換え
   ワクチニアウィルス。 ２、リスター温度感受性変異ワクチニアウィルス株のウ
   サギ腎細胞における増殖不能温度が４１℃である特許請
   求の範囲第１項記載の組換えワクチニアウィルス。 ３、リスター温度感受性変異ワクチニアウィルスの孵化
   鶏卵漿尿膜上でのボックサイズが、３ｍｍ以下である特
   許請求の範囲第２項記載の組換えワクチニアウィルス。 ４、リスター温度感受性変異ワクチニアウィルス株の非
   必須ＤＮＡ領域がチミジンキナーゼをコードするＤＮＡ
   領域である特許請求の範囲第１項記載の組換えワクチニ
   アウィルス。 ５、プロモーター機能を有するＤＮＡが７．５Ｋポリペ
   プチドをコードする初期ワクチニアウィルス遺伝子のプ
   ロモーターである特許請求の範囲第１項記載の組換えワ
   クチニアウィルス。 ６、外来性ＤＮＡが感染症病原体のタンパクをコードす
   るＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の組換えワク
   チニアウィルス。 ７、タンパクがＢ型肝炎表面抗原である特許請求の範囲
   第６項記載の組換えワクチニアウィルス。