KR20110127714A - Ｃ. 제주니 ｎ-글리칸 또는 이의 유도체를 제시하는 살모넬라 엔테리카 - Google Patents

Ｃ. 제주니 ｎ-글리칸 또는 이의 유도체를 제시하는 살모넬라 엔테리카 Download PDF

Info

Publication number
KR20110127714A
KR20110127714A KR1020117021982A KR20117021982A KR20110127714A KR 20110127714 A KR20110127714 A KR 20110127714A KR 1020117021982 A KR1020117021982 A KR 1020117021982A KR 20117021982 A KR20117021982 A KR 20117021982A KR 20110127714 A KR20110127714 A KR 20110127714A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
salmonella
galnac
jejuni
glycan
salmonella enterica
Prior art date
Application number
KR1020117021982A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101395431B1 (ko
Inventor
카린 일크
마르쿠스 애비
우메시 아후자
사바 암버
플라비오 슈바르츠
Original Assignee
아이제노에시쉐 테크니쉐 호히쉘 쮸리히
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이제노에시쉐 테크니쉐 호히쉘 쮸리히 filed Critical 아이제노에시쉐 테크니쉐 호히쉘 쮸리히
Publication of KR20110127714A publication Critical patent/KR20110127714A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101395431B1 publication Critical patent/KR101395431B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K2039/106—Vibrio; Campylobacter; Not used, see subgroups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체를 포함하고 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 N-글리칸 또는 캄필로박터 제주니의 N-글리칸 유도체를 세포 표면 상에 제시하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리카에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이의 의학 용도 및 약학 조성물, 및 캄필로박터 및 임의로 살모넬라 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 이 살모넬라 균주를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

Ｃ. 제주니 Ｎ-글리칸 또는 이의 유도체를 제시하는 살모넬라 엔테리카{SALMONELLA ENTERICA PRESENTING C. JEJUNI N-GLYCAN OR DERIVATIVES THEREOF}
본 발명은 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체를 포함하고 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 N-글리칸 또는 캄필로박터 제주니의 N-글리칸 유도체를 세포 표면 상에 제시하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의학 용도, 이것으로 제조된 약학 조성물, 식품 및 사료 첨가제, 및 캄필로박터 감염, 특히 C. 제주니, C. 라리(C. lari), C. 콜라이(C. coli), C. 웁살리엔시스(C. upsaliensis) 및 C. 페투스(C. fetus)에 의해 야기되는 캄필로박터 감염, 및 임의로 살모넬라 감염의 치료 및/또는 예방 방법 및 이러한 살모넬라 균주를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
캄필로박터 제주니(C. 제주니)는 선진국에서 인간 급성 위장염의 주요 원인인 식품 매개 병원균이다. 이의 일반적인 숙주는 가축, 특히 닭 및 소이다. C. 제주니에 의한 감염은 또한 여러 장기간 결과와 관련되고, 가장 중증은 자가면역 질환 밀러-피셔 증후군(Miller-Fisher syndrome) 및 갈랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)이다. 이것은 병원균의 표면 상에 포유동물 강글리오사이드 구조의 모사에 대항하여 포유동물 숙주의 항체에 의해 일어나고, 이후 병원균은 또한 숙주 자신의 강글리오사이드를 공격한다. 이러한 분자 모사에 의해 백신으로서 약독화된 또는 사멸된 C. 제주니 세포의 사용이 배제되므로, 이것이 C. 제주니에 대해 이용 가능한 효과적인 백신이 현재 존재하지 않는 이유 중 하나이다.
US 특허 제2007/065461호는 실험실내 운반 단백질에 임의로 결합된 C. 제주니의 하나 이상의 협막성 폴리사카라이드(CPS: capsular polysaccharide)로 이루어지는 백신을 교시한다. 이 접합체를 마우스 및 유인원에 주사하면 이후에 C. 제주니에 대한 비강 공격이 보호된다. 이 백신의 보호는 CPS의 단리 및 정제, 및 운반 단백질에 대한 화학 결합 및 추가의 정제 단계를 요한다.
폴리(Poly) 등(Infection and Immunity, 75: 3425-3433, 2008)은 백신 후보로서 현재 시험되는 강글리오사이드 모의 구조가 결여된 C. 제주니 균주를 기재하고 있다.
일단 글리코실화는 구체적으로 진핵 현상인 것으로 생각되었지만, 고세균 및 진정세균 범위 둘 다에서 보편화되어 있는 것으로 나중에 밝혀졌다. 박테리아 O-결합 및 N-결합이 진핵 당단백질에서 관찰되는 것보다 더 넓은 범위의 당에 의해 형성된다. 원핵생물에서의 단백질의 글리코시드 N-글리코실화가 C. 제주니에서 처음 입증되었다.(Szymanski et al., Molecular Microbiology 32:1022-1030, 1999). C. 제주니의 글리코실화 기계가 규명되었고, 심지어 E. 콜라이로 성공적으로 이동되어, 여기서 단백질의 활성 N-글리코실화가 입증되었다(Wacker et al., Science, 298: 1790-1793, 2002). (단백질 글리코실화에 대해) pgl라 칭하는 C. 제주니의 유전자좌는 여러 단백질의 글리코실화에 관련된다. 이의 돌연변이 침묵은 여러 단백질에서 면역원성을 손실시킨다.
US 특허 출원 제2006/0165728 A1호는 인간 및 가축 병원균으로서 중요한 다양한 균주 및 적어도 몇몇의 캄필로박터 종에 통상적인 특이적이고 고도 면역성인 헵타사카라이드를 확인하였다. 헵타사카라이드는 다음의 화학식 (Ⅰ)을 갖는다:
화학식 (Ⅰ)
GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-Bac
[식 중, Bac(바실로사민이라고도 칭함)은 2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시-D-글루코피라노스이고, GalNAc는 N-아세틸-갈락토사민이고, Glc는 글루코스이다].
이 글리칸 잔기는 여러 당단백질의 성분이다. C. 제주니에서, N-글리칸은 C. 제주니와 숙주 세포의 상호작용에 중요하다. 글리코실화 기계에서의 돌연변이는 마우스에서 장관의 콜로니화를 감소시킨다. 또한, (ⅰ) 상기 헵타사카라이드 또는 이의 접합체 또는 (ⅱ) 상기 헵타사카라이드에 대한 항체 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물은 가축, 구체적으로 가금에서의 백신 접종 용도를 위해 제시되었다.
살모넬라 속은 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae) 패밀리의 구성원이다. 이 속은 조건적 혐기성 및 편모성(이동성)인 그람 음성 바실루스로 이루어진다. 이것은 3개의 주요 항원, "H" 또는 편모 항원, "O" 또는 균체 항원(LPS 부분의 일부) 및 "Vi" 또는 협막 항원(다른 엔테로박테리아세아에서 "K"라 칭함)을 보유한다. 살모넬라는 또한 그람 음성 박테리아의 LPS 내독소 특성을 보유한다. LPS는 지질 A 부분(내독소로도 공지됨), 외부막 내 앵커 LPS 분자와 이의 지방산 사슬의 3개의 도메인으로 이루어진다. 이것은 헵토스 및 KDO(3-데옥시-D-만노-옥투로손산)로 이루어지는 내부 코어를 통해 헥소스 및 N-아세틸헥소스를 함유하는 외부 코어와 연결된다. 외부 코어의 마지막 글루코스에 중합체 O-항원 영역이 연결된다. 이 영역은 4개 내지 6개의 모노사카라이드를 포함하는 16개 내지 100개의 반복의 올리고사카라이드 구조로 이루어진다. 내독소 지질 A 부분은 열을 발생시키고 보체, 키닌 및 응고 인자를 활성화할 수 있다.
오래전부터 살모넬라 균주는 박테리아 면역원을 제조 및 제시하기 위해 중요하였다. 예를 들면, 쉬겔라(Shigella)의 O-항원의 생합성을 위한 효소를 코딩하는 유전자가 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움(typhimurium)의 aroA 백신 접종 균주에 유전적으로 통합되고, 이것은 이후 하이브리드 LPS를 생성시킨다(Falt et al., Microbial Pathogenesis 20: 11-30, 1996). 또한, 살모넬라 디젠테리아(Salmonella dysenteriae)의 O-항원 생합성에 필요한 클러스터가 안정한 발현 벡터로 클로닝되고, 이것은 이후 장티푸스 백신 접종 균주 Ty21a로 이동한다. 얻어진 균주는 하이브리드 LPS를 생성시키고 S. 디젠테리아에 의한 공격에 대해 방어 면역을 유도한다(DE Qui Xu et al., Vaccine 25: 6167-6175, 2007).
US 특허 제6,399,074 B1호는 조류 병원성 그람 음성 미생물에 의한 감염에 대해 조류를 보호하기 위한 약독화 생(live) 살모넬라 백신을 개시한다. 상기 백신은 가금에서 병원성인 E. 콜라이 O78과 같은 조류 병원성 그람 음성 미생물의 O-항원을 발현하는 재조합 살모넬라 균주이다. 재조합 살모넬라 균주는 O-항원 폴리머라제 rfz(새로운 유전자 명명법 wzy)에서 돌연변이로 인해 살모넬라 O-항원을 발현하지 않는다.
상기 선행 기술의 견지에서, 본 발명의 목적은 인간 및 동물, 특히 가축, 더욱 특히 가금에서 캄필로박터 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 효과적이고 안전하며, 용이하게 대량 생산되며, 장기간 작용하며, 저렴한 백신 조성물을 제공하는 것이다.
제1 양태에서, 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체를 포함하고 세포 표면 상에 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 N-글리칸 또는 캄필로박터 제주니의 N-글리칸 유도체를 제시하는 살모넬라 엔테리카를 제공함으로써 이 목적을 해결한다.
본 발명에 유용한 살모넬라 균주는 살아 있는 및/또는 죽은 형태의 인간 및/또는 동물에게 이것이 비병리학적으로 투여되도록 충분히 약독화되거나 약독화될 수 있는 임의의 균주일 수 있다. 바람직한 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움, 엔테리디티스(enteriditis), 하이델베르크(heidelberg), 갈리노룸(gallinorum), 하다(hadar), 아고나(agona), 켄터키(kentucky), 타이피(typhi) 및 인판티스(infantis)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 균주인 살모넬라 엔테리카 균주이다. 게놈 서열이 완전히 규명되었고 많은 동물 연구에 의해 살모넬라 티피뮤리움의 안전한 의학적 용도가 확인되었으므로, 살모넬라 티피뮤리움은 백신 접종 목적에 특히 유용하다.
본원에서 사용되는 "pgl 오페론"이란 용어는 본 발명의 살모넬라 균주에 의해 생산되는 동종 또는 이종 구조를 N-글리코실화할 수 있는 임의의 생리학적으로 활성인 C. 제주니 유전자의 N-글리코실화 클러스터를 의미한다. C. 제주니에서의 pgl 오페론은 C. 제주니 N-글리칸 헵타-사카라이드의 합성, 내부막을 통한 이의 운반 및 단백질로의 운반에 필요한 모든 효소를 코딩한다. PglD, E, F는 바실로사민 생합성에 관련된 효소를 코딩하고, PglC는 포스포릴화 바실로사민을 운데카프레닐포스페이트로 운반하고, PglA, H 및 J는 GalNAc 잔기를 추가한다. 브랜칭 Glc는 PglI에 의해 부착된다. PglK의 작용에 의해 완성된 헵타사카라이드가 운반되고 올리고사카릴트랜스퍼라제 PglB는 N-글리칸을 단백질로 운반한다.
pgl 오페론의 기능성 유도체는 뉴클레오타이드(들) 또는 전체 유전자의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 갖지만, 여전히 본 발명의 살모넬라 균주에 의해 생산되는 동종 또는 이종 구조에 결합할 수 있는 결합성 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드를 생산할 수 있는 임의의 C. 제주니 pgl 오페론으로부터 유도된 유전자의 클러스터이다. 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 유도체는 살모넬라 균주의 염색체에 통합될 수 있거나, 이것은 하나 이상의 플라스미드의 일부로서 도입될 수 있다. 염색체 통합이 플라스미드 벡터와 비교하여 더 안정하므로 바람직하고, 전파 동안 이의 손실이 발생한다. 본 발명의 살모넬라 균주가 하나 이상의 N-글리칸 또는 이의 유도체(들)를 생산하는 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다는 것이 중요하다. 사실, 본 발명의 균주는 하나 이상의 N-글리칸 구조를 생성시키는 하나 이상의 유형의 pgl 오페론을 갖는 것이 바람직하고, 이것은 여러 C. 제주니 균주에 대해 인간 또는 동물에서 더욱 다양한 면역 반응을 유발하는 데 유익할 수 있다.
또한, C. 제주니 N-글리칸의 발현 수준은 pgl 오페론의 업스트림에서 리보솜 단백질 유전자의 프로모터, 예를 들면 spc 또는 rpsm, 및 항생물질 내성 코딩 유전자로부터 얻은 프로모터, 예를 들면 bla 등, 바람직하게는 강한 프로모터(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 상이한 프로모터 사용에 의해 임의로 조절될 수 있다는 것이 중요하다. 플라스미드 코딩된 또는 게놈으로 통합된 pgl 오페론에 대해 이러한 유형의 조절을 이용할 수 있다. 또한, 플라스미드에서 필수 유전자를 포함시키면서 본 발명의 살모넬라 균주의 게놈에서 이 유전자를 결실시킴으로써 플라스미드 안정성을 임의로 증강시킬 수 있다. 바람직한 표적은 예를 들면 CysS와 같은 tRNA-트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 살모넬라 균주는 바실로사민 생합성을 위한 하나 이상의 유전자가 유전자 pgl D, E, F, G의 돌연변이 및/또는 부분 또는 완전 결실에 의해, 바람직하게는 부분 및/또는 완전 결실에 의해 불활화되어 있는 하나 이상의 pgl 오페론을 포함하는 것이다. 가장 바람직한 양태에서, pgl 오페론의 pglE, F 및 G 유전자는 완전 결실되고 pglD 유전자는 부분 결실되고, 예를 들면 pglD 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)은 270개의 염기쌍 다음에 종료한다(전체 길이 ORF는 612개의 염기쌍을 포함한다).
추가의 바람직한 양태에서, pgl 오페론의 pglB 유전자는 불활화되어 있고, 이것은 상응하는 올리고사카릴트랜스퍼라제 B가 발현되지 않거나, 적어도 효소적으로 불활화되어 있다는 것을 의미한다. pglB 유전자 산물은 N-글리칸을 하기 추가로 기재된 특이적 폴리펩티드 억셉터 부위로 운반한다. 트랜스퍼라제의 불활화는 살모넬라에서 O-항원 억셉터 지질 A 코어에 N-글리칸 또는 N-글리칸 유도체가 배타적으로 결합하게 한다.
가장 바람직한 양태에서, pgl 유도체는 바실로사민 생합성을 위한 하나 이상의 유전자인, pgl D, E, F, G, 및 운반이 불활화되어 있고 pglB 유전자가 또한 불활화되어 있는 것이다. 이 양태는 세포 제시를 증가시키는 바실로사민에 대한 GlcNAc의 교환 및 폴리펩티드 억셉터 대신에 지질 A 코어로의 변형 헵타사카라이드의 운반을 발생시킨다.
C. 제주니의 하나 이상의 N-글리칸 또는 C. 제주니의 N-글리칸 유도체는 캄필로박터 제주니의 임의의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체에 의해 생산되는 임의의 N-글리칸일 수 있다. 물론, N-글리칸이 여전히 면역성인 것, 즉 C. 제주니에 특이적인 면역 반응을 발생시키는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, N-글리칸은 상기 기재된 화학식 (Ⅰ)의 헵타사카라이드, 즉 GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-Bac(식 중, Bac(바실로사민이라고도 칭함)은 2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시-D-글루코피라노스임)이다.
바실로사민 생합성에 대한 유전자가 불활화되어 있는, 바람직하게는 대부분 또는 완전 결실된 바람직한 pgl 오페론은 N-글리칸 유도체, 즉 화학식 (Ⅱ)의 헵타사카라이드(GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc)를 합성시킨다.
놀랍게도, 화학식 (Ⅱ)의 N-글리칸 유도체는 본 발명의 살모넬라 균주의 세포 표면 상에 화학식 (Ⅰ)의 N-글리칸보다 많은 양으로 제시되고 또한 면역성이다. 이것은 하기 실시예 섹션에서 실험적으로 확인된다.
바람직한 양태에서, 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 유도체로부터 생기는 N-글리칸(들) 또는 유도체(들)는 결국 세포 표면에 운반되고 이 표면 상에 제시되는 하나 이상의 동종 또는 이종 살모넬라 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 N-글리칸 또는 N-글리칸 유도체는 하나 이상의 공통 세쿠온 N-Z-S/T(문헌[Nita-Lazar M et al., Glycobiology. 2005; 15(4): 361-7] 참조), 바람직하게는 D/E-X-N-Z-S/T(서열 번호 1)(여기서, X 및 Z는 Pro을 제외한 임의의 천연 아미노산일 수 있음)(문헌[Kowarik et al. EMBO J. 2006; 25(9): 1957-66] 참조)를 포함하는 폴리펩티드에 결합된다.
N-글리칸에 결합된 폴리펩티드(유도체)는 임의의 유형의 폴리펩티드, 예컨대 (아미노산으로만 이루어지는) 순수한 폴리펩티드 또는 전사후 변형된 폴리펩티드, 예를 들면 지질 결합 폴리펩티드일 수 있다.
N-글리칸(들)(유도체)의 운반체로서의 이종 폴리펩티드의 경우, 이것이 N 결합 접합체를 세포의 외부막으로 지시하는 신호 서열 MKKILLSVLTTFVAVVLAAC(서열 번호 2)를 포함하는 것이 바람직하고, 여기서 LAAC 모티프(서열 번호 3)를 외부막에서 폴리펩티드를 고정시키는 시스테인의 아실화에 사용한다(또한, 문헌[Kowarik et al., EMBO J. May 3; 25(9): 1957-66, 2006] 참조).
가장 바람직한 양태에서, 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 유도체로부터 생기는 하나 이상의 N-글리칸 또는 이의 유도체는 살모넬라 지질 A 코어 또는 이의 기능적으로 동등한 유도체에 결합된다. 살모넬라의 지질 A 코어는 2개의 글루코사민을 통해 박테리아의 외부막에서 구조를 고정시키는 6개의 지방산 쇄에 결합된 헥소스, N-아세틸헥소스, 헵토스 및 KDO(3-데옥시-D-만노-옥투로손산)로 이루어지는 올리고사카라이드 구조이다. 지질 A 코어의 기능적으로 동등한 유도체는 하나 이상의 글리칸 또는 이의 유도체를 수용하고 이것을 세포 표면 상에 제시할 수 있는 것이다. 살모넬라 구조 지질 A가 폴리펩티드가 아니므로, 이러한 경우에 N-글리칸 또는 이의 유도체가 N-결합되지 않는다는 것이 중요하다. N-글리칸은 바람직하게는 지질 A 코어 또는 이의 기능성 유도체에서 GlcII에 결합된다.
바람직하게는, 하나 이상의 N-글리칸 또는 이의 유도체는 LPS(리포폴리사카라이드) 내 O-항원 측쇄의 자리를 차지한다. 살모넬라의 내부 및 외부 지질 A 코어는 변치않고 있지만, O-항원 생합성은 wbaP의 돌연변이를 통해 무효된다. 이후, N-글리칸은 O-항원 리가제 WaaL에 의해 운반되고 지질 A 외부 코어 올리고사카라이드 구조의 GlcII 잔기에 결합된다.
본 발명의 살모넬라 균주가 살아 있는 및/또는 불활화된 형태의 동물 또는 인간에게 투여될 때 병원성 효과를 발생시키지 않는다는 것이 바람직하고 의학 용도에서 매우 중요하다. 당업자는 돌연변이에 의해 악성 살모넬라 종을 약독화하는 많은 방법을 알 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 살모넬라 균주를 약독화하기 위한 바람직한 돌연변이는 pab, pur, aro, aroA, asd, dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxA 및 galU로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이러한 돌연변이 중 하나 이상이 존재할 수 있다. 돌연변이 aroA, cya 및/또는 crp가 더 바람직하다.
살모넬라의 O-항원 생합성 유전자는 살모넬라 염색체의 고도 가변 DNA 영역인 rfb 유전자좌에서 클러스터된다. 부분 또는 완전 불활화는 살모넬라 균주의 약독화와 관련된다. 한편, O-항원은 또한 숙주에서 면역력을 유발하기 위한 중요한 항원 결정기이다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 살모넬라 균주는 O-항원의 발현의 부분 또는 완전 불활화에 의해, 바람직하게는 rfb 유전자군(gene cluster), 더 바람직하게는 wbaP 유전자 내 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실에 의해, 가장 바람직하게는 wbaP 유전자의 결실에 의해 약독화된다.
본원에서 사용되는 "rfb 유전자좌" 및 "wbaP 유전자"란 용어는 O-항원 또는 관련 항원을 발현할 수 있는 임의의 살모넬라 균주에서 임의의 상응하는 유전자좌 및 유전자를 포함하는 것을 의미한다.
wbaP 유전자 산물은 포스포갈락토스를 운데카프레닐포스페이트에 추가하여 O-항원 생합성을 시작하는 포스포갈락토실트랜스퍼라제이다. 이의 불활화/결실은 O-항원 합성을 완전 무효시키고, 이의 당 산물은 지질 운반 운데카프레닐포스페이트 및 리가제 WaaL에 의한 운반에 대해 C. 제주니의 N-글리칸(들)(유도체)과 경쟁한다. 박테리아에서 pgl 유전자좌 유발 단백질 N-글리코실화 및 wzy 의존 O-항원 합성은 동종 과정이다. 살모넬라 O-항원 리가제 WaaL이 기질 특이성을 완화시키고 이것이 C. 제주니 N-글리칸을 살모넬라 지질 A 코어에 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
그러므로, 가장 바람직한 양태에서 본 발명의 살모넬라 균주는 포스포갈락토실트랜스퍼라제 효소를 불활화하는 wbaP 유전자에서 돌연변이된다. 이러한 유형의 O-항원 불활화가 유전적으로 한정되고 살모넬라 균주의 세포 표면 상에 제시되는 C. 제주니 N-글리칸(유도체)의 양을 증가시키는 것을 허용하므로, 이것이 백신 접종 목적을 위해 상기 기재되어 있지 않고 현재 알려진 O-항원 음성 돌연변이체보다 우수하다는 것이 중요하다.
따라서 그리고 독립적인 발명으로서, 본 발명은 또한 그대로의 살모넬라 균주, 및 이종 항원, 바람직하게는 글리코실화된, 더 바람직하게는 N-글리코실화된 항원의 운반체로서의 살모넬라 균주의 백신 용도에 유용한 wbaP 유전자에서 돌연변이된, 바람직하게는 결실된, 따라서 불활화된 살모넬라 균주에 관한 것이다.
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 살모넬라 엔테리카, 바람직하게는,
(a) (ⅰ) 바실로사민 생합성을 위한 하나 이상의 유전자가 불활화되어 있는 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체, 바람직하게는 하나 이상의 pgl 오페론 및
(ⅱ) O-항원 생합성의 완전 불활화를 유도하는 wbaP 유전자 내 돌연변이 및/또는 결실
을 포함하는 것, 및
(b) 세포 표면 상에 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 N-글리칸 또는 캄필로박터 제주니의 N-글리칸 유도체, 바람직하게는 (Ⅰ) GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시-D-글루코피라노스 및/또는 (Ⅱ) GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc를 제시하는 것
을 특징으로 하는 혈청형 티피뮤리움 균주에 관한 것이다.
본 발명의 상기 기재된 살모넬라 균주는 고도로 면역성이고 C. 제주니 감염에 대해 면역 반응을 생산시킨다. 또한, 일단 생산되면 이것은 용이하게 전파되고 대량 생산된다. 추가 이점으로서, 동물 또는 인간에게 이것을 투여하면, C. 제주니 및 살모넬라 감염에 대해 면역력이 제공된다. 숙주에서 연장된 전파 및 지속된 면역 자극 및 면역보강제 없는 완전 면역 반응을 허용하는 사백신 또는 생백신, 생백신으로서 이것을 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 특히 의약, 바람직하게는 백신을 제조하기 위한 본 발명의 생 또는 사 살모넬라 균주의 의학 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 의약은 캄필로박터 제주니 감염 및 임의로 살모넬라 감염, 바람직하게는 가축, 더 바람직하게는 축우 및 가금, 가장 바람직하게는 가금, 예컨대 닭, 칠면조, 거위 및 오리에서의 캄필로박터 제주니 감염 및 임의로 살모넬라 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
본 발명의 제3 양태는 본 발명의 사 또는 생 살모넬라 엔테리카 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물, 식품 또는 사료(첨가제)에 관한 것이다.
예를 들면, 본 발명의 약학 조성물을 하나 이상의 플라스미드 코딩된 또는 염색체 통합된 pgl 오페론 또는 이의 유도체 중 하나 이상을 포함하는 본 발명의 살모넬라 균주의 중간 규모 또는 대규모 성장에 의해 제조할 수 있다. 이러한 살모넬라를 직접 사용하거나 특이적 표적 인간 또는 동물 및 특이적 투여 경로를 수용하도록 제제화할 수 있다. 생 살모넬라를 포함하는 약학 조성물은 명확한 이유로 바람직하다.
대안적으로, 본 발명은 본 발명의 사 또는 생 살모넬라 엔테리카 및 생리학적으로 허용되는 부형제 및/또는 식품 재료를 포함하는 인간 또는 동물, 바람직하게는 가축, 더 바람직하게는 가금을 위한 식품 또는 사료에 관한 것이다. 예를 들면, 이 사료는 가금 무리의 C. 제주니 콜로니화를 크게 감소시키고 결과적으로 C. 제주니에 의한 인간 감염 및 또한 오염된 고기를 통한 살모넬라 감염의 기회를 감소시킨다.
본 발명의 제4 양태는 C. 제주니 감염 및 임의로 살모넬라 감염의 치료 및/또는 예방 방법으로서, 이를 필요로 하는 인간 또는 동물에게 본 발명의 살모넬라 엔테리카, 약학 조성물, 식품 또는 사료를 생리학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
치료학적 및/또는 예방학적 용도를 위해, 본 발명의 약학 조성물을 임의의 종래 방식으로 임의의 종래 제형으로 투여할 수 있다. 투여 경로로는 정맥내, 근육내, 피하, 비강내, 활액막내, 점적, 설하, 경피, 경구(예를 들면, 위관 영양), 국소 또는 흡입에 의한 것을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 투여 방식은 경구, 정맥내 및 비강내이고, 경구 및 비강내가 가장 바람직하다.
본 발명의 살모넬라를 단독으로 또는, 다른 활성 성분을 포함하여, 박테리아의 안정성 및/또는 면역원성을 증강시키고, 이것을 포함하는 약학 조성물의 투여를 수월하게 하고, 용해 또는 분산을 증가시키고, 증식 활성을 증가시키고, 부가 치료 등을 제공하는 면역보강제와 조합하여 투여할 수 있다.
본원에 기재된 살모넬라의 약학 제형은 당업자에게 공지된 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 면역보강제를 포함한다. 이러한 담체 및 면역보강제로는 예를 들면 이온 교환체, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 셀룰로스계 물질, 젤라틴, 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일, 식염수, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 및 글리콜 화합물, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 항산화제, 락테이트 등을 들 수 있다. 바람직한 제형으로는 정제, 캡슐, 용액제, 현탁제, 에멀션, 용시제조용 산제 및 경피 패치를 들 수 있다. 제형을 제조하기 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[H.C. Ansel and N.G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990)] 및 특히 문헌[Pastoret et al., Veterinary Vaccinology, Elsevier March 1999]을 참조한다. 용량 수준 및 요건은 당해 분야에 널리 알려져 있고 이용 가능한 방법 및 특정 환자에 적합한 기술로부터 당업자가 선택할 수 있다. 당업자라면 특정 인자에 따라 더 적은 또는 더 많은 용량이 필요할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 구체적인 용량 및 치료 섭생은 예컨대 환자(인간 또는 동물)의 일반적인 건강 프로파일, 환자의 질환의 중증도 및 과정 또는 이에 대한 소인, 및 주치의 또는 수의사의 판단과 같은 인자에 따라 달라진다.
경구 백신 접종을 대한 바람직한 양태에서, 섭생은 병아리당 약 106 cfu(콜로니 형성 단위)에 의한 병아리의 부화 1일 또는 2일 후 플라스미드 상에 또는 염색체에 통합된 pgl 오페론 또는 이의 유도체를 포함하는 살모넬라의 투여와 함께 동량의 박테리아에 의한 부화 14일 또는 21일 후 추가 접종(boost)으로 이루어진다. 이러한 2회의 투여는 면역계가 C. 제주니 N-글리칸 또는 이의 유도체 및 또한 살모넬라 단백질에 대한 반응을 구축하기에 충분한 자극을 제공하여 후의 닭의 콜로니화에 보호를 제공한다. 닭의 백신 접종에 대한 대안은 부화 1일 또는 2일 후 불활화된, 예를 들면 열 불활화된 또는 포르말린 불활화된 박테리아의 정맥내 주사 및 14일 또는 21일에 추가 접종에 의한다. 추가의 선택으로서, 닭을 또한 후의 3주 이하의 주령까지 오직 1회, 열 불활화된 또는 포르말린 불활화된 박테리아에 의해 정맥내 백신 접종하거나, 생 박테리아에 의해 위내 백신 접종할 수 있다.
마지막이지만 중요한 것으로, 본 발명은
(ⅰ) 바람직하게는 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 또는 게놈 통합에 의해, 바실로사민 생합성을 위한 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 모든 유전자가 불활화되어 있는, C. 제주니의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체, 바람직하게는 하나 이상의 pgl 오페론을 살모넬라 엔테리카에 도입하는 단계, 및
(ⅱ) 바람직하게는, O-항원 생합성의 완전 불활화를 유도하는 wbaP 유전자 내 돌연변이 및/또는 결실을 도입하는 단계
를 포함하는 본 발명에 따른 살모넬라 엔테리카의 제조 방법에 관한 것이다.
하기에서, 특허청구범위에 의해 제시되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되는 것으로 의도되지 않는 특정한 양태 및 실험을 참고로 하여 본 발명을 추가로 기재하였다.
도면
도 1은 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 상에 C. 제주니 N-글리칸 디스플레이의 도식도이다.
(A) O-항원을 생산하고 pglmut 오페론("mut"는 PglB가 2개의 점 돌연변이에 의해 불활화된다는 것을 의미함)을 특징으로 하는 균주에서 S. 티피뮤리움 지질 A 코어로의 C. 제주니 N-글리칸의 운반을 보여준다.
(B) 임의의 O-항원이 없고 바실로사민 생합성에 대한 유전자가 결실된 pgl3mut 오페론을 특징으로 하는 S. 티피뮤리움 ΔwbaP 균주를 보여준다.
(C) pgl3mut 오페론에서 결실을 보여준다.
도 2는 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 상에 C. 제주니 N-글리칸의 디스플레이를 보여준다.
(A) 표시된 플라스미드를 보유하는 균주의 S. 티피뮤리움 야생형 및 ΔwbaP 프로테이나제 K 처리된 전체 세포 추출물의 SDS-PAGE의 항-C. 제주니 N-글리칸 면역 블롯을 보여주고, S. 티피뮤리움 지질 A 코어 상에 C. 제주니 N-글리칸의 디스플레이를 나타낸다.
(B) S. 티피뮤리움 야생형 및 프로테이나제 K 처리된 ΔwbaP 전체 세포 추출물의 SDS-PAGE의 은 염색된 SDS-PAGE(왼쪽 패널) 및 항살모넬라 B 군 O-항원 면역 블롯(오른족 패널)이다. 이것은 ΔwbaP 균주에서 중합체 O-항원의 결핍을 확인시켜 준다.
(C) 통합된 빈 벡터(대조군) 또는 통합된 pgl3mut 오페론에 의한 S. 티피뮤리움 ΔwbaP 균주의 SDS-PAGE의 항-C. 제주니 N-글리칸 면역 블롯을 보여주고, 통합된 pgl3mut 오페론에 의한 S. 티피뮤리움 ΔwbaP 지질 A 코어 상의 C. 제주니 N-글리칸의 발현을 보여준다.
(D) 왼쪽 패널에서 환원 말단에서 GlcNAc와 C. 제주니 N-글리칸을 디스플레이하는 열 사멸된 S. 티피뮤리움 ΔwbaP에 의해 정맥내 감염되고 pgl3mut에 의해 코딩된 마우스로부터 혈청을 사용한 면역 블롯을 도시한 것이다. C. 제주니 81-176pglB 세포가 아닌 C. 제주니 야생형의 인식이 분명하다. 오른쪽 패널은 마우스 혈청의 면역 블롯 분석에서 사용되는 샘플의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE를 보여준다.
도 3은 S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 약독화를 보여주기 위해 사용되는 실험실내 시험을 도시한 것이다.
(A) 인간 혈청에서 보체에 대한 S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 증가된 감수성을 보여준다: 20% 인간 혈청 또는 20% 열 불활화된 인간 혈청과 함께 표시된 시점 동안 야생형, ΔwbaP 및 ΔwbaP::pKI9(SKI33) 살모넬라의 1:1:1 혼합물을 항온처리함으로써 카나마이신 내성 혈청형 티피뮤리움 야생형 균주, M939, O-항원 음성 ΔwbaP::cat(SKI11) 및 보체를 갖는 돌연변이된 ΔwbaP::pKI9(SKI33)의 보체 매개 사멸을 시험하였다. 분화 배지에 플레이팅하여 생존율을 분석하였다.
(B) 대신에 열 불활화 혈청을 사용한다는 것이 다른 것을 제외한 (A)의 실험 세팅의 결과를 도시한 것이다. 어떠한 균주도 생존율에 영향받지 않았다.
(C) S. 티피뮤리움 야생형 및 비운동성 균주 fliGHI:Tn10과 비교하여 유영 운동성에서의 S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 결함을 시사하는 것이다.
도 4는 S. 티피뮤리움 야생형에 의한 동시 감염 실험에서 S. 티피뮤리움 ΔwbaP에 대한 감소된 콜로니화 능력을 나타낸다.
(A) 야생형과 비교할 때 S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 감소된 콜로니화 능력을 나타내는 배설물에서의 감염 1∼3일 후 및 맹장 내용물에서의 감염 4일 후 결정된 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP(SKI12) 및 야생형의 경쟁 지수(CI; (돌연변이체/야생형) 생산/(돌연변이체/야생형) 유입)를 그래프로 제시한 것이다.
(B) 감염 4일 후 mLN, 비장 및 간에서의 CI.
[실시예]
박테리아 균주 및 성장 조건
실시예에 기재된 실험에 사용된 박테리아 균주의 요약을 표 1에 제공하였다. 박테리아를 루리아-베르타니(LB: Luria-Bertani) 배지(10 g/ℓ 박토 트립톤, 5 g/ℓ 박토 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl)에서 성장시켰다. LB 한천 판에 1.5%(w/v) 한천을 보충하였다. 암피실린(amp) 100 ㎍/㎖, 카나마이신(kan) 50 ㎍/㎖, 클로람페니콜(cam) 25 ㎍/㎖, 스트렙토마이신(strep) 50 ㎍/㎖, 테트라사이클린(tet) 10 ㎍/ml의 최종 농도로 항생제를 사용하였다.
실시예 1: 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 지질 A 코어 상에 C. 제주니 N- 글리칸의 디스플레이
Wzy 의존 O-항원 생합성 및 C. 제주니 N-글리칸 생합성은 동종 과정이고(Feldman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 102(8): 3016-21, 2005), 둘 다 운데카프레닐피로포스페이트 링커에서 올리고사카라이드 구조의 어셈블리로 시작하였다. 2의 경로의 동종성 및 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 O-항원 리가제 WaaL의 완화된 기질 특이성(Falt et al., Microbial Pathogenesis 20: 11-30, 1996; De Qui Xu et al., Vaccine 25: 6167-6175, 2007)을 살모넬라 지질 A 코어 상에 C. 제주니 N-글리칸을 디스플레이하는 경로를 조합하는 가능성에 대해 조사하였다.
C. 제주니 pglmut 오페론을 불활화된 PglB와 포함하는 플라스미드(pACYCpglmut; Wacker et al 2002)를 전기천공에 의해 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 균주에 도입하였다. 음성 대조군으로서 상응하는 빈 벡터 pACYC184를 사용하였다.
SDS-PAGE에 의한 C. 제주니 N-글리칸의 디스플레이 및 항-C. 제주니 N-글리칸 항혈청에 의한 후속적인 면역 블롯에 대해 형질전환체의 당접합체를 시험하였다(Amber 2008). 샘플을 다음과 같이 제조하였다: pACYC184 또는 pACYpglmut 중 어느 하나를 포함하는 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움의 로그 기 성장 배양물의 2 OD600/ml의 당량을 2분 동안 16,000 g에서 스핀 다운하고 상청액을 버렸다. 세포를 100 ㎕ 람밀리(Lammli) 샘플 완충액(0.065 M 트리스-HCl(pH 6.8), 2% SDS(w/v), 5% β-머캅토에탄올(v/v), 10% 글리세린(v/v), 0.05% 브로모페놀 블루(w/v)) 중에 재현탁시키고 95℃에서 5분 동안 용해시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 프로테이나제 K(Gibco/Life Technologies)를 첨가하고(최종 농도 0.4 ㎎/㎖), 60℃에서 1시간 항온처리하고 이후 15% 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 상에 동량을 로딩하였다. C. 제주니 N-글리칸을 검출하기 위해, C. 제주니 N-글리칸에 대해 래빗 다클론 항혈청을 사용하였다(S. Amber, PhD.-thesis, ETH Zurich, Department of Biological Science. Zurich, 2008). 제조업자가 추천한 바대로 염소-항-래빗-IgG-HRP 접합체(Santa Cruz) 및 ECL(Amersham)에 의해 신호 가시화를 수행하였다.
C. 제주니 N-글리칸은 pACYCpglmut가 세포 내 존재할 때에는 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 지질 A 코어 상에 검출할 수 있었지만(도 2A 2 레인), 빈 벡터가 세포로 도입되는 경우에는 검출할 수 없었다(도 2A 1 레인). 이것은 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 WaaL이 C. 제주니 N-글리칸을 운데카프레닐피로포스페이트로부터 지질 A 코어로 운반한다는 것을 보여준다.
실시예 2: 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움에서 wbaP 결실 및 O-항원 음성 균주에서 C. 제주니 N- 글리칸의 디스플레이 증가의 구축
O-항원 생합성의 결실은 지질 운반 운데카프레닐포스페이트에 대한 O-항원 생합성 경로와 C. 제주니 N-글리칸의 생합성 사이의 경쟁을 무효시키는 것으로 예상된다.
S. 티피뮤리움 야생형 SL1344의 wbaP 결실 돌연변이체의 구축을 기재된 바대로 수행하였다(Datsenko and Wanner, PNAS USA 97(12): 6640-5, 2000). FRT(FLP 인지 표적) 부위에 의해 플랭킹된 클로람페니콜 내성 유전자를 보유하는 플라스미드 pKD3으로부터 주형 DNA에 어닐링하는 프라이머 RfbP H1P1(서열에 대해 표 1 참조) 및 RfbP H2P2를 합성하였다. 이러한 프라이머는 또한 wbaP 유전자의 바로 업스트림 및 다운스트림에 영역에 해당하는 40개 내지 45개의 추가의 뉴클레오타이드를 포함하였다. 이것을 사용하여 기재된 바대로 wbaP의 인 프레임 결실(in frame deletion)을 위해 유전자 카세트를 증폭시켰다(Datsenko and Wanner, 상기 참조). S. 티피뮤리움 야생형 균주 SL1344에서 플라스미드 pKD46으로부터 λ 레드 레콤비나제의 아라비노스 유발 발현 후, 이 레콤비나제는 표적 유전자를 전기천공에 의해 도입된 PCR 산물의 클로람페니콜 카세트와 교환하였다. 클로람페니콜 플레이트에서 37℃에서 밤새 플레이팅하여 형질전환체를 선택하고, PCR에 의해 게놈에서의 정확한 위치에서의 cat 유전자의 존재를 확인하였다. 클로람페니콜 내성 생성 클론(wbaP::cat)을 SKI11이라 칭하였다. 플랭킹 FRT 영역을 인지하는 FLP 레콤비나제 코딩 pCP20을 사용함으로써 클로람페니콜 내성 카세트의 제거가 가능하고 PCR에 의한 검증 후 얻어진 균주를 SKI12라 칭하였다(또한, 문헌[Ilg, Endt et al., Inf. Immun., 77, 2568, June 2009] 참조).
SDS-PAGE에 이어 은에 의한 당접합체의 후속 염색에 의해 얻어진 균주의 당접합체의 표현형 분석을 수행하였다. SDS-PAGE의 경우, 샘플을 다음과 같이 제조하였다: S. 티피뮤리움 야생형 또는 S. 티피뮤리움 ΔwbaP(SKI12)의 로그 기 성장 배양물의 2 OD600/ml의 당량을 2분 동안 16,000 g에서 스핀 다운하고 상청액을 버렸다. 세포를 100 ㎕ 람밀리(Lammli) 샘플 완충액(0.065 M 트리스-HCl(pH 6.8), 2% SDS(w/v), 5% β-머캅토에탄올(v/v), 10% 글리세린(v/v), 0.05% 브로모페놀 블루(w/v)) 중에 재현탁시키고 95℃에서 5분 동안 용해시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 프로테이나제 K(Gibco/Life Technologies)를 첨가하고(최종 농도 0.4 ㎎/㎖), 60℃에서 1시간 항온처리하고 이후 12% 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 상에 동량을 로딩하였다. S. 티피뮤리움 O-항원을 검출하기 위해, 살모넬라 O 항혈청 B 군 인자 1, 4, 5, 12(Difco)를 사용하였다. 제조업자가 추천한 바대로 염소-항-래빗-IgG-HRP 접합체(Santa Cruz) 및 ECL(Amersham)에 의해 신호 가시화를 수행하였다. 염색을 위해, Tsai 및 Frasch로부터 얻은 방법(Tsai and Frasch, Anal. Biochem. 119(1): 115-9, 1982)을 이용하였다.
S. 엔테리카 야생형에서 포스포갈락토실-트랜스퍼라제 WbaP를 코딩하는 유전자의 결실은 도 2B에서 볼 수 있는 것처럼 O-항원 생합성을 무효시켰다. SDS-PAGE와 함께 은에 의한 당접합체의 후속 염색 및 SDS-PAGE에 이어 살모넬라 B 군 특이적 항-O-항혈청에 의한 면역 블롯은 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 야생형 균주에 대한 중합체 O-항원의 통상적인 리포폴리사카라이드 사다리 패턴 및 ΔwbaP 균주에서 이 패턴의 부재의 부재를 보여준다.
이 O-항원 음성 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP SKI12를 이의 세포 표면 상에 C. 제주니 N-글리칸을 디스플레이하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 플라스미드 pACYCpglmut 또는 pACYC184를 전기천공에 의해 도입하였다. 형질전환체의 당접합체를 실시예 1에 기재된 바대로 분석하였다. 야생형과 비교하여 ΔwbaP 균주를 포함하는 레인에서 C. 제주니 N-글리칸이 더 높은 강도로 검출될 수 있었다(도 2A 4 레인 대 2 레인). 빈 벡터 pACYC184가 S. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP SKI12 중에 존재할 때 C. 제주니 N-글리칸이 검출될 수 없었다. 이것은 ΔwbaP 균주에서 더 많은 C. 제주니 N-글리칸이 지질 A 코어로 운반될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움에서 C. 제주니 N- 글리칸 디스플레이를 증가시키는 변경된 C. 제주니 pglmut 오페론의 구축
C. 제주니에서, N-글리칸을 헵타사카라이드 GalNAc5(Glc)-Bac(여기서, Bac(환원 말단에서의 당)은 2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시-글루코피라노스임)로서 합성하였다. E. 콜라이 및 S. 티피뮤리움에서, C. 제주니 N-글리칸 생합성 기계가 이종 발현되지 않는 경우 Bac는 합성되지 않는다. C. 제주니 N-글리칸 생합성 기계를 공시 발현하는 E. 콜라이 야생형 세포에서 2종의 상이한 유형의 N-글리칸이 합성되었고, 1종은 환원 말단에서 Bac을 갖고 1종은 GlcNAc을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 당지질 생합성에 관여하는 UDP-GlcNAc(운데카프레닐포스페이트 GlcNAc-1-포스페이트 트랜스퍼라제)인 WecA의 작용에 기여한다(Linton D. et al., Mol. Microbiol.,55(6): 1695-703, 2005). 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 O-항원 리가제 WaaL이 GlcNAc 함유 구조를 지질 A 코어로 운반할 수 있다는 것이 알려지면서, GlcNAc 함유 N-글리칸이 Bac 함유 N-글리칸보다 WaaL에 대해 더 우수한 기질일 수 있다고 예상된다. 바실로사민 생합성을 위한 유전자가 결실된 pglmut 오페론, 즉 pglD, E, F, G를 구축하였다. pglD, E, F, G를 코딩하는 유전자는 완전 결실되었지만, PglD를 코딩하는 유전자는 부분 결실되었다. 변경된 pgl 오페론에서의 pglD 오픈 리딩 프레임(ORF)은 270개의 염기쌍 다음에 종료하였지만, 완전 길이 ORF는 612개의 염기쌍을 포함하였다. 이러한 변경된 pglmut 오페론을 구축하기 위한 절차를 플라스미드 전파에 대한 숙주 균주로서 E. 콜라이 DH5α를 사용하여 다음과 같이 수행하였다: pACYCpglmut DNA를 Alw44I 및 SmaI로 절단하고, 이후 Alw44I 오버행을 DNA 폴리머라제 I Klenow 단편과 함께 넣고 재결찰시켰다. 얻어진 오페론을 pACYCpgl3mut라 칭하고 ΔwbaP 균주로 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환체의 당접합체를 실시예 1에 기재된 바대로 분석하였다. 야생형과 비교할 때 pglmut 오페론을 갖는 ΔwbaP 균주를 포함하는 레인에서보다 pgl3mut 오페론을 갖는 ΔwbaP 균주를 포함하는 레인에서 C. 제주니 N-글리칸을 더 높은 강도로 검출할 수 있었다(도 2A 5 레인 대 4 레인). 대체로, pgl3mut를 갖는 ΔwbaP 균주는 항-C. 제주니 N-글리칸 항혈청에 의해 프로빙될 때 가장 높은 강도를 나타냈고, 따라서 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 지질 A 코어 상에 가장 높은 수준의 C. 제주니 N-글리칸이 디스플레이된다는 것을 보여준다.
실시예 4: O-항원 음성 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 Δ wbaP 균주의 게놈으로의 pgl3mut 오페론의 통합
생체내 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP 균주 지질 A 코어 상에 C. 제주니 N-글리칸의 연속적인 디스플레이를 보장하기 위해, pgl3mut 오페론을 pagC 유전자의 다운스트림에 ΔwbaP 균주 SKI12 게놈에 통합시켰다.
oriR6K를 갖는 자살 플라스미드를 수반하는 모든 클로닝 단계를 E. 콜라이 CC118λpir에서 수행하였다. 최종 통합적 자살 플라스미드 pKI15를 다음의 방식으로 구축하였다: 살모넬라 게놈에서 표적 영역에 동종인 512 bp 서열을 프라이머 3' PagC Fw NotI 및 3' PagC Rev SacII에 의해 PCR로 증폭시켰다(서열 표 1 참조). 얻어진 DNA 단편을 SacII 및 NotI와 pSB377로 삽입하고, 삽입 서열의 검증 후에 플라스미드를 pKI14라 칭하였다. pACYCpgl3mut DNA를 BamHI 및 EheI로 절단하면서 pKI14를 BamHI 및 SmaI로 절단하여 PKI15를 구축하였다. 이후, pACYCpgl3mut로부터 자른 11083 bp 단편을 pKI14 골격과 결찰시켰다. 살모넬라 균주로의 자살 플라스미드의 전기천공은 매우 비효과적이었고, pKI15 또는 pKI14를 우선 전기천공에 의한 접합을 위해 E. 콜라이 Sm10λpir로 도입하였다. 이후, pKI15 또는 pKI14를 포함하는 Sm10λpir를 SKI12와 접합하였다. 접합을 위해, pKI15 및 SKI12를 포함하는 Sm10λpir의 후기 로그 기 배양물의 4 OD600의 당량을 스핀 다운하고 1 ㎖ LB로 3회 세척하였다. 펠렛을 100 ㎕ LB 중에 재현탁하고, 합하고, LB 한천 플레이트에 3 cm의 직경으로 바르고, 이후 그 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 박테리아를 다음날 아침에 1 ㎖ LB로 플레이트를 세척하고 수배 희석액을 접합체 선택을 위한 LB(+strep+tet)에 플레이팅하였다. 얻어진 균주를 SKI34(SKI12::pKI14) 및 SKI35(SKI12::pKI15)라 칭하였다.
음성 대조군으로서 통합된 pgl3mut 클러스터 또는 통합된 빈 벡터 중 어느 하나를 포함하는 O-항원-음성 균주의 지질 A 코어에서 C. 제주니 N-글리칸에 대해 시험하기 위해, SKI34 및 SKI35의 전체 세포 추출물을 제조하고 실시예 1에 기재된 바대로 분석하였다. 도 2C는 SKI35를 포함하는 2 레인에서 강한 신호를 나타내지만 SKI34를 포함하는 1 레인에서는 신호가 없는 항-C. 제주니 N-글리칸 항혈청에 의해 검출된 면역 블롯이다. 이것은 통합된 pgl3mut 오페론으로부터 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 지질 A 코어로 C. 제주니 N-글리칸의 효과적인 운반을 나타낸다.
실시예 5: pgl3 mut 오페론에 의해 코딩된 글리칸의 면역원성
pgl3mut 코딩된 글리칸의 면역원성을 조사하기 위해, 마우스를 열 불활화된 박테리아 SKI12+pMLpgl3mut로 감염시키고 이의 혈청을 항-C. 제주니 N-글리칸 항체에 대해 시험하였다. 실험을 다음과 같이 수행하였다:
마우스 감염 실험
살모넬라 감염을 상기 기재된 바대로 RCHCI(Zurich)에서 개별 통풍 우리에서 수행하였다(Stecher, Hapfelmeier et al., Infection Infect Immun. 2004 Jul; 72(7): 4138-50 2004). 정맥 감염에 대해, 마우스에 pMLBAD(대조군) 또는 pMLpgl3mut를 보유하는 열 불활화 S. 티피뮤리움 SL1344 ΔwbaP(SKI12)의 5×105 CFU로 꼬리 정맥에 주사하였다. 감염 29일 후 혈청 분석 후, 마우스에 36일에 동일한 박테리아 균주로 재주사하고 혈청을 50일에 분석하였다.
마우스 혈청의 분석
C. 제주니 81-176 및 81-176pglB의 전체 세포 추출물에 대한 면역 블롯에 의해 항-C. 제주니 N-글리칸 항체의 생산에 대해 마우스 혈청을 분석하였다(음성 대조군). C. 제주니 81-176pglB는 글리코실화 단백질을 생산하지 않았고 음성 대조군으로서 제공되었다. 1 ㎖ PBS에 의한 포화 박테리아 성장의 플레이트로부터 C. 제주니를 수확하여 전체 세포 추출물을 제조하였다. 샘플을 PBS로 동일한 광학 밀도로 조정한 후, 실온에서 16000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포를 PBS에 의해 이전에 결정된 동일한 최종 부피로 첨가된 람밀리 샘플 완충액(0.065 M 트리스-HCl(pH 6.8), 2% SDS(w/v), 5% β-머캅토에탄올(v/v), 10% 글리세린(v/v), 0.05% 브로모페놀 블루(w/v)) 중에 95℃에서 5분 동안 용해시켜 각각의 샘플 내에 동량의 세포를 얻었다. SDS-PAGE에 의해 동일 부피의 각각의 샘플을 분리한 후 쿠마시 블루에 의해 단백질을 염색하여 이것을 확인하였다. 추가로, C. 제주니 N-글리칸에 대한 면역 반응을 가시화하기 위해 글리코실화 및 비글리코실화 단백질 AcrA를 사용하였다. 마우스 혈청의 분석을 위해, 동일 부피의 전체 세포 추출물 및 동량의 글리코실화 및 비글리코실화 AcrA를 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 단백질을 면역 블롯 검출을 위한 폴리비닐리덴플루오라이드 막으로 운반하였다. 마우스 혈청은 제1 배양 단계에서 1차 항혈청으로서 제공되었다. 결합 IgG를 항-마우스-IgG-HRP 접합체(Bethyl Laboratories)에 의해 확인하였다. 제조업자에 따라 ECL(Amersham)로 검출을 수행하였다.
도 1D는 재감염 61 후 마우스 혈청에서 항-C. 제주니 N-글리칸-IgG의 존재를 보여준다. 항체는 C. 제주니로부터 비글리코실화 AcrA 또는 비글리코실화 단백질 추출물을 인지하지 못하고 따라서 글리칸에 대한 특이성을 보여준다. C. 제주니 N-글리칸-특이적 반응이 대조군 균주로 감염된 마우스의 혈청에 의해 관찰되지 않았다(데이터 도시되지 않음).
실시예 6: S. 티피뮤리움 Δ wbaP 의 약독화된 표현형
S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 약독화를 몇몇 실험실내 및 생체내 접근법에서 시험하였다. 실험실내 접근법은 이의 혈청 저항, 운동성 및 항균제 펩티드 모사 폴리믹신 B에 대한 내성에 대해 돌연변이체 및 야생형을 시험하는 것으로 이루어진다. 생체내 동시 감염 실험에서 ΔwbaP의 콜로니화 능력을 분석하였다.
혈청 저항의 분석
보체의 살균 활성을 실질적으로 기재된 바대로 시험하였다(Bengoechea, Najdenski et al. 2004). 간단히 말하면, 혈청형 티피뮤리움 wbaP::cat(SKI11), M939, 혈청형 티피뮤리움 야생형 SL1344 균주의 카나마이신 내성 유도체(sopE의 다운스트림에 통합된 aph) 및 지수로 성장하는 배양물로부터 취한 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP::pKI9(SKI33)로부터 얻은 세포를 동량(M393에 대해 3×108 cfu/㎖; SKI11 및 SKI33에 대해 4×108 cfu/㎖) 혼합하고 무균 1×PBS 중에 사용하기 전에 5×104 배 희석하였다. 이 희석된 박테리아 배양물을 혈청형 티피뮤리움 LPS에 대한 항체를 포함하지 않는 20% 인간 혈청과 1:1 혼합하고 약간 교반하면서 37℃에서 항온처리하였다. 분액을 혼합 0분, 15분 및 30분 후 취하고 보체 활성을 Brain Heart Infusion Broth를 첨가하여 켄칭하였다. 분액을 야생형 선택을 위한 LB(strep, kan), wbaP::cat 선택을 위한 LB(Sm, Cam) 및 ΔwbaP::pKI9 CFU 결정을 위한 LB(Sm, Tet)에 플레이팅할 때까지 얼음에서 유지시켰다. 보체가 56℃에서 30분 동안 열 불활화된 혈청을 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 데이터를 log CFU±표준 편차의 평균으로서 나타냈다. 도 3A는 야생형과 비교할 때 S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 감소된 혈청 저항을 나타낸다: 20% 인간 혈청에 의한 항온처리 30분 후, ΔwbaP에 대한 계수는 항온처리 기간 초기에서보다 6배 적었다. 도 3B는 음성 대조군으로서 열 불활화 혈청으로 항온처리된 동일한 균주를 나타낸다.
유영 운동성 검정
박테리아의 운동성은 공지된 독성 인자이므로, 박테리아의 운동성을 연한 한천 플레이트(0.3%(w/v) 한천, 5 g/ℓ NaCl, 10 g/ℓ 박토 트립톤)에서 시험하였다. 혈청형 티피뮤리움 야생형(SL1344), 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP(SKI12), 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP::pKI9(SKI33) 또는 혈청형 티피뮤리움 fliGHI::Tn10(M933)의 밤새 배양물 1 ㎕를 플레이트 중앙에 스팟(spot) 표시하고, 운동성을 37℃에서 항온처리 4.75시간 및 9.5시간 후 가시적인 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 정량화하였다. 각 실험을 2의 상이한 경우에서 3회 수행하고 데이터를 평균±표준 편차로서 나타낸다. 도 3C에서 볼 수 있는 것처럼, 운동성은 야생형과 비교할 때 ΔwbaP(SKI12)에서 강하게 감소하였지만 비운동성 대조군 fliGHI::Tn10보다 여전히 높았다.
폴리믹신 B 내성의 분석
혈청형 티피뮤리움 야생형 SL1344 균주 또는 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP(SKI12)로부터 얻은 지수로 성장하는 배양물의 1 OD600/ml의 당량을 스핀 다운하고, 150 ㎕ 차가운 무균 1×PBS 중에 재현탁시키고 사용 전에 5×106 배 희석하였다. 검정을 위해, 희석된 배양물 45 ㎕를 폴리믹신 B(Sigma, 1 ㎕/㎖ 최종 농도) 5 ㎕ 또는 PBS 5 ㎕와 혼합하고 약하게 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 80 ㎕ LB 첨가 후, 박테리아를 스트렙토마이신을 포함하는 LB-한천 플레이트에 플레이팅하였다. 펩티드 처리 배양물의 CFU(콜로니 형성 단위)를 비처리 배양물의 CFU로 나누고 100을 곱하여 생존 효율을 계산하였다. 검정을 2의 독립 실험에서 3회 수행하고 데이터를 평균±표준 편차로서 나타낸다. 야생형과 비교하여 S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 감소된 폴리믹신 B 내성은 도 3D에서 입증되었다.
동시 감염 실험에서 Δ wbaP 의 콜리니화 능력
마우스가 ΔwbaP 돌연변이체 및 야생형 균주로 장내 감염되는 동시 감염 실험에서 S. 티피뮤리움 ΔwbaP의 콜로니화 능력을 시험하였다. C57BL/6 마우스(SPF; RCHCI(Zurich)의 콜로니)를 스트렙토마이신 20 ㎎으로 경구 영양으로 예비 치료하였다. 24시간 후, 마우스에 표시된 혈청형 티피뮤리움 균주 또는 균주 혼합물 5×107 CFU로 접종하였다. 상기 기재된 바대로 MacConkey 한천 플레이트(50 ㎍ 스트렙토마이신)에 플레이팅하여 새로운 배설물 펠렛에서의 박테리아 로드(CFU), 장간막 림프절(mLN), 비장 및 맹장 내용물을 결정하였다(Barthel, Hapfelmeier et al. 2003). 플레이팅 후 식 CI = (돌연변이체/야생형) 생산/(돌연변이체/야생형) 유입에 따라 경쟁 지수(CI)를 결정하였다. 혈청형 티피뮤리움 야생형(M939) 및 ΔwbaP 균주(SKI11)의 동시 감염 실험을 수행하였다. 5마리의 스트렙토마이신 처리 마우스에 ΔwbaP 균주(SKI11) 및 야생형 균주의 장내 1:2 혼합물(전체 5×107 CFU)로 감염시켰다. 2개의 균주의 비율(CI; 경쟁 지수, 물질 및 방법 참조)을 감염 1일, 2일 및 3일 후에 배설물에서 결정하였다. 야생형과 비교한 ΔwbaP 계수의 감소를 검출하고(일당 1 log 규모), ΔwbaP 균주(SKI11)가 장관에서 야생형 혈청형 티피뮤리움 균주와 비교하여 실제로 심각한 경쟁 결함을 갖는다는 것으로 나타났다(p > 0.05; 도 4A). 또한, 감염 4일 후에 전신 부위에서 2개의 균주의 CI(mLN, 간, 비장)는 또한 혈청형 티피뮤리움 ΔwbaP(SKI12)의 상당한 경쟁 결함을 입증하였다. 그럼에도 불구하고, 그 결함은 장에서보다 덜 뚜렷하였다(도 4B).
[표 1] 본 연구에 사용된 wbaP 결실에 대한 균주, 플라스미드 및 프라이머
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Eidgenoessische Technische Hochschule Z?ich <120> Salmonella enterica presenting C. jejuni N-glycan or derivatives thereof <130> 50087PCT <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequon for N-glycosylation <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> may be replaced by Glu <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> may be replaced by Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> may be replaced by Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> may be replaced by Thr <400> 1 Asp Ala Asn Ala Ser 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal sequence for targeting to outer membrane <400> 2 Met Lys Lys Ile Leu Leu Ser Val Leu Thr Thr Phe Val Ala Val Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Cys 20 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LAAC motif of signal sequence <400> 3 Leu Ala Ala Cys 1 <210> 4 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RfbP H1P1 <400> 4 cttaatatgc ctattttatt tacattatgc acggtcagag ggtgaggatt aagtgtaggc 60 tggagctgct tc 72 <210> 5 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RfbP H2P2 <400> 5 gattttacgc aggctaattt atacaattat tattcagtac ttctcggtaa gccatatgaa 60 tatcctcctt agttcctatt cc 82 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3' PagC Fw NotI <400> 6 aagcggccgc gcataagcta tgcggaaggt tc 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3' PagC Rev SacII <400> 7 accgcgggac actgaggtaa taacattata cg 32

Claims (16)

  1. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체를 포함하고 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 N-글리칸 또는 캄필로박터 제주니의 N-글리칸 유도체를 세포 표면 상에 제시하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica).
  2. 제1항에 있어서, 살모넬라 티피뮤리움(typhimurium), 엔테리디티스(enteriditis), 하이델베르크(heidelberg), 갈리노룸(gallinorum), 하다(hadar), 아고나(agona), 켄터키(kentucky) 및 인판티스(infantis)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 균주인 살모넬라 엔테리카.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바실로사민 생합성을 위한 하나 이상의 유전자가 유전자 pgl D, E, F, G의 돌연변이 및/또는 부분 또는 완전 결실에 의해, 바람직하게는 부분 및/또는 완전 결실에 의해 불활화되어 있는 하나 이상의 pgl 오페론을 포함하는 것인 살모넬라 엔테리카.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, pglB 유전자 산물이 돌연변이 및/또는 결실에 의해 불활화되는 하나 이상의 pgl 오페론을 포함하는 것인 살모넬라 엔테리카.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 N-글리칸은 하기 화학식 (Ⅰ)을 갖는 것인 살모넬라 엔테리카:
    화학식 (Ⅰ)
    GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-Bac
    [식 중, Bac(바실로사민이라고도 칭함)은 2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시-D-글루코피라노스임].
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 N-글리칸 유도체는 하기 화학식 (Ⅱ)를 갖는 것인 살모넬라 엔테리카:
    화학식 (Ⅱ)
    GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, N-글리칸(들) 또는 유도체(들)는 세포 표면에 운반되어 그 표면 상에 제시되는 하나 이상의 동종 또는 이종 살모넬라 폴리펩티드에 연결되고, 바람직하게는 하나 이상의 공통 세쿠온 N-Z-S/T, 더 바람직하게는 D/E-X-N-Z-S/T(서열 번호 1)(여기서, X 및 Z는 Pro을 제외한 임의의 천연 아미노산일 수 있음)를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드에 연결되는 것인 살모넬라 엔테리카.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 N-글리칸 또는 이의 유도체가 살모넬라 지질 A 코어 또는 이의 기능적으로 동등한 유도체에 연결되는 것인 살모넬라 엔테리카.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 살모넬라 균주가 바람직하게는 pab, pur, aro, aroA, asd, dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxA 및 galU로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이, 더 바람직하게는 돌연변이 aroA, cya 및 crp에 의해 약독화되는 것인 살모넬라 엔테리카.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 살모넬라 균주가 O-항원의 발현의 부분 또는 완전 불활화에 의해, 바람직하게는 rfb 유전자군(gene cluster), 더 바람직하게는 wbaP 유전자 내 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실에 의해, 가장 바람직하게는 wbaP 유전자의 결실에 의해 약독화되는 것인 살모넬라 엔테리카.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는,
    (a) (ⅰ) 바실로사민 생합성을 위한 하나 이상의 유전자가 불활화되어 있는 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체, 바람직하게는 하나 이상의 pgl 오페론 및
    (ⅱ) O-항원 생합성의 완전 불활화를 유도하는 wbaP 유전자 내 돌연변이 및/또는 결실
    을 포함하는 것, 및
    (b) 세포 표면 상에 캄필로박터 제주니의 하나 이상의 N-글리칸 또는 캄필로박터 제주니의 N-글리칸 유도체, 바람직하게는 (Ⅰ) GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시-D-글루코피라노스 및/또는 (Ⅱ) GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc를 제시하는 것
    을 특징으로 하는 혈청형 티피뮤리움 균주인 살모넬라 엔테리카.
  12. 의약, 바람직하게는 백신을 제조하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 살모넬라 엔테리카, 바람직하게는 생(live) 살모넬라 엔테리카의 용도.
  13. 제12항에 있어서, 캄필로박터 제주니 감염 및 임의로 살모넬라 감염, 바람직하게는 가축, 더 바람직하게는 축우 및 가금, 가장 바람직하게는 가금에서의 캄필로박터 제주니 감염 및 임의로 살모넬라 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 의약, 바람직하게는 백신을 제조하기 위한 용도.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 살모넬라 엔테리카, 바람직하게는 생 살모넬라 엔테리카 및 임의로 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물, 식품 또는 사료, 식품 또는 사료 첨가제.
  15. C. 제주니 감염 및 임의로 살모넬라 감염의 치료 및/또는 예방 방법으로서, 이를 필요로 하는 인간 또는 동물에게 살모넬라 엔테리카, 살모넬라 엔테리카를 포함하는 약학 조성물, 식품 또는 사료를 생리학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 치료 및/또는 예방 방법.
  16. (ⅰ) 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 또는 게놈 통합에 의해, 바실로사민 생합성을 위한 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 모든 유전자가 불활화되어 있는, C. 제주니의 하나 이상의 pgl 오페론 또는 이의 기능성 유도체, 바람직하게는 하나 이상의 pgl 오페론을 살모넬라 엔테리카에 도입하는 단계, 및
    (ⅱ) 바람직하게는, O-항원 생합성의 완전 불활화를 유도하는 wbaP 유전자 내 돌연변이 및/또는 결실을 도입하는 단계
    를 포함하는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 살모넬라 엔테리카의 제조 방법.
KR1020117021982A 2009-03-27 2010-03-25 Ｃ. 제주니 ｎ-글리칸 또는 이의 유도체를 제시하는 살모넬라 엔테리카 KR101395431B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09004445 2009-03-27
EP09004445.4 2009-03-27
PCT/EP2010/001884 WO2010108682A1 (en) 2009-03-27 2010-03-25 Salmonella enterica presenting c. jejuni n-glycan or derivatives thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110127714A true KR20110127714A (ko) 2011-11-25
KR101395431B1 KR101395431B1 (ko) 2014-05-14

Family

ID=42199060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117021982A KR101395431B1 (ko) 2009-03-27 2010-03-25 Ｃ. 제주니 ｎ-글리칸 또는 이의 유도체를 제시하는 살모넬라 엔테리카

Country Status (14)

Country Link
US (2) US9309493B2 (ko)
EP (1) EP2411503B1 (ko)
JP (1) JP5568626B2 (ko)
KR (1) KR101395431B1 (ko)
CN (1) CN102365359B (ko)
BR (1) BRPI1010283B8 (ko)
CA (1) CA2757224C (ko)
ES (1) ES2646320T3 (ko)
IL (1) IL215239A (ko)
MX (1) MX2011009791A (ko)
PL (1) PL2411503T3 (ko)
PT (1) PT2411503T (ko)
RU (1) RU2507253C2 (ko)
WO (1) WO2010108682A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101855380B1 (ko) * 2009-11-19 2018-05-08 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 원핵세포에서 면역원성 폴리사카라이드를 제조하는 생합성 시스템
WO2013034664A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
EP2841559A4 (en) 2012-04-27 2015-12-16 Univ Alberta GLYCOMODIFIED EXTERNAL MEMBRANE VESICLES AND THEIR USE AS VACCINES
RU2671473C2 (ru) * 2013-04-05 2018-10-31 Де Гавенерс Оф Де Юниверсити Оф Альберта Вакцина против кампилобактериоза
CN103740632B (zh) * 2014-01-22 2016-02-10 山东大学 一株重组大肠杆菌及其在制备抗o157:h7的n-糖蛋白疫苗中的应用
CN110520153B (zh) * 2017-01-27 2024-04-02 佛罗里达大学研究基金公司 在禽类中控制肠道沙门氏菌和减少弯曲杆菌的食品安全疫苗
CA3054765A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 London School Of Hygiene And Tropical Medicine Whole cell vaccines
PE20171768A1 (es) * 2017-06-12 2017-12-21 Farm Veterinarios S A C Obtencion de una salmonela enteritidis tipo rugosa y sus modificaciones geneticas para uso como vacuna aviar
US20200377620A1 (en) * 2017-12-19 2020-12-03 The Governors Of The University Of Alberta Clostridium perfringens surface glycans and uses thereof
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6399074B1 (en) * 1998-07-24 2002-06-04 Megan Health, Inc. Live attenuated salmonella vaccines to control avian pathogens
HU227667B1 (en) * 2001-05-03 2011-11-28 Fit Biotech Oyj Plc Novel expression vectors and uses thereof
CA2494223C (en) * 2002-08-01 2012-10-02 National Research Council Of Canada Campylobacter glycans and glycopeptides
RU2237089C2 (ru) * 2002-10-31 2004-09-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий salmonella enteriditis е-23/pgex-2t-tbi как кандидат для конструирования живой вакцины против вируса иммунодефицита человека
AU2004236636B2 (en) * 2003-03-24 2010-02-04 The Scripps Research Institute DNA vaccines against tumor growth and methods of use thereof
RU2248396C2 (ru) * 2003-04-17 2005-03-20 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Рекомбинантная плазмидная днк pcdna-tci, обеспечивающая экспрессию искусственного гена tci в клетках эукариот, и рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий salmonella enteritidis e-23/pcdna-tci как кандидат для конструирования живой днк-вакцины против вируса иммунодефицита человека
EP1655370A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-10 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung Bacterial vector
US8753864B2 (en) * 2005-05-11 2014-06-17 Eth Zurich Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells
WO2007038122A2 (en) 2005-09-21 2007-04-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Immunogenic capsule composition for use as a vaccine component against campylobacter jejuni
DE102008012452A1 (de) * 2008-03-04 2009-09-10 Tridonicatco Gmbh & Co. Kg Schaltung zum Beheizen und Überwachen der Heizwendeln mindestens einer mit einem elektronischen Vorschaltgerät betriebenen Gasentladungslampe auf Wendelbruch

Also Published As

Publication number Publication date
CN102365359B (zh) 2014-10-29
EP2411503A1 (en) 2012-02-01
MX2011009791A (es) 2011-10-17
BRPI1010283B1 (pt) 2021-04-06
CN102365359A (zh) 2012-02-29
JP5568626B2 (ja) 2014-08-06
PT2411503T (pt) 2017-11-15
BRPI1010283B8 (pt) 2021-05-25
CA2757224A1 (en) 2010-09-30
KR101395431B1 (ko) 2014-05-14
ES2646320T3 (es) 2017-12-13
EP2411503B1 (en) 2017-09-13
WO2010108682A1 (en) 2010-09-30
IL215239A (en) 2016-02-29
RU2507253C2 (ru) 2014-02-20
US9309493B2 (en) 2016-04-12
US20160213770A1 (en) 2016-07-28
US9764021B2 (en) 2017-09-19
US20120100177A1 (en) 2012-04-26
CA2757224C (en) 2016-12-06
IL215239A0 (en) 2011-12-29
JP2012521747A (ja) 2012-09-20
PL2411503T3 (pl) 2018-01-31
BRPI1010283A2 (pt) 2016-10-11
RU2011143381A (ru) 2013-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101395431B1 (ko) Ｃ. 제주니 ｎ-글리칸 또는 이의 유도체를 제시하는 살모넬라 엔테리카
JP2640525B2 (ja) 無毒の微生物とその使用
US9040059B2 (en) Recombinant bacterium capable of eliciting a protective immune response against C. perfringens
US8889121B2 (en) Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid
US11766475B2 (en) Food safety vaccine to control Salmonella enterica and reduce Campylobacter in poultry
KR20020018193A (ko) 감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물
Zhao et al. Two novel Salmonella bivalent vaccines confer dual protection against two Salmonella serovars in mice
US20230090746A1 (en) Attenuated salmonella synthesizing antigens for vaccinating against helicobacter pylori
US20220218810A1 (en) New immunogenic compositions
JP2011511630A (ja) Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａのｆｕｒ細胞およびその外膜タンパク質の抽出物によるＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａに対する異種性の防御
US20230111599A1 (en) Vaccines comprising glycoengineered bacteria
KR101774863B1 (ko) 살모넬라증 치료를 위한 변이 균주 ｈｉｄ２０９２와 ｈｉｄ２１１４ 및 이를 포함하는 살모넬라증 약제학적 조성물
WO2015021147A1 (en) Acid-resistant, attenuated microbial vector for improved oral delivery of multiple targeted antigens
Tian et al. Outer membrane vesicles derived from Salmonella Typhimurium can deliver Shigella flexneri 2a O-polysaccharide antigen to prevent lethal pulmonary infection in mice
WO2024040046A2 (en) Compositions, kits, methods, and methods of administration relating to edwardsiella piscicida vaccine and/or antigen delivery vector systems

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170427

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180427

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190425

Year of fee payment: 6