KR20220141834A - 글리코엔지니어링된 박테리아를 포함하는 백신 - Google Patents

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KR20220141834A
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Abstract

본 발명은 박테리아 숙주 세포의 지질 A-코어에 결합되고 박테리아 숙주 외부 표면 상에 위치되는 APP O-항원을 생산하는 이종성 기능성 Actinobacillus pleuropneumoniae(악티노바실러스 플루로뉴모니아, APP) rfb 유전자 클러스터를 포함하는 백신 사용을 위한 그람 음성 박테리아 숙주 세포에 관한 것이고, 여기서 박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터는 기능적이지 않다. 본 발명은 추가로 상기 숙주 세포를 포함하는 조성물, 특히 백신, 및 Actinobacillus pleuropneumoniae(APP) 감염의 예방 및/또는 치료에서 상응하는 용도에 관한 것이다.

Description

글리코엔지니어링된 박테리아를 포함하는 백신
본 발명은 박테리아 숙주 세포의 지질 A-코어에 결합되고 박테리아 숙주 외부 표면에 위치되는 APP O-항원을 생산하는 이종성 기능성 Actinobacillus pleuropneumoniae(악티노바실러스 플루로뉴모니아, APP) rfb 유전자 클러스터를 포함하는 백신 사용을 위한 그람 음성 박테리아 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터는 기능성이 아니다. 본 발명은 추가로 상기 숙주 세포을 포함하는 조성물, 특히 백신, 및 악티노바실러스 플루로뉴모니아(APP) 감염의 예방 및/또는 치료에서의 상응하는 용도에 관한 것이다.
Actinobacillus pleuropneumoniae(APP)는 돼지 산업에서 주요 경제적 손실을 초래하는 돼지의 전염성이 높은 호흡기 질환인 돼지 흉막폐렴의 주요 원인이다. 전파는 에어로졸 또는 감염된 동물 또는 무증상 보균자와의 긴밀한 접촉을 통해 발생한다. 현재까지 서로 다른 지리적 분포를 가진 APP의 18개 혈청형이 표면 협막 다당류에 의해 분류되었다(Bosse et al. 2018, Vet Microbiol., Vol. 220, 83-89). 독력(virulence)의 차이가 존재하지만 모든 혈청형은 질병을 유발할 수 있다. 적어도 18개의 혈청형이 존재하기 때문에 광범위하게 보호되는 백신을 개발하기가 어렵다. 질병의 경제적 중요성은 APP 백신 분야에서 지난 몇 년 동안 집중적인 연구를 자극하였다. 그러나 항생제를 사용하여 질병을 통제하고 항생제 내성이 전 세계적으로 놀라운 수준에 도달함에 따라 대체 해결책이 필요하다.
APP에 대한 현재 사용 가능한 백신은 주로 비활성화된 전체 세포 박테린(화학적으로 비활성화된 박테리아 세포) 또는 외부 막 단백질을 기반으로 하는 서브유닛 백신으로 구성된다. 일부 백신은 APP 발병에서 중심적인 역할을 하는 기공 형성 세포용해소(cytolysin) 세트인 Apx 독소(ApxI-IV 톡소이드)를 기반으로 하거나 이로 보완된다. 현재까지 상용화된 모든 백신이 유도하는 보호효과는 만족스럽지 못하다. 박테린 기반 백신과 서브유닛 백신은 이종성 균주에 대해 제한된 보호를 제공하는 것으로 나타났다. 비활성화된 Apx 독소를 기반으로 한 백신은 감염과 관련된 이환율을 줄이는데 효과적이지만 폐의 콜로니화를 예방할 수 없으며, 그의 사용은 무증상 보균자에 의한 감염을 유발할 수 있는 잠재적 위협이 된다(Andresen et al. 1997, Acta Vet Scand, Vol. 38, 283-293, Antenucci et al.2017, Vet Res., Vol. 48:74, Antenucci et al.2018, Vet Res., 49:4, Haesebrouck et al. 2004, Vet Microbiol., Vol. 100, 255-268, Loera-Muro and Angulo 2018, Vet Micro-biol. Vol. 217, 66-75, Ramjeet et al. 2008, Anim Health Res Rev, Vol. 9(1), 25-45).
박테리아 백신 개발을 위한 표면 단백질 외에 잠재적인 항원 구조는 병원성 박테리아의 표면에 존재하는 글리칸(glycan)이다. 이 글리칸은 감염된 숙주의 면역 체계의 첫 번째 접촉점 중 하나이다. 그람 음성 박테리아의 두 가지 두드러진 표면 글리칸 구조는 세포외 협막 다당류(CPS, 그람 양성 및 음성 박테리아) 및 지질다당류(LPS, 그람 음성 박테리아)이다. 인간 분야에서 박테리아성 질병에 대한 글리칸 기반 백신 개발은 주로 CPS 구조에 중점을 두었다. CPS 구조를 분리하고 이러한 글리칸을 면역자극 단백질 운반체에 화학적으로 접합함으로써 여러 박테리아성 질병이 해결되었다. 사노피 파스퇴르의 파상풍 톡소이드에 접합된 H. 인플루엔자 B형의 CPS(제품 ActHIB) 및 GSK 백신의 디프테리아 톡소이드에 접합된 4개의 Neisseria meningitidis 혈청형의 CPS(Menveo), 화이자(Pfizer)의 디프테리아 톡소이드에 접합된 13개의 Streptococcus pneumoniae 혈청형의 CPS(Prevnar 13)는 이러한 유형의 CPS 기반 백신의 성공적인 개발에 대한 세 가지 예를 대표한다.
그러나 수의학적 백신 개발을 위해 표면 글리칸의 분리 및 운반체 구조로 후속적인 화학적 접합은 비경제적인 생산 비용을 초래한다.
본 발명에 근본적인 목적은 APP 박테리아의 많은, 대부분, 바람직하게는 본질적으로 모든 혈청형에 대한 보호를 제공하는 안전하고 효율적인 백신을 제공하는 것으로, 이는 식품 생산에서 항생제 치료의 상당한 감소를 허용하고, 돼지의 비육 기간 동안 임상 발병 및 손실을 감소시킨다.
이 목적은 다음을 포함하는 백신 사용을 위한 그람 음성 박테리아 숙주 세포를 제공함으로써 해결된다:
(a) 이종성 기능성 악티노바실러스 플루로뉴모니아(APP) rfb 유전자 클러스터, 여기서 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 박테리아 숙주 세포의 지질 A-코어에 결합되고 박테리아 숙주 외부 표면에 위치되는 APP O-항원을 생산하고, 및 여기서 박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터는 기능성이 아닌 것인 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터;
(b) 선택적으로, 내인성 rfb 유전자 클러스터에 대한 내인성 프로모터보다 더 강한 이종성 APP rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 이종성 프로모터;
(c) 선택적으로, APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자;
(d) 선택적으로, Apx 독소의 적어도 하나의 중화 에피토프, 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 적어도 하나의 중화 에피토프, 선택적으로 박테리아 숙주 외부 세포 표면에 위치되고 및/또는 세포로부터 분비되는 적어도 하나의 중화 에피토프;
여기서 선택적으로 (a), (c) 및 (d) 중 적어도 하나는 박테리아 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된다.
본 명세서에 포함되어 있다.
하기 도 및 실시예는 본 발명을 예시하는 역할을 하며 첨부된 청구범위에 기재된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
도 1은 서열화된 APP2 균주로부터 확인된 APP rfb 클러스터의 개략도이다. 길이가 12928bp인 APP2의 rfb 클러스터는 추정상의 글리코실트랜스퍼라제, 글리칸 변형 효소, 사슬 길이 결정자 단백질, O-항원 수송자, 아세틸트랜스퍼라제 및 가상 단백질(O-항원 중합 효소 wzy와 상동성을 가짐)을 암호화하는 13개의 유전자로 구성된다. 유전자의 위치와 클러스터 크기는 염기쌍으로 제공된다. h.P. - 가상 단백질.
도 2는 인접(flanking) 유전자 erpA를 가진 APP2의 O-항원 생합성 클러스터의 개략도이고 추가 다운스트림 서열이 사용되어 SL1344 및 E. coli_5에 통합되었다. 완전한 단편은 13758bp의 길이를 가진다. 유전자의 위치와 클러스터 크기는 염기쌍으로 제공된다. h.P. - 가상 단백질.
도 3은 rfb 클러스터의 인접 상동성 숙주 세포 영역을 가진 pDOC 플라스미드에 위치된 APP2 O-항원 생합성 클러스터의 개략도이다. APP2 rfb 클러스터 및 그의 인접 영역을 함유하는 13758 bp 단편(도 2 참조)은 내인성 rfb 클러스터에 대한 안티센스 방향으로 SL1344 및 E. coli_5로 통합되도록 변경되었다. 이를 위해 FRT 사이트 인접된 카나마이신 내성 카세트가 다운스트림에 융합되었다. 융합 구조물은 SL1344 또는 E. coli_5(안티센스 방향의 galF 유전자 포함)의 rfb 클러스터 인접된 상동성 영역에 의해 업스트림 및 다운스트림에 인접된다. 전체 구조물은 I-SceI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위에 인접된다.
도 4는 내인성 rfb 클러스터의 인접 상동 영역을 가진 pDOC 플라스미드 상에 위치된 코돈 최적화된 APP2 O-항원 생합성 클러스터의 개략도이다. APP2의 코돈 최적화 rfb 클러스터를 SL1344 및 E. coli_5에 통합하기 위해 내인성 rfb 클러스터에서 원래의 통합 사이트는 동일하게 유지되었다. 코돈 최적화(E. coli 발현용) APP2 rfb 클러스터가 합성되었고, 이는 카나마이신 내성 카세트(FRT 부위에 인접됨)를 5' 영역에서 암호화하였다. 이것은 카나마이신 유전자의 프로모터에 의해 조절된 전사를 초래한다. 전체 구조물은 I-SceI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위에 인접된다.
도 5의 A 내지 D는 APP2 O-항원 생합성 클러스터를 발현하는 SL1344에서 wzy 및 gne의 염색체외 발현(A, B) 및 APP2 O-항원 생합성 클러스터를 발현하는 E. coli_5에서 gne의 염색체외 발현(C, D)의 검증을 위한 겔의 APP2 LPS에 대한 웨스턴 블롯(A, C) 및 은 염색(B, D) 사진이다. Wzy 및/또는 gne는 카나마이신 내성 카세트의 다운스트림에서 APP2 rfb 클러스터(코돈 최적화가 있거나 없는)를 발현하는 SL1344 및 E. coli_5 세포에서 아라비노스 유도성 프로모터의 제어 하에서 플라스미드상에 암호화되었다. 세포는 0.1%(SL1344 세포) 또는 0.2%(E. coli_5) 아라비노스로 유도되고 하룻밤 배양물은 세포의 프로테이나제 K 처리에 의해 APP2 LPS 발현에 대해 및 SDS-PAGE를 통한 분해된 추출물의 분석에 의해 분석되었다. 왼쪽에는 분자 마커 밴드가 kDa로 표시된다. 레인 1: APP2 P1875, 레인 2: SL1344, 레인 3: SL1344 Δrfb, 레인 4: SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy, 레인 5: SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD pEC415, 레인 6: SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD-gne, 레인 7: SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pEC415-wzy, 레인 8: SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD-gne pEC415-wzy, 레인 9: E. coli_5, 레인 10: E. coli_5 Δrfb, 레인 11: E. coli_5 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.), 레인 12: E. coli_5 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD, 레인 13: E. coli_5 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD-gne
도 6의 A 및 B는 E. coli_5 및 SL1344 유도체에 통합될 단편 rfaL-Ωgne/cat(A) 및 rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(B)를 생성하기 위한 중첩 PCR의 개략도이다. (A) 겹치는 영역이 있는 gne 및 cat에 대한 rfaL-Ωgne/cat를 생성하기 위해, 개별 단편이 증폭되었다. 중첩 PCR로 두 단편이 융합되었고 5' 및 3' 말단이 연장되어 E. coli_5 및 SL1344의 게놈에서 표적 통합 부위를 가진 상동 영역을 암호화하였다. 중첩 PCR에 의해 3개의 단편을 결합하고 5 및 3' 말단의 서열에서 상동 재조합 서열을 통합하기 전에, 코돈 최적화된 wzy를 암호화하는 추가 단편이 생성되었다는 점을 제외하고 통합 구조물 rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(B)를 생성함으로써 동일한 원리를 따랐다.
도 7은 cat/kP 통합 구조물의 개략도이다. 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터의 업스트림에 카나마이신 프로모터(kP)를 통합하기 위해, 카나마이신 내성 카세트(pKD4에 암호화됨)의 373bp 프로모터 영역이 뒤따르는 인접하는 FRT 부위를 가진 클로람페니콜 내성 카세트를 함유하는 1414bp 구조물이 합성되었다.
도 8의 A, B 및 C는 추가 글리코엔지니어링(glycoengineering)(APP2 rfb 클러스터 발현의 KanR 및 Kp 제어, wzy 및/또는 gne 통합)이 있거나 없는 APP2 O-항원 생합성 클러스터를 발현하는 SL1344 및 E. coli_5에서 APP2 O-항원 발현 수준의 비교를 도시한다. 도 8의 A에 나열된 세포의 포화된 하룻밤 배양물은 프로테이나제 K 처리에 의한 APP2 O-항원 발현 및 SDS-PAGE를 통한 분해된 세포 추출물의 분석에 대해 분석되었다. 도 8의 B는 APP2 LPS에 대한 은 염색의 사진이고, 도 8의 C는 겔의 APP2 LPS와 반응성인 토끼 혈청을 사용한 웨스턴 블롯이다. 왼쪽에는, 분자 마커 밴드가 kDa로 표시된다.
도 9는 서열화된 APP8 균주로부터 확인된 APP rfb 클러스터의 개략도이다. 길이가 13598bp인 APP8의 rfb 클러스터는 13개의 유전자로 구성된다(개별 유전자의 잠재적 기능이 표에 나열됨). 유전자의 위치와 클러스터 크기는 염기쌍으로 제공된다.
도 10은 내인성 rfb 클러스터(SL1344의 galF 포함)의 인접 상동 영역을 가진 pDOC_SL1344_Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)에 위치된 코돈 최적화된 APP8 O-항원 생합성 클러스터의 개략도이다. APP8의 코돈 최적화된 rfb 클러스터의 업스트림에 클로람페니콜 내성 카세트(FRT 부위에 인접)에 이어 kP(카나마이신) 프로모터가 위치된다. 전체 구조물은 I-SceI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위에 인접된다.
도 11의 A 및 B는 kP 프로모터의 제어 하에 코돈 최적화된 APP8 rfb 클러스터를 암호화하는 SL1344에서 APP8 O-항원 발현 수준을 도시한다. SL1344(레인 1), SL1344 Δrfb(레인 2), APP8(레인 3), APP3(레인 4) 및 SL1344 Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)(레인 5)의 포화된 하룻밤 배양물은 프로테이나제 K 처리에 의한 APP8 O-항원 발현 및 SDS-PAGE를 통한 분해된 세포 추출물의 분석에 대해 분석되었다. (A)는 LPS에 대한 은 염색의 사진이고 (B) 겔의 APP3 LPS와 반응하는 돼지 혈청을 사용한 웨스턴 블롯이다. 분자 마커 밴드(M)는 kDa로 표시된다.
도 12의 A 및 B는 HIS10-ApxII(439-801aa)의 발현 및 정제를 입증한다. HIS10-ApxII(439-801aa)는 아라비노스 유도 후 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)를 암호화하는 BL21 세포에서 발현되었다. 4시간 배양 후 세포는 수확되었고 리소자임 처리를 통해 파괴된 후 초음파 처리-동결-해동 주기가 이어졌다. 단백질은 Ni-NTA 결합 및 중력 흐름에 의한 변성 조건에서 정제되었다. Ni-NTA 비드로부터의 용리(E)은 0.5M 이미다졸을 함유하는 1ml의 변성 완충액으로 5회에 의해 달성되었다. 7.5㎕의 각 용리 분획(레인 1: E1, 레인 2: E2, 레인 3: E3, 레인 4: E4, 레인 5: E5)이 SDS-PAGE에 로딩되고, 쿠마시(Coomassie) 염색(A) 및 HIS 에피토프에 대한 웨스턴 블롯(B)을 통해 분석되었다. 왼쪽과 오른쪽에는 분자 마커 밴드가 kDa로 표시된다.
도 13의 A 및 B는 ApxIII(27-245aa)-HIS9의 발현 및 정제를 입증한다. ApxIII(27-245aa)-HIS9는 아라비노스 유도 후 pMLBAD-ApxIII(27-245aa)-HIS9를 암호화하는 BL21 세포에서 발현되었다. 4시간 배양 후, 세포가 수확되었고 리소자임 처리를 통해 파괴된 후 초음파 처리-동결-해동 주기가 이어졌다. 단백질은 Ni-NTA 결합 및 중력 흐름에 의해 정제되었다. 완충액은 풀링된 용리 분획에서 PBS로 교환되었다. 풀링 및 투석된 샘플 7.5 ㎕가 SDS-PAGE에 사용되었고, 쿠마시 염색(A) 및 HIS 에피토프에 대한 웨스턴 블롯(B)을 통해 분석되었다. 왼쪽에는 분자 마커 밴드가 kDa로 표시된다.
도 14는 상동성 재조합 부위, 합성 프로모터 및 3' 클로람페니콜 내성 카세트가 인접한 합성된 ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6의 개략도이다.
도 15의 A, B 및 C는 개선된 APP2 O-항원 발현을 가진 SL1344에서 ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII-(aa626-860)-HIS6의 발현을 입증한다. 분석된 균주는 (A)에 표시된 로딩 패턴으로 표시된다. 하룻밤 배양물은 액체 배지에서 0.05 OD600으로 희석되었고 대수 성장(OD600 ~1)까지 성장시켰다. 세포는 수확되었고, 1x Lammli에서 쿠킹되었고, SDS-PAGE용 구배 Bis Tris 겔에 로딩되었고, 쿠마시 염색(A) 및 HIS 에피토프에 대한 웨스턴 블롯(B)을 통해 분석되었다. 왼쪽과 오른쪽에는 분자 마커 밴드가 kDa로 표시된다.
도 16은 예방접종 일정의 개관이다. 돼지는 연구일(SD) 0일 및 SD 14일에 2회 비활성화된 시험 물질로 면역화되었고, 마지막 면역화 후 2주(SD 28일)에 안락사되었다. 혈액은 혈청 수집을 위해 매주 샘플링되었다. 동물은 임상 징후에 대해 매일 모니터링되었다.
도 17은 APP 혈청형 2(APP2) 및 7(APP7)의 정제된 LPS에 대해 시험된 모든 동물의 SD 0일 및 SD 28일 시점에서의 혈청 IgG 매개된 흡광도를 도시한다. 개별 동물은 그들의 귀 태그에 따라 도시된다. 450nm에서의 OD는 단일 측정으로 기록되었다. 개별 다이어그램은 적용된 항원과 그 적용(경구 및 비강 대 주사)에 대해 분류된다.
도 18은 APP 혈청형 2(APP2), 1(APP1), 5(APP5) 및 7(APP7)의 정제된 LPS에 대해 시험된 모든 동물의 SD 28일 시점에서의 BALF IgA 매개된 흡광도를 도시한다. 개별 동물은 그들의 귀 태그에 따라 도시된다. 450 nm에서의 OD는 2회 측정에 대해 기록되었다(오차 막대가 표시됨). 개별 다이어그램은 적용된 항원과 그 적용(경구 및 비강 대 주사)에 대해 분류된다.
도 19는 그룹 2 및 7의 모든 동물, 그룹 3 및 10의 동물 2마리 및 그룹 11의 동물 1마리의 SD 0일 및 SD 28일 시점에서의 혈청 IgG 매개된 흡광도 및 SD 28일 시점에서의 BALF IgA 매개된 흡광도가 정제된 ApxII(439-801aa) 및 AcrA-HIS6 단백질(음성 대조군)에 대해 테스트되었다는 것을 도시한다. 개별 동물은 그들의 귀 태그에 따라 도시된다. 450 nm에서의 OD는 단일 측정으로 기록되었다. 개별 다이어그램은 적용된 항원과 그 적용(경구 및 비강 대 주사)에 대해 분류된다.
도 20은 면역화 스케줄의 개략적인 개관이다. 돼지는 연구일(SD) 0일 및 SD 14일에 2회 살아있는 재조합 박테리아로 면역화되었고 마지막 면역화 2주 후(SD 28일) 안락사되었다. 혈액은 혈청 수집을 위해 매주 샘플링되었다. 동물은 임상 징후에 대해 매일 모니터링되었다.
도 21은 백신접종 및 챌린지 일정의 개관이다. 돼지는 SD 0일 및 SD 21일에 2회 백신 접종된 후, SD 42일에 APP2 박테리아로 챌린지되었다. 돼지는 48일(SD 48)에 안락사되었다. 표시된 시점에서 혈청이 수집되었다. 동물은 임상 징후에 대해 정기적으로 모니터링되었다(챌린지 후 6일 동안 매일 적어도 2회).
도 22는 문헌 [Hannan et al. 1982]에 따른 병변 스코어링을 도시한다. 그룹 1: 살아있는 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS-(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat, 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9. 그룹 2: 비활성화된 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne, 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9. 그룹 3: 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9. 그룹 4: 백신 접종하지 않은 대조군. 통계는 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의해 수행되었다. (*) P 값 0.01로 표시된 통계적 유의성.
도 23은 0일이 챌린지일이고 6일이 본 연구 종료일인 그룹으로 분류된 챌린지 후 6일 동안의 생존율(%)을 도시한다. 그룹 1: 비활성화된 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne, 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9; 그룹 2: 시판 백신 Porcilis® APP. 그룹 3: 백신을 접종하지 않은 대조군.
도 24는 문헌 [Hannan et al. 1982]에 따른 병변 스코어링을 도시한다. 그룹 1: 비활성화된 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne, 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9. 그룹 2: 시판 백신 Porcilis® APP. 그룹 3: 백신을 접종하지 않은 대조군. 통계는 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의해 수행되었다. (**) P-값 <0.01로 표시된 통계적 유의성.
도 25는 모든 동물에 대해 평가되고 그룹별로 분류된 APP2 재분리를 도시한다. 박테리아학 점수 값은 0 = APP2 박테리아 없음, 1 = < 20 CFU(콜로니 형성 단위) APP2 박테리아, 2 = < 200 CFU APP2 박테리아, 3 => 200 CFU APP2 박테리아 재분리로 설정된다.
Actinobacillus pleuropneumoniae (악티노바실러스 플루로뉴모니아, APP) rfb 유전자 클러스를 포함하고 박테리아 숙주 세포의 지질 A-코어에 결합되고 박테리아 숙주 외부 표면에 위치되는 APP O-항원을 생산하는, 즉 내인성 O-항원의 생산이 없는, 비기능성 내인성 rfb 유전자 클러스터를 가진 그람 음성 박테리아 숙주 세포는 APP 감염으로부터 보호하는 우수한 면역 반응을 돼지에서 이끌어낼 것이라는 점이 놀랍게도 발견되었고 임상적으로 입증되었다.
본 명세서에 사용된 형용사 용어 "이종성(heterologous)"은 소위 물질, 예를 들어 유전자, 단백질, 글리칸, 당단백질, 대사물 등과 같은 세포 구성요소가 자연에 의해 상기 세포에 자연적으로 존재하지 않고, 즉 인위적으로 도입되었으며, 이종, 즉 유전적으로 동일하지 않은 유기체에서 유래하였다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 형용사 용어 "내인성"은 소위 물질, 예를 들어 유전자, 단백질, 글리칸, 당단백질, 대사산물 등과 같은 세포 구성요소가 자연적으로 그리고 본래 상기 세포에 자연적으로 존재한다는 것을 나타낸다.
당해 분야의 숙련자는 공지된 방법, 예를 들어 비교 분자 유전학 및 생화학 분석에 의해, 세포의 성분 및 화합물이 이종성 또는 내인성인 것으로 일상적으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 APP가 아닌 세포에서 APP rfb 유전자 클러스터 및/또는 APP O-항원을 이종성으로 일상적으로 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, rfb 유전자 클러스터가 그람 음성 박테리아에서 비기능적이거나 내인적으로 부재하거나 비기능성 유전자 구조이고/또는 세포에 또는 세포 상에 또는 관심 세포로부터 분비된 해당하는 APP O-항원이 없음을 입증하는 것이 일상적이다.
본 명세서에 사용된 용어 "비-기능성"은, 특히 박테리아 숙주 세포에서 rfb 유전자 클러스터와 관련하여, 그 유전자 클러스터로부터 야기하는 적어도 하나의 단백질, 선택적으로 모든 단백질의 부재를 야기하고, 및 유전자 클러스터 발현 생산물로부터 O-항원의 생산을 본질적으로 야기하지 않는, 적어도 하나의 유전자, 선택적으로 클러스터의 모든 유전자의 부분적 또는 완전한 부재, 구조적 또는 기능성 변경 또는 적어도 기능장애를 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, rfb 유전자 클러스터의 유전자 중 하나 이상이 변경 및/또는 결실될 수 있고/있거나 클러스터의 유전자 조절이 변경되어 해당 유전자의 발현이 기능장애를 일으킬 수 있고, 즉 O-항원 합성을 위한 단백질의 발현과 생리학적으로 관련이 없거나 전혀 없음을 야기한다. 유전자 및 단백질의 분석 및 그들의 기능 또는 부재의 평가는 분자 생물학 및 생화학의 일상적인 기술로 달성될 수 있다.
생리학적으로 효과적인 면역 반응을 달성하기 위해, 박테리아 숙주 세포는 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터의 발현으로 인한 APP O-항원을 박테리아 숙주의 지질 A-코어에 결합하고, 환경에서, 예를 들어 백신을 접종한 살아있는 돼지의 관련 면역-관련된 구성요소와 접촉 및 전시를 위한 접합체를 박테리아 숙주의 외부 표면으로 전달할 것이다.
본 발명의 박테리아 숙주 세포는 모든 그람 음성 세포가 본 발명의 박테리아 숙주 세포의 이종성 O-항원에 결합하는데 필요한 지질 A를 발현하고 포함하기 때문에 그람 음성 박테리아 세포로부터 광범위하게 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 박테리아 숙주 세포는 장내박테리아과(Enterobacteriaceae), 버크홀데리아과(Burkholderiaceae), 슈도모나드과(Pseudomonadaceae), 비브리온과(Vibrionaceae), 선택적으로 부르크홀데리아 타이란덴시스(Burkholderia thailandensis), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 대장균(Escherichia coli), 선택적으로 E.coli_5, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica, 선택적으로 혈청형 Typhimurium, Enteritidis, Heidelberg, Gallinarum, Hadar, Agona, Kentucky 및 Infantis, 및 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium SL1344으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 Salmonella enterica subsp. enterica로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
물론, 선택된 박테리아 숙주 세포는, 예를 들어 백신 사용을 위해, 사백신 또는 생백신으로, 약학적 적용에 적합하여야 함을 이해해야 한다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 모든 공지된 APP rfb 유전자 클러스터, 특히 널리 공지된 APP1 내지 18 rfb 유전자 클러스터로부터 선택될 수 있는 이종성 기능성 rfb 유전자 클러스터를 포함한다. 이들 유전자 클러스터는 본 발명의 박테리아 숙주 세포에서 사용하기 위해 변경될 수 있으며, 즉 상응하는 발현된 이종성 APP O-항원이 기능적이며, 즉 돼지에서 APP 도전에 대항하여 생리학적으로 관련된 면역을 이끌어내고 여전히 박테리아 숙주 세포의 지질 A 코어에 결합될 수 있을 정도로 자연적으로 존재하는 유전자 클러스터와 상이하다.
한 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위한 이종성 rfb 유전자 클러스터는 APP2 또는 APP8 rfb 유전자 클러스터이고,
(i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하거나 이들로 이루어지고;
(ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 핵산 서열 동일성을 가지고;
(iii) 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는
(iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성된다.
당업자에게 알려져 있고 핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "%(퍼센트) 서열 동일성"은 서열 간의 일치에 의해 결정되는 적어도 2개의 핵산 분자 간의 관련성 정도를 나타낸다. "서열 동일성"의 백분율은 간격 및 기타 서열 특성을 고려하면서 둘 이상의 서열에서 동일한 영역의 백분율의 결과이다.
관련된 핵산 분자의 동일성은 공지된 방법의 도움으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 이 작업의 특정 요구를 수용하도록 조정된 알고리즘을 사용하는 특수 컴퓨터 프로그램이 사용된다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 비교할 서열 중에서 동일성의 가장 큰 정도의 생성으로 시작한다. 2개의 핵산 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은, 이에 한정된 것은 아니지만, BLASTN(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., Vol. 215 p403-410) 및 LALIGN(Huang and Miller 1991, Adv. Appl. Math., Vol. 12, p337-357)을 포함한다. BLAST 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 기타 출처(BLAST handbook, Altschul et al., NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894)에서 얻을 수 있다.
관련 핵산 분자의 동일성, 예를 들어 APP rfb 유전자 클러스터는, 또한 선택적으로 엄격한 조건 하에서 특이적으로 참조된 핵산 서열에 혼성화하는 능력에 의해 결정될 수 있다. 엄격한 조건 하에서 특이적으로 참조된 핵산 서열에 혼성화하는 능력을 결정하기 위한 선행 기술에서 공통 및/또는 표준 프로토콜(예: Sambrook and Russell, (2001) Molecular cloning: A lab manual (3 volume)) 옆에, 예를 들어, 앞서 언급된 BLASTN (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., Vol. 215 p403-410), LALIGN 정렬 도구 및 예를 들어 CLUSTALW (Sievers et al. 2011, Mol. Sys. Bio., Vol. 7, p539), MUSCLE (Edgar 2004, Nucl. Acids Res., Vol. 32, p1792-7) 또는 T-COFFEE (Notredame et al. 2000, J. of Mol. Bio., Vol. 302(1), p205-17)와 같은 다중 정렬 도구로 유전자 데이터베이스(예: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=nucleotide)에서 발견될 수 있는, 핵산 서열을 비교함으로써 엄격한 조건 하에서 특이적으로 참조된 핵산 서열에 혼성화하는 능력을 분석하고 결정하는 것이 바람직하다.
가장 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 APP rfb 유전자 클러스터의 특이적으로 언급된 핵산, 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 3 및 4에 나열된 것에 혼성화하는 능력은 다음 조건 하에서 서던 블롯 분석에서 확인되었다: 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에 이어 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS에서 세척.
추가 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 APP1 내지 18의 O-항원, 선택적으로 APP2 또는 APP8 O-항원을 생산하고, 여기서 APP rfb 유전자 클러스터는 선택적으로 임의의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 단백질을 발현한다 SEQ ID NO: 2, 50-61, 또는 SEQ ID NO: 5, 62-72 중 임의의 하나의 아미노산을 포함하거나 이루어지는 적어도 하나의 단백질, 또는 이들 서열에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 아미노산 서열 동일성을 가진 적어도 하나의 단백질을 선택적으로 발현한다.
관련된 아미노산 분자의 백분율 동일성은 공지된 방법의 도움으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 이 작업의 특정 요구 사항을 수용하도록 조정된 알고리즘을 사용하는 특수 컴퓨터 프로그램이 사용된다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 비교될 서열 중에서 가장 큰 동일성의 정도를 생성하는 것으로 시작한다. 2개의 아미노산 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은, 이에 한정되는 것은 아니지만, TBLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTX(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., Vol. 215 p403-410), 또는 ClustalW(Larkin et al. 2007, Bioinformatics, Vol. 23, p2947-2948)을 포함한다. BLAST 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 기타 출처(BLAST handbook, Altschul et al., NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894)에서 얻을 수 있다. ClustalW 프로그램은 http://www.clustal.org에서 얻을 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 이종성 APP rfb 유전자 클러스터는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 합성으로 제조될 수 있지만, 또한 적합한 DNA 라이브러리 및 기타 공개적으로 이용가능한 핵산 공급원으로부터 분리될 수 있고, 후속적으로 선택적으로 돌연변이될 수 있다. 이러한 라이브러리 또는 돌연변이의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다.
하나의 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터가 비-기능적이고 적어도 부분적으로, 선택적으로 완전히 결실된 것이다.
이종성 프로모터가 APP rfb 유전자 클러스터에 대한 내인성 프로모터보다 강한 경우 이종성 APP rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 이종성 프로모터의 도입이 APP O-항원 발현을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 이종성 APP rfb 유전자 클러스터에 대한 이종성 프로모터는, 카나마이신 프로모터, proD 프로모터, j23101 프로모터, proC 프로모터, STER_RS05525 프로모터, STER_RS01225 프로모터, STER_RS04515 프로모터, STER_RS05020 프로모터, STER_RS06870 프로모터, STER_RS00780 프로모터, P32 프로모터로 이루어지는 그룹, 선택적으로 카나마이신 프로모터, proD 프로모터, j23101 프로모터, STER_RS04515 프로모터 및 P32 프로모터로 이루어지는 그룹, 선택적으로 카나마이신 프로모터 및 proD로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다(Dat-senko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645, Davis et al. 2010, Nucleic acids research, Vol. 39(3), p1121-1141, Kong et al. 2019, ACS Synthetic Biology, Vol. 8, p1469-1472).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 프로모터 효율을 비교하는 맥락에서 용어 "더 강한"은 이종성 프로모터가 더 많은 전사 산물, 즉 rfb 유전자 클러스터 전사체 및 번역 산물, 즉 rfb 클러스터 발현 산물(효소), 및 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 내인성 및 기능성 APP rfb 프로모터보다 더 많은 APP O-항원을 생산할 것임을 나타내는 것을 의미한다.
APP rfb 유전자 클러스터로 인한 효소 활성 중 일부가 APP O-항원의 세포 생산을 제한할 수 있음이 발견되었다. 이와 관련하여, 본 발명의 박테리아 숙주 세포에서 APP O-항원의 세포 생산은, 예를 들어 APP O-항원 합성의 중간 생성물 등에 관여되는데 보조하거나, 형질전환하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자를 도입함으로써 효능이 개선될 수 있음이 입증되었다. 선택적으로, APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 뉴클레오티드 활성화된 글리칸 생합성을 위한 효소, 운데카프레닐피로포스페이트 글리코실트랜스퍼라제, O-항원 글리코실트랜스퍼라제, O-항원 폴리머라제, O-항원 사슬 길이 결정인자 단백질, 및 N-글리칸 에피머라제 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고, 선택적으로 gne 유전자 및 wzy 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고,
i. 여기서 gne 유전자는 UDP-갈락토스/UDP-N-아세틸갈라코사민 에피머라제, 선택적으로 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터의 에피머라제를 암호화하고, gne 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 6과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고;
ii. 여기서 wzy 유전자는 APP, 선택적으로 APP2의 O-항원 폴리머라제를 암호화하고, wzy 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 코돈 최적화된 wzy 유전자를 포함하거나 이로 이루어지거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO:8의 핵산 서열에 혼성화한다.
박테리아 감염은 종종 독성 화합물의 방출과 연관이 있다. APP 박테리아는 전형적으로 APP 혈청형에 따라 다양한 조합으로 ApxI, ApxII, ApxIII 및 ApxIV 독소를 분비한다. APP 감염의 증상을 개선하기 위해, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 선택적으로 Apx 독소의 적어도 하나의 중화 에피토프, 선택적으로 박테리아 숙주 외부 세포 표면에 위치되고 막 단백질, 선택적으로 세포용해소 A, 삼량체 자가수송자 부착소, 바람직하게는 AIDA-I 및 EaeA, 및 외막 단백질(OMP)로부터 선택되는, 바람직하게는 E. coli의 OmpA인 막 단백질에 결합되는 Apx 독소 I 내지 III의 적어도 하나의 중화 에피토프를 포함할 수 있다(Xu et al. 2018, Plos-One, Vol. 13(1), Ruther-ford et al. 2006, Vol.188(11), Wentzel et al. 2001, J. Bacteriol., Vol. 183(24), 7273-7284, 2001, Georgiou et al. 1996, Protein Engineering, Vol. 9(2), 239-247).
동의어 치환에 의한 코돈 최적화는 재조합 단백질 발현에 널리 사용된다. 코돈 최적화는 생성된 아미노산 서열을 변경하지 않고 단백질 발현을 개선하기 위해 재조합 유전자의 코돈 조성의 조정을 의미한다. 이것은 대부분의 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해 암호화되기 때문에 가능하다. 전형적으로, 코돈 최적화는 특정 숙주 유기체에 맞게 조정된다(Burgess-Brown et al. 2008, Protein Expression & Purification Vol. 59, p94-102, Elena et al. 2014, Frontiers in Microbiology, Vol. 5(21), 1-8).
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는, (a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터, (b) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자, 및/또는 (c) Apx 독소의 적어도 하나의 중화 에피토프는 박테리아 숙주 세포에 대해 코돈 최적화되는 것이다. 선택적으로, 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 박테리아 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된다.
하기에서 본 발명의 박테리아 숙주 세포의 구체적이고 비제한적인 실시양태는 일반적인 본 발명의 개념을 추가로 예시하기 위해 제시된다.
하나의 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli), 선택적으로는 E. coli_5, 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 선택적으로는 Salmonella enteria subsp. enterica, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. 엔테리카 혈청형 Typhimurium SL1344이고, 여기서
(a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP1 내지 18 rfb 유전자 클러스터로부터 선택되고, 선택적으로 APP2 또는 APP8 rfb 유전자 클러스터이고;
(b) 이종성 APP rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 이종성 프로모터는 카나마이신 또는 proD 프로모터이고;
(c) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 wzy 유전자, 선택적으로 코돈 최적화된 wzy 및/또는 gne 유전자이고, 두 유전자는 모두 박테리아 숙주 세포의 게놈에 선택적으로 통합되거나 또는 플라스미드에 위치되고;
(d) Apx 독소 I, II 및 III의 중화 에피토프 중 적어도 하나를 선택적으로 포함하고, 선택적으로 막 단백질에 결합되고, 선택적으로 E. coli의 세포용해소 A에 결합되거나, 또는 숙주 세포로부터 분비되고;
여기서 (i) APP2 또는 APP8 rfb 유전자 클러스터, (ii) gne 유전자 및/또는 (iii) wzy 유전자, 선택적으로 APP2 rfb 유전자 클러스터 및 wzy 유전자는 박테리아 숙주 세포인 Escherichia coli, 선택적으로 E. coli_5, 또는 Salmonella enterica, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium에 대해 코돈 최적화된다.
선택적으로 상기 또 다른 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium 균주 SL1344이고, 여기서
(a) 코돈 최적화된 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP2 rfb 유전자 클러스터이며, 선택적으로 (i) SEQ ID NO: 3을 포함하거나 이로 이루어지고; (ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98%의 핵산 서열 동일성을 가지고; (iii) 엄격한 조건 하에서서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성되고, 박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터가 적어도 부분적으로 또는 완전히 결실되고;
(b) 이종성 APP2 rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 선택적 이종성 프로모터는 카나마이신 프로모터이고;
(c) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는, 선택적으로 박테리아 숙주 세포의 게놈 내로 통합된, gne 유전자 및/또는 wzy 유전자이고;
i. 여기서 gne 유전자, 선택적으로 Campylobacter jejuni의 gne 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 6과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고;
ii. 여기서 wzy 유전자는, 선택적으로 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8을 포함하거나 이로 구성되거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 핵산 서열에 혼성화하고;
(d) 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 적어도 Apx 독소 II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 막 단백질에 결합되고, 선택적으로 E. coli의 세포용해소 A에 결합된다.
추가의 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 E. coli, 선택적으로 E. coli_5이고, 여기서
(a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP2 rfb 유전자 클러스터이고, 선택적으로 (i) SEQ ID NO: 3을 포함하거나 이로 이루어지고; (ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 핵산 서열 동일성을 가지고; (iii) 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성되고, 박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터가 적어도 부분적으로 또는 완전히 결실되고;
(b) 이종성 APP2 rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 이종성 프로모터는 카나마이신 또는 proD 프로모터, 선택적으로는 카나마이신 프로모터이고;
(c) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 선택적으로 박테리아 숙주 세포의 게놈 내로 통합되거나 플라스미드 상에 위치하는 gne 유전자이고,
여기서 gne 유전자, 선택적으로 Campylobacter jejuni의 gne 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나 SEQ ID NO: 6과 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고; 및
(d) 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 중화 에피토프 중 적어도 하나를 포함하거나, 선택적으로 적어도 Apx 독소 II 및 III의 중화 에피토프 중 적어도 하나를 포함하거나, 선택적으로 막 단백질에 결합되거나, 선택적으로 E. coli의 세포용해소 A에 결합되거나, 숙주 세포로부터 분비되고;
여기서 APP2 rfb 유전자 클러스터는 E. coli에 대해 선택적으로 코돈 최적화된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium 균주 SL1344 또는 Escherichia coli, 선택적으로 E. coli_5이고, 여기서
(a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP8 rfb 유전자 클러스터이며, 선택적으로 코돈 최적화된 것이고, 선택적으로 (i) SEQ ID NO: 4를 포함하거나 이로 이루어지고; (ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 핵산 서열 동일성을 가지고; (iii) 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성되고;
(b) 이종성 APP2 rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 선택적 이종성 프로모터는 카나마이신 또는 proD 프로모터, 선택적으로는 카나마이신 프로모터이고;
(c) APP O-항원 합성의 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 wzy 및/또는 gne 유전자이고, 선택적으로 코돈 최적화된 것이고, 선택적으로 두 유전자 모두 박테리아 숙주 세포의 게놈으로 통합되고;
i. 여기서, 선택적으로 Campylobacter jejuni의 gne 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나, SEQ ID NO: 6과 선택적으로 전체에 걸쳐 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고;
ii. 여기서, wzy 유전자는, 선택적으로 코돈 최적화된 것이고, 선택적으로 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8을 포함하거나 이로 구성되거나 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8과 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 핵산 서열에 혼성화하고;
(d) 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 Apx 독소 II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 막 단백질에 결합되고, E. coli의 세포용해소 A에 결합된다.
본 발명의 박테리아 숙주 세포는 살아있는 또는 비활성화된 형태로 돼지에게 투여될 수 있다.
전술한 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 면역원성이 높고, APP 감염에 대한 면역 반응을 일으킨다. 또한, 일단 준비되면 쉽게 전파되고 대량 생산될 수 있다. 이들은 예를 들어, 생백신 또는 사백신, 숙주에서 연장된 증식 및 지속적인 면역 자극뿐만 아니라 보조제 없이 완전한 면역 반응을 허용하는 생백신으로서 생 또는 비활성화되어 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 특히 APP 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 의약, 바람직하게는 백신을 제조하기 위한 본 발명의 살아있는 또는 죽은 박테리아 숙주 세포의 의학적 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 의약은 APP, 특히 APP1-18 감염, 바람직하게는 돼지에서 APP 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
본 발명의 추가 측면은 조성물, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 적어도 하나의 박테리아 숙주 세포, 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 적어도 두개의 상이한 O-항원에서, 선택적으로 APP1 내지 APP18로부터 O-항원에서, 선택적으로 APP1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 17 및 18로 이루어지는 그룹으로부터 선택된, 선택적으로 APP1, 2, 5, 7, 8 10, 12, 14 및 18로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 O-항원의 조합을 발현하는 박테리아 숙주 세포를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포 또는 조성물은 악티노바실러스 플루로뉴모니아(APP) 감염, 선택적으로 포유동물, 선택적으로 돼지(Sus) 또는 가축 돼지(Sus scrofa domesticus)에서 APP2 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동물, 특히 돼지 가축용 사료 또는 음용수, 및 생리학적으로 허용되는 부형제 및/또는 식품을 포함한다. 예를 들어, 백신이나 사료와 같은 이러한 조성물은 돼지 가축의 APP 콜로니화를 크게 줄이고 결과적으로 감염 확산의 기회를 줄이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생리학적 유효량의 본 발명의 박테리아 숙주 세포 또는 조성물, 식품 또는 사료를 APP의 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체에게, 선택적으로 돼지에서 APP 감염의 예방을 위해 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
치료 및/또는 예방 용도를 위해, 본 발명의 조성물, 약학적 조성물, 식품 또는 사료는 임의의 통상적인 방식으로 임의의 통상적인 투여 형태로 투여될 수 있다.
투여 경로는, 이에 한정되지는 않지만, 비강내, 경구, 구강내, 경피, 결막, 난내, 피하, 피내, 근육내, 설하, 경피 또는 결막을 포함한다. 예를 들어, 적용 장치 및 방법은 주사기, 분무 및 분무 장치, 스프레이(거친 스프레이, 사료에 스프레이) 및 음용수를 포함한다. 흡입은 액체 또는 분말의 흡입을 의미한다. 적용 경로는 예를 들어 비강 및 경구 적용과 같이 결합될 수 있다.
바람직한 투여 방식은 비강내, 경구, 비강내, 설하, 피하, 피내, 경피, 결막 및 근육내, 비강내 및 경구가 가장 바람직하다.
본 발명의 박테리아 숙주 세포는, 단독으로 또는 박테리아의 안정성 및/또는 면역원성을 향상시키고, 이를 함유하는 약학적 조성물의 투여를 촉진하고, 증가된 용해 또는 분산을 제공하고, 증식 활성을 증가시키고, 부가 요법 및 기타 활성 성분을 포함하는 유사 요법을 제공하는 보조제와 조합하여 투여될 수 있다.
박테리아 숙주 세포의 약학적 투여 형태, 예를 들어 E. coli 및 Salmonella enterica subsp. Enterica, 선택적으로 혈청형 Typhimurium은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 당업자에게 공지된 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 포함한다. 이러한 담체 및 보조제는 예를 들어 세제 및/또는 염을 가지거나 가지지 않은 물 또는 완충 용액, 금속염(예: 알루미늄 기반), 사포닌, 오일(광유 및 비광유), 오일 에멀젼, 박테리아 유도체, 사이토카인, 이스컴, 리포솜, 마이크로입자, 비타민(예: 알파 토코페롤), 덱스트란, 카보머, 마이크로에멀젼, 합성 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 기타 면역자극 화합물을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 바람직한 투여 형태는 용액, 현탁액, 에멀젼, 분말, 정제, 캡슐 및 경피 패치를 포함한다. 투여 형태를 제조하는 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Ansel et al. 1990, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., ISBN: 978-0812112559] 및 특히, 문헌 [Pastoret 1999, Acad. Sci. Paris/Elsevier SAS, Vol. 322, p967-972]를 참조하라.
예를 들어, 본 발명의 박테리아 숙주 세포 및 조성물을 사용한 백신 접종은 단일 백신 접종으로 또는 부스트 백신 접종으로 수행될 수 있으며, 가능하게는 규정된 기간 후에 재백신 접종이 뒤따를 수 있다. 백신은, 보조제를 포함 또는 미포함하여, 예를 들어 10E4 ~ 10E6 cfu(콜로니 형성 단위)의 투여량으로 적용된 살아있는 박테리아로 구성될 수 있거나, 또는 예를 들어 10E6 ~ 10E11 cfu(콜로니 형성 단위)의 투여량으로 적용된 비활성화된 박테리아로 구성될 수 있다.
하기에서 본 발명은 대표적인 실시예에 의해 기술될 것이며, 이들 중 어느 것도 첨부된 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
물질 및 방법
실험예에 사용된 박테리아 균주 및 그 출처는 표 1에 나열되어 있다.
박테리아
배경 유전자형 내성 출처 / 참고
APP 혈청형 2 균주 P1875 　 Provided by V. Perreten, University of Bern
APP 혈청형 2 균주 HK361 　 NCTC 10976
APP 혈청형 1 균주 S4074 - ATCC 27088
APP 혈청형 3 균주 ORG1224 Provided by V. Perreten, University of Bern
APP 혈청형 5 균주 K17 - APP reference 균주 provided by V. Perreten, University of Bern
APP 혈청형 7 WF83 - APP reference 균주 provided by V. Perreten, University of Bern
APP 혈청형 8 균주 MIDG2331 - Provided by V. Perreten, University of Bern
SL1344 his- (히스티딘 영양요구균주) Strep Hoiseth et al. 1981, Nature, Vol. 291(5812), p238-239
SL1344 his-, Δrfb::kanR Kan, Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::APP2.LPS/kanR Kan, Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::APP2.LPS Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb:: kanR -APP2.LPS Strep, Kan, Cm 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::kanR -APP2.LPS(cod.opt.) Kan, Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::kanR -APP2.LPS rfaL-Ωgne/cat Kan, Strep, Cm 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::kanR -APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat Strep, Kan, Cm 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::kanR -APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat Strep, Kan, Cm 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.) Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::cat/kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.) Strep, Cm 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.) Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt) pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC Strep 본 연구
SL1344 his-, Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.) Strep 본 연구
E. coli_5 　 Amp, Strep Provided by Roger Stephan, University of Zurich
E. coli_5 Δrfb::kanR Kan, Amp, Strep 본 연구
E. coli_5 Δrfb Amp, Strep 본 연구
E. coli_5 Δrfb::APP2.LPS/kanR Kan, Amp, Strep 본 연구
E. coli_5 Δrfb::APP2.LPS Amp, Strep 본 연구
E. coli_5 Δrfb::kanR -APP2.LPS Amp, Strep, Kan 본 연구
E. coli_5 Δrfb::kanR -APP2.LPS(cod.opt.) Kan, Amp, Strep 본 연구
E. coli_5 Δrfb::kanR -APP2.LPS(cod. opt.) rfaL-Ωgne/cat Amp, Strep, Kan, Cm 본 연구
E. coli_5 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod. opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat Amp, Strep, Kan, Cm 본 연구
실험예에 사용된 플라스미드와 그 출처는 표 2에 나열된다.
플라스미드 　 　
pMLBAD Tmp Lefebre et al. 2002, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 68(12), p5956-64
pEC415 Amp Schulz et al. 1998, Science, Vol. 181, p1197-1199
pMLBAD-HIS10-APXII(439-801aa) Tmp 본 연구
pMLBAD-HIS10-APXIII-APP2 Tmp 본 연구
pMLBAD-APXIII(27-245aa)-HIS9 Tmp 본 연구
pMLBAD-gne-HA Tmp 본 연구
pEC415-wzy Amp 본 연구
pDOC Amp Lee et al. 2009, BMC Mircobiol., Vol. 9(252)
pDOC_E.coli_5_Δrfb::APP2.LPS/kanR Amp, Kan 본 연구
pDOC_SL1344_Δrfb::APP2.LPS/kanR Kan, Amp 본 연구
pDOC_E.coli_5_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) Amp, Kan 본 연구
pDOC_SL1344_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) Amp, Kan 본 연구
pDOC_SL1344_Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.) Amp, Cm 본 연구
pACBSCE Cm Lee et al. 2009, BMC Mircobiol., Vol. 9(252)
pKD46 Amp Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645
pLAMBDA46 Gent 본 연구
pCP20 Amp, Cm Cherepanov et al. 1995, Gene, Vol. 158, p9-14
pCP20-GentR Gent, Cm 본 연구
pKD3 Amp, Cm Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645
pKD4 Amp, Kan Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645
실험예에 사용된 플라스미드의 올리고뉴클레오티드 및 이들의 핵산 서열은 표 3에 나열된다.
OLIGO 명칭 서열
Ec_SL/Kan_fw CAAATTCCGGTTAAAAAAAGACCGCTTGTTTGAGAGTGATAATCGCAAACAAGCGGTCTTTTTTGATCAAAATATTATTACACGTCTTGAGCGATTG (SEQ ID NO: 9)
Ec_SL/Kan_rev GATGAAGAGCAAAGATTGGGAGATAATGTGAGAAATCTTTAGATTCAAACTAAGCTGAGAAGAAAAAGGTCCATATGAATATCCTCCTTAG (SEQ ID NO: 10)
E.c._5_Δrfb fw GTAATGTTAATGAAAGCATATAAGAAATTTTCAAATGAATAAAGAAACTGTTTCAGTTATTATTACACGTCTTGAGCGATTG (SEQ ID NO: 11)
E.c._5_Δrfb rev GAGCATGTAATCTTCTGATAAAAATCATTTGTACGATATTTTCAGTTACATACTATGCGTAGGTCCATATGAATATCCTCCTTAG (SEQ ID NO: 12)
SL1344_Δrfb fw GAGCAATTAATTTTTATTGGCAAATTAAATACCACATTAAATACGCCTTATGGAATAGAAAAATTACACGTCTTGAGCGATTG (SEQ ID NO: 13)
SL1344_Δrfb rev GCGTTCAGATTTTACGCAGGCTAATTTATACAATTATTATTCAGTACTTCTCGGTAAGCGGTCCATATGAATATCCTCCTTAG (SEQ ID NO: 14)
Ec_SL/Kan_fw_elo CAGGGCTAGCGCTAATTACCAATTTATTGTTTAGCTTAGGAATTTTTTTAGGTTAGTTGCAAATTCCGGTTAAAAAAAGACCGCTTGTTTGA (SEQ ID NO: 15)
Ec_SL/Kan_rev_elo CAATATTAGCTTATGTATTATATTAGAAGGCCTACAGATAAGCAAAAAATATTATTGATGAAGAGCAAAGATTGGGAGATAATGTGAGAAAT (SEQ ID NO: 16)
BamHI-Fw KanR-Fw CGGGAATTCAAGCTTGGATCCC (SEQ ID NO: 17)
XhoI 3'rspU- Rev GACGCTAGCATATGAGCTCGAG (SEQ ID NO: 18)
BamHI-SL-gnd Fw ext GTTTCATCAGTAATGGGACAGAAAGGTACC (SEQ ID NO: 19)
XhoI-SL-GalF Rev ext CACACTCGAGCAATTGACCGGTTTTTCTATTCCATAAGGC (SEQ ID NO: 20)
5' NdeI_wzy CAGGTACCATATGAACTCCTTAGTATATAGAATAGATATTAGAACA (SEQ ID NO: 21)
3' EcoRI_wzy CTTATCAGAATTCATTTTTTACATTCCAAATAGCGTACAA (SEQ ID NO: 22)
3' EcoRI_pEC415fw GTACCGAGCTCGAATTCTTGAAGACGAAAGG (SEQ ID NO: 23)
5' NdeI_pEC415rev CACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATATGT (SEQ ID NO: 24)
3'-gne-cat_overlap GAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGG (SEQ ID NO: 25)
5'-gneΔSl1344rfaL ATTGCTCAAATTGGTATCATTACCGGTTTTCTGCTGGCGCTAAGAAATAGATAATGAAAATTCTTATTAGCGGTGGTGCA (SEQ ID NO: 26)
3'-cat_Sl1344rfaL AAAAACTGGTTTGATAAGTGATTGAGTCCTGATGATGGAAAACGCGCTGATACCGTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO: 27)
5'-elo-gneΔSl1344rfaL TTTTATCTTTCGTCGGTTTTTATATCGTTCGTGGCAATTTTGAACAGGTCGATATTGCTCAAATTGGTATCATTACCGGT (SEQ ID NO: 28)
3'-elo-cat_Sl1344rfaL TTTCAAAATACAGTTGGGAAAATGTAGCGCAGCGTTTCGAGGAACAAATGAAAAACTGGTTTGATAAGTGATTGAGTCCT (SEQ ID NO: 29)
5'-cat-P2new GGTCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC (SEQ ID NO: 30)
5' gne overlap_wzy (co) CCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAATGAATTCTTTAGTGTATCGCATTGACATCC (SEQ ID NO: 31)
3' wzy (co)-cat_overlap GAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCTCATTTTTTACACTCTAAATAACGCACAATATTGG (SEQ ID NO: 32)
3' gne_wzy (co) overlap GGATGTCAATGCGATACACTAAAGAATTCATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGG (SEQ ID NO: 33)
5' XmaI-XhoI-APXIIIne-HIS-fw AAAAAACCCGGGCTCGAGATGGATGTAACTAAAAATGGTTTGCAATATGGG (SEQ ID NO: 34)
3' APXIIIne-HIS-HindIII-rv AAAAAAAAGCTTTTAGTGGTGATGATGATGGTGATGGT (SEQ ID NO: 35)
FW_pliCint CTAATTAGTAACCACTTTTAAGCATGGTTAATCCTATTTTGAAAAAGCAAAATCCCTGGTGTTTTCAAAATA (SEQ ID NO: 36)
REV_pagCint GATTCACTCTGAAAAATTTTCCTGGAATTAATCACAATGTCAGGTCGATATTGCTCAAATTGGTATCATTA (SEQ ID NO: 37)
eloFW_pliCint CGTAACGTTAAAGAATATGTGAATCACTACCGTAGTATAATGGCTAATTAGTAACCACTTTTAAGCATGGTTAATC (SEQ ID NO: 38)
eloREV_pagCint GATAAGCAGGAAGGAAAATCTGGTGTAAATAACGCCAGATCTCACAAGATTCACTCTGAAAAATTTTCCTGGAATTAAT (SEQ ID NO: 39)
FW_rfaK_rfaL CTATTTATATGGCGCTATCATCAGGGAAACAG (SEQ ID NO: 40)
REV_rfaL_rfaK GACAGTATAATTAATGATATTAACCGTGCGCTTG (SEQ ID NO: 41)
방법 - 박테리아 균주의 성장
위의 표 1 및 2에 나열된 박테리아 균주 및 플라스미드는 Luria-Bertani(LB) 배지(10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 5g/L NaCl), TB 배지(12g/L 트립톤, 24g/L 효모 추출물, 0.017M KH2PO4, 0.072M K2HPO4) 또는 2mg/Lβ-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)로 보충된 BHI + NAD(37g/L 뇌 심장 주입 브로쓰(BHI; 정확한 조성은 Sigma Aldrich cat. nr. 53286 참조)에서 성장되었다.
한천 플레이트는 1.5%(w/v) 한천이 보충되었다. 항생제는 다음과 같은 최종 농도로 사용되었다: 암피실린(Amp) 100㎍/ml, 카나마이신(Kan) 50㎍/ml, 클로람페니콜(Cm) 25㎍/ml, 스트렙토마이신(Strep), 트리메토프림(Tmp) 10㎍/ml, 겐타마이신(gent) 15㎍/ml.
실시예 1
1) APP2 O-항원 생합성 클러스터를 발현하는 백신 균주의 생성
1.1) E. coli 및 SL1344에서 APP2 O-항원 생합성 클러스터의 통합
첫 번째 단계에서 Actinobacillus pleuropneumoniae 혈청형 2(APP2) 균주(P1875)가 서열화되었고, 문헌 [Xu et al. 2010, J. Bacteriol., Vol. 192(21), p5625-5636]에 따라 O-항원 생합성 클러스터(rfb 클러스터)가 확인되었다. 이 간행물에 사용된 모든 APP 혈청형의 rfb 클러스터는 erpA 유전자와 rpsU 유전자 사이에 위치되는 것으로 나타났다. 도 1, 표 4, 및 서열 1은 본 연구의 서열화된 APP2 균주에 대한 유전적 조직 및 주석이 달린 유전자/단백질을 보여준다.
표 4 - 각각의 주석이 달린 유전자 및 단백질/기능과 함께 erpA 및 rpsU가 플랭킹된 APP2의 rfb 유전자좌.
주석달린 유전자 예측된 단백질/기능
wzzB 사슬 길이 결정 단백질
kanE　　　　　　　　　　　　　 알파-D-카노사미닐트랜스퍼라제
cpsP 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 2
epsJ 추정상의 글리코실트랜스퍼라제 EpsJ
setA 진핵생물 교통 단백질 A의 전복
가상 유전자 가상 단백질
rfbX 추정상의 O-항원 트랜스포터
vatD 스트렙토그라민 A 아세틸트랜스퍼라제
pglC 운데카프레닐 포스페이트 N,N'-디아세틸바실로사민 1-포스페이트 트랜스퍼라제
rffG dTDP-글루코스 4,6-디하이드라타제 2
rmlA2 글루코스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼라제 2
rmlD dTDP-4-디하이드로람노스 리덕타제
rfbC dTDP-4-디하이드로람노스 3,5-에피머라제
백신 균주로서 Salmonella enterica subsp. enterica Typhimurium 및 Escherichia coli(균주 목록 참조)에서 유래된 2개의 벡터 박테리아가 선택되었다. Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium SL1344 부모 균주는 감염된 소로부터 분리되었다(Hoiseth et al. 1981, Nature, Vol. 291(5812), p238-239). 균주 SL1344는 부모 균주의 유전적으로 표시된 버전이다. 두 번째 균주인 Escherichia coli 균주 5(E. coli_5)는 스위스에서 건강한 돼지의 편도선에서 분리되었다. 독력 인자 stx, eae, LT 및 ST에 대해 PCR 음성인 것으로 나타났다. 두 균주 모두 서열화되었고 내인성 O-항원 생합성 클러스터(rfb 클러스터)가 유전자 galF와 gnd 사이에서 확인되었다. 또한, 두 균주 모두 내인성 O-항원을 발현하지 않고 대신 이 위치에 삽입된 APP2의 O-항원 생합성 경로를 암호화하는 유전자 클러스터를 발현하도록 유전적으로 변형되었다(서열 42, 도 2).
APP2 rfb 클러스터와 그 인접(flanking) 영역을 포함하는 13758 bp 단편(도 2)은 내인성 rfb 클러스터에 대한 안티센스 방향으로 SL1344 및 E. coli_5로의 통합을 위해 변형되었다. 이를 위해 FRT 사이트 옆에 있는 카나마이신 내성 카세트가 다운스트림에 융합되었다. 융합 구조물은 SL1344 또는 E. coli_5(안티센스 방향의 galF 유전자를 포함함)의 rfb 클러스터 인접된 상동 영역에 의해 업스트림 및 다운스트림에 인접된다.
구체적으로, APP2 rfb 클러스터(서열 1)를 E. coli_5 및 SL1344에 통합하기 위해, 문헌 [Lee et al. 2009]의 pDOC 시스템을 기반으로 한 셔틀 벡터 플라스미드 pDOC_E.-coliΔ5_Δrfb::APP2.LPS/kanR(E. coli_5의 경우) 및 pDOC_SL1344_Δrfb::APP2.LPS/kanR(SL1344의 경우)가 생성/합성되었다(CRO에 의해). 확인된 APP2 rfb 오페론(유전자 wzzB에서 rfbC로)은 5' 및 3' 말단에서 연장되어 서열 1의 인접 업스트림 프로모터 영역(erpA 유전자도 포함)과 다운스트림 종결자 영역(rpsU의 3' 영역 포함)을 포함한다(도 2 참조). 이 서열은 5' 및 3' 인접 FRT 인식 부위(회문 플립파제 인식 부위)가 있는 카나마이신 내성 마커 유전자(kanR)와 3' 말단에서 융합되었다. E. coli_5 및 SL1344의 서열화 결과로부터 내인성 rfb 클러스터의 인접 영역이 검색되어 다음과 같이 APP2 rfb 클러스터 및 kanR 내성 카세트에 대한 인접 영역으로 사용되었다. E. coli_5 및 SL1344의 내인성 rfb 클러스터의 마지막 유전자의 정지 직후의 800bp 단편이 APP2 rfb 클러스터 앞에 위치한 업스트림 상동 재조합 서열로 선택되었다. 1252bp(E. coli_5) 또는 1399bp(SL1344) 영역은 kanR의 다운스트림에서 상동 재조합 서열로 선택되었다. 이 영역은 클러스터의 첫 번째 유전자의 시작 코돈 이전의 +1 위치까지 전체 galF 유전자와 모든 뉴클레오티드를 포함한다. 전체 통합 클러스터는 I-SecI 제한 엔도뉴클레아제-절단 부위에 인접된다. 통합 카세트는 내인성 rfb 클러스터의 안티센스 방향으로 통합되도록 설계되었다. 구조물의 일반적인 개략도는 도 3에 도시된다. 셔틀 벡터에 APP2 rfb 오페론을 통합하려면 추가 유전자가 필요하였다. 플라스미드 선택 마커로 암피실린 내성 카세트를 사용하였다. sucB 유전자(수크로스의 존재 하에 독성 대사산물을 생성하는 수크로스 전환에 관여됨)는 벡터 플라스미드 역선택을 위해 통합되었다.
셔틀 벡터 플라스미드(pDOC_E.coli_5_Δrfb::APP2.LPS/kanR in E. coli_5 및 pDOC_SL1344_Δrfb::APP2.LPS/kanR in SL1344)는, 아라비노스 유도성 시스템을 암호화하고 I-SceI 제한 효소 및 I-SceI 절단 부위를 운반하는 헬퍼 플라스미드 pACBSCE와 함께, 표적 세포로 형질전환되었다. 형질전환 후, 발현된 I-SceI 효소는 I-SceI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 셔틀 벡터 플라스미드를 절단하여, 내인성 상동 서열에 의해 인접된 카나마이신 내성 유전자로 상기 기재된 변형된 APP2 rfb 오페론을 선형화하였다. λ-재조합 시스템은 수용 세포의 게놈의 각 부위에서 상동 인접 영역을 인식하고 내인성 DNA를 도너 DNA와 교환하여 E. coli_5 또는 SL1344에서 APP2 O-항원 생합성 클러스터를 카나마이신 내성 카세트와 통합하였다(균주 E. coli_5 Δrfb::APP2.LPS/kanR 및 SL1344 Δrfb::APP2.LPS/kanR 생성). 카나마이신 및 수크로스 함유 배지에서 선택된 세포는 외래 DNA의 존재 및 선택 배지에서의 성장 부족에 의한 셔틀 벡터 및 헬퍼 플라스미드의 부재에 대해 PCR에 의해 양성으로 테스트되었다.
카나마이신 내성 마커를 "외부 재조합"하기 위해, 회문 FRT 부위를 인식하는 플립파제를 암호화하는, SL1344 유도체의 경우 온도 민감성 플라스미드 pCP20(Cherepanov et al. 1995, Gene, Vol. 158, p9-14) 또는 E. coli_5 유도체(클로람페니콜 내성 유전자의 다운스트림에 겐타마이신 내성 유전자가 통합됨)의 경우 pCP20-Gent가 세포에 도입되었다. "플립 아웃(flip out)" 사건 이후에 게놈에는 단 하나의 FRT 부위만 남았다. 배양 온도가 증가함에 따라, 플라스미드를 암호화하는 플립파제에 대해 양성 클론이 역선택되었다. 최종 PCR은 모든 헬퍼 플라스미드의 부재, 카나마이신 내성 마커의 부재 및 APP2 rfb 클러스터 구조물의 도입을 검증하였다(균주 E. coli_5 Δrfb::APP2.LPS 및 SL1344 Δrfb::APP2.LPS 생성). E. coli_5와 SL1344의 표면에 나타난 APP2 O-항원의 발현은 SDS-PAGE와 면역블로팅으로 검증되었다(Fig. 8). 분석 절차 및 결과는 1.6에 설명되어 있다.
대조군으로서, 내인성 rfb 클러스터는 야생형 세포 E. coli_5 및 SL1344에서 결실되었다. 이를 위해, 녹아웃 카세트가 주형으로 pKD4 및 E. coli_5 rfb용 올리고뉴클레오타이드 E.c._5_Δrfb fw/E.c._5_Δrfb rev 및 SL1344 rfb 클러스터 결실을 위해 SL1344_Δrfb fw/ SL1344_Δrfb fw를 사용하여 PCR에 의해 생성되었다(Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645). 생성된 PCR 산물은 FRT 사이트에 의해 인접된 카나마이신 내성 카세트를 암호화하고, 또한 상동 재조합에 필요한 내인성 5'(rfb 클러스터의 첫 번째 유전자의 시작 전 → wfgD(E. coli_5) 또는 rfbB(SL1344)) 및 3'(rfb 클러스터의 마지막 유전자의 정지 코돈 후 → pglH(E. coli_5) 또는 rfbP(SL1344))을 가진 21-24bp 중첩 서열을 함유한다. DNA 단편(E. coli_5 1759bp, SL1344 1623bp) 및 SL1344를 위한 λ-재조합 시스템 pKD46(Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6644) 및 E. coli_5를 위한 pLAMBDA46(β-락타마제 유전자는 겐타마이신 내성 유전자로 교환되었다)을 암호화하는 온도 민감성 헬퍼 플라스미드가 도입되었다. λ-재조합 시스템은 rfb 클러스터에서 첫 번째 유전자의 시작 전과 마지막 유전자의 정지 코돈 후 각각의 부위에서 상동 인접 영역을 인식하였고, FRT 사이트에 인접된 카나마이신 내성 카세트를 통합함으로써 내인성 rfb 유전자 클러스터를 삭제하였다. 생성된 균주 E. coli_5 Δrfb::kanR 및 SL1344 Δrfb::kanR은 항생제 마커를 잃도록 추가로 조작되었다. 카나마이신 내성 마커를 "외부 재조합"하기 위해, 문헌 [Cherepanov et al. 1995, Gene, Vol. 158, p9-14]은 상술된 바와 같이 사용되었다. 최종 E. coli_5 Δrfb 및 SL1344 Δrfb 균주는 PCR에 의해 검증되었고, 면역블롯팅에 의해 O-항원 발현의 손실에 대해 분석되었다(도 8). 분석 절차 및 결과는 1.6에 설명된다.
1.2) APP2 rfb 클러스터의 업스트림에 kanR 내성 마커를 도입하여 E. coli_5 및 SL1344에서 APP2 O-항원의 발현을 개선함
글리코엔지니어링된(glycoengineered) E. coli_5 및 SL1344 균주에서 APP2 O-항원 제시를 개선하기 위해, rfb 클러스터의 프로모터 영역은 카나마이신 프로모터가 다운스트림 유전자의 전사를 유도하기 위해 이용되는 카나마이신 내성 유전자로 교환되었다. 이를 위해 올리고뉴클레오티드 Ec_SL/Kan_fw 및 Ec_SL/Kan_rev 및 pKD4를 주형으로 사용하여 암호화된 카나마이신 프로모터 및 내성 유전자를 5' 및 3' 암호화된 FRT 부위로 증폭하여 PCR 단편이 생성되었다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 erpA 유전자에 상동인 상동 재조합 서열을 개시 코돈 이전 및 종료 코돈 이후에 도입하였다. 1644bp 크기의 생성된 생성물이 2차 PCR 반응에 올리고뉴클레오티드 Ec_SL/Kan_fw_elo 및 Ec_SL/Kan_rev_elo와 함께 사용되어 상동 재조합 서열을 연장하여 통합 효율을 증가시켰다. 이 DNA 단편 및 SL1344 Δrfb::APP2.LPS를 위해 λ-재조합 시스템 pKD46(Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645) 및 E. coli_5 Δrfb::APP2-LPS 균주를 위해 pLAMBDA46을 암호화하는 온도 민감성 헬퍼 플라스미드가 도입되었다. λ-재조합 시스템은 erpA의 시작 및 종료 코돈에서 각 부위의 상동 인접 영역을 인식하고 erpA 유전자를 "외부 재조합"하고 FRT 부위에 인접한 카나마이신 프로모터 및 내성 유전자를 각각의 부위에 통합하였다. 도입된 카나마이신 내성 유전자는 양성 클론의 선택을 허용하였다(성공적인 통합). 이들 양성 후보는 erpA의 결실 및 PCR에 의한 PCR 단편의 통합에 대해 검증되었다. 온도 민감성 헬퍼 플라스미드는 여러 라운드의 배양 동안 성장 온도를 증가에 의해 세포에서 손실되었다. 최종 균주 E. coli_5 Δrfb::kanR-APP2.LPS 및 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS에서 O-항원 제시는 면역블롯팅에 의해 시험되었다(도 8). 분석 절차 및 결과는 1.6에 설명되어 있다.
1.3) APP2 rfb 클러스터의 코돈 최적화를 통한 E. coli_5 및 SL1344의 APP2 O-항원 발현을 개선함
APP2 O-항원 클러스터 단백질/효소 발현을 개선하고 궁극적으로 지질 A에 대한 APP2 O-항원 제시를 증가시키기 위해, 유전자 암호화 서열의 뉴클레오티드 트리플릿 코돈을 SL1344 및 E. coli_5에 대해 최적화할 수 있다. 그 결과 A. pleuropneumoniae에서는 유리하지만 SL1344 및 E. coli_5에서는 불리할 수 있는 원치 않는 트리플릿의 사용이 감소한다. 본 연구에서 코돈 최적화는 CRO에 의해 수행되었으며 E. coli 발현 수준에 대해 수행되었다. Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium SL1344에 대해서도 동일하게 적용되면 동일한 코돈 최적화 APP2 rfb 클러스터를 SL1344 내인성 rfb 클러스터에 통합하여 표시해야 하였다.
APP2의 코돈 최적화 rfb 클러스터를 SL1344 및 E. coli_5에 통합하기 위해, 원래 통합은 동일하게 유지되는 내인성 rfb 클러스터에 위치시킨다. 5' 말단에서, 카나마이신 내성 카세트(FRT 부위에 인접한 위치)를 암호화하는 코돈 최적화(E. coli 발현용) APP2 rfb 클러스터가 합성되었다. 이는 카나마이신 유전자의 프로모터에 의해 조절되는 APP2 rfb 클러스터(코돈 최적화됨)의 전사를 초래한다. 구체적으로, APP2 rfb 클러스터(서열 1 및 7)의 업스트림에 있는 카나마이신 내성 유전자 통합과 APP2 rfb 클러스터(합성을 수행한 CRO는 플라스미드의 E. coli 발현을 위한 코돈 최적화를 적용했음)의 코돈 최적화를 결합하여 새로운 통합 카세트가 설계되었다(도 4). 생성된 플라스미드(서열 43; pDOC_E.coli_5_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.))는 E. coli_5의 조작 및 플라스미드 pDOC_SL1344_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)(서열 44)는 SL1344 세포를 유전적으로 조작하는데 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 BamHI-Fw KanR-Fw/XhoI 3'rspU-Rev가 사용되어 FRT 사이트 인접한 업스트림 통합된 카나마이신 내성 카세트와 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터를 포함하는 플라스미드 pDOC_E.coli_5_Δrfb::Kan-APP2.LPS(cod.opt.)로부터 14972 bp 단편을 증폭하였다. 또한, 새로운 제한 절단 부위가 PCR에 의해 5'(BamHI) 및 3'(XhoI) 말단에 통합되었다. 두 번째 PCR은 수행되어 SL1344의 rfb 클러스터에 카세트의 통합을 위한 상동 재조합 서열을 암호화하는 pDOC 백본을 포함하는 단편을 생성하였다. 주형으로 pDOC_SL1344_Δrfb::APP2.LPS/kanR은 사용되어 프라이머 BamHI-SL-gnd Fw ext/XhoI-SL-GalF Rev ext.를 사용하여 BamHI 및 XhoI 절단 부위가 도입된 8113bp 단편을 생성하였다. PCR 산물의 BamHI 및 XhoI로 제한 분해 후, 두 단편이 결찰되었다. 서열은 서열화(pDOC_SL1344_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.))에 의해 확인되었고, 플라스미드는 SL1344의 rfb 클러스터를 카나마이신 내성 카세트의 다운스트림에 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터로 교체하는데 추가로 사용되었다. 카나마이신 내성 카세트와 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터를 E. coli_5 및 SL1344에 통합하기 위해, 플라스미드 pDOC_E.coli_5_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) 및 pDOC_SL1344_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)는 각각 E. coli_5 또는 SL1344로 형질전환되었다. 절차는 위에서 설명한 대로 그리고 문헌 [Lee et al. 2009.]에 의해 설명한 대로 최종 균주 E. coli_5 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) 및 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS-(코돈 최적화됨)는 PCR에 의해 검증되었고, O-항원 발현은 면역 블로팅(도 8)에 의해 테스트되었다. 분석 절차 및 결과는 1.6에 설명되어 있다.
1.4) gne 및 wzy 도입에 의해 APP2 rfb 클러스터를 발현하는 SL1344에서 APP2 O-항원의 발현을 개선함
APP2 rfb 클러스터를 발현하는 생성된 균주에서 볼 수 있는 바와 같이, 리포-폴리사카라이드의 전형적인 "사다리" 패턴은 약하게만 존재하거나 검출할 수 없었다(도 8). 대신 단일 서브유닛 올리고당으로서 O-항원의 강한 축적이 관찰되었다. 이는 O-항원 폴리머라제(Wzy)가 LPS 글리칸을 효율적으로 조립하지 않을 수 있음을 나타낸다. APP2 O-항원 특이적 wzy는 플라스미드에 암호화된 Wzy를 발현하도록 선택되었다. wzy는 문헌 [Xu et al. 2010, J. Bacteriol., Vol. 192(21), p5625-5636]에 의해 APP2 클러스터의 6번째 유전자이며 서열 1 및 도 1에서 setA와 rfbX 사이에 위치된 가상 단백질에 해당한다. NCBI 단백질 데이터베이스에 대해 가상 단백질 서열을 블라스팅하여 29% 동일성을 가진 Lactococcus lactis(유전자좌 AZY91860)의 Wzy, 22% 동일성을 가진 Oenococcus oeni(유전자좌 WP_071436899)의 다당류 폴리머라제 및 24% 동일성을 가진 Streptococcus sp. DD12(유전자좌 KXR76217)를 확인하였다. 이러한 발견에 기초하여 가상 단백질이 APP2 rfb 클러스터의 O-항원 폴리머라제 Wzy를 나타낼 수 있다고 가정하였다. 올리고뉴클레오티드 5' NdeI_wzy/3' EcoRI_wzy가 사용되어 5' NdeI 및 3' EcoRI 제한 절단 부위를 가진 플라스미드 pDOC_E.coli_5_Δrfb::APP2.LPS/kanR로부터 잠재적인 wzy 유전자를 증폭하였다(PCR 산물의 단편 크기는 1138bp). wzy의 발현을 위해, 아라비노스 유도성 프로모터를 가진 벡터 pEC415가 선택되었다. wzy를 pEC415로 클로닝하기 위해, 벡터가 선형화되었고, 증폭되었고, 올리고뉴클레오티드 3' EcoRI_pEC415fw/5' NdeI_pEC415rev(5419bp의 단편)를 사용하는 PCR에 의해 변형되었다. 다시, EcoRI 및 NdeI 절단 부위가 단편 말단에 도입되었다. PCR로 생성된 EcoRI-wzy-NdeI 및 EcoRI-pEC415-NdeI 단편은 각각의 제한 엔도뉴클레아제로 분해되었고 결찰되었다. 서열(pEC415-wzy)의 확인 후, 플라스미드는 APP2 rfb 클러스터를 발현하는 세포에서 테스트를 위해 추가로 사용되었다.
O-항원 생합성에 대한 두 번째 잠재적 제한 인자는 글리칸의 가용성 및/또는 전달일 수 있다. 특정 APP 혈청형에 대한 LPS 구조 데이터는 문헌 [Perry et al. 1990]에 의해, APP2 O-항원 오당류 [→2)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp(6-(Ac)0-65)-(1→4)-β-D-GalpNAc-(1→2)-α-L-Rhap-(1→]n의 환원 말단에서 갈락토오스를 확인하여 발표되었다. 박테리아 세포에서 갈락토오스의 생성의 한 중요한 효소는 기질인 포도당에서 갈락토오스의 전환이다. 이것은 에피머라제의 작용이 필요하다. Campylobacter jejuni의 UDP-GlcNAc/Glc 4-에피머라아제 gne는 세포-표면 탄수화물을 위해 박테리아 세포에서 갈락토오스와 N-아세틸갈락토사민을 제공하는 것으로 확인되었다(Bernatchez et al. 2005). C. jejuni 81116(유전자좌 C8J_1070)의 gne의 서열은 C-말단 HA(헤마글루티닌) 태그 및 5' EcoRI 및 3' XbaI 제한 절단 사이트와 융합되었다. 이 단편은 합성되고, 이후 아라비노스 유도성 프로모터의 제어 하에 있도록 pMLBAD의 EcoRI/XbaI 절단 부위로 클로닝되었다(pMLBAD-gne-HA).
wzy 및/또는 gne의 플라스미드 기반 발현은 그 표면에서 APP2 O-항원을 발현하는 SL1344 및 E. coli_5에서 테스트되었다. SL1344 및 그 유도체(Δrfb, Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy, Δrfb::-kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD pEC415, Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD-gne, Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pEC415-wzy 및 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD-gne pEC415-wzy) 뿐만 아니라 E. coli_5 및 그 유도체(Δrfb, Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.), Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD, Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) pMLBAD-gne)을 항생제가 보충된 LB 배지(표 1 및 2에 따름)에서 37℃에서 진탕하여 0.6의 OD600이 될 때까지 성장시켰다. wzy 및/또는 gne 발현을 유도하기 위해, 아라비노스는 0.1%(SL1344 및 그 유도체의 경우) 또는 0.2%(E. coli_5 및 그 유도체의 경우)의 최종 농도로 첨가되었다. 37℃(진탕)에서 5시간 더 배양한 후, 아라비노스는 0.1%(SL1344 및 그 유도체) 또는 0.2%(E. coli_5 및 그 유도체)로 다시 첨가되었고, 배양물은 37℃(진탕)에서 약 16시간 동안 배양되었다. 정지된 세포는 수확되었고 추가 처리되었다. 지질 A에 대한 APP2 O-항원 제시에 대한 대조군으로서, APP2 P1875 균주가 느린 진탕(110 rpm)으로 37℃에서 BHI + NAD에서 정지상까지 성장되었고, 그 후 세포가 수확되었다. APP2 O-항원 분석을 위해, 세포는 1x Lammli 완충액(1 OD600 세포/100 ㎕ 1x Lammli 완충액)에 재현탁되었다. 샘플은 95℃에서 5분 동안 배양되었다. OD600 당량 세포(10mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM CaCl2, 50% 글리세롤 중 스톡 20mg/ml)당 12μg 프로테이나제 K가 첨가되었고 샘플이 60℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 후, 프로테이나제 K 처리된 샘플(0.1 OD600 세포 당량)은 4-12% Bis-Tris 겔 상에 로딩되었고, 분자는 MES 완충액에서 크기별로 분리되었다. 겔은 면역블롯팅 및 은 염색을 위해 추가로 처리되었다. 면역블롯을 통해 LPS 합성을 분석하기 위해, LPS는 겔에서 PVDF 막으로 옮겨졌다. 막은 실온에서 2시간 동안 진탕하여 차단 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.1% 카제인)에서 배양되었다. 그 다음, 막은 APP2 LPS(APP2 P1875의 프로테이나제 K 처리 추출물로 면역화된 토끼)에 대하여 반응성인 토끼 혈청의 1:2000 희석액을 함유하는 항체 결합 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.05% 카제인)에서 4℃에서 하룻밤 진탕하면서 배양되었다. 면역블롯은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액 pH 7.5로 5분 동안 3회 세척되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액에서 2차 염소 항 토끼 IgG-HRP 항체(BETHYL Cat# A120-401P)와 함께 항체 결합 용액에서 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 배양되었다. 막은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액 pH 7.5로 5분 동안 4회 세척되었다. 항체 결합은 ECL 용액(GE healthcare #RPN2105) 및 Stella 8300(Raytest)으로 광 신호 검출로 막을 중첩하여 시각화되었다. 은 염색을 위해 문헌 [Tsai et al. 1982, Anal. Biochem., Vol. 119(1), p115-9]에 의해 설명된 프로토콜이 사용되었다. 간단히 말해서, 겔은 실온에서 40% EtOH/5% 아세트산에서 하룻밤 고정되었다. 그 후, 겔은 40% EtOH/5% 아세트산 중 0.7% 과요오드산으로 10분 동안 처리한 다음, ddH2O로 15분 동안 3회 세척되었다. 겔은 염색 용액(0.187N 수산화나트륨, 0.2N 수산화암모늄, 0.667% 질산은)으로 염색되었고, 다시 ddH2O로 10분에 3회 광범위하게 세척되었다. 겔 상의 LPS는 현상 용액(0.25 mg/ml 시트르산 일수화물, 0.0185% 포름알데히드 용액)을 사용하여 시각화되었다.
APP2의 LPS에 대한 토끼 혈청으로 처리된 막의 면역블롯의 분석은 약 10kDa에서 10kDa 주변에서 지질 A 분획의 강한 염색 뿐만 아니라 균주 APP2 P1875의 ~12.5 내지 190kDa 사이에 이동하는 사다리 패턴(지질 A상에 O-항원 중합)(도 5의 A, C 레인 1)을 입증하였다. 토끼 혈청에 의한 인식은 SL1344 및 SL1344 Δrfb(도 5의 A 레인 2, 3) 또는 E. coli_5 및 E. coli_5 Δrfb에 대해 관찰되지 않았다. 은 염색에서 SL1344의 LPS가 검출될 수 있으며, 이는 내인성 O-항원 생합성의 성공적인 결핍을 나타내는 SL1344 Δrfb에서 사라진다(도 5의 B 레인 2, 3). E. coli_5의 LPS는 저분자량에서만 볼 수 있었고, E. coli_5 Δrfb 세포에서 사라졌다(도 5의 D 레인 9 및 10). SL1344의 rfb 클러스터(도 5의 A 레인 5)에서 카나마이신 내성 카세트의 다운스트림에서 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터의 통합은 부착된 단일 O-항원를 가진 지질 A에 해당하는 10 내지 15 kDa 사이의 밴드를 생성하였다. gne 또는 wzy가 이 세포에서 과발현되었을 때(도 5의 A 레인 6, 7) 앞에서 설명된 사다리 패턴이 나타나고, 두 단백질이 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)(도 5의 A, B 레인 8)에서 과발현된다면, 더욱 향상될 수 있다. 또한, 이들 세포는 동일한 발현 설정을 가진 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터가 없는 세포보다 더 강한 디스플레이를 도시한다(도 5의 A 레인 4). 따라서, gne 및 wzy 발현이 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) 세포에서 APP2 LPS 발현을 향상시키는 것으로 입증되었다. 또한, 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터를 발현하는 E. coli_5 세포의 경우 APP2 O-항원에 대한 사다리 패턴은 gne의 과발현에 의해 추가로 개선될 수 있다(도 5의 C, D 레인 12 및 13의 비교)
1.5) APP2 O-항원을 발현하는 SL1344로의 gne 및 코돈 최적화된 wzy 의 통합
유전자 변형된 SL1344에 플라스미드 상의 gne 및/또는 wzy를 도입한 후 APP2 O-항원 합성의 개선을 보고, 이들 유전자는 APP2 rfb 클러스터를 발현하는 균주의 게놈에 통합되었다. APP2 LPS의 발현 수준을 비교하기 위해, gne 단독 및 코돈-최적화된 wzy에 융합된 gne(APP2의 wzy(cod.opt.), 서열 8)가 통합되었다. 통합 부위로서, O-항원 리가제 rfaL의 다운스트림 영역은 통합된 gne 및 wzy(cod.opt.) 뿐만 아니라 전사하기 위해 rfaL 프로모터를 사용하도록 선택되었다. 일반적인 디자인(도 6)은 각각의 두 개의 효소(gne, wzy-cod.opt) 및 FRT 부위 인접한 항생제 내성 카세트 cat(클로람페니콜 내성 카세트)을 암호화하는 두 개(도 6의A)에서 세 개(도 6의B)의 개별적인 PCR 단편의 생성을 기반으로 한다.
rfaL-Ωgne/cat(도 6의 A)을 생성하기 위해, 중첩 영역이 있는 gne 및 cat에 대한 개별적인 단편이 증폭되었다. 중첩 PCR로 두 단편이 융합되었고, 5' 및 3' 말단이 연장되어 SL1344의 게놈에서 표적 통합 부위를 가진 상동 영역을 암호화하였다. 중첩 PCR에 의해 3개의 단편을 결합하고 5' 및 3' 말단에 상동 재조합 서열을 추가하기 전에, 코돈 최적화된 wzy를 인코딩하는 추가 단편이 생성된 것을 제외하고, 동일한 원칙에 따라 통합 구성물 rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat을 생성하였다(도 6의 B). 융합 구조물의 5' 및 3' 말단은 rfaL 정지 코돈의 다운스트림에서 표적화된 게놈 통합 부위와 재결합할 수 있는 상동 영역을 포함하도록 추가로 연장되었다(방법은 문헌 [Bryskin et al. 2010, Biotechniques, Vol. 48(6), p463-465]으로부터 조정됨). SL1344를 조작하기 위한 기질을 생성하기 위한 개별 PCR 및 중첩 PCR에 대한 템플릿 및 올리고뉴클레오티드 정보는 표 5에 나열된다.
PCR1 중첩/연장 PCR2
융합 구조물 단편 주형 올리고 1 올리고 2 주형 올리고 1 올리고 2
rfaL-gne/cat gne pMLBAD-gne-HA 5'-gne-SI1344rfaL 3'-gne-cat_중첩 SI1344 PCR1 gne/PCR1 cat 5'-elo-gne-SI1344rfaL 3'-elo-cat_SI1344rfaL
cat pKD3 5'-cat-P2new 3'-cat_SI1344rfaL
rfaL-gne-wyz(cod.opt.)/cat gne pMLBAD-gne-HA 5'-gne_SI1344rfaL 3'-gne-wyz(co) 중첩 SI1344 PCR1 gne/PCR1 wzy(cod.opt.)PCR1cat 5'-elo-gne_SI1344rfaL 3'-elo-cat_SI1344rfaL
wyz(cod.opt.) pDOC_E.coli_5_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) 5'-gne 중첩_wzy(co) 3'-wyz(co)-cat_중첩
cat pKD3 5'-cat 3'-cat_SI1344rfaL
중첩 PCR로부터 생성된 융합 구조물은 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS, SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)에 대해 λ-재조합 시스템 pLAMBDA46(Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645에서 변형됨)을 암호화하는 온도 민감성 헬퍼 플라스미드와 함께 형질전환되었다. λ-재조합 시스템은 융합 구조물의 상동 인접 영역을 인식하고 rfaL의 정지 코돈 후 게놈 다운스트림에서 이들을 재조합하였다. 도입된 클로람페니콜 내성 유전자(cat)는 양성 클론의 선택을 허용하였다(성공적인 통합). 이러한 양성 후보는 PCR에 의한 PCR 단편의 통합에 대해 검증되었다. 온도 민감성 헬퍼 플라스미드는 여러 라운드의 배양 동안 성장 온도를 증가시켜 세포에서 손실되었다. 최종 균주 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne/cat, SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat, SL1344 Δrfb: :kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne/cat 및 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat에서 O-항원 제시가 면역블롯팅에 의해 테스트되었다(도 8). 분석 절차 및 결과는 1.6에 설명된다.
1.6) APP2 rfb 클러스터의 발현을 "구동"하기 위해 카나마이신 프로모터만 있는 카나마이신 내성 카세트를 교환함
전체 세포 박테리아에 기반한 백신의 경우, 항생제 내성이 없는 것이 추천된다. 따라서, APP2 rfb 발현을 향상시키기 위해 도입된 카나마이신 내성이 게놈에서 제거되는 것이 필요하였다. 그러나 카나마이신 프로모터에 의한 증가된 전사의 이점은 미래의 박테리아 백신 균주에서 사용될 수 있다. 첫 번째 단계에서 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 카세트는 온도 민감성 플라스미드 pCP20(Cherepanov et al. 1995, Gene, Vol. 158, p9-14)을 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)-/cat 세포로 도입함으로써 "뒤집어졌다(flip out)". 각 위치에서 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 카세트의 "뒤집힘(flip out)" 이벤트 이후, 게놈에는 단 하나의 FRT 부위만 남아 있었다. 배양 온도가 증가함에 따라 플라스미드를 암호화하는 플립파제에 대해 양성 클론이 역선택되었다. PCR에 의해 pCP20의 부재 및 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 마커의 부재가 검증되었다. 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터의 업스트림에 카나마이신 프로모터(kP)를 통합하기 위해, 1414bp 구조물이 카나마이신 내성 카세트의 373bp 프로모터 영역이 뒤따르는 FRT 부위에 인접한 클로람페니콜 내성 카세트를 포함하도록 합성되었다(도 7, 서열 45). APP2 rfb 클러스터의 업스트림에 서열 22를 도입하기 위해, 올리고뉴클레오티드 Ec_SL/Kan_fw 및 Ec_SL/Kan_rev 및 kP 통합 카세트를 증폭하고 rfb 클러스터의 업스트림 영역에 대해 상동 재조합 서열을 추가하는 주형으로서 서열 24를 사용하여 PCR 단편이 생성되었다. 생성된 생성물은 두 번째 PCR 반응을 위해 올리고뉴클레오티드 Ec_SL/Kan_fw_elo 및 Ec_SL/Kan_rev_elo와 함께 사용되어 통합 효율(단편 크기 1671 bp)의 증가를 위해 상동 재조합 서열을 연장하였다. 이 DNA 단편 및 온도 민감성 헬퍼 플라스미드 암호화 λ-재조합 시스템 pKD46(Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645)가 SL1344 Δrfb::APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)를 위해 도입되었다. λ-재조합 시스템은 rfb 클러스터의 업스트림에 있는 상동 인접 영역을 인식하고 카나마이신 프로모터에 융합된 인접 FRT 부위를 가진 클로람페니콜 내성 유전자를 각 부위에 통합하였다. 도입된 클로람페니콜 내성 유전자는 양성 클론의 선택을 가능하게 하였다(성공적인 통합). 이러한 양성 후보는 PCR 단편의 통합에 대해 검증되었다. 온도 민감성 헬퍼 플라스미드는 여러 라운드의 배양 동안 성장 온도의 증가에 의해 세포로부터 손실되었다. 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하기 위해, 생성된 균주 SL1344 Δrfb::cat/kP-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)는 pCP20으로 형질전환되었고, 위에 설명된 대로 마커가 뒤집혔다. 생성된 균주 SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)는 그의 APP2 O-항원 생성에 대해 분석하고 그의 모 균주와 비교되었다(도 8).
야생형 SL1344 및 E. coli_5 뿐만 아니라 내인성 O-항원 생합성이 없거나(E. coli_5 Δrfb 및 SL1344 Δrfb) APP2 rfb 클러스터를 발현하는(E. coli_5 Δrfb::APP2.-LPS, Δrfb::kanR-APP2.LPS, Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) 및 SL1344 Δrfb::APP2.LPS, Δrfb::kanR-APP2.LPS, Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.), Δrfb::kanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne/cat, Δrfb::kanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat, Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod. opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat, Δrfb::kP-APP2-.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.), Δrfb rfaK-ΩClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL, Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.) pliC-ΩClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII-(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC) 유전자 변형 세포는 37℃에서 진탕하면서 LB 배지에서 포화 상태(OD600 >2)로 성장되었다. 추가 처리를 위해 세포가 수확되었다. 지질 A에 대한 APP2 O-항원 제시에 대한 대조군으로서, APP2 P1875 균주가 느린 진탕(110rpm)으로 37℃에서 정지상으로 BHI + NAD에서 성장되었다. 세포는 수확되었고 추가 처리에 사용되었다. APP2 O-항원 분석을 위해, 세포는 1x Lammli 완충액(1 OD600 세포/100 ㎕ 1x Lammli 완충액)에 재현탁되었다. 샘플은 95℃에서 5분 동안 배양되었다. OD600 당량 세포(10mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM CaCl2, 50% 글리세롤 중 스톡 20mg/ml)당 12μg 프로테이나제 K가 첨가되었고 샘플이 60℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 후, 프로테이나제 K 처리된 샘플(0.1 OD600 세포 당량)은 4-12% Bis-Tris 겔에 로딩되었고 MES 완충액에서 분자가 크기별로 분리되었다. 겔은 면역블롯팅 및 은 염색을 위해 추가로 처리되었다. 면역블롯을 통한 LPS 합성을 분석하기 위해, LPS는 겔에서 PVDF 막으로 옮겨졌다. 막은 실온에서 2시간 동안 진탕하면서 차단 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.1% 카세인)에서 배양되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액에서 APP2 LPS에 반응성인 토끼 혈청을 함유하는 항체 결합 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.05% 카제인)에서 4℃에서 하룻밤 진탕하면서 배양되었다. 면역블롯은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액 pH 7.5로 5분 동안 3회 세척되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액의 2차 염소 항 토끼 IgG-HRP 항체(BETHYL Cat# A120-401P)와 함께 항체 결합 용액에서 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 배양되었다. 막은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액(pH 7.5)로 5분 동안 4회 세척되었다. 그 후 특이적 항체 결합은 ECL 용액(GE Healthcare #RPN2105)의 첨가 및 Stella 8300(Raytest)으로 검출된 광 신호를 기록함으로써 시각화되었다. 은 염색을 위해, 문헌 [Tsai et al. 1982, Anal. Biochem., Vol. 119(1), p115-9]에 설명된 프로토콜이 사용되었다. 간단히 말해서, 겔은 실온에서 40% EtOH/5% 아세트산에서 하룻밤 고정되었다. 그 후 겔은 40% EtOH/5% 아세트산 중 0.7% 과요오드산으로 10분 동안 처리된 다음, ddH2O로 15분 동안 3회 세척되었다. 겔은 염색 용액(0.187N 수산화나트륨, 0.2N 수산화암모늄, 0.667% 질산은)으로 염색되었고, 다시 ddH2O로 10분 동안 3회 광범위하게 세척되었다. 겔 상의 LPS는 현상 용액(0.25mg/ml 시트르산 일수화물, 0.0185% 포름알데히드 용액)을 첨가함으로써 시각화되었다.
APP2의 LPS에 대한 토끼 혈청 사용에 의한 면역블롯팅은 약 10kDa에서 지질 A 분획의 강한 염색 및 균주 APP2 P1875의 ~12.5 내지 190kDa(지질 A에 대한 O-항원 중합) 사이에서 이동하는 사다리 패턴을 보여주었다(도 8의 C, 레인 1). SL1344 및 SL1344 Δrfb(도 8의 C, 레인 2, 3), SL1344 Δrfb rfaK-ΩClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII-(aa612-801)-ApxIII(aa626-801)-ApxIII -860)-HIS6-rfaL(도 8의 C, 레인 11) 또는 E. coli_5 및 E. coli_5 Δrfb(도 8의 C, 레인 13, 14)에 대해 토끼 혈청에 의한 인싱을 볼 수 없었다. 은 염색에서 SL1344(10kDa에서 >115kDa 범위) 및 E. coli_5(10kDa - 15kDa)의 LPS가 검출될 수 있으며, 이는 내인성 O-항원 생합성의 성공적인 삭제를 나타내며(도 8의 C, 레인 2, 3, 13, 14) SL1344 Δrfb 및 E. coli_5 Δrfb에서 사라진다. APP2 rfb 클러스터의 통합은 단일 O-항원이 부착된 지질 A에 해당하는 10~15kDa 사이의 매우 희미한 밴드의 표시를 초래하였다(도 8의 C, 레인 4, 15). 이 신호는 APP2 O-항원 생합성이 카나마이신 내성 카세트의 다운스트림에 위치될 때 향상될 수 있다(도 8의 C, 레인 5, 16). 업스트림 카나마이신 내성 카세트와 결합된 APP2 rfb 클러스터의 코돈 최적화는 APP2 O-항원 생합성을 추가로 개선하였다(도 8의 C, 레인 6, 17). 특히 E. coli_5의 경우 중합된 O-항원 사슬의 표시를 초래하였다(사다리 패턴, 도 8의 C 레인 17). 저분자량에서 사다리 패턴은 은 염색 분석에서도 검출될 수 있다(도 8의 B, 레인 17). gne 또는 gne 및 wzy를 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS에 도입한 후(도 8의 C, 레인 7, 8), 고분자량에서 밴드가 나타나는 APP2 O-항원 발현의 단계적 증가가 관찰되었으며, 이는 지질 A 상의 O-항원의 중합을 나타낸다. 카나마이신 내성 카세트의 다운스트림에서(도 8의 C, 레인 9) 또는 카나마이신 프로모터(도 8의 C, 레인 10)만 중 어느 것이든 코돈 최적화된 APP2 rfb 클러스터를 발현하는 SL1344에서 gne 및 코돈 최적화된 wzy의 게놈 발현은 O-항원 중합 및 지질 A에 대한 제시를 고분자량(>190 kDa)에서도 글리칸 구조물이 검출될 수 있는 양으로 증가하였다. 두 세포주에서도 은 염색 분석에서 저분자량 밴드가 검출될 수 있다(도 8의 B, 레인 9, 10). 세포 표면 상에 ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6(도 8의 C, 레인 12)을 추가로 제시하는 최종 글리코엔지니어링된 SL1344는 모 균주 SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)로서의 APP2 O-항원 발현의 동일한 강도를 보여준다.
1.7) SL1344에서 kP 프로모터에 의해 제어되는 코돈 최적화된 APP8 O-항원 생합성 클러스터의 통합
설명된 이종성 O-항원의 숙주 박테리아로의 전달이 다양한 O-항원 유형에 적용될 수 있음을 입증하기 위해, Actinobacillus pleuropneumoniae 혈청형 8(APP8) 균주(MIDG2331)의 rfb 클러스터는 SL1344에 게놈 통합되었고, 지질 A에 대한 APP8 O-항원 제시에 대해 테스트되었다.
APP8 rfb 클러스터를 포함하는 코돈 최적화된(APP2 rfb 클러스터가 SL1344에 대해서도 작동하는 것으로 도시된 E. coli 발현에 대해) 13598 bp 단편(도 9, 서열 4)이 SL1344로 내인성 rfb 클러스터로 안티센스 방향에서 통합을 위해 변형되었다. APP8 rfb 클러스터의 업스트림에서 FRT 부위의 인접한 클로람페니콜 내성 카세트에 이어서 카나마이신 내성 카세트의 373 bp 프로모터 영역이 융합되었다. 구조물은 I-SceI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위에 의해 인접된 SL1344(안티센스 방향의 galF 유전자 포함)의 rfb 클러스터에 인접한 상동 영역에 의해 업스트림 및 다운스트림에서 인접되었다(서열 46, 도 10). kP에 의해 제어되는 코돈 최적화된 APP8 rfb 클러스터를 SL1344에 통합하기 위해, 문헌 [Lee et al. 2009]의 pDOC 시스템에 기반한 셔틀 벡터 플라스미드 pDOC_SL1344_Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)가 생성되었다/합성되었다(CRO에 의해).
헬퍼 플라스미드 pACBSCE와 함께 셔틀 벡터 플라스미드(pDOC_SL1344_Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.))는 SL1344로 형질전환되었다. 절차는 위에서 설명한 대로 및 문헌 [Lee et al. 2019]에 의해 따랐다. 최종 균주 SL1344 Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)는 PCR에 의해 검증되었고 O-항원 발현은 면역블롯팅에 의해 시험되었다(도 11).
야생형 SL1344 뿐만 아니라 내인성 O-항원 생합성 이론이 결여된 유전적으로 변형된 세포(SL1344 Δrfb) 또는 kP 프로모터의 제어 하에 코돈 최적화된 APP8 rfb 클러스터를 발현하는 세포(SL1344 Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.))가 37℃에서 진탕하면서 LB 배지에서 포화(OD600 >2)까지 성장되었다. 추가 처리를 위해 세포가 수확되었다. 지질 A에 대한 APP8 O-항원 제시에 대한 대조군으로서, APP8(MIDG2331) 및 APP3(ORG1224) 균주가 느린 진탕(110rpm)으로 37℃에서 정지상으로 BHI + NAD에서 성장되었다. 세포는 수확되었고 추가 처리에 사용되었다. APP8 O-항원 분석을 위해, 세포는 1x Lammli 완충액(1 OD600 세포/100 ㎕ 1x Lammli 완충액)에 재현탁되었다. 샘플은 95℃에서 5분 동안 배양되었다. OD600 당량 세포(10mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM CaCl2, 50% 글리세롤 중 스톡 20mg/ml)당 12μg 프로테이나제 K가 첨가되었고, 샘플은 60℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 후, 프로테이나제 K 처리된 샘플(0.1 OD600 세포 당량)은 4-12% Bis-Tris 겔에 로딩되었고, MES 완충액에서 분자는 크기별로 분리되었다. 겔은 면역블롯팅 및 은 염색을 위해 추가로 처리되었다. 면역블롯을 통한 LPS 합성을 분석하기 위해, LPS는 겔에서 PVDF 막으로 옮겨졌다. 막은 실온에서 2시간 동안 진탕하는 차단 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.1% 카세인)에서 배양되었다. 그 후, 막은 1:500 희석액으로 APP3 LPS에 반응성인 돼지 혈청을 함유하는 항체 결합 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.05% 카제인)에서 4℃에서 하룻밤 진탕하면서 배양되었다. 면역블롯은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액 pH 7.5로 5분 동안 3회 세척되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액에서 이차 돼지 항-IgG-HRP(BETHYL Cat#A100-105P)와 함께 항체 결합 용액에서 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 배양되었다. 막은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액 pH 7.5로 5분 동안 4회 세척되었다. 그 후 ECL 용액(GE Healthcare #RPN2105)을 막에 첨가하고 Stella 8300(Raytest)으로 검출된 광 신호를 기록함으로써 특이적 항체 결합이 시각화되었다. 은 염색을 위해, 문헌 [Tsai et al. 1982, Anal. Biochem., Vol. 119(1), p115-9]에 의해 설명된 프로토콜이 사용되었다. 간단히 말해서, 겔은 실온에서 40% EtOH/5% 아세트산에서 하룻밤 고정되었다. 그 후 겔은 40% EtOH/5% 아세트산 중 0.7% 과요오드산으로 10분 동안 처리한 다음 ddH2O로 15분 동안 3회 세척되었다. 겔은 염색 용액(0.187 N 수산화나트륨, 0.2 N 수산화 암모늄, 0.667 % 질산은)으로 염색되었고 다시 ddH2O로 10분 동안 3회 광범위하게 세척되었다. 겔 상의 LPS는 현상 용액(0.25 mg/ml 시트르산 일수화물, 0.0185 % 포름알데히드 용액)을 첨가함으로써 시각화되었다.
APP3 및 APP8의 O-항원 구조가 동일하기 때문에 혈청형 3에 대해 반응성인 토끼 혈청이 사용되었다(Perry et al. 1990, Serodiagnosis and Immunotherapy in Infectious Disease, Vol. 4(4), p299-308).
APP3의 LPS에 대한 토끼 혈청을 사용한 면역블롯팅은 약 10kDa에서 지질 A 분획의 강한 염색과 두 혈청형 O-항원과 돼지 혈청의 교차 반응성을 증명하는 균주 APP8 및 3의 ~12.5 내지 190kDa(지질 A에 대한 O-항원 중합) 사이에서 이동하는 사다리 패턴을 보여주었다(도 11의 B, 레인 3, 4). 토끼 혈청에 의한 인식은 SL1344 및 SL1344 Δrfb에 대해 볼 수 없었다(도 11의 B, 레인 1, 2). 은 염색에서 SL1344의 LPS(10kDa에서 >115kDa 범위)가 검출될 수 있으며, 이는 SL1344 Δrfb에서 사라진다(도 11의 A, 레인 1, 2). kP 프로모터의 제어 하에 코돈 최적화된 APP8 rfb 클러스터의 통합은 부착된 단일 O-항원으로 지질 A에 상응할 가능성이 있는 10 내지 15 kDa 사이의 강한 밴드의 출현을 초래하였다(도 11의 B, 레인 5). 더욱이, APP3 반응성 돼지 혈청과 반응성이고 O-항원 중합을 나타내는 15 내지 190 kDa 범위의 희미한 사다리 패턴이 검출될 수 있었다.
이종성 APP8 rfb 클러스터(코돈 최적화되고 kP 프로모터의 제어 하에 있음)가 이종성 숙주 SL1344로 성공적으로 전달될 수 있고 지질 A에 APP8 O-항원이 제시될 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 2
2) 잠재적 백신 후보로서 APP의 Apx 독소의 중화 에피토프의 클로닝
2.1) ApxII 및 ApxIII의 가용성 중화 에피토프를 암호화하는 플라스미드의 생성
APP 감염에 대한 효과적인 백신의 경우 비활성화 독소(Apx 톡소이드)가 최종 백신 제형에 존재하는 것으로 간주된다. 이러한 기공 형성 Apx 독소는 APP의 주요 독력 인자에 속하며 감염의 발병기전에 강하게 기여한다(Bosse et al. 2002, Microbes Infect., Vol. 4(2), p225-235). 4개의 확인된 Apx 독소(ApxI, II, III 및 IV)는 apx 오페론에서 이들의 전독소 구조적 형태로 암호화되며, 이는 추가로 활성자 유전자 및 분비-장치-암호화 유전자를 암호화한다. 4가지 독소는 다양한 APP 혈청형에서 다양한 조합으로 발현된다. APP 혈청형 2는 ApxII, III 및 IV을 암호화한다(Beck et al. 1994, J. Clin. Microbiol., Vol. 32(11), p2749-2754). 여기에서 ApxII 및 III의 잘린 버전이 생성되고 E. coli에서 발현되고 정제되었다. 최근 간행물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 ApxII 및 III의 중화 에피토프가 확인되었으며 이러한 에피토프에 대해 생성된 항체는 시험관 내에서 보호성이었다. 문헌 [Kim et al. 2010]은 아미노산 439-801aa를 함유하는 APP2로부터 N-말단 HIS10 태그 절단된 ApxII를 기술하였다. RTX 톡신 IIA(ApxII)의 서열은 데이터베이스(GenBank: AF363362.1)로부터 검색되었으며, 합성되었고, pMLBAD 벡터 pMLBAD-HIS10ApxII(439-801aa)(서열 47)에 암호화된 절단된 HIS10 태그된 ApxII(439-801aa)(서열 47)를 생성하는데 사용되었다. ApxIII의 서열은 데이터베이스(GenBank: AF363363.1)로부터 검색되었고, 합성을 위한 템플릿으로 사용되었다. 이전 연구에서, ApxIII의 N-말단 도메인이 회복기 돼지 혈청에 의해 인식되어 세포독성 중화 활성을 가지고 ApxIII에 의해 유도된 시험관내 호중구 세포자멸사를 예방하는 것으로 나타났다(Seah et al. 2004, Vaccine, Vol. 22(11-12), p1494-1497). ApxIII의 N-말단 도메인(아미노산 27-245)은 C-말단 HIS10 태그(서열 48)로 합성되었고, PCR 반응에서 프라이머 5' XmaI-XhoI-APXIIIne-HIS-fw/3' APXIIIne-HIS-HindIII-rv를 사용하여 시작 코돈 및 5' XmaI/3' HindIII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 도입하기 위한 주형으로 사용되었다. 생성된 단편은 각각의 효소로 분해되었고, XmaI/-HindIII 처리된 pMLBAD 벡터(pMLBAD-ApxIII(27-245aa)-HIS9; 클로닝 과정에서 하나의 HIS 에피토프가 손실됨)로 결찰되었다. 두 플라스미드 모두 단백질 발현 테스트 및 돼지 백신 접종 시험을 위한 정제를 위해 E. coli BL21에 도입되었다. HIS10-ApxII-(439-801aa)를 정제하기 위해, LB + Tmp(10 ㎍/ml)에서 진탕시키면서 37℃에서 성장된 BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)의 하룻밤 배양물은 1 L LB + Tmp에서 0.1 OD600으로 희석되었고, OD600이 약 0.8 - 0.9가 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 배양되었다. 아라비노스(0.2% 최종 농도)는 첨가되어 단백질 발현을 유도하였다. 세포는 진탕기에서 37℃에서 추가로 4시간 동안 배양된 후 원심분리(5000 x g/4℃/10분 및 상청액 폐기)에 의해 수확되었다. 세포 용해를 위해, 1x PBS 중 20ml의 0.1mg/ml 리소자임이 첨가되었다. 세포는 초음파 처리-동결-해동 라운드에 의해 파괴되었다. 간단히 말해서, 세포 펠렛은 85%의 진폭으로 초음파 처리되었고, 액체 질소에서 1분 동안 동결되었고, 37℃에서 10분 동안 해동되었다(진탕). 이 절차는 3회 반복되었다. 세포 현탁액은 10000 x g으로 4℃에서 5분 동안 원심분리되었다. 이전에 설명된 단계 동안 HIS10-ApxII(439-801aa)가 응집되어 원심분리 후 펠렛 분획에서 단백질이 발견되는 것으로 나타났다. 약 20ml의 변성 완충액(6M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 0.1M Tris-HCl pH 8.0)이 펠렛에 첨가되었고, 물질은 4℃에서 10000 x g에서 20분 동안 다시 원심분리되었다. 4ml 평형화된 니켈-NTA 수지는 상청액에 첨가되었고 물질은 4℃에서 회전 휠 상에서 1시간 동안 배양되었다. 그 후, 현탁액은 중력 유동 칼럼에 로딩되었다. 수지는 10ml 1x PBS로 3회 세척되었고, 단백질은 0.5 M 이미다졸을 함유하는 1ml 변성 완충액으로 5회 용리되었다. 수집된 물질을 분석하기 위해, 각 용리 분획 60μl를 20μl 4x Lammli 완충액과 혼합되었다. 샘플은 95℃에서 5분 동안 쿠킹되었고 10㎕가 4-12% Bis-Tris 겔에 로딩되었고, MES 완충액에서 분자는 크기별로 분리되었다. 겔은 쿠마시 염색(도 12의 A) 및 HIS 특이적 항체를 사용한 면역블롯팅(도 12의 B)을 위해 추가로 처리되었다. 쿠마시 염색을 위해, 겔은 쿠마시 염색 용액(3mM 쿠마시 브릴리언트 블루 R 250, 40% 에탄올, 10% 아세트산)으로 덮혀지고, 실온에서 하룻밤 진탕하여 배양되었다. 겔의 원하는 탈색 및 단백질의 얼룩이 관찰될 때까지 겔은 쿠마시 탈색 용액(30% 에탄올, 10% 아세트산)에 반복적으로 넣어졌다. 면역블롯을 통해 정제된 HIS10-ApxII(439-801aa)를 검출하기 위해, 단백질이 겔에서 PVDF 막으로 옮겨졌다. 막은 실온에서 2시간 동안 진탕하여 차단 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.1% 카세인)에서 배양되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액으로 테트라-HIS 항체(Qiagen #34670)를 함유하는 항체 결합 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.05% 카제인)에서 4℃에서 하룻밤 진탕하면서 배양되었다. 막은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액 pH 7.5로 5분 동안 3회 세척되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액의 이차 염소 항 마우스 IgG-HRP 항체(BETHYL Cat# A90-116P)와 함께 항체 결합 용액에서 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 배양되었다. 막은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액(pH7.5)으로 5분 동안 4회 세척되었다. 이후 ECL 용액(GE Healthcare #RPN2105)을 막에 첨가하고, Stella 8300(Raytest)으로 검출된 광 신호를 기록함으로써 특정 항체 결합이 시각화되었다.
적용된 단백질 발현 및 정제 방법으로 HIS10-ApxII(439-801aa)는 Nickel-NTA 수지에 결합하고 중력 흐름을 이용한 용리를 통해 다량으로 정제할 수 있었다(도 12). 가장 높은 단백질 양은 용리 분획 3-5에서 발견되었다. 약 41kDa에서 정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) 외에도 특정 불순물이 HIS 항체(도 12의 B)에 의해 인식되는 더 높은 분자량 및 더 낮은 분자량에서 검출될 수 있다(도 12의 A). 이 실험을 통해 잘린 HIS10-ApxII(439-801aa)의 성공적인 발현과 정제를 보여줄 수 있었다.
적용된 단백질 발현 및 정제 방법으로 HIS10-ApxII(439-801aa)는 Nickel-NTA 수지에 결합하고 중력 흐름을 이용한 용리를 통해 다량으로 정제될 수 있었다(도 12). 가장 높은 단백질 양은 용리 분획 3-5에서 발견된다. 약 41kDa에서 정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) 외에도 특정 불순물이 HIS 항체(도 12의 B)에 의해 인식되는 더 높은 분자량 및 더 낮은 분자량에서 검출될 수 있다(도 12의 A). 이 실험을 통해 잘린 HIS10-ApxII(439-801aa)의 성공적인 발현과 정제가 보여질 수 있었다.
ApxIII(27-245aa)-HIS9를 정제하기 위해, TB + Tmp(10 ㎍/ml)에서 진탕하며 37℃에서 성장된 BL21 pMLBAD-ApxIII(27-245aa)-HIS9의 하룻밤 배양물은 1L TB + Tmp에서 0.1 OD600으로 희석되었고 OD600이 약 0.6 - 0.8일 때까지 37℃에서 진탕하여 배양되었다. 아라비노스(0.2% 최종 농도)가 첨가되어 단백질 발현을 유도하였다. 세포는 진탕기에서 37℃에서 추가로 4시간 동안 배양된 다음, 원심분리에 의해 수확되었다. HIS10-ApxII(439-801aa)에 대해 설명된 것과 유사한 절차를 따랐다. 간단히 말해서, 세포 용해는 70ml의 최종 부피에서 수행되었다(30mM Tris HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 20% 수크로스, 1mM EDTA, 1g/l 리소자임, 1x 프로테아제 억제제 칵테일). 세포는 초음파처리-양이온-동결-해동 라운드의 3회에 의해 용해되었다(상기 기재된 바와 같음). 세포 현탁액은 5525 x g에서 4℃에서 15분 동안 원심분리되었다. 상층액은 4℃에서 20000 x g에서 1시간 동안 다시 원심분리되었다. 결합 완충액(30mM Tris HCl pH 7.5, 300mM NaCl)에서 평형화된 0.3ml 니켈-NTA 수지가 상청액에 첨가되고 물질이 4℃에서 회전 휠에서 1시간 동안 배양되었다. 그 후, 현탁액은 중력 흐름 칼럼에 로딩되었다. 수지는 3ml 결합 완충액으로 2회 세척되었고, 3ml 세척 완충액(30mM Tris HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸)으로 1회 세척되었다. 용리는 0.3ml 용리 완충액 1(3 0mM Tris HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 200mM 이미다졸)을 4회, 0.5ml 용리 완충액 2(30mM Tris HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 500mM 이미다졸)를 2회 및 0.5ml 용리 완충액 3(30mM Tris HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 1M 이미다졸)을 3회 첨가함으로써 수행되었다. 세포 준비 및 단백질 정제를 분석하기 위해, 모든 분획은 HIS 에피토프 및 쿠마시 염색에 대한 면역블롯에 의해 테스트되었고, 용리 분획 4-8을 풀링하고 PBS에서 투석하여 완충액을 교환하기로 결정되었다. 풀링 및 투석된 샘플을 분석하기 위해, 60μl의 물질은 20μl 4x Lammli 완충액과 혼합되었다. 샘플은 95℃에서 5분 동안 쿠킹되었고, 10㎕가 4-12% Bis-Tris 겔에 로딩되었고, MES 완충액에서 분자는 크기별로 분리되었다. HIS 특이적 항체를 이용한 면역블롯 및 쿠마시 염색은 상술한 바와 같이 수행되었다(도 13). HIS 특이적 신호는 ApxIII(27-245aa)-HIS9의 계산된 분자량과 일치하는 약 25kDa에서 확인되었으며(도 13의 B), 이는 쿠마시 염색 겔에서도 검출될 수 있었다(도 13의 A). 저분자량 및 고분자량의 일부 불순물도 검출된다. 절단된 ApxIII(27-245aa)-HIS9의 성공적인 발현 및 정제가 입증되었다(도 10).
2.2) 둘 다 APP2 O-항원을 발현하는 E. coli_5 또는 SL1344의 세포 표면에서 발현될 융합 구조물로서 ApxI, II 및 III의 중화 에피토프의 게놈 통합
APP2 LPS 및 표면에 Apx 독소의 중화 에피토프를 제시하는 살아있는 Salmonella 백신 균주를 생성하기 위해, 상응하는 유전자는 게놈적으로 통합되어 중화 에피토프의 표면 제시를 초래하였다. 문헌 [Xu et al. 2018, PlosOne, Vol. 13(1)]은 절단된 ApxI(628-845aa), 절단된 ApxII(612-801aa) 및 절단된 ApxII(612-801aa) 및 C-말단 HIS6 태그가 있는 절단된 ApxIII(626-860aa)에 연결된 특정 면역 반응을 유도하는 세포 표면에서 발현되는 기공 형성 용혈성 단백질인 ClyA로 이루어진 융합 구조물을 설명하였다. 마우스에 대한 백신접종 및 시험감염 연구에서, 그룹은 상이한 APP 혈청형으로 챌린지 후 시험감염 후 증가된 생존율 뿐만 아니라 면역글로불린 및 사이토카인 수준의 상승을 보여주었다. 구성물의 순서는 공개적으로 입수가능하며 다음과 같이 수정되었다. 합성 회사에서 제공된 알고리즘으로 ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6의 코돈 사용이 E. coli 발현 시스템에 최적화되었다. 강력한 전사 속도를 위해 합성 프로모터 proD의 서열(Davis et al. 2010, Nucleic acid research, Vol. 39(3), p1121-1141)은 시작 코돈 전에 통합되었다. 게놈으로의 성공적인 통합을 선택하기 위해, 인접 FRT 부위가 있는 클로람페니콜 내성 카세트(cat)(pKD3 기반; Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645)는 융합 구조물의 종료 코돈 후에 첨가되었다. 게놈으로의 상동 통합을 위해, 유전자간 rfaK-rfaL 영역에 대한 구조물 상동 서열의 업스트림 및 다운스트림이 선택되었다(proD 프로모터의 213bp 5' 추가, 클로람페니콜 내성 카세트 후 250bp). 전체 합성된 구조물은 도 14(서열 49)에 개략적으로 표시된다. 융합 구조물 proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/cat을 SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy-(cod.opt.)로 통합하기 위해, 서열 32의 인접 영역은 올리고뉴클레오티드 FW_pli-Cint/REV_pagCint를 사용한 PCR에 의해 변경되었고, 이어서 올리고뉴클레오티드 eloFW_pliCint/-eloREV_pagCint로 5' 및 3' 말단의 연장이 이어졌다. 이 절차는 SL1344에서 pliC의 다운스트림 영역과 83bp 상동 영역을 생성하고 SL1344에서 pagC의 다운스트림 영역과 87bp 상동 영역을 생성하였다. 이러한 변형으로, 융합 구조 proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/cat는 pliC와 pagC 사이의 유전자간 영역으로 통합될 수 있다. 최종 구조물은 g-재조합 시스템 pKD46(Datsenko et al. 2000, PNAS, Vol. 97(12), p6640-6645)을 암호화하는 온도 민감성 헬퍼 플라스미드와 함께 SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy-(cod.opt.)로 형질전환되었다. λ-재조합 시스템은 개별적인 게놈 부위에서 상동 인접 영역을 인식하고, 융합 구조물 proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII-(626-860aa)-HIS6/cat을 앞서 언급한 통합 사이트(SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.) pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626- 860)-HIS6-cat/pagC)로 재조합하였다. APP2 rfb 클러스터가 없지만 proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6 융합 구조물을 발현하는 대조군 균주를 생성하기 위해, 서열 32는 올리고뉴클레오티드 FW-rfaK_rfaL/REV_rfaL_rfaK를 사용하여 증폭되어 SL1344의 rfaK와 rfaL 사이의 유전자간 영역에서 통합을 위한 인접 상동 영역이 있는 통합 구조물을 포함하는 4513bp 단편을 생성한다. 이 단편은 pKD46과 함께 SL1344 Δrfb로 형질전환되었고, 절차는 상기 기재된 바와 같이 따랐다. 구성물 proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/cat는 유전자 rfaK와 rfaL(SL1344K Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL/cat) 사이의 유전자간 영역에 통합되었다. 두 균주에 도입된 항생제 내성 카세트는 양성 클론의 선택을 허용하였다(성공적인 통합). 이러한 양성 후보는 PCR에 의한 PCR 단편의 통합에 대해 검증되었다. 온도 민감성 헬퍼 플라스미드는 여러 라운드의 배양 동안 성장 온도를 증가시켜 세포에서 손실되었다. 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하기 위해 생성된 균주 SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.) pliC-ΩproDClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-ApxIII01) (aa626-860)-HIS6-cat/pagC 및 SL1344 Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-cat/rfaL는 회문 FRT 사이트를 인식하는 플립파제를 암호화하는 온도 민감성 플라스미드 pCP20(Cherepanov et al. 1995, Gene, Vol. 158, p9-14)으로 형질전환되었다. "플립 아웃" 이벤트 후 FRT는 게놈에 남아 있었다. 다시, 배양 온도가 증가함에 따라 양성 클론이 플립파제 암호화 플라스미드에 대해 역선택되었다. 최종 PCR은 모든 헬퍼 플라스미드의 부재, 클로람페니콜 내성 마커의 부재 및 proD-ClyA-ApxI-(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6의 통합을 검증하였다. 생성된 균주 SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.) pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860) HIS6-pagC 및 SL1344 Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL도 그들의 APP2 O-항원 생성 뿐만 아니라 ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII-(626-860aa)-HIS6 발현에 대해 분석되었다. ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII-(626-860aa)-HIS6의 발현을 검증하기 위해, SL1344 Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.) 및 SL1344 Δrfb 전체 세포 추출물은 면역-블롯 및 쿠마시 염색으로 분석되었다.
야생형 SL1344, APP2 rfb 클러스터(SL1344 Δrfb::APP2.LPS, Δrfb::KanR-APP2.LPS, Δrfb::KanR-APP2.LPS(cod.opt.), Δrfb::KanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne/cat, Δrfb::KanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat, Δrfb::KanR -APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat, Δrfb::kP-APP2.LPS-(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)를 발현하는 내인성 O-항원 생합성(SL1344 Δrfb)이 없는 유전적으로 변형된 세포, 또는 ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC (SL1344 Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL, Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.) pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC)를 발현하는 통합된 개선된 APP2 rfb 클러스터가 있거나 없는 세포의 하룻밤 배양물은 LB 배지에서 OD600/ml가 0.05가 되도록 희석되었고, 대수 성장상(OD600 ~1)으로 진탕기에서 37℃에서 성장되었다. 또한 APP2 P1875 균주는 천천히 진탕하며(110rpm) BHI + NAD를 37℃에서 정지상으로 성장되었다. SL1344 유도체 및 APP2 세포는 수확되었고, 95℃에서 5분 동안 1x Lammli(1 OD600 세포 당량/100 μl 1x Lammli)에서 쿠킹되었다. 0.1 OD600 세포 당량을 4-12% Bis-Tris 겔에 로딩되었다. 대조군으로서 1x Lammli 중 정제된 2.5㎍ HIS10-APXII(439-801aa) 및 5㎍ APXIII(27-245aa)-HIS9가 겔 상에 로딩되었다. 단백질 및 전체 세포 추출물은 MOPS 완충액에서 크기별로 분리되었다(도 15의 A에서 로딩 방식). 겔은 쿠마시 염색(도 15의 B) 및 웨스턴 블롯팅을 위해 추가로 처리되어 HIS 에피토프를 검출하였다(도 15의 C). 쿠마시 염색을 위해, 겔은 쿠마시 염색 용액(3mM 쿠마시 브라이트 블루 R 250, 40% 에탄올, 10% 아세트산)으로 중첩되었고 실온에서 하룻밤 진탕하여 배양되었다. 겔의 원하는 탈색 및 단백질의 얼룩이 관찰될 때까지 겔은 쿠마시 탈색 용액(30% 에탄올, 10% 아세트산)에 반복적으로 넣어졌다. 면역블롯을 통해 ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6, HIS10-APXII(439-801aa) 및 APXIII(27-245aa)-HIS9를 검출하기 위해, 단백질은 겔로부터 PVDF 막 상으로 형질전환되었다. 막은 실온에서 2시간 동안 진탕하는 차단 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.1% 카세인)에서 배양되었다. 그 다음, 막은 1:2000 희석액(Qiagen #34670)의 테트라-HIS 항체를 포함하는 항체 결합 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.05% 카제인)에서 4℃에서 하룻밤 진탕하면서 배양되었다. 면역블롯은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액(pH 7.5)로 5분 동안 3회 세척되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액의 이차 염소 항 마우스 IgG-HRP 항체(BETHYL Cat# A90-116P)와 함께 항체 결합 용액에서 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 배양되었다. 막은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액(pH 7.5)로 5분 동안 4회 세척되었다. 그 다음, ECL 용액(GE health-care #RPN2105)은 막에 추가되었고 Stella 8300(Raytest)으로 검출된 광 신호를 기록하여 특정 항체 결합이 시각화되었다. SL1344 Δrfb::Kan-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(잠재적 로딩 오류, 도 15의 B, 레인 10) 제외한 쿠마시 염색된 겔 상에 SL1344 및 그들의 유도체를 비교할 때 동일한 양의 세포 등가물이 로딩되었다. APP2 전체 세포 추출물의 쿠마시 분석은 SL1344 세포와도 다른 전체 단백질 염색이 덜한 것으로 나타났다. 정제된 HIS10-APXII(439-801aa)는 약 50kDa에서 희미한 밴드로 나타났으며(도 15의 B, 레인 1), 웨스턴 블롯 분석에서 사용된 HIS 항체에 의해 인식된다(도 15의 C, 레인 1). 또한, APXIII(27-245aa)-HIS9는 약 25kDa에서 검출가능하였다(도 15의 B, 레인 2). HIS 면역블롯에서 이 단백질에 대해 매우 집중적인 신호가 모니터링되었다(도 15의 C, 레인 2). ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6을 발현하는 세포(도 15의 C, 레인 13, 14)는 115kDa 이상의 HIS 면역블롯에서 신호를 도시하였고, 계산된 분자량 약 104 kDa보다 높다. 이는 SDS-PAGE 매개변수로 인해 이 막횡단 단백질에 대한 실행 패턴이 변경되었기 때문일 수 있다. 또한, 융합 구조물의 단백질분해 절단으로 인한 것일 수 있는 115 kDa 미만의 추가 밴드가 검출되었다. 검출된 신호는 융합 구조물이 결여된 다른 모든 시험된 대조군 세포에는 존재하지 않았다.
실시예 3 - 임상 연구
3.1) 재조합 APP2 O-항원 및 비활성화된 APP2 박테리아를 제시하는 비활성화된 백신 균주를 가진 새끼 돼지에서의 면역화 연구
이 첫 번째 면역화 시험의 목표는 APP2 rfb 클러스터를 암호화하는 비활성화된 E. coli_5 및 SL1344가 있는 돼지의 비강/경구 또는 근육내 면역화 후 APP2 LPS의 안전성 및 면역원성을 테스트하는 것이었다(시험 레이아웃은 표 6 참조).
박테리아 전체 세포 백신은 다음과 같이 제조되었다: 그룹 1 및 6은 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy를 함유하고, 여기서 면역화를 위한 균주를 준비하기 전에 wzy 및 gne 발현이 유도될 필요가 있다(아라비노스 유도성 프로모터 조절 하에 두 유전자 모두). 그로 인해 세포는 약 0.6의 OD600이 될 때까지 180rpm에서 진탕하면서 37℃에서 각각의 항생제(표 2 참조) 및 0.01% 아라비노스와 함께 LB에서 배양되었다. 세포는 0.1% 아라비노스로 유도되었다. 6시간의 배양 후, 세포는 수확되었고 PBS 완충액에 재현탁되었다. 이러한 세포 현탁액 중에서 OD600이 결정되었다(1 OD600은 4.1 x 10E8 cfu에 해당됨). 그룹 4 및 8의 세포는 SL1344 Δrfb 및 E. coli_5 Δrfb로 이루어졌으며, 개별 면역화에서 1:1 혼합물로 사용되었다. 이들 세포는 배양물이 OD600이 2 이상에 도달하고 수확할 때까지 LB 배지에서 배양되었다. APP 혈청형 2 세포(그룹 5 및 9)는 느린 진탕(110rpm)으로 37℃에서 정지상에 BHI + NAD로 접종되었고, PBS 완충제에 수확하고 및 재현탁되었다. 세포 현탁액 중 OD600이 결정되었다. 배양 조건으로 인해, OD600에서 cfu로의 전환율은 위의 설명된 것으로부터 변한다(1 OD600은 APP2의 경우 4.1 x 10E5 cfu에 해당됨). 글리코엔지니어링된 SL1344 뿐만 아니라 SL1344 Δrfb, E. coli_5 Δrfb 및 APP2 세포(PBS 완충액 중)는 600rpm으로 진탕하면서 80℃에서 90분 동안 물질을 배양하여 열 비활성화되었다. 물질을 적용하기 전에, 세포가 완전한 비활성화에 대해 테스트되었다.
단백질 기반 물질은 다음과 같이 제조되었다: APP2(439-801aa)로부터의 ApxII의 N-말단 HIS10 태그가 붙은 중화 에피토프는 Ni-NTA 세파로스 결합 및 FPLC를 통한 이미다졸 용리를 통해 E. coli(BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa))으로부터 발현 및 정제되었다. 정제된 단백질은 PBS에서 투석되었다. 단백질 농도가 결정되었다.
비강내 및 경구 면역화를 위한 물질을 제조하기 위해(그룹 1-5) 면역화당 동물당 1ml의 2회 투여량이 제조되었다. 각 투여량은 PBS 중 10E11(그룹 1, 4) 또는 10E8(그룹 5) cfu, 400μg HIS10-ApxII(439-801aa)(그룹 2) 또는 PBS 단독(그룹 3)을 포함하였고, 공급자 정보에 따라 25%의 농도에 도달하도록 Montanide IMS1313(Seppic)과 혼합되었다.
근육내 면역화를 위해 동물당 0.5ml 총 부피가 제조되었다. 각 투여량은 0.375ml의 비활성화된 세포(10E8 cfu가 있는 그룹 6, 8, PBS 중 10E5 cfu가 있는 그룹 9) 또는 400μg HIS10-ApxII(439-801aa)(그룹 7) 및 0.125ml Montanide ISA 25(Seppic)에 도달하는 세포를 함유하여 25% 보조제의 최종 농도에 도달하였다. 혼합물은 공급자 권장 사항에 따라 균질화되었다. 그룹 10은 보조제 대조군(0.125ml Montanide ISA 25와 혼합되고 균질화된 0.375ml PBS 완충액)이었고, 그룹 11은 미처리 대조군으로 유지되었으며 항원을 받지 않았다.
표 6은 비강내 및 경구 또는 근육내 적용을 위해 비활성화된 세포, 단백질, 보조제만 적용되거나 전혀 적용되지 않은 면역화 그룹 1-11의 개요를 제공한다. 항원의 양과 투여량 부피가 제공된다. 비강내 및 경구 백신 접종을 위해, 3번의 적용이 제조되었고 각 콧구멍(콧구멍당 0.5ml) 및 경구(1ml)에 제공되었다.
그룹 박테리아/단백질 면역화됨 보조제 적용 항원 양 투여량 부피
1 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy Montanide IMS 1313 비강내&경구 2x10E11cfu(10E11cfu in 1.0ml) 콧구멍당 0.1ml
경구 1.0ml
2 정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) 2x400㎍(400㎍ in 1.0ml)
3 보조제 대조군
4 SL1344 Δrfb/E.coli_5Δrfb 2x10E11cfu(10E11cfu in 1.0ml)
5 APP 혈청형 2 균주 P18 2x10E8cfu(10E8cfu in 1.0ml)
6 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy Montanide ISA 25 근육내 10E8cfu 0.5ml
7 정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) 400㎍
8 보조제 대조군 10E8cfu
9 SL1344 Δrfb/E.coli_5Δrfb 10E5cfu
10 APP 혈청형 2 균주 P18
11 음성 대조군 n.a. n.a. n.a. n.a.
연구를 위해, 상업적인 돼지 품종(Swiss Landrace x Large White)의 연구일(SD) 0일에 약 4주령의 이유 돼지가 사용되었다. 돼지는 확인된 APP가 없는 사육장에서 왔으며 모든 동물은 SD -7일에서 ELISA에 의해 APP에 대한 항체에 대해 음성이었다. 그룹당 3마리의 동물(무작위화)이 SD 0일 및 SD 14일에서 2회 면역화되었다(도 16).
비강내 투여는 MAD Nasal Intranasal Mucosal Atomization Device(비강 비강내 점액 분무 장치) MAD 100과 3ml 주사기(Teleflex)를 사용하여 수행되었다. 각 동물에 대해 2개의 주사기/MAD 장치가 1ml의 공기 및 0.5ml의 관련 항원/보조제 혼합물로 채워졌다. 각 돼지는 콧구멍당 0.5ml를 받았다.
경구 투여는 3ml 주사기(Teleflex)가 있는 MAD Nasal Intranasal Mucosal Atomization Device MAD 100 OS를 사용하여 수행되었다. 각 동물에 대해 하나의 주사기/MAD 장치는 1ml의 공기 및 관련 항원/보조제 혼합물 1ml로 채워졌다. 물질은 편도선에 투여되었다.
근육내 투여를 위해 각 동물은 목의 오른쪽에 근육내 주사에 의해 항원/보조제 혼합물 0.5ml을 받았다.
혈청을 분리하기 위해 매주 혈액이 채취되었고, 임상 징후에 대해 적어도 매일 동물이 검사되었다. 무처리 대조군과 비교하여, 보조제를 함유한 백신뿐만 아니라 보조제의 근육내 주사 후 4시간에서 10시간 사이에 직장 온도가 41.0℃까지 일시적으로 상승하여 보조제에 반응한 체온의 비특이적 상승을 시사하였다.
SD28에서 안락사 후 폐는 제거되었고 BALF(기관지폐포 세척액)이 수집되었다. 각 세트의 폐에 대해, 500ml 부피의 PBS가 기관으로 플러싱되었고, 폐는 5~10초 동안 부드럽게 뒤집혔고, 유체가 회수되었다.
LPS에 대한 혈청 및 BALF의 IgG 및 IgA 반응이 ELISA로 분석되었다. 혈청 분석용 APP2 및 7 및 BALF 분석용 APP1, 2, 5a 및 7의 페놀/클로로포름 추출된 LPS(iNtRON Biotechnology #17141 사용 설명서에 따라, 반응당 10 OD600 박테리아 처리)가 MaxiSorb 96 웰 플레이트에서 코팅되었다(100 μl 코팅 완충액(PBS 완충액 pH 7.5) 중에 0.05 OD600 당량/웰). 플레이트는 진탕기 상에서 4℃에서 하룻밤 배양되었다. 플레이트는 웰당 200μl 세척 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.05% 카제인)으로 한 번 세척되었고, 웰당 150μl 차단 완충액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.1% 카세인)이 첨가되었다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 배양되었다. 차단 완충액이 제거되었고, SD 0일(사전면역)일 및 28일(2차 면역화 후 2주/안락사 날짜)의 돼지 혈청이 1:500 희석액(세척 용액 중)에 첨가되었다. SD 28일의 BALF는 1:2 희석액(세척 용액 중)에 첨가되었다. 실온에서 진탕하면서 1시간의 배양 기간 후, 플레이트는 웰당 200㎕ 세척 용액으로 3회 세척되었고, 혈청에 대해 이차 돼지 항-IgG-HRP(BETHYL Cat#A100-105P) 또는 BALF에 대해 돼지 항-IgA-HRP(BETHYL Cat# A100-102P) 항체가 세척 용액에 1:1000 희석액으로 첨가되었다(웰당 총 100㎕). 실온에서 진탕기에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 웰당 200㎕ 세척 용액으로 4회 세척되었다. 플레이트의 현상은 웰당 현상 용액 110μl를 추가함으로써 수행되었다(플레이트당 1.5mg 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 디하이드로클로라이드는 1.5ml 100% DMSO에 용해된 다음, 13.5ml 0.05M 포스페이트-시트레이트 완충액이 첨가되었다; 신선한 30% H2O2 2μl이 사용 전에 추가되었다). 적절한 발색이 관찰된 후 110μl 정지 시약 BioFX를 첨가함으로써 반응이 정지되었다. 흡광도는 Tecan Infinite M Nano 리더를 이용하여 450 nm에서 측정되었다.
ApxII에 대한 면역 반응을 분석하기 위해, BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)에서 발현되는 ApxII의 정제된 N-말단 HIS10 태그 중화 에피토프 뿐만 아니라 E. coli에서 정제된, 정제된 AcrA-HIS6 단백질(HIS6 태그가 사용된 C. jejuni 음성대조군으로)이 사용되었다. 500ng의 각 단백질은 96-웰 플레이트(TPP, 92096)에서 웰당(100㎕ 코팅 완충액에서) 코팅되었고, 돼지 혈청 및 BALF에 대해 조사하였다. 절차는 위에서 설명한 대로 수행되었다. 특정 ApxII 항체 생성을 검출하기 위한 ELISA를 위해 그룹 2 및 7의 모든 동물, 그룹 3 및 10의 2마리 동물 및 그룹 11의 동물 1마리가 테스트되었다.
혈청 IgG 분석(도 17)은 열 비활성화된 APP2로 면역화된 동물(점막 및 근육내 면역화된 동물, 그룹 5 및 9) 및 글리코엔지니어링된 SL1344(SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy, 점막 및 근육내 면역 동물, 그룹 1 및 6)로 면역화된 돼지 둘 모두에서 SD 28일에 특이적 항-APP2 LPS 반응을 나타냈다. SD 0일에 면역화하기 전에 IgG 반응은 검출되지 않았다. SL1344 Δrfb 및 E. coli_5 Δrfb(그룹 4, 8), 보조제(그룹 3, 10) 또는 음성 대조군(그룹 11)을 받은 동물의 혈청 내 IgG 수준은 수행된 ELISA의 배경 수준에 있었다.
APP2 LPS에 대한 IgA 반응 분석을 위해, BALF가 1:2로 희석에서 사용되었다. SL1344 Δrfb 및 E. coli_5 Δrfb, 보조제로 면역화된 대조군 및 비면역군은 높은 배경 수준을 도시하였다(도 18). 또한 모든 동물에서 APP1, APP5 및 APP7 LPS에 대한 교차 반응성이 검출되었다. 비활성화된 APP2로 면역화된 모든 동물에서, 점막 및 근육내 경로 모두에서, APP2에 대한 반응은 APP1, 5 및 7에 대한 반응을 분명히 초과했으며, 이는 APP2 LPS에 대한 특이적 IgA 반응을 나타낸다. 그룹 1 및 6(글리코엔지니어링된 SL1344 - SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy의 적용)을 분석할 때, 점막 면역화된 동물이 근육내 면역화된 동물보다 APP2 LPS에 대해 더 높은 IgA 역가를 나타내는 것으로 나타났다. 더욱이, 한 마리의 개별 동물(돼지 5062)은 4개의 테스트된 APP LPS 혈청형 모두에 대해 유사한 수준의 인식을 나타내었다.
정제된 HIS10-ApxII(439-801aa)로 면역화된 동물(도 19)은 근육내 후 SD 28일에서 ApxII에 대한 상승된 혈청 IgG를 발달시켰지만, 점막 면역화 후에는 그렇지 않았다.
ApxII에 대한 특이적 IgA는 정제된 HIS10-ApxII-(439-801aa)로 면역화된 돼지의 BALF에서 검출되지 않았다. 동물 5136은 또한 AcrA-HIS6에 대해 상승된 BALF IgA를 나타내어, ApxII에 대한 것이 아니라 오히려 HIS 항체의 발달을 시사한다(변형된 단백질 AcrA 및 ApxII 둘 다 공통된 HIS 태그만 있고 더 이상의 상동성은 없음). 또한, 대조군(보조제 및 비면역 대조군)의 동물은 HIS10-ApxII(429-801aa) 및 AcrA-HIS6을 비특이적으로 인식하였다.
결론적으로, 비활성화된 항원은 돼지에서 안전하였다. 관찰된 일시적인 체온 증가는 주로 보조제 반응에 기인한 것 같았다. 글리코엔지니어링된 SL1344(SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy)는 면역원성이었고 APP2 LPS에 대한 특이적 혈청 IgG 반응은 6마리의 돼지 모두에서 검출가능했으며, APP2 LPS에 대한 특이적 IgA는 6마리의 돼지 중 4마리에서 발견되었다. 정제된 HIS10-ApxII(439-801aa)로 면역화하면 근육내 면역화된 돼지의 혈청에서 특이적 IgG의 형성이 시작되었다(점막 면역화 후 아님). ApxII에 대한 특이적 IgA는 BALF에서 검출되지 않았다.
3.2) 새끼 돼지에서 개선된 살아있는 재조합 APP 백신 균주를 사용한 면역화 연구
두 번째 면역화 시험에서, 세포 표면에 APP2 O-항원 제시가 개선된 APP2 rfb 클러스터를 암호화하는 살아있는 SL1344의 안전성 및 면역원성이 돼지에서 시험되었다(시험 레이아웃은 표 7 참조). SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat가 있는 그룹 1 및 그룹 2는 미처리된 대조군(항원 적용되지 않음)으로 유지되었다.
본 실험을 위해, 다음과 같이 살아있는 박테리아가 제조되었다. 배양액이 OD600이 2 이상에 도달할 때까지 37℃에서 진탕하는 LB 배지에서 박테리아가 배양되었고 수확되었다. OD600은 cfu/ml를 추정하기 위해 결정되었다(1 OD600은 4.1 x 10E8 cfu와 동등함). 세포는 멸균 PBS로 세척되었고, PBS에 1 x 10E8 cfu/ml의 세포 농도로 재현탁되었다. 세포는 동물에 적용될 때까지 얼음에 보관되었다.
표 7은 살아있는 세포(비강내 및 경구)를 적용한 면역화 그룹 1 또는 미처리된 대조군 2의 개요를 제공한다. 항원의 양과 투여량 부피가 제공된다. 비강내 및 경구 백신 접종을 위해 2회 적용(1ml 2회)이 제조되어 각 콧구멍(각 콧구멍 0.5ml) 및 경구(1ml)에 투여되었다.
그룹 시험 물질 적용 항원 양 투여량 부피
1 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat 비강내 & 경구 2 x 10E8 cfu(10E8 cfu in 10ml) 콧구멍당 0.5ml
경구 1.0ml
2 미처리된 대조군 n.a. n.a. n.a.
n.a. - 적용되지 않음
본 연구를 위해, SD 0일에서 대략 4-5주령의 Duroc 부계 돼지와 함께 Danebreed(landrace 및 large white의 상업적 교배)가 사용되었다. 그룹당 6마리의 동물(무작위화)이 SD 0일 및 SD 14일에 2회 면역화되었다(도 20). 돼지는 확인된 APP가 없는 사육장에서 왔으며 모든 동물은 SD -7일에 ELISA에 의해 APP에 대한 항체에 대해 음성이었다. PBS 중 살아있는 박테리아의 비강내 투여는 3ml 주사기(Teleflex)가 있는 MAD Nasal Intranasal Mucosal Atomization Device MAD 100을 사용하여 수행되었다. 각 동물에 대해 2개의 주사기/MAD 장치가 각각 1ml의 공기와 0.5ml의 관련 살아있는 세포/PBS 혼합물로 채워졌다. 각 돼지는 콧구멍당 0.5ml를 받았다. 경구 투여는 3ml 주사기(Teleflex)가 있는 MAD Nasal Intranasal Mucosal Atomization Device MAD 100 OS를 사용하여 수행되었다. 각 동물에 대해 하나의 주사기/MAD 장치는 1ml의 공기와 1ml의 관련 살아있는 세포/PBS 혼합물로 채워졌다. 물질은 편도선에 투여되었다. 혈청을 분리하기 위해 매주 혈액이 채취되었고 동물은 임상 징후를 검사받았다.
SD 28일에서 안락사 후, 폐가 제거되었고 BALF가 수집되었다. 각 세트의 폐에 대해, 500ml 부피의 PBS가 기관으로 플러싱되었고, 폐는 5-10초 동안 부드럽게 뒤집혔고 유체가 회수되었다(BALF). 면역화에 사용된 박테리아 균주의 지속성은 안락사 후 테스트되었다. 면봉 샘플은 그룹 1과 2의 각 동물의 편도선, 폐(좌우 횡격막 엽) 및 기관지기관 림프절에서 수집되었다. 각 면봉은 카나마이신이 함유된 멸균 LB 한천 플레이트에 무균적으로 도말되었고, 16~24시간동안 37℃에서 배양되었다.
모든 동물은 연구 기간 동안 건강을 유지하였다. 어떤 동물에서도 비정상적인 임상 징후가 관찰되지 않았다. 부검 후 폐 이상은 관찰되지 않았다. 어떤 동물의 폐에도 병변이나 다른 병리가 관찰되지 않았다.
박테리아 콜로니는 그룹 1의 두 동물에서 회수되었다. 한 동물(번호 341609)은 편도선에서 총 366개의 콜로니가 회수되었지만 다른 조직은 없었다. 두 번째 동물(번호 341618)은 편도선과 기관지기관 림프절에서 단일 콜로니가 있었지만 다른 조직은 없었다. 면역되지 않은 대조군의 동물에서는 박테리아를 분리할 수 없었다.
APP2 LPS에 대한 혈청 및 BALF 면역 반응이 면역블롯에 의해 분석되었다. APP2 P1875 균주는 느린 진탕(110 rpm)으로 37℃에서 정지상으로 BHI + NAD에서 성장되었다. 세포는 수확되었고, 추가 처리에 사용되었다. APP2 O-항원 분석을 위해 세포는 1x Lammli 완충액(1 OD600 세포/100 ㎕ 1x Lammli 완충액)에 재현탁되었다. 샘플은 95℃에서 5분 동안 배양되었다. OD600 당량 세포(10mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM CaCl2, 50% 글리세롤 중 스톡 20mg/ml)당 12㎍ 프로테이나제 K가 첨가되었고 샘플은 60℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 후, 프로테이나제 K 처리된 샘플(0.1 OD600 세포 당량)은 4-12% Bis-Tris 겔에 로딩되었고 MES 완충액에서 분자가 크기별로 분리되었다. 겔은 면역블롯팅을 위해 추가로 처리되었다. LPS는 겔에서 PVDF 막으로 옮겨졌다. 막은 실온에서 2시간 동안 진탕하는 차단 용액(PBS pH 7.5/-0.05% Tween/0.1% 카세인)에서 배양되었다. 그 후, 막은 1:500 희석액에서 SD0일 및 28일에서 및 1:2 희석액의 SD28에서 BALF SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat 로 면역화된 그룹 1의 6마리 및 그룹 2(미처리된 대조군)의 2마리의 돼지 혈청을 함유하는 항체 결합 용액(PBS pH 7.5/0.05% Tween/0.05% 카제인)에서 4℃에서 하룻밤 진탕시키면서 배양되었다. 면역블롯은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액(pH 7.5)으로 5분 동안 3회 세척되었다. 그 후, 막은 1:2000 희석액에서 이차 돼지 항-IgG-HRP 항체(BETHYL Cat#A100-105P) 또는 돼지 항-IgA-HRP(BETHYL Cat# A100-102P)와 함께 항체 결합 용액에서 실온에서 1시간 동안 진탕하여 배양되었다. 막은 과량의 PBS 0.05% Tween 완충액 pH 7.5로 5분 동안 4회 세척되었다. 이후 ECL 용액(GE Healthcare #RPN2105)을 막에 첨가하고 Stella 8300(Raytest)으로 검출된 광 신호를 기록하여 특정 항체 결합을 시각화되었다.
그룹 시험 물질 검출된 면역 반응 반응
1 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat 전신 IgG 6마리 중 6마리
점액 IgA 6마리 중 5마리
2 미처리된 대조군 전신 IgG 2마리 중 0
점액 IgA 2마리 중 0
APP2 LPS에 대한 특정 면역 반응을 평가한 결과(표 8), 살아있는 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(그룹 1)로 면역화된 동물 6마리 중 6마리에 대해 SD 28일에 혈청 IgG에 의한 명확한 APP2 LPS 인식이 나타났고, 이는 SD 0일에는 없었다. 그룹 2(미처리 대조군)의 2마리의 시험 동물은 APP2 LPS에 대해 특이적으로 지시된 혈청 IgG의 유의한 증가를 나타내지 않았다.
BALF에서 APP LPS에 대한 IgA를 분석하면 6마리 중 5마리의 동물에서 그룹 1에서 APP2 O-항원의 상승된 특이적인 인식을 보여줬다. 미처리된 대조군 그룹 1의 두 시험 동물 모두는 APP2에 대한 IgA 반응을 나타내지 않았다.
결론적으로, 살아있는 글리코엔지니어링된 SL1344는 안전하고, 콜로니화는 안락사 후 2마리의 돼지에서 확인될 수 있었다. 또한, 재조합 APP2 O-항원은 면역원성이었으며, 전신 IgG 및 점막 IgA 반응이 모두 유도되었다.
3.3) 새끼 돼지에서 APP 혈청형 2에 대한 글리코엔지니어링된 APP 백신 후보의 효능
본 연구의 목적은 그 표면에 APP2 O-항원을 표시하는 개발된 글리코엔지니어링된 SL1344 백신 균주로 면역화된 돼지에서 APP2 감염을 예방하는 효능을 조사하는 것이었다(그룹 개요는 표 9 참조).
백신 균주 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat이 생백신(그룹 1)으로 사용되었고, 두 번째 균주(유도된 wzy 및 gne 발현을 가진 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne)가 비활성화된 백신(그룹 2)으로 사용되었다. 둘 다 ApxII 및 III의 중화 에피토프와 결합하여 적용되었다. 백신은 SD 0일 및 21일에 근육내 적용에 의해 Apx 독소의 에피토프를 중화하는 경구 및 비강내 경로로 투여되었다(도 21). 이들 그룹은 2개의 Apx 중화 에피토프(그룹 3), Apx 중화 에피토프 단독(그룹 4) 또는 백신 접종되지 않은 동물(그룹 5)의 주사와 함께 비활성화된 APP2로 백신 접종된 동물과 비교되었다. 돼지는 SD 42일에 감염성 투여량의 APP 혈청형 2(HK 361, NCTC 10976)로 챌린지되었고, SD 48일에 안락사되었다. 동물은 임상 징후에 대해 규칙적으로 모니터링되었고(챌린지 후 6일 동안 적어도 하루에 두번), 직장 온도 측정은 하루에 한 번 또는 두 번 수행되었다. 체온의 온라인 원격 측정(Body Cap의 AniPill)은 동물의 50%에서 피하 위치된 온도 프로브로 사용되었다.
이 실험을 위해 박테리아와 단백질은 다음과 같이 제조되었다. 생백신접종(그룹 1)을 위한 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat을 제조하기 위해, 세포는 약 24시간 동안 진탕하면서 약 37℃에서 LB 배지에 접종되었다. 백신 접종 당일, 정지기(OD600 >2)로 성장된 박테리아 배양물은 얼음 위에서 약 10분 동안 냉각되었다. 배양물은 4℃에서 4100 x g에서 15분 동안 원심분리되었다. 펠렛화된 세포는 미리 냉각된 멸균 PBS 완충액에 조심스럽게 재현탁되었다. 현탁액은 4℃에서 4100 x g에서 15분 동안 다시 원심분리되었고, 상청액이 제거되었고, 생성된 세포 펠렛은 미리 냉각된 PBS에 재현탁되었다. 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)가 결정되었다(1 OD600은 4.1 x 10E8 cfu에 해당). 돼지에 적용된 각 백신 투여량은 1ml 부피에 1 x 10E8 cfu를 함유하였다.
비활성화 및 백신접종을 위한 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne를 제조하기 위해(그룹 2), 세포는 37℃에서 하룻밤 진탕된 LB 배지에 접종되었다. 다음날, OD600이 측정되었고, 세포는 Amp, Tmp 및 0.01% 아라비노스가 보충된 LB 배지에서 0.075 OD600/ml로 희석되었다. 배양물은 37℃ 진탕에서 배양되었다. 0.6의 OD600에서 아라비노스가 0.1% 최종 농도로 첨가되어, 플라스미드 암호화 단백질(gne 및 wzy)의 발현을 유도하였다. 배양물은 37℃ 진탕에서 추가로 배양되었다. 다시, 6시간 후 아라비노스가 0.1%로 첨가되었다. 배양물은 10-12시간 동안 진탕하면서 37℃에서 추가로 배양되었다. 다음날 OD600이 측정되었고, 배양액은 4℃에서 7,000 x g에서 10분간 원심분리되었다. 상층액이 제거된 다음, 펠렛화된 세포는 PBS로 조심스럽게 재현탁되었다. OD600에서 광학 밀도가 결정되었다(1 OD600은 4.1 x 10E8 cfu에 해당). 열 비활성화를 위해 세포 현탁액이 수욕(bath)에서 80℃에서 90분 동안 배양되었다. 그 후 현탁액은 동결되었고 백신 접종일까지 -80℃에서 보관되었다. 물질을 적용하기 전에, 세포는 완전한 비활성화에 대해 테스트되었다.
단백질 기반 백신은 다음과 같이 제조되었다. ApxII(439-801aa)(그룹 1-4)의 N-말단 HIS10 태그가 지정된 중화 에피토프가 Ni-NTA 세파로스 결합 및 FPLC 상으로 이미다졸 용리를 통해 E. coli(BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa))로부터 발현 및 정제되었다. 정제된 단백질이 PBS에서 투석되었다. 단백질 농도가 결정되었다. ApxIII(27-245aa)(그룹 1-4)의 C-말단 HIS9 태그가 지정된 중화 에피토프는 Ni-NTA 세파로스 결합 및 FPLC 상으로 이미다졸 용리를 통해 E. coli(BL21 pMLBAD-APXIII(27-245aa)-HIS9)로부터 발현 및 정제되었다. 정제된 단백질은 PBS에서 투석되었다. 단백질 농도가 결정되었다.
비강내 및 경구 투여용 생백신(그룹 1)을 제조하기 위해, 동물당 1ml의 2회 투여량이 제조되었다. 적용된 각 백신 투여량은 1ml 부피에 1 x 10E8 cfu를 함유하였다.
비강내 및 경구 백신접종을 위한 비활성화 백신을 제조하기 위해(그룹 2 및 3), 동물당 1ml의 2회 투여량이 제조되었다. 각 투여량은 PBS 중 10E11(그룹 2) 및 10E8(그룹 3) cfu를 함유하고, 공급자 정보에 따라 보조제 Montanide IMS1313(Seppic)과 혼합되어 농도 25%에 도달하였다.
HIS10-APXII(439-801aa) 및 APXIII(27-245aa)-HIS9(그룹 1-3)의 근육내 백신 접종을 위해, 항원 당 및 동물 당 총 부피 0.5ml이 제조되었다. 각 투여량은 0.375ml 400㎍ 단백질 항원 및 0.125ml Montanide ISA 28(Seppic)을 포함하여 25%의 최종 농도에 도달하였다. 혼합물은 공급자 권장 사항에 따라 균질화되었다. 그룹 4는 미처리된 대조군으로 유지되었다(항원이 적용되지 않음).
챌린지 물질은 다음과 같이 제조되었다. 챌린지 감염 2일 전에 APP2 균주 HK361은 HIS+V 배양 플레이트에서 배양되었고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 성장되었다. 다음 날, 하나의 콜로니를 10개의 새로운 HIS+V 배양 플레이트에 옮겨 배양물이 제조되었고 6시간 동안 배양되었다. 그 후, 각 플레이트의 모든 콜로니를 PBS로 채워진 튜브로 옮기고 냉장고에서 하룻밤 보관하였다. cfu 세포/PBS 용액은 HIS+V 배양 플레이트 상에서 세포를 희석하고 플레이팅하여 결정되었다. 다음날 아침 cfu는 측정되었고 용액이 희석되어 10E6 cfu/ml의 챌린지 농도를 얻었다.
그룹 동물 수 시험 물질 보조제 경로 양(부피) 투여일
1 7a 살아있는 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat 없음 경구 & 비강 10E8 cfu (1ml) 경구 & 10E8 cfu (1ml) 비강내 SD 0 & SD 21
정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) MontanideISA 28 근육내 400㎍ HIS10-ApxII(439-801aa)(0.5ml)/400㎍APXIII(27-245aa)-HIS9(0.5ml)
정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9
2 7b 비활성화된 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne Montanide IMS 1313 경구 & 비강 10E11 cfu, 0.583g (1ml) 경구 & 10E11 cfu, 0.583g (1ml) 비강내
정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) MontanideISA 28 근육내 400㎍ HIS10-ApxII(439-801aa)(0.5ml)/400㎍APXIII(27-245aa)-HIS9(0.5ml)
정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9
3 8 정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) MontanideISA 28 근육내 400㎍ HIS10-ApxII(439-801aa)(0.5ml)/400㎍APXIII(27-245aa)-HIS9(0.5ml) SD 0 & SD 21
정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9
4 8 비-백신접종된 대조군
a 그룹 1의 돼지 한 마리는 연구 시작 전에 갑작스러운 심부전으로 인해 조정 단계(-5일) 동안 예기치 않게 사망하였다. b 그룹 2의 돼지 한 마리는 SD 5일에 예기치 않게 사망하였다. 돼지는 사전 질병 징후 없이 죽은 채로 발견되었다. 예방 접종과 관련이 없을 가능성이 크다. 첫 번째 백신 접종 전에 죽은 그룹 1의 돼지에서 비슷한 그림이 발견되었다.
연구를 위해, 상업적인 돼지 품종(TOPIGS-Norsvin, TN70, Z-line)의 약 5주령의 돼지가 사용되었다. 돼지는 확인된 APP가 없는 사육장에서 왔으며, 모든 동물은 SD -7일에 ELISA에 의한 APP에 대한 항체에 대해 음성이었다. 그룹당 7-8마리의 동물(무작위)에게 3주 간격으로 2회 백신을 접종하였다(SD 0일, SD 21일; 도 21). 그룹 1과 2는 연구 시작 전(그룹 1) 또는 SD 5일(그룹 2)에 부검 시 검출 가능한 병변 없이 2마리의 동물이 죽어서 각각 7마리의 동물만을 포함하였다.
비강내 투여는 3ml 주사기(Teleflex)가 있는 MADgic Laryngotracheal Mucosal Atomization Device MAD 600을 사용하여 수행되었다. 각 동물에 대해 2개의 주사기/MAD 장치는 1ml의 공기 및 0.5ml의 관련 항원/보조제 혼합물로 채워졌다. 각 돼지는 콧구멍당 0.5ml를 받았다.
경구 투여는 3ml 주사기(Teleflex)가 있는 Nasal Intranasal Mucosal Atomization Device MAD 100 OS를 사용하여 수행되었다. 각 동물에 대해 하나의 주사기/MAD 장치는 1ml의 공기와 1ml의 관련 항원/보조제 혼합물로 채워졌다. 물질은 편도선에 투여되었다.
근육내 투여를 위해 각 동물은 목에 근육내 주사에 의해 0.5ml의 각 항원/보조제 혼합물을 받았다.
챌린지는 MAD NasalTM Intranasal Mucosal Atomization Device(Teleflex®)에 의해 10E6 cfu/ml의 APP2 균주 HK361로 2ml의 비강내 접종에 의해 42일째에 수행되었다.
혈청을 분리하기 위해 SD -6일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 41일 및 48일에 혈액이 채취되었고(도 21), 동물의 임상 징후가 검사되었다.
SD 48일에 동물은 안락사되었고, 부검이 수행되었다. 폐와 흉막의 병변은 문헌 [Hannan et al. 1982, Res. Vet. Sci., Vol. 33(1), p76-88]에 따라 점수가 부여되었다. 점수는 전형적인 APP 병변에 의해 영향을 받는 각 엽(7개 위치)의 백분율을 기반으로 하였다(표 10). 각 폐의 등쪽과 배쪽 표면이 모두 촉지되었고 육안으로 검사되었지만, 전체 표면적의 평균을 기준으로 각 엽에 대해 단일 값이 도달되었다. Tukey-Kramer의 All Pairs Simultaneous Confidence Interval of Mean Difference 및 P-값이 통계적 평가 방법으로 사용되었다.
병변 점수 설명
0 병변의 영향을 받는 영역 0%
1 병변의 영향을 받는 영역 1-15%
2 병변의 영향을 받는 영역 16-30%
3 병변의 영향을 받는 영역 31-45%
4 병변의 영향을 받는 영역 46-60%
5 과급성 폐(부종, 출혈 및 폐 부피의 큰 부분[>50%] 또는 전체의 경화, 종종 표면에 피브린 침착과 함께)
챌린지 APP2 균주의 존재 여부를 테스트하기 위해, 모든 그룹에서 폐로부터 조직 표본이 박테리아학적 분석을 위해 샘플링되었다. APP2 박테리아의 재-분리를 위해, 폐 조직 샘플은 요리 물에서 7초 동안 출현시킨 후 스토마커(stomacher)에서 파쇄되어 현탁액을 수득하고, 이 중 100 μl는 HIS+V 플레이트에 플레이팅되었고 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 배양되었다. 콜로니는 MALDI-TOF에 의해 확인되었다.
백신 접종 후 비정상적인 국소 또는 전신 반응을 보인 돼지는 없었다. 두 백신 접종 후 0.5일 후에 백신을 접종한 모든 돼지에서 체온이 약간 증가했으며, 이는 백신 접종 후 1일 후에 정상 값으로 돌아갔다.
체온이 챌린지 후 1일 2회 측정되었다. 챌린지 1일 후부터 직장 온도가 상승하였다. 일반적으로, 온도 상승은 백신을 접종하지 않은 대조군에 비해 백신 접종군에서 더 낮았다. 이 차이는 모든 백신 접종 그룹의 평균 온도가 백신 접종되지 않은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 더 낮았을 때 챌린지 후 4일에 가장 두드러졌다(표 11).
표 11. 백신을 접종하지 않은 대조군(그룹 4)과 비교하여 백신 접종 그룹(그룹 1 내지 3)에서 통계적으로 유의한(*) 더 낮은 체온 증가. 그룹 1: 살아있는 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.) rfaL-Ωgne-wzy(cod. opt.)/cat, 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9. 그룹 2: 비활성화된 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne, 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9. 그룹 3: 정제된 HIS10-APXII(439-801aa), 정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9. 그룹 4: 백신을 접종하지 않은 대조군. Dunnett의 다중 비교 테스트.
직장 온도의 평균값차 95.00% 신뢰도
차이의 간격 		조정된 P 값
챌린지 후 4일, 아침 측정
그룹 4 대 그룹 1 0.7071* 0.2709 내지 1.143 0.0003
그룹 4 대 그룹 2 0.7214* 0.2852 내지 1.158 0.0002
그룹 4 대 그룹 3 0.5625* 0.1410 내지 0.9840 0.0042
챌린지 후 4일, 오후 측정
그룹 4 대 그룹 1 0.6661* 0.2298 내지 1.102 0.0008
그룹 4 대 그룹 2 0.7946* 0.3584 내지 1.231 <0.0001
그룹 4 대 그룹 3 0.7000* 0.2785 내지 1.121 0.0002
폐 병변을 평가하여(도 22, 표 12 참조), 개별 동물의 폐 점수는 음성 대조군(그룹 4)의 동물이 Hannan 점수 0 - 7(평균 3.75)에서 폐 손상을 나타내는 것으로 나타났다. Apx 독소만 백신 접종된 동물(그룹 3)은 백신 접종하지 않은 대조군과 비교하여 폐 점수의 유의한 감소를 나타내지 않았지만, 이 그룹의 평균 값은 2.25로 떨어졌다.
비활성화된 APP2 및 Apx 중화 에피토프로 백신 접종된 그룹 1의 동물 7마리 중 6마리는 검출 가능한 폐 병변이 없었고, 한 동물은 점수 2로 폐 병변을 나타냈다. 평균 폐 병변 점수 0.286으로 폐 병변은 유의하게(P = 0.00369) 대조군 동물(그룹 4)보다 덜 발달되었다.
표 12. 음성 대조군 4와 비교한 모든 그룹의 평균값차 및 P-값의 Tukey-Kramer의 모든 쌍 동시 신뢰 구간. 각 그룹의 Hannan 폐 점수의 평균 사이의 평균 쌍별 차이, 뿐만 아니라 다중 비교 P-값(그룹 4 대 그룹 1-3)이 도시됨. Tukey-Kramer 다중 비교 절차를 사용하여 차이가 유의하게 되는 유의 수준이다. P-값 <0.05일 때 그룹 4와 비교된 통계적으로 유의한 폐 점수.
그룹 동물 평균 평균값차 P-값
4 8 3.75
1 7 0.285714 3.464 0.00369
2 7 0.285714 3.464 0.00369
3 8 2.25 1.5 0.42721
챌린지 균주의 재분리에 대한 반정량적 결과(표 13)는 그룹 4의 모든 동물에서 많은 수의 APP2 박테리아가 재분리될 수 있었음을 보여주었다. 기록된 데이터로 통계적 평가를 수행할 수 없었지만 폐 병변 점수가 재분리된 박테리아의 수와 양의 상관관계가 있는 경향이 관찰되었다: 그룹 1에서 검출 가능한 병변이 있는 돼지 한 마리만이 많은 수의 재분리된 챌린지 박테리아를 나타냈다. 그룹 2에서, 2마리 이상의 동물에서 적은 양의 APP2가 눈에 보이는 병변 없이 폐 영역에서 다시 분리될 수 있었다. 그룹 1과 2는 폐 병변 점수에 대해 차이가 없었지만(두 그룹 모두에서 7마리 돼지 중 6마리가 병변이 없었음), 그룹 2에서, 병변이 검출된 1마리와 무병변 돼지 5마리가 낮은 수에서 높은 수까지 챌린지 박테리아의 재분리에서 양성이었다(7마리 동물 중 6마리 APP2 챌린지 균주 양성). 그룹 3의 폐 병변이 있는 4마리 동물의 경우, 폐로부터 병변이 있는 영역으로부터 또는 가시적인 병변이 없는 영역으로부터 다량의 APP2가 분리될 수 있었다.
표 13 폐 병변 점수와 배양 점수의 비교.
그룹 동물 폐 병변 점수 폐로부터 APP2 박테리아의 재분리
총 배양 점수a 폐 병변에서 점수b 병변의 외부 점수c
1 233 2 +++ +++ -
1 234 0 + - + (17 / 4)
1 235 0 + - + (10 / 0)
1 232 0 - - -
1 236 0 - - -
1 237 0 - - -
1 238 0 - - -
2 244 2 +++ +++ + (0 / 13)
2 243 0 +++ - +++ (1000 / 0)
2 246 0 ++ - ++ (250 / 150)
2 239 0 + - + (1 / 0)
2 240 0 + - + (2 / 2)
2 245 0 + - + (2 / 2)
2 241 0 - - - (0 / 0)
3 265 6 +++ +++ + (3 / 0)
3 266 6 +++ +++ + (1 / 0)
3 261 4 +++ - +++ ( 0 / 1000)
3 262 2 +++ ++ +++ ( >1000 / 0)
3 259 0 - - - (0 / 0)
3 260 0 - - - (0 / 0)
3 263 0 - - - (0 / 0)
3 264 0 - - - (0 / 0)
4 268 7 +++ +++ +++ (1000 / 16)
4 269 6 +++ +++ +++ (>1000 / 80)
4 257 5 +++ - +++ (2 / >1000)
4 256 4 +++ +++ + (0 / 1)
4 267 4 +++ +++ + (0 / 2)
4 255 3 +++ +++ + (0 / 12)
4 258 1 +++ +++ + (21 / 0)
4 270 0 ++ - ++ (0 / 250)
a 총 챌린지 균주 재분리 배양 점수는 결정된 가장 높은 점수에서 유도된다(폐 병변 내에 또는 눈에 보이는 병변의 외부).
b 샘플은 눈에 보이는 폐 병변에서 채취되었다.
c 샘플은 눈에 보이는 병변의 외부에 있는 두 개의 정의된 폐 위치에서 채취되었다. 점수는 위를 참조하라. 2개 위치에서 분리된 총 cfu 수는 괄호 안에 표시된다.
점수: -(성장 없음), +(< 50 cfu), ++(50 내지 500 cfu), +++(> 500 cfu).
요약하면, 글리코엔지니어링된 후보 백신은 미처리 동물과 비교하여 백신 접종된 동물에서 매우 효능이 있고 폐 병변을 유의하게 감소시켰다. 실험은 선택적으로 ApxII 및 III의 중화 에피토프와 조합하여 표면에 이종성 APP O-항원을 제시하는 재조합 박테리아 백신이 폐 병변 발달을 거의 완전히 예방할 수 있고 APP 챌린지 박테리아로 폐의 집락화를 강력하게 감소시킬 수 있음을 증명한다.
3.4) 경구 및 비강 경로로 투여된 새끼 돼지에서 APP 혈청형 2에 대한 글리코엔지니어링된 APP 백신 후보의 효능
본 연구의 목적은 근육내로 주사된 ApxII 및 III(그룹 1)의 중화 에피토프와 조합하여 경구 및 비강내로 적용될 때 비활성화된 APP2 백신 균주(wzy 및 gne 발현 유도된 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne)의 효능을 재현하는 것이었다. 또한, 효능은 시판 백신 Porcilis® APP(그룹 2)로 치료한 동물과 비교되었다. 절차는 3.3장에 설명된 실험과 유사하였다. 백신은 SD 0일 및 21일에 투여되었다. 두 그룹 모두 백신을 접종하지 않은 동물(그룹 3)과 비교되었다. 돼지는 SD 42일에 APP 혈청형 2(HK 361, NCTC 10976)의 감염 투여량으로 챌린지되었고, SD 48일에 안락사되었다. 동물은 임상 징후에 대해 정기적으로 모니터링되었고(챌린지 후 6일 동안 매일 적어도 2회), 매일 1회 또는 2회 직장 온도 측정이 수행되었다.
이 실험을 위해, 위의 3.3장에 설명된 바와 같이, 박테리아 및 단백질 뿐만 아니라 챌린지 물질도 제조되었다.
그룹 동물의 수 시험 물질 보조제 경로 양(부피) 투여일
1 8 비활성화된 SL1344 Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne Montanide IMS 1313 경구 & 비강 10E11 cfu (1ml) 경구 & 10E11 cfu (1ml) 비강내 SD 0 & SD 21
정제된 HIS10-ApxII(439-801aa) MontanideISA 28 근육내 400㎍ HIS10-ApxII(439-801aa)(0.5ml)/400㎍APXIII(27-245aa)-HIS9(0.5ml)
정제된 APXIII(27-245aa)-HIS9
2 8 시판중인 APP 백신(Porcilis APP) a-토코페롤 근육내 공급자 매뉴얼에 따라
3 8 비-백신접종된 대조군 경구 & 비강 포스페이트 완충된 염수
연구를 위해 상업적인 돼지 품종(TOPIGS-Norsvin, TN70, Z-라인)의 대략 5주령의 돼지가 사용되었다. 돼지는 확인된 APP가 없는 사육장에서 왔으며, 모든 동물은 연구 1일 이전에 APP에 대한 항체에 대해 음성이었다. 그룹당 8마리의 동물(무작위화)이 3주 간격(SD 0일, SD 21일)으로 2회 백신 접종되었다. 글리코엔지니어링된 백신의 비강내 및 경구 투여 뿐만 아니라 Apx 항원(그룹 1)의 근육내 주사가 위의 3.3장에 설명된 바와 같이 수행되었다. 그룹 2의 동물에게 2ml의 Porcilis® APP가 근육내로 주사되었다.
챌린지는 MAD Nasal® Intranasal Mucosal Atomization Device(Teleflex®)에 의해 10E6 cfu/ml의 APP2 균주 HK361로 2ml의 비강내 접종에 의해 42일째에 수행되었다.
SD -1일, 7일, 14일, 20일, 28일, 35일, 41일 및 48일에 혈청을 분리하기 위해 혈액이 채취되었고 동물은 임상 징후에 대해 검사되었다.
SD 48일에 동물은 안락사되었고, 부검이 수행되었다. 폐와 흉막의 병변은 문헌 [Hannnan et al. 1982, Res. Vet. Sci., Vol. 33(1), p76-88]에 따라 점수 매겨졌다. 점수는 전형적인 APP 병변에 의해 영향을 받는 각 엽(7개 위치)의 백분율을 기반으로 하였다(표 10). 각 폐의 등쪽과 배쪽 표면 모두가 촉지되었고 육안으로 검사되었지만, 전체 표면적의 평균을 기준으로 각 엽에 대해 단일 값에 도달되었다. Dunnett의 다중비교검정과 P-값이 통계적 평가 방법으로 사용되었다.
챌린지 APP2 균주의 존재 여부를 테스트하기 위해, 모든 그룹으로부터 폐로부터 조직 표본이 박테리아학적 분석을 위해 샘플링되었다. APP2 박테리아의 재분리를 위해, 폐 조직 샘플은 요리용 물에서 7초 동안 출현시킨 후 스토마커(stomacher)에서 파쇄되어 현탁액을 수득하고, 이 중 100 μl가 HIS+V 플레이트에 플레이팅되었고 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 배양되었다. 콜로니는 MALDI-TOF에 의해 확인되었다. 박테리아 점수 값은 0 = 분리된 APP2 박테리아 없음, 1 = <20 CFU(콜로니 형성 단위) APP2 박테리아 분리, 2 = <200 CFU APP2 박테리아 분리 및 3 = >200 CFU APP2 박테리아 분리로 번역되었다.
백신 접종 후 비정상적인 국소 또는 전신 반응을 보인 돼지는 없었다. 두 백신 접종 후 0.5일 후에 모든 백신 접종 돼지의 체온이 약간 정도 상승했으며 백신 접종 1일 후에 정상 값으로 돌아갔다.
챌린지 후 매일 2회 체온이 측정되었다. 대조군 3에서 챌린지 후 1일부터 직장 온도의 약간의 증가가 있었다. 일반적으로 온도 상승은 백신 접종하지 않은 대조군에 비해 백신 접종군에서 더 낮았다.
감염으로 인한 증상으로 인해, 인간 종말점 기준에 도달한 동물은 안락사되었고, 임상적으로 평가되었다. 도 23은 3개 그룹 모두의 동물에 대한 생존 확률의 그래프를 도시한다. 챌린지 후 2일째에, 대조군 4의 동물 8마리 중 5마리가 발병률 증가로 인해 안락사되어야 하였다. 4일째에는, 시판 백신군 2의 동물 1마리가 안락사되어야 하였다. 글리코엔지니어링된 백신 그룹 1의 동물 중 어느 것도 임상 증상을 나타내지 않았으며 모든 동물은 챌린지 후 6일째에 연구가 끝날 때까지 생존하였다.
폐 병변을 평가하여(도 24, 표 15 참조), 개별 동물의 폐 점수는 음성 대조군(그룹 3)에서 동물이 Hannan 점수 0 - 8(평균 3.75)에서 폐 손상을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 시판 백신으로 백신 접종된 동물(그룹 2)은 유의미하지는 않았지만 접종하지 않은 대조군과 비교하여 P 값이 0.05를 약간 상회하는 폐 점수에서 감소하는 경향을 보였다.
비활성화된 APP2 및 Apx 중화 에피토프로 백신 접종된 그룹 1의 동물은 검출 가능한 폐 병변이 없었다. 백신접종 그룹 1은 대조군 3과 유의하게 달랐다(P = 0.007).
표 15. 음성 대조군 3과 비교된 모든 그룹의 Dunnett's 다중 비교 및 P-값. 각 그룹의 Hannan 폐 점수의 평균과 다중 비교 P-값(그룹 3 대 그룹 1 및 2)사이의. 쌍별 차이를 도시한다. P-값 <0.05일 때 그룹 3과 비교하여 통계적으로 유의한 폐 점수.
그룹 동물 평균 평균값차 P-값
3 8 3.75
1 8 0 3.75 0.007
2 8 1.125 2.625 0.0527
챌린지 균주의 재분리에 대한 반정량적 결과(도 25)는 그룹 3 중 하나를 제외한 모든 동물에서 많은 수의 APP2 박테리아가 재분리될 수 있음을 보여주었다. 상업용 백신 그룹 2에서 APP2 박테리아는 많은 수의 박테리아가 존재하는 2마리의 동물과 함께 8마리 동물 중 4마리에서 재분리될 수 있었다. 대조적으로, 그룹 1에서 글리코엔지어링된 백신으로 백신 접종한 동물 중 어느 것도 APP2 박테리아 재분리에 대해 양성이 아니었다.
요약하면, 이전 연구의 결과가 확인될 수 있었다. 글리코엔지니어링된 후보 백신은 매우 효능이 있었고, 미처리된 동물과 비교하여 백신 접종된 동물에서 항원 챌린지 6일 후에 APP2 박테리아 재분리가 없었고 폐 병변이 발생하지 않았다. 더욱이, 효능은 시판되는 APP 백신으로 처리된 동물에서 관찰된 것보다 더 높았다.

Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 백신 사용을 위한 그람 음성 박테리아 숙주 세포:
    (a) 이종성 기능성 Actinobacillus pleuropneumoniae(악티노바실러스 플루로뉴모니아, APP) rfb 유전자 클러스터, 여기서 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 박테리아 숙주 세포의 지질 A-코어에 결합되고 박테리아 숙주 외부 표면 상에 위치하는 APP O-항원을 생성하고, 박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터는 기능성이 아닌 것인 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터;
    (b) 선택적으로 내인성 rfb 유전자 클러스터에 대한 내인성 프로모터보다 더 강한 이종성 APP rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 이종성 프로모터;
    (c) 선택적으로 APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자;
    (d) 선택적으로 Apx 독소의 적어도 하나의 중화 에피토프, 선택적으로 박테리아 숙주 외부 세포 표면에 위치하고/하거나 세포로부터 분비되는 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 적어도 하나의 중화 에피토프;
    여기서 선택적으로 (a), (c) 및 (d) 중 적어도 하나는 박테리아 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된 것인 백신 사용을 위한 박테리아 숙주 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    박테리아 숙주 세포는 장내박테리아과(Enterobacteriaceae), 버크홀데리아과(Burkholderiaceae), 슈도모나드과(Pseudomonadaceae), 비브리온과(Vibrionaceae), 선택적으로 부르크홀데리아 타이란덴시스(Burkholderia thailandensis), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 대장균(Escherichia coli), 선택적으로 E.coli_5, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica, 선택적으로 혈청형 Typhimurium, Enteritidis, Heidelberg, Gallinarum, Hadar, Agona, Kentucky 및 Infantis, 및 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium SL1344으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 Salmonella enterica subsp. enterica로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    이종성 rfb 유전자 클러스터는 APP1 내지 18 rfb 유전자 클러스터로부터 선택되고, 선택적으로 APP2 또는 APP8 rfb 유전자 클러스터이고,
    (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하거나 이들로 이루어지고;
    (ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 핵산 서열 동일성을 가지고;
    (iii) 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는
    (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성되는 것인, 박테리아 숙주 세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터가 APP1 내지 18의 O-항원, 선택적으로 APP2 또는 APP8 O-항원을 생산하고, 여기서 APP rfb 유전자 클러스터는 선택적으로 적어도 SEQ ID NO: 2, 50-61, 또는 SEQ ID NO: 5, 62-72 중 어느 하나의 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 하나의 단백질, 또는 이들 서열에 대한 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 아미노산 서열 동일성을 가진 적어도 하나의 단백질을 발현하는 것인 박테리아 숙주 세포.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터가 적어도 부분적으로, 선택적으로 완전히 결실된 것인 박테리아 숙주 세포.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종성 APP rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하는 이종성 프로모터는, 카나마이신 프로모터, proD 프로모터, j23101 프로모터, proC 프로모터, STER_RS05525 프로모터, STER_RS01225 프로모터, STER_RS04515 프로모터, STER_RS05020 프로모터, STER_RS06870 프로모터, STER_RS00780 프로모터, P32 프로모터로 이루어지는 그룹, 선택적으로 카나마이신 프로모터, proD 프로모터, j23101 프로모터, STER_RS04515 프로모터 및 P32 프로모터로 이루어지는 그룹, 선택적으로 카나마이신 프로모터 및 proD로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 프로모터인 박테리아 숙주 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 뉴클레오티드 활성화된 글리칸 생합성을 위한 효소, 운데카프레닐피로포스페이트 글리코실트랜스퍼라제, O-항원 글리코실트랜스퍼라제, O-항원 폴리머라제, O-항원 사슬 길이 결정인자 단백질, 및 N-글리칸 에피머라제 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고, 선택적으로 gne 유전자 및 wzy 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고,
    i. 여기서 gne 유전자는 UDP-갈락토스/UDP-N-아세틸갈라코사민 에피머라제, 선택적으로 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터의 에피머라제를 암호화하고, gne 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 6과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고;
    ii. 여기서 wzy 유전자는 APP, 선택적으로 APP2의 O-항원 폴리머라제를 암호화하고, wzy 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 코돈 최적화된 wzy 유전자를 포함하거나 이로 이루어지거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO:8의 핵산 서열에 혼성화하는 것인 박테리아 숙주 세포.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Apx 독소의, 선택적으로 적어도 Apx 독소 I, II 및 III의 적어도 하나의 중화 에피토프는 박테리아 숙주 외부 세포 표면에 위치되고, 세포용해소 A, 삼량체 자가수송자 부착소, AIDA-I, EaeA, 외막 단백질(OMP), 및 E. coli의 OmpA로 이루어지는 그룹으로부터 선택적으로 선택되는 막 단백질에 결합되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터,
    (b) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자, 및/또는
    (c) Apx 독소의 적어도 하나의 중화 에피토프는
    박테리아 숙주 세포에 대해 코돈 최적화되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  10. 제 9 항에 있어서,
    이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터(a)는 박테리아 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된 것인 박테리아 숙주 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아 숙주는 대장균(Escherichia coli), 선택적으로는 E. coli_5, 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 선택적으로는 Salmonella enteria subsp. enterica, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. 엔테리카 혈청형 Typhimurium SL1344이고, 여기서
    (a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP1 내지 18 rfb 유전자 클러스터로부터 선택되고, 선택적으로 APP2 또는 APP8 rfb 유전자 클러스터이고;
    (b) 이종성 APP rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 이종성 프로모터는 카나마이신 또는 proD 프로모터이고;
    (c) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 wzy 유전자, 선택적으로 코돈 최적화된 wzy 유전자, 및/또는 gne 유전자이고, 두 유전자는 모두 박테리아 숙주 세포의 게놈에 선택적으로 통합되거나 또는 플라스미드에 위치되고;
    (d) Apx 독소 I, II 및 III의 중화 에피토프 중 적어도 하나를 선택적으로 포함하고, 선택적으로 막 단백질에 결합되고, 선택적으로 E. coli의 세포용해소 A에 결합되거나, 또는 숙주 세포로부터 분비되고;
    여기서 (i) APP2 또는 APP8 rfb 유전자 클러스터, (ii) gne 유전자 및/또는 (iii) wzy 유전자, 선택적으로 APP2 rfb 유전자 클러스터 및 wzy 유전자는 박테리아 숙주 세포인 Escherichia coli, 선택적으로 E. coli_5, 또는 Salmonella enterica, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium에 대해 코돈 최적화되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  12. 제 11 항에 있어서,
    박테리아 숙주는 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium 균주 SL1344이고, 여기서
    (a) 코돈 최적화된 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP2 rfb 유전자 클러스터이며, 선택적으로 (i) SEQ ID NO: 3을 포함하거나 이로 이루어지고; (ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98%의 핵산 서열 동일성을 가지고; (iii) 엄격한 조건 하에서서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성되고,
    박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터는 적어도 부분적으로 또는 완전히 결실되고;
    (b) 이종성 APP2 rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 선택적 이종성 프로모터는 카나마이신 프로모터이고;
    (c) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 선택적으로 박테리아 숙주 세포의 게놈 내로 통합된, gne 유전자 및/또는 wzy 유전자이고;
    i. 여기서 gne 유전자, 선택적으로 Campylobacter jejuni의 gne 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 6과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고;
    ii. 여기서 wzy 유전자는, 선택적으로 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8을 포함하거나 이로 구성되거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 핵산 서열에 혼성화하고;
    (d) 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 적어도 Apx 독소 II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 막 단백질에 결합되고, 선택적으로 E. coli의 세포용해소 A에 결합되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  13. 제 11 항에 있어서,
    박테리아 숙주 세포는 E. coli, 선택적으로 E. coli_5이고, 여기서
    (a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP2 rfb 유전자 클러스터이고, 선택적으로 코돈 최적화된 것이고, 선택적으로 (i) SEQ ID NO: 3을 포함하거나 이로 이루어지고;
    (ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 핵산 서열 동일성을 가지고;
    (iii) 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는
    (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성되고,
    박테리아 숙주 세포의 내인성 rfb 유전자 클러스터가 적어도 부분적으로 또는 완전히 결실되고;
    (b) 이종성 APP2 rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 이종성 프로모터는 카나마이신 또는 proD 프로모터, 선택적으로는 카나마이신 프로모터이고;
    (c) APP O-항원 합성을 보조하는 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 선택적으로 박테리아 숙주 세포의 게놈 내로 통합되거나 플라스미드 상에 위치된 gne 유전자이고,
    여기서 gne 유전자, 선택적으로 Campylobacter jejuni의 gne 유전자는, 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 6과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고; 및
    (d) 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 중화 에피토프 중 적어도 하나를 포함하거나, 선택적으로 적어도 Apx 독소 II 및 III의 중화 에피토프 중 적어도 하나를 포함하거나, 선택적으로 막 단백질에 결합되거나, 선택적으로 E. coli의 세포용해소 A에 결합되거나, 숙주 세포로부터 분비되고;
    여기서 APP2 rfb 유전자 클러스터는 E. coli에 대해 선택적으로 코돈 최적화된 것인 박테리아 숙주 세포.
  14. 제 11 항에 있어서,
    박테리아 숙주는 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium, 선택적으로 Salmonella enterica subsp. enterica 혈청형 Typhimurium 균주 SL1344 또는 Escherichia coli, 선택적으로 E. coli_5이고, 여기서
    (a) 이종성 기능성 APP rfb 유전자 클러스터는 APP8 rfb 유전자 클러스터이며, 선택적으로 코돈 최적화된 것이고, 선택적으로 (i) SEQ ID NO: 4를 포함하거나 이로 이루어지고; (ii) 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 핵산 서열 동일성을 가지고; (iii) 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열에 혼성화하고; 및/또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 핵산 서열과 관련하여 변성되고;
    (b) 이종성 APP2 rfb 유전자 클러스터의 전사를 조절하기 위한 선택적 이종성 프로모터는 카나마이신 또는 proD 프로모터, 선택적으로는 카나마이신 프로모터이고;
    (c) APP O-항원 합성의 효소를 기능적으로 발현하기 위한 적어도 하나의 추가 유전자는 wzy 및/또는 gne 유전자이고, 선택적으로 코돈 최적화된 것이고, 선택적으로 두 유전자 모두 박테리아 숙주 세포의 게놈으로 통합되고;
    i. 여기서, gne 유전자, 선택적으로 Campylobacter jejuni의 gne 유전자는 선택적으로 SEQ ID NO: 6을 포함하거나 이로 이루어지거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 6과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 혼성화하고;
    ii. 여기서, wzy 유전자는, 선택적으로 코돈 최적화된 것이고, 선택적으로 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8을 포함하거나 이로 구성되거나, 선택적으로 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 핵산 서열을 가지고, 및/또는 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 핵산 서열에 혼성화하고;
    (d) 선택적으로 Apx 독소 I, II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 Apx 독소 II 및 III의 적어도 2개의 중화 에피토프를 포함하고, 선택적으로 막 단백질에 결합되고, E. coli의 세포용해소 A에 결합되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아 숙주는 살아 있거나 비활성화되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 박테리아 숙주 세포를 포함하는 조성물, 선택적으로 약학적 조성물.
  17. 제 15 항에 있어서,
    APP로부터의 적어도 2개의 상이한 O-항원, 선택적으로 APP1 내지 APP18로부터 선택된 O-항원, 선택적으로 APP1, 2, 5, 7, 8, 10, 12, 14 및 18로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 APP O-항원의 조합을 발현하는 박테리아 숙주 세포를 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물.
  18. Actinobacillus pleuropneumoniae(악티노바실러스 플루로뉴모니아, APP) 감염, 선택적으로 포유동물에서, 선택적으로 돼지(Sus) 또는 가축 돼지(Sus scrofa domesticus)에서, APP2 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 숙주 세포 또는 제 16 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    박테리아 숙주는 비강내, 경구, 구강비강, 설하, 피하, 피내, 경피, 결막 또는 근육내 투여되는 것인 박테리아 숙주 세포.
  20. 생리학적 유효량의 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 숙주 세포 또는 제 16 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 APP 감염의 치료 및/또는 예방, 및/또는 선택적으로 APP 감염의 예방을 필요로 하는 포유동물 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
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