BR112020026676A2 - remodelação microbiana guiada, uma plataforma para a melhoria racional de espécies microbianas para agricultura - Google Patents

Abstract

REMODELAÇÃO MICROBIANA GUIADA, UMA PLATAFORMA PARA A MELHORIA RACIONAL DE ESPÉCIES MICROBIANAS PARA AGRICULTURA. A presente divulgação fornece métodos de remodelação microbiana guiada (GMR) para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas. Os métodos de GMR descritos nesse documento permitem a otimização genética não intergenérica das principais redes regulatórias dentro dos micróbios, que melhoram as funções benéficas às plantas em relação aos micróbios de tipo selvagem, mas não têm os riscos associados às abordagens transgênicas (por exemplo, função do gene imprevisível, questões públicas e reguladoras, etc.). A presente divulgação também fornece micróbios remodelados e composições dos mesmos. A utilização de micróbios remodelados e composições dos mesmos permitirá que os agricultores obtenham rendimentos de colheitas mais produtivos e previsíveis sem a degradação de nutrientes, lixiviação ou escoamento tóxico associado aos fertilizantes tradicionais derivados sinteticamente.

Description

REMODELAÇÃO MICROBIANA GUIADA, UMA PLATAFORMA PARA A MELHORIA RACIONAL DE ESPÉCIES MICROBIANAS PARA AGRICULTURA REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório U.S. Nº 62/690.619, depositado em 27 de junho de 2018, que é incorporado por referência nesse documento em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente com esse documento é incorporado no mesmo por referência em sua totalidade: Uma cópia de formato legível por computador do nome de arquivo da Listagem de Sequência: PIVO_007_01WO_SeqList_ST25.txt, data de criação, 26 de junho de 2019, tamanho do arquivo ≈ 602 kilobytes.

ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO

[003] Em 2050, a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação projeta que a produção total de alimentos deve aumentar em 70% para atender às necessidades de uma população crescente, um desafio que é exacerbado por vários fatores, incluindo: diminuição dos recursos de água doce, aumento da competição por terra arável, aumento dos preços da energia, aumento dos custos dos insumos e a provável necessidade de as safras se adaptarem às pressões de um clima global mais seco, quente e extremo.

[004] As práticas agrícolas atuais não estão bem equipadas para atender a essa demanda crescente de produção de alimentos, ao mesmo tempo em que equilibram os impactos ambientais que resultam do aumento da intensidade agrícola.

[005] Um dos principais insumos agrícolas necessários para satisfazer a demanda global de alimentos é o fertilizante de nitrogênio. No entanto, o padrão industrial atual utilizado para produzir fertilizantes de nitrogênio, é um método de fixação artificial de nitrogênio chamado de processo Haber-Bosch, que converte o nitrogênio atmosférico (N2) em amônia (NH3) por uma reação com hidrogênio (H2) usando um catalisador de metal sob altas temperaturas e pressões. Esse processo consome muitos recursos e é prejudicial ao meio ambiente.

[006] Em contraste com o processo de Haber-Bosch sintético, certos sistemas biológicos evoluíram para fixar o nitrogênio atmosférico. Esses sistemas utilizam uma enzima chamada nitrogenase, que catalisa a reação entre N2 e H2 e resulta na fixação de nitrogênio. Por exemplo, os rizóbios são bactérias diazotróficas que fixam nitrogênio após se estabelecerem no interior dos nódulos das raízes das leguminosas. Um objetivo importante da pesquisa de fixação de nitrogênio é a extensão desse fenótipo para plantas não leguminosas, particularmente para gramíneas agronômicas importantes, tais como, trigo, arroz e milho. No entanto, apesar do progresso significativo feito na compreensão do desenvolvimento da simbiose de fixação de nitrogênio entre rizóbio e leguminosas, o trajeto para usar esse conhecimento para induzir nódulos fixadores de nitrogênio em cultivos de não leguminosas ainda não está claro.

[007] Consequentemente, a grande maioria da agricultura moderna de cultivo em linha utiliza fertilizante de nitrogênio que é produzido via processo Haber-Bosch de uso intensivo de recursos e prejudicial ao meio ambiente. Por exemplo, o USDA indica que o agricultor de milho dos EUA tipicamente aplica entre 130 e 200 lb. de nitrogênio por acre (58,9 a 90,7 kg/ha). Esse nitrogênio não é apenas produzido em um processo sintético de uso intensivo de recursos, mas é aplicado por maquinários pesados que atravessam/impactam o solo do campo, queimando petróleo e exigindo horas de trabalho humano.

[008] Além disso, o fertilizante de nitrogênio produzido pelo processo industrial Haber-Bosch não é bem utilizado pelo cultivo alvo. A chuva, o escoamento, o calor, a volatilização e o microbioma do solo degradam o fertilizante químico aplicado. Isso equivale não apenas a dinheiro desperdiçado, mas também aumenta a poluição, em vez do rendimento da colheita. Para esse fim, as Nações Unidas calculam que quase 80% do fertilizante é perdido antes que um cultivo possa utilizá-lo. Consequentemente, a produção e a dispensação de fertilizantes agrícolas modernos não são apenas prejudiciais ao meio ambiente, mas são extremamente ineficazes.

[009] A fim de atender às crescentes necessidades de abastecimento de alimentos do mundo - ao mesmo tempo em que equilibra a utilização de recursos e fornece impactos mínimos sobre os sistemas ambientais - uma melhor abordagem para a fixação de nitrogênio e a dispensação às plantas é urgentemente necessária.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[0010] São fornecidos nesse documento métodos de remodelação microbiana guiada (GMR) para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas.

[0011] Em um aspecto, o método de GMR compreende: (a) fornecer uma pluralidade de espécies microbianas que estão associadas a uma planta de interesse alvo; (b) ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; (c) selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; (d) introduzir uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata; (e) confirmação da integração da variação genética não intergenérica no locus genômico alvo e da ausência de qualquer sequência transgenética; e (f) repetir as etapas d) e e) uma ou mais vezes, até que a espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada de desempenhar a função de interesse benéfica às plantas.

[0012] Em um aspecto, a etapa b) de ensaio da pluralidade de espécies microbianas compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes.

[0013] Em um aspecto, o método de GMR compreende uma etapa de sequenciamento dos genomas da pluralidade de espécies microbianas obtidas na etapa a) e caracterização de uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que são associados a uma função de interesse benéfica às plantas.

[0014] Em um aspecto, a etapa d) de introdução de uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata compreende: (a) transformar a espécie microbiana candidata com um plasmídeo de transformação compreendendo (i) um marcador de seleção, (ii) um marcador de contrasseleção, (iii) um fragmento de DNA compreendendo: uma variação genética não intergenérica a ser introduzida na espécie microbiana candidata em um locus genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a um função de interesse benéfica às plantas, e braços de homologia com o locus genômico alvo que flanqueia a variação genética não intergenérica e (iv) estrutura principal do plasmídeo; (b) selecionar uma espécie microbiana candidata que sofreu uma recombinação homóloga inicial e tem a variação genética não intergenérica integrada no locus genômico alvo com base na presença do marcador de seleção no genoma; e (c) a seleção de uma espécie microbiana candidata que tem a variação genética não intergenérica integrada no locus genômico alvo, mas sofreu uma recombinação homóloga adicional que desdobra a estrutura principal do plasmídeo, com base na ausência do marcador de contrasseleção.

[0015] Em um aspecto, a etapa e) de confirmar a integração da variação genética não intergenérica no locus genômico alvo e a ausência de qualquer sequência transgenética compreende o sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata transformada e a confirmação da ausência de qualquer sequência transgenética do genoma da espécie microbiana candidata transformada. Em um aspecto, a etapa e) compreende a confirmação da ausência de qualquer sequência transgenética do plasmídeo de transformação.

[0016] Em um aspecto, o método de GMR compreende: (a) fornecer uma pluralidade de espécies microbianas que estão associadas a uma planta de interesse alvo; (b) sequenciar os genomas da pluralidade de espécies microbianas e caracterizar uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas; (c) ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização, genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; (d) selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; (e) transformar a espécie microbiana candidata com um plasmídeo de transformação compreendendo: (i) um marcador de seleção, (ii) um marcador de contrasseleção, (iii) um fragmento de DNA compreendendo: uma variação genética não intergenérica a ser introduzida na espécie microbiana candidata em um locus genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas e braços de homologia com o locus genômico alvo que flanqueia a variação genética não intergenérica; e (iv) estrutura principal do plasmídeo; (f) selecionar uma espécie microbiana candidata que sofreu uma recombinação homóloga inicial e tem a variação genética não intergenérica integrada no locus genômico alvo com base na presença do marcador de seleção no genoma; (g) selecionar uma espécie microbiana candidata que tem a variação genética não intergenérica integrada no locus genômico alvo, mas foi submetida a uma recombinação homóloga adicional que desdobra a estrutura principal do plasmídeo, com base na ausência do marcador de contrasseleção; (h) sequenciar o genoma da espécie microbiana candidata transformada e confirmar a integração da variação genética não intergenérica no locus genômico alvo e ausência de qualquer sequência genética do plasmídeo de transformação; e (i) repetir as etapas e)-h) uma ou mais vezes, até que uma espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada para desempenhar a função de interesse benéfica às plantas.

[0017] Em um aspecto, as funções benéficas às plantas de interesse nos métodos descritos nesse documento podem ser fixação de nitrogênio, solubilização de fosfato, colonização microbiana ou combinações dos mesmos.

[0018] Em um aspecto, a etapa de sequenciamento dos genomas da pluralidade de espécies microbianas e caracterização de uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas (por exemplo, etapa b do método descrito acima) compreende o sequenciamento do genoma completo e/ou a caracterização da via de fixação de nitrogênio.

[0019] Em um aspecto, a caracterização da via de fixação de nitrogênio compreende a caracterização de um conjunto de genes selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica a glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, e combinações dos mesmos.

[0020] Em um aspecto, a caracterização da via de colonização microbiana compreende a caracterização de um ou mais de genes envolvidos em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina.

[0021] Em um aspecto, a caracterização da via de colonização microbiana compreende a caracterização de um ou mais de genes selecionados do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos.

[0022] Em um aspecto, a caracterização da via de colonização microbiana compreende a caracterização de um ou mais de genes selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica a glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica a glutamina sintetase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2 e combinações dos mesmos.

[0023] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização sob condições de estufa ou laboratório e/ou sob condições de campo.

[0024] Em um aspecto, a métrica de colonização compreende pelo menos um dos seguintes: padrões de colonização espacial, dinâmica de colonização temporal, densidade de colonização ou combinações dos mesmos.

[0025] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) ocorre sob condições de estufa ou laboratório.

[0026] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) ocorre sob condições de campo.

[0027] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) ocorre in vitro.

[0028] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) ocorre sob condições de estufa ou laboratório; sob condições de campo; e/ou in vitro.

[0029] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) ocorre sob condições de estufa ou de laboratório e compreende (i) medir o perfil transcriptômico das espécies microbianas; (ii) medir a atividade transcriptômica de genes associados à capacidade da espécie microbiana de desempenhar uma função de interesse benéfica às plantas; (iii) medir a atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores; (iv) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras; (v) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno; e/ou (vi) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[0030] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) ocorre sob condições de campo e compreende (i) medir o perfil transcriptômico das espécies microbianas; (ii) medir a atividade transcriptômica de genes associados com a capacidade da espécie microbiana de desempenhar uma função de interesse benéfica às plantas; (iii) medir a atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores; (iv) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras; (v) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno; e/ou (vi) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[0031] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método descrito acima) ocorre in vitro e compreende (i) medir o perfil transcriptômico da espécie microbiana; (ii) medir a atividade transcriptômica de genes associados à capacidade da espécie microbiana de desempenhar uma função de interesse benéfica às plantas; (iii) medir a atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores; (iv) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras; (v) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras sob condições de esgotamento de nitrogênio e repletas de nitrogênio; e/ou (vi) medir a atividade transcriptômica de sequências promotoras sob condições de esgotamento e repletas de nitrogênio, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[0032] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo.

[0033] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições em estufa ou laboratório.

[0034] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o crescimento da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[0035] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições em estufa ou laboratório e sob condições de campo.

[0036] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o crescimento da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo.

[0037] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o crescimento da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições em estufa ou laboratório.

[0038] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o crescimento da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[0039] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o crescimento da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições em estufa ou laboratório e sob condições de campo.

[0040] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização e genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes (por exemplo, na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende: o crescimento da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[0041] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas sob condições em estufa ou laboratório.

[0042] Em um aspecto, a etapa de ensaio da pluralidade de espécies microbianas na etapa c do método de remodelação microbiana guiada descrito acima compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à atividade de fixação de nitrogênio. Em um aspecto, a atividade de fixação de nitrogênio é avaliada em um ensaio de redução de acetileno ou ensaio de excreção de amônio.

[0043] Em um aspecto, o plasmídeo de transformação usado na etapa e do método de remodelação microbiana guiada descrito acima é um plasmídeo suicida.

[0044] Em um aspecto, o sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata transformada e a confirmação da integração da variação genética não intergenérica no locus genômico alvo e ausência de qualquer sequência genética do plasmídeo de transformação (etapa h do método de remodelação microbiana guiada descrito acima) compreende o sequenciamento do genoma completo.

[0045] Em um aspecto, é fornecido nesse documento um método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: (a) fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; (b) ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; (c) selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; (d) introduzir uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata em um locus genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas; (e) confirmar a integração da variação genética não intergenérica no locus genômico alvo e ausência de qualquer sequência genética transgênica; e (f) repetir as etapas d)-e) uma ou mais veze(s), até que uma espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada para desempenhar a função de interesse benéfica às plantas. Em um aspecto adicional dessa modalidade, a etapa b) compreende o ensaio de genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes. Em um aspecto adicional dessa modalidade, na etapa d), as referidas variações genéticas não intergenéricas são selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações de pares de bases únicas e combinações das mesmas. Em ainda outro aspecto dessa modalidade, a etapa e) compreende o sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata.

[0046] Em um aspecto, é fornecido nesse documento um método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: (a) fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; (b) ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; (c) selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; (d) introduzir duas ou mais variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata em dois ou mais loci genômicos alvo, em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados com uma função de interesse benéfica às plantas; e (e) confirmação da introdução das variações genéticas não intergenéricas nos loci genômicos alvo e ausência de qualquer sequência genética transgênica. Em um outro aspecto dessa modalidade, a etapa b) compreende o ensaio de genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes. Em um aspecto adicional dessa modalidade, na etapa d), as referidas variações genéticas não intergenéricas são selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações de pares de bases únicas e combinações das mesmas. Em um outro aspecto dessa modalidade, a etapa e) compreende o sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata.

[0047] Em um aspecto, é fornecido nesse documento um método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: (a) fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; (b) ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização, genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; (c) selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; (d) introduzir uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata em um locus genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas, as referidas variações genéticas não intergenéricas selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações pares de bases únicas e combinações das mesmas; (e) sequenciar o genoma da espécie microbiana candidata e confirmar a integração da variação genética não intergenérica no locus genômico alvo e ausência de qualquer sequência genética transgênica; e (f) repetir as etapas d)-e) uma ou mais vezes, até que uma espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada para realizar a função de interesse benéfica às plantas.

[0048] Em um aspecto, é fornecido nesse documento um método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, compreendendo: (a) fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; (b) ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização, genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; (c) selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; (d) introduzir duas ou mais variações genéticas não intergenéricas direcionadas para as espécies microbianas candidatas em dois ou mais loci genômicos alvo, em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas, as referidas variações genéticas não intergenéricas selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações pares de bases únicas e combinações das mesmas; e (e) sequenciar o genoma da espécie microbiana candidata e confirmar a introdução das variações genéticas não intergenéricas nos loci genômicos alvo e ausência de qualquer sequência genética transgênica.

[0049] Em um aspecto, é fornecido um método de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: (a) acessar uma pluralidade de sequências de genoma microbiano completo; (b) identificar uma pluralidade de sequências de genes reguladores que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; (c) identificar uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; (d) selecionar uma sequência de gene regulador e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades; em que as etapas a)-d) ocorrem in silico; e (e) fabricar, in vivo, uma célula microbiana remodelada que tem a sequência do gene regulador selecionada operacionalmente ligada ao gene selecionado associado a uma função benéfica às plantas, melhorando assim a expressão gênica associada a uma função benéfica às plantas.

[0050] Em um aspecto, é fornecido um sistema de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, compreendendo: (a) um ou mais processador(es); e (b) uma ou mais de memórias operativamente acopladas a um ou mais processador(es) e tendo instruções armazenadas nos mesmos, que quando executadas por um ou mais processador(es), fazem com que o sistema: (i) acesse uma pluralidade de sequências microbianas do genoma completo; (ii) identifique uma pluralidade de sequências de genes reguladores que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; (iii) identifique uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; e (iv) selecione uma sequência de gene regulador e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades.

[0051] Em um aspecto, é fornecido um método de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, compreendendo: (a) ativar um sistema de computador tendo: um ou mais processador(es) e uma ou mais memória(s) operativamente acoplada(s) a um ou mais processador(es) e tendo instruções armazenadas nos mesmos, fazendo com que um ou mais processador(es) execute(m) as instruções e fazendo com que o sistema: (i) acesse uma pluralidade de sequências microbianas do genoma inteiro; (ii) identifique uma pluralidade de sequências de genes reguladores que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; (iii) identifique uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; (iv) selecione uma sequência de gene regulador e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades; e (b) fabrique, in vivo, uma célula microbiana remodelada que tem a sequência do gene regulador selecionada operacionalmente ligada ao gene selecionado associado a uma função benéfica às plantas, melhorando assim a expressão gênica associada a uma função benéfica às plantas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0052] A FIG. 1A representa uma visão geral do processo de remodelação microbiana guiada, de acordo com as modalidades.

[0053] A FIG. 1B representa uma vista expandida da medição da composição do microbioma como mostrado na FIG. 1A.

[0054] A FIG. 1C representa uma abordagem problemática de “bioprospecção tradicional”, que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma ensinada de remodelação microbiana guiada (GMR).

[0055] A FIG. 1D representa um sistema problemático de “abordagem de campo para bioprospecção”, que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma ensinada de remodelação microbiana guiada (GMR).

[0056] A FIG. 1E representa o período de tempo no ciclo de crescimento do milho, no qual o nitrogênio é mais necessário para a planta.

[0057] A FIG. 1F representa uma visão geral de um processo de desenvolvimento de campo para um micróbio remodelado.

[0058] A FIG. 1G representa uma visão geral de uma modalidade de plataforma de remodelação microbiana guiada.

[0059] A FIG. 1H representa uma visão geral de uma plataforma de remodelação microbiana guiada por computador.

[0060] A FIG. 1I descreve o uso de dados de campo combinados com modelagem em aspectos da plataforma de remodelação microbiana guiada.

[0061] A FIG. 1J representa 5 propriedades que podem ser possuídas por micróbios remodelados da presente revelação.

[0062] A FIG. 1K representa um esquema de uma abordagem de remodelação para um micróbio, PBC6.1.

[0063] A FIG. 1L representa a expressão de nifA desacoplada da regulação de nitrogênio endógeno em micróbios remodelados.

[0064] A FIG. 1M representa assimilação e excreção melhoradas de nitrogênio fixado por micróbios remodelados.

[0065] A FIG. 1N representa a melhoria do rendimento do milho atribuível a micróbios remodelados.

[0066] A FIG. 1O ilustra a ineficácia dos sistemas atuais de dispensação de nitrogênio, que resultam em campos subfertilizados, campos fertilizados e escoamento de nitrogênio prejudicial ao meio ambiente.

[0067] A FIG. 2 ilustra a colonização de PBC6.1 em abundância de quase 21% da microbiota associada à raiz nas raízes do milho. Os dados de abundância são baseados no sequenciamento do amplicon 16S da rizosfera e endosfera de plantas de milho inoculadas com PBC6.1 e cultivadas sob condições de estufa.

[0068] As FIGs. 3A-3E ilustram micróbios derivados que fixam e excretam nitrogênio in vitro sob condições similares a solos agrícolas com alto teor de nitrato. A FIG. 3A ilustra a rede reguladora que controla a fixação e a assimilação de nitrogênio em PBC6.1, incluindo os nós chave NifL, NifA, GS, GlnE representados como a enzima ATase-AR de dois domínios e AmtB. A FIG. 3B ilustra o genoma do isolado PBC6.1 de Kosakonia sacchari. As três trilhas que circunscrevem o genoma transmitem dados de transcrição de PBC6.1, PBC6.38 e a expressão diferencial entre as cepas, respectivamente. A FIG. 3C ilustra o agrupamento de genes de fixação de nitrogênio e os dados de transcrição são expandidos para maiores detalhes. A FIG. 3D ilustra que a atividade da nitrogenase sob concentrações variáveis de nitrogênio exógeno é medida com o ensaio de redução de acetileno. A cepa do tipo selvagem exibe repressão da atividade da nitrogenase conforme as concentrações de glutamina aumentam, enquanto as cepas derivadas mostram vários graus de robustez. No gráfico de linha, os triângulos representam a cepa PBC6.22; os círculos representam a cepa PBC6.1; os quadrados representam a cepa PBC6.15; e os diamantes representam a cepa PBC6.14. As barras de erro representam o erro padrão da média de pelo menos três réplicas biológicas. A FIG. 3E ilustra a excreção temporal de amônia por cepas derivadas é observada em concentrações de mM. As cepas do tipo selvagem não excretam nitrogênio fixado e uma amônia insignificante se acumula no meio. As barras de erro representam o erro padrão da média.

[0069] A FIG. 4 ilustra taxas de transcrição de nifA em cepas derivadas de PBC6.1 correlacionadas com taxas de redução de acetileno. Um ensaio ARA foi realizado conforme descrito nos Métodos, após o qual as culturas foram amostradas e submetidas à análise qPCR para determinar os níveis de transcrição nifA. As barras de erro mostram o erro padrão da média de pelo menos três réplicas biológicas em cada medida.

[0070] As FIGs. 5A-5C ilustram experimentos em estufa que demonstram a fixação de nitrogênio microbiano no milho. A FIG. 5A ilustra a colonização de micróbios seis semanas após a inoculação de plantas de milho por cepas derivadas de PBC6.1. As barras de erro mostram o erro padrão da média de pelo menos oito repetições biológicas. A FIG. 5B ilustra a transcrição in planta de nifH medida por extração de RNA total das raízes e subsequente análise de Nanostring. Apenas as cepas derivadas mostram a transcrição de nifH no ambiente de raiz. As barras de erro mostram o erro padrão da média de pelo menos 3 réplicas biológicas. A FIG. 5C ilustra a fixação de nitrogênio microbiano medida pela diluição do traçador isotópico em tecidos vegetais. Micróbios derivados exibem transferência substancial de nitrogênio fixado para a planta. As barras de erro mostram o erro padrão da média de pelo menos dez repetições biológicas.

[0071] A FIG. 6 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI006.

[0072] A FIG. 7 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI019.

[0073] A FIG. 8 representa um mapa de calor das libras de nitrogênio dispensadas por acre na estação por micróbios da presente revelação registrado como uma função de micróbios por peso fresco g por mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que dispensam menos de libra de nitrogênio por acre na estação, e acima da linha estão os micróbios que dispensam mais de uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre na estação. A tabela abaixo do mapa de calor fornece o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio h) junto com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g de pf) para cada micróbio mostrado no mapa de calor. Os micróbios utilizados no mapa de calor foram testados para a produção de N no milho. Para as cepas WT CI006 e CI019, os dados de colonização da raiz do milho foram retirados de um único sítio de campo. Para as cepas restantes, a colonização foi considerada igual ao nível do campo de WT. A atividade de fixação de N foi determinada usando um ensaio ARA in vitro a 5 mM de glutamina.

[0074] A FIG. 9 representa o rendimento de plantas que foram expostas à cepa CI006. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento MRTN particular. O eixo x é o valor p e o eixo y é a taxa de vitória.

[0075] A FIG. 10 representa o rendimento de plantas que foram expostas à cepa CM029. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular. O eixo x é o valor p e o eixo y é a taxa de vitória.

[0076] A FIG. 11 representa o rendimento de plantas que foram expostas à cepa CM038. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento MRTN particular. O eixo x é o valor p e o eixo y é a taxa de vitória.

[0077] A FIG. 12 representa o rendimento de plantas que foram expostas à cepa CI019. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento MRTN particular. O eixo x é o valor p e o eixo y é a taxa de vitória.

[0078] A FIG. 13 representa o rendimento de plantas que foram expostas à cepa CM081. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento MRTN particular. O eixo x é o valor p e o eixo y é a taxa de vitória.

[0079] A FIG. 14 representa o rendimento de plantas que foram expostas às cepas CM029 e CM081. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento MRTN particular. O eixo x é o valor p e o eixo y é a taxa de vitória.

[0080] A FIG. 15 representa o rendimento das plantas como ganho/perda agregada de alqueire. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento MRTN particular. O eixo x é o valor p e o eixo y é a taxa de vitória.

[0081] A FIG. 16 ilustra os resultados de um experimento de teste de campo no verão de 2017. Os resultados de rendimento obtidos demonstram que os micróbios da revelação podem servir como um substituto potencial do fertilizante. Por exemplo, a utilização de um micróbio da revelação (isto é, 6-403) resultou em um rendimento maior do que a cepa do tipo selvagem (WT) e um rendimento maior do que o controle não tratado (UTC). O tratamento de “-25 lb (11,34 kg) de N” utiliza 25 libras (11,34 kg) a menos de N por acre do que as práticas agrícolas padrão da região. O tratamento de UTC “100% de N” destina-se a representar as práticas agrícolas padrão da região, em que 100% da utilização padrão de N é implantada pelo agricultor. O micróbio “6-403” foi depositado como NCMA 201708004 e pode ser encontrado na Tabela 1. Este é um Kosakonia sacchari mutante (também chamado de CM037) e é uma cepa de progênie mutante de CI006 WT.

[0082] A FIG. 17 ilustra os resultados de um experimento de teste de campo no verão de 2017. Os resultados de rendimento obtidos demonstram que os micróbios da revelação têm um desempenho consistente em todos as localizações. Além disso, os resultados de rendimento demonstram que os micróbios da revelação têm um bom desempenho em um ambiente estressado por nitrogênio, bem como em um ambiente que tem suprimentos suficientes de nitrogênio. O micróbio “6-881” (também conhecido como CM094, PBC6.94), e que é uma cepa de Kosakonia sacchari mutante de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1034”, que é uma cepa de Klebsiella variicola mutante de progênie de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712001 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1036”, que é uma cepa de Klebsiella variicola mutante de progênie de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “6-404” (também conhecido como CM38, PBC6.38), e que é uma cepa de Kosakonia sacchari mutante de progênie de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708003 e pode ser encontrado na Tabela 1. A condição de “Estresse nutricional” corresponde ao regime de 0% de nitrogênio. A condição “Fertilizante Suficiente” corresponde ao regime de 100% de nitrogênio.

[0083] A FIG. 18 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI006 (também denominado “6”, Kosakonia sacchari WT).

[0084] A FIG. 19 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI019 (também denominada “19”, Rahnella aquatilis WT).

[0085] A FIG. 20 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI137 (também denominada (“137”, Klebsiella variicola WT).

[0086] A FIG. 21 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 1021 (Kosakonia pseudosacchari WT).

[0087] A FIG. 22 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 910 (Kluyvera intermedia WT).

[0088] A FIG. 23 representa a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 63 (Rahnella aquatilis WT).

[0089] A FIG. 24 representa um mapa de calor das libras de nitrogênio dispensadas por acre na estação por micróbios da presente revelação registrado como uma função de micróbios por peso fresco g por mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que dispersam menos de uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre na estação, e acima da linha estão os micróbios que dispersam mais de uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre na estação. A Tabela 28 no Exemplo 5 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio h) junto com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g de pf) para cada micróbio mostrado no mapa de calor. Os dados da FIG. 24 é derivado de cepas microbianas testadas para a produção de N no milho sob condições de campo. Cada ponto representa lb de N/acre produzido por um micróbio usando dados de colonização de raiz de milho de um único local de campo. A atividade de fixação de N foi determinada usando o ensaio ARA in vitro a N 5mM na forma de glutamina ou fosfato de amônio.

[0090] A FIG. 25 representa um mapa de calor das libras de nitrogênio distribuídas por acre na estação por micróbios da presente revelação, registrado como uma função de micróbios por g de peso fresco por mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que fornecem menos de uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre na estação, e acima da linha estão os micróbios que fornecem mais de uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre na estação. A Tabela 29 no Exemplo 5 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio h) junto com a UFC precisa por grama de peso fresco (UFC/g de pf) para cada micróbio mostrado no mapa de calor. Os dados da FIG. 25 são derivados de cepas microbianas testadas para produção de N em milho sob condições de laboratório e estufa. Cada ponto representa lb de N/acre produzido por uma única cepa. Os pontos brancos representam cepas nas quais os dados de colonização da raiz do milho foram coletados sob condições de estufa. Os pontos pretos representam cepas mutantes para as quais os níveis de colonização de raiz de milho são derivados dos níveis médios de colonização de raiz de milho da cepa precursora de tipo selvagem. Os pontos tracejados representam as cepas precursores de tipo selvagem em seus níveis médios de colonização de raiz de milho de campo. Em todos os casos, a atividade de fixação de N foi determinada por ensaio ARA in vitro a 5 mM de N na forma de glutamina ou fosfato de amônio.

[0091] A FIG. 26 ilustra a excreção da excreção de amônia por WT CI137 e cepas mutantes descritas no Exemplo 7. A cepa WT foi observada para não excretar amônia, e amônia negligenciável se acumula no meio.

[0092] A FIG. 27 ilustra a colonização microbiana em milho três semanas após o plantio. A semente de milho foi inoculada no plantio por CI137 WT e cepas derivadas descritas no Exemplo 7.

[0093] A FIG. 28 ilustra os mesmos dados da FIG. 27, mas de uma forma ligeiramente diferente. A FIG. 28 ilustra a colonização microbiana média no milho três semanas após o plantio. A semente de milho foi inoculada no plantio por CI137 WT e cepas derivadas descritas no Exemplo 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

[0094] Embora várias modalidades da revelação tenham sido mostradas e descritas nesse documento, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, mudanças e substituições podem ocorrer para aqueles habilitados na técnica sem se afastar da revelação. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da revelação descritas nesse documento podem ser empregadas.

[0095] O aumento da utilização de fertilizantes traz consigo preocupações ambientais e também provavelmente não é possível para muitas regiões economicamente estressadas do globo. Além disso, muitos participantes da indústria na arena microbiana estão focados na criação de micróbios intergenéricos. No entanto, há uma grande carga reguladora colocada sobre os micróbios manipulados geneticamente que são caracterizados/classificados como intergenéricos. Esses micróbios intergenéricos enfrentam não apenas uma carga reguladora mais elevada, o que torna difícil a adoção e implementação generalizada, mas também enfrentam um grande controle da percepção pública.

[0096] Atualmente, não há micróbios modificados no mercado que sejam não intergenéricos e que sejam capazes de aumentar a fixação de nitrogênio em culturas não leguminosas. A escassez de tal micróbio é um elemento que falta para ajudar a inaugurar um sistema agrícola do século 21 verdadeiramente ecologicamente correto e mais sustentável.

[0097] A presente revelação resolve os problemas acima mencionados e fornece um micróbio não intergenérico que foi manipulado geneticamente para fixar prontamente nitrogênio em cultivos. Esses micróbios não são caracterizados/classificados como micróbios intergenéricos e, portanto, não enfrentarão ascargas reguladoras pesadas de tais micróbios. Além disso, os micróbios não intergenéricos ensinados servirão para ajudar os agricultores do século 21 a se tornarem menos dependentes do uso de quantidades cada vez maiores de fertilizante de nitrogênio exógeno. Definições

[0098] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “a” e referentes similares no contexto de descrição da revelação (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados para cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma nesse documento ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “compreendendo", “tendo”, “incluindo” e “contendo” devem ser interpretados como termos abertos (isto é, significando “incluindo, mas não se limitando a”), a menos que indicado de outra forma. A recitação de faixas de valores nesse documento é meramente destinada a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado caindo dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma nesse documento, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado nesse documento. Por exemplo, se a faixa de 10-15 é revelada, então 11, 12, 13 e 14 também são reveladas. Todos os métodos descritos nesse documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma nesse documento ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem de exemplo (por exemplo, “tal como”) fornecido(a) nesse documento, destina- se meramente a iluminar melhor a revelação e não representa uma limitação no escopo da revelação, a menos que seja reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da revelação.

[0099] Os termos “polinucleotídeo", “nucleotídeo”, “sequência de nucleotídeos”, “ácido nucleico” e

“oligonucleotídeo” são usados indistintamente. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definido(s) a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossomal (rRNA), RNA de interferência curto (siRNA), RNA em gancho curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais de nucleotídeos modificados, tais como, nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de rotulação.

[00100] “Hibridização” refere-se a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reage(m) para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligações de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por pareamento de bases de Watson

Crick, ligação de Hoogstein ou em qualquer outra maneira específica de sequência de acordo com a complementaridade de bases. O complexo pode compreender duas fitas formando uma estrutura duplex, três ou mais fitas formando um complexo de fitas múltiplas, uma única fita auto-hibridizante ou qualquer combinação dessas. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa de um processo mais extenso, tal como a iniciação da PCR ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma endonuclease. Uma segunda sequência que é complementar a uma primeira sequência é referida como o “complemento” da primeira sequência. O termo “hibridizável”, como aplicado a um polinucleotídeo, refere- se à capacidade do polinucleotídeo de formar um complexo que é estabilizado por meio de ligações de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo em uma reação de hibridização.

[00101] “Complementaridade” refere-se à capacidade de um ácido nucleico de formar ligação(ões) de hidrogênio com outra sequência de ácidos nucleicos por Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradicionais. Uma porcentagem de complementaridade indica a porcentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, pareamento de bases de Watson- Crick) com uma segunda sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 sendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares, respectivamente). “Perfeitamente complementar” significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos farão uma ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácidos nucleicos. “Substancialmente complementar”, como usado nesse documento, refere-se a um grau de complementaridade que é de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições estringentes. A identidade de sequência, tal como para a finalidade de avaliar a complementaridade percentual, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento adequado, incluindo o, mas não se limitando ao, algoritmo Needleman-Wunsch (ver, por exemplo, o alinhador EMBOSS Needle disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, opcionalmente com configurações padrão), o algoritmo BLAST (ver, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com configurações padrão), ou o algoritmo Smith-Waterman (ver, por exemplo, o alinhador EMBOSS Water disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, opcionalmente com configurações padrão). O alinhamento ideal pode ser avaliado usando quaisquer parâmetros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo parâmetros padrão.

[00102] Em geral, “condições estringentes” para hibridização referem-se a condições sob as quais um ácido nucleico tendo complementaridade com uma sequência alvo hibridiza predominantemente com uma sequência alvo e substancialmente não hibridiza com sequências não alvo. As condições restritivas geralmente dependem da sequência e variam de acordo com uma série de fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, mais alta é a temperatura na qual a sequência hibridiza especificamente com sua sequência alvo. Exemplos não limitativos de condições estringentes são descritos em detalhes em Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology- Hybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Segundo Capítulo “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Elsevier, N.Y.

[00103] Como usado nesse documento, “expressão” refere- se ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um molde de DNA (tal como em e mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser referidos coletivamente como “produto gênico”. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica.

[00104] Os termos “polipeptídeo", “peptídeo” e “proteína” são usados indistintamente nesse documento para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como a conjugação com um componente de rotulação. Como usado nesse documento, o termo “aminoácido” inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D ou L e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[00105] Como usado nesse documento, o termo “cerca de” é usado como sinônimo do termo “aproximadamente”. Ilustrativamente, o uso do termo “cerca de” em relação a uma quantidade indica que os valores estão ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1% a 10%.

[00106] O termo “cultura biologicamente pura” ou “cultura substancialmente pura” refere-se a uma cultura de uma espécie bacteriana descrita nesse documento não contendo nenhuma outra espécie bacteriana em quantidades suficientes para interferir com a replicação da cultura ou ser detectada por técnicas bacteriológicas normais.

[00107] “Produtividade da planta” refere-se geralmente a qualquer aspecto do crescimento ou desenvolvimento de uma planta que seja a razão pela qual a planta é cultivada. Para culturas alimentares, tais como grãos ou vegetais, “produtividade vegetal” pode se referir ao rendimento de grãos ou frutas colhido(a)s de um cultivo específico. Como usado nesse documento, a produtividade de planta melhorada refere-se amplamente a melhorias no rendimento de grãos, frutas, flores ou outras partes da planta colhidas para várias finalidades, melhorias no crescimento das partes da planta, incluindo caules, folhas e raízes, promoção do crescimento da planta, manutenção de alto teor de clorofila nas folhas, aumentando o número de frutos ou sementes, aumentando o peso da unidade de fruto ou semente, reduzindo a emissão de NO2 devido ao uso reduzido de fertilizante de nitrogênio e melhorias similares no crescimento e no desenvolvimento das plantas.

[00108] Micróbios dentro e ao redor de cultivos de alimentos podem influenciar as características desses cultivos. As características da planta que podem ser influenciadas por micróbios incluem: rendimento (por exemplo, produção de grãos, geração de biomassa, desenvolvimento de frutos, floração); nutrição (por exemplo, nitrogênio, fósforo, potássio, ferro, aquisição de micronutrientes); gerenciamento de estresse abiótico (por exemplo, tolerância à seca, tolerância ao sal, tolerância ao calor); e gerenciamento de estresse biótico (por exemplo, pragas, ervas daninhas, insetos, fungos e bactérias). As estratégias para alterar as características da cultura incluem: aumentar as concentrações de metabólitos principais; alteração da dinâmica temporal da influência do micróbio nos principais metabólitos; vincular a produção/degradação de metabólitos microbianos a novas pistas ambientais; reduzindo metabólitos negativos; e melhorar o equilíbrio dos metabólitos ou proteínas subjacentes.

[00109] Como usado nesse documento, uma “sequência de controle” se refere a um operador, promotor, silenciador ou terminador.

[00110] Como usado nesse documento, “in planta” pode referir-se à planta, na planta ou intimamente associado à planta, dependendo do contexto de uso (por exemplo, associações endofíticas, epifíticas ou rizosféricas). A planta pode compreender partes da planta, tecido, folhas, raízes, pelos da raiz, rizomas, caules, sementes, óvulos, pólen, flores, frutas, etc.

[00111] Em algumas modalidades, as sequências de controle nativas ou endógenas de genes da presente revelação são substituídas por uma ou mais sequência(s) de controle intragenérica(s).

[00112] Como usado nesse documento, “introduzido” refere-se à introdução por meio da biotecnologia moderna, e não uma introdução de ocorrência natural.

[00113] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação foram modificadas de modo que não sejam bactérias de ocorrência natural.

[00114] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 ufc, 104 ufc, 105 ufc, 106 ufc, 107 ufc, 108 ufc, 109 ufc, 1010 ufc, 1011 ufc, ou 1012 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos cerca de 103 ufc, cerca de 104 ufc, cerca de 105 ufc, cerca de 106 ufc, cerca de 107 ufc, cerca de 108 ufc, cerca de 109 ufc, cerca de 1010 ufc, cerca de 1011 ufc ou cerca de 1012 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 a 109, 103 a 107, 103 a 105, 105 a 109, 105 a 107, 106 a 1010, 106 a 107 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta.

[00115] Fertilizantes e nitrogênio exógeno da presente revelação podem compreender as seguintes moléculas contendo nitrogênio: amônio, nitrato, nitrito, amônia, glutamina, etc. As fontes de nitrogênio da presente revelação podem incluir amoníaco, sulfato de amônia, ureia, fosfato de diamônio, forma de ureia, fosfato de monoamônio, nitrato de amônio, soluções de nitrogênio, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, nitrato de sódio, etc.

[00116] Como usado nesse documento, “nitrogênio exógeno” refere-se ao nitrogênio não atmosférico prontamente disponível no solo, campo ou meio de crescimento que está presente sob condições não limitantes de nitrogênio, incluindo amônia, amônio, nitrato, nitrito, ureia, ácido úrico, ácidos de amônio, etc.

[00117] Como usado nesse documento, “condições não limitantes de nitrogênio” referem-se ao nitrogênio não atmosférico disponível no solo, campo, meio em concentrações maiores que cerca de 4 mM de nitrogênio, como revelado por Kant et al. (2010. J. Exp. Biol. 62 (4): 1499-1509), que é incorporado nesse documento por referência.

[00118] Como usado nesse documento, um “microrganismo intergenérico” é um microrganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos de diferentes gêneros taxonômicos. Um “mutante intergenérico” pode ser usado indistintamente com “microrganismo intergenérico”. Um exemplo de “microrganismo intergenérico” inclui um microrganismo contendo um elemento genético móvel que foi identificado pela primeira vez em um microrganismo em um gênero diferente do microrganismo receptor. Explicações adicionais podem ser encontradas, inter alia, em 40 C.F.R. § 725.3.

[00119] Em aspectos, os micróbios ensinados nesse documento são “não intergenéricos”, o que significa que os micróbios não são intergenéricos.

[00120] Como usado nesse documento, um “microrganismo intragenérico” é um microrganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos do mesmo gênero taxonômico. Um “mutante intragenérico” pode ser usado alternadamente com “microrganismo intragenérico”.

[00121] Como usado nesse documento, “material genético introduzido” significa material genético que é adicionado e permanece como um componente do genoma do receptor.

[00122] Como usado nesse documento, no contexto de microrganismos não intergenéricos, o termo “remodelado” é usado como sinônimo do termo “manipulado geneticamente”. Consequentemente, um “microrganismo remodelado não intergenérico” tem um significado sinônimo para “microrganismo modificado não intergenérico” e será utilizado de forma intercambiável. Além disso, a revelação pode se referir a uma “cepa manipuladas geneticamente” ou “derivado manipulado geneticamente” ou “micróbio não intergenérico manipulado geneticamente”, esses termos são usados como sinônimos de “cepa remodelada” ou “derivado remodelado” ou “micróbio não intergenérico remodelado”.

[00123] Em algumas modalidades, a rede reguladora genética de fixação e assimilação de nitrogênio compreende polinucleotídeos que codificam genes e sequências não codificantes que direcionam, modulam e/ou regulam a fixação e/ou assimilação de nitrogênio microbiano e podem compreender sequência de polinucleotídeos do agrupamento nif (por exemplo, nifA, nifB, nifC,………nifZ), polinucleotídeos que codificam a proteína C reguladora de nitrogênio, polinucleotídeos que codificam a proteína B reguladora de nitrogênio, sequências de polinucleotídeos do grupamento gln (por exemplo, glnA e glnD), draT e transportadores/permeases de amônia. Em alguns casos, o grupamento Nif pode compreender NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa, e NifV. Em alguns casos, o grupamento Nif pode compreender um subconjunto de NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV.

[00124] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de nitrogênio por peso.

[00125] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13% , cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de

62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de nitrogênio em peso.

[00126] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende cerca de 5% a 50%, cerca de 5% a 75%, cerca de 10% a 50%, cerca de 10% a 75%, cerca de 15% a 50%, cerca de 15 % a 75%, cerca de 20% a 50%, cerca de 20% a 75%, cerca de 25% a 50%, cerca de 25% a 75%, cerca de 30% a 50%, cerca de 30% a 75%, cerca de 35% a 50%, cerca de 35% a 75%, cerca de 40% a 50%, cerca de 40% a 75%, cerca de 45% a 50%, cerca de 45% a 75% ou cerca de 50% a 75% de nitrogênio em peso.

[00127] Em algumas modalidades, o aumento da fixação de nitrogênio e/ou a produção de 1% ou mais do nitrogênio na planta são medidos em relação às plantas de controle, que não foram expostas às bactérias da presente revelação. Todos os aumentos ou diminuições nas bactérias são medidos em relação às bactérias de controle. Todos os aumentos ou as diminuições nas plantas são medidos em relação às plantas de controle.

[00128] Como usado nesse documento, um “promotor constitutivo” é um promotor que é ativo na maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Existem várias vantagens no uso de promotores constitutivos em vetores de expressão usados em biotecnologia, tais como: alto nível de produção de proteínas usadas para selecionar células ou organismos transgênica(o)s; alto nível de expressão de proteínas repórteres ou marcadores classificáveis, permitindo fáceis detecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcrição que faz parte de um sistema de transcrição regulador; produção de compostos que requerem atividade ubíqua no organismo; e produção de compostos que são necessários durante todos os estágios de desenvolvimento. Promotores constitutivos exemplificativos não limitantes incluem, promotor CaMV 35S, promotores de opina, promotor de ubiquitina, promotor de álcool desidrogenase, etc.

[00129] Como usado nesse documento, um “promotor não constitutivo” é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células e/ou durante certos estágios de desenvolvimento. Por exemplo, os promotores indutíveis específicos do tecido, preferidos do tecido, específicos do tipo de célula, e os promotores sob controle de desenvolvimento são promotores não constitutivos. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que de preferência iniciam a transcrição em certos tecidos.

[00130] Como usado nesse documento, o promotor “indutível” ou “reprimível” é um promotor que está sob o controle do fator químico ou ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores indutíveis incluem condições anaeróbicas, certos produtos químicos, a presença de luz, condições ácidas ou básicas, etc.

[00131] Como usado nesse documento, um promotor “específico de tecido” é um promotor que inicia a transcrição apenas em certos tecidos. Ao contrário da expressão constitutiva de genes, a expressão específica de tecido é o resultado de vários níveis interativos de regulação gênica. Como tal, na técnica às vezes é preferível usar promotores de espécies homólogas ou intimamente relacionadas para alcançar a expressão eficaz e confiável de transgenes em tecidos particulares. Essa é uma das principais razões para a grande quantidade de promotores específicos de tecido isolados de tecidos particulares encontrados na literatura científica e de patentes.

[00132] Como usado nesse documento, o termo “operacionalmente ligado” refere-se à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de regular a expressão dessa sequência de codificação (isto é, que a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operativamente ligadas a sequências reguladoras em uma orientação de sentido ou antissentido. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da revelação podem ser operacionalmente ligadas, direta ou indiretamente, 5’ para o mRNA alvo, ou 3’ para o mRNA alvo, ou dentro do mRNA alvo, ou uma primeira região complementar é 5’ e seu complemento é 3’ em relação ao mRNA alvo.

[00133] Em aspectos, “aplicar à planta uma pluralidade de bactérias não intergenéricas” inclui qualquer meio pelo qual a planta (incluindo partes da planta, tais como uma semente, raiz, caule, tecido, etc.) é feita para entrar contato (isto é, exposto) com a referida bactéria em qualquer estágio do ciclo de vida da planta. Consequentemente, “aplicar à planta uma pluralidade de bactérias não intergenéricas” inclui qualquer um dos seguintes meios de expor a planta (incluindo partes da planta, tais como, um(a) semente, raiz, caule, tecido, etc.) às referidas bactérias: pulverização sobre planta, gotejando na planta, aplicando como um revestimento de semente, aplicando a um campo que então será plantado com sementes, aplicando a um campo já plantado com sementes, aplicando a um campo com plantas adultas, etc.

[00134] Como usado nesse documento, “MRTN” é um acrônimo para máximo retorno ao nitrogênio e é utilizado como um tratamento experimental nos Exemplos. MRTN foi desenvolvido pela Iowa State University e as informações podem ser encontradas em: cnrc.agron.iastate.edu. O MRTN é a taxa de nitrogênio em que o retorno econômico líquido da aplicação de nitrogênio é maximizado. A abordagem para calcular o MRTN é uma abordagem regional para o desenvolvimento de diretrizes para a taxa de nitrogênio do milho em estados individuais. Os dados do teste de taxa de nitrogênio foram avaliados para Illinois, Iowa, Michigan, Minnesota, Ohio e Wisconsin, onde um número adequado de testes de pesquisa estava disponível para plantações de milho após plantações de soja e milho após milho. Os ensaios foram conduzidos com nitrogênio aplicado antes do plantio, depois do plantio, ou dividido em antes do plantio/depois do plantio, e os sítios não foram irrigados, exceto aqueles que foram indicados para areias irrigadas em Wisconsin. MRTN foi desenvolvido pela Universidade Estadual de Iowa devido a diferenças aparentes nos métodos para determinar as taxas de nitrogênio sugeridas necessárias para a produção de milho, percepções errôneas relativas às diretrizes de taxa de nitrogênio e preocupações sobre as taxas de aplicação. Ao calcular o MRTN, os profissionais podem determinar o seguinte: (1) a taxa de nitrogênio onde o retorno econômico líquido para a aplicação de nitrogênio é maximizado, (2) a taxa econômica ótima de nitrogênio, que é o ponto em que o último incremento de nitrogênio retorna um rendimento aumento grande o suficiente para pagar pelo nitrogênio adicional, (3) o valor do aumento de grãos de milho atribuído à aplicação de nitrogênio e o rendimento máximo, que é o rendimento onde a aplicação de mais nitrogênio não resulta em um aumento de rendimento do milho. Assim, os cálculos do MRTN fornecem aos profissionais os meios para maximizar as safras de milho em diferentes regiões enquanto maximizam os ganhos financeiros das aplicações de nitrogênio.

[00135] O termo mmol é uma abreviatura de milimol, que é um milésimo (10−3) de um mol, abreviado nesse documento como mol.

[00136] Como usado nesse documento, os termos “microrganismo” ou “micróbio” devem ser considerados de forma ampla. Esses termos, usados indistintamente, incluem, mas não estão limitados a, os dois domínios procarióticos, Bacteria e Archaea. O termo também pode abranger fungos eucarióticos e protistas.

[00137] O termo “consórcios microbianos” ou “consórcio microbiano” refere-se a um subconjunto de uma comunidade microbiana de espécies microbianas individuais, ou cepas de uma espécie, que podem ser descritas como realizando uma função comum, ou podem ser descritas como participantes em, ou levando a, ou se correlacionando com, um parâmetro reconhecível, como uma característica fenotípica de interesse.

[00138] O termo “comunidade microbiana” significa um grupo de micróbios que compreende duas ou mais espécies ou cepas. Ao contrário dos consórcios microbianos, uma comunidade microbiana não precisa estar realizando uma função comum, ou não precisa estar participando, ou levando a, ou se correlacionando com, um parâmetro reconhecível, como uma característica fenotípica de interesse.

[00139] Como usado nesse documento, “isolar", “isolado", “micróbio isolado” e termos semelhantes, destinam-se a significar que um ou mais de microrganismos foram separados de pelo menos um dos materiais com os quais está associado em um ambiente particular (por exemplo, solo, água, tecido vegetal, etc.). Assim, um “micróbio isolado” não existe em seu ambiente natural; em vez disso, é através das várias técnicas descritas nesse documento que o micróbio foi removido de seu ambiente natural e colocado em um estado de existência não natural. Assim, a cepa isolada ou micróbio isolado pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura ou como esporos (ou outras formas da cepa). Em aspectos, o micróbio isolado pode estar em associação com um carreador aceitável, que pode ser um carreador agricolamente aceitável.

[00140] Em certos aspectos da revelação, os micróbios isolados existem como “culturas isoladas e biologicamente puras”. Será apreciado por um habilitado na técnica que uma cultura isolada e biologicamente pura de um micróbio particular denota que a referida cultura está substancialmente livre de outros organismos vivos e contém apenas o micróbio individual em questão. A cultura pode conter concentrações variáveis do referido micróbio. A presente revelação observa que micróbios isolados e biologicamente puros muitas vezes “diferem necessariamente de materiais menos puros ou impuros". Ver, por exemplo, In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970) (discutindo prostaglandinas purificadas), ver também, In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979) (discutindo micróbios purificados), ver também, Parke-Davis & Co. v. HK Mulford & Co., 189 F. 95 (SDNY 1911) (Learned Hand discutindo adrenalina purificada), publicado em parte, revisto em parte, 196 F. 496 (2a Cir. 1912), cada um dos quais são aqui incorporados por referência. Além disso, em alguns aspectos, a revelação fornece certas medidas quantitativas da concentração, ou limitações de pureza, que devem ser encontradas dentro de uma cultura microbiana isolada biologicamente pura. A presença desses valores de pureza, em certas modalidades, é um outro atributo que distingue os micróbios presentemente revelados daqueles micróbios existentes em um estado natural. Ver, por exemplo, Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4ª Cir. 1958) (discutindo as limitações de pureza da vitamina B12 produzida por micróbios), incorporado nesse documento por referência.

[00141] Como usado nesse documento, “isolados individuais” devem ser entendidos como significando uma composição ou cultura, compreendendo uma predominância de um único gênero, espécie ou cepa de microrganismo, após a separação de um ou mais de outros microrganismos.

[00142] Micróbios da presente revelação podem incluir esporos e/ou células vegetativas. Em algumas modalidades, os micróbios da presente revelação incluem micróbios em um estado viável, mas não cultivável (VBNC). Como usado nesse documento, “esporo” ou “esporos” refere(m)-se a estruturas produzidas por bactérias e fungos que são adaptados para sobrevivência e dispersão. Os esporos são geralmente caracterizados como estruturas dormentes; entretanto, os esporos são capazes de se diferenciar por meio do processo de germinação. A germinação é a diferenciação de esporos em células vegetativas que são capazes de atividade metabólica, crescimento e reprodução. A germinação de um único esporo resulta em uma única célula vegetativa fúngica ou bacteriana. Os esporos de fungos são unidades de reprodução assexuada e, em alguns casos, são estruturas necessárias nos ciclos de vida dos fungos. Os esporos bacterianos são estruturas para condições de sobrevivência que podem normalmente não ser conducentes à sobrevivência ou ao crescimento das células vegetativas.

[00143] Como usado nesse documento, “composição microbiana” refere-se a uma composição que compreende um ou mais de micróbios da presente revelação. Em algumas modalidades, uma composição microbiana é administrada às plantas (incluindo várias partes da planta) e/ou em campos agrícolas.

[00144] Como usado nesse documento, “carreador”, “carreador aceitável” ou “carreador agricolamente aceitável” refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o micróbio pode ser administrado, o que não afeta negativamente o micróbio. Regulação da Fixação de Nitrogênio

[00145] Em alguns casos, a via de fixação de nitrogênio pode atuar como um alvo para engenharia genética e otimização. Uma característica que pode ser direcionada para regulação pelos métodos descritos nesse documento é a fixação de nitrogênio. O fertilizante de nitrogênio é a maior despesa operacional em uma fazenda e o maior impulsionador de maiores rendimentos em cultivos como milho e trigo. São descritos nesse documento produtos microbianos que podem dispensar formas renováveis de nitrogênio em cultivos não leguminosos. Embora alguns endófitos tenham a genética necessária para fixar nitrogênio em cultura pura, o desafio técnico fundamental é que os endófitos de tipo selvagem de cereais e gramíneas param de fixar nitrogênio em campos fertilizados. A aplicação de fertilizantes químicos e os níveis de nitrogênio residual em solos de campo sinalizam ao micróbio para desligar a via bioquímica para a fixação de nitrogênio.

[00146] Alterações nos níveis de transcrição e pós- tradução de componentes da rede reguladora de fixação de nitrogênio podem ser benéficas para o desenvolvimento de um micróbio capaz de fixar e transferir nitrogênio para o milho na presença de fertilizante. Para esse fim, é descrita nesse documento a tecnologia Host-Microbe Evolution (HoME) para desenvolver redes reguladoras com precisão e provocar novos fenótipos. Também são descritas nesse documento bibliotecas únicas e proprietárias de endófitos fixadores de nitrogênio isolados de milho, pareados com dados ômicos extensos em torno da interação de micróbios e planta hospedeira sob diferentes condições ambientais, como estresse e excesso de nitrogênio. Em algumas modalidades, essa tecnologia permite a evolução precisa da rede reguladora genética de endófitos para produzir micróbios que fixam nitrogênio ativamente, mesmo na presença de fertilizantes no campo. Também são descritas nesse documento avaliações do potencial técnico de micróbios em evolução que colonizam os tecidos da raiz do milho e produzem nitrogênio para plantas fertilizadas e avaliações da compatibilidade de endófitos com práticas de formulação padrão e diversos solos para determinar a viabilidade de integração dos micróbios em estratégias modernas de controle de nitrogênio.

[00147] A fim de utilizar o nitrogênio elementar (N) para a síntese química, as formas de vida combinam o gás nitrogênio (N2) disponível na atmosfera com o hidrogênio em um processo conhecido como fixação de nitrogênio. Devido à natureza intensiva de energia da fixação biológica de nitrogênio, os diazotróficos (bactérias e arqueas que fixam o gás nitrogênio atmosférico) desenvolveram uma regulação sofisticada e rígida do grupamento gênico nif em resposta ao oxigênio ambiental e ao nitrogênio disponível. Os genes Nif codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio (tal como o complexo nitrogenase) e proteínas que regulam a fixação de nitrogênio. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8 (4): 84-94) revela descrições detalhadas de genes nif e seus produtos, e é incorporado nesse documento por referência. São descritos nesse documento métodos de produção de uma planta com uma característica melhorada compreendendo isolar bactérias de uma primeira planta, introduzir uma variação genética em um gene da bactéria isolada para aumentar a fixação de nitrogênio, expor uma segunda planta à bactéria variante, isolar bactérias da segunda planta tendo uma característica melhorada em relação à primeira planta e repetindo as etapas com bactérias isoladas da segunda planta.

[00148] Em Proteobacteria, a regulação da fixação de nitrogênio centra-se em torno da proteína de ligação do intensificador dependente de 54 NifA, o regulador transcricional positivo do grupamento nif. Os níveis intracelulares de NifA ativo são controlados por dois fatores principais: a transcrição do operon nifLA e a inibição da atividade de NifA pela interação proteína-proteína com NifL. Ambos os processos respondem aos níveis intracelulares de glutamina via cascata de sinalização da proteína PII. Essa cascata é mediada por GlnD, que detecta diretamente a glutamina e catalisa a uridililação ou desuridililação de duas proteínas reguladoras PII - GlnB e GlnK - em resposta à ausência ou presença, respectivamente, de glutamina ligada. Sob condições de excesso de nitrogênio, o GlnB não modificado sinaliza a desativação do promotor nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, o GlnB é modificado pós-tradução, o que inibe sua atividade e leva à transcrição do operon nifLA. Dessa forma, a transcrição de nifLA é rigidamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização da proteína PII. No nível pós-tradução de regulação de NifA, GlnK inibe a interação NifL/NifA em uma questão dependente do nível geral de GlnK livre dentro da célula.

[00149] NifA é transcrito a partir do operon nifLA, cujo promotor é ativado por NtrC fosforilado, outro regulador dependente de 54. O estado de fosforilação de NtrC é mediado pela histidina quinase NtrB, que interage com o GlnB desuridililado, mas não com o GlnB uridililado. Sob condições de excesso de nitrogênio, um alto nível intracelular de glutamina leva à desuridililação de GlnB, que então interage com NtrB para desativar sua atividade de fosforilação e ativar sua atividade de fosfatase, resultando na desfosforilação de NtrC e na desativação do promotor nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, um baixo nível de glutamina intracelular resulta na uridililação de GlnB, que inibe sua interação com NtrB e permite a fosforilação de NtrC e a transcrição do operon nifLA. Dessa forma, a expressão de nifLA é rigidamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental via cascata de sinalização da proteína PII. nifA, ntrB, ntrC e glnB, são todos genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse documento. Esses processos também podem responder aos níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[00150] A atividade de NifA também é regulada pós- tradução em resposta ao nitrogênio ambiental, mais tipicamente por meio da inibição da atividade de NifA mediada por NifL. Em geral, a interação de NifL e NifA é influenciada pela cascata de sinalização da proteína PII via GlnK, embora a natureza das interações entre GlnK e NifL/NifA varie significativamente entre os diazotróficos. Em Klebsiella pneumoniae, ambas as formas de GlnK inibem a interação NifL/NifA, e a interação entre GlnK e NifL/NifA é determinada pelo nível geral de GlnK livre dentro da célula. Sob condições de excesso de nitrogênio, o GlnK desuridililado interage com o transportador de amônio AmtB, que serve para bloquear a captação de amônio pelo AmtB e sequestrar o GlnK para a membrana, permitindo a inibição do NifA pelo NifL. Por outro lado, em Azotobacter vinelandii, a interação com GlnK desuridililado é necessária para a interação NifL/NifA e inibição de NifA, enquanto a uridililação de GlnK inibe sua interação com NifL. Em diazotróficos sem o gene nifL, há evidências de que a atividade de NifA é inibida diretamente pela interação com as formas desuridililadas de GlnK e GlnB sob condições de excesso de nitrogênio. Em algumas bactérias, o grupamento Nif pode ser regulado por glnR e, além disso, em alguns casos, isso pode incluir regulação negativa. Independentemente do mecanismo, a inibição pós-tradução de NifA é um importante regulador do grupamento nif na maioria dos diazotróficos conhecidos. Além disso, nifL, amtB, glnK e glnR são genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse documento.

[00151] Além de regular a transcrição do grupamento gênico nif, muitos diazotróficos desenvolveram um mecanismo para a modificação pós-tradução direta e inibição da própria enzima nitrogenase, conhecido como desligamento da nitrogenase. Isso é mediado pela ribosilação do ADP da proteína Fe (NifH) sob condições de excesso de nitrogênio, o que interrompe sua interação com o complexo proteico MoFe (NifDK) e elimina a atividade da nitrogenase. DraT catalisa a ribosilação do ADP da proteína Fe e desligamento da nitrogenase, enquanto DraG catalisa a remoção de ADP-ribose e reativação da nitrogenase. Tal como acontece com a transcrição de nifLA e a inibição de NifA, o desligamento da nitrogenase também é regulado via cascata de sinalização da proteína PII. Sob condições de excesso de nitrogênio, o GlnB desuridililado interage com e ativa DraT, enquanto o GlnK desuridililado interage com DraG e AmtB para formar um complexo, sequestrando DraG para a membrana. Sob condições limitantes de nitrogênio, as formas uridililadas de GlnB e GlnK não interagem com DraT e DraG, respectivamente, levando à inativação de DraT e à difusão de DraG para a proteína Fe, onde remove a ADP-ribose e ativa a nitrogenase. Os métodos descritos nesse documento também contemplam a introdução de variação genética nos genes nifH, nifD, nifK e draT.

[00152] Embora alguns endófitos tenham a capacidade de fixar nitrogênio in vitro, muitas vezes a genética é silenciada no campo por altos níveis de fertilizantes químicos exógenos. Pode-se desacoplar a detecção de nitrogênio exógeno da expressão da enzima nitrogenase para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo. Melhorar a integralidade da atividade da nitrogenase ao longo do tempo serve adicionalmente para aumentar a produção de nitrogênio para utilização pelo cultivo. Alvos específicos para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo usando os métodos descritos nesse documento incluem um ou mais de genes selecionados do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[00153] Um alvo adicional para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio com base em campo usando os métodos descritos nesse documento é a proteína NifA. A proteína NifA é tipicamente o ativador para a expressão de genes de fixação de nitrogênio. Aumentar a produção de NifA

(constitutivamente ou durante a condição de alto teor de amônia) contorna a via nativa de detecção de amônia. Além disso, a redução da produção de proteínas NifL, um conhecido inibidor de NifA, também leva a um aumento do nível de NifA livremente ativo. Além disso, o aumento do nível de transcrição do operon nifAL (constitutivamente ou durante a condição de alto teor de amônia) também leva a um nível geral mais alto de proteínas NifA. O nível elevado de expressão nifAL é alcançado alterando o próprio promotor ou reduzindo a expressão de NtrB (parte da cascata de sinalização de ntrB e ntrC que originalmente resultaria no desligamento do operon nifAL durante a condição de alto teor de nitrogênio). O alto nível de NifA alcançado por esses ou quaisquer outros métodos descritos nesse documento aumenta a atividade de fixação de nitrogênio dos endófitos.

[00154] Outro alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio com base em campo usando os métodos descritos nesse documento é a cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. O nível de glutamina intracelular é detectado através da cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. Mutações de sítio ativo em GlnD que abolem a atividade de remoção de uridilil de GlnD interrompem a cascata de detecção de nitrogênio. Além disso, a redução da concentração de GlnB causa um curto-circuito na cascata de detecção de glutamina. Essas mutações “enganam” as células para que percebam um estado limitado de nitrogênio, aumentando assim a atividade do nível de fixação de nitrogênio. Esses processos também podem responder aos níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[00155] A proteína amtB também é um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio com base em campo usando os métodos descritos nesse documento.

A absorção de amônia do meio ambiente pode ser reduzida diminuindo o nível de expressão da proteína amtB.

Sem amônia intracelular, o endófito não é capaz de sentir o alto nível de amônia, impedindo a regulação negativa dos genes de fixação de nitrogênio.

Qualquer amônia que consegue entrar no compartimento intracelular é convertida em glutamina.

O nível de glutamina intracelular é a principal moeda de detecção de nitrogênio.

A redução do nível de glutamina intracelular evita que as células detectem altos níveis de amônio no ambiente.

Esse efeito pode ser alcançado aumentando o nível de expressão da glutaminase, uma enzima que converte a glutamina em glutamato.

Além disso, a glutamina intracelular também pode ser reduzida pela diminuição da glutamina sintase (uma enzima que converte a amônia em glutamina). Em diazotróficos, a amônia fixada é rapidamente assimilada em glutamina e glutamato para ser usada em processos celulares.

As interrupções na assimilação da amônia podem permitir o desvio do nitrogênio fixado para ser exportado da célula como amônia.

A amônia fixada é predominantemente assimilada em glutamina pela glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, e subsequentemente em glutamina pela glutamina oxoglutarato aminotransferase (GOGAT). Em alguns exemplos, glnS codifica uma glutamina sintetase.

GS é regulado pós-tradução por GS adenilil transferase (GlnE), uma enzima bifuncional codificada por glnE que catalisa a adenililação e desadenililação de GS por meio da atividade de seus domínios de remoção de adenilil- transferase (AT) e adenilila (AR), respectivamente.

Sob condições limitantes de nitrogênio, glnA é expressado, e o domínio de AR de GlnE desadinilila GS, permitindo que seja ativo. Sob condições de excesso de nitrogênio, a expressão de glnA é desativada e o domínio de AT de GlnE é ativado alostericamente pela glutamina, causando a adenililação e a desativação de GS.

[00156] Além disso, o gene draT também pode ser um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo usando os métodos descritos nesse documento. Uma vez que as enzimas fixadoras de nitrogênio são produzidas pela célula, o desligamento da nitrogenase representa outro nível no qual a célula regula negativamente a atividade de fixação sob condições de alto nitrogênio. Esse desligamento pode ser removido diminuindo o nível de expressão de DraT.

[00157] Os métodos para transmitir novos fenótipos microbianos podem ser realizados nos níveis transcricional, translacional e pós-tradução. O nível de transcrição inclui alterações no promotor (tal como alteração da afinidade do fator sigma ou sítios de ligação para fatores de transcrição, incluindo eliminação de todo ou de uma porção do promotor) ou alteração dos terminadores e atenuadores da transcrição. O nível de tradução inclui alterações nos sítios de ligação do ribossomo e a alteração dos sinais de degradação do mRNA. O nível pós-tradução inclui a mutação do sítio ativo de uma enzima e a alteração das interações proteína-proteína. Essas mudanças podem ser alcançadas de várias maneiras. A redução do nível de expressão (ou abolição completa) pode ser alcançada trocando o sítio de ligação ao ribossomo nativo (RBS) ou promotor por outro com menor força/eficiência. Os sítios de início ATG podem ser trocados para um códon de partida GTG, TTG ou CTG, o que resulta na redução da atividade de tradução da região de codificação. A abolição completa da expressão pode ser feita eliminando (eliminando) a região codificadora de um gene. A mudança de quadro do quadro de leitura aberta (ORF) provavelmente resultará em um códon de parada prematuro ao longo do ORF, criando assim um produto truncado não funcional. A inserção de códons de parada no quadro também criará de forma similar um produto truncado não funcional. A adição de uma etiqueta de degradação no terminal N ou C também pode ser feita para reduzir a concentração eficaz de um determinado gene.

[00158] Por outro lado, o nível de expressão dos genes descritos nesse documento pode ser alcançado usando um promotor mais forte. Para garantir a alta atividade do promotor durante a condição de alto nível de nitrogênio (ou qualquer outra condição), um perfil de transcrição de todo o genoma em uma condição de alto nível de nitrogênio poderia ser obtido e promotores ativos com um nível de transcrição desejado podem ser escolhidos desse conjunto de dados para substituir o promotor fraco. Os códons de início fracos podem ser trocados por um códon de partida ATG para melhor eficiência de início da tradução. Os sítios de ligação ribossômica (RBS) fracos também podem ser trocados por um RBS diferente com maior eficiência de iniciação da tradução. Além disso, a mutagênese específica do local também pode ser realizada para alterar a atividade de uma enzima.

[00159] O aumento do nível de fixação de nitrogênio que ocorre em uma planta pode levar a uma redução na quantidade de fertilizante químico necessário para a produção da cultura e reduzir as emissões de gases de efeito estufa (por exemplo,

óxido nitroso). Regulamentação do Potencial de Colonização

[00160] Uma característica que pode ser direcionada para regulação pelos métodos descritos nesse documento é o potencial de colonização. Por conseguinte, em algumas modalidades, as vias e genes envolvidos na colonização podem atuar como um alvo para engenharia genética e otimização.

[00161] Em alguns casos, exopolissacarídeos podem estar envolvidos na colonização bacteriana de plantas. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas podem produzir um biofilme. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas secretam moléculas que podem ajudar na adesão à planta ou na evasão de uma resposta imune da planta. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas podem excretar moléculas de sinalização que alteram a resposta das plantas aos micróbios. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas podem secretar moléculas que alteram o microambiente local. Em alguns casos, um micróbio colonizador de planta pode alterar a expressão de genes para se adaptar a uma planta da qual o referido micróbio está próximo. Em alguns casos, um micróbio colonizador de planta pode detectar a presença de uma planta no ambiente local e pode alterar a expressão de genes em resposta.

[00162] Em algumas modalidades, para melhorar a colonização, um gene envolvido em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina pode ser direcionado para engenharia genética e otimização.

[00163] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de exopolissacarídeos pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Genes exemplificativas que codificam uma enzima produtora de exopolissacarídeo que podem ser direcionados para melhorar a colonização incluem, mas não estão limitados a, bcsii, bcsiii e yjbE.

[00164] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de uma hemaglutinina filamentosa pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Por exemplo, um gene fhaB que codifica uma hemaglutinina filamentosa pode ser direcionado para melhorar a colonização.

[00165] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de uma endo-poligalaturonase pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Por exemplo, um gene pehA que codifica um precursor de endo- poligalaturonase pode ser direcionado para melhorar a colonização.

[00166] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de trealose pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Genes exemplares que codificam uma enzima produtora de trealose que podem ser direcionados para melhorar a colonização incluem, mas não estão limitados a, otsB e treZ.

[00167] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na conversão de glutamina pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Por exemplo, o gene glsA2 codifica uma glutaminase que converte a glutamina em amônio e glutamato. A regulação positiva de glsA2 melhora a aptidão, aumentando o grupamento de glutamato da célula,

aumentando assim o N disponível para as células. Por conseguinte, em algumas modalidades, o gene glsA2 pode ser direcionado para melhorar a colonização.

[00168] Em algumas modalidades, os genes de colonização selecionados do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2 e combinações dos mesmos, podem ser geneticamente modificados para melhorar a colonização.

[00169] Genes de colonização que podem ser direcionados para melhorar o potencial de colonização também são descritos em uma publicação PCT, WO/2019/032926, que é incorporada nesse documento por referência em sua totalidade. Geração de Populações Bacterianas Isolamento de bactérias

[00170] Micróbios úteis em métodos e composições revelados nesse documento podem ser obtidos pela extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas. Os micróbios podem ser obtidos triturando as sementes para isolar os micróbios. Micróbios podem ser obtidos plantando sementes em diversas amostras de solo e recuperando micróbios de tecidos. Adicionalmente, os micróbios podem ser obtidos inoculando plantas com micróbios exógenos e determinando quais micróbios aparecem nos tecidos das plantas. Exemplos não limitativos de tecidos vegetais podem incluir uma semente, plântula, folha, cortes, planta, bulbo ou tubérculo.

[00171] Um método de obtenção de micróbios pode ser através do isolamento de bactérias do solo. As bactérias podem ser coletadas de vários tipos de solo. Em alguns exemplos, o solo pode ser caracterizado por características como alta ou baixa fertilidade, níveis de umidade, níveis de minerais e várias práticas de cultivo. Por exemplo, o solo pode estar envolvido em uma rotação de culturas, onde diferentes culturas são plantadas no mesmo solo em épocas de plantio sucessivas. O crescimento sequencial de diferentes cultivos no mesmo solo pode evitar o esgotamento desproporcional de certos minerais. A bactéria pode ser isolada das plantas que crescem nos solos selecionados. As mudas podem ser colhidas em 2-6 semanas de crescimento. Por exemplo, pelo menos 400 isolados podem ser coletados em uma rodada de colheita. Os tipos de solo e planta revelam o fenótipo da planta, bem como as condições, que permitem o enriquecimento a jusante de certos fenótipos.

[00172] Micróbios podem ser isolados de tecidos vegetais para avaliar características microbianas. Os parâmetros para processamento de amostras de tecido podem ser variados para isolar diferentes tipos de micróbios associativos, tais como, bactérias rizoféricas, epífitas ou endófitas. Os isolados podem ser cultivados em meio sem nitrogênio para enriquecimento de bactérias que realizam a fixação de nitrogênio. Alternativamente, os micróbios podem ser obtidos em bancos globais de cepas.

[00173] As análises in planta são realizadas para avaliar as características microbianas. Em algumas modalidades, o tecido da planta pode ser processado para triagem por processamento de alto rendimento para DNA e RNA. Adicionalmente, medições não invasivas podem ser usadas para avaliar as características da planta, tal como a colonização. As medições de micróbios selvagens podem ser obtidas planta a planta. As medições de micróbios selvagens também podem ser obtidas no campo usando métodos de rendimento médio. As medições podem ser feitas sucessivamente ao longo do tempo. O sistema de planta modelo pode ser usado incluindo, mas não se limitando a Setaria.

[00174] Micróbios em um sistema de planta podem ser triados via perfil transcricional de um micróbio em um sistema de planta. Exemplos de triagem por meio de perfis transcricionais são o uso de métodos de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), códigos de barras moleculares para detecção de transcrição, sequenciamento de última geração e rotulação de micróbios com marcadores fluorescentes. Os fatores de impacto podem ser medidos para avaliar a colonização na estufa incluindo, mas não se limitando a, microbioma, fatores abióticos, condições do solo, oxigênio, umidade, temperatura, condições de inóculo e localização da raiz. A fixação de nitrogênio pode ser avaliada em bactérias medindo 15 gás de N/fertilizante (diluição) com IRMS ou NanoSIMS, como descrito nesse documento. NanoSIMS é espectrometria de massa de íons secundários de alta resolução. A técnica NanoSIMS é uma forma de investigar a atividade química de amostras biológicas. A catálise da redução das reações de oxidação que impulsionam o metabolismo dos microrganismos pode ser investigada a nível celular, subcelular, molecular e elementar. O NanoSIMS pode fornecer alta resolução espacial maior que 0,1 µm. O NanoSIMS pode detectar o uso de traçadores de isótopos, tais como 13C, 15N e 18O. Portanto, o NanoSIMS pode ser usado para a atividade química do nitrogênio na célula.

[00175] Estufas automatizadas podem ser usadas para análises in planta. As métricas da planta em resposta à exposição microbiana incluem, mas não estão limitadas a,

biomassa, análise de cloroplasto, câmera CCD, medições de tomografia volumétrica.

[00176] Uma forma de enriquecer uma população de micróbios é de acordo com o genótipo. Por exemplo, um ensaio de reação em cadeia da polimerase (PCR) com um iniciador direcionado ou iniciador específico. Os iniciadores projetados para o gene nifH podem ser usados para identificar os diazotróficos porque os diazotróficos expressam o gene nifH no processo de fixação de nitrogênio. Uma população microbiana também pode ser enriquecida por meio de abordagens independentes de cultura de célula única e abordagens de isolamento guiadas por quimiotaxia. Alternativamente, o isolamento direcionado de micróbios pode ser realizado através da cultura dos micróbios em meios de seleção. Abordagens premeditadas para enriquecer populações microbianas para características desejadas podem ser guiadas por dados de bioinformática e são descritas nesse documento. Enriquecimento para Micróbios com Capacidades de Fixação de Nitrogênio Usando Bioinformática

[00177] Ferramentas de bioinformática podem ser usadas para identificar e isolar rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPRs), que são selecionadas com base em sua capacidade de realizar a fixação de nitrogênio. Micróbios com alta capacidade de fixação de nitrogênio podem promover características favoráveis nas plantas. Os modos de análise de bioinformática para a identificação de PGPRs incluem, mas não estão limitados a, genômica, metagenômica, isolamento direcionado, sequenciamento de genes, sequenciamento de transcriptoma e modelagem.

[00178] A análise genômica pode ser usada para identificar PGPRs e confirmar a presença de mutações com métodos de Sequenciamento de Próxima Geração como descrito nesse documento e controle de versão de micróbio.

[00179] A metagenômica pode ser usada para identificar e isolar PGPR usando um algoritmo de predição para colonização. Os metadados também podem ser usados para identificar a presença de uma cepa manipulada geneticamente em amostras ambientais e de estufa.

[00180] O sequenciamento transcriptômico pode ser usado para prever genótipos que levam a fenótipos PGPR. Adicionalmente, os dados transcriptômicos são usados para identificar promotores para alterar a expressão gênica. Os dados transcriptômicos podem ser analisados em conjunto com a Sequência do Genoma Completo (WGS) para gerar modelos de metabolismo e redes reguladoras de genes. Domesticação de Micróbios

[00181] Micróbios isolados da natureza podem sofrer um processo de domesticação em que os micróbios são convertidos em uma forma que é geneticamente rastreável e identificável. Uma maneira de domesticar um micróbio é manipulá-lo geneticamente com resistência a antibióticos. O processo de manipulação genética da resistência aos antibióticos pode começar determinando a sensibilidade aos antibióticos na cepa microbiana de tipo selvagem. Se a bactéria for sensível ao antibiótico, ele pode ser um bom candidato para a manipulação genética de resistência a antibióticos. Subsequentemente, um gene resistente a antibióticos ou um vetor suicida contrasselecionável pode ser incorporado no genoma de um micróbio usando métodos de recombinação. Um vetor suicida contrasselecionável pode consistir em uma eliminação do gene de interesse, um marcador selecionável e o marcador contrasselecionável sacB. A contrasseleção pode ser usada para trocar sequências de DNA microbiano nativas com genes resistentes a antibióticos. Um método de rendimento médio pode ser usado para avaliar vários micróbios simultaneamente, permitindo a domesticação paralela. Os métodos alternativos de domesticação incluem o uso de nucleases de homing para evitar que as sequências do vetor suicida entrem em enovelamento ou obtenham sequências do vetor intervenientes.

[00182] Os vetores de DNA podem ser introduzidos em bactérias por meio de vários métodos, incluindo eletroporação e transformações químicas. Uma biblioteca padrão de vetores pode ser usada para transformações. Um exemplo de um método de edição de genes é CRISPR precedido por testes Cas9 para garantir a atividade de Cas9 nos micróbios. Manipulação genética Não Transgênica de Micróbios

[00183] Uma população microbiana com características favoráveis pode ser obtida via evolução direcionada. A evolução direta é uma abordagem em que o processo de seleção natural é imitado para desenvolver proteínas ou ácidos nucleicos em direção a um objetivo definido pelo usuário. Um exemplo de evolução direta é quando mutações aleatórias são introduzidas em uma população microbiana, os micróbios com as características mais favoráveis são selecionados e o crescimento dos micróbios selecionados é continuado. As características mais favoráveis em rizobactérias promotoras de crescimento (PGPRs) podem estar na fixação de nitrogênio. O método de evolução direcionada pode ser iterativo e adaptativo com base no processo de seleção após cada iteração.

[00184] Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPRs) com alta capacidade de fixação de nitrogênio podem ser geradas. A evolução dos PGPRs pode ser realizada por meio da introdução da variação genética. A variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese direcionada por oligonucleotídeos, mutagênese de saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações dos mesmos. Essas abordagens podem introduzir mutações aleatórias na população microbiana. Por exemplo, os mutantes podem ser gerados usando DNA ou RNA sintético via mutagênese direcionada por oligonucleotídeo. Os mutantes podem ser gerados usando ferramentas contidas em plasmídeos, que são posteriormente curados. Genes de interesse podem ser identificados usando bibliotecas de outras espécies com características melhoradas, incluindo, mas não se limitando a, propriedades de PGPR melhoradas, colonização melhoradas de cereais, sensibilidade aumentada ao oxigênio, fixação aumentada de nitrogênio e excreção aumentada de amônia. Genes intragenéricos podem ser projetados com base nessas bibliotecas usando software tal como o software de projeto Geneious ou Platypus. As mutações podem ser projetadas com a ajuda de aprendizado de máquina. As mutações podem ser projetadas com o auxílio de um modelo metabólico. O projeto automatizado da mutação pode ser feito usando a la Platypus e guiará RNAs para mutagênese direcionada por Cas.

[00185] Os genes intragenéricos podem ser transferidos para o micróbio hospedeiro. Adicionalmente, os sistemas repórteres também podem ser transferidos para o micróbio. Os sistemas repórteres caracterizam os promotores, determinam o sucesso da transformação, triam mutantes e atuam como ferramentas de triagem negativo.

[00186] Os micróbios que carregam a mutação podem ser cultivados por meio de passagens em série. Uma colônia microbiana contém uma única variante do micróbio. As colônias microbianas são triadas com o auxílio de um coletor de colônias automatizado e manipulador de líquidos. Mutantes com duplicação de genes e aumento do número de cópias expressam um genótipo superior da característica desejada. Seleção de micróbios promotores de crescimento de plantas com base na fixação de nitrogênio

[00187] As colônias microbianas podem ser triadas usando vários ensaios para avaliar a fixação de nitrogênio. Uma maneira de medir a fixação de nitrogênio é por meio de um único ensaio fermentativo, que mede a excreção de nitrogênio. Um método alternativo é o ensaio de redução de acetileno (ARA) com amostragem em linha ao longo do tempo. ARA pode ser realizado em placas de alto rendimento de matrizes de microtubos. ARA pode ser realizado com plantas vivas e tecidos de planta. A formulação do meio e a concentração de oxigênio do meio podem ser variadas em ensaios ARA. Outro método de triagem de variantes microbianas é o uso de biossensores. O uso de NanoSIMS e microespectroscopia Raman pode ser usado para investigar a atividade dos micróbios. Em alguns casos, as bactérias também podem ser cultivadas e expandidas usando métodos de fermentação em biorreatores. Os biorreatores são projetados para melhorar a robustez do crescimento de bactérias e diminuir a sensibilidade das bactérias ao oxigênio. Microfermentadores com base em placa de TP médio a alto são usados para avaliar a sensibilidade ao oxigênio, necessidades nutricionais, fixação de nitrogênio e excreção de nitrogênio. As bactérias também podem ser cocultivadas com micróbios competitivos ou benéficos para elucidar as vias crípticas. A citometria de fluxo pode ser usada para triar bactérias que produzem altos níveis de nitrogênio usando indicadores químicos, colorimétricos ou fluorescentes. As bactérias podem ser cultivadas na presença ou ausência de uma fonte de nitrogênio. Por exemplo, as bactérias podem ser cultivadas com glutamina, amônia, ureia ou nitratos. Remodelação Microbiana Guiada - Uma Visão Geral

[00188] A remodelação microbiana guiada é um método para identificar e melhorar sistematicamente o papel das espécies dentro do microbioma da cultura. Em alguns aspectos, e de acordo com uma metodologia particular de agrupamento/categorização, o método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas por mapeamento de interações planta-micróbio e previsão de redes reguladoras ligadas a um fenótipo particular, 2) melhoria pragmática e previsível de fenótipos microbianos por meio do cruzamento intraespécies de redes reguladoras e grupamentos de genes dentro do genoma de um micróbio e 3) triagem e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de cultura desejados.

[00189] Para avaliar sistematicamente a melhoria das cepas, um modelo é criado que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies-

chave. O modelo é usado para prever genes alvos para remodelação genética não intergenérica (isto é, manipulação genética da arquitetura genética do micróbio de uma forma não transgênica). Ver a FIG. 1A para uma representação gráfica de uma modalidade do processo.

[00190] Como ilustrado na FIG. 1A, a melhoria racional do microbioma da cultura pode ser usada para aumentar a biodiversidade do solo, ajustar o impacto das espécies-chave e/ou alterar o tempo e a expressão de importantes vias metabólicas.

[00191] Para esse fim, foi desenvolvida uma plataforma para identificar e melhorar o papel das cepas dentro do microbioma da cultura. Em alguns aspectos, esse processo foi chamado de melhoramento microbiano.

[00192] O processo de “Remodelação Microbiana Guiada” acima mencionado será mais elaborado nos Exemplos, por exemplo, no Exemplo 1, intitulado: “Remodelação Microbiana Guiada - Uma Plataforma para o Melhoramento Racional de Espécies Microbianas para Agricultura." Passagem em série

[00193] A produção de bactérias para melhorar as características das plantas (por exemplo, fixação de nitrogênio) pode ser alcançada por meio de passagens em série. A produção dessas bactérias pode ser feita por meio da seleção de plantas, que possuem uma característica melhorada particular que é influenciada pela flora microbiana, além de identificar bactérias e/ou composições que são capazes de transmitir uma ou mais características melhoradas a uma ou mais planta(s). Um método de produção de uma bactéria para melhorar uma característica da planta inclui as etapas de: (a) isolar a bactéria do tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introduzir uma variação genética em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactéria(s) variante(s); (c) expor uma pluralidade de plantas às bactérias variantes; (d) isolar bactérias de tecido ou solo de uma da pluralidade de plantas, em que a planta da qual a bactéria é isolada tem uma característica melhorada em relação a outras plantas na pluralidade de plantas; e (e) repetir as etapas (b) a (d) com bactérias isoladas da planta com uma característica melhorada (etapa (d)). As etapas (b) a (d) podem ser repetidas qualquer número de vezes (por exemplo, uma, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, dez vezes ou mais) até que a característica melhorada em uma planta atinja um nível desejado. Além disso, a pluralidade de plantas pode ser mais de duas plantas, tal como 10 a 20 plantas, ou 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou 1000 ou mais plantas.

[00194] Além de obter uma planta com uma característica melhorada, uma população bacteriana compreendendo bactérias compreendendo uma ou mais de variações genéticas introduzidas em um ou mais de genes (por exemplo, genes que regulam a fixação de nitrogênio) é obtida. Ao repetir as etapas descritas acima, uma população de bactérias pode ser obtida que inclui os membros mais apropriados da população que se correlacionam com uma característica da planta de interesse. As bactérias nessa população podem ser identificadas e suas propriedades benéficas determinadas, tal como por análise genética e/ou fenotípica. A análise genética pode ocorrer de bactérias isoladas na etapa (a). Informações fenotípicas e/ou genotípicas podem ser obtidas usando técnicas, incluindo: triagem de alto rendimento de componentes químicos de origem vegetal, técnicas de sequenciamento, incluindo sequenciamento de alto rendimento de material genético, técnicas de exibição diferencial (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjo de ácido nucleico, sequenciamento de RNA (Sequenciamento Shotgun de Transcriptoma Inteiro) e qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real). As informações obtidas podem ser usadas para obter informações de perfilação da comunidade sobre a identidade e a atividade das bactérias presentes, tal como a análise filogenética ou a triagem baseada em microarranjo de ácidos nucleicos que codificam para componentes de operons rRNA ou outros loci taxonomicamente informativos. Exemplos de loci taxonomicamente informativos incluem gene de rRNA 16S, gene de rRNA 23S, gene de rRNA 5S, gene de rRNA 5.8S, gene de rRNA 12S, gene de rRNA 18S, gene de rRNA 28S, gene gyrB, gene rpoB, gene fusA, gene recA, gene coxl, gene nifD. Processos de exemplo de perfilação taxonômica para determinar táxons presentes em uma população são descritos em US20140155283. A identificação bacteriana pode compreender a caracterização da atividade de um ou mais de genes ou uma ou mais de vias de sinalização, tais como genes associados à via de fixação de nitrogênio. Interações sinergísticas (onde dois componentes, em virtude de sua combinação, aumentam um efeito desejado em mais de uma quantidade aditiva) entre diferentes espécies bacterianas também podem estar presentes nas populações bacterianas. Variação genética - Localizações e Fontes de Alteração Genômica

[00195] A variação genética pode ser uma variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador transcricional, ativador anti- transcricional, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina ou NAD+-dinitrogênio redutase aDP-D- ribosiltransferase. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: aumento da expressão ou atividade de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; diminuição da atividade de remoção de adenilil e de GlnE; ou diminuição da atividade de remoção de uridilil e de GlnD. A variação genética pode ser uma variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, uma variação genética pode ser uma variação em qualquer um dos genes descritos ao longo dessa revelação.

[00196] A introdução de uma variação genética pode compreender a inserção e/ou eliminação de um ou mais nucleotídeos em um sítio alvo, tais como, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ou mais nucleotídeos. A variação genética introduzida em uma ou mais de bactérias dos métodos revelados nesse documento pode ser uma mutação por inativação (por exemplo, eliminação de um promotor, inserção ou eliminação para produzir um códon de parada prematuro,

eliminação de um gene inteiro), ou pode ser eliminação ou abolição da atividade de um domínio de proteína (por exemplo, mutação pontual que afeta um sítio ativo, ou eliminação de uma porção de um gene que codifica a porção relevante do produto de proteína), ou pode alterar ou abolir uma sequência reguladora de um gene alvo.

Uma ou mais de sequências reguladoras também pode(m) ser inserida(s), incluindo sequências reguladoras heterólogas e sequências reguladoras encontradas dentro de um genoma de um(a) espécie ou gênero bacteriana(o) correspondente à bactéria na qual a variação genética é introduzida.

Além disso, as sequências reguladoras podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou em um tecido de planta.

A variação genética pode ser uma variação genética predeterminada que é introduzida especificamente em um sítio alvo.

A variação genética pode ser uma mutação aleatória no sítio alvo.

A variação genética pode ser uma inserção ou eliminação de um ou mais nucleotídeo(s). Em alguns casos, uma pluralidade de variações genéticas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais) é introduzida em uma ou mais das bactérias isoladas antes de expor as bactérias a plantas para avaliar a melhoria da característica.

A pluralidade de variações genéticas pode ser qualquer um dos tipos acima, os mesmos tipos ou diferentes, e em qualquer combinação.

Em alguns casos, uma pluralidade de diferentes variações genéticas é introduzida em série, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma segunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento e assim por diante, de modo a acumular uma pluralidade de variações genéticas em bactérias na transmitindo progressivamente características melhoradas nas plantas associadas. Variação genética - Métodos de Introdução de Alteração Genômica

[00197] Em geral, o termo “variação genética” refere-se a qualquer alteração introduzida em uma sequência de polinucleotídeos em relação a um polinucleotídeo de referência, tal como um genoma de referência ou porção do mesmo, ou gene de referência ou porção do mesmo. Uma variação genética pode ser referida como uma “mutação” e um(a) sequência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser referida como um(a) “variante genética” ou “mutante". As variações genéticas podem ter vários efeitos, tal como o aumento ou a diminuição de alguma atividade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinalização celular. As variações genéticas podem ser introduzidas especificamente em um sítio de destino, ou introduzidas aleatoriamente. Uma variedade de ferramentas e métodos moleculares é disponível para a introdução da variação genética. Por exemplo, a variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese dirigida por oligonucleotídeos, mutagênese de saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, manipulação genética por recombinação, recombinação mediada por vermelho lambda, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações das mesmas. Métodos químicos de introdução de variação genética incluem a exposição de DNA a um mutagênico químico, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosoureia (EN U), N-metil-N-nitro-N′-

nitrosoguanidina, N-óxido de 4-nitroquinolina, dietilssulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda nitrogenada, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, cloridrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12 dimetilbenz(a)antraceno, clorambucil, hexametilfosforamida, bissulfano e semelhantes.

Os agentes indutores de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação , raios-X e bombardeio rápido de nêutrons.

A variação genética também pode ser introduzida em um ácido nucleico usando, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta.

A inserção aleatória ou direcionada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento transponível, é outro método adequado para gerar variação genética.

As variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico durante a amplificação em um sistema in vitro sem células, por exemplo, usando uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como PCR propensa a erros.

Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico in vitro usando técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de éxon, troca de domínio e semelhantes). Variações genéticas também podem ser introduzidas em um ácido nucleico como um resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de DNA em uma célula, por exemplo, a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mutante deve gerar uma alta frequência de mutações (isto é, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10.000 genes) no genoma da célula.

Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, mas não estão limitados a, Mut H, Mut S, Mut L,

e Mut U, e seus homólogos em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 e semelhantes). Descrições de exemplo de vários métodos para a introdução de variações genéticas são fornecidas em, por exemplo, Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:10747-10751; e U.S. Pat. Nos 6.033.861, e 6.773.900.

[00198] As variações genéticas introduzidas em micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intragenéricas, intergenéricas, sintéticas, evoluídas, rearranjadas ou SNPs.

[00199] A variação genética pode ser introduzida em numerosas vias metabólicas dentro dos micróbios para provocar melhorias nas características descritas acima. As vias representativas incluem as vias de captação de enxofre, biossíntese de glicogênio, a via de regulação da glutamina, a via de captação de molibdênio, a via de fixação de nitrogênio, assimilação de amônia, excreção ou secreção de amônia, absorção de nitrogênio, biossíntese de glutamina, annamox, solubilização de fosfato, transporte de ácido orgânico, produção de ácido orgânico, produção de aglutininas, genes de eliminação de radicais de oxigênio reativos, biossíntese de ácido indol acético, biossíntese de trealose, enzimas ou vias de degradação da parede celular de plantas, genes de afixação de raízes, secreção de exopolissacarídeo, via de glutamato sintase, vias de absorção de ferro, via de sideróforo, via de quitinase, ACC desaminase, biossíntese de glutationa, genes de sinalização de fósforo, via de extinção de quorum, vias de citocromo, via de hemoglobina, via semelhante à hemoglobina bacteriana,

RNA pequeno rsmZ, biossíntese de rizobitoxina, proteína de adesão lapA, via de percepção de quorum AHL, biossíntese de fenazina, biossíntese de lipopeptídeos cíclicos e produção de antibiótico.

[00200] Sistemas CRISPR/Cas9 (repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas em grupamento)/associados a CRISPR (Cas) podem ser usados para introduzir as mutações desejadas. O CRISPR/Cas9 fornece às bactérias e arqueas imunidade adaptativa contra vírus e plasmídeos usando RNAs CRISPR (crRNAs) para orientar o silenciamento de ácidos nucléicos invasores. A proteína Cas9 (ou equivalente funcional e/ou variante da mesma, isto é, proteína semelhante a Cas9) contém naturalmente atividade de endonuclease de DNA que depende da associação da proteína com duas moléculas de RNA sintéticas ou de ocorrência natural chamadas crRNA e tracrRNA (também chamadas de RNAs guia) Em alguns casos, as duas moléculas são ligadas covalentemente para formar uma única molécula (também chamada de um único RNA guia (“sgRNA”). Assim, a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 se associa a um RNA que tem como alvo DNA (cujo termo abrange tanto a configuração de RNA guia de duas moléculas e a configuração de RNA guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 e guia a proteína para uma sequência de ácidos nucleicos alvo. Se a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 retiver sua função enzimática natural, ele clivará o DNA alvo para criar uma quebra de fita dupla, que pode levar à alteração do genoma (isto é, edição, eliminação, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição etc.), alterando assim a expressão gênica. Algumas variantes de Cas9 (cujas variantes são englobadas pelo termo semelhante a Cas9) foram alteradas de modo que tenham uma atividade de clivagem de DNA diminuída (em alguns casos, eles clivam uma única fita em vez de ambas as fitas do DNA alvo, enquanto em outros casos, foi severamente reduzida à nenhuma atividade de clivagem de DNA). Outras descrições exemplificativas de sistemas CRISPR para a introdução de variação genética podem ser encontradas em, por exemplo, US8795965.

[00201] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese por reação em cadeia da polimerase (PCR) usa iniciadores mutagênicos para introduzir as mutações desejadas. O PCR é realizado por ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Após a amplificação por PCR, a seleção do DNA mutado e a remoção do DNA do plasmídeo precursor podem ser realizadas por: 1) substituição de dCTP por dCTP hidroximetilado durante a PCR, seguida por digestão com enzimas de restrição para remover apenas o DNA precursor não hidroximetilado; 2) mutagênese simultânea de um gene de resistência a antibióticos e do gene estudado mudando o plasmídeo para uma resistência diferente a antibióticos, a nova resistência a antibióticos facilitando a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) após a introdução de uma mutação desejada, digestão do DNA molde metilado precursor pela enzima de restrição Dpnl que cliva apenas DNA metilado, através do qual as cadeias não metiladas mutagenizadas são recuperadas; ou 4) circularização dos produtos de PCR mutados em uma reação de ligação adicional para aumentar a eficiência de transformação do DNA mutado. Uma descrição adicional de métodos exemplificativos pode ser encontrada em, por exemplo, US7132265, US6713285, US6673610, US6391548,

US5789166, US5780270, US5354670, US5071743 e US20100267147.

[00202] A mutagênese dirigida a oligonucleotídeo, também chamada de mutagênese dirigida ao local, normalmente utiliza um iniciador de DNA sintético. Esse iniciador sintético contém a mutação desejada e é complementar ao DNA molde em torno do sítio da mutação, de modo que possa hibridizar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma única mudança de base (uma mutação pontual), múltiplas mudanças de base, eliminação ou inserção, ou uma combinação das mesmas. O iniciador de fita simples é então estendido usando uma DNA polimerase, que copia o resto do gene. O gene assim copiado contém o sítio mutado, e pode então ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Finalmente, os mutantes podem ser selecionados por sequenciamento de DNA para verificar se eles contêm a mutação desejada.

[00203] As variações genéticas podem ser introduzidas usando PCR propensa a erros. Nessa técnica, o gene de interesse é amplificado usando uma DNA polimerase sob condições que são deficientes na fidelidade de replicação da sequência. O resultado é que os produtos de amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o(s) produto(s) resultante(s) da reação conté(ê)m uma ou mais de alterações na sequência quando comparadas à molécula modelo, os produtos resultantes são mutagenizados em comparação com o molde. Outro meio de introduzir mutações aleatórias é expor as células a um mutagênico químico, tal como nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat Res junho de 1975; 28 (3): 323-30), e o vetor contendo o gene é então isolado do hospedeiro.

[00204] A mutagênese por saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual se tenta gerar todas ou quase todas as mutações possíveis em um sítio específico ou região estreita de um gene. Em um sentido geral, a mutagênese de saturação compreende a mutagenização de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem, por exemplo, 1-500 bases de comprimento) na sequência de polinucleotídeos definida a ser mutagenizada (em que a sequência a ser mutagenizada é, por exemplo, de 15 a 100.000 bases de comprimento). Portanto, um grupo de mutações (por exemplo, variando de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações a ser introduzido em um cassete pode ser diferente ou o mesmo de um segundo agrupamento de mutações a ser introduzido em um segundo cassete durante a aplicação de uma rodada de mutagênese de saturação. Tais agrupamentos são exemplificados por eliminações, adições, agrupamentos de códons específicos e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos específicos.

[00205] A mutagênese por embaralhamento de fragmentos, também chamada de embaralhamento de DNA, é uma forma de propagar mutações benéficas rapidamente. Em um exemplo de um processo de embaralhamento, DNAse é usado para fragmentar um conjunto de genes precursores em pedaços de, por exemplo, cerca de 50-100 bp de comprimento. Isto é então seguido por uma reação em cadeia da polimerase (PCR) sem iniciadores - fragmentos de DNA com sequência homóloga sobreposta suficiente se anelam entre si e são então estendidos pela DNA polimerase. Várias rodadas dessa extensão de PCR podem ocorrer, depois que algumas das moléculas de DNA atingirem o tamanho dos genes precursores. Esses genes podem então ser amplificados com outro PCR, dessa vez com a adição de iniciadores que são projetados para complementar as extremidades das fitas. Os iniciadores podem ter sequências adicionais adicionadas às suas extremidades 5’, tais como sequências para sítios de reconhecimento de enzimas de restrição necessários para ligação a um vector de clonagem. Outros exemplos de técnicas de embaralhamento são fornecidos em US20050266541.

[00206] A mutagênese de recombinação homóloga envolve a recombinação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência de polinucleotídeos alvo. Depois que ocorre uma quebra de fita dupla, seções de DNA em torno das extremidades 5’ da quebra são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão da fita a seguir, uma extremidade 3’ projetada da molécula de DNA quebrada “invade” uma molécula de DNA similar ou idêntica que não está quebrada. O método pode ser usado para eliminar um gene, remover éxons, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagênese por recombinação homóloga pode ser permanente ou condicional. Tipicamente, um molde de recombinação também é fornecido. Um molde de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em algumas modalidades, um modelo de recombinação é projetado para servir como um molde em recombinação homóloga, tal como dentro ou perto de uma sequência alvo descontinuada ou clivada por uma nuclease específica de sítio. Um polinucleotídeo molde pode ser de qualquer comprimento adequado, tal como cerca ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo molde é complementar a uma porção de um polinucleotídeo que compreende a sequência alvo. Quando alinhado de maneira ideal, um polinucleotídeo molde pode se sobrepor a um ou mais de nucleotídeos de sequências alvo (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência molde e um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo estão alinhados de forma ideal, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo moldes está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 ou mais nucleotídeos da sequência alvo. Exemplos não limitativos de nucleases dirigidas ao sítio úteis em métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedo de zinco, CRISPR nucleases, TALE nucleases e meganuclease. Para uma descrição mais detalhada do uso de tais nucleases, ver, por exemplo, US8795965 e US20140301990.

[00207] Mutagênicos que criam principalmente mutações pontuais e eliminações, inserções, transversões e/ou transições curtas, incluindo mutagênicos químicos ou radiação, podem ser usados para criar variações genéticas. Os mutagênicos incluem, mas não estão limitados a, etil metanossulfonato, metilmetanossulfonato, N-etil-N- nitrosoureia, trietilmelamina, N-metil-N-nitrosoureia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, dietil sulfato, monômero de acrilamida, melfalano, mostarda nitrogenada, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N’-nitro- Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno,

hexametilfosforamida, bissulfano, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano, diepoxibutano, e outros semelhantes), dicloridrato de 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2- cloro-etil)aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[00208] A introdução da variação genética pode ser um processo incompleto, de modo que algumas bactérias em uma população tratada de bactérias carreguem uma mutação desejada, enquanto outras não. Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção de modo a enriquecer para bactérias portadoras de uma variação genética desejada. Tradicionalmente, a seleção de variantes genéticas bem sucedidas envolveu a seleção a favor ou contra alguma funcionalidade conferida ou abolida pela variação genética, como no caso de inserir o gene de resistência a antibióticos ou abolir uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. Também é possível aplicar uma pressão de seleção com base na própria sequência de polinucleotídeos, de modo que apenas uma variação genética desejada precise ser introduzida (por exemplo, sem exigir também um marcador selecionável). Nesse caso, a pressão de seleção pode compreender a clivagem de genomas sem a variação genética introduzida em um sítio alvo, de modo que a seleção seja eficazmente direcionada contra a sequência de referência na qual a variação genética é procurada para ser introduzida. Tipicamente, a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do sítio alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10 ou menos nucleotídeos do sítio alvo, incluindo clivagem no ou dentro do sítio alvo). A clivagem pode ser dirigida por uma nuclease específica de sítio selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma

CRISPR nuclease, uma TALE nuclease (TALEN) e uma meganuclease. Tal processo é similar a processos para intensificar a recombinação homóloga em um sítio alvo, exceto que nenhum molde para recombinação homóloga é fornecido. Como resultado, as bactérias sem a variação genética desejada têm maior probabilidade de sofrer clivagem que, se não for reparada, resulta na morte celular. As bactérias que sobrevivem à seleção podem então ser isoladas para uso na exposição a plantas para avaliar a atribuição de uma característica melhorada.

[00209] Uma CRISPR nuclease pode ser usada como a nuclease específica do sítio para direcionar a clivagem para um sítio alvo. Uma seleção melhorada de micróbios mutados pode ser obtida usando Cas9 para matar células não mutadas. As plantas são então inoculadas com os micróbios mutantes para reconfirmar a simbiose e criar pressão evolutiva para selecionar simbiontes eficientes. Os micróbios podem então ser isolados de novo dos tecidos das plantas. Os sistemas de CRISPR nuclease empregados para seleção contra não variantes podem empregar elementos similares aos descritos acima no que se refere à introdução de variação genética, exceto que nenhum molde para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem direcionada ao sítio alvo intensifica, portanto, a morte das células afetadas.

[00210] Outras opções para induzir especificamente a clivagem em um sítio alvo estão disponíveis, tais como nucleases de dedo de zinco, sistemas de TALE nuclease (TALEN) e meganuclease. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são endonucleases de DNA artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA.

ZFNs podem ser manipuladas geneticamente para terem como alvo as sequências de DNA desejadas e isso permite que as nucleases de dedo de zinco clivem as sequências alvo únicas.

Quando introduzidas em uma célula, as ZFNs podem ser usadas para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo quebras de fita dupla.

As nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) são endonucleases de DNA artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de DNA efetor TAL (semelhante a ativador de transcrição) a um domínio de clivagem de DNA.

As TALENS podem ser rapidamente manipuladas geneticamente para se ligarem a praticamente qualquer sequência de DNA desejada e, quando introduzidas em uma célula, as TALENs podem ser usadas para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo quebras de fita dupla.

Meganucleases (endonuclease de homing) são endodeoxirribonucleases caracterizadas por um grande sítio de reconhecimento (sequências de DNA de fita dupla de 12 a 40 pares de bases.

As meganucleases podem ser usadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de uma forma altamente direcionada.

Modificando sua sequência de reconhecimento por meio da manipulação genética da proteína, a sequência direcionada pode ser alterada.

As meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, sejam bacterianos, vegetais ou animais e são comumente agrupados em quatro famílias: a família LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1), a família GIY-YIG, a família da caixa His-Cyst e a família HNH.

Endonucleases de homing exemplificativas incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I- PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e

I-TevIII. Variação Genética - Métodos de Identificação

[00211] Os micróbios da presente revelação podem ser identificados por uma ou mais de modificações ou alterações genéticas, que foram introduzidas no referido micróbio. Um método pelo qual a referida modificação ou alteração genética pode ser identificada é por meio de referência a uma SEQ ID NO que contém uma porção da sequência genômica do micróbio que é suficiente para identificar a modificação ou alteração genética.

[00212] Além disso, no caso de micróbios que não tiveram uma modificação ou alteração genética (por exemplo, um tipo selvagem, WT) introduzida em seus genomas, a revelação pode utilizar sequências de ácidos nucleicos 16S para identificar os referidos micróbios. Uma sequência de ácidos nucleicos 16S é um exemplo de um “marcador molecular” ou “marcador genético”, que se refere a um indicador que é usado em métodos para visualizar diferenças nas características de sequências de ácidos nucleicos. Exemplos de outros indicadores são marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mutações por inserção, marcadores de microssatélites (SSRs), regiões amplificadas caracterizadas por sequência (SCARs), marcadores de sequência polimórfica amplificada clivada (CAPS) ou marcadores de isozima ou combinações dos marcadores descritos nesse documento que definem uma localização genética e cromossômica específica. Os marcadores incluem adicionalmente sequências de polinucleotídeos que codificam rRNA 16S ou 18S e sequências espaçadoras transcritas internas (ITS), que são sequências encontradas entre genes de rRNA de subunidade pequena e subunidade grande que provaram ser especialmente úteis na elucidação de relações ou distinções quando comparados com um outro. Além disso, a revelação utiliza sequências únicas encontradas em genes de interesse (por exemplo, nif H,D,K,L,A, glnE, amtB, etc.) para identificar os micróbios revelados nesse documento.

[00213] A estrutura primária da subunidade 16S de rRNA principal compreende uma combinação particular de regiões conservadas, variáveis e hipervariáveis que evoluem em taxas diferentes e permitem a resolução de linhagens muito antigas, tais como domínios, e linhagens mais modernas, tais como gêneros. A estrutura secundária da subunidade 16S inclui aproximadamente 50 hélices que resultam no pareamento de bases de cerca de 67% dos resíduos. Essas características estruturais secundárias altamente conservadas são de grande importância funcional e podem ser usadas para garantir homologia posicional em alinhamentos de sequência múltipla e análise filogenética. Nas décadas anteriores, o gene de rRNA 16S tornou-se o marcador taxonômico mais sequenciado e é o pilar para a classificação sistemática atual de bactérias e arquéias (Yarza et al. 2014. Nature Rev. Micro. 12:635- 45).

[00214] Assim, em certos aspectos, a revelação fornece uma sequência, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer sequência nas Tabelas 23, 24, 30, 31 e 32.

[00215] Assim, em certos aspectos, a revelação prevê um micróbio que compreende uma sequência, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 62-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas 31 e 32.

[00216] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos 16S, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 32.

[00217] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 86- 95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158 -166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 32.

[00218] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%,

75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 177- 260, 296-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 32.

[00219] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende, ou iniciador que compreende, ou sonda que compreende, ou sequência de junção não nativa que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 304-

424. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 30.

[00220] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de junção não nativa que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 372-

405. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 30.

[00221] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de aminoácidos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 77, 78, 81, 82 ou 83. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 31. Variação Genética - Métodos de Detecção: Iniciadores, Sondas E Ensaios

[00222] A presente revelação ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detectar os micróbios ensinados nesse documento. Em alguns aspectos, a revelação fornece métodos de detecção das cepas precursoras WT. Em outros aspectos, a revelação fornece métodos de detecção de micróbios manipulados geneticamente não intergenéricos derivados das cepas WT. Em aspectos, a presente revelação fornece métodos de identificação de alterações genéticas não intergenéricas em um micróbio.

[00223] Em aspectos, os métodos de manipulação genética genômica da presente revelação levam à criação de sequências de “junção” de nucleotídeos não naturais nos micróbios não intergenéricos derivados. Essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética particular em um micróbio ensinado nesse documento.

[00224] As presentes técnicas são capazes de detectar essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos de PCR quantitativos especializados, incluindo iniciadores e sondas concebidos exclusivamente. Em alguns aspectos, as sondas da revelação ligam-se às sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural. Em alguns aspectos, o PCR tradicional é utilizado. Em outros aspectos, a PCR em tempo real é utilizada. Em alguns aspectos, é utilizado PCR quantitativo (qPCR).

[00225] Assim, a revelação pode abranger a utilização de dois métodos comuns para a detecção de produtos de PCR em tempo real: (1) corantes fluorescentes não específicos que intercalam com qualquer DNA de fita dupla e (2) sondas de DNA específicas de sequência consistindo em oligonucleotídeos que são rotulados com um repórter fluorescente que permite a detecção apenas após a hibridização da sonda com sua sequência complementar. Em alguns aspectos, apenas a junção de nucleotídeos de ocorrência não natural será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Em outros aspectos, os iniciadores da revelação são escolhidos de modo que os iniciadores flanqueiam ambos os lados de uma sequência de junção, de modo que se uma reação de amplificação ocorrer, então a referida sequência de junção estará presente.

[00226] Os aspectos da revelação envolvem moléculas de sequência de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural per se, juntamente com outras moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às referidas sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural sob condições de hibridização suaves a rigorosas. Em alguns aspectos, as moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às referidas sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a rigorosas são denominadas “sondas de nucleotídeos”.

[00227] Em alguns aspectos, o DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da revelação usando qPCR. Os iniciadores utilizados na reação qPCR podem ser iniciadores projetados por Primer Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma de tipo selvagem ou regiões únicas de cepas mutantes intergenéricas. A reação qPCR pode ser realizada usando o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), usando apenas iniciadores de amplificação direta e reversa; alternativamente, o kit de Foça de Sonda Capa (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan contendo um rótulo de corante FAM na extremidade 5’, um exterminador ZEN interno e um aglutinante de sulco menor e exterminador fluorescente em a extremidade 3’ (Tecnologias Integradas de DNA).

[00228] Certos, iniciador, sonda e sequências de junção não nativas estão listadas na Tabela 30. A eficiência da reação qPCR pode ser medida usando uma curva padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma alvo. Os dados podem ser normalizados para cópias do genoma por g de peso fresco usando o peso do tecido e o volume de extração.

[00229] A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é um método de quantificar, em tempo real, a amplificação de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos. A quantificação em tempo real do ensaio de PCR permite a determinação da quantidade de ácidos nucleicos sendo gerados pelas etapas de amplificação de PCR comparando os ácidos nucleicos de amplificação de interesse e uma sequência de ácidos nucleicos de controle apropriada, que pode atuar como um padrão de calibração.

[00230] As sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em ensaios qPCR que requerem uma especificidade aumentada para quantificar sequências de ácidos nucleicos alvo. As sondas TaqMan compreendem uma sonda de oligonucleotídeo com um fluoróforo ligado à extremidade 5’ e um supressor ligado à extremidade 3’ da sonda. Quando as sondas TaqMan permanecem como estão com as extremidades 5’ e 3’ da sonda em contato próximo uma com a outra, o exterminador evita a transmissão do sinal fluorescente do fluoróforo. As sondas TaqMan são projetadas para anelar dentro de uma região de ácido nucleico amplificada por um conjunto específico de iniciadores. À medida que a Taq polimerase estende o iniciador e sintetiza a fita nascente, a atividade de exonuclease 5’ para 3’ da Taq polimerase degrada a sonda que se emparelhou com o molde. Essa degradação da sonda libera o fluoróforo, quebrando assim a proximidade do supressor e permitindo a fluorescência do fluoróforo. A fluorescência detectada no ensaio qPCR é diretamente proporcional ao fluoróforo liberado e à quantidade de molde de DNA presente na reação.

[00231] As características de qPCR permitem que o médico elimine a etapa de pós-amplificação trabalhosa da preparação de eletroforese em gel, que geralmente é necessária para a observação dos produtos amplificados de ensaios de PCR tradicionais. Os benefícios do qPCR sobre o PCR convencional são consideráveis e incluem maior velocidade, facilidade de uso, reprodutibilidade e capacidade quantitativa. Melhoria de Características

[00232] Métodos da presente revelação podem ser empregados para introduzir ou melhorar um ou mais de uma variedade de características desejáveis. Exemplos de características que podem ser introduzidas ou melhoradas incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura,

comprimento do ramo, número de folhas, eficiência do uso de água, biomassa geral, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância a sal, resistência ao estresse de nematoides, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito e expressão de proteoma. As características desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, biomassa da(o) raiz e/ou ramo, germinação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, grãos de plantas ou rendimento de frutos, conteúdo de clorofila na folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação dos mesmos, pode ser usado para medir o crescimento e comparado com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem as características melhoradas) cultivadas sob condições idênticas.

[00233] Uma característica preferida a ser introduzida ou melhorada é a fixação de nitrogênio, como descrito nesse documento. Em alguns casos, uma planta resultante dos métodos descritos nesse documento exibe uma diferença na característica que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais do que uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições no solo. Em exemplos adicionais, uma planta resultante dos métodos descritos nesse documento exibe uma diferença na característica que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais do que uma planta agrícola de referência cultivada sob condições similares no solo.

[00234] A característica a ser melhorada pode ser avaliada sob condições, incluindo a aplicação de um ou mais estressores bióticos ou abióticos. Exemplos de estressores incluem estresse abiótico (tais como estresse por calor, estresse salino, estresse hídrico, estresse frio e estresse de baixo nutriente) e estresse biótico (como estresse por nematoides, estresse por insetos herbívoros, estresse por fungos patogênicos, estresse por patógenos bacterianos e estresse por patógenos virais).

[00235] A característica melhorada por métodos e composições da presente revelação pode ser a fixação de nitrogênio, incluindo em uma planta que não era anteriormente capaz de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, as bactérias isoladas de acordo com um método descrito aqui produzem 1% ou mais (por exemplo, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% ou mais) do nitrogênio de uma planta, o que pode representar um aumento na capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes (por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou mais) em comparação com as bactérias isoladas da primeira planta antes de introduzir qualquer variação genética. Em alguns casos, as bactérias produzem 5% ou mais do nitrogênio de uma planta. O nível desejado de fixação de nitrogênio pode ser alcançado após repetir as etapas de introdução de variação genética, exposição a uma pluralidade de plantas e isolamento de bactérias de plantas com uma característica melhorada uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 ou mais vezes). Em alguns casos, níveis intensificados de fixação de nitrogênio são obtidos na presença de fertilizantes suplementados com glutamina, amônia ou outra fonte química de nitrogênio. Métodos para avaliar o grau de fixação de nitrogênio são conhecidos, exemplos dos quais são descritos nesse documento.

[00236] O melhoramento de micróbios é um método para identificar e melhorar sistematicamente o papel das espécies dentro do microbioma do cultivo. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas mapeando as interações planta-micróbio e prevendo redes reguladoras ligadas a um fenótipo particular, 2) melhoria pragmática e previsível de fenótipos microbianos por meio do cruzamento intraespécies de redes reguladoras e grupamentos de genes, e 3) triagem e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de cultura desejados. Para avaliar sistematicamente a melhoria das cepas, é criado um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética de espécies-chave. O modelo é usado para prever genes alvos para reprodução e melhorar a frequência de seleção de melhorias em características codificadas por microbioma de relevância agronômica. Medição do Nitrogênio Fornecido em um Contexto de Campo Relevante para a Agricultura

[00237] No campo, a quantidade de nitrogênio dispensada pode ser determinada pela função de colonização multiplicada pela atividade.

[00238] A equação acima requer (1) a colonização média por unidade de tecido da planta e (2) a atividade como a quantidade de nitrogênio fixada ou a quantidade de amônia excretada por cada célula microbiana. Para converter em libras de nitrogênio por acre, a fisiologia do crescimento do milho é triada ao longo do tempo, por exemplo, o tamanho da planta e o sistema radicular associado ao longo dos estágios de maturidade.

[00239] As libras de nitrogênio dispensadas a uma safra por acre na estação podem ser calculadas pela seguinte equação:

[00240] O tecido da planta(t) é o peso fresco do tecido da planta do milho ao longo do tempo de crescimento (t). Os valores para fazer o cálculo razoavelmente são descritos em detalhes na publicação intitulada Roots, Growth and Nutrient Uptake (Mengel. Dept. de Agronomia Pub.# AGRY-95-08 (Rev. Maio-95. págs. 1-8.).

[00241] A Colonização (t) é a quantidade de micróbios de interesse encontrados dentro do tecido da planta, por grama de peso fresco do tecido da planta, em qualquer momento particular, t, durante a estação de crescimento. No caso de apenas um único momento disponível, o único momento é normalizado como a taxa de colonização de pico ao longo da temporada, e a taxa de colonização dos momentos restantes são ajustados em conformidade.

[00242] A atividade (t) é a taxa em que N é fixado pelos micróbios de interesse por unidade de tempo, em qualquer momento particular, t, durante a estação de crescimento. Nas modalidades reveladas nesse documento, essa taxa de atividade é aproximada por ensaio de redução de acetileno in vitro (ARA) em meio de ARA na presença de glutamina 5 mM ou ensaio de excreção de amônio em meio de ARA na presença de íons de amônio 5 mM.

[00243] A quantidade de nitrogênio dispensada é então calculada integrando numericamente a função acima. Nos casos em que os valores das variáveis descritas acima são medidos discretamente em momentos definidos, os valores entre esses momentos são aproximados por meio de interpolação linear. Fixação de Nitrogênio

[00244] São descritos nesse documento métodos para aumentar a fixação de nitrogênio em uma planta, compreendendo a exposição da planta a bactérias compreendendo uma ou mais de variações genéticas introduzidas em um ou mais de genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio na planta (por exemplo, 2%, 5%, 10% ou mais), o que pode representar uma capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes em comparação com a planta na ausência da bactéria. A bactéria pode produzir o nitrogênio na presença de fertilizantes suplementados com glutamina, ureia, nitratos ou amônia. As variações genéticas podem ser qualquer variação genética descrita nesse documento, incluindo os exemplos fornecidos acima, em qualquer número e qualquer combinação. A variação genética pode ser introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: aumento da expressão ou atividade de nifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; diminuição da atividade de remoção de adenilil e de GlnE; ou diminuição da atividade de remoção de uridilila e de GlnD. A variação genética introduzida em uma ou mais de bactérias dos métodos revelados nesse documento pode ser uma mutação por inativação ou pode abolir uma sequência reguladora de um gene alvo, ou pode compreender a inserção de uma sequência reguladora heteróloga, por exemplo, a inserção de uma sequência reguladora encontrada dentro do genoma da mesma espécie ou gênero bacteriano. A sequência reguladora pode ser escolhida com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de tecido de planta. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. As plantas cultivadas na etapa (c) podem ser expostas a estressores bióticos ou abióticos.

[00245] A quantidade de fixação de nitrogênio que ocorre nas plantas descritas nesse documento pode ser medida de várias maneiras, por exemplo, por um ensaio de redução de acetileno (AR). Um ensaio de redução de acetileno pode ser realizado in vitro ou in vivo. A evidência de que uma bactéria em particular está fornecendo nitrogênio fixado a uma planta pode incluir: 1) o N total da planta aumenta significativamente após a inoculação, de preferência com um aumento concomitante na concentração de N na planta; 2) os sintomas de deficiência de nitrogênio são aliviados sob condições limitantes de N após a inoculação (que deve incluir um aumento na matéria seca); 3) a fixação de N2 é documentada através do uso de uma abordagem 15N (que pode ser experimentos de diluição de isótopos, ensaios de redução de 15N2 ou ensaios de abundância natural de 15N); 4) N fixo é incorporado em uma proteína ou metabólito de planta; e 5) todos estes efeitos não são vistos em plantas não inoculadas ou em plantas inoculadas com um mutante da cepa de inóculo.

[00246] A cascata reguladora de fixação de nitrogênio de tipo selvagem pode ser representada como um circuito lógico digital onde as entradas de O2 e NH4+ passam por uma porta NOR, cuja saída entra em uma porta AND além do ATP. Em algumas modalidades, os métodos revelados nesse documento interrompem a influência de NH4+ nesse circuito, em vários pontos da cascata reguladora, de modo que os micróbios possam produzir nitrogênio mesmo em campos fertilizados. No entanto, os métodos revelados nesse documento também visam alterar o impacto de ATP ou O2 nos circuitos, ou substituir os circuitos por outras cascatas reguladoras na célula, ou alterar circuitos genéticos diferentes da fixação de nitrogênio. Os grupamentos de genes podem ser remanipulados geneticamente para gerar produtos funcionais sob o controle de um sistema regulador heterólogo. Ao eliminar elementos reguladores nativos fora e dentro de sequências de codificação de grupamentos de genes e substituindo-os por sistemas reguladores alternativos, os produtos funcionais de operons genéticos complexos e outros grupamentos de genes podem ser controlados e/ou movidos para células heterólogas, incluindo células de espécies diferentes além das espécies das quais os genes nativos foram derivados. Uma vez remanipulados geneticamente, os grupamentos de genes sintéticos podem ser controlados por circuitos genéticos ou outros sistemas reguladores indutíveis, controlando assim a expressão dos produtos como desejado. Os cassetes de expressão podem ser projetados para atuar como portas lógicas, geradores de pulso, osciladores, comutadores ou dispositivos de memória. O cassete de expressão de controle pode ser ligado a um promotor de modo que o cassete de expressão funcione como um sensor ambiental, tal como um sensor de oxigênio, temperatura, toque, estresse osmótico, estresse de membrana ou de redox.

[00247] Como um exemplo, os genes nifL, nifA, nifT, e nifX podem ser eliminados do grupamento de genes nif. Genes sintéticos podem ser projetados por códon randomizando o DNA que codifica cada sequência de aminoácidos. A seleção do códon é realizada, especificando que o uso do códon seja o mais divergente possível do uso do códon no gene nativo. As sequências propostas são varridas para quaisquer características indesejadas, tais como sítios de reconhecimento de enzimas de restrição, sítios de reconhecimento de transpoons, sequências repetitivas, promotores sigma 54 e sigma 70, sítios de ligação de ribossoma crípticos e terminadores independentes de rho. Os sítios de ligação do ribossomo sintético são escolhidos para corresponder com a força de cada sítio de ligação do ribossomo nativo correspondente, tal como por meio da construção de um plasmídeo repórter fluorescente no qual os 150 bp circundando o códon de partida de um gene (de -60 a +90) são fundidos a um gene fluorescente. Essa quimera pode ser expressada sob o controle do promotor Ptac e a fluorescência medida via citometria de fluxo. Para gerar sítios de ligação de ribossomo sintéticos, uma biblioteca de plasmídeos repórteres usando 150 bp (-60 a +90) de um cassete de expressão sintética é gerada. Resumidamente, um cassete de expressão sintética pode consistir em um espaçador de DNA aleatório, uma sequência degeneradora que codifica uma biblioteca RBS e a sequência de codificação para cada gene sintético. Múltiplos clones são selecionados para identificar o sítio de ligação ao ribossomo sintético que melhor corresponda ao sítio de ligação do ribossomo nativo. Operons sintéticos que consistem nos mesmos genes que os operons nativos são construídos e testados para complementação funcional. Uma outra descrição de exemplo de operons sintéticos é fornecida em US20140329326. Espécies Bacterianas

[00248] Micróbios úteis nos métodos e nas composições revelados nesse documento podem ser obtidos de qualquer fonte. Em alguns casos, os micróbios podem ser bactérias, arquéias, protozoários ou fungos. Os micróbios dessa revelação podem ser micróbios fixadores de nitrogênio, por exemplo, uma bactéria fixadora de nitrogênio, archaea fixadora de nitrogênio, fungos fixadores de nitrogênio, levedura fixadora de nitrogênio ou protozoários fixadores de nitrogênio. Micróbios úteis nos métodos e nas composições revelados nesse documento podem ser micróbios formadores de esporos, por exemplo bactérias formadoras de esporos. Em alguns casos, as bactérias úteis nos métodos e nas composições revelados nesse documento podem ser bactérias Gram positivas ou bactérias Gram negativas. Em alguns casos, a bactéria pode ser uma bactéria formadora de endosporos do filo Firmicute. Em alguns casos, a bactéria pode ser um diazotrófico. Em alguns casos, a bactéria pode não ser um diazotrófico.

[00249] Os métodos e as composições dessa revelação podem ser usados com uma arquea, tal como, por exemplo, Methanothermobacter thermoautotrophicus.

[00250] Em alguns casos, as bactérias que podem ser úteis incluem, mas não estão limitadas a, Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (também conhecido como Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (sinônimos: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (também conhecido como Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis,

Bacillus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (primeiramente Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae (primeiramente Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (primeiramente Bacillus penetrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (primeiramente Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (primeiramente conhecido como Burkholderia cepacia), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (N de Accesso NRRL B-21663), Bacillus sp.

AQ175 (N de Accesso ATCC 55608), Bacillus sp.

AQ 177 (N de Accesso ATCC 55609), Bacillus sp.

AQ178 (N de Accesso ATCC 53522), e Streptomyces sp. cepa N de Accesso NRRL B-30145. Em alguns casos, a bactéria pode ser Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klebsiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum ou Rhizobium etli.

[00251] Em alguns casos, a bactéria pode ser uma espécie de Clostridium, por exemplo Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum.

[00252] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e as composições da presente revelação podem ser cianobactérias. Exemplos de gêneros cianobacterianos incluem Anabaena (por exemplo, Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (por exemplo, Nostoc punctiforme) ou Synechocystis (por exemplo Synechocystis sp. PCC6803).

[00253] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e as composições da presente revelação podem pertencer ao filo Chlorobi, por exemplo, Chlorobium tepidum.

[00254] Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e as composições da presente revelação podem compreender um gene homólogo a um gene NifH conhecido. Sequências de genes NifH conhecidos podem ser encontradas, por exemplo, no banco de dados NifH do laboratório Zehr, (wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014), ou no banco de dados NifH do laboratório Buckley (www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh, e Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. “A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen- fixing bacteria." Banco de dados 2014 (2014): bau001.). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e as composições da presente revelação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados NifH do laboratório Zehr (wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e as composições da presente revelação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados NifH do laboratório Buckley, (Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. “A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria." Banco de dados 2014 (2014): bau001.).

[00255] Micróbios úteis nos métodos e nas composições revelados nesse documento podem ser obtidos pela extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas; triturar sementes para isolar micróbios; plantar sementes em diversas amostras de solo e recuperar micróbios dos tecidos; ou inocular plantas com micróbios exógenos e determinar quais micróbios aparecem nos tecidos das plantas. Exemplos não limitativos de tecidos de planta incluem um(a) semente, plântula, folha, corte de planta, planta, bulbo, tubérculo, raiz e rizomas. Em alguns casos, as bactérias são isoladas de uma semente. Os parâmetros para o processamento de amostras podem ser variados para isolar diferentes tipos de micróbios associativos, tais como rizosféricos, epífitos ou endófitos. As bactérias também podem ser provenientes de um repositório, tais como coleções de cepas ambientais, em vez de inicialmente isolar de uma primeira planta. Os micróbios podem ser genotipados e fenotipados, via sequenciamento de genomas de micróbios isolados; traçar o perfil da composição das comunidades in planta; caracterizar a funcionalidade transcriptômica de comunidades ou micróbios isolados; ou triagem de características microbianas usando meios seletivos ou fenotípicos (por exemplo, fixação de nitrogênio ou fenótipos de solubilização de fosfato). As cepas ou populações candidatas selecionadas podem ser obtidas via dados de sequência; dados fenotípicos; dados de planta (por exemplo, genoma, fenótipo e/ou dados de rendimento); dados do solo (por exemplo, pH, teor de N/P/K e/ou comunidades bióticas do solo em massa); ou qualquer combinação dos mesmos.

[00256] As bactérias e os métodos de produção de bactérias descritos nesse documento podem se aplicar a bactérias capazes de se autopropagar eficientemente na superfície da folha, superfície da raiz ou dentro dos tecidos da planta sem induzir uma reação de defesa danosa da planta, ou bactérias que são resistentes às respostas de defesa da planta. As bactérias descritas nesse documento podem ser isoladas por cultura de um extrato de tecido vegetal ou lavagem da superfície da folha em um meio sem nitrogênio adicionado. No entanto, a bactéria pode não ser cultivável, isto é, não se sabe que é cultivável ou difícil de cultivar usando métodos padrão conhecidos na técnica. As bactérias descritas nesse documento podem ser uma endófita ou uma epífita ou uma bactéria que habita a rizosfera da planta (bactérias rizosféricas). As bactérias obtidas após repetir as etapas de introdução de variação genética, exposição a uma pluralidade de plantas e isolamento de bactérias de plantas com uma característica melhorada uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes) pode ser endofítica, epifítica ou rizosférica. Endófitos são organismos que entram no interior das plantas sem causar sintomas de doenças ou desencadear a formação de estruturas simbióticas e são de interesse agronômico porque podem intensificar o crescimento da planta e melhorar a nutrição das plantas (por exemplo, através da fixação de nitrogênio). A bactéria pode ser um endófito transmitido pela semente. Endófitos transmitidos por sementes incluem bactérias associadas ou derivadas da semente de uma grama ou planta, tal como um endófito bacteriano transmitido por sementes encontrado em sementes maduras, secas, não danificadas (por exemplo, sem rachaduras, infecção fúngica visível ou germinadas prematuramente). O endófito bacteriano transmitido pela semente pode ser associado ou derivado da superfície da semente; alternativamente, ou adicionalmente, pode ser associado ao ou derivado do compartimento interno de sementes (por exemplo, de uma semente esterilizada na superfície). Em alguns casos, um endófito bacteriano transmitido pela semente é capaz de se replicar no tecido da planta, por exemplo, no interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano transmitido pela semente é capaz de sobreviver à dessecação.

[00257] A bactéria isolada de acordo com os métodos da revelação, ou usada em métodos ou composições da revelação, pode compreender uma pluralidade de diferentes táxons bacterianos em combinação. A título de exemplo, a bactéria pode incluir Proteobacteria (tais como Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium e Halomonas), Firmicutes (tal como Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma e Acetabacterium), e Actinobacteria (tal como Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium e Curtobacterium). As bactérias usadas nos métodos e nas composições dessa revelação podem incluir consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio de duas ou mais espécies. Em alguns casos, uma ou mais espécies bacterianas do consórcio bacteriano podem ser capazes de fixar nitrogênio. Em alguns casos, uma ou mais espécies do consórcio bacteriano podem facilitar ou intensificar a capacidade de outras bactérias para fixar nitrogênio. As bactérias que fixam nitrogênio e as bactérias que intensificam a capacidade de outras bactérias de fixarem nitrogênio podem ser iguais ou diferentes. Em alguns exemplos, uma cepa bacteriana pode ser capaz de fixar nitrogênio quando em combinação com uma cepa bacteriana diferente, ou em um determinado consórcio bacteriano, mas pode ser incapaz de fixar nitrogênio em uma monocultura. Exemplos de gêneros bacterianos que podem ser encontrados em consórcios de bactérias fixadoras de nitrogênio incluem, mas não estão limitados a, Herbaspirillum, Azospirillum, Enterobacter e Bacillus.

[00258] As bactérias que podem ser produzidas pelos métodos revelados nesse documento incluem Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp., e Sinorhizobium sp. Em alguns casos, a bactéria pode ser selecionada do grupo que consiste em: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae, e Sinorhizobium meliloti. Em alguns casos, a bactéria pode ser do gênero Enterobacter ou Rahnella. Em alguns casos, a bactéria pode ser do gênero Frankia ou Clostridium. Exemplos de bactérias do gênero Clostridium incluem, mas não estão limitados a, Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens e Clostridium tetani. Em alguns casos, a bactéria pode ser do gênero Paenibacillus, por exemplo, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae subsp. Larvae, Paenibacillus larvae subsp. Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae, ou Paenibacillus polymyxa.

[00259] Em alguns exemplos, as bactérias isoladas de acordo com os métodos da revelação podem ser um membro de um ou mais dos seguintes táxons: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus,

Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter , Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, WPS-2 genera incertae sedis, Xanthomonas, e Zimmermannella.

[00260] Em alguns casos, uma espécie bacteriana selecionada de pelo menos um dos seguintes gêneros é utilizada: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, é utilizada uma combinação de espécies bacterianas dos seguintes gêneros: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia, e Rahnella. Em alguns casos, as espécies utilizadas podem ser uma ou mais das seguintes:Enterobacter sacchari, Klebsiella variicola, Kosakonia sacchari, e Rahnella aquatilis.

[00261] Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase de molibdênio-ferro compreendendo: nifH, nifD, nifK, nifB, nifE, nifN, nifX, hesA, nifV, nifW, nifU, nifS, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase de vanádio compreendendo: vnfDG, vnfK, vnfE, vnfN, vupC, vupB, vupA, vnfV, vnfR1, vnfH, vnfR2, vnfA (regulador transcricional). Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase apenas de ferro compreendendo: anfK, anfG, anfD, anfH, anfA (regulador da transcrição). Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase compreendendo glnB e glnK (proteínas de sinalização de nitrogênio). Alguns exemplos de enzimas envolvidas no metabolismo do nitrogênio em micróbios Gram-positivos incluem glnA (glutamina sintetase), gdh (glutamato desidrogenase), bdh (3-hidroxibutirato desidrogenase), glutaminase, gltAB/gltB/gltS (glutamato desidrogenase), asnA/asnB (aspartato - amônia ligase/asparagina sintetase) e ansA/ansZ (asparaginase). Alguns exemplos de proteínas envolvidas no transporte de nitrogênio em micróbios Gram positivos incluem amtB (transportador de amônio), glnK (regulador do transporte de amônio), glnPHQ/glnQHMP (transportadores de glutamina/glutamato dependentes de ATP), glnT/alsT/yrbD/yflA (transportadores simportadores de prótons semelhante à glutamina) e gltP/gltT/yhcl/nqt (transportadores simportadores de prótons semelhantes a glutamato).

[00262] Exemplos de micróbios Gram positivos que podem ser de particular interesse incluem Paenibacillus polymixa, Paenibacillus riograndensis, Paenibacillus sp., Frankia sp., Heliobacterium sp., Heliobacterium chlorum, Heliobacillus sp., Heliophilum sp., Heliorestis sp., Clostridium acetobutylicum, Clostridium sp., Mycobacterium flaum, Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Agromyces sp., Corynebacterium autitrophicum, Corynebacterium sp., Micromonspora sp., Propionibacteria sp., Streptomyces sp., e Microbacterium sp..

[00263] Alguns exemplos de alterações genéticas que podem ser feitas em micróbios Gram positivos incluem: eliminação de glnR para remover a regulação negativa de BNF na presença de nitrogênio ambiental, inserção de diferentes promotores diretamente a montante do grupamento nif para eliminar a regulação por GlnR em resposta a nitrogênio ambiental, mutação de glnA para reduzir a taxa de assimilação de amônio pela via GS-GOGAT, eliminação de amtB para reduzir a captação de amônio do meio, mutação glnA para que esteja constitutivamente no estado inibido por realimentação (FBI- GS), para reduzir assimilação de amônio pela via GS-GOGAT.

[00264] Em alguns casos, glnR é o principal regulador do metabolismo e fixação de N em espécies de Paenibacillus. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnR. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnE ou glnD. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um gene para produzir glnB ou glnK. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para glnB, ou seus homólogos encontrados no archaeon Methanococcus maripaludis, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, os genomas das espécies de Paenibacillus podem ser variáveis. Por exemplo, Paenibacillus polymixa E681 carece de glnK e gdh, tem vários transportadores de compostos de nitrogênio, mas apenas amtB parece ser controlado por GlnR. Em outro exemplo, Paenibacillus sp. JDR2 tem glnK, gdh e muitos outros genes centrais do metabolismo do nitrogênio, tem muito menos transportadores de compostos de nitrogênio, mas tem glnPHQ controlado por GlnR. Paenibacillus riograndensis SBR5 contém um operon glnRA padrão, um gene fdx, um operon nif principal, um operon nif secundário e um operon anf (codificando nitrogenase somente de ferro). Sítios glnR/tnrA putativos foram encontrados a montante de cada um desses operons. GlnR pode regular todos os operons acima, exceto o operon anf. GlnR pode se ligar a cada uma dessas sequências reguladoras como um dímero.

[00265] As cepas fixadoras de N de Paenibacillus podem se enquadrar em dois subgrupos: Subgrupo I, que contém apenas um grupamento mínimo de genes nif e subgrupo II, que contém um grupamento mínimo, mais um gene não caracterizado entre nifX e hesA, e muitas vezes outros grupamentos duplicando alguns dos genes nif, tal como nifH, nifHDK, nifBEN, ou grupamentos que codificam para vanádio nitrogenase (vnf) ou genes de nitrogenase apenas de ferro (anf).

[00266] Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnB ou glnK. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um grupamento nif mínimo com 9 genes transcritos de um promotor sigma-70. Em alguns casos, um grupamento nif de Paenibacillus pode ser regulado negativamente por nitrogênio ou oxigênio. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir sigma-54. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para sigma-54. Em alguns casos, um agrupamento nif pode ser regulado por glnR e/ou TnrA. Em alguns casos, a atividade de um grupamento nif pode ser alterada alterando a atividade de glnR e/ou TnrA.

[00267] Em Bacilli, a glutamina sintetase (GS) é inibida por feedback por altas concentrações de glutamina intracelular, causando uma mudança na confirmação (referida como FBI-GS). Os grupamentos de Nif contêm sítios de ligação distintos para os reguladores GlnR e TnrA em várias espécies de Bacilli. GlnR se liga e reprime a expressão gênica na presença de excesso de glutamina intracelular e AMP. Um papel do GlnR pode ser prevenir o influxo e a produção intracelular de glutamina e amônio sob condições de alta disponibilidade de nitrogênio. O TnrA pode ligar e/ou ativar (ou reprimir) a expressão gênica na presença de glutamina intracelular limitante e/ou na presença de FBI-GS. Em alguns casos, a atividade de um grupamento nif de Bacilli pode ser alterada pela alteração da atividade de GlnR.

[00268] A glutamina sintetase inibida por realimentação (FBI-GS) pode ligar GlnR e estabilizar a ligação de GlnR a sequências de reconhecimento. Várias espécies bacterianas têm um sítio de ligação GlnR/TnrA a montante do grupamento nif. Alterar a ligação de FBI-GS e GlnR pode alterar a atividade da via nif. Fontes de Micróbios

[00269] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) podem ser obtidas a partir de qualquer ambiente terrestre geral, incluindo seus solos, plantas, fungos, animais (incluindo invertebrados) e outra biota, incluindo os sedimentos, água e biota de lagos e rios; do ambiente marinho, sua biota e sedimentos (por exemplo, água do mar, lamas marinhas, plantas marinhas, invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixes)); a geosfera terrestre e marinha (regolito e rocha, por exemplo, rochas subterrâneas esmagadas, areia e argila); a criosfera e sua água de degelo; a atmosfera (por exemplo, poeiras aéreas filtradas, nuvens e gotas de chuva); ambientes urbanos, industriais e outros feitos pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumulada no concreto, calhas de beira de estrada, superfícies de telhado e superfícies de estrada).

[00270] As plantas das quais as bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) são obtidas podem ser uma planta tendo uma ou mais de características desejáveis, por exemplo, uma planta que cresce naturalmente em um ambiente particular ou sob certas condições de interesse. A título de exemplo, uma determinada planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou areia de alta salinidade, ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou pode ser resistente a certas pragas ou doenças presentes no meio ambiente, e pode ser desejável para um cultivo comercial ser cultivada em tais condições, particularmente se elas forem, por exemplo, as únicas condições disponíveis em uma localização geográfica particular. A título de exemplo adicional, as bactérias podem ser coletadas de cultivos comerciais cultivados em tais ambientes, ou mais especificamente de plantas de cultivos individuais que melhor exibem uma característica de interesse entre um cultivo cultivado em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas de crescimento mais rápido entre um cultura cultivada em solos limitantes de solução salina, ou as plantas menos danificadas em cultivos expostos a danos graves por insetos ou epidemia de doença, ou plantas tendo quantidades desejadas de certos metabólitos e outros compostos, incluindo teor de fibra, teor de óleo e semelhantes, ou plantas exibindo cores, sabor ou cheiro desejáveis. As bactérias podem ser coletadas de uma planta de interesse ou de qualquer material que ocorra no ambiente de interesse, incluindo fungos e outros animais e biota vegetal, solo, água, sedimentos e outros elementos do ambiente, como referido anteriormente.

[00271] A bactéria (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) pode ser isolada do tecido vegetal. Esse isolamento pode ocorrer a partir de qualquer tecido apropriado na planta, incluindo, por exemplo, raiz, caule e folhas, e tecidos reprodutivos da planta. A título de exemplo, os métodos convencionais para isolamento de plantas incluem tipicamente a excisão estéril do material vegetal de interesse (por exemplo, raiz ou comprimento do caule, folhas), esterilização da superfície com uma solução apropriada (por exemplo, hipoclorito de sódio a 2%), após o que o material de planta é colocado em meio nutriente para o crescimento microbiano. Alternativamente, o material de planta esterilizado na superfície pode ser triturado em um líquido estéril (geralmente água) e a suspensão líquida,

incluindo pequenos pedaços do material de planta triturado, espalhado sobre a superfície de um meio de ágar sólido adequado, ou meio, que pode ou pode não ser seletivo (por exemplo, conter apenas ácido fítico como uma fonte de fósforo). Essa abordagem é especialmente útil para bactérias que formam colônias isoladas e podem ser coletadas individualmente para placas separadas de meio nutriente e posteriormente purificadas para uma única espécie por métodos bem conhecidos. Alternativamente, a raiz da planta ou amostras de folhagem podem não ser esterilizadas na superfície, mas apenas lavadas suavemente, incluindo microrganismos epifíticos residentes na superfície no processo de isolamento, ou os micróbios epifíticos podem ser isolados separadamente, imprimindo e retirando pedaços de raízes de plantas, caule ou folhas na superfície de um meio de ágar e, em seguida, isolar as colônias individuais como acima. Essa abordagem é especialmente útil para bactérias, por exemplo. Alternativamente, as raízes podem ser processadas sem a remoção por lavagem de pequenas quantidades de solo aderidas às raízes, incluindo micróbios que colonizam a rizosfera da planta. Caso contrário, o solo que adere às raízes pode ser removido, diluído e espalhado em ágar de meio seletivo e não seletivo adequado para isolar colônias individuais de bactérias rizosféricas.

TRATADO BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA EFEITOS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE

[00272] Os depósitos microbianos da presente revelação foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Fins de Procedimento de Patente (Tratado de Budapeste).

[00273] Os requerentes declaram que, de acordo com 37 C.F.R. § 1.808 (a) (2) “todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente removidas após a concessão da patente.” Essa declaração está submetida ao parágrafo (b) dessa seção (ou seja, 37 C.F.R. § 1.808 (b)).

[00274] O Enterobacter sacchari foi agora reclassificado como Kosakonia sacchari, o nome do organismo pode ser usado indistintamente em todo o manuscrito.

[00275] Muitos micróbios da presente revelação são derivados de duas cepas de tipo selvagem, como representado na FIG. 6 e FIG. 7. A cepa CI006 é uma espécie bacteriana previamente classificada no gênero Enterobacter (ver reclassificação acima mencionada em Kosakonia), e a FIG. 6 identifica a linhagem dos mutantes que foram derivados de CI006. A cepa CI019 é uma espécie bacteriana classificada no gênero Rahnella, e a FIG. 7 identifica a linhagem dos mutantes que foram derivados de CI019. Em relação à FIG. 6 e FIG. 7, é notado que as cepas que compreendem CM no nome são mutantes das cepas representadas imediatamente à esquerda da referida cepa CM. As informações de depósito para o tipo selvagem de Kosakonia (WT) CI006 e WT de Rahnella CI019 são encontradas na Tabela 1 abaixo.

[00276] Alguns microrganismos descritos nesse pedido foram depositados em 6 de janeiro de 2017 ou 11 de agosto de 2017 no Centro Nacional Bigelow de Algas Marinhas e Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA. Como mencionado acima, todos os depósitos foram feitos de acordo com os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente. O Centro Nacional de Bigelow para números de acesso de Algas Marinhas e Microbiota e as datas de depósito para os depósitos do Tratado de Budapeste acima mencionados são fornecidos na Tabela 1.

[00277] Culturas biologicamente puras de Kosakonia sacchari (WT), Rahnella aquatilis (WT) e uma cepa Kosakonia sacchari variante/remodelada foram depositadas em 06 de janeiro de 2017 com o Centro Nacional Bigelow para Algas Marinhas e Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e os números de designação de depósito de patente NCMA 201701001, 201701003 e 201701002, respectivamente. As informações de depósito aplicáveis são encontradas abaixo na Tabela 1.

[00278] Culturas biologicamente puras de cepas variante/remodeladas de Kosakonia sacchari foram depositadas em 11 de agosto de 2017 com o Centro Nacional de Bigelow para Algas Marinhas e Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e Números de designação de depósito de patente NCMA atribuídos 201708004, 201708003 e 201708002, respectivamente. As informações de depósito aplicáveis são encontradas abaixo na Tabela 1.

[00279] Uma cultura biologicamente pura de Klebsiella variicola (WT) foi depositada em 11 de agosto de 2017 no Centro Nacional Bigelow para Algas Marinhas e Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e número de Designação de Depósito de Patente NCMA atribuído 201708001. Culturas biologicamente puras de duas variantes/cepas remodeladas de Klebsiella variicola foram depositadas em 20 de dezembro de 2017 no Centro Nacional de Bigelow para Algas Marinhas e Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e os números de designação de depósito de patente NCMA 201712001 e 201712002, respectivamente.

As informações de depósito aplicáveis são encontradas abaixo na Tabela 1. Tabela 1: Microrganismos depositados sob o Tratado de Budapeste Designação de Cepa Pivô Número de Data de Depositário (algumas cepas Taxonomia acesso Depósito têm várias designações) CI006, 06 de Kosakonia sacchari NCMA PBC6.1, 201701001 janeiro de (WT) 6 2017 06 de CI019, Rahnella aquatilis NCMA 201701003 janeiro de 19 (WT) 2017 06 de NCMA CM029, 6-412 Kosakonia sacchari 201701002 janeiro de 2017 11 de 6-403 NCMA Kosakonia sacchari 201708004 agosto de CM037 2017 6-404, 11 de NCMA CM38, Kosakonia sacchari 201708003 agosto de PBC6.38 2017 CM094, 11 de NCMA 6-881, Kosakonia sacchari 201708002 agosto de PBC6.94 2017 11 de CI137, 137, Klebsiella NCMA 201708001 agosto de PB137 variicola (WT) 2017 20 de Klebsiella NCMA 137-1034 201712001 dezembro variicola de 2017 Klebsiella 20 de NCMA 137-1036 201712002 variicola dezembro

Designação de Cepa Pivô Número de Data de Depositário (algumas cepas Taxonomia acesso Depósito têm várias designações) de 2017 Microrganismos isolados e biologicamente puros

[00280] A presente revelação, em certas modalidades, fornece microrganismos isolados e biologicamente puros que têm aplicações, inter alia, na agricultura. Os microrganismos revelados podem ser utilizados em seus estados isolados e biologicamente puros, bem como sendo formulados em composições (ver seção abaixo para descrições de composições exemplificativas). Além disso, a revelação fornece composições microbianas contendo pelo menos dois membros dos microrganismos isolados e biologicamente puros revelados, bem como métodos de utilização das referidas composições microbianas. Além disso, a revelação fornece métodos de modulação da fixação de nitrogênio em plantas via a utilização dos micróbios isolados e biologicamente puros revelados.

[00281] Em alguns aspectos, os microrganismos isolados e biologicamente puros da revelação são aqueles da Tabela 1. Em outros aspectos, os microrganismos isolados e biologicamente puros da revelação são derivados de um microrganismo da Tabela 1. Por exemplo, uma cepa, descendente, mutante ou derivado de um microrganismo da Tabela 1 é fornecida(o) nesse documento. A revelação contempla todas as combinações possíveis de micróbios listados na Tabela 1, as referidas combinações às vezes formando um consórcio microbiano. Os micróbios da Tabela 1, individualmente ou em qualquer combinação, podem ser combinados com qualquer planta, molécula ativa (sintética, orgânica etc.), adjuvante, carreador, suplemento ou biológico, mencionado na revelação.

[00282] Em alguns aspectos, a revelação fornece composições microbianas que compreendem espécies agrupadas nas Tabelas 2-8. Em alguns aspectos, essas composições que compreendem várias espécies microbianas são denominadas um consórcio ou consórcio microbiano.

[00283] Com relação às Tabelas 2-8, as letras de A a I representam uma seleção não limitativa de microrganismos da presente revelação, definida como: A = Micróbio com número de acesso 201701001 identificado na Tabela 1; B = Micróbio com número de acesso 201701003 identificado na Tabela 1; C = Micróbio com número de acesso 201701002 identificado na Tabela 1; D = Micróbio com número de acesso 201708004 identificado na Tabela 1; E = Micróbio com número de acesso 201708003 identificado na Tabela 1; F = Micróbio com número de acesso 201708002 identificado na Tabela 1; G = Micróbio com número de acesso 201708001 identificado na Tabela 1; H = Micróbio com número de acesso 201712001 identificado na Tabela 1; e I = Micróbio com número de acesso 201712002 identificado na Tabela 1. Tabela 2: Oito e nove Composições de cepas

A,B,C,D,E,F,G A,B,C,D,E,F,G A,B,C,D,E,F,H A,B,C,D,F,G,H A,B,C,E,F,G,H A,B,C,D,E,G,H,I ,H ,I ,I ,I ,I A,B,D,E,F,G,H A,C,D,E,F,G,H B,C,D,E,F,G,H A,B,C,D,E,F,G,H ,I ,I ,I ,I

Tabela 3: Sete Composições de Cepas A,B,C,D,E, A,B,C,D, A,B,C,D, A,B,C,D, A,B,C,D, A,B,C,D,

F,G E,F,H E,F,I E,G,H E,G,I E,H,I A,B,C,D,F, A,B,C,D, A,B,C,D, A,B,C,D, A,B,C,E, A,B,C,E, G,H F,G,I F,H,I G,H,I F,G,H F,G,I A,B,C,E,F, A,B,C,E, A,B,C,F, A,B,D,E, A,B,D,E, A,B,D,E, H,I G,H,I G,H,I F,G,H F,G,I F,H,I A,B,D,E,G, A,B,D,F, A,B,E,F, A,C,D,E, A,C,D,E, A,C,D,E, H,I G,H,I G,H,I F,G,H F,G,I F,H,I A,C,D,E,G, A,C,D,F, A,C,E,F, A,D,E,F, B,C,D,E, B,C,D,E, H,I G,H,I G,H,I G,H,I F,G,H F,G,I B,C,D,E,F, B,C,D,E, B,C,D,F, B,C,E,F, B,D,E, C,D,E, H,I G,H,I G,H,I G,H,I F,G,H,I F,G,H,I

Tabela 4: Seis composições de Cepas A,B,C,D,E,F A,B,C,D,E,G A,B,C,D,E,H A,B,C,D,E,I A,B,C,D,F,G A,B,C,D,F,H A,B,C,D,F,I

A,B,C,D,G,H A,B,C,D,G,I A,B,C,D,H,I A,B,C,E,F,G A,B,C,E,F,H A,B,C,E,F,I A,B,C,E,G,H A,B,C,E,G,I A,B,C,E,H,I A,B,C,F,G,H A,B,C,F,G,I A,B,C,F,H,I A,B,C,G,H,I A,B,D,E,F,G A,B,D,E,F,H A,B,D,E,F,I A,B,D,E,G,H A,B,D,E,G,I A,B,D,E,H,I A,B,D,F,G,H A,B,D,F,G,I D,E,F,G,H,I C,E,F,G,H,I A,B,D,F,H,I A,B,D,G,H,I A,B,E,F,G,H A,B,E,F,G,I A,B,E,F,H,I A,B,E,G,H,I A,B,F,G,H,I A,C,D,E,F,G A,C,D,E,F,H A,C,D,E,F,I A,C,D,E,G,H A,C,D,E,G,I A,C,D,E,H,I A,C,D,F,G,H A,C,D,F,G,I A,C,D,F,H,I A,C,D,G,H,I A,C,E,F,G,H A,C,E,F,G,I A,C,E,F,H,I A,C,E,G,H,I A,C,F,G,H,I A,D,E,F,G,H A,D,E,F,G,I A,D,E,F,H,I A,D,E,G,H,I A,D,F,G,H,I A,E,F,G,H,I B,C,D,E,F,G B,C,D,E,F,H B,C,D,E,F,I B,C,D,E,G,H B,C,D,E,G,I B,C,D,E,H,I B,C,D,F,G,H B,C,D,F,G,I B,C,D,F,H,I B,C,D,G,H,I B,C,E,F,G,H B,C,E,F,G,I B,C,E,F,H,I B,C,E,G,H,I B,C,F,G,H,I B,D,E,F,G,H B,D,E,F,G,I B,D,E,F,H,I B,D,E,G,H,I B,D,F,G,H,I B,E,F,G,H,I C,D,E,F,G,H C,D,E,F,G,I C,D,E,F,H,I C,D,E,G,H,I C,D,F,G,H,I

Tabela 5: Cinco Composições de Cepas A,B,C,D,E A,B,C,D,F A,B,C,D,G A,B,C,D,H A,B,C,D,I A,B,C,E,F A,B,C,E,G A,B,C,E,H

A,B,C,F,H A,B,C,F,G A,B,C,F,I A,B,C,G,H A,B,C,G,I A,B,C,H,I A,B,D,E,F A,B,D,E,G A,B,D,E,I A,B,D,F,G A,B,D,F,H A,B,D,F,I A,B,D,G,H A,B,D,G,I A,B,D,H,I A,B,E,F,G A,B,E,F,I A,B,E,G,H A,B,E,G,I A,B,E,H,I A,B,F,G,H A,B,F,G,I A,B,F,H,I A,B,G,H,I A,C,D,E,G A,C,D,E,H A,C,D,E,I A,C,D,F,G A,C,D,F,H A,C,D,F,I A,C,D,G,H A,C,D,G,I A,C,E,F,G A,C,E,F,H A,C,E,F,I A,C,E,G,H A,C,E,G,I A,C,E,H,I A,C,F,G,H A,C,F,G,I A,C,G,H,I A,D,E,F,G A,D,E,F,H A,D,E,F,I A,D,E,G,H A,D,E,G,I A,D,E,H,I A,D,F,G,H A,D,F,H,I A,D,G,H,I A,E,F,G,H A,E,F,G,I A,E,F,H,I A,E,G,H,I A,F,G,H,I B,C,D,E,F B,C,D,E,H B,C,D,E,I B,C,D,F,G B,C,D,F,H B,C,D,F,I B,C,D,G,H B,C,D,G,I B,C,D,H,I B,C,E,F,H B,C,E,F,I B,C,E,G,H B,C,E,G,I B,C,E,H,I B,C,F,G,H B,C,F,G,I B,C,F,H,I B,D,E,F,G B,D,E,F,H B,D,E,F,I B,D,E,G,H B,D,E,G,I B,D,E,H,I B,D,F,G,H B,D,F,G,I B,D,G,H,I B,E,F,G,H B,E,F,G,I B,E,F,H,I B,E,G,H,I B,F,G,H,I C,D,E,F,G C,D,E,F,H C,D,E,G,H C,D,E,G,I C,D,E,H,I C,D,F,G,H C,D,F,G,I C,D,F,H,I C,D,G,H,I C,E,F,G,H C,E,F,H,I C,E,G,H,I C,F,G,H,I D,E,F,G,H D,E,F,G,I D,E,F,H,I D,E,G,H,I D,F,G,H,I A,B,C,E,I A,B,D,E,H A,B,E,F,H A,C,D,E,F A,C,D,H,I A,C,F,H,I A,D,F,G,I B,C,D,E,G B,C,E,F,G B,C,G,H,I B,D,F,H,I C,D,E,F,I C,E,F,G,I E,F,G,H,I

Tabela 6: Quatro Composições de Cepas A,B,C,D A,B,C,E A,B,C,F A,B,C,G A,B,C,H A,B,C,I A,B,D,E A,B,D,F D,G,H,I

A,B,D,G A,B,D,H A,B,D,I A,B,E,F A,B,E,G A,B,E,H A,B,E,I A,B,F,G E,F,G,H A,B,F,H A,D,F,H A,D,F,I A,D,G,H A,D,G,I A,D,H,I A,E,F,G A,E,F,H E,F,G,I A,B,F,I A,B,G,H A,B,G,I A,B,H,I A,C,D,E A,C,D,F A,C,D,G A,C,D,H E,F,H,I A,C,D,I A,C,E,F A,C,E,G A,C,E,H A,C,E,I A,C,F,G A,C,F,H A,C,F,I E,G,H,I A,C,G,H A,C,G,I A,C,H,I A,D,E,F A,D,E,G A,D,E,H A,D,E,I A,D,F,G F,G,H,I A,E,F,I A,E,G,H A,E,G,I A,E,H,I A,F,G,H A,F,G,I A,F,H,I A,G,H,I D,E,F,H B,C,D,E B,C,D,F B,C,D,G B,C,D,H B,C,D,I B,C,E,F B,C,E,G B,C,E,H D,E,F,I B,C,E,I B,C,F,G B,C,F,H B,C,F,I B,C,G,H B,C,G,I B,C,H,I B,D,E,F D,E,G,H

B,D,E,G B,D,E,H B,D,E,I B,D,F,G B,D,F,H B,D,F,I B,D,G,H B,D,G,I D,E,G,I B,D,H,I B,E,F,G B,E,F,H B,E,F,I B,E,G,H B,E,G,I B,E,H,I B,F,G,H D,E,H,I B,F,G,I B,F,H,I B,G,H,I C,D,E,F C,D,E,G C,D,E,H C,D,E,I C,D,F,G D,F,G,H C,D,F,H C,D,F,I C,D,G,H C,D,G,I C,D,H,I C,E,F,G C,E,F,H C,E,F,I D,F,G,I C,E,G,H C,E,G,I C,E,H,I C,F,G,H C,F,G,I C,F,H,I C,G,H,I D,E,F,G D,F,H,I Tabela 7: Três Composições de Cepas A,B,C A,B,D A,B,E A,B,F A,B,G A,B,H A,B,I A,C,D A,C,E G,H,I E,F,H A,C,F A,C,G A,C,H A,C,I A,D,E A,D,F A,D,G A,D,H A,D,I F,H,I E,F,G A,E,F A,E,G A,E,H A,E,I A,F,G A,F,H A,F,I A,G,H A,G,I F,G,I D,H,I A,H,I B,C,D B,C,E B,C,F B,C,G B,C,H B,C,I B,D,E B,D,F F,G,H D,G,I B,D,G B,D,H B,D,I B,E,F B,E,G B,E,H B,E,I B,F,G B,F,H E,H,I E,F,I B,F,I B,G,H B,G,I B,H,I C,D,E C,D,F C,D,G C,D,H C,D,I E,G,I D,G,H C,E,F C,E,G C,E,H C,E,I C,F,G C,F,H C,F,I C,G,H C,G,I E,G,H D,F,I C,H,I D,E,F D,E,G D,E,H D,E,I D,F,G D,F,H Tabela 8: Duas Composições de Cepas A,B A,C A,D A,E A,F A,G A,H A,I B,C B,D B,E B,F B,G B,H B,I C,D C,E C,F C,G C,H C,I D,E D,F D,G D,H D,I E,F E,G E,H E,I F,G F,H F,I G,H G,I H,I

[00284] Em algumas modalidades, as composições microbianas podem ser selecionadas de qualquer grupo membro das Tabelas 2-8. Composições Agrícolas

[00285] As composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos nesse documento e/ou tendo as características descritas nesse documento podem estar na forma de um líquido, uma espuma ou um produto seco. As composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos nesse documento e/ou com as características descritas nesse documento também podem ser usadas para melhorar as características das plantas. Em alguns exemplos, uma composição que compreende populações bacterianas pode estar na forma de um pó seco, uma pasta fluida de pó e água ou um tratamento de semente fluida. As composições que compreendem populações bacterianas podem ser revestidas na superfície de uma semente e podem estar na forma líquida.

[00286] A composição pode ser fabricada em biorreatores, tais como reatores de tanque agitado contínuo, reatores de batelada e na fazenda. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas em um recipiente, tal como uma jarra ou em minitanque. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas dentro de um objeto selecionado do grupo que consiste em uma garrafa, frasco, ampola, pacote, recipiente, saco, caixa, silo, envelope, caixa de pacote, contêiner, silo, contêiner de transporte, leito de caminhão e/ou estojo.

[00287] As composições também podem ser usadas para melhorar as características das plantas. Em alguns exemplos, uma ou mais de composições pode(m) ser revestida(s) sobre uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições pode(m) ser revestida(s) em uma muda. Em alguns exemplos, uma ou mais composições pode(m) ser revestida(s) sobre a superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições pode(m) ser revestida(s) como uma camada acima da superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma composição que é revestida sobre uma semente pode estar na forma líquida, na forma de produto seco, na forma de espuma, na forma de uma pasta fluida de pó e água ou em um tratamento de sementes escoáveis. Em alguns exemplos, uma ou mais composições pode(m) ser aplicada(s) a uma semente e/ou muda por pulverização, imersão, revestimento, encapsulamento e/ou pulverização da semente e/ou plântula com uma ou mais composições. Em alguns exemplos, múltiplas bactérias ou populações bacterianas podem ser revestidas em uma semente e/ou uma muda da planta. Em alguns exemplos, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias de uma combinação bacteriana podem ser selecionado de um dos seguintes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas, e Stenotrophomonas.

[00288] Em alguns exemplos, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, ou mais do que dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, e Pleosporaceae.

[00289] Em alguns exemplos, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, ou mais do que dez bactérias e bactérias populações de uma combinação endofítica são selecionadas de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[00290] Exemplos de composições podem incluir revestimentos de sementes para cultivos agrícolas comercialmente importantes, por exemplo, sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, milho e trigo. Exemplos de composições também podem incluir revestimentos de sementes para milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais e sementes oleaginosas. As sementes, conforme fornecidas nesse documento, podem ser organismos geneticamente modificados (OGM), não-OGM, orgânico ou convencional. Em alguns exemplos, as composições podem ser pulverizadas nas partes aéreas da planta ou aplicadas às raízes, inserindo-as em sulcos nos quais as sementes da planta são plantadas, regando o solo ou mergulhando as raízes em uma suspensão da composição. Em alguns exemplos, as composições podem ser desidratadas de uma maneira adequada que mantém a viabilidade celular e a capacidade de inocular e colonizar artificialmente as plantas hospedeiras. As espécies bacterianas podem estar presentes em composições a uma concentração de entre 108 a 1010 UFC/mL. Em alguns exemplos, as composições podem ser suplementadas com traços de íons de metal, tais como íons de molibdênio, íons de ferro, íons de manganês ou combinações desses íons. A concentração de íons em exemplos de composições como descrito nesse documento pode entre cerca de 0,1 mM e cerca de 50 mM.

Alguns exemplos de composições também podem ser formulados com um carreador, tal como beta-glucano, carboxilmetilcelulose (CMC), substância polimérica extracelular bacteriana (EPS), açúcar, leite animal ou outros carreadores adequados. Em alguns exemplos, turfa ou materiais de plantio podem ser usados como um carreador, ou biopolímeros nos quais uma composição está aprisionada no biopolímero podem ser usados como um carreador. As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse documento podem melhorar as características das plantas, tais como promoção do crescimento da planta, manutenção de alto teor de clorofila nas folhas, aumento do número de frutos ou sementes e aumento da unidade do peso de frutos ou semente.

[00291] As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse documento podem ser revestidas na superfície de uma semente. Como tal, composições compreendendo uma semente revestida com uma ou mais bactérias descritas nesse documento também são contempladas. O revestimento da semente pode ser formado pela mistura da população bacteriana com um carreador granular poroso quimicamente inerte. Alternativamente, as composições podem ser inseridas diretamente nos sulcos nos quais a semente é plantada ou pulverizada sobre as folhas da planta ou aplicada mergulhando as raízes em uma suspensão da composição. Uma quantidade eficaz da composição pode ser usada para povoar a região do subsolo adjacente às raízes da planta com crescimento bacteriano viável ou povoar as folhas da planta com crescimento bacteriano viável. Em geral, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para resultar em plantas com características melhoradas (por exemplo, um nível desejado de fixação de nitrogênio).

[00292] As composições bacterianas descritas nesse documento podem ser formuladas usando um carreador agricolamente aceitável. A formulação útil para essas modalidades pode incluir pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um conservante, um estabilizador, um tensoativo, um agente anticomplexo, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um fertilizante, um rodenticida, um dessecante, um bactericida, um nutriente e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, as composições podem ser estáveis em armazenamento. Por exemplo, qualquer uma das composições descritas nesse documento pode incluir um carreador agricolamente aceitável (por exemplo, um ou mais de um fertilizante, tais como, um fertilizante não natural, um agente de adesão, tais como um agente de adesão de ocorrência não natural, e um pesticida tal como um pesticida de ocorrência não natural). Um agente de adesão de ocorrência não natural pode ser, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética. Por exemplo, qualquer uma das sementes revestidas, mudas ou plantas descritas nesse documento pode conter um tal carreador agricolamente aceitável no revestimento da semente. Em qualquer uma das composições ou dos métodos descritos nesse documento, um carreador agricolamente aceitável pode ser ou pode incluir um composto de ocorrência não natural (por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão de ocorrência não natural, tal como um polímero, copolímero ou cera sintética ou um pesticida de ocorrência não natural). Exemplos não limitativos de carreadores agricolamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de carreadores agricolamente aceitáveis são conhecidos na técnica.

[00293] Em alguns casos, as bactérias são misturadas com um carreador aceitável para agricultura. O carreador pode ser um carreador sólido ou líquido e em várias formas incluindo microesferas, pós, emulsões e semelhantes. O carreador pode ser qualquer um ou mais de uma série de transportadores que conferem uma variedade de propriedades, tais como, estabilidade, umectabilidade ou dispersabilidade aumentadas. Agentes umectantes, tais como tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação dos mesmos, podem ser incluídos na composição. As emulsões de água em óleo também podem ser usadas para formular uma composição que inclui as bactérias isoladas (ver, por exemplo, Patente U.S. N 7.485.451). As formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós umectáveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou sedimentos, espessantes e semelhantes, partículas microencapsuladas e semelhantes, líquidos, tais como suspensões aquosas, suspensões aquosas escoáveis, emulsões de água em óleo, etc. A formulação pode incluir grãos ou produtos leguminosos, por exemplo, grãos ou feijões moídos, caldo ou farinha derivado(a) de grãos ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[00294] Em algumas modalidades, o carreador agrícola pode ser solo ou um meio de crescimento de planta. Outros carreadores agrícolas que podem ser usados incluem água,

fertilizantes, óleos vegetais, umectantes ou combinações dos mesmos. Alternativamente, o carreador agrícola pode ser um sólido, tal como terra de diatomáceas, argila, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, cascas de sementes, outros produtos vegetais e animais, ou combinações, incluindo grânulos, sedimentos ou suspensões. As misturas de qualquer um dos ingredientes acima mencionados também são contempladas como carreadores, tais como, mas não se limitando a, pesta (farinha e argila de caulim), ágar ou grânulos à base de farinha em barra, areia ou argila, etc. As formulações podem incluir fontes de alimentos para as bactérias, tal como cevada, arroz ou outros materiais biológicos, tais como, sementes, partes de plantas, bagaço de cana-de-açúcar, cascas ou caules de processamento de grãos, material vegetal triturado ou madeira de resíduos de construção, serragem ou pequenas fibras de reciclagem de papel, tecido ou madeira.

[00295] Por exemplo, um fertilizante pode ser usado para ajudar a promover o crescimento ou fornecer nutrientes para uma semente, muda ou planta. Exemplos não limitativos de fertilizantes incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, enxofre, magnésio, boro, cloreto, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio e selênio (ou um sal do mesmo). Exemplos adicionais de fertilizantes incluem um ou mais de aminoácidos, sais, carboidratos, vitaminas, glicose, NaCl, extrato de levedura, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, glicerol, valina, L- leucina, ácido láctico, ácido propiônico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico, tartarato de KH, xilose, lixose e lecitina. Em uma modalidade, a formulação pode incluir um agente de pegajosidade ou aderente (referido como um agente adesivo) para ajudar a ligar outros agentes ativos a uma substância (por exemplo, a superfície de uma semente). Esses agentes são úteis para combinar bactérias com carreadores que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para produzir uma composição de revestimento. Essas composições ajudam a criar revestimentos em torno da planta ou semente para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em uma modalidade, os adesivos são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, goma arábica, goma xantana, óleo mineral, polietileno glicol (PEG) , Polivinilpirrolidona (PVP), Arabino-galactano, Metilcelulose, PEG 400, Quitosano, Poliacrilamida, Poliacrilato, Poliacrilonitrila, Glicerol, Trietilenoglicol, Acetato de Vinila, Goma Gelano, Poliestireno, Polivinil, Carboximetil celulose, Goma Ghatti, e copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxibutileno.

[00296] Em algumas modalidades, os adesivos podem ser, por exemplo, uma cera, tais como, cera de carnaúba, cera de abelha, cera chinesa, cera goma laca, cera de espermacete, cera de candelila, cera de mamona, cera de ouricúrio e cera de farelo de arroz, um polissacarídeo (por exemplo, amido, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas), gordura, óleo, uma proteína (por exemplo, gelatina e zeínas), gomas aráveis e goma-laca. Os agentes adesivos podem ser compostos de ocorrência não natural, por exemplo, polímeros, copolímeros e ceras. Por exemplo, exemplos não limitativos de polímeros que podem ser usados como um agente adesivo incluem: acetatos de polivinila, copolímeros de acetato de polivinila, copolímeros de etileno vinil acetato (EVA), álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico, celuloses (por exemplo, etilceluloses, metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilceluloses e carboximetilceluloses), polivinilpirrolidonas, cloreto de vinila, copolímeros de cloreto de vinilideno, lignossulfonatos de cálcio, copolímeros acrílicos, polivinilacrilatos, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acilamida, acrilato de poli-hidroxietila, monômeros de metilacrilamida e policloropreno.

[00297] Em alguns exemplos, um ou mais dos agentes de adesão, agentes antifúngicos, agentes de regulação do crescimento e pesticidas (por exemplo, inseticida) são compostos de ocorrência não natural (por exemplo, em qualquer combinação). Exemplos adicionais de carreadores agricolamente aceitáveis incluem dispersantes (por exemplo, polivinilpirrolidona/acetato de vinila PVPIVA S-630), tensoativos, ligantes e agentes de enchimento.

[00298] A formulação também pode conter um tensoativo. Exemplos não limitativos de tensoativos incluem misturas de tensoativos de nitrogênio, tais como Prefer 28 (Cenex), Surf- N (US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esterificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração dentre 0,01% v/v a 10% v/v. Em outra modalidade,

o tensoativo está presente em uma concentração dentre 0,1% v/v a 1% v/v.

[00299] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizador microbiano. Tal agente pode incluir um dessecante, que pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que podem ser classificados como um dessecante, independentemente de o composto ou compostos ser(em) usado(s) em tais concentrações que de fato tenham um efeito dessecante em um inoculante líquido. Esses dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacteriana usada e devem promover a capacidade da população microbiana de sobreviver à aplicação nas sementes e à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais de trealose, sacarose, glicerol e metilenoglicol. Outros dessecantes adequados incluem, mas não estão limitados a, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode variar de cerca de 5% a cerca de 50% em peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% a cerca de 40%, entre cerca de 15% a cerca de 35%, ou entre cerca de 20% a cerca de 30%. Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes tal como um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, bactericida ou um nutriente. Em alguns exemplos, os agentes podem incluir protetores que fornecem proteção contra patógenos transmitidos pela superfície da semente. Em alguns exemplos, os protetores podem fornecer algum nível de controle de patógenos transmitidos pelo solo. Em alguns exemplos, os protetores podem ser eficazes predominantemente na superfície da semente.

[00300] Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir um composto ou agente, seja químico ou biológico, que pode inibir o crescimento de um fungo ou matar um fungo. Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um protetor ou agentes que são eficazes predominantemente na superfície da semente, fornecendo proteção contra patógenos da superfície da semente e fornecendo algum nível de controle de patógenos do solo. Exemplos não limitativos de fungicidas protetores incluem captan, maneb, thiram ou fludioxonil.

[00301] Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um fungicida sistêmico, que pode ser absorvido pela muda emergente e inibir ou matar o fungo dentro dos tecidos da planta hospedeira. Os fungicidas sistêmicos usados para o tratamento de sementes incluem, mas não estão limitados aos seguintes: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina e vários fungicidas triazóis, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são usados principalmente para atingir os fungos de bolor aquático Pythium e Phytophthora. Alguns fungicidas são preferidos a outros, dependendo da espécie de planta, seja por diferenças sutis na sensibilidade das espécies de fungos patogênicos, seja por causa das diferenças na distribuição ou sensibilidade dos fungicidas das plantas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um agente de controle biológico, tal como um(a) bactéria ou fungo. Esses organismos podem ser parasitas dos fungos patogênicos ou secretar toxinas ou outras substâncias que podem matar ou impedir o crescimento de fungos. Qualquer tipo de fungicida, particularmente aqueles comumente usados em plantas, pode ser usado como agente de controle na composição de uma semente.

[00302] Em alguns exemplos, a composição de revestimento de sementes compreende um agente de controle que possui propriedades antibacterianas. Em uma modalidade, o agente de controle com propriedades antibacterianas é selecionado dos compostos descritos nesse documento em outro lugar. Em outra modalidade, o composto é estreptomicina, oxitetraciclina, ácido oxolínico ou gentamicina. Outros exemplos de compostos antibacterianos que podem ser usados como parte de uma composição de revestimento de sementes incluem aqueles baseados em diclorofeno e álcool benzílico hemiformal (Proxel® da ICI ou Acticide® RS da Thor Chemie e Kathon® MK 25 da Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona, tais como, alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie).

[00303] Em alguns exemplos, o regulador de crescimento é selecionado do grupo que consiste em: ácido abscísico, amidochlor, ancimidol, 6-benzilaminopurina, brassinolide, butralin, clormequat (cloreto de clormequat), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, dikegulac, dimetipin, 2,6- dimetilpuridina, etefon, flumetralina, flurprimidol, flutiacet, forclorfenuron, ácido giberélico, inabenfide, ácido indol-3-acético, hidrazida maleico, mefluidida, mepiquat (cloreto de mepiquat), ácido naftalenoacético, N- 6-benzyladenina, paclobutrazol, fosforotritioato de prohexadiona, ácido 2,3,5-tri-iodobenzóico, trinexapaque-

etílico e uniconazol. Exemplos não limitativos adicionais de reguladores de crescimento incluem brassinosteroides, citocininas (por exemplo, cinetina e zeatina), auxinas (por exemplo, ácido indolilacético e indolilacetil aspartato), flavonóides e isoflavanóides (por exemplo, formononetina e diosmetina), fitoaixinas (por exemplo, gliceolina), e oligossacarídeos indutores de fitoalexina (por exemplo, pectina, quitina, quitosana, ácido poligalacurônico e ácido oligogalacturônico) e gibelerinas. Tais agentes são idealmente compatíveis com a semente agrícola ou muda sobre a qual a formulação é aplicada (por exemplo, não deve ser prejudicial ao crescimento ou à saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente aquele que não causa preocupações de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, sem problemas de segurança ou o composto é suficientemente instável para que o produto de planta derivado da planta contenha quantidades insignificantes do composto).

[00304] Alguns exemplos de agentes de biocontrole antagonísticos a nematoides incluem ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; vesicular- arbuscular mycorrhizal fungi, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e Rhizobacteria. Os agentes de biocontrole antagonísticos a nematoides particularmente preferidos incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vixens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, fungos micorrízicos vesicular-arbusculares, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage, Brevibacillus laterosporus cepa G4, Pseudomonas fluorescens e Rhizobacteria.

[00305] Alguns exemplos de nutrientes podem ser selecionados do grupo que consiste em um fertilizante de nitrogênio incluindo, mas não se limitando a, ureia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, soluções de nitrogênio sem pressão, Hidróxido de amônio, Amoníaco, Tiossulfato De Amônio, Ureia revestida de enxofre, ureia-formaldeídos, IBDU, ureia revestida com polímero, nitrato de cálcio, ureiaform e metileno ureia, fertilizantes de fósforo, tais como, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, polifosfato de amônio, superfosfato concentrado e superfosfato triplo, e fertilizantes de potássio, tais como, cloreto de potássio, sulfato de potássio, sulfato de potássio e magnésio, nitrato de potássio. Tais composições podem existir como sais livres ou íons dentro da composição do revestimento da semente. Alternativamente, os nutrientes/fertilizantes podem ser complexados ou quelados para fornecer liberação sustentada ao longo do tempo.

[00306] Alguns exemplos de rodenticidas podem incluir selecionados do grupo de substâncias que consistem em 2- isovalerilindan-1,3-diona, 4-(quinoxalin-2- ilamino)benzenossulfonamida, alfa-cloridrina, fosfeto de alumínio, antu, óxido de arsenoso, carbonato de bário, bisthiosemi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, cloralose, clorofacinona, colecalciferol, coumachlor, fumarina, coumatetralil, crimidina, difenacoum, difetialona, difacinona, ergocalciferol, flocumafen, fluoroacetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hidrogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metila, norbormida, fosacetim, fosfina, fósforo, pindone, arsenito de potássio, pirinuron, scilliroside, arsenito de sódio, cianeto de sódio, fluoroacetato de sódio, estricnina, sulfato de tálio, varfarina e fosfeto de zinco.

[00307] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas podem ser misturadas ou colocadas em suspensão em água ou em soluções aquosas. Os diluentes ou carreadores líquidos adequados incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros carreadores líquidos.

[00308] As composições sólidas podem ser preparadas dispersando as populações bacterianas em e sobre um carreador sólido adequadamente dividido, tais como, turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra fuller, solo pasteurizado e semelhantes. Quando tais formulações são usadas como pós umectáveis, podem ser usados agentes dispersantes biologicamente compatíveis, tais como, dispersantes e emulsionantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos.

[00309] Os carreadores sólidos usados na formulação incluem, por exemplo, carreadores minerais, tais como, argila de caulim, piroxilina, bentonita, montmorilonita, terra de diatomáceas, solo branco ácido, vermiculita e perlita, e sais inorgânicos, tais como, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Além disso, podem ser usados pós finos orgânicos, tais como, farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz. Os carreadores líquidos incluem óleos vegetais, tais como óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etilenoglicol, polietilenoglicol, propilenoglicol, polipropilenoglicol, etc. Pragas

[00310] As composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse documento, às vezes são combinadas com um ou mais pesticida(s).

[00311] Os pesticidas que são combinados com os micróbios da revelação podem ter como alvo qualquer uma das pragas mencionadas abaixo.

[00312] “Praga” inclui, mas não está limitado a, insetos, fungos, bactérias, nematoides, ácaros, carrapatos e semelhantes. As pragas de insetos incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Coleoptera.

[00313] Os habilitados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos que podem ser combinados com micróbios da revelação podem exibir atividade contra pragas de insetos,

que podem incluir pragas agronômicas, de floresta, de estufa, de plantas ornamentais de viveiro, de alimentos e fibras, de saúde pública e animal, de estrutura doméstica e comercial, de produtos domésticos e armazenados economicamente importantes.

[00314] Como mencionado acima, as composições agrícolas da revelação (que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse documento) estão em modalidades combinadas com um ou mais pesticida(s). Esses pesticidas podem ser ativos contra qualquer uma das seguintes pragas:

[00315] As larvas da ordem Lepidoptera incluem, mas não estão limitadas a, lagartas, larvas de traça, larva, e heliothíneos na família Noctuidae Spodoptera frugiperda J E Smith (lagarta do cartucho); S. exigua Hubner (larva da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta do tabaco, lagarta desfolhadora); Mamestra configurata Walker (lagarta militar Bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta negra); A. orthogonia Morrison (lagarta rosca pálida ocidental); A. subterranea Fabricius (Feltia subterranea); Alabama argillacea Hubner (lagarta curuquerê da folha do algodão); Trichoplusia ni Hubner (lagarta mede-palmo de repolho); Pseudoplusia includens Walker (lagarta de soja); Anticarsia gemmatalis Hubner (lagarta do feijão da Flórida); Hypena scabra Fabricius (trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta do tabaco); Pseudaletia unipuncta Haworth (Lagarta das pastagens); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (lagarta de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta do lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta manchada); Helicoverpa armigera Hubner

(traça do tomateiro); H. zea Boddie (minhoca do milho ou lagarta do milho ); Melanchra picta Harris (lagarta zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta dos cítricos); brocas, traças de parede, lagartas de tenda, mariposa do asbesto e esqueletizadores da família Pyralidae Ostrinia nubilalis Hubner (broca do milho europeia); Amyelois transitella Walker (traça de laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (traça da farinha do Mediterrâneo); Cadra cautella Walker (mariposa da amêndoa); Chilo suppressalis Walker (broca do caule do arroz); C. partellus, (broca do sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (traça do arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de tenda da raiz do milho); C. teterrellus Zincken (lagarta de tenda da poa anual); Cnaphalocrocis medinalis Guenee (enrolador de folhas de arroz); Desmia funeralis Hubner (mariposa de uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (larva de melão); D. nitidalis Stoll (larva de pepinos); Diatraea grandiosella Dyar (broca do milho do sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca da cana-de-açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca do arroz mexicana); Ephestia elutella Hubner (traça do tabaco (cacau)); Galleria mellonella Linnaeus (grande traça da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de tenda de relvado); Homoeosoma electellum Hulst (traça do girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca do caule de milho menor); Achroia grisella Fabricius (traça da cera menor); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta de tenda da beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (lagarta de tenda da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca da vagem do feijão); Plodia interpunctella Hubner (mariposa indiana); Scirpophaga incertulas Walker (broca amarela do caule); Udea rubigalis Guenee (cigarra de aipo); e pragas de folha, pragas de brotos, pragas de sementes e frutas na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (Western budheaded budworm); A. variana Fernald (traça de cabeça negra do oeste); Archips argyrospila Walker (pulgão de enrolamento de folhas de árvores frutíferas); A. rosana Linnaeus (pulgão de enrolamento de folhas europeu); e outras espécies de Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (mariposa tortrix de frutas de verão); Cochylis hospes Walsingham (mariposa do girassol rajada); Cydia latiferreana Walsingham (mariposa de avelã); C. pomonella Linnaeus (mariposa das maçãs); Platynota flavedana Clemens (traça matizada); P. stultana Walsingham (larva onívora); Lobesia botrana Denis & Schiffermuller (traça da videira europeia); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller (traça vermelha dos gomos); Endopiza viteana Clemens (traça da uva); Eupoecilia ambiguella Hubner (traça da videira); Bonagota salubricola Meyrick (lagarta-enroladeira da macieira); Grapholita molesta Busck (mariposa oriental); Suleima helianthana Riley (mariposa do botão do girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.

[00316] Outras pragas agronômicas selecionadas na ordem Lepidoptera incluem, mas não estão limitadas a, Alsophila pometaria Harris (lagarta do outono); Anarsia lineatella Zeller (broca do ponteiro do pessegueiro); Anisota senatoria J. E. Smith (lagarta do carvalho listrada de laranja); Antheraea pernyi Guerin-Meneville (mariposa tussar chinesa do carvalho); Bombyx mori Linnaeus (bicho da seda); Bucculatrix thurberiella Busck (Broca da folha do algodão); Colias eurytheme Boisduval (lagarta da alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta da nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (mariposa de seda siberiana), Ennomos subsignaria Hubner (lagarta do olmo); Erannis tiliaria Harris (mariposa de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (mariposa da cauda marrom); Harrisina americana Guerin-Meneville (esqueletizador de folha da videira); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta); Hyphantria cunea Drury (lagarta da teia do outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (traça do tomate); Lambdina fiscellaria Hulst (lagarta de cicuta oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta de cicuta ocidental); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposa cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (traça falcão de cinco manchas, lagarta do tomate); M. sexta Haworth (lagarta do tomate, lagarta do fumo); Operophtera brumata Linnaeus (mariposa do inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta da primavera); Papilio cresphontes Cramer (lagartas gigantes com cauda de andorinha); Phryganidia californica Packard (mariposa de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (larva mineradora da folha dos citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (larva mineradora tentiforme manchada); Pieris brassicae Linnaeus (grande borboleta branca); P. rapae Linnaeus (pequena borboleta branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca de veias verdes); Platyptilia carduidactyla Riley (traça da pluma de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (traça-das- crucíferas); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta rosada); Pontia protodice Boisduval e Leconte (lagarta da couve do sul); Sabulodes aegrotata Guenee (looper onmívoro);

Schizura concinna J. E. Smith (lagarta de costas vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa de grão Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta processionária do pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (traça da roupa de teia); Tuta absoluta Meyrick (traça do tomateiro); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexa Guenee; Malacosoma spp. e Orgyia spp.; Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho); larva da semente do milho; Agrotis ipsilon (lagarta negra).

[00317] Larvas e adultos da ordem Coleoptera, incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, mas não se limitando a: Anthonomus grandis Boheman (bicudo); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgulho aquático do arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho do celeiro); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha do trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule do girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente do girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinza da semente do girassol); Sphenophorus maidis Chittenden (besouro do milho); besouro saltador, besouro do pepino, lagarta da raiz, besouro de folha, besouro de batata e minadores da família Chrysomelidae (incluindo, mas não se limitando a: Leptinotarsa decemlineata Say (escaravelho da batata do Colorado); Diabrotica virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho ocidental); D. barberi Smith e Lawrence (lagarta da raiz do milho do norte); D. undecimpunctata howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro saltador do milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro saltador de crucíferas); Phyllotreta striolata (besouro saltador estriado); Colaspis brunnea Fabricius (besouro saltador da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro das folhas dos cereais); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas não se limitando a: Epilachna varivestis Mulsant (besouro mexicano do feijão)); besouros voadores e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, mas não se limitando a: Popillia japonica Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (besouro voador mascarado do norte, larva branca); C. immaculata Olivier (besouro voador mascarado sul, larva branca); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (besouro voador europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); Ligyrus gibbosus De Geer (escaravelho da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp .; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouro casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae; Cerotoma trifurcate (besouro da folha do feijão); e larva arame.

[00318] Adultos e imaturos da ordem Diptera, incluindo minadores da folha Agromyza parvicornis Loew (mineiro de folhas da mancha de milho); moscas (incluindo, mas não se limitando a: Contarinia sorghicola Coquillett (moscas do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessiana); Sitodiplosis mosellana Gehin (mosca de trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente de girassol)); moscas de fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas da fruta); larvas (incluindo, mas não se limitando a: Delia platura Meigen (larva da semente do milho); D. coarctata

Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outras Delia spp., Meromyza americana Fitch (larva do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas domésticas menores); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas domésticas, moscas-dos-chifres, moscas varajeiras, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas da mosca muscóides, mutuca Tabanus spp .; moscas berneiras Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de gado Hypoderma spp.; moscas dos veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (falso carrapato das ovelhas) e outros Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas pretas Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos picadores, mosquitos palha, ciárídeos e outros Nematocera.

[00319] Adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera, tais como, mas não se limitando a, adelgídeos da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cigarras da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da família Cicadellidae, gafanhotos das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, gafanhotos da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas brancas da família Aleyrodidae, pulgões da família Aphididae, filoxera da família Fíloxera da família Pseudococcidae, insetos escamados das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejos da família Tingidae, percevejos fedorentos da família Pentatomidae, percevejos Blissus spp., e outros percevejos da família Lygaeidae, piolhos da família Cercopidae, percevejos de abóbora da família Coreidae e percevejos vermelhos e manchadores de algodão da família Pyrrhocoridae.

[00320] Membros agronomicamente importantes da ordem Homoptera incluem, mas não estão limitados a: Acyrthisiphon pisum Harris (pulgão da ervilha); Aphis craccivora Koch (pulgão do feijão-caupi); A. fabae Scopoli (pulgão do feijão preto); A. gossypii Glover (pulgão do algodão, pulgão do melão); A. maidiradicis Forbes (pulgão da raiz do milho); A. pomi De Geer (pulgão da maçã); A. spiraecola Patch (pulgão verde dos citros); Aulacorthum solani Kaltenbach (pulgão da dedaleira); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgão do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (pulgão do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (pulgão rosado das macieiras); Eriosoma lanigerum Hausmann (pulgão lanígero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (pulgão da couve); Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgão da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (pulgão do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (pulgão dos cereais); Macrosiphum euphorbiae Thomas (pulgão da batata); Myzus persicae Sulzer (pulgão do pêssego, pulgão do pêssego verde); Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgão da alface); Pênfigo spp. (pulgões da raiz e pulgões das galhas); Rhopalosiphum maidis Fitch (pulgão da folha do milho); R. padi Linnaeus (piolho-da- cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão verde); Sipha flava Forbes (pulgão amarelo da cana-de- açúcar); Sitobion avenae Fabricius (pulgão de grão inglês); Therioaphis maculata Buckton (pulgão de alfafa manchado); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (pulgão de cítrico preto) e T. citricida Kirkaldy (pulgão de cítrico marrom); Melanaphis sacchari (pulgão da cana-de-açúcar); Adelges spp.

(adelgídeos); Phylloxera devastatrix Pergande (pulgão de folha de noz pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata-doce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca-branca de folha prateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asas em faixas) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (lagartixa marrom menor); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nigropictus Stal (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stal (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha do dorso branco); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha da maçã branca); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya buyeri Maskell (escala de almofada de algodão); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (piolho de São José); Planococcus citri Risso (cochonilha de citrus); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilhas); Cacopsylla pyricola Foerster (psila das peras); Trioza diospyri Ashmead (psila de dióspiro).

[00321] As espécies da ordem Hemiptera incluem, mas não estão limitadas a: Acrosternum hilare Say (percevejo fedorento verde); Anasa tristis De Geer (pragad e abóbora); Blissus leucopterus Say (percevejo de gramínea); Corythuca gossypii Fabricius (percevejo de renda de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (percevejo do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (manchador de algodão);

Euschistus servus Say (percevejo fedorento marrom); E. variolarius Palisot de Beauvais (um percevejo fedorento manchado); Graptostethus spp. (complexo de pragas de semente); Leptoglossus corculus Say (percevejo pés de folha de sementes de pinheiro); Lygus lineolaris Palisot de Beauvais (percevejo de planta manchado); L. Hesperus Knight (inseto da planta manchada do oeste); L. pratensis Linnaeus (percevejo comum do prado); L. rugulipennis Poppius (inseto europeu manchado de planta); Lygocoris pabulinus Linnaeus (cápside verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo fedorento verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo fedorento do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (grande percevejo da serralha); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[00322] Hemiptera, tais como, Calocoris norvegicus Gmelin (praga do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (cápside de maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (percevejo do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (inseto sugador); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulgão com marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (pulgão do espinheiro da Virgínia); Labopidicola allii Knight (praga da planta de cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulgão do algodão); Adelphocoris rapidus Say (pulgão rápido das plantas); Poecilocapsus lineatus Fabricius (pulgão de quatro plantas forradas); Nysius ericae Schilling (pulgão falso percevejo); Nezara viridula Linnaeus (percevejo fedorento verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[00323] Adultos e larvas da ordem Acari (ácaros), tais como Aceria tosichella Keifer (ácaro do trigo); Petrobia latens Muller (ácaro marrom do trigo); ácaros-aranha e ácaros vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (dois ácaros-aranha manchados); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaros-aranha morango); ácaros chatos na família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro chato de citrus); ácaros de cor amarelada a rosada na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes para a saúde humana e animal, isto é, ácaros de poeira da família Epidermoptidae, ácaros dermosíticos da família Demodicidae, ácaros dos grãos da família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato de veado); I. holocyclus Neumann (carrapato australiano da paralisia); Dermacentor variabilis Say (carrapato de cão americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela solitária) e ácaros da sarna nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.

[00324] Pragas de insetos da ordem Thysanura, tal como Lepisma saccharina Linnaeus (traça); Thermobia domestica Packard (tesourinha).

[00325] Pragas artrópodes adicionais incluem: aranhas na ordem Araneae, tais como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha marrom reclusa) e o Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra) e centopéias na ordem Scutigeromorpha, tal como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia caseira).

[00326] Superfamília de percevejos fedorentos e outros insetos relacionados, incluindo, mas não se limitando a, espécies pertencentes à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, e Bagrada hilaris (Bagrada Bug)), a família Plataspidae (Megacopta cribraria-plataspídeo do feijão) e a família Cydnidae (Scaptocoris castanea-inseto fedorento de raiz) e espécies de Lepidoptera incluindo, mas não se limitando a: mariposa de dorso de diamante, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; mariposa de soja, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta de soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hubner.

[00327] Os nematódeos incluem nematódeos parasitas, tais como, nematódeos de nódulos de raiz, de cisto e de lesão, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos de cisto, incluindo, mas não se limitando a, Heterodera glycines (nematódeo de cisto de soja); Heterodera schachtii (nematódeo do cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematoide de cisto de cereal) e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematoide de cisto de batata). Nematoides de lesão incluem Pratylenchus spp. Composições de Pesticidas que Compreendem um Pesticida e um Micróbio da Revelação

[00328] Como mencionado acima, as composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse documento, às vezes são combinadas com um ou mais pesticidas. Os pesticidas podem incluir herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, etc.

[00329] Em algumas modalidades, as combinações pesticidas/microbianas podem ser aplicadas na forma de composições e podem ser aplicadas à área de cultivo ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, herbicidas, crioprotetores, surfactantes, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos dormentes, polímeros e/ou formulações de liberação temporizada ou carreadoras biodegradáveis que permitem a dosagem de longo prazo de uma área alvo após uma única aplicação da formulação. Eles também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas ou misturas de várias dessas preparações, se desejado, juntamente com outros carreadores, tensoativos ou adjuvantes promotores de aplicação agricolamente aceitáveis habitualmente empregados na técnica da formulação. Os carreadores adequados (isto é, carreadores aceitáveis em agricultura) e adjuvantes podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias normalmente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes de aderência, agentes de aderência, aglutinantes ou fertilizantes. Da mesma forma, as formulações podem ser preparadas em iscas comestíveis ou moldadas em armadilhas de pragas para permitir a alimentação ou ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.

[00330] Composições químicas exemplificativas, que podem ser combinadas com os micróbios da revelação, incluem: Herbicidas para Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazins, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halo sulfuron Gowan,

Paraquat, Propizamida, Sethoxydim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Insecticidas para Frutas/Veqetais: aldicarb, Bacillus thuringiensis, carbaril, carbofurano, clorpirifós, cipermetrina, deltametrina, diazinon, Malationa, Abamectina, Ciflutrina/betaciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, bifenazato, Metoxifenozida, novaluron, Cromafenozida, tiaclopride, dinotefurano, Fluacripirim, Tolfenpirad, Clotianidina, espirodiclofeno, Gama-cialotrina, espiromesifeno, Espinosade, Rynaxypyr, Cyazypyr, espinoteram, Triflumuron, espirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofen, Cianopirafen, Imidacloprid, Clotianidina, Thiametoxam, espinotoram, Tiodicarb, Flonicamid, Metiocarb, benzoato de emamectina, Indoxacarb, Fortiazato, Fenamifós, Cadusafós, Piriproxifeno, óxido de fembutatina, Hexthiazox, Metomil, 4-[[(6- Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)- ona; Fungicidas para Frutas e vegetais: carbendazim, clorotalonil, EBDCs, enxofre, tiofanato-metílico, azoxistrobina, cimoxanil, fluazinam, fosetil, iprodiona, cresoxime-metílico, Metalaxil/mefenoxam, trifloxistrobina, etaboxam, iprovalicarbe, trifloxistrobina, fenexamida, fumarato de oxpoconazol, ciazofamida, fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalid; Herbicidas para Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, loxinil, Fenóxis, Chlorsulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluoroxypyr, Metsulfuron, Triasulfuron, Flucarbazona, lodosulfurona, Propoxicarbazona, Picolinafeno, Mesosulfuron, Beflubutamid, Pinoxaden, Amidosulfuron, Tifensulfuron-metílico,

Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfosulfuron, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralkoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas para Cereais: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorfe, Epoxiconazol, Cresoxim-metílico, Quinoxyfen, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, fluoxastrobina; Inseticidas para Cereais: Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β- ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Clorpirifós , Metamidofós, oxidemeton-metílico, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas para milho: Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralide, S-Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, S-Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfona; Inseticidas para milho: Carbofurano, Clorpirifós, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufós, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rynaxypyr, Deltametrina, Thiodicarb, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirinfós, Etiprole, Ciazipir, Tiaclopride, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarb, espirodiclofeno, espirotetramato; Fungicidas para milho: Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas para arroz: Butacloro, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron,

Cialofope, Daimuron, Fentrazamida, Imazosulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclona, Piriftalide, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfurom, Pretilacloro, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Inseticidas para Arroz: Diazinon, fenitrotiona, Fenobucarb, Monocrotofós, benfuracarb, buprofezina, dinotefurano, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, tiaclopride, Cromafenozida, tiaclopride, dinotefurano, clotianidina, Etiprole, Flubendiamida, Rynaxypyr, Deltametrina, acetamiprida, tiametoxam, Cyazypyr, Espinosade, espinotoram, Emamectina-Benzoato, Cipermetrina, Clorpirifós, Cartap, Metamidofós, Etofenprox, Triazofós, 4- [[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan- 2(5H)-ona, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas para arroz: Tiofanato-metílico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfós, Ferimzona, Iprobenfós, Isoprotiolano, Pencicurom, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas para algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butílico, Glifosata, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac-sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Inseticidas para Algodão: acefato, aldicarb, clorpirifós, cipermetrina, deltametrina, malationa, monocrotofós, abamectina, acetamiprida, Benzoato de Emamectina, imidacloprida, indoxacarb, lambda-cialotrina, espinosade, Tiodicarb, Gama-Cialotrina, espiromesifeno, piridalil, flonicamid, Flubendiamida, triflumuron, Rinaxypyr, Beta-

Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Cyazypyr, Espinosade, espinotoram, gama Cialotrins, 4-[[(6- Clorpiridin-3-il)metil](2,2-aminodifluoretil)amino]furan-2- (5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofós, Triazofós, Endosulfano; Fungicidas para Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas para soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron-Etílico, Cloransulam-Metílico, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquim, Imazetapir, (S-)Metolacloro, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Insecticidas para soja: Lambda- cialotrina, metomil, paration, Tiocarb, imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, tiaclopride, acetamiprida, Dinetofuran, Flubendiamida, Rynaxypyr, Cyazypyr, espinosade, espinotoram, benzoato de emamectina, fipronil, Etiprole, Deltametrina, β-ciflutrina, gama e lambda cialotrina, 4- [[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan- 2(5H)-ona, espirotetramat, espinodiclofeno, triflumuron, flonicamida, tiodicarb, beta-ciflutrina; Fungicidas para Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas para beterraba sacarina: cloridazon, desmedifam, etofumesato, fenmedifam, trialato, clopyralid, fluazifop, lenacil, metamitron, quinmerac, cicloxidima, triflusulfuron, tepraloxidim, quizalofop; Inseticidas para beterraba sacarina: imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, tiacloprida, acetamiprida, dinetofurano, deltametrina, β-

ciflutrina, gama/lambda cialotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3- il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rynaxypyr, Cyaxypyr, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas para canola: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina Etametsulfurona, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas para Canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Prochloraz, Vinclozolin; Inseticidas para canola: organofosfatos de carbofurano, piretróides, tiaclopride, deltametrina, imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, acetamiprida, dinetofurano, β-ciflutrina, gama e lambda cialipirrina, tau- Fluvaleriato, Etiprole, espinosad, espinotoram, Flubendiamida, Rynaxypyr, Cyazypyr, 4-[[(6-Clorpiridin-3- il)metil] (2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona. Composições Inseticidas Compreendendo um Inseticida e um Micróbio Da Revelação

[00331] Como mencionado acima, as composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse documento, às vezes são combinadas com um ou mais de inseticidas.

[00332] Em algumas modalidades, as composições inseticidas podem ser incluídas nas composições estabelecidas nesse documento e podem ser aplicadas a uma planta(s) ou parte(s) da(s) mesma(s) simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Os inseticidas incluem carbonato de amônio, silicato de potássio aquoso, ácido bórico, sulfato de cobre, enxofre elementar, enxofre de cal, ésteres de octanoato de sacarose, 4-[[(6-clorpiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furano-2(5H)-ona,

abamectina, notenona, fenazaquina, fenopiroximato, piridabeno, pirimedifeno, tebufenpirade, tolfenpirade, acefato, benzoato de emamectina, lepimectina, milbemectina, hidropreno, quinopreno, metopreno, fenoxicarb, piriproxifeno, brometo de metirila e outros haletos de alquila, fluoreto de fulfurila, cloropicrina, bórax, octaborato dissódico, borato de sódio, metaborato de sódio, tártaro emético, dazomet, metam, pimetrozina, pirifluquinazon, flofoxentezina, diflovidazin, hexitiazox, bifenazato, tiametoxam, imidacloprida, fenpiroximato, azadiractina, permetrina, esfenvalerato, acetamiprida, bifentrina, indoxacarb, azadiractina, piretrina, imidacloprida, beta-ciflutrina, sulfotep, tebupirimfós, temefós, terbufós, tetraclorvinfós, tiometon, triazofós, alanicarb, aldicarb, bendiocarb, benfluracarb, butocarboxim, butoxicarboxim, carbaril, carbofurano, carbosulfano, etiofencarb, fenobucarb, formetanato, furatiocarb, isoprocarb, metiocarb, metimil, metolcarb, oxamil, primicarb, propoxur, tiodicarb, tiofanox, triazamato, trimetacarb, XMC, xililcarb, acefato, azametifós, azinfós- etílico, azinfós-metílico, cadusafós, cloretoxifox, triclorfon, vamidotion, clordano, endosulfano, etiprol, fipronil, acrinatrina,, aletrina, bifentrina, bioaletrins, bioaleterina X-ciclopentenil, bioresmetrins, ciclorotrina, ciflutrina, cialotrina, cipermetrina, cifenotrin[(1R)- trans-isômeros], deltametrins, empentrins [(EZ)-(1R)- isômeros], esfenvalerato, etofenprox, fenpropatrins, fenvalerato, flucitrinato, flumetrina, halfenprox, cadatrina, fenotrina[(1R)-trans-isômero]praletrina, piretrinas (piretro), resmetrins, silafluofeno, teflutrina,

tetrametrina, tetrametrina[(1R)-isômeros], tralometrins, transflutrins, alfa-cipermetrina, beta-ciflutrina, beta- cipermetrina, d-cis-trans aletrina, d-trans aletrina, gama- cialotrina, lamda-cihalotrins, tau-fluvalinato, teta- cipermetrina, zeta-cipermetrina, metoxicloro, nicotina, sulfoxaflor, acetamiprida, clotianidina, dinotefurano, imidacloprida, nitenpiram, tiacloprida, tiametoxam, tebuprimfós, beta-ciflutrina, clotianidina, flonicamid, hidrametilnons, amitraz, flubendiamids, blorantraniliprol, lambda cialotrina, espinosad, gama cialotrina, Beauveria bassiana, extrato de capsicum oleoresin, óleo de alho, carbarila, clorpirifós, sulfoxaflor, cialotrina lambda, clorfenvinfós, clormefós, clorpirifós, clorpirifós- metílico, Cumafós, Cianofós, Demeton-S-metílico, diazinon, diclorvós/DDVP, dicrotofós, dimetoato, dimetilvinfós, Disulfoton, EPN, Etiona, etoprofós, famfur, fenamifós, fenitrotiona, fentiona, fostiazato, Heptenofós, Imiciafós, Isofenfós, isopropil O- (metoxiaminotio- fosforil)salicilato, Isoxationa, malationa, mecarbame, Metamidofós, Metidationa, Mevinfós, monocrotofós, Naled, ometoato, oxidemetona-metílico, parationa, parationa- metílico, Fentoato, Foroato, Fosalona, Fosmet, Fosfamidona, foxim, Pirimifós-metílico, Profenofós, Propetanfós, Protiofós, Piraclofós, Piridafentiona, Quinalfosfluacripirim, tebufenozida, clorantranusprol, Bacillus thuringiensis subs.

Kurstaki, terbufós, óleo mineral, fenpropatrina, metaldeído, deltametrina, diazinona, dimetoato, diflubenzurona, piriproxifeno, óleo de alecrim, óleo de hortelã-pimenta, geraniol, azadiractina, butóxido de piperonila, ciantraniliprol, alfa cipermetrina, teflutrina,

teflutrina, pimetrozina, malationa, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, dicofol, bromopropilato, benzoximato, azadiractina, flonicamida, óleo de soja, Chromobacterium subtsugae cepa PRAA4-1, zeta cipermetrina, fosmet, metoxifenozida, óleo parafínico, espirotetramat, metomil, Metarhizium tetratinum cepa F52, etoprop, tetradifon, propargita, óxido de fenbutatina, azociclotina, ciexatina, diafentiuron, Bacillus sphaericus, etoxazol, flupiradifurona, azadiractina, Beauveria bassiana, ciflumetofeno, azadiractina, quinometionato, acefato, Isaria fumosorosea Apopka cepa 97, tetraborohidrato de sódio deca- hidratado, benzoato de emamectina, criolite, espinetorame, extrato de Chenopodium ambrosioides, novaluron, dinotefurano, carbaril, acequinocil, flupiradifurons, fosfato de ferro, caulim, buprofezina, ciromazina, cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida, tebufenozida, bistrifluron, clorfluazuron, diflubenzuron, flucicloxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, nocaluron, noviflumuron, teflubenzuron, triflumuron, bensultap, cloridrato de cartap, tiociclame, tiossultap-sódico, DNOC, clorfenapir, sulfuramida, forato, tolfenpirad, sulfoxaflor, óleo de nim, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis cepa SA-10, ciromazina, Burkholderia spp. exterminado por calor, ciantraniliprol, cianopirrafeno, ciflumetofeno, cianeto de sódio, cianeto de potássio, cianeto de cálcio, fosfeto de alumínio, fosfeto de cálcio, fosfina, fosfeto de zinco, espriodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramat, metaflumizona, flubendiamida, piflubumida, oxamil, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, etoxazol e esfenvalerato.

Tabela 9. Inseticidas exemplificativas associados a vários modos de ação, que podem ser combinados com micróbios da revelação Modo de ação Classe do Inseticidas exemplificativos Função(ões) Composta fisiológica(s) afetada(s)

inibidores da carbamatos Alanicarbe, Aldicarbe, Nervo e acetilcolinesterase Bendiocarbe, Benfuracarbe, músculo (AChE) Butocarboxim, Butoxicarboxim, Carbaril, Carbofurano, Carbossulfano, Etiofencarbe, Fenobucarbe, Formetanato, Furatiocarbe, Isoprocarbe, Metiocarbe, Metomil, Metolcarbe, Oxamil, Pirimicarbe, Propoxur, Tiodicarbe, Tiofanox, Triazamato, Trimetacarbe, XMC, Xililcarbe inibidores da organofosforatos Acefato, Azametifós, Nervo e acetilcolinesterase Azinfós-etila, Azinfós- músculo (AChE) metílicoa, Cadusafós, cloretoxifós, clorfenvinfós, clormefós, clorpirifós, clorpirifós-metílico, Coumafós, Cianofós, Demeton- S-metílico, diazinon, diclorvós/DDVP, dicrotofós, dimetoato, dimetilvinfós, Dissulfotom, EPN, Ethion, etoprofós, Famphur, Fenamifós, Fenitrotion, Fenthion, Fostiazato, Heptenofós, Imiciafós, Isofenfós, Isopropil O- (metoxiaminotio-fosforil) salicilato, Isoxationa, Malationa, Mecarbama, Metamidofós, Naled, Ometoato, Oxidemeton- metílico, Paration, Paration -metílico, fentoato, Forato, Fosalona, Fosmete, Fosfamidon, Phoxim, Pirimifós-metílico, Profenofós, Propetanfós, Protiofós, Piraclofós, Piridafentiona, Quinalfós, Sulfotepe, Tebupirinfós,

Modo de ação Classe do Inseticidas exemplificativos Função(ões) Composta fisiológica(s) afetada(s)

Temefós, Terbufós, Tetraclorvinfós, Tiometon, Triazofós, Triclorfon, Vamidotion Bloqueadores de organoclorados de Clordano, Endosulfano Nervo e canal de cloreto ciclodienos músculo controlados por GABA Bloqueadores de fenilpirazóis Etiprole, fipronil Nervo e canal de cloreto (Fiproles) músculo controlados por GABA moduladores do canal piretróides, Acrinatrina, Aletrina, Nervo e de sódio piretrinas Bifentrina, Bioaletrina, músculo Bioaletrina S-ciclopentenil, Bioresmetrina, Cicloprotrina, Ciflutrina, Cialotrina, Cipermetrina, Cifenotrina [(1R)-trans- isômeros], Deltametrina, Empentrina [(EZ)-(1R)- isômeros], Esfenvalerato, Etofenprox, Fenpropatrina, Fenvalerato, Flucitrinato, Flumetrina, Halfenprox, Kadatrim, Fenotrina [(1R) - trans-isômero], Praletrina, Piretrina (piretro), Resmetrina, Silafluofeno, Teflutrina, Tetrametrina, Tetrametrina [(1R)- isômeros], Tralometrina, transflutrina, alfa-cipermetrina, beta- ciflutrina, beta- cipermetrina, d-cis-trans aletrina, d-trans aletrina, gama-cialotrina, lambda- cialotrina, tau-fluvalinato, teta-cipermetrina, zeta- cipermetrina moduladores do canal DDT, metoxicloro DDT, metoxicloro Nervo e de sódio músculo moduladores neonicotinoides Acetamiprida, Clotianidina, Nervo e competitivos do Dinotefurano, Imidacloprida, músculo receptor nicotínico Nitenpiram, Tiacloprida, de acetilcolina Tiametoxam (nAChR) moduladores nicotina nicotina Nervo e

Modo de ação Classe do Inseticidas exemplificativos Função(ões) Composta fisiológica(s) afetada(s)

competitivos do músculo receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) moduladores sulfoximinas sulfoxaflor Nervo e competitivos do músculo receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) moduladores butenolídeos Flupiradifurona Nervo e competitivos do músculo receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) moduladores espinosinas Espinetoram, Espinosade Nervo e alostéricos de músculo receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) Moduladores avermectinas, Abamectina, benzoato de Nervo e alostéricos de canal milbemicinas emamectina, lepimectina, músculo de cloreto bloqueado milbemectina por glutamato (GluCl) Simulados de Análogos do Hidropreno, Quinopreno, Crescimento hormônio juvenil hormônio juvenil Metopreno Simulados de Fenoxicarbe Fenoxicarbe Crescimento hormônio juvenil Simulados de Piriproxifeno Piriproxifeno Crescimento hormônio juvenil diversos inibidores haletos de Brometo de metila e outros Desconhecido não específicos alquila haletos de alquila ou não (multilocais) específico diversos inibidores Cloropicrina Cloropicrina Desconhecido não específicos ou não (multilocais) específico diversos inibidores fluoretos Criolita, fluoreto de Desconhecido não específicos sulfurila ou não (multilocais) específico diversos inibidores boratos Bórax, ácido bórico, Desconhecido não específicos octaborato dissódico, borato ou não (multilocais) de sódio, metaborato de sódio específico diversos inibidores tártaro emético tártaro emético Desconhecido não específicos ou não (multilocais) específico diversos inibidores geradores de Dazomet, Metam Desconhecido não específicos isotiocianato de ou não

Modo de ação Classe do Inseticidas exemplificativos Função(ões) Composta fisiológica(s) afetada(s)

(multilocais) metila específico moduladores de Derivados de Pimetrozina, Nervo e órgãos cordotonais piridina de Pirifluquinazona músculo azometina inibidores de Clofentezina, Clofentezina, Diflovidazina, Crescimento crescimento de Diflovidazina, Hexitiazox ácaros Hexitiazox inibidores de Etoxazol Etoxazol Crescimento crescimento de ácaros rompedores Bacillus Bt var. aizawai, Bt var.

Intestino microbianos das thuringiensis e israelensis, Bt var. médio membranas as proteínas kurstaki, Bt var. intestinais dos inseticidas que tenebrionensis insetos eles produzem rompedores Bacillus Bacillus sphaericus Intestino microbianos das sphaericus médio membranas intestinais dos insetos inibidores da ATP Diafentiuron Diafentiuron Respiração sintase mitocondrial inibidores da ATP miticidas Azociclotina, ciexatina, Respiração sintase mitocondrial organoestânicos óxido de fembutatina inibidores da ATP Propargita Propargita Respiração sintase mitocondrial inibidores da ATP Tetradifon Tetradifon Respiração sintase mitocondrial desacopladores de Clorfenapir, Clorfenapir, DNOC, Respiração fosforilação DNOC, Sulfuramida Sulfuramida oxidativa via ruptura do gradiente de prótons Bloqueadores do análogos de Bensultap, cloridrato de Nervo e canal do receptor nereistoxina Cartap, tiociclam, músculo nicotínico da Tiosultap-sódico acetilcolina (nAChR) inibidores da benzoilureia Bistrifluron, Clorfluazuron, Crescimento biossíntese de Diflubenzuron, quitina, tipo 0 Flucicloxuron, Flufenoxuron, Hexaflumuron, Lufenuron, Novaluron, Noviflumuron, Teflubenzuron, Triflumuron inibidores da Buprofezina Buprofezina Crescimento biossíntese de quitina, tipo 1 rompedor de muda, Ciromazina Ciromazina Crescimento

Modo de ação Classe do Inseticidas exemplificativos Função(ões) Composta fisiológica(s) afetada(s)

Dipterano agonistas do diacil-hidrazinas Cromafenozida, Halofenozida, Crescimento receptor de ecdisona Metoxifenozida, Tebufenozida agonistas do Amitraz Amitraz Nervo e receptor de musculo octopamina inibidores do Hidrametilnona Hidrametilnona Respiração transporte de elétrons do complexo III mitocondrial inibidores do Acequinocil Acequinocil Respiração transporte de elétrons do complexo III mitocondrial inibidores do Fluacripirim Fluacripirim Respiração transporte de elétrons do complexo III mitocondrial inibidores do Bifenazato Bifenazato Respiração transporte de elétrons do complexo III mitocondrial inibidores do Meti acaricidas e Fenazaquina, Fenpiroximato, Respiração transporte de inseticidas piridabem, Pirimidifeno, elétrons do complexo Tebufenpiraz, Tolfenpirad I mitocondrial inibidores do rotenona Rotenona Respiração transporte de elétrons do complexo I mitocondrial bloqueadores do oxadiazinas Indoxacarb Nervo e canal de sódio músculo dependentes de voltagem bloqueadores do semicarbazonas Metaflumizona Nervo e canal de sódio músculo dependentes de voltagem inibidores da acetil derivados de Eespirodiclofeno, Crescimento CoA carboxilase ácido tetrônico e Eespiromesifenoo, tetrâmico Eespirotetramat inibidores do fosfetos Fosfeto de alumínio, fosfeto Respiração transporte de de cálcio, fosfina, fosfeto elétrons do complexo de zinco mitocondrial IV inibidores do cianetos Cianeto de cálcio, cianeto de Respiração transporte de potássio, cianeto de sódio

Modo de ação Classe do Inseticidas exemplificativos Função(ões) Composta fisiológica(s) afetada(s) elétrons do complexo mitocondrial IV inibidores do derivados de Cienopirafeno, Ciflumetofeno Respiração transporte de beta-cetonitrila elétrons do complexo II mitocondrial inibidores do carboxanilidas Piflubumida Respiração transporte de elétrons do complexo II mitocondrial moduladores do diamidas Clorantraniliprol, Nervo e receptor de Ciantraniliprol, músculo rianodina Flubendiamida Moduladores de Flonicamida Flonicamida Nervo e órgãos cordotonais - músculo local de destino indefinido compostos de modo de Azadiractina Azadiractina Desconhecida ação desconhecido ou incerta compostos de modo de Benzoximato Benzoximato Desconhecida ação desconhecido ou incerta compostos de modo de Bromopropilato Bromopropilato Desconhecida ação desconhecido ou incerta compostos de modo de quinometionato Quinometionato Desconhecida ação desconhecido ou incerta compostos de modo de Dicofol Dicofol Desconhecida ação desconhecido ou incerta compostos de modo de enxofre e cal enxofre e cal Desconhecida ação desconhecido ou incerta compostos de modo de Piridalil Piridalil Desconhecida ação desconhecido ou incerta compostos de modo de enxofre enxofre Desconhecida ação desconhecido ou incerta Tabela 10. Lista de exemplo de pesticidas, que podem ser combinados com micróbios da revelação Categoria Compostos

INSETICIDAS

Categoria Compostos arseniato de cálcio acetoarsenita de cobre arseniato de cobre inseticidas arsenicais arseniato de chumbo arsenito de potássio arsenito de sódio alicina anabasina azadiractina carvacrol d-limoneno matrina nicotina nornicotina oximatrina piretrinas cinerinas cinerina I inseticidas botânicos cinerina II Jasmolina I Jasmolina II piretrina I piretrina II Quássia rodojaponina-III rotenona ryania sabadilla sanguinarino triptólido bendiocarb inseticidas carbamato carbaril benfuracarb carbofurano Inseticidas de metilcarbamato de carbosulfano benzofuranila decarbofurano furatiocarb dimetano dimetilano hipquincarb inseticidas de dimetilcarbamato isolano pirimicarb piramat pirolan alanicarb aldicarb aldoxicarb inseticidas de carbamato de oxima butocarboxim butoxicarboxim metomil

Categoria Compostos nitrilacarb oxamil tazimcarb tiocarboxim tiodicarb tiofanox alilxicarb aminocarb bufencarb butacarb carbanolato cloetocarb

CPMC dicresil dimetacarb dioxacarb

EMPC etiofencarb inseticidas de fenil metilcarbamato fenetacarb fenobucarb isoprocarb metiocarb metolcarb mexacarbato promacil promecarb propoxur trimetacarb

XMC xililcarb broflanilida clorantraniliprol ciantraniliprol inseticidas diamida ciclaniliprol cialodiamida flubendiamida tetraniliprol dinex dinoprop inseticidas dinitrofenol dinosam

DNOC hexafluorossilicato de bário criolita flursulamida inseticidas de flúor Fluoreto de Sódio hexafluorossilicato de sódio sulfluramida amitraz inseticidas formamidina clordimeforme

Categoria Compostos formetanato formparanato medimeforme semiamitraz acrilonitrila dissulfeto de carbono tetracloreto de carbono sulfeto de carbonila clorofórmio cloropicrina cianogênio para-diclorobenzeno 1,2-dicloropropano ditioéter formiato de etila dibrometo de etileno inseticidas fumigantes dicloreto de etileno óxido de etileno Cianeto de hidrogênio brometo de metila iodeto de metila metilclorofórmio cloreto de metileno naftaleno fosfina tetratiocarbonato de sódio fluoreto de sulfurila tetracloroetano bórax ácido bórico polissulfeto de cálcio oleato de cobre inseticidas inorgânicos terra de diatomáceas cloreto mercuroso tiocianato de potássio gel de sílica tiocianato de sódio reguladores de crescimento de insetos buprofezina inibidores da síntese de quitina ciromazina bistriflurona clorbenzurona clorfluazurona diclorbenzurona inibidores da síntese de quitina diflubenzurona benzoilfenilureia flucicloxurona flufenoxurona hexaflumurona lufenurona novalurona

Categoria Compostos noviflumurona penflurona teflubenzurona triflumurona dayoutong epofenonano fenoxicarb hidropreno simuladores de hormônio juvenil quinopreno metopreno piriproxifeno tripreno hormônio juvenil I hormônios juvenis hormônio juvenil II hormônio juvenil III cromafenozida furano tebufenozida halofenozida agonistas do hormônio da muda metoxifenozida tebufenozida Yishijing α-ecdisona hormônios de muda ecdisterona inibidores de muda diofenolano Precoceno I precocenos precoceno II precoceno III reguladores de crescimento de insetos não diciclanil classificados inseticidas de lactona macrocíclica abamectina doramectina emamectina inseticidas de avermectina eprinomectina ivermectina selamectina lepimectina milbemectina inseticidas de milbemicina milbemicina oxima moxidectina espinetoram Inseticidas de espinosina espinosade inseticidas neonicotinoides clotianidina dinotefurano inseticidas neonicotinoides de imidacloprida nitroguanidina imidaclotiz tiametoxam inseticidas neonicotinoides de nitenpiram

Categoria Compostos nitrometileno nitiazina acetamiprida imidacloprida inseticidas neonicotinóides de Nitenpiram piridilmetilamina paichongding tiaclopride bensultap cartap inseticidas análogos de nereistoxina politialano tiociclam tiosultap bromo-DDT canficloro

DDT pp′-DDT etil-DDD inseticidas organoclorados HCH gama-HCH lindano metoxicloro pentaclorofenol

TDE aldrina bromocicleno clorbicicleno clordano clordecona dieldrina dilor endosulfano inseticidas ciclodienos alfa-endosulfano endrina

HEOD heptacloro

HHDN isobenzano isodrina Quelevan mirex inseticidas organofosforados bromfenvinfós Calvinfós clorfenvinfós crotoxifós diclorvós inseticidas organofosforado dicrotofós dimetilvinfós fospirar heptenofós metocrotofós

Categoria Compostos mevinfós monocrotofós naled naftalofós fosfamidona propafós

TEPP tetraclorvinfós dioxabenzofós inseticidas organotiofosforados Fosmetilano fentoato acetion acetofós amiton cadusafós cloretoxifós clormefós demefion demefion-O demefion-S Demeton demeton-O Demeton-S demeton-metílico demeton-O-metílico demeton-S-metílico inseticidas organotiofosforados demeton-S-metilssulfona alifáticos disulfotona Etiona etoprofós

IPSP isotioato malationa metacrifós metilacetofós oxidemetona-metílico oxideprofós Oxidisulfotona forato sulfotep terbufós tiometona amidition ciantoato dimetoato inseticidas organotiofosforados etoato-metílico de amida alifática formotiona mecarbam ometoato protoato

Categoria Compostos sofamida vamidotiona clorfoxim inseticidas organotiofosfato oxima foxim foxim-metílico azametifós colofonato coumafós coumitoato dioxationa endotiona inseticidas organotiofosforados menazona heterocíclicos morfotiona fosalona piraclofós pirazotiona piridafentiona quinotiona inseticidas organotiofosforados diticrofós benzotiopiranos ticrofós inseticidas organotiofosfato de azinfós-etila benzotriazina azinfós-metílico dialifós inseticidas organotiofosforados isoindol fosmet isoxationa inseticidas organotiofosforados isoxazol zolaprofós inseticidas organotiofosforados clorprazofós pirazolopirimidina pirazofós inseticidas organotiofosfato de clorpirifós piridina clorpirifós-metílico butatiofós diazinona etrimfós lirimfós pirimioxifós inseticidas organotiofosfato de pirimidina pirimifós-etila pirimifós-metílico primidofós pirimitar tebupirimfós inseticidas organotiofosforados quinalfós de quinoxalina quinalfós-metílico atidationa inseticidas organotiofosforados litidationa de tiadiazol metidationa protidationa inseticidas organotiofosforados isazofós de triazol triazofós inseticidas organotiofosforados de fenila azotoato

Categoria Compostos bromofós bromofós-etila carbofenotiona clortiofós cianofós citioato dicapton diclofentiona etafós famfur fenclorfós fenitrotion fensulfotion fentiona fentiona-etila heterofós Jodfenfós mesulfenfós parationa parationa-metílico fencaptona fosnicloro profenofós protiofós sulprofós temefós triclormetafós-3 trifenofós xiaochongliulina butonato inseticidas de fosfonato triclorfona inseticidas de fosfonotioato mecarfona fonofós Inseticidas de etilfosfonotioato de fenila tricloronato cianofenfós inseticidas de fenilfosfonotioato EPN leptofós crufoma fenamifós Fostietano inseticidas de fosforamidato mephosfolan Fosfolan fosfolan-metílico pirimetafós acefato fósforo de cloramina isocarbofós Inseticidas de fosforamidotioato isofenfós isofenfós-metílico metamidofós

Categoria Compostos fosglicina propetanfós dimefox mazidox Inseticidas de fosforodiamida mipafox schradan Inseticidas de oxadiazina indoxacarb inseticidas de oxadiazolona metoxadiazona dialifós inseticidas de ftalimidas fosmet tetrametrina inseticidas físicos maltodextrina ácido bórico inseticidas dessecantes terra de diatomáceas gel de sílica clorantraniliprol ciantraniliprol ciclaniliprol dimetilano inseticidas de pirazol isolano tebufenpirade tetraniliprol Tolfenpirade acetoprol etiprol fipronil flufiprol inseticidas de fenilpirazol piraclofos pirafluprol piriprol pirolano vaniliprol inseticidas piretróides acrinatrina aletrina bioaletrina esdepaletrina Barhrina bifentrina capa-bifentrina bioetanometrina inseticidas de éster de piretróide brofenvalerato broflutrinato brometrina butetrina clorempentrina cicletrina cicloprotrina ciflutrina

Categoria Compostos beta-ciflutrina cialotrina gama-cialotrina lambda-cialotrina cipermetrina alfa-cipermetrina beta-cipermetrina teta-cipermetrina zeta-cipermetrina cifenotrina deltametrina dimeflutrina dimetrina empentrina d-fanshiluquebingjuzhi cloropraletrina fenflutrina fenpiritrina fenpropatrina fenvalerato esfenvalerato flucitrinato fluvalinato tau-fluvalinato furametrina furetrina heptaflutrina imiprotrina japotrinas cadetrina metotrina metoflutrina épsilon-metoflutrina momfluorotrina épsilon-momfluorotrina pentmetrina permetrina biopermetrina transpermetrina fenotrina praletrina proflutrina propartrina piresmetrina renoflutrina meperflutrina resmetrina bioresmetrina cismetrina teflutrina

Categoria Compostos capa-teflutrina teraletrina tetrametrina tetrametilflutrina tralocitrina tralometrina transflutrina valerato etofenprox flufenprox inseticidas de éter piretróide halfenprox protrifenbuto silafluofeno sulfoxima inseticidas de oxima piretróide tiofluoximato flufenerim inseticidas de pirimidinamina pirimidifeno inseticidas de pirrol clorfenapir inseticidas de amônio quaternário sanguinarina Inseticidas de sulfoximina sulfoxaflor inseticidas de ácido tetrâmico espirotetramat Inseticidas de ácido tetrônico espiromesifeno clotianidina imidaclotiz inseticidas tiazólicos tiametoxam tiapronil tazimcarb inseticidas tiazolidina tiaclopride inseticidas de tioureia diafentiuron flucofuron inseticidas de ureia sulcofuron dicloromezotiaz inseticidas zwitteriônicos triflumezopirim afidopiropeno afoxolaner alosamidina closantel naftenato de cobre crotamiton

EXD fenazaflor inseticidas não classificados fenoxacrim flometoquina flonicamida fluhexafona flupiradifurona fluralaner fluxametamida hidrametilnona

Categoria Compostos isoprotiolano Jiahuangchongzong Malonoben metaflumizona nifluridida plifenato piridabeno piridalil pirifluquinazona rafoxanida Turingiensina triarateno triazamato

ACARICIDAS carvacrol acaricidas botânicos sanguinarino azobenzeno benzoximato benzoato de benzila bromopropilato clorbensida clorfenetol clorfenson clorofensulfeto clorobenzilato cloropropilato ciflumetofeno

DDT Acaricidas de difenil em ponte dicofol difenil sulfona dofenapina Fenson fentrifanil fluorbensida genit hexaclorofeno fenpróxido proclonol tetradifona tetrasul benomil carbanolato carbaril carbofurano acaricidas de carbamato metiocarb metolcarb promacil propoxur aldicarb acaricidas de oxima carbamato butocarboxim

Categoria Compostos oxamil tiocarboxime tiofanox acaricidas de carbazato bifenazato binapacril dinex dinobuton dinocap dinocap-4 acaricidas de dinitrofenol dinocap-6 dinoctona dinopentona dinossulfona dinoterbona

DNOC amitraz clordimeforme cloromebuforme acaricidas formamidina formetanato formparanato medimeforme semiamitraz acaricidas lactona macrocíclica tetranactina abamectina doramectina acaricidas avermectinas eprinomectina ivermectina selamectina milbemectina acaricidas milbemicina milbemicina oxima moxidectina clofentezina ciromazina diflovidazina dofenapina reguladores de crescimento de ácaros fluazurona flubenzimina flucicloxurona flufenoxurona hexitiazox bromocicleno canficloro

DDT acaricidas organoclorados dienocloro endosulfano lindano acaricidas organofosforados clorfenvinfós acaricidas organofosforados crotoxifós diclorvós

Categoria Compostos heptenofós mevinfós monocrotofós naled

TEPP tetraclorvinfós amidition amiton azinfós-etila azinfós-metílico azotoato benoxafos bromofos bromofós-etila carbofenotiona clorpirifós clortiofós coumafós ciantoato Demeton demeton-O Demeton-S demeton-metílico demeton-O-metílico demeton-S-metílico demeton-S-metilssulfona dialifós diazinon acaricidas organofosforados dimetoato dioxation disulfoton endotiona Etion etoato-metílico formotion malationa mecarbam metacrifós ometoato oxideprofós Oxidisulfoton paration fencapton forato fosalona fosmet Fostina foxim pirimifós-metílico protidation

Categoria Compostos protoato pirimitato quinalfós quintiofós sofamida sulfotep tiometon triazofós trifenofós vamidotion acaricidas fosfonato triclorfon isocarbofós acaricidas fosforamidotioato metamidofós propetanfós dimefox acaricidas fosforodiamida mipafox schradan azociclotina ciexatina acaricidas organoestânicos óxido de fembutatina Fostina acaricidas fenilsulfamida diclofluanida dialifós acaricidas ftalimida fosmet cienopirrafeno fenpiroximato acaricidas pirazol pirflubumida tebufenpirade acetoprol acaricidas fenilpirazol fipronil vaniliprol acaricidas piretróides acrinatrina bifentrina broflutrinato cialotrina cipermetrina alfa-cipermetrina acaricidas de éster de piretróide fenpropatrina fenvalerato flucitrinato flumetrina fluvalinato tau-fluvalinato permetrina acaricidas de éter piretróide halfenprox acaricidas pirimidinamina pirimidifeno acaricidas pirrol clorfenapir acaricidas de amônio quaternário sanguinarino

Categoria Compostos quinometionato acaricidas quinoxalina tioquinox acaricidas de estrobilurina bifujunzhi acaricidas de estrobilurina de fluacripirim metoxiacrilato flufenoxistrobina piriminostrobina aramita Acaricidas de éster sulfito Propargita acaricidas de ácido tetrônico espirodiclofeno clofentezina acaricidas de tetrazina diflovidazina flubenzimina acaricidas de tiazolidina hexitiazox acaricidas de tiocarbamato fenotiocarb clorometiuron acaricidas de tioureia diafentiuron acequinocil afoxolaner amidoflumet óxido de arsenoso clenpirina closantel crotamiton cicloprato cimiazol dissulfiram etoxazol fenazaflor acaricidas não classificados fenazaquim fluenetil fluralaner mesulfeno

MNAF nifluridida nikkomicinas piridabeno sulfiram sulfluramida enxofre Turingiensin triarateno

QUIMOESTERILIZANTES afolato bisazir busulfan diflubenzuron dimatif Hemel

Categoria Compostos hempa metepa metiotepa afolato de metila morzid penfluron tepa thiohempa tiotepa tretamina uredepa

REPELENTES DE INSETOS acrep butopironoxil cânfora d-cânfora carboxida ftalato de dibutila dietiltoluamida carbato de dimetila ftalato de dimetila succinato de dibutila etohexadiol hexamida icaridina metoquin-butila metilneodecanamida 2-(octiltio)etanol oxamato Quwenzhi quyingding rebemida Zengxiaoan

NEMATICIDAS nematicidas de avermectina abamectina nematicidas botânicos carvacrol benomil carbofurano Nematicidas de carbamato carbosulfan cloetocarb alanicarb aldicarb Nematicidas de carbamato de oxima aldoxicarb oxamil tirpato dissulfeto de carbono cianogênio nematicidas fumigantes 1,2-dicloropropano 1,3-dicloropropeno ditioéter

Categoria Compostos brometo de metila iodeto de metila tetratiocarbonato de sódio nematicidas organofosforados diamidafós fenamifós nematicidas organofosforados Fostietano fosfamidona cadusafós clorpirifós diclofentiona dimetoato etoprofós fensulfotion fostiazato nematicidas organofosforados heterofós isamidofós isazofós forato fosfocarb terbufós tionazina triazofós imiciafós nematicidas organofosforados mecarfon acetoprol benclotiaz cloropicrina dazomet

DBCP

DCIP nematicidas não classificados fluazaindolizina fluensulfona furfural metam isotiocianato de metila tioxazafen xilenóis

[00333] Os inseticidas também incluem sinergistas ou ativadores que não são considerados tóxicos ou inseticidas, mas são materiais usados com inseticidas para sinergizar ou intensificar a atividade dos inseticidas. Os sinergistas ou ativadores incluem butóxido de piperonila. Pesticidas Bioracionais

[00334] Os inseticidas podem ser bioracionais ou também podem ser conhecidos como biopesticidas ou pesticidas biológicos. Bioracional refere-se a qualquer substância de origem natural (ou substâncias artificiais semelhantes às de origem natural) que tem um efeito prejudicial ou letal em pragas alvo específicas, por exemplo, insetos, ervas daninhas, doenças de plantas (incluindo nematoides) e pragas de vertebrados possuem um modo de ação único, não são tóxicas para o homem, as plantas e os animais domésticos e têm pouco ou nenhum efeito adverso na vida selvagem e no meio ambiente.

[00335] Inseticidas bioracionais (ou biopesticidas ou pesticidas biológicos) podem ser agrupados como: (1) bioquímicos (hormônios, enzimas, feromônios e agentes naturais, tais como insetos e reguladores de crescimento de plantas), (2) microbianos (vírus, bactérias, fungos, protozoários e nematoides), ou (3) protetores incorporados em plantas (PIPs) - principalmente plantas transgênicas, por exemplo, milho com Bt.

[00336] Biopesticidas, ou pesticidas biológicos, podem incluir amplamente agentes fabricados a partir de microrganismos vivos ou um produto natural e vendidos para o controle de pragas de plantas. Os biopesticidas podem ser: microrganismos, produtos bioquímicos e semioquímicos. Os biopesticidas também podem incluir peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos, tais como, DNA de fita dupla, DNA de fita simples, RNA de fita dupla, RNA de fita simples e DNA ou RNA tipo grampo de cabelo.

[00337] Bactérias, fungos, oomicetos, vírus e protozoários são todos usados para o controle biológico de pragas de insetos. O biopesticida microbiano mais amplamente usado é a bactéria patogênica de insetos Bacillus thuringiensis (Bt), que produz um cristal de proteína (a - endotoxina de Bt) durante a formação de esporos bacterianos que é capaz de causar lise de células intestinais quando consumida por insetos suscetíveis. Os biopesticidas Bt microbianos consistem em esporos bacterianos e cristais de -endotoxina produzidos em massa em tanques de fermentação e formulados como um produto pulverizável. O Bt não prejudica os vertebrados e é seguro para as pessoas, organismos benéficos e meio ambiente. Assim, as pulverizações de Bt são uma tática crescente para o controle de pragas em culturas de frutas e vegetais, onde seu alto nível de seletividade e segurança são considerados desejáveis e onde a resistência a inseticidas químicos sintéticos é um problema. As pulverizações de Bt também têm sido usadas em cultivos de commodities, tais como, milho, soja e algodão, mas com o advento da modificação genética das plantas, os agricultores estão cada vez mais cultivando variedades de cultivos transgênicas com Bt.

[00338] Outros inseticidas microbianos incluem produtos baseados em baculovírus entomopatogênicos. Baculovírus que são patogênicos para artrópodes pertencem à família de vírus e possuem grandes genomas de DNA circulares, covalentemente fechados e de fita dupla que são acondicionados em nucleocapsídeos. Mais de 700 baculovírus foram identificados a partir de insetos das ordens Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. Os baculovírus são usualmente altamente específicos para seus insetos hospedeiros e, portanto, são seguros para o meio ambiente, humanos, outras plantas e organismos benéficos. Mais de 50 produtos de baculovírus foram usados para controlar diferentes pragas de insetos em todo o mundo.

Nos EUA e na Europa, o granulovírus Cydia pomonella (CpGV) é usado como um biopesticida inundativo contra a mariposa das maçãs. O Estado de Washington, como o maior produtor de maçã dos EUA, usa CpGV em 13% da safra de maçã. No Brasil, o nucleopoliedrovírus da lagarta da soja Anticarsia gemmatalis era usado em até 4 milhões de ha (aproximadamente 35%) da cultura da soja em meados da década de 1990. Vírus tais como Gemstar® (Certis EUA) estão disponíveis para controlar larvas de espécies Heliothis e Helicoverpa.

[00339] Pelo menos 170 produtos biopesticidas diferentes com base em fungos entomopatogênicos foram desenvolvidos para uso contra pelo menos cinco ordens de insetos e acarinos em cultivos de estufa, frutas e vegetais do campo, bem como cultivos de commodities. A maioria dos produtos é baseada nos ascomicetes Beauveria bassiana ou Metarhizium anisopliae. M. anisopliae também foi desenvolvida para o controle de pragas de gafanhotos e gafanhotos na África e na Austrália e é recomendada pela Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) para o controle de gafanhotos.

[00340] Vários pesticidas microbianos registrados nos Estados Unidos estão listados na Tabela 16 de Kabaluk et al. 2010 (Kabaluk, JT et al. (Ed.). 2010. The Use and Regulation of Microbial Pesticides in Representative Jurisdictions Worldwide. IOBC Global. 99pp.) e pesticidas microbianos registrados em países selecionados estão listados no Anexo 4 de Hoeschle-Zeledon et al. 2013 (Hoeschle-Zeledon, I., P. Neuenschwander e L. Kumar. (2013). Regulatory Challenges for biological control. SP-IPM Secretariat, International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigéria.

43 pp.), cada um dos quais é incorporado nesse documento em sua totalidade.

[00341] As plantas produzem uma grande variedade de metabólitos secundários que impedem os herbívoros de se alimentarem das mesmas. Alguns deles podem ser usados como biopesticidas. Eles incluem, por exemplo, piretrinas, que são compostos inseticidas de ação rápida produzidos por Chrysanthemum cinerariaefolium. Eles têm baixa toxicidade para mamíferos, mas se degradam rapidamente após a aplicação. Essa curta persistência levou ao desenvolvimento de piretrinas sintéticas (piretróides). O composto botânico mais amplamente usado é o óleo de nim, um inseticida químico extraído das sementes de Azadirachta indica. Dois pesticidas altamente ativos estão disponíveis com base em metabólitos secundários sintetizados por actinomicetos do solo, mas eles foram avaliados pelas autoridades reguladoras como se fossem pesticidas químicos sintéticos. O espinosade é uma mistura de dois compostos macrolídeos de Saccharopolyspora spinosa. Tem uma toxicidade muito baixa para mamíferos e os resíduos degradam-se rapidamente no campo. Os agricultores e cultivadores usaram amplamente após sua introdução em 1997, mas a resistência já se desenvolveu em algumas pragas importantes, tais como tripes das flores ocidentais. A abamectina é um composto de lactona macrocíclica produzido por Streptomyces avermitilis. É ativo contra uma variedade de espécies de pragas, mas também se desenvolveu resistência ao mesmo, por exemplo, em ácaros tetraniquídeos.

[00342] Verificou-se que os peptídeos e as proteínas de vários organismos possuem propriedades pesticidas. Talvez os mais proeminentes sejam os peptídeos do veneno de aranha

(King, G.F. and Hardy, M.C. (2013) Spider-venom peptides: structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.

Annu.

Rev.

Entomol. 58: 475-496). Um arranjo único de ligações dissulfeto em peptídeos de veneno de aranha os torna extremamente resistentes a proteases.

Como resultado, esses peptídeos são altamente estáveis no intestino do inseto e na hemolinfa e muitos deles são oralmente ativos.

Os peptídeos têm como alvo uma ampla faixa de receptores e canais iônicos no sistema nervoso do inseto.

Outros exemplos de peptídeos inseticidas incluem: veneno de anêmona do mar que age nos canais de Na+ controlados por voltagem (Bosmans, F. e Tytgat, J. (2007) Sea anemone venom as a source of insecticidal peptides acting on voltage-gated Na+ channels.

Toxicon. 49(4): 550–560); o PA1b (Albumina de ervilha 1, subunidade b) peptídeo de sementes de leguminosas com atividade letal em várias pragas de insetos, tais como mosquitos, alguns afídeos e gorgulhos de cereais (Eyraud, V. et al. (2013) Expression and Biological Activity of the Cystine Knot Bioinsecticide PA1b (Pea Albumin 1 Subunit b). PLoS ONE 8(12): e81619); e um peptídeo interno de 10 kDa gerado pela hidrólise enzimática de urease de Canavalia ensiformis (feijão de porco) em insetos suscetíveis (Martinelli, AHS, et al. (2014) Structure–function studies on jaburetox, a recombinant insecticidal peptide derived from jack bean (Canavalia ensiformis) urease.

Biochimica et Biophysica Acta 1840: 935–944). Exemplos de inseticidas peptídicos comercialmente disponíveis incluem Spear-T para o tratamento de tripes em vegetais e plantas ornamentais em estufas, Spear-P para controlar o Besouro da batata e Spear-C para proteger os cultivos de pragas de lepidópteros

(Vestaron Corporation, Kalamazoo, MI). Uma nova proteína inseticida de Bacillus bombysepticus, chamada toxina de cristal parasporal (PC), mostra atividade patogênica oral e letalidade para bichos-da-seda e cepas resistentes a Helicoverpa armigera a Cry1Ac (Lin, P. et al. (2015) PC, uma nova toxina inseticida oral de Bacillus bombysepticus envolvido na letalidade do hospedeiro via APN e BtR-175. Sci. Rep. 5: 11101).

[00343] Um semioquímico é um sinal químico produzido por um organismo que causa uma mudança comportamental em um indivíduo da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Os semioquímicos mais amplamente usados para proteção de cultivos são feromônios sexuais de insetos, alguns dos quais agora podem ser sintetizados e são usados para monitoramento ou controle de pragas por captura em massa, sistemas de isca e morte e ruptura do acasalamento. Em todo o mundo, a ruptura do acasalamento é usada em mais de 660.000 ha e tem sido particularmente útil em cultivos de pomares.

[00344] Como usado nesse documento, “característica inseticida transgênica” refere-se a uma característica exibida por uma planta que foi geneticamente manipulada geneticamente para expressar um ácido nucleico ou polipeptídeo que é prejudicial a uma ou mais praga(s). Em uma modalidade, as plantas da presente revelação são resistentes à fixação e/ou infestação de qualquer uma ou mais das pragas da presente revelação. Em uma modalidade, a característica compreende a expressão de proteínas inseticidas vegetativas (VIPs) de Bacillus thuringiensis, lectinas e inibidores de proteinase de plantas, terpenóides, colesterol oxidases de Streptomyces spp., quitinases de insetos e enzimas quitinolíticas fúngicas, proteínas inseticidas bacterianas e genes de resistência de reconhecimento precoce. Em outra modalidade, a característica compreende a expressão de uma proteína de Bacillus thuringiensis que é tóxica para uma praga. Em uma modalidade, a proteína de Bt é uma proteína Cry (proteína cristal). Os cultivos com Bt incluem milho com Bt, algodão com Bt e soja com Bt. As toxinas de Bt podem ser da família Cry (ver, por exemplo, Crickmore et al., 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-812), que são particularmente eficazes contra Lepidoptera, Coleoptera e Diptera.

[00345] As toxinas de Bt Cry e Cyt pertencem a uma classe de toxinas bacterianas conhecidas como toxinas formadoras de poros (PFT) que são secretadas como proteínas solúveis em água que sofrem mudanças conformacionais a fim de inserir nas, ou translocar através das, membranas celulares de seu hospedeiro. Existem dois grupos principais de PFT: (i) as toxinas α-helicoidais, em que as regiões α-hélice formam o poro transmembranar, e (ii) as toxinas barril , que se inserem na membrana formando um barril  composto por grampos de cabelo de folha β de cada monômero. Ver, Parker MW, Feil SC, “Pore-forming protein toxins: from structure to function,” Prog. Biophys. Mol. Biol. Maio de 2005; 88(1):91-

142. A primeira classe de PFT inclui toxinas, tais como colicinas, exotoxina A, toxina da difteria e também as toxinas de três domínios Cry. Por outro lado, aerolisina, α- hemolisina, antígeno protetor do antraz, toxinas dependentes de colesterol tal como a perfringolisina O e as toxinas Cyt pertencem às toxinas barril . Id. Em geral, as bactérias produtoras de PFT secretam suas toxinas e essas toxinas interagem com receptores específicos localizados na superfície da célula hospedeira. Na maioria dos casos, os PFT são ativados por proteases do hospedeiro após a ligação ao receptor, induzindo a formação de uma estrutura oligomérica que é competente para inserção. Finalmente, a inserção da membrana é desencadeada, na maioria dos casos, por uma diminuição do pH que induz um estado de glóbulo fundido da proteína. Id.

[00346] O desenvolvimento de culturas transgênicas que produzem proteínas Cry de Bt tem permitido a substituição de inseticidas químicos por alternativas ecologicamente corretas. Em plantas transgênicas, a toxina Cry é produzida continuamente, protegendo a toxina da degradação e tornando- a acessível aos insetos mastigadores e brocas. A produção da proteína Cry em plantas foi melhorada pela engenharia de genes cry com o uso de códon com viés em plantas, pela remoção de sequências de sinal de splicing putativas e eliminação da região carboxi-terminal da protoxina. Ver, Schuler TH, et al., “Insect-resistant transgenic plants,” Trends Biotechnol. 1998;16:168–175. O uso de cultivos resistentes a insetos diminuiu consideravelmente o uso de pesticidas químicos nas áreas onde esses cultivos transgênicos são plantados. Ver, Qaim M, Zilberman D, “Yield effects of genetically modified crops in developing countries,” Science. 7 de fev. de 2003; 299(5608):900-2.

[00347] Proteínas Cry conhecidas incluem: -endotoxinas incluindo, mas não se limitando a: classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry

29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51, Cry52, Cry 53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59. Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 e Cry71 de genes de -endotoxina e os genes citolíticos de B. thuringiensis e genes cyt2.

[00348] Os membros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, mas não estão limitados a: CrylAa1 (# de Acesso AAA22353); Cry1Aa2 (# de Acesso # de Acesso AAA22552); Cry1Aa3 (# de Acesso BAA00257); Cry1Aa4 (# de Acesso CAA31886); Cry1Aa5 (# de Acesso BAA04468); Cry1Aa6 (# de Acesso AAA86265); Cry1Aa7 (# de Acesso AAD46139); Cry1Aa8 (# de Acesso 126149); Cry1Aa9 (# de Acesso BAA77213); CrylAa10 (# de Acesso AAD55382); CrylAa11 (# de Acesso CAA70856); Cry1Aa12 (# de Acesso AAP80146); Cry1Aa13 (# de Acesso AAM44305); Cry1Aa14 (# de Acesso AAP40639); Cry1Aa15 (# de Acesso AAY66993); Cry1Aa16 (# de Acesso HQ439776); Cry1Aa17 (# de Acesso HQ439788); Cry1Aa18 (# de Acesso HQ439790); Cry1Aa19 (# de Acesso HQ685121); Cry1Aa20 (# de Acesso JF340156); Cry1Aa21 (# de Acesso JN651496); Cry1Aa22 (# de Acesso KC158223); Cry1Abl (# de Acesso AAA22330); Cry1Ab2 (# de Acesso AAA22613); Cry1Ab3 (# de Acesso AAA22561); Cry1Ab4 (# de Acesso BAA00071); Cry1Ab5 (# de Acesso CAA28405); Cry1Ab6 (# de Acesso AAA22420); Cry1Ab7 (# de Acesso CAA31620); Cry1Ab8 (# de Acesso AAA22551); Cry1Ab9 (# de Acesso CAA38701); Cry1Ab10 (# de Acesso A29125); CrylAb11 (# de Acesso Il2419); Cry1Ab12 (# de Acesso AAC64003); Cry1Ab13 (# de Acesso AAN76494); Cry1Ab14 (# de Acesso AAG16877); Cry1Ab15 (# de Acesso

AA013302); Cry1Ab16 (# de AcessoAAK55546); Cry1Ab17 (# de Acesso AAT46415); Cry1Ab18 (# de Acesso AAQ88259); Cry1Ab19 (# de Acesso AAW31761); Cry1Ab20 (# de Acesso ABB72460); Cry1Ab21 (# de Acesso ABS18384); Cry1Ab22 (# de Acesso ABW87320); Cry1Ab23 (# de Acesso HQ439777); Cry1Ab24 (# de Acesso HQ439778); Cry1Ab25 (# de Acesso HQ685122); Cry1Ab26 (# de Acesso HQ847729); Cry1Ab27 (# de Acesso JN135249); Cry1Ab28 (# de Acesso JN135250); Cry1Ab29 (# de Acesso JN135251); Cry1Ab30 (# de Acesso JN135252); Cry1Ab31 (# de Acesso JN135253); Cry1Ab32 (# de Acesso JN135254); Cry1Ab33 (# de Acesso AAS93798); Cry1Ab34 (# de Acesso KC156668); Cry1Ab-like (# de Acesso AAK14336); Cry1Ab-like (# de Acesso AAK14337); Cry1Ab-like (# de Acesso AAK14338); Cry1Ab-like (# de Acesso ABG88858); Cry1Ac1 (# de Acesso AAA22331); Cry1Ac2 (# de Acesso AAA22338); Cry1Ac3 (# de Acesso CAA38098); Cry1Ac4 (# de Acesso AAA73077); Cry1Ac5 (# de Acesso AAA22339); Cry1Ac6 (# de AcessoAAA86266); Cry1Ac7 (# de Acesso AAB46989); Cry1Ac8 (# de Acesso AAC44841); Cry1Ac9 (# de Acesso AAB49768); CrylAc10 (# de Acesso CAA05505); CrylAc11 (# de Acesso CAA10270); Cry1Ac12 (# de Acesso Il2418); Cry1Ac13 (# de Acesso AAD38701); Cry1Ac14 (# de Acesso AAQ06607); Cry1Ac15 (# de Acesso AAN07788); Cry1Ac16 (# de Acesso AAU87037); CrylAc17 (# de Acesso AAX18704); Cry1Ac18 (# de Acesso AAY88347); Cry1Ac19 (# de Acesso ABD37053); Cry1Ac20 (# de Acesso ABB89046); Cry1Ac21 (# de Acesso AAY66992); Cry1Ac22 (# de Acesso ABZ01836); Cry1Ac23 (# de Acesso CAQ30431); Cry1Ac24 (# de Acesso ABL01535); Cry1Ac25 (# de Acesso FJ513324); Cry1Ac26 (# de Acesso FJ617446); Cry1Ac27 (# de Acesso FJ617447); Cry1Ac28 (# de Acesso ACM90319); Cry1Ac29 (# de Acesso DQ438941); Cry1Ac30

(# de Acesso GQ227507); Cry1Ac31 (# de Acesso GU446674); Cry1Ac32 (# de Acesso HM061081 ); Cry1Ac33 (# de Acesso GQ866913); Cry1Ac34 (# de Acesso HQ230364); Cry1Ac35 (# de Acesso JF340157); Cry1Ac36 (# de Acesso JN387137); Cry1Ac37 (# de Acesso JQ317685); CrylAd1 (# de Acesso AAA22340); Cry1Ad2 (# de Acesso CAA01880); CrylAe1 (# de Acesso AAA22410); CrylAf1 (# de Acesso AAB82749); CrylAg1 (# de Acesso AAD46137); CrylAh1 (# de Acesso AAQ14326); Cry1Ah2 (# de Acesso ABB76664); Cry1Ah3 (# de Acesso HQ439779); CrylAi1 (# de Acesso AA039719); Cry1Ai2 (# de Acesso HQ439780); Cry1A-like (# de Acesso AAK14339); Cry1Bal (# de Acesso CAA29898); Cry1Ba2 (# de Acesso CAA65003); Cry1Ba3 (# de Acesso AAK63251); Cry1Ba4 (# de Acesso AAK51084); Cry1Ba5 (# de Acesso AB020894); Cry1Ba6 (# de Acesso ABL60921); Cry1Ba7 (# de Acesso HQ439781); CrylBb1 (# de Acesso AAA22344); Cry1Bb2 (# de Acesso HQ439782); Cry1Bcl (# de Acesso CAA86568); Cry1Bdl (# de Acesso AAD10292); Cry1Bd2 (# de Acesso AAM93496); CrylBe1 (# de Acesso AAC32850); Cry1Be2 (# de Acesso AAQ52387); Cry1Be3 (# de Acesso ACV96720); Cry1Be4 (# de Acesso HM070026); CrylBf1 (# de Acesso CAC50778); Cry1Bf2 (# de Acesso AAQ52380); Cry1Bgl (# de Acesso AA039720); Cry1Bhl (# de Acesso HQ589331); Cry1Bil (# de Acesso KC156700); Cry1Cal (# de Acesso CAA30396); Cry1Ca2 (# de Acesso CAA31951); Cry1Ca3 (# de Acesso AAA22343); Cry1Ca4 (# de Acesso CAA01886); Cry1Ca5 (# de Acesso CAA65457); Cry1Ca6 [1] (# de Acesso AAF37224); Cry1Ca7 (# de Acesso AAG50438); Cry1Ca8 (# de Acesso AAM00264); Cry1Ca9 (# de Acesso AAL79362); CrylCa10 (# de Acesso AAN16462); Cry1Ca11(# de Acesso AAX53094); Cry1Ca12 (# de Acesso HM070027); Cry1Ca13 (# de Acesso HQ412621); Cry1Ca14 (# de

AcessoJN651493); CrylCb1 (# de Acesso M97880); Cry1Cb2 (# de Acesso AAG35409); Cry1Cb3 (# de Acesso ACD50894); Cry1Cb- like (# de Acesso AAX63901); Cry1Dal (# de Acesso CAA38099); Cry1Da2 (# de Acesso I76415); Cry1Da3 (# de Acesso HQ439784); Cry1 Dbl (# de Acesso CAA80234); Cry1 Db2 (# de Acesso AAK48937); Cry1 Dcl (# de Acesso ABK35074); Cry1Eal (# de Acesso CAA37933); Cry1Ea2 (# de Acesso CAA39609); Cry1Ea3 (# de Acesso AAA22345); Cry1Ea4 (# de Acesso AAD04732); Cry1Ea5 (# de Acesso A15535); Cry1Ea6 (# de Acesso AAL50330); Cry1Ea7 (# de Acesso AAW72936); Cry1Ea8 (# de Acesso ABX11258); Cry1Ea9 (# de Acesso HQ439785); CrylEa10 (# de Acesso ADR00398); CrylEa11 (# de Acesso JQ652456); Cry1Ebl (# de Acesso AAA22346); Cry1Fal (# de Acesso AAA22348); Cry1Fa2 (# de Acesso AAA22347); Cry1Fa3 (# de Acesso HM070028); Cry1Fa4 (# de AcessoHM439638); Cryl Fbl (# de Acesso CAA80235); Cry1Fb2 (# de Acesso BAA25298); Cry1Fb3 (# de Acesso AAF21767); Cry1Fb4 (# de Acesso AAC10641); Cry1Fb5 (# de Acesso AA013295); Cry1Fb6 (# de Acesso ACD50892); Cry1Fb7 (# de Acesso ACD50893); CrylGal (# de Acesso CAA80233); Cry1Ga2 (# de Acesso CAA70506); CrylGbl (# de Acesso AAD10291); Cry1Gb2 (# de Acesso AA013756); CrylGcl (# de Acesso AAQ52381); CrylHa1 (# de Acesso CAA80236); CrylHbl (# de Acesso AAA79694); Cry1Hb2 (# de Acesso HQ439786); CrylH-like (# de Acesso AAF01213); CrylIal (# de Acesso CAA44633); Cry1Ia2 (# de Acesso AAA22354); Cry1Ia3 (# de Acesso AAC36999); Cry1Ia4 (# de Acesso AAB00958); Cry1Ia5 (# de Acesso CAA70124); Cry1Ia6 (# de Acesso AAC26910); Cry1Ia7 (# de Acesso AAM73516); Cry1Ia8 (# de Acesso AAK66742); Cry1Ia9 (# de Acesso AAQ08616); Cry1Ia10 (# de Acesso AAP86782); CrylIa11 (# de Acesso CAC85964); Cry1Ia12 (# de Acesso

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Acesso CAA41122); Cry9Aa2 (# de Acesso CAA41425); Cry9Aa3 (# de Acesso GQ249293); Cry9Aa4 (# de Acesso GQ249294); Cry9Aa5 (# de Acesso JXl 74110); Cry9Aa like (# de Acesso AAQ52376); Cry9Bal (# de Acesso CAA52927); Cry9Ba2 (# de Acesso GU299522); Cry9Bbl (# de Acesso AAV28716); Cry9Cal (# de Acesso CAA85764); Cry9Ca2 (# de Acesso AAQ52375); Cry9Dal (# de Acesso BAAl 9948); Cry9Da2 (# de Acesso AAB97923); Cry9Da3 (# de Acesso GQ249293); Cry9Da4 (# de Acesso GQ249297); Cry9Dbl (# de Acesso AAX78439); Cry9Dcl (# de Acesso KCl 56683); Cry9Eal (# de Acesso BAA34908); Cry9Ea2 (# de Acesso AA012908); Cry9Ea3 (# de Acesso ABM21765); Cry9Ea4 (# de Acesso ACE88267); Cry9Ea5 (# de Acesso ACF04743); Cry9Ea6 (# de AcessoACG63872); Cry9Ea7 (# de Acesso FJ380927); Cry9Ea8 (# de Acesso GQ249292); Cry9Ea9 (# de Acesso JN651495); Cry9Ebl (# de Acesso CAC50780); Cry9Eb2 (# de Acesso GQ249298); Cry9Eb3 (# de Acesso KC156646); Cry9Ecl (# de Acesso AAC63366); Cry9Edl (# de Acesso AAX78440); Cry9Eel (# de Acesso GQ249296); Cry9Ee2 (# de Acesso KC156664); Cry9Fal (# de Acesso KC156692); Cry9Gal (# de Acesso KC156699); Cry9- like (# de Acesso AAC63366); CrylOAal (# de AcessoAAA22614); Cry10Aa2 (# de Acesso E00614); Cry10Aa3 (# de Acesso CAD30098); Cry10Aa4 (# de Acesso AFB18318); CrylOA-like (# de Acesso DQ167578); Cryl lAal (# de Acesso AAA22352); Cryl 1Aa2 (# de Acesso AAA22611); Cry11Aa3 (# de Acesso CAD30081); Cry11Aa4 (# de Acesso AFB18319); CryllAa-like (# de Acesso DQ166531); CryllBal (# de Acesso CAA60504); CryllBbl (# de Acesso AAC97162); Cry11Bb2 (# de Acesso HM068615); Cry12Aal (# de Acesso AAA22355); Cry13Aal (# de Acesso AAA22356); Cry14Aal (# de Acesso AAA21516); Cry14Abl (# de Acesso KC156652); Cry15Aal (# de Acesso AAA22333); Cryl6Aal (# de

Acesso CAA63860); Cry17Aal (# de Acesso CAA67841); Cry18Aal (# de Acesso CAA67506); Cryl8Bal (# de Acesso AAF89667); Cry18Cal (# de Acesso AAF89668); Cry19Aal (# de Acesso CAA68875); Cry19Bal (# de Acesso BAA32397); Cry19Cal (# de Acesso AFM37572); Cry20Aal (# de Acesso AAB93476); Cry20Bal (# de Acesso ACS93601); Cry20Ba2 (# de Acesso KC156694); Cry20-like (# de Acesso GQ144333); Cry21Aal (# de Acesso I32932); Cry21Aa2 (# de Acesso I66477); Cry21Bal (# de Acesso BAC06484); Cry21Cal (# de Acesso JF521577); Cry21Ca2 (# de Acesso KC156687); Cry21Dal (# de Acesso JF521578); Cry22Aal (# de Acesso I34547); Cry22Aa2 (# de Acesso CAD43579); Cry22Aa3 (# de Acesso ACD93211); Cry22Abl (# de Acesso AAK50456); Cry22Ab2 (# de Acesso CAD43577); Cry22Bal (# de Acesso CAD43578); Cry22Bbl (# de Acesso KC156672); Cry23Aal (# de Acesso AAF76375); Cry24Aal (# de Acesso AAC61891); Cry24Bal (# de Acesso BAD32657); Cry24Cal (# de Acesso CAJ43600); Cry25Aal (# de Acesso AAC61892); Cry26Aal (# de Acesso AAD25075); Cry27Aal (# de Acesso BAA82796); Cry28Aal (# de Acesso AAD24189); Cry28Aa2 (# de Acesso AAG00235); Cry29Aal (# de Acesso CAC80985); Cry30Aal (# de Acesso CAC80986); Cry30Bal (# de Acesso BAD00052); Cry30Cal (# de Acesso BAD67157); Cry30Ca2 (# de Acesso ACU24781); Cry30Dal (# de Acesso EF095955); Cry30Dbl (# de Acesso BAE80088); Cry30Eal (# de Acesso ACC95445); Cry30Ea2 (# de Acesso FJ499389); Cry30Fal (# de Acesso ACI22625); Cry30Gal (# de Acesso ACG60020); Cry30Ga2 (# de AcessoHQ638217); Cry31Aal (# de Acesso BABll 757); Cry31Aa2 (# de Acesso AAL87458); Cry31Aa3 (# de Acesso BAE79808); Cry31Aa4 (# de Acesso BAF32571); Cry31Aa5 (# de Acesso BAF32572); Cry31Aa6 (# de Acesso BA144026); Cry31Abl (# de AcessoBAE79809); Cry31Ab2

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AAK64566); Cry35Ba2 (# de Acesso AAT29027); Cry35Ba3 (# de Acesso AAT29026); Cry36Aal (# de Acesso AAK64558); Cry37 Aal (# de Acesso AAF76376); Cry38Aal (# de Acesso AAK64559); Cry39Aal (# de Acesso BAB72016); Cry40Aal (# de Acesso BAB72018); Cry40Bal (# de Acesso BAC77648); Cry40Cal (# de Acesso EU381045); Cry40Dal (# de Acesso ACF15199); Cry41Aal (# de Acesso BAD35157); Cry41Abl (# de Acesso BAD35163); Cry41Bal (# de Acesso HM461871); Cry41Ba2 (# de Acesso ZP _04099652); Cry42Aal (# de Acesso BAD35166); Cry43Aal (# de Acesso BAD15301); Cry43Aa2 (# de Acesso BAD95474); Cry43Bal (# de Acesso BAD15303); Cry43Cal (# de Acesso KC156676); Cry43Cbl (# de Acesso KC156695); Cry43Ccl (# de Acesso KC156696); Cry43-like (# de Acesso BAD15305); Cry44Aa (# de Acesso BAD08532); Cry45Aa (# de Acesso BAD22577); Cry46Aa (# de Acesso BAC79010); Cry46Aa2 (# de Acesso BAG68906); Cry46Ab (# de Acesso BAD35170); Cry47 Aa (# de Acesso AAY24695); Cry48Aa (# de Acesso CAJ18351); Cry48Aa2 (# de Acesso CAJ86545); Cry48Aa3 (# de Acesso CAJ86546); Cry48Ab (# de Acesso CAJ86548); Cry48Ab2 (# de Acesso CAJ86549); Cry49Aa (# de Acesso CAH56541); Cry49Aa2 (# de Acesso CAJ86541); Cry49Aa3 (# de Acesso CAJ86543); Cry49Aa4 (# de Acesso CAJ86544); Cry49Abl (# de Acesso CAJ86542); Cry50Aal (# de Acesso BAE86999); Cry50Bal (# de Acesso GU446675); Cry50Ba2 (# de Acesso GU446676); Cry51Aal (# de Acesso AB114444); Cry51Aa2 (# de Acesso GU570697); Cry52Aal (# de Acesso EF613489); Cry52Bal (# de Acesso FJ361760); Cry53Aal (# de Acesso EF633476); Cry53Abl (# de Acesso FJ361759); Cry54Aal (# de Acesso ACA52194); Cry54Aa2 (# de Acesso GQ140349); Cry54Bal (# de Acesso GU446677); Cry55Aal (# de Acesso ABW88932); Cry54Abl (# de Acesso JQ916908); Cry55Aa2 (# de

Acesso AAE33526); Cry56Aal (# de Acesso ACU57499); Cry56Aa2 (# de Acesso GQ483512); Cry56Aa3 (# de Acesso JX025567); Cry57Aal (# de Acesso ANC87261); Cry58Aal (# de Acesso ANC87260); Cry59Bal (# de Acesso JN790647); Cry59Aal (# de Acesso ACR43758); Cry60Aal (# de Acesso ACU24782); Cry60Aa2 (# de Acesso EA057254); Cry60Aa3 (# de Acesso EEM99278); Cry60Bal (# de Acesso GU810818); Cry60Ba2 (# de Acesso EA057253); Cry60Ba3 (# de Acesso EEM99279); Cry61Aal (# de Acesso HM035087); Cry61Aa2 (# de Acesso HM132125); Cry61Aa3 (# de Acesso EEM19308); Cry62Aal (# de Acesso HM054509); Cry63Aal (# de Acesso BA144028); Cry64Aal (# de Acesso BAJ05397); Cry65Aal (# de Acesso HM461868); Cry65Aa2 (# de Acesso ZP_04123838); Cry66Aal (# de Acesso HM485581); Cry66Aa2 (# de Acesso ZP _04099945); Cry67Aal (# de AcessoHM485582); Cry67Aa2 (# de Acesso ZP_04148882); Cry68Aal (# de Acesso HQ113114); Cry69Aal (# de Acesso HQ401006); Cry69Aa2 (# de Acesso JQ821388); Cry69Abl (# de Acesso JN209957); Cry70Aal (# de Acesso JN646781); Cry70Bal (# de Acesso AD051070); Cry70Bbl (# de Acesso EEL67276); Cry71Aal (# de Acesso JX025568); Cry72Aal (# de Acesso JX025569); Cyt1Aa (Número de Acesso do Banco de Genes X03182); Cyt1Ab (Número de Acesso do Banco de Genes X98793); Cyt1B (Número de Acesso do Banco de Genes U37196); Cyt2A (Número de Acesso do Banco de Genes Z14147); e Cyt2B (Número de Acesso do Banco de Genes U52043).

[00349] Exemplos de -endotoxinas também incluem, mas não estão limitados a proteínas Cry1A da Patente U.S. Nos

5.880.275, 7.858.849 8.530.411, 8.575.433 e 8.686.233; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (eliminação N-terminal de variantes a-hélice 1 e/ou a-hélice 2 de proteínas cry, tais como Cry1A,

Cry3A) de Pat. US Nos 8.304.604, 8.304.605 e 8.476.226; Cry1B do pedido de patente U.S. N de Série 10/525.318; Cry1C da Patente U.S. N 6.033.874; Cry1F da Patente U.S. 5.188.960 e

6.218.188; quimeras Cry1A/F da Pat. U.S. Nos 7.070.982;

6.962.705 e 6.713.063); uma proteína Cry2, tal como a proteína Cry2Ab da Patente U.S. N 7.064.249); uma proteína Cry3A incluindo, mas não se limitando a, uma proteína inseticida híbrida manipulada geneticamente (eHIP) criada pela fusão de combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente US Número 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 da Patente U.S. Nos 7.329.736,

7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 e

7.462.760; uma proteína Cry9, tal como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F, incluindo, mas não se limitando à proteína Cry9D da Pat. U.S. N 8.802.933 e a proteína Cry9B da Patente U.S. N 8.802.934; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008), “Applied and Environmental Microbiology,” 74:7145-7151; uma Cry22, uma proteína Cry34Abl da Patente U.S. Nos 6.127.180, 6.624.145 e

6.340.593; uma proteína CryET33 e cryET34 da Patente U.S. Nos 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e

7.504.229; um CryET33 e homólogos CryET34 da Publicação de Patente US Números 2006/0191034, 2012/0278954 e Publicação PCT Número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Abl da Pat. Nos

6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; um TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 da publicação do pedido de patente US número 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812,

TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; toxinas TIC853 da Patente U.S.

N 8.513.494, AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Pat.

N 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 da Patente U.S.

N 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 do WO 2006/083891; AXMI-010 de WO 2005/038032; AXMI-003 de WO 2005/021585; AXMI-008 da publicação do pedido de patente US número 2004/0250311; AXMI-006 da publicação do pedido de patente US número 2004/0216186; AXMI-007 da publicação do pedido de patente US número 2004/0210965; AXMI-009 do pedido de patente US número 2004/0210964; AXMI-014 da publicação do pedido de patente US número 2004/0197917; AXMI-004 da publicação do pedido de patente US número 2004/0197916; AXMI- 028 e AXMI-029 de WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI- 0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 de WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente U.S.

N 8.084.416; AXMI-205 da publicação do pedido de Patente U.S.

N 2011/0023184; AXMI-011, AXMI- 012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI- 043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI- 041, AXMI-063 e AXMI-064 da publicação do pedido de Patente U.S.

N 2011/0263488; AXMI-Rl e proteínas relacionadas da Publicação do Pedido de Patente U.S.

N 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z do documento WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 de WO 2011/103247 e Pat.

N 8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI- 005, AXMI-163 e AXMI-184 da Patente U.S.

N 8.334.431; AXMI- 001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 da publicação do pedido de Patente U.S.

N 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI- 076 da publicação do pedido de Patente U.S.

N 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141,

AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente U.S. N 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 do Número de Publicação do Pedido de Patente US 2010/0005543, AXMI270 da Publicação do Pedido de Patente US US20140223598, AXMI279 da Publicação do Pedido de Patente US US20140223599, proteínas cry tais como Cry1A e Cry3A tendo sítios proteolíticos modificados da Patente US N 8.319.019; uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa de Bacillus thuringiensis VBTS 2528 da Publicação de Pedido de Patente US Número 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas dos habilitados na técnica. Ver N. Crickmore, et al., “Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,” Microbiology and Molecular Biology Reviews,” (1998) Vol 62: 807-813; ver também, N. Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2016), em www.btnomenclature.info/.

[00350] O uso de proteínas Cry como características de plantas transgênicas é bem conhecido por um habilitado na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, mas não se limitando a plantas que expressam CrylAc, Cry1Ac+Cry2Ab, CrylAb, CrylA.105, CrylF, Cry1Fa2, CrylF+CrylAc, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bbl, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam aprovação regulamentar. Ver, Sanahuja et al., “Bacillus thuringiensis: a century of research, development and commercial applications,” (2011) Plant Biotech Journal, April 9(3):283-300 and the CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado na rede mundial usando o prefixo “www”. Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um habilitado na técnica também pode ser expressada em plantas tais como Vip3Ab & CrylFa (US2012/0317682); CrylBE & CrylF (US2012/0311746); CrylCA & CrylAB (US2012/ 0311745); CrylF & CryCa (US2012/0317681); CrylDA& CrylBE (US2012/0331590); CrylDA & CrylFa (US2012/ 0331589); CrylAB & CrylBE (US2012/0324606); CrylFa & Cry2Aa e Cryll & CrylE (US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/ VCry35Ab & Cry3Aa (US20130167268); CrylAb & CrylF (US20140182018); e Cry3A e CrylAb ou Vip3Aa (US20130116170). As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas, incluindo acil hidrolases lipídicas da Patente U.S. N 7.491.869, e colesterol oxidases tais como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15: 1406-1413).

[00351] As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas). Bactérias entomopatogênicas produzem proteínas inseticidas que se acumulam em corpos de inclusão ou cristais parasporais (tais como as proteínas Cry e Cyt mencionadas anteriormente), bem como proteínas inseticidas que são secretadas no meio de cultura.

Entre as últimas estão as proteínas Vip, que se dividem em quatro famílias de acordo com sua identidade de aminoácidos.

As proteínas Vip1 e Vip2 atuam como toxinas binárias e são tóxicas para alguns membros de Coleoptera e Hemiptera.

Acredita-se que o componente Vip1 se ligue a receptores na membrana do intestino médio do inseto, e o componente Vip2 entra na célula, onde exibe sua atividade de ADP-ribosiltransferase contra actina, evitando a formação de microfilamentos.

Vip3 não tem nenhuma similaridade com a sequência com Vip1 ou Vip2 e é tóxico para uma grande variedade de membros da Lepidoptera.

Foi demonstrado que seu modo de ação se assemelha ao das proteínas Cry em termos de ativação proteolítica, ligação à membrana epitelial do intestino médio e formação de poros, embora as proteínas Vip3A não compartilhem sítios de ligação com as proteínas Cry.

A última propriedade os torna bons candidatos para serem combinados com proteínas Cry em plantas transgênicas (cultivos tratados com Bacillus thuringiensis [culturas com Bt]) para prevenir ou retardar a resistência a insetos e ampliar o espectro inseticida.

Existem variedades cultivadas comercialmente de algodão com Bt e milho com Bt que expressam a proteína Vip3Aa em combinação com proteínas Cry.

Para a família Vip4 relatada mais recentemente, nenhum inseto alvo foi encontrado ainda.

Ver, Chakroun et al., “Bacterial Vegetative Insecticidal Proteins (Vip) from Entomopathogenic Bacteria,” Microbiol Mol Biol Rev. 2 de março de 2016;80(2):329-50. VIPs podem ser encontrados na Patente US Nos 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e

8.237.020 e semelhantes. Outras proteínas VIP são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica (ver, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, que pode ser acessado na rede usando o prefixo “www”).

[00352] As proteínas pesticidas também incluem proteínas do complexo de toxinas (TC), que podem ser obtidas de organismos tais como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (ver, Patentes US 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida “autônoma” e outras proteínas TC intensificam a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo organismo. A toxicidade de uma proteína TC “autônoma” (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser intensificada por um ou mais de “potencializadores” da proteína TC derivados de um organismo fonte de um gênero diferente. Existem três tipos principais de proteínas TC. Como referido nesse documento, as proteínas de classe A (“Proteína A”) são toxinas autônomas. As proteínas da classe B (“Proteína B”) e as proteínas da classe C (“Proteína C”) intensificam a toxicidade das proteínas da classe A. Exemplos de proteínas de classe A são TcbA, TcdA, XptAl e XptA2. Exemplos de proteínas de classe B são TcaC, TcdB, XptBlXb e XptCl Wi. Exemplos de proteínas de classe C são TccC, XptClXb e XptBl Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de liotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente U.S. N 8.334.366).

[00353] Alguns PIPs atualmente registrados estão listados na Tabela 11. As plantas transgênicas também foram manipuladas geneticamente para expressar dsRNA direcionado contra genes de insetos (Baum, JA et al. (2007) Control of coleopteran insect pests through RNA interference.

Nature Biotechnology 25: 1322-1326; Mao, Y.B. et al. (2007) Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant- mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol.

Nature Biotechnology 25: 1307-1313). A interferência de RNA pode ser desencadeada na praga pela alimentação da praga na planta transgênica.

A alimentação de pragas, portanto, causa ferimentos ou morte à praga.

Tabela 11. Lista de exemplos de protetores incorporados em plantas, que podem ser combinados com micróbios da revelação Protetores incorporados em plantas (PIPs) Empresa e nomes Números de registro de comerciais pesticidas

Batata Batata

Cry3A de Batata PC Código 006432 Naturemark 524-474 New Leaf Monsanto

Cry3A & PLRV de Batata Monsanto 524-498 Códigos PC 006432, 006469 New Leaf Plus

Milho

Cry1Ab de Milho Evento 176 PC Código Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-1 006458 Syngenta Seeds 66736-1

Cry1Ab de Milho Evento Bt11 EPA PC Código Agrisure CB (com 67979-1 006444 Identificador Único OECD SYN- Yieldgard) 65268-1 BTØ11-1, Atribuir Milho Doce Protegido contra Insetos Syngenta Seeds

Cry1Ab de Milho Evento MON 801 Monsanto 524-492

Cry1Ab de Milho Evento MON 810 Código PC Monsanto 524-489 006430 Identificador Único OECD MON- ØØ81Ø-6

Cry1Ac de Milho PC Código 006463 Dekalb Genetics c/o 69575-2 Monsanto BT-XTRA

Cry1F de milho Evento TC1507 PC Código Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-2 006481 Identificador exclusivo OECD DAS- Pioneer Hi- 29964-3 Ø15Ø7-1 Bred/Dupont moCry1F de milho Evento DAS-Ø6275-8 Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-4 Código PC 006491 Identificador único OECD DAS-Ø6275-8

Milho de Cry9C Aventis 264-669 StarLink

Cry3Bb1 de milho Evento MON863 PC Código Monsanto 524-528 006484 YielGard RW

Protetores incorporados em plantas (PIPs) Empresa e nomes Números de registro de comerciais pesticidas

Identificador Único OECD MON-ØØ863-5

Cry3Bb1 de milho Evento MON 88017 PC Monsanto 524-551 Código 006498 Lagarta-da-raiz do Identificador Único OECD MON-88Ø17-3 milho YieldGrad VT

Cry34Ab1/Cry35Ab1 de milho Evento DAS- Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-5 591227-7 Pioneer Hi- 29964-4 Código PC 006490 Bred/Dupont Herculex Identificador Único OCDE DAS-59122-7 Lagarta-da-raiz do milho

Cry34Ab1/Cry35Ab1 e Cry1F de milho Evento Pioneer Hi- 29964-17 4114 Bred/Dupont Códigos PC 006555, 006556 mCry3A de milho Evento MIR 604 Syngenta Seeds 67979-5 Código PC 006509 Identificador Único OECD Agrisure RW SYN-IR604-8

Cry1A.105 e Cry2Ab2 de milho Evento MON Monsanto 524-575 89034 PC Códigos 006515 e 006514 Genuity VT Double Pro

Vip3Aa20 de milho Evento MIR 162 Syngenta Seeds 67979-14 Código PC 006599 Identificador Único OECD Agrisure Viptera SYN-IR162-4 eCry3.1Ab de milho no Evento 5307 Código Syngenta 67979-22 PC 016483 Identificador Único OECD SYN- Æ53Æ7-1

Eventos Transformados e Mistura de Sementes de Milho

MON863 x MON810 com Cry3Bb1 + Cry1Ab Monsanto YieldGard 524-545 Plus

DAS-59122-7 x TC1507 com Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-6 Cry34Ab1/Cry35Ab1 + Cry1F Pioneer Hi- 29964-5 Bred/Dupont Herculex Xtra

MON 88017 x MON 810 com Cry1AB + Cry3Bb Monsanto 524-552 YieldGard VT Triple YieldGard VT Plus

MIR 604 x Bt11 com mCry3A + Cry1Ab Syngenta 67979-8 Agrisure CB/RW Agrisure 3000GT

Mon 89034 x Mon 88017 com Cry1A.105 + Monsanto 524-576 Cry2Ab2 + Cry3Bb1 Genuity VT Triple PRO

Bt11 x MIR 162 com Cry1Ab + Vip3Aa 20 Syngenta Seeds 67979-12 Agrisure 2100

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 com Cry1Ab + Syngenta Seeds 67979-13 Vip3Aa20 + mCry3A Agrisure 3100

MON 89034 x TC1507 x MON 88017 x DAS- Monsanto Company 524-581 59122-7 com Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Cry1F + Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-7 Cry3Bb1 + Cry34Ab1/Cry35Ab1 Genuity SmartStax SmartStax

Mistura de sementes MON 89034 x TC1507 x Monsanto Company 524-595 MON 88017 x DAS-59122-7 Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-16 Genuity SmartStax RIB Complete SmartStax Refuge Advanced; Refuge Advanced Powered by SmartStax

Mistura de sementes de Herculex Xtra + Pioneer Hi- 29964-6

Protetores incorporados em plantas (PIPs) Empresa e nomes Números de registro de comerciais pesticidas

Herculex I Bred/Dupont Proteção de Inseto Optimum AcreMax1

Mistura de sementes de milho RW + sem Bt Pioneer Hi- 29964-10 Herculex Bred/Dupont Optimum AcreMax RW

(Cry1F x Cry34/35 x Cry1Ab) - mistura de Pioneer Hi- 29964-11 sementes Bred/Dupont Optimum AcreMax Xtra

(Cry1F x Cry1Ab) - mistura de sementes Pioneer Hi- 29964-12 Bred/Dupont Optimum AcreMax Proteção de Inseto

(Cry1F x mCry3A) Pioneer Hi- 29964-13 Bred/Dupont Optimum Trisect

(Cry1F x Cry34/35 x Cry1Ab x mCry3A) Pioneer Hi- 29964-14 Bred/Dupont Optimum Intrasect Xtreme

59122 x MON 810 x MIR 604 (Cry34/35 x Pioneer Hi- 29964-15 Cry1Ab x mCry3A) Bred/Dupont

Optimum AcreMax Xtreme (Cry1F x Cry34/35 Pioneer Hi- 29964-16 x Cry1Ab x mCry3A) - seed blend Bred/Dupont Optimum AcreMax Xtreme (seed blend)

MON 810 x MIR 604 (Cry1Ab x mCry3A) Pioneer Hi- 29964-18 Bred/Dupont

1507 x MON810 x MIR 162 (Cry1F x Cry1Ab x Pioneer Hi- 29964-19 Vip 3Aa20) Bred/Dupont Optimum Intrasect Leptra

1507 x MIR 162 (Cry1F x Vip30Aa20) Pioneer Hi- 29964-20 Bred/Dupont

4114 x MON 810 x MIR 604 (Cry34/35 x Cry1F Pioneer Hi- 29964-21 x Cry1Ab x mCry3A) - mistura de sementes Bred/Dupont

4114 x MON 810 x MIR 604 (Cry34/35 x Cry1F Pioneer Hi- 29964-22 x Cry1Ab x mCry3A) Bred/Dupont

1507 x MON810 x MIR 604 (Cry1F x Cry1Ab x Pioneer Hi- 29964-23 mCry3A) - mistura de sementes Bred/Dupont Optimum AcreMax Trisect

1507 x MON810 x MIR 604 (Cry1F x Cry1Ab x Pioneer Hi- 29964-24 mCry3A) Bred/Dupont Optimum Intrasect Trisect

4114 x MON 810 (Cry34/35 x Cry1F x Cry1Ab) Pioneer Hi- 29964-25 Bred/Dupont

1507 x MON810 x MIR 162 (Cry1F x Cry1Ab x Pioneer Hi- 29964-26 Vip 3Aa20) - mistura de sementes Bred/Dupont Optimum AcreMax Leptra

Intermediários SmartStax (8 produtos) Monsanto 524-583, 524-584, 524-586, 524 -587, 524-588, 524-589, 524 -590

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x Cry2Ab2 x Monsanto 524-585

Protetores incorporados em plantas (PIPs) Empresa e nomes Números de registro de comerciais pesticidas

Cry1F) Genuity PowerCore

MON 89034 (Cry1A.105 x Cry2Ab2) - mistura Monsanto 524-597 de sementes Genuity VT Double PRO RIB Complete

MON 89034 x 88017 RIB Complete (Cry1A.105 Monsanto 524-606 x Cry2Ab2 x Cry3Bb1) - mistura de sementes Genuity VT Triple PRO RIB Complete

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x Cry2Ab2 x Monsanto 524-612 Cry1F) - mistura de sementes Genuity PowerCore RIB Complete

Bt11 x MIR162 x 1507 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x Syngenta Seeds 67979-15 Cry1F) Agrisure Viptera 3220 Refuge Renew

Bt11 x 59122-7 x MIR 604 x 1507 (Cry1Ab x Syngenta Seeds 67979-17 Cry34/35 x mCry3A x Cry1F) Agrisure 3122

Bt11 x MIR162 x TC1507 (Cry1Ab x Vip3Aa20 Syngenta Seeds 67979-19 x Cry1F) - mistura de sementes Agisure Viptera 3220 (E-Z Refuge) (Refuge Advanced)

Bt11 x DAS 59122-7 x MIR604 x TC1507 Syngenta Seeds 67979-20 (Cry1Ab x Cry34/35 x mCry3A x Cry1F) - Agisure Viptera 3122 mistura de sementes (E-Z Refuge) (Refuge Advanced)

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x TC1507 x 5307 Syngenta Seeds 67979-23 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x mCry3A x Cry1F x Agrisure Duracade eCry3.1Ab) (Refuge Renew) 5222

Bt11 x MIR 604 x TC1507 x 5307 (Cry1Ab x Syngenta Seeds 67979-24 mCry3A x Cry1F x eCry3.1Ab) Agrisure Duracade (Refuge Renew) 5122

Bt11 x MIR 604 x TC1507 x 5307 (Cry1Ab x Syngenta Seeds 67979-25 mCry3A x Cry1F x eCry3.1Ab) - mistura de Agisure Duracade 5122 sementes E-Z Refuge

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x TC1507 x 5307 Syngenta Seeds 67979-26 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x mCry3A x Cry1F x Agisure Duracade 5222 eCry3.1Ab) - mistura de sementes E-Z Refuge

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x TC1507 x 5307 Syngenta Seeds 67979-27 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x mCry3A x Cry1F x Agrisure Duracade eCry3.1Ab) (Refuge Renew) 5022

MIR604 x DAS-59122-7 x TC1507 (mCry3A x Syngenta Seeds 67979-29 Cry34/35 x Cry1F)

Intermediários SmartStax (8 produtos) Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-8, 68467-9, 68467-10, 68467-11, 68467-13, 68467-14, 68467-15

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x Cry2Ab2 x Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-12 Cry1F) PowerCore; PowerCore Enlist

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x Cry2Ab2 x Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-21 Cry1F) - mistura de sementes PowerCore Refuge Advanced; Refuge Advanced Powered by PowerCore

1507 x MON 810 Pioneer Hi- 29964-7 Bred/Dupont Optimum Intrasect

59122 x 1507 x MON 810 Pioneer Hi- 29964-8

Protetores incorporados em plantas (PIPs) Empresa e nomes Números de registro de comerciais pesticidas Bred/Dupont 59122 x MON 810 Pioneer Hi- 29964-9 Bred/Dupont Algodão Cry1Ac de Algodão Monsanto 524-478 BollGard Cry1Ac e Cry2Ab2 no Evento 15985 de Monsanto 524-522 Algodão Códigos PC 006445, 006487 BollGard II Algodão com Bt Evento MON531 com Cry1Ac Monsanto 524-555 (somente para uso em viveiros de reprodução) Algodão Bt Evento MON15947 com Cry2Ab2 Monsanto 524-556 (apenas para uso em viveiros de reprodução) COT102 x MON 15985 (Vip3Aa19 x Cry1Ac x Monsanto 524-613 Cry2Ab2) Bollgard III Cry1F e Cry1Ac (Eventos DAS-21023-5 x Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-3 DAS-24236-5) Códigos PC de algodão Widestrike 006512, 006513 Evento 3006-210-23 (Cry1Ac) Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-17 Evento 281-24-236 (Cry1F) Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-18 WideStrike x COT102 (Cry1F x Cry1Ac x Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-19 Vip3Aa19) WideStrike 3 Vip3Aa19 e FLCry1Ab (Eventos Syngenta Seeds 67979-9 Cot102xCot67B) Códigos PC de Algodão (Formally VipCot) 016484, 016486 Identificador Único OECD SYN-IR102-7 X SYN-IR67B-1 COT102 (Vip3Aa19) Syngenta Seeds 67979-18 COT67B (FLCry1Ab) Syngenta Seeds 67979-21 T304-40 (Cry1Ab) Bayer CropScience 264-1094 GHB119 (Cry2Ae) Bayer CropScience 264-1095 T304-40 x GHB119 (Cry1Ab x Cry2Ae) Bayer CropScience 264-1096 Identificador único da OCDE: BCS-GHØØ4-7 TwinLink x BCS-GHØØ5-8 Soja Cry1Ac no Evento 87701 de Soja Código PC Monsanto 524-594 006532 Identificador Único OECD Inacta Cry1A.105 e Cry2Ab2 no Evento 87751 Monsanto 524-619 Códigos PC de Soja 006614, 006615 Identificador Único OECD MON-87751-7 Cry1Ac x Cry1F no Evento DAS 81419 Códigos Mycogen Seeds/Dow Agro 68467-20 PC de Soja 006527, 006528 Identificador Único OECD DAS 81419 (Cry1Ac x Cry1F)

[00354] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos pesticidas estabelecidos nesse documento podem ser utilizados com qualquer um ou mais dos micróbios da revelação e podem ser aplicados a plantas ou partes das mesmas, incluindo sementes. Herbicidas

[00355] Como mencionado acima, as composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse documento, às vezes são combinadas com um ou mais de herbicidas.

[00356] As composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos nesse documento e/ou tendo características descritas nesse documento podem incluir adicionalmente um ou mais de herbicidas. Em algumas modalidades, as composições herbicidas são aplicadas às plantas e/ou partes da planta. Em algumas modalidades, as composições herbicidas podem ser incluídas nas composições aqui estabelecidas e podem ser aplicadas a uma planta(s) ou parte(s) da(s) mesma(s) simultaneamente ou em sucessão com outros compostos.

[00357] Os herbicidas incluem 2,4-D, 2,4-DB, acetocloro, acifluorfeno, alacloro, ametrina, atrazina, aminopiralide, benefina, bensulfuron, bensulida, bentazon, biciclopirona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimuron, clorsulfuron, cletodim, clomazone, clopyralid, cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifame, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopyr, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endothall, EPTC, etalfluralin, etofumesato, fenoxaprop, fluazifop-P, flucarbazona, flufenacet, flumetsulam, flumiclorac, flumioxazina, fluometuron, fluroxipir, fomesafeno, foramsulfuron, glufosinato, glifosato, halosulfuron, hexazinona, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazaquin, imazetapir, isoxaflutole, lactofen, linuron,

MCPA, MCPB, mesotriona, metolacloro-s, metribuzina, indaziflam, metsulfuron, molinato, MSMA, napropamida, naptalam, nicosulfuron, norflurazon, oryzalin, oxadiazon, oxyfluorfen, paraquat, ácido pelargônico, pendimethalin, phenmedipham, picloram, primisulfuron, prodiamine, prometrina, pronamida, propanila, prosulfuron, pirazon, pyrithioac, quinclorac, quizalofop, rimsulfuron, S- metolaclor, setoxidim, siduron, simazina, sulfentrazona, sulfometuron, sulfosulfuron, tebuthiuron, tembotriona, terbacil, thiazopyr, tifensulfuron, tiobencarb, topramezone, tralkoxydim, trialato, triasulfuron, tribenuron, triclopyr, trifluralina e triflusulfuron.

[00358] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos herbicidas estabelecidos nesse documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas estabelecidas nesse documento.

[00359] Produtos herbicidas podem incluir CORVUS, BALANCE FLEXX, CAPRENO, DIFLEXX, LIBERTY, LAUDIS, AUTUMN SUPER e DIFLEXX DUO.

[00360] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos herbicidas estabelecidos na Tabela 12 abaixo podem ser utilizados com qualquer um ou mais dos micróbios ensinados nesse documento e podem ser aplicados a qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas estabelecidas nesse documento. Tabela 12. Lista de exemplos de herbicidas, que podem ser combinados com micróbios da revelação Número do grupo de Local de Ação herbicidas Família Química Herbicida Inibidores ACCase 1 Ciclohexanedionas Sethoxydim (Poast, Poast

Número do grupo de Local de Ação herbicidas Família Química Herbicida Plus) Clethodim (Select, Select Max, Arrow) Ariloxifenoxipropionatos Fluazifop (Fusilade DX, componente em Fusion) Fenoxaprop (Puma, componente em Fusion) Quizalofop (Assure II, Targa) Fenilpirazolinas Pinoxaden (Axial XL) Inibidores de ALS 2 Imidazolinonas Imazethapyr (Pursuit) Imazamox (Raptor) Sulfonilureias Chlorimuron (Classic) Halosulfuron (Permit, Sandea) Iodosulfuron (componente em Autumn Super) Mesosulfuron (Osprey) Nicosulfuron (Accent Q) Primisulfuron (Beacon) Prosulfuron (Peak) Rimsulfuron (Matrix, Resolve) Tifensulfuron (Harmony) Tribenuron (Express) Triflusulfuron (UpBeet) Triazolopirimidina Flumetsulam (Python) Cloransulam-metílico (FirstRate) Pyroxsulam (PowerFlex HL) Florasulam (componente em Quelex) Sulfonilaminocarbonil Propoxycarbazone triazolinononas (Olympus) Tiencarbazona-methyl (componente em Capreno)

Inibidores de 3 Dinitroanilinas Trifluralina (muitos microtúbulos nomes) (inibidores de Etalfluralin (Sonalan) raiz) Pendimethalin (Prowl/Prowl H2O) Benzamida Pronamide (Kerb) Auxinas sintéticas 4 Arilpicolinato Halauxifen (Elevore, componente em Quelex)

Número do grupo de Local de Ação herbicidas Família Química Herbicida Ácidos fenoxiacéticos 2,4-D (Enlist One, outros) 2,4-DB (Butyrac 200, Butoxone 200)

MCPA Ácidos benzóicos Dicamba (Banvel, Clarity, DiFlexx, Engenia, XtendiMax; componente em Status) Piridinas Clopyralid (Stinger) Fluroxypyr (Starane Ultra) Inibidores do 5 Triazinas Atrazina fotossistema II Simazine (Princep, Sim- Trol) Triazinona Metribuzin (Metribuzin, others) Hexazinona (Velpar) Fenilcarbamatos Desmedipham (Betenex) Phenmedipham (componente em Betamix) Uracilas Terbacil (Sinbar) 6 Benzotiadiazóis Bentazona (Basagran, outros) Nitrilas Bromoxynil (Buctril, Moxy, outros) 7 Fenilureias Linuron (Lorox, Linex) Inibidor da 8 Tiocarbamatos EPTC (Eptam) síntese de lipídios Inibidor sw EPSPS 9 Organofósforo Glifosato Inibidor de 10 Organofósforo Glufosinato (Liberty, glutamina Rely) sintetase Inibidor da 13 Isoxazolidinona Clomazone (Comando) biossíntese de diterpeno (branqueamento) Inibidores da 14 Éter difenílico Acifluorfen (Ultra protoporfi- Blazer) rinogênio oxidase Fomesafen (Flexstar, (PPO) Reflex) Lactofen (Cobra, Phoenix) N-fenilftalimida Flumiclorac (Resource) Flumioxazin (Valor, Valor

Número do grupo de Local de Ação herbicidas Família Química Herbicida EZ, Rowel) Aril triazolinona Sulfentrazona (Authority, Spartan) Carfentrazona (Aim) Flutiaceto-metílico (Cadet) Pirazóis Piraflufen-etil (Vida) Pirimidinadiona Saflufenacil (Sharpen) Inibidores de 15 Acetamidas Acetocloro (Harness, ácidos graxos de Surpass NXT, cadeia longa Breakfree NXT, Warrant) Dimetenamida-P (Outlook) Metolacloro (Paralelo) Piroxassulfona (Zidua, Zidua SC) s-metolacloro (Dual Magnum, Dual II Magnum, Cinch) Flufenacet (Define) Local específico 16 Benzofuranos Etofumesato (Nortron) desconhecido Inibidor de 19 Semicarbazona diflufenzopyr transporte de (componente em Status) auxina Inibidores do 22 Bipyridiliums Paraquat (Gramoxone, fotossistema I Parazone) Diquat (Reglone) 4-inibidores de 27 Isoxazol Isoxaflutol (Balance HPPD Pirazol Flexx) (branqueamento) Pirazolona Pirossulfotol Tricetona (componente em Huskie) Topramezone (Armezon/Impact) Biciclopirona (componente em Acuron) Mesotriona (Callisto) Tembotriona (Laudis) Fungicidas

[00361] Como mencionado acima, as composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio nesse documento ensinado, às vezes são combinadas com um ou mais de fungicidas.

[00362] As composições compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos nesse documento e/ou tendo as características descritas nesse documento podem incluir adicionalmente um ou mais de fungicidas. Em algumas modalidades, as composições fungicidas podem ser incluídas nas composições estabelecidas nesse documento e podem ser aplicadas a uma planta(s) ou parte(s) da(s) mesma(s) simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Os fungicidas incluem azoxistrobina, captana, carboxina, etaboxam, fludioxonil, mefenoxam, fludioxonil, tiabendazol, tiabendaz, ipconazol, mancozeb, ciazofamida, zoxamida, metalaxil, PCNB, metaconazol, piraclostrobina, Bacillus subtilis cepa QST 713, sedaxane, tiametoxam, fludioxonil, thiram, tolclofós-metílico, trifloxistrobina, Bacillus subtilis cepa MBI 600, piraclostrobina, fluoxastrobina, Bacillus pumilus cepa QST 2808, clorotalonil, cobre, flutriafol, fluxapyroxad, mancozeb, gludioxonil, penthiopyrad, triazol, propiconaozol, protioconazol, tebuconazol, fluoxastrobin, piraclostrobina, picoxystrobin, qols, tetraconazol, trifloxistrobina, ciproconazol, flutriafol, SDHI, EBDCs, sedaxane, MAXIM QUATTRO (gludioxonil, mefenoxam, azoxistrobina, e tiabendaz), RAXIL (tebuconazol, prothoconazol, metalaxil, e sebo alquil aminas etoxiladas), e benzovindiflupyr.

[00363] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos fungicidas estabelecidos nesse documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas estabelecidas nesse documento. Nematicidas

[00364] Como mencionado acima, as composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse documento, às vezes são combinadas com um ou mais de nematicidas.

[00365] As composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos nesse documento e/ou com características como descritas nesse documento podem incluir ainda um ou mais de nematicidas. Em algumas modalidades, as composições nematicidas podem ser incluídas nas composições estabelecidas nesse documento e podem ser aplicadas a uma planta(s) ou parte(s) da(s) mesma(s) simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Os nematicidas podem ser selecionados de D-D, 1,3-dicloropropeno, dibrometo de etileno, 1,2-dibromo-3-cloropropano, brometo de metila, cloropicrina, metam sódio, dazomet, metilisotiocianato, tetratiocarbonato de sódio, aldicarb, aldoxicarb, carbofurano, oxamil, etoprop, fenamifós, cadusafós, fostiazato, terbufós, fensulfotion, forato, DiTera, clandosan, sincocina, iodeto de metila, brometo de propargil, 2,5-di-hidroximetil-3,4-di-hidroxipirrolidina (DMDP), qualquer uma ou mais das avermectinas, azida, furfural, Bacillus firmus, abamectrin, tiametoxam, fludioxonil, clotiandina, ácido salicílico e éster S- metílico do ácido benzo-(1,2,3)-tiadiazol-7-carbotióico.

[00366] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos nematicidas estabelecidos nesse documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas estabelecidas nesse documento.

[00367] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos nematicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas e/ou pesticidas estabelecidos nesse documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas estabelecidas nesse documento. Fertilizantes, Estabilizadores de nitrogênio e Inibidores de urease

[00368] Como mencionado acima, as composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse documento, são às vezes combinadas com um ou mais de um: fertilizante, estabilizador de nitrogênio ou inibidor de urease.

[00369] Em algumas modalidades, os fertilizantes são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação. Os fertilizantes incluem composições de amoníaco, ureia, nitrato de amônio e ureia-nitrato de amônio (UAN), entre muitos outros. Em algumas modalidades, fertilização na semente e/ou fertilização próxima da semente é usada em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação.

[00370] Em algumas modalidades, estabilizadores de nitrogênio são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação. Os estabilizadores de nitrogênio incluem nitrapirina, 2-cloro-6- (triclorometil)piridina, N-SERVE 24, INSTINCT, dicianodiamida (DCD).

[00371] Em algumas modalidades, os inibidores de urease são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação. Os inibidores da urease incluem N-(n- butil)-triamida tiofosfórica (NBPT), AGROTAIN, AGROTAIN PLUS e AGROTAIN PLUS SC. Além disso, a revelação contempla a utilização de AGROTAIN ADVANCED 1.0, AGROTAIN DRI-MAXX e AGROTAIN ULTRA.

[00372] Além disso, podem ser usadas formas estabilizadas de fertilizante. Por exemplo, uma forma estabilizada de fertilizante é SUPER U, contendo 46% de nitrogênio em um grânulo estabilizado à base de ureia, SUPERU contém inibidores de urease e nitrificação para proteger contra desnitrificação, lixiviação e volatilização. Fertilizantes foliares estabilizados e direcionados, tal como NITAMIN, também podem ser usados nesse documento.

[00373] Os fertilizantes na semente são comumente usados em campos de milho. A fertilização na semente consiste na aplicação de alguns quilos de nutrientes com a semente no plantio. A fertilização na semente é usada para aumentar o vigor da muda.

[00374] Fertilizante de liberação lenta ou controlada que pode ser usado aqui envolve: Um fertilizante contendo um nutriente de planta em uma forma que retarda sua disponibilidade para absorção e uso pela planta após a aplicação, ou que estende sua disponibilidade para a planta significativamente mais do que uma referência ‘fertilizante nutritivo rapidamente disponível’, tal como nitrato de amônio ou ureia, fosfato de amônio ou cloreto de potássio. Esse atraso de disponibilidade inicial ou tempo estendido de disponibilidade contínua pode ocorrer por uma variedade de mecanismos. Esses incluem solubilidade em água controlada do material por revestimentos semipermeáveis, oclusão, materiais proteicos ou outras formas químicas, por hidrólise lenta de compostos de baixo peso molecular solúveis em água ou por outros meios desconhecidos.

[00375] Fertilizante de nitrogênio estabilizado que pode ser usado envolve nesse documento: Um fertilizante ao qual um estabilizador de nitrogênio foi adicionado. Um estabilizador de nitrogênio é uma substância adicionada a um fertilizante que estende o tempo em que o componente de nitrogênio do fertilizante permanece no solo na forma de N- ureia ou N-amoniacal.

[00376] O inibidor de nitrificação que pode ser usado envolve nesse documento: Uma substância que inibe a oxidação biológica de N-amoniacal em N-nitrato. Alguns exemplos incluem: (1) 2-cloro-6-(triclorometil-piridina), nome comum Nitrapirina, fabricado por Dow Chemical; (2) 4-amino-1,2,4- 6-triazol-HCl, nome comum ATC, fabricado por Ishihada Industries; (3) 2,4-diamino-6-tricloro-metiltriazina, nome comum CI-1580, fabricado por American Cyanamid; (4) Dicianodiamida, nome comum DCD, fabricado por Showa Denko; (5) Tioureia, nome comum TU, fabricado por Nitto Ryuso; (6) 1-mercapto-1,2,4-triazol, nome comum MT, fabricado pela Nippon; (7) 2-amino-4-cloro-6-metil-piramidina, nome comum AM, fabricado por Mitsui Toatsu; (8) fosfato de 3,4- dimetilpirazol (DMPP), da BASF; (9) 1-amida-2-tioureia (ASU), da Nitto Chemical Ind .; (10) Tiossulfato de amônio (ATS); (11) 1H-1,2,4-triazol (HPLC); (12) óxido de 5- etileno-3-tricloro-metil-1,2,4-tiodiazol (Terrazol), de Olin Mathieson; (13) 3-metilpirazol (3-MP); (14) 1- carbamoil-3-metil-pirazol (CMP); (15) Nim; e (16) DMPP.

[00377] O inibidor de urease que pode ser usado envolve nesse documento: Uma substância que inibe a ação hidrolítica da ureia pela enzima urease. Milhares de produtos químicos foram avaliados como inibidores da urease do solo (Kiss e Simihaian, 2002). No entanto, apenas alguns dos muitos compostos testados atendem aos requisitos necessários de serem não tóxicos, eficazes em baixas concentrações, estáveis e compatíveis com a ureia (sólida e soluções), degradáveis no solo e baratos. Eles podem ser classificados de acordo com suas estruturas e sua interação assumida com a enzima urease (Watson, 2000, 2005). Quatro classes principais de inibidores de urease foram propostas: (a) reagentes que interagem com os grupos sulfidrila (reagentes sulfidrila), (b) hidroxamatos, (c) produtos químicos para proteção de cultivos agrícolas e (d) análogos estruturais de ureia e compostos relacionados. N-(n-butil)triamida tiofosfórica (NBPT), fenilfosforodiamidato (PPD/PPDA) e hidroquinona são provavelmente os inibidores de urease mais estudados (Kiss e Simihaian, 2002). Pesquisas e testes práticos também foram realizados com triamida do ácido N- (2-nitrofenil)fosfórico (2-NPT) e tiossulfato de amônio (ATS). Os compostos organo-fósforo são análogos estruturais da ureia e são alguns dos inibidores mais eficazes da atividade da urease, bloqueando o sítio ativo da enzima (Watson, 2005). Tratamentos de Sementes com Inseticidas (ISTs) para Milho

[00378] Os tratamentos de sementes de milho normalmente visam três espectros de pragas: nematoides, doenças fúngicas de mudas e insetos.

[00379] Os tratamentos de sementes com inseticidas são geralmente o principal componente de um pacote de tratamento de sementes. A maioria das sementes de milho disponíveis hoje vem com um pacote básico que inclui fungicida e inseticida. Em alguns aspectos, as opções de inseticidas para o tratamento de sementes incluem PONCHO (clotianidina), CRUISER/CRUISER EXTREME (tiametoxam) e GAUCHO

(Imidacloprid). Todos os três produtos são produtos químicos neonicotinoides. CRUISER e PONCHO na taxa de 250 (0,25 mg AI/semente) são algumas das opções de base mais comuns disponíveis para o milho. Em alguns aspectos, as opções de inseticida para tratamentos incluem CRUISER 250 tiametoxam, CRUISER 250 (tiametoxam) mais LUMIVIA (clorantraniliprol), CRUISER 500 (tiametoxam) e PONCHO VOTIVO 1250 (Clotianidina & Bacillus firmus I-1582).

[00380] A pacote de tratamento de sementes com inseticida básico da Pioneer consiste em CRUISER 250 com PONCHO/VOTIVO 1250 também disponível. VOTIVO é um agente biológico que protege contra nematoides.

[00381] Os produtos da Monsanto, incluindo milho, soja e algodão, estão sob o tratamento guarda-chuva ACCELERON. A semente de milho Dekalb vem de fábrica com PONCHO 250. Os produtores também têm a opção de atualizar para PONCHO/VOTIVO, com PONCHO aplicado na taxa 500.

[00382] Agrisure, Golden Harvest e Garst possuem um pacote básico com fungicida e CRUISER 250. Milho completo AVICTA também está disponível; isso inclui CRUISER 500, fungicida e proteção de nematoides. CRUISER EXTREME é outra opção disponível como pacote de tratamento de sementes; as quantidades de CRUISER são iguais às do tratamento convencional de sementes CRUISER, isto é, 250, 500 ou 1250.

[00383] Outra opção é comprar o tratamento inseticida mínimo disponível e ter um revendedor para tratar a semente a jusante.

[00384] ISTs comercialmente disponíveis para milho estão listados na Tabela 13 abaixo e podem ser combinados com um ou mais dos micróbios ensinados nesse documento.

Tabela 13. Lista de tratamentos de sementes exemplificativos, incluindo ISTs, que podem ser combinados com micróbios da revelação Tipo de Ingrediente(s) Tratamento ativo(s) Nome comercial do produto Cultivo F azoxistrobina DINASTIA Milho, Soja PROTÉGÉ FL Milho F Bacillus pumilus YIELD SHIELD Milho, Soja F Bacillus subtilis HISTICK N/T Soja VAULT HP Milho, Soja F Captan CAPTAN 400 Milho, Soja CAPTAN 400-C Soja Corny F Fludioxonil MAXIM 4FS Milho, Soja F Peróxido de hidrogênio OXIDATE Soja STOROX Soja F ipconazol ACCELERON DC-509 Milho RANCONA 3.8 FS Milho, Soja VÓRTICE Milho F mancozeb BONIDE MANCOZEB COM CONCENTRADO Milho

DE ZINCO DITHANE 75DF RAINSHIELD Milho DITHANE DF RAINSHIELD Milho DITHANE F45 RAINSHIELD Milho DITHANE M45 Milho LESCO 4 FLOWABLE MANCOZEB Milho PENNCOZEB 4FL FLOWABLE PENNCOZEB 75DF DRY FLOWABLE Milho PENNCOZEB 80WP Milho Milho F mefenoxam APRON XL Milho, Soja F metalaxil ACCELERON DC-309 Milho ACCELERON DX-309 Milho, Soja ACQUIRE Milho, Soja AGRI STAR METALAXIL 265 ST Milho, Soja ALLEGIANCE DRY Milho, Soja ALLEGIANCE FL Milho, Soja BELMONT 2.7 FS Milho, Soja DYNA-SHIELD METALAXIL Milho, Soja SEBRING 2.65 ST Milho, Soja SEBRING 318 FS Milho, Soja SEBRING 480 FS Milho, Soja VIREO MEC Soja F PIRACLOSTROBINA ACCELERON DX-109 Soja ENERGIA Milho F Streptomyces MYCOSTOP Milho, Soja griseoviridis F Streptomyces lydicus ACTINOGROW ST Milho, Soja F tebuconazol AMTIDE TEBU 3.6F Milho

Tipo de Ingrediente(s) Tratamento ativo(s) Nome comercial do produto Cultivo SATIVA 309 FS Milho SATIVA 318 FS Milho TEBUSHA 3.6FL Milho TEBUZOL 3.6F Milho F tiabendazol MERTECT 340-F Soja F tiram 42-S THIRAM Milho, Soja FLOWSAN Milho, Soja SIGNET 480 FS Milho, Soja F Trichoderma harzianum T-22 HC Milho, Soja Rifai F trifloxistrobina ACCELERON DX-709 Milho TRILEX FLOWABLE Milho, soja I clorpirifós LORSBAN 50W em pacotes solúveis Milho em água I clotianidina ACCELERON IC-609 Milho NIPSIT INSIDE Milho, Soja PONCHO 600 Milho I imidacloprida ACCELERON IX-409 Milho AGRI STAR MACHO 600 ST Milho, Soja AGRISOLUTIONS NITRO SHIELD Milho, Soja ATTENDANT 600 Milho, Soja AXCESS Milho, Soja COURAZE 2F Soja DYNA-SHIELD IMIDACLOPRID 5 Milho, Soja GAUCHO 480 FLOWABLE Milho, Soja GAUCHO 600 FLOWABLE Milho, Soja GAUCHO SB FLOWABLE Milho, Soja NUPRID 4.6F PRO Soja SENATOR 600 FS Milho, Soja I tiametoxam CRUISER 5FS Milho, Soja N abamectina AVICTA 500 FS Milho, Soja N Bacillus firmus VOTIVO FS Soja P citocinina SOIL X-CYTO Soja X-CYTE Soja P proteína alfa beta ACCELERON HX-209 Milho, Soja tipo grampo de cabelo N-HIBIT GOLD CST Milho, Soja N-HIBIT HX-209 Milho, Soja P ácido indol butírico KICKSTAND PGR Milho, Soja I, N tiametoxam, AVICTA DUO CORN Milho abamectina AVICTA DUO 250 I, F clotianidina, PONCHO VOTIVO Milho, Soja Bacillus firmus F, F carboxina, captana ENHANCE Soja I, F permetrina, carboxina KERNEL GUARD SUPREME Milho, Soja F, F carboxina, tiram VITAFLO 280 Milho, Soja F, F mefenoxam, MAXIM XL Milho, Soja fludioxonil WARDEN RTA Soja

APRON MAXX RFC

Tipo de Ingrediente(s) Tratamento ativo(s) Nome comercial do produto Cultivo APRON MAXX RTA + MOLY

APRON MAXX RTA I, F imidacloprida, AGRISOLUTIONS CONCUR Milho metalaxil F, F metalaxil, ipconazol RANCONA SUMMIT Soja

RANCONA XXTRA F, F thiram, metalaxil PROTECTOR-L-ALLEGIANCE Soja F, F trifloxistrobina, TRILEX AL Soja metalaxil TRILEX 2000 P, P, P citocinina, ácido STIMULATE YIELD ENHANCER ASCEND Milho , soja giberélico, ácido indol butírico F, F, I mefenoxam, CRUISERMAXX PLUS Soja fludioxonil, tiametoxam F, F, F captana, carboxina, BEAN GUARD/ ALLEGIANCE Soja metalaxil F, F, I captana, carboxina, ENHANCE AW Soja imidacloprida F, F, I carboxina, metalaxil, LATITUDE Milho , soja imidacloprida F, F, F metalaxil, STAMINA F3 HL Milho piraclostrobina, triticonazol F, F, F, I azoxistrobina, CRUISER EXTREME Milho fludioxonil, mefenoxam, tiametoxam F, F, F, F, azoxistrobina, MAXIM QUATTRO Milho F fludioxonil, mefenoxam, tiabendazol I Clorantraniliprol LUMIVIA Milho F = Fungicida; I = inseticida; N = Nematicida; P = Regulador de Crescimento Vegetal Aplicação de Populações Bacterianas em Cultivos

[00385] A composição da bactéria ou população bacteriana descrita nesse documento pode ser aplicada em sulco, em talco ou como tratamento de sementes. A composição pode ser aplicada a um pacote de sementes a granel, minigranel, em um saco ou em talco.

[00386] O plantador pode plantar a semente tratada e cultivar o cultivo de acordo com as formas convencionais, fileiras duplas ou formas que não requerem lavoura. As sementes podem ser distribuídas usando uma tremonha de controle ou em tremonha individual. As sementes também podem ser distribuídas usando ar pressurizado ou manualmente. A colocação de sementes pode ser realizada usando tecnologias de taxa variável. Adicionalmente, a aplicação da bactéria ou população bacteriana descrita nesse documento pode ser aplicada usando tecnologias de taxa variável. Em alguns exemplos, a bactéria pode ser aplicada a sementes de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais, pseudocereais e sementes oleaginosas. Exemplos de cereais podem incluir cevada, fonio, aveia, grama nipa, centeio, milheto, sorgo, espelta, teff, triticale e trigo. Exemplos de pseudocereais podem incluir fruta-pão, trigo-sarraceno, tabúa-larga, chia, linho, amaranto de grãos, aizen, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modificados (OGM), não-OGM, orgânicos ou convencionais.

[00387] Aditivos tal como micro-fertilizante, PGR, herbicida, inseticida e fungicida podem ser usados adicionalmente para tratar os cultivos. Exemplos de aditivos incluem protetores de cultivo, tais como, inseticidas, nematicidas, fungicidas, agentes de aprimoramento, tais como, corantes, polímeros, agentes de peletização, agentes de embebimento e desinfetantes e outros agentes, tais como, inoculante, PGR, amaciante e micronutrientes. Os PGRs podem ser hormônios de planta naturais ou sintéticos que afetam o crescimento da raiz, a floração ou o alongamento do caule. PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas,

etileno e ácido abscísico (ABA).

[00388] A composição pode ser aplicada em sulco em combinação com fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser mantido em tanques. Os fertilizantes NPK contêm macronutrientes de sódio, fósforo e potássio.

[00389] A composição pode melhorar as características da planta, tal como, promoção do crescimento da planta, manutenção de alto teor de clorofila nas folhas, aumento do número de frutos ou sementes e aumento do peso unitário dos frutos ou sementes. Os métodos da presente revelação podem ser empregados para introduzir ou melhorar um ou mais de uma variedade de características desejáveis. Exemplos de características que podem ser introduzidas ou melhoradas incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência do uso de água, biomassa geral, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância a sal, tolerância ao baixo estresse de nitrogênio, eficiência de uso de nitrogênio, resistência ao estresse de nematoides, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito, modulação no nível de um metabólito, expressão de proteoma. As características desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, raiz e/ou biomassa do broto, germinação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, grãos de plantas ou rendimento de frutos, conteúdo de clorofila na folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser usadas para medir o crescimento e comparado com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem as características introduzidas e/ou melhoradas) cultivadas sob condições idênticas. Em alguns exemplos, as características desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, biomassa de raiz e/ou broto, germinação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de semente/fruto, grão de planta ou rendimento de fruto, teor de clorofila de folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz ou qualquer combinação dos mesmos podem ser usados para medir o crescimento e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem as características introduzidas e/ou melhoradas) cultivadas sob condições similares.

[00390] Uma característica agronômica de uma planta hospedeira pode incluir, mas não está limitada a, como a seguir: teor de óleo alterado, teor de proteína alterado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada e composição de proteína de semente alterada, tolerância química, tolerância a frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhoria do crescimento, melhoria da saúde, tolerância ao calor, resistência herbívora melhorada com fixação de nitrogênio, utilização de nitrogênio melhorada, arquitetura de raiz melhorada, eficiência de uso de água melhorada, biomassa aumentada, comprimento da raiz aumentada, peso da semente aumentado, comprimento do broto aumentado, aumento da produção, aumento da produção sob condições de limitação de água, massa do grão, teor de umidade do grão, tolerância de metal, número de espigas, número de grãos por espiga, número de vagens, aprimoramento nutricional, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhoria da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, permanência verde, melhoria do vigor, aumento de peso seco de sementes maduras, aumento do peso fresco de sementes maduras, aumento do número de sementes maduras por planta, aumento do conteúdo de clorofila, aumento do número de vagens por planta, aumento do comprimento das vagens por planta, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de um transcrito e uma modulação detectável no proteoma, em comparação com uma planta isolina crescido a partir de uma semente sem a referida formulação de tratamento de semente.

[00391] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias ou populações de bactérias que são isoladas da mesma espécie de planta que o elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria ou população bacteriana que é normalmente encontrada em uma variedade de Zea mays (milho) está associada a um elemento de planta de uma planta de outra variedade de Zea mays que em seu estado natural não possui as referidas bactérias e populações bacterianas. Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são derivadas de uma planta de uma espécie de planta relacionada como o elemento da planta da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria e populações bacterianas que são normalmente encontradas em Zea diploperennis Iltis et al., (Teosinto diploperenial) são aplicadas a um Zea mays (milho), ou vice- versa. Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias e populações de bactérias heterólogas ao elemento de planta da planta inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são derivadas de uma planta de outra espécie. Por exemplo, uma bactéria e populações bacterianas que são normalmente encontradas em dicotiledôneas são aplicadas a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculando milho com uma bactéria e populações bacterianas derivada(s) de soja) ou vice-versa. Em outros casos, as bactérias e as populações de bactérias a serem inoculadas em uma planta são derivadas de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são derivadas de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são parte de uma composição projetada inoculada em qualquer elemento da planta hospedeira.

[00392] Em alguns exemplos, a bactéria ou população bacteriana é exógena, em que a bactéria e a população bacteriana são isoladas de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, a bactéria ou população bacteriana pode ser isolada de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, a bactéria ou população bacteriana pode ser isolada de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[00393] Em alguns exemplos, as bactérias e as populações bacterianas descritas nesse documento são capazes de se mover de um tipo de tecido para outro.

Por exemplo, a detecção e o isolamento da presente revelação de bactérias e populações bacterianas dentro dos tecidos maduros das plantas após o revestimento no exterior de uma semente demonstra sua capacidade de se mover do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta em maturação.

Portanto, em uma modalidade, a população de bactérias e as populações bacterianas são capazes de se mover do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta.

Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas que são revestidas na semente de uma planta são capazes, após a germinação da semente em um estado vegetativo, de se localizar em um tecido diferente da planta.

Por exemplo, bactérias e populações bacterianas podem ser capazes de se localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: raiz, raiz adventícia, raiz 5 seminal, pelo de raiz, broto, folha, flor, botão, borla, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidátodo, pétala, sépala, gluma, raque, câmbio vascular, floema e xilema.

Em uma modalidade, a bactéria e as populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz e/ou no pelo da raiz da planta.

Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta.

Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema.

Em ainda outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta)

da planta. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar na(o)(s) raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em ainda outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas colonizam um fruto ou tecido de semente da planta. Em ainda outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de colonizar a planta de modo que ela esteja presente na superfície da planta (isto é, sua presença está detectavelmente presente no exterior da planta ou na episfera da planta). Em ainda outras modalidades, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de localizar substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, as bactérias e as populações bacterianas não estão localizadas na raiz de uma planta. Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[00394] A eficácia das composições também pode ser avaliada medindo a maturidade relativa do cultivo ou da unidade de aquecimento da colheita (CHU). Por exemplo, a população bacteriana pode ser aplicada ao milho e o crescimento do milho pode ser avaliado de acordo com a maturidade relativa do grão de milho ou o momento em que o grão de milho está no peso máximo. A unidade de aquecimento do cultivo (CHU) também pode ser usada para prever a maturação do cultivo de milho. A CHU determina a quantidade de acúmulo de calor medindo as temperaturas máximas diárias no crescimento da cultura.

[00395] Em exemplos, as bactérias podem se localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo de raiz, broto, folha, flor,

borla de botão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidátodo, pétala, sépala, gluma, raque, câmbio vascular, floema e xilema. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame ou fruta) da planta. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana coloniza um fruto ou tecido de semente da planta. Em ainda outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de colonizar a planta de modo que esteja presente na superfície da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de localizar substancialmente todos, ou todos os tecidos da planta. Em certas modalidades, a bactéria ou população bacteriana não está localizada na raiz de uma planta. Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[00396] A eficácia das composições bacterianas aplicadas aos cultivos pode ser avaliada medindo várias características do crescimento do cultivo, incluindo, mas não se limitando a, taxa de plantio, vigor de semeadura, força da raiz, tolerância à seca, altura da planta, secagem e peso de teste. Espécies de plantas

[00397] Os métodos e bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas, tais como plantas dos gêneros Hordeum, Oryza, Zea e Triticeae. Outros exemplos não limitativos de plantas adequadas incluem musgos, líquenes e algas. Em alguns casos, as plantas têm valor econômico, social e/ou ambiental, tais como, cultivos alimentares, cultivos de fibras, cultivos oleaginosos, plantas da silvicultura ou indústrias de papel e celulose, carga de alimentação para produção de biocombustíveis e/ou plantas ornamentais. Em alguns exemplos, as plantas podem ser usadas para produzir produtos economicamente valiosos, tais como, um grão, uma farinha, um amido, um xarope, uma refeição, um óleo, um filme, um pacote, um produto nutracêutico, uma polpa, uma ração animal, uma forragem para peixes, um material a granel para produtos químicos industriais, um produto de cereal, um produto alimentício humano processado, um açúcar, um álcool e/ou uma proteína. Exemplos não limitativos de plantas de colheita incluem milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, triticale de centeio, trigo sarraceno, milho doce, cana-de- açúcar, cebola, tomate, morango e aspargo. Em algumas modalidades, os métodos e as bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas transgênicas, plantas não transgênicas e plantas híbridas das mesmas.

[00398] Em alguns exemplos, as plantas que podem ser obtidas ou melhoradas usando os métodos e a composição revelados nesse documento podem incluir plantas que são importantes ou interessantes para a agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de biocombustível e outros produtos químicos e/ou silvicultura.

Alguns exemplos dessas plantas podem incluir abacaxi, banana, coco, lírio, ervilhas e grama; e plantas dicotiledôneas, tais como, por exemplo, ervilhas, alfafa, tomatillo, melão, grão de bico, chicória, trevo, couve, lentilha, soja, tabaco, batata, batata doce, rabanete, repolho, colza, macieira, uva, algodão, girassol, agrião, canola, frutas cítricas (incluindo laranja, tangerina, quincã, lima, limão, toranja, tangerina, tangelo, cidra e pomelo), pimenta, feijão, alface, Panicum virgatum (gramínea nativa da América do Norte), Sorghum bicolor (sorgo, Sudão), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (cana selvagem), Populus balsamifera (choupo-bálsamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp.

Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum- 25 trigo X centeio), Bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (dendê), Phoenix dactylifera (tamareira), Archontophoenix cunninghamiana (palmeira real), Syagrus romanzoffiana (palmeira rainha), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface),

Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve de Bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimentão), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Papaver somniferum (papoila-dormideira), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea 5 spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia spp., Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tobaco), Lupinus albus (tremoço-branco), Uniola paniculata (aveia do mar), Hordeum vulgare (cevada), and Lolium spp. (centeio).

[00399] Em alguns exemplos, uma planta monocotiledônea pode ser usada. As plantas monocotiledôneas pertencem às ordens dos Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales, e Zingiberales. As plantas pertencentes à classe das Gymnospermae são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales, and Pinales. Em alguns exemplos, a planta monocotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, cevada e cana-de-açúcar.

[00400] Em alguns exemplos, uma planta dicotiledônea pode ser usada, incluindo aquelas pertencentes às ordens de Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales, e Violates. Em alguns exemplos, a planta dicotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em algodão, soja, pimenta e tomate.

[00401] Em alguns casos, a planta a ser melhorada não é prontamente receptiva às condições experimentais. Por exemplo, uma planta de cultivo pode levar muito tempo para crescer o suficiente para avaliar de forma prática uma característica melhorada em série ao longo de múltiplas iterações. Consequentemente, uma primeira planta a partir da qual as bactérias são inicialmente isoladas e/ou a pluralidade de plantas às quais bactérias geneticamente manipuladas são aplicadas pode ser uma planta modelo, tal como uma planta mais passível de avaliação nas condições desejadas. Exemplos não limitativos de plantas modelo incluem Setaria, Brachypodium e Arabidopsis. A capacidade das bactérias isoladas de acordo com um método da revelação usando uma planta modelo pode então ser aplicada a uma planta de outro tipo (por exemplo, uma planta de cultivo) para confirmar a atribuição da característica melhorada.

[00402] Traços que podem ser melhorados pelos métodos revelados nesse documento incluem qualquer característica observável da planta, incluindo, por exemplo, taxa de crescimento, altura, peso, cor, sabor, cheiro, mudanças na produção de um ou mais compostos pela planta (incluindo, por exemplo, metabólitos, proteínas, fármacos, carboidratos, óleos e quaisquer outros compostos). A seleção de plantas com base na informação genotípica também é considerada (por exemplo, incluindo o padrão de expressão gênica da planta em resposta à bactéria, ou a identificação da presença de marcadores genéticos, como aqueles associados à fixação aumentada de nitrogênio). As plantas também podem ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de um(a) certo(a) traço ou característica (tal como um(a) traço ou característica indesejável) em oposição à presença de um(a) certo(a) traço ou característica (tal como um(a)

certo(a) traço ou característica). Milho Não Geneticamente Modificado

[00403] Os métodos e bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas de milho não geneticamente modificadas ou parte das mesmas. E em alguns aspectos o milho é orgânico. Além disso, os métodos e bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer um dos seguintes híbridos, variedades, linhagens não geneticamente modificados, etc. Em algumas modalidades, as variedades de milho geralmente se enquadram em seis categorias: milho doce, milho sílex, milho de pipoca, milho dentado, milho selvagem e farinha de milho. Milho doce

[00404] As variedades de Yellow su incluem Earlivee, Early Sunglow, Sundance, Early Golden Bantam, Iochief, Merit, Jubilee e Golden Cross Bantam. As variedades de su branco incluem True Platinum, Country Gentleman, Silver Queen e Stowell’s Evergreen. As variedades Bicolor su incluem Açúcar e Ouro, Quickie, Duplo Padrão, Manteiga e Açúcar, Pontos de Açúcar, Mel e Creme. As variedades multicoloridas de su incluem Hookers, Triple Play, Painted Hill, Black Mexican/Astec.

[00405] As variedades de Yellow su incluem Buttergold, Precocious, Spring Treat, Sugar Buns, Colorow, Kandy King, Bodacious R/M, Smoking, Incredible, Merlin, Miracle e Kandy Korn EH. As variedades de white se incluem Spring Snow, Sugar Pearl, Whiteout, Cloud Nine, Alpine, Silver King e Argent. As variedades bicolor se incluem Sugar Baby, Fleet, Bon Jour, Trinity, Bi-Licious, Temptation, Luscious, Ambrosia, Accord, Brocade, Lancelot, Precious Gem, Peaches e Cream Mid EH e

Delectable R/M. Variedades multicoloridas incluem Ruby Queen.

[00406] As variedades de Yellow sh2 incluem Extra Early Super Sweet, Takeoff, Early Xtra Sweet, Raveline, Summer Sweet Yellow, Krispy King, Garrison, Illini Gold, Challenger, Passion, Excel, Jubilee SuperSweet, Illini Xtra Sweet, and Crisp ‘N Sweet. White sh2 varieties include Summer Sweet White, Tahoe, Aspen, Treasure, How Sweet It Is, and Camelot. Bicolor sh2 varieties include Summer Sweet Bicolor, Radiance, Honey ‘N Pearl, Aloha, Dazzle, Hudson, e Phenomenal.

[00407] As variedades de Yellow sy incluem Applause, Inferno, Honeytreat, and Honey Select. White sy varieties include Silver Duchess, Cinderella, Mattapoisett, Avalon, and Captivate. Bicolor sy varieties include Pay Dirt, Revelation, Renaissance, Charisma, Synergy, Montauk, Kristine, Serendipity/Providence, e Cameo.

[00408] Variedades de yellow aumentado superdoce incluem Xtra-Tender 1ddA, Xtra-Tender 11dd, Mirai 131Y, Mirai 130Y, Vision, e Mirai 002. Variedades de yellow superdoce aumentado include Xtra-Tender 3dda, Xtra-Tender 31dd, Mirai 421W, XTH 3673, e Devotion. Variedades bicolor superdoce aumentado incluem Xtra-Tender 2dda, Xtra-Tender 21dd, Kickoff XR, Mirai 308BC, Anthem XR, Mirai 336BC, Fantastic XR, Triumph, Mirai 301BC, Stellar, American Dream, Mirai 350BC, e Obsession. Milho de sílex

[00409] Variedades de milho de sílex incluem Laranja Bronze, Sílex maçã do amor, Floriani Red Flint, multicolorido, Indiano Ornamental (arco-íris), Mandan Red

Flour, Painted Mountain, Petmecky, Cherokee White Flour. Milho de Pipoca

[00410] As variedades de milho de pipoca incluem borboleta monarca, borboleta amarela, azul meia-noite, vermelho rubi, arroz misturado de bebês, malva da rainha, flocos de cogumelos, sem casca japonesa, morango, xamã azul, colorido em miniatura, rosa em miniatura, sabor de manteiga holandesa da Pensilvânia, e morango vermelho. Milho dentado

[00411] As variedades de milho dentado incluem Bloody Butcher, Blue Clarage, Ohio Blue Clarage, Cherokee White Eagle, Hickory Cane, Hickory King, Jellicorse Twin, Kentucky Rainbow, Daymon Morgan’s Knt. Butcher, Leaming, Leaming’s Yellow, McCormack’s Blue Giant, Neal Paymaster, Pungo Creek Butcher, Reid’s Yellow Dent, Rotten Clarage e Tennessee Red Cob.

[00412] Em algumas modalidades, as variedades de milho incluem P1618W, P1306W, P1345, P1151, P1197, P0574, P0589 e P0157. W = milho branco.

[00413] Em algumas modalidades, os métodos e bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer híbrido das variedades de milho estabelecidas nesse documento. Milho Geneticamente Modificado

[00414] Os métodos e bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer um de um(a) híbrido, variedade, linhagem, etc. de plantas de milho geneticamente modificadas ou parte das mesmas.

[00415] Além disso, os métodos e bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer um dos seguintes eventos de milho geneticamente modificado, que foram aprovados em um ou mais países: 32138 (32138 SPT Maintainer), 3272 (ENOGEN), 3272 x Bt11, 3272 x bt11 x GA21, 3272 x Bt11 x MIR604, 3272 x Bt11 x MIR604 x GA21, 3272 x Bt11 x MIR604 x TC1507 x 5307 x GA21, 3272 x GA21, 3272 x MIR604, 3272 x MIR604 x GA21, 4114, 5307 (AGRISURE Duracade), 5307 x GA21, 5307 x MIR604 x Bt11 x TC1507 x GA21 (AGRISURE Duracade 5122), 5307 x MIR604 x Bt11 x TC1507 x GA21 x MIR162 (AGRISURE Duracade 5222), 59122 (HERCULEX RW), 59122 x DAS40278, 59122 x GA21, 59122 x MIR604, 59122 x MIR604 x GA21, 59122 x MIR604 x TC1507, 59122 x MIR604 x TC1507 x GA21, 59122 x MON810, 59122 x MON810 x MIR604, 59122 x MON810 x NK603, 59122 x MON810 x NK603 x MIR604, 59122 x MON88017, 59122 x MON88017 x DAS40278, 59122 x NK603 (Herculex RW ROUNDUP READY 2), 59122 x NK603 x MIR604, 59122 x TC1507 x GA21, 676, 678, 680, 3751 IR, 98140, 98140 x 59122, 98140 x TC1507, 98140 x TC1507 x 59122, Bt10 (Bt10), Bt11 [X4334CBR, X4734CBR] (AGRISURE CB/LL), Bt11 x 5307, Bt11 x 5307 x GA21, Bt11 x 59122 x MIR604, Br11 x 59122 x MIR604 x GA21, Bt11 x 59122 x MIR604 x TC1507, M53, M56, DAS-59122-7, Bt11 x 59122 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x 59122 x TC1507, TC1507 x DAS- 59122-7, Bt11 x 59122 x TC1507 x GA21, Bt11 x GA21 (AGRISURE GT/CB/LL), Bt11 x MIR162 (AGRISURE Viptera 2100), BT11 x MIR162 x 5307, Bt11 x MIR162 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x GA21 (AGRISURE Viptera 3110), Bt11 x MIR162 x MIR604 (AGRISURE Viptera 3100), Bt11 x MIR162 x MIR604 x 5307, Bt11 x MIR162 x MIR604 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x MIR604 x GA21 (AGRISURE Viptera 3111/AGRISURE Viptera 4), Bt11, MIR162 x MIR604 x MON89034 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307,

Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x MIR162 x MON89034, Bt11 x MIR162 x MON89034 x GA21, Bt11 x MIR162 x TC1507, Bt11 x MIR162 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR162 x TC1507 x 5307 x GA21, Bt11 x MR162 x TC1507 x GA21 (AGRISURE Viptera 3220), BT11 x MIR604 (Agrisure BC/LL/RW), Bt11 x MIR604 x 5307, Bt11 x MIR604 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR604 x GA21, Bt11 x MIR604 x TC1507, Bt11 x MIR604 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x MON89Ø34 x GA21, Bt11 x TC1507, Bt11 x TC1507 x 5307, Bt11 x TC1507 x GA21, Bt176

[176] (NaturGard KnockOut/Maximizer), BVLA430101, CBH-351 (STARLINK Maize), DAS40278 (ENLIST Maize), DAS40278 x NK603, DBT418 (Bt Xtra Maize), DLL25 [B16], GA21 (ROUNDUP READY Maize/AGRISURE GT), GA21 x MON810 (ROUNDUP READY Yieldgard Maize), GA21 x T25, HCEM485, LY038 (MAVERA Maize), LY038 x MON810 (MAVERA Yieldgard Maize), MIR162 (AGRISURE Viptera), MIR162 x 5307, MIR162 x 5307 x GA21, MIR162 x GA21, MIR162 x MIR604, MIR162 x MIR604 x 5307, MIR162 x MIR604 x 5307 x GA21, MIR162 x MIR604 x GA21, MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307, MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307 x GA21, MIR162 x MIR604 x TC1507 x GA21, MIR162 x MON89Ø34, MIR162 x NK603, MIR162 x TC1507, MIR162 x TC1507 x 5307, MIR162 x TC1507 x 5307 x GA21, MIR162 x TC1507 x GA21, MIR604 (AGRISURE RW), MIR604 x 5307, MIR604 x 5307 x GA21, MIR604 x GA21 (AGRISURE GT/RW), MIR604 x NK603, MIR604 x TC1507, MIR604 x TC1507 x 5307, MIR604 x TC1507 x 5307 xGA21, MIR604 x TC1507 x GA21, MON801 [MON80100], MON802, MON809, MON810 (YIELDGARD, MAIZEGARD), MON810 x MIR162, MON810 x MIR162 x NK603, MON810 x MIR604, MON810 x MON88017 (YIELDGARD VT Triple), MON810 x NK603 x MIR604, MON832 (ROUNDUP READY Maize), MON863 (YIELDGARD Rootworm RW, MAXGARD), MON863 x MON810 (YIELDGARD Plus),

MON863 x MON810 x NK603 (YIELDGARD Plus with RR), MON863 x NK603 (YIELDGARD RW + RR), MON87403, MON87411, MON87419, MON87427 (ROUNDUP READY Maize), MON87427 x 59122, MON87427 x MON88017, MON87427 x MON88017 x 59122, MON87427 x MON89034, MON87427 x MON89034 x 59122, MON87427 x MON89034 x MIR162 x MON87411, MON87427 x MON89034 x MON88017, MON87427 x MON89034 x MON88017 x 59122, MON87427 x MON89034 x NK603, MON87427 x MON89034 x TC1507, MON87427 x MON89034 x TC1507 x 59122, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON87411 x 59122, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON87411 x 59122 x DAS40278, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON88017 , MON87427 x MON89Ø34 x MIR162 x NK603, MON87427 x MON89Ø34 x TC15Ø7 x MON88Ø17 x 59122, MON87427 x TC1507, MON87427 x TC1507 x 59122, MON87427 x TC1507 x MON88017, MON87427 x TC1507 x MON88017 x 59122, MON87460 (GENUITY DROUGHTGARD), MON87460 x MON88017, MON87460 x MON89034 x MON88017, MON87460 x MON89034 x NK603, MON87460 x NK603, MON88017, MON88017 x DAS40278, MON89034, MON89034 x 59122, MON89034 x 59122 x DAS40278, MON89034 x 59122 x MON88017, MON89034 x 59122 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x DAS40278, MON89034 x MON87460, MON89034 x MON88017 (GENUITY VT Triple Pro), MON89034 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x NK603 (GENUITY VT Double Pro), MON89034 x NK603 x DAS40278, MON89034 x TC1507, MON89034 x TC1507 x 59122, MON89034 x TC1507 x 59122 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x MON88017, MON89034 x TC1507 x MON88017 x 59122 (GENUITY SMARTSTAX), MON89034 x TC1507 x MON88017 x 59122 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x NK603 (POWER CORE), MON89034 x TC1507 x NK603 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x NK603 x MIR162, MON89034 x TC1507 x NK603 x MIR162 x DAS40278,

MON89Ø34 x GA21, MS3 (INVIGOR Maize), MS6 (INVIGOR Maize), MZHG0JG, MZIR098, NK603 (ROUNDUP READY 2 Maize), NK603 x MON810 x 4114 x MIR604, NK603 x MON810 (YIELDGARD CB + RR), NK603 x T25 (ROUNDUP READY LIBERTY LINK Maize), T14 (LIBERTY LINK Maize), T25 (LIBERTY LINK Maize), T25 x MON810 (LIBERTY LINK YIELDGARD Maize), TC1507 (HERCULEX I, HERCULEX CB), TC1507 × 59122 × MON810 × MIR604 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT XTREME), TC1507 × MON810 × MIR604 × NK603, TC1507 x 5307, TC1507 x 5307 x GA21, TC1507 x 59122 (HERCULEX XTRA), TC1507 x 59122 x DAS40278, TC1507 x 59122 x MON810, TC1507 x 59122 x MON810 x MIR604, TC1507 x 59122 x MON810 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT XTRA), TC1507 x 59122 x MON88017, TC1507 x 59122 x MON88017 x DAS40278, TC1507 x 59122 x NK603 (HERCULEX XTRA RR), TC1507 x 59122 x NK603 x MIR604, TC1507 x DAS40278, TC1507 x GA21, TC1507 x MIR162 x NK603, TC1507 x MIR604 x NK603 (OPTIMUM TRISECT), TC1507 x MON810, TC1507 x MON810 x MIR162, TC1507 x MON810 x MIR162 x NK603, TC1507 x MON810 x MIR604, TC1507 x MON810 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT), TC1507 x MON810 x NK603 x MIR604, TC1507 x MON88017, TC1507 x MON88017 x DAS40278, TC1507 x NK603 (HERCULEX I RR), TC1507 x NK603 x DAS40278, TC6275, e VCO-01981-5. Plantas geneticamente modificadas adicionais

[00416] Os métodos e as bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas geneticamente modificadas ou parte das mesmas.

[00417] Além disso, os métodos e as bactérias descritos nesse documento são adequados para qualquer um dos seguintes eventos de plantas geneticamente modificadas que foram aprovados em um país ou mais países. Tabela 14 - Características do arroz, que podem ser combinadas com micróbios da revelação Arroz Oryza sativa Evento Companhia Descrição CL121, CL141, CFX51 BASF Inc. Tolerância ao herbicida imidazolinona, imazethapyr, induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) usando metanossulfonato de etila (EMS).

IMINTA-1, IMINTA-4 BASF Inc. Tolerância a herbicidas imidazolinonas induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) usando azida de sódio.

LLRICE06, LLRICE62 Aventis CropScience Arroz tolerante a herbicida amônio glufosinato produzido pela inserção de um gene codificador de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria de solo Streptomyces hygroscopicus).

LLRICE601 Bayer CropScience (Aventis Arroz tolerante a herbicida CropScience(AgrEvo)) amônio glufosinato produzido pela inserção de um gene codificador de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria do solo Streptomyces hygroscopicus).

PWC16 BASF Inc. Tolerância ao herbicida imidazolinona, imazethapyr, induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) usando metanossulfonato de etila (EMS).

Tabela 15 - Característica de alfafa, que podem ser combinados com micróbios da revelação Alfalfa Medicago sativa Evento Companhia Descrição J101, J163 Monsanto Company e Forage Alfafa tolerante a herbicida Genetics International glifosato (luzerna) produzida pela inserção de um gene que codifica a enzima 5-enolipiruvilshiquimato- 3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens.

Tabela 16 - Características do trigo, que podem ser combinadas com os micróbios da revelação Trigo Triticum aestivum Evento Companhia Descrição AP205CL BASF Inc. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

AP602CL BASF Inc. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

BW255-2, BW238-3 BASF Inc. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

BW7 BASF Inc. Tolerância a herbicidas imidazolinonas induzida por mutagênese química do gene da acetohidroxiácido sintase (AHAS) usando azida sódica.

MON71800 Monsanto Company Variedade de trigo tolerante ao glifosato produzida pela inserção de um gene que codifica a 5- enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) da bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens, cepa CP4.

SWP965001 Cyanamid Crop Seleção para uma versão Protection mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

Teal 11A BASF Inc. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

Tabela 17 - Características do girassol, que podem ser combinadas com micróbios da revelação Girassol Helianthus annuus Evento Companhia Descrição X81359 BASF Inc. Tolerância a herbicidas imidazolinonas por seleção de um mutante de ocorrência natural.

Tabela 18 - Características da Soja, que podem ser combinadas com os micróbios da revelação Soja Glycine max L.

Evento Companhia Descrição A2704-12, A2704-21, Bayer CropScience Soja tolerante a herbicida A5547-35 (Aventis CropScience amônio glufosinato produzida (AgrEvo)) pela inserção de um gene codificador de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria de solo Streptomyces viridochromogenes.

A5547-127 Bayer CropScience Soja tolerante a herbicida (Aventis CropScience amônio glufosinato produzida (AgrEvo)) pela inserção de um gene codificador de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria de solo Streptomyces viridochromogenes.

BPS-CV127-9 BASF Inc. O gene csr1-2 introduzido de Arabidopsis thaliana codifica uma proteína aceto- hidroxiácido sintase que confere tolerância a herbicidas de imidazolinona devido a uma mutação pontual que resulta em uma única substituição de aminoácido em que o resíduo serina na posição 653 é substituído por asparagina (S653N).

DP-305423 Pioneer Hi-Bred Soja com alto teor de ácido International Inc. oleico produzida pela inserção de cópias adicionais de uma porção do gene que codifica a dessaturase ômega 6, gm-fad2- 1, resultando no silenciamento do gene da dessaturase ômega- 6 endógeno (FAD2-1).

DP356043 Pioneer Hi-Bred Evento da soja com dois genes International Inc. de tolerância a herbicidas: glifosato N-acetitransferase, que desintoxica o glifosato, e um gene da acetolactato sintase (ALS) modificado, que é tolerante aos herbicidas inibidores de ALS.

G94-1, G94-19, G168 DuPont Canada Soja com alto teor de ácido Agricultural Products oleico produzida pela inserção de uma segunda cópia do gene que codifica a dessaturase de ácido graxo (Gm Fad2-1) da soja, que resultou no “silenciamento” do gene hospedeiro endógeno.

GTS 40-3-2 Monsanto Company Variedade de soja tolerante ao glifosato produzida pela inserção de um gene modificado que codifica a 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) da bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens.

GU262 Bayer CropScience Feijão de soja tolerante a (Aventis herbicida amônio glufosinato CropScience(AgrEvo)) produzida pela inserção de um gene codificador de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria de solo Streptomyces viridochromogenes.

MON87701 Monsanto Company Resistência às pragas de lepidópteros da soja, incluindo a lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis) e o mariposa-da-soja (Pseudoplusia includens).

MON87701 x MON89788 Monsanto Company Tolerância a herbicida de glifosato por meio da expressão do gene que codifica EPSPS de A. tumefaciens cepa CP4 e resistência a pragas de Lepidópteros de soja, incluindo lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis) e mariposa-da-soja (Pseudoplusia includens) por meio da expressão do gene que codifica Cry1Ac de B. thuringiensis.

MON89788 Monsanto Company Soja tolerante ao glifosato produzida pela inserção de uma 5-enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) modificada que codifica o gene aroA (epsps) de Agrobacterium tumefaciens CP4.

OT96-15 Agricultura e Soja com baixo teor de ácido Agroalimentação Canadá linolênico produzida por meio de cruzamentos tradicionais para incorporar a nova característica de um mutante do gene fan1 de ocorrência natural que foi selecionado para baixo teor de ácido linolênico.

W62, W98 Bayer CropScience Feijão de soja tolerante a (Aventis herbicida amônio glufosinato CropScience(AgrEvo)) produzida pela inserção de um gene codificador de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria de solo Streptomyces hygroscopicus.

Tabela 19 - Características do milho, que podem ser combinadas com os micróbios da revelação Milho Zea mays L.

Evento Companhia Descrição 176 Syngenta Seeds, Inc. Milho resistente a insetos produzido pela inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. A modificação genética oferece resistência ao ataque da broca europeia do milho (BCE).

3751 IR Pioneer Hi-Bred Seleção de variantes 676, 678, 680 International Inc. somaclonais por cultura de Pioneer Hi-Bred embriões em meio contendo International Inc. imidazolinona. Milho macho estéril e tolerante a herbicida amônio glufosinato, produzido pela inserção de genes que codificam DNA adenina metilase e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Escherichia coli e Streptomyces viridochromogenes, respectivamente.

B16 (DLL25) Dekalb Genetics Milho tolerante a herbicida Corporation amônio glufosinato produzido pela inserção do gene que codifica a fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

BT11 (X4334CBR, Syngenta Seeds, Inc. Milho resistente a insetos e X4734CBR) tolerante a herbicidas produzido pela inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

BT11 x GA21 Syngenta Seeds, Inc. Milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYN-BTO11-1) e GA21 (identificador único OECD: MON-OOO21-9).

BT11 x MIR162 x Syngenta Seeds, Inc. Resistência a pragas de MIR604 x GA21 coleópteros, particularmente pragas da lagarta da raiz do milho (Diabrotica spp.) e várias pragas lepidópteras do milho, incluindo a broca do milho europeia (ECB, Ostrinia nubilalis), lagarta do cartucho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta do cartucho (FAW, Spodoptera frugiperda) e lagarta rosca (BCW, Agrotis ipsilon); tolerância a herbicidas contendo glifosato e amônio glufosinato.

BT11 x MIR162 Syngenta Seeds, Inc.

Milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYN-BTO11-1) e MIR162 (identificador único OECD: SYN-1R162-4). A resistência à broca europeia do milho e a tolerância ao herbicida amônio glufosinato (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene Cry1Ab do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

A resistência a outras pragas de lepidópteros, incluindo H. zea, S. frugiperda, A. ipsilon e S. albicosta, é derivada de MIR162, que contém o gene vip3Aa de Bacillus thuringiensis cepa AB88.

BT11 x MIR162 x Syngenta Seeds, Inc. Proteína delta-endotoxina MIR604 Cry1Ab de Bacillus thuringiensis e o material genético necessário para sua produção (via elementos do vetor pZO1502) no milho Evento Bt11 (Identificador Único OECD: SYNBTO11-1) x proteína inseticida de Bacillus thuringiensis Vip3Aa20 e o material genético necessário para sua produção (via elementos do vetor pNOV1300) no milho Evento MIR162 (Identificador Único OECD: SYN-IR162-4) x proteína Cry3A modificada e o material genético necessário para sua produção (via elementos do vetor pZM26) no milho Evento MIR604 (Identificador Único OECD: SYN -1R604-5).

CBH-351 Aventis CropScience Milho resistente a insetos e tolerante a herbicida amônio glufosinato desenvolvido pela inserção de genes que codificam a proteína Cry9C de Bacillus thuringiensis subsp tolworthi e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

DAS-06275-8 DOW AgroSciences LLC Variedade de milho resistente a insetos lepidópteros e tolerante a herbicida amônio glufosinato produzida pela inserção do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var aizawai e da fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

BT11 x MIR604 Syngenta Seeds, Inc.

Milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYN-BTO11-1) e MIR604 (identificador único OECD: SYN-1R6O5-5). A resistência à broca europeia do milho e a tolerância ao herbicida amônio glufosinato (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene Cry1Ab do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

A resistência a lagarta rosca do milho é derivada de MIR604, que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis.

BT11 x MIR604 x GA21 Syngenta Seeds, Inc. Milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYN-BTO11-1), MIR604 (identificador único OECD: SYN-1R6O5-5) e GA21 (identificador único OECD: MON-OOO21-9). A resistência à broca europeia do milho e a tolerância ao herbicida amônio glufosinato (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene Cry1Ab do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes. A resistência a lagarta da raiz do milho é derivada de MIR604, que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis. A tolerância ao herbicida glifosato é derivada de GA21, que contém um gene EPSPS modificado do milho.

DAS-59122-7 DOW AgroSciences LLC Milho resistente à lagarta da and Pioneer Hi-Bred raiz do milho produzido pela International Inc. inserção dos genes Cry34Ab1 e Cry35Ab1 da cepa PS149B1 de Bacillus thuringiensis. O gene que codifica PAT de Streptomyces viridochromogenes foi introduzido como um marcador selecionável.

DAS-59122-7 x TC1507 DOW AgroSciences LLC Milho transformado resistente x NK603 and Pioneer Hi-Bred a insetos e tolerante a International Inc. herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais DAS-59122- 7 (identificador único OECD: DAS-59122-7) e TC1507 (identificador único OECD: DAS-01507-1) com NK603 (identificador único OECD: MON-00603-6). A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de DAS-59122-7, que contém os genes Cry34Abl e Cry35Abl da cepa P5149B1 de Bacillus thuringiensis. A resistência a lepidópteros e e a tolerância dos ao herbicida amônio glufosinato são derivadas de TC1507. A tolerância ao herbicida glifosato é derivada de NK603.

DBT418 Dekalb Genetics Milho resistente a insetos e Corporation tolerante a herbicida amônio glufosinato desenvolvido pela inserção de genes que codificam a proteína Cry1AC de Bacillus thuringiensis subsp kurstaki e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

MIR604 x GA21 Syngenta Seeds, Inc. Milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais MIR604 (identificador único da OCDE: SYN-1R605-5) e GA21 (identificador único da OCDE: MON-00021-9). A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de MIR604, que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis. A tolerância a herbicida glifosato é derivada de GA21.

MON80100 Monsanto Company Milho resistente a insetos produzido pela inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. A modificação genética oferece resistência ao ataque da broca europeia do milho (BCE).

MON802 Monsanto Company Milho resistente a insetos e tolerante a herbicida glifosato produzido pela inserção dos genes que codificam a proteína Cry1Ab de Bacillus thuringiensis e a 5- enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de A. tumefaciens cepa CP4.

MON809 Pioneer Hi-Bred Resistência à broca europeia International Inc. do milho (Ostrinia nubilalis) pela introdução de um gene Cry1Ab sintético. Resistência ao glifosato por meio da introdução da versão bacteriana de uma enzima de planta, 5-enolpirinivil shiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS).

MON810 Monsanto Company Milho resistente a insetos produzido pela inserção de uma forma truncada do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1. A modificação genética oferece resistência ao ataque da broca europeia do milho (BCE).

MON810 x LY038 Monsanto Company Milho transformado resistente a insetos e com maior conteúdo de lisina derivado de cruzamentos convencionais das linhagens parentais MON810 (identificador OECD: MON- OO81O-6) e LY038 (identificador OECD: REN- OOO38-3).

MON810 x MON88017 Monsanto Company Milho transformado resistente a insetos e tolerante ao glifosato derivado de cruzamentos convencionais das linhagens parentais MON810 (identificador OECD: MON- OO81O-6) e MON88017 (identificador OECD: MON- 88017-3). A resistência à broca do milho europeia (ECB) é derivada de uma forma truncada do gene Cry1Ab do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 presente no MON810. A resistência a lagarta da raiz do milho é derivada do gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis da subespécie kumamotoensis da cepa EG4691 presente em MON88017. A tolerância ao glifosato é derivada de um gene que codifica a 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens de cepa CP4 presente em MON88017.

MON832 Monsanto Company Introdução, por bombardeio de partículas, de glifosato oxidase (GOX) e uma 5- enolpiruvil chiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica do shiquimato para a produção de aminoácidos aromáticos.

MON863 Monsanto Company Milho resistente à lagarta da raiz do milho produzido pela inserção do gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis.

MON863 x MON810 Monsanto Company Híbrido de milho resistente a insetos transformados derivado de cruzamentos convencionais das linhagens parentais MON863 (identificador OECD: MON- 00863-5) e MON810 (identificador OECD: MON- 00810-6) MON863 x MON810 x Monsanto Company Híbrido de milho transformado Monsanto NK603 resistente a insetos e tolerante a herbicida derivado de cruzamento convencional do híbrido transformado MON- 00863-5 x MON-00810-6 e NK603 (identificador OECD: MON- 00603-6).

MON863 x NK603 Monsanto Company Híbrido de milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicida derivado do cruzamento convencional das linhagens parentais MON863 (identificador OECD: MON- OO863-5) e NK603 (identificador OECD: MON- OO6O3-6).

MON87460 Monsanto Company O MON 87460 foi desenvolvido para fornecer perda de rendimento reduzida sob condições de limitação de água em comparação com o milho convencional. A eficácia no MON 87460 é derivada da expressão da proteína B de choque frio de Bacillus subtilis inserida (CspB).

MON88017 Monsanto Company Milho resistente à lagarta da raiz do milho produzido pela inserção do gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis da subespécie kumamotoensis da cepa EG4691. Tolerância ao glifosato derivada da inserção de um gene que codifica 5- enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens de cepa CP4.

MON89034 Monsanto Company Evento de milho que expressa duas proteínas inseticidas diferentes de Bacillus thuringiensis, proporcionando resistência a várias pragas de lepidópteros.

MON89034 x MON88017 Monsanto Company Milho transformado resistente a insetos e tolerante a glifosato derivado de cruzamentos convencionais das linhagens parentais MON89034 (identificador OECD: MON- 89O34-3) e MON88017 (identificador OECD: MON- 88O17-3). A resistência a insetos lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes em MON89043. A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de um único gene Cry e a tolerância ao glifosato é derivada do gene que codifica 5- enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens presente em MON88017.

MON89034 x NK603 Monsanto Company Milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicida produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais MON89034 (identificador OECD: MON- 89034-3) com NK603 (identificador único OECD: MON-00603-6). A resistência a insetos lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes em MON89043. A tolerância ao herbicida glifosato é derivada do NK603.

NK603 x MON810 Monsanto Company Híbrido de milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicida derivado do cruzamento convencional das linhagens parentais NK603 (identificador OECD: MON- 00603-6) e MON810 (identificador OECD: MON- 00810-6).

MON89034 x TC1507 x Monsanto Company and Milho transformado resistente MON88017 x DAS- Mycogen Seeds c/o Dow a insetos e tolerante a 59122-7 AgroSciences LLC herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais: MON89034, TC1507, MON88017 e DAS-59 122. Resistência a pragas de insetos acima e abaixo do solo e tolerância a herbicidas contendo glifosato e amônio glufosinato.

M53 Bayer CropScience Esterilidade masculina causada (Aventis pela expressão do gene da CropScience(AgrEvo )) ribonuclease barnase de Bacillus amyloliquefaciens; a resistência a PPT foi via PPT- acetiltransferase (PAT).

M56 Bayer CropScience Esterilidade masculina causada (Aventis pela expressão do gene da CropScience(AgrEvo ) ribonuclease barnase de Bacillus amyloliquefaciens; a resistência ao PPT foi via PPT-acetiltransferase (PAT).

NK603 Monsanto Company Introdução, por bombardeio de transformado partículas, de uma 5- enolpiruvil shiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica do shiquimato para a produção de aminoácidos aromáticos.

NK603 x T25 Monsanto Company Híbrido de milho tolerante a herbicida amônio glufosinato transformado e glifosato derivado de cruzamento convencional das linhagens parentais NK603 (identificador OECD: MON-00603-6) e T25 (identificador OECD: ACS- ZM003-2).

T25 x MON810 Bayer CropScience Híbrido de milho transformado (Aventis resistente a insetos e CropScience(AgrEvo)) tolerante a herbicida derivado de cruzamentos convencionais das linhagens parentais T25 (identificador OECD: ACS- ZMOO3-2) e MON810 (identificador OECD: MON- OO81O-6).

TC1507 Mycogen (c/o Dow Milho resistente a insetos e AgroSciences); Pioneer tolerante a herbicida amônio (c/o DuPont) glufosinato, produzido pela inserção do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var. aizawai e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.

TC1507 x NK603 DOW AgroSciences LLC Híbrido de milho transformado resistente a insetos e tolerante a herbicida derivado de cruzamentos convencionais das linhagens parentais 1507 (identificador OECD: DAS- O15O7-1) e NK603 (identificador OECD: MON- OO6O3-6).

TC1507 x DAS-59122-7 DOW AgroSciences LLC e Milho transformado resistente Pioneer Hi-Bred a insetos e tolerante a International Inc. herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais TC1507 (identificador único da OCDE: DAS-O15O7-1) com DAS-59122-7 (identificador exclusivo da OCDE: DAS-59122-7). A resistência a insetos lepidópteros é derivada de TC1507 devido à presença do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var. aizawai. A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de DAS- 59122-7 que contém os genes Cry34Ab1 e Cry35Ab1 de Bacillus thuringiensis de cepa P5149B1. A tolerância ao herbicida amônio glufosinato é derivada de TC1507 do gene que codifica fosfinotricina N- acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.

Evento Companhia Descrição Família Híbrida P0157 Dupont Pioneer P0157 P0157AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0157 P0157AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0157 P0157R Dupont Pioneer RR2 P0157 P0339AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0339 P0339AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0339 P0306AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0306 P0589 Dupont Pioneer P0589

P0589AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0589

P0589AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0589

P0589R Dupont Pioneer RR2 P0589

P0574 Dupont Pioneer P0574

P0574AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0574

P0574AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0574

P0533EXR Dupont Pioneer HXX LL RR2 P0533

P0506AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0566

P0760AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0760

P0707AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0707

P0707AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0707

P0825AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0825

P0825AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0825

P0969AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0969

P0969AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0969

P0937AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0937

P0919AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0919

P0905EXR Dupont Pioneer HXX LL RR2 P0905

P1197 Dupont Pioneer P1197

P1197AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1197

P1197AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1197

P1197R Dupont Pioneer RR2 P1197

P1151 Dupont Pioneer P1151

P1151AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1151

P1151R Dupont Pioneer RR2 P1151

P1138AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1138 P1366AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1366 P1366AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1366 P1365AMX Dupont Pioneer AMX LL RR2 P1365 P1353AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1353 P1345 Dupont Pioneer P1345 P1311AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1311 P1498EHR Dupont Pioneer HX1 LL RR2 P1498 P1498R Dupont Pioneer RR2 P1498 P1443AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1443 P1555CHR Dupont Pioneer RW HX1 LL RR2 P1555 P1751AMT Dupont Pioneer AMT LL RR2 P1751 P2089AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P2089 QROME Dupont Pioneer Q LL RR2

[00418] A seguir estão as definições para a abreviatura que ocorre na Tabela 19. AM - Sistema de proteção contra insetos ACREMAX OPTIMUM com YGCB, HX1, LL, RR2. AMT - Sistema de proteção contra insetos OPTIMUM ACREMAX TRISECT com RW, YGCB, HX1, LL, RR2. AMXT - (OPTIMUM ACREMAX XTreme). HXX - HERCULEX XTRA contém os genes Herculex I e Herculex RW. HX1 - Contém o gene de proteção contra insetos HERCULEX I que fornece proteção contra a broca do milho europeia, broca do milho do sudoeste, lagarta rosca, lagarta do cartucho, lagarta do feijão ocidental, lagarta-elasmo, broca do colmo do milho do sul e broca da cana-de-açúcar; e suprime a minhoca da espiga do milho. LL - Contém o gene LIBERTYLINK para resistência ao herbicida LIBERTY. RR2 - Contém a característica do Milho 2 ROUNDUP READY que fornece segurança ao cultivo para aplicações por cima de herbicidas de glifosato rotulados quando aplicados de acordo com as instruções do rótulo. YGCB - contém o gene da broca do milho YIELDGARD oferece um alto nível de resistência à broca do milho europeia, broca do milho do sudoeste e broca do colmo do milho do sul; resistência moderada à lagarta da espiga do milho e à broca do colmo comum; e resistência acima da média à lagarta do cartucho. RW - contém a característica de resistência à lagarta da raiz AGRISURE. Q - fornece proteção ou supressão contra broca do milho europeia suscetível, broca do milho do sudoeste, lagarta rosca, lagarta do cartucho, lagarta-elasmo, broca do colmo do milho do sul, broca do colmo, broca da cana-de-açúcar e lagarta da orelha do milho; e também fornece proteção contra lesões larvais causadas por lagarta de milho do oeste, lagarta de milho do norte e lagarta de milho mexicano; contém (1) genes de proteção contra insetos HERCULEX XTRA que produzem as proteínas Cry1F e Cry34ab1 e Cry35ab1, (2) a característica AGRISURE RW que inclui um gene que produz a proteína mCry3A e (3) o gene da broca do milho YIELDGARD que produz a proteína Cry1Ab. Concentrações e Taxas de Aplicação de Composições Agrícolas

[00419] Como mencionado acima, as composições agrícolas da presente revelação, que compreendem um micróbio ensinado, podem ser aplicadas a plantas de uma infinidade de maneiras. Em dois aspectos particulares, a revelação contempla um tratamento em sulco ou um tratamento de sementes.

[00420] Para modalidades de tratamento de sementes, os micróbios da revelação podem estar presentes na semente em uma variedade de concentrações. Por exemplo, os micróbios podem ser encontrados em um tratamento de sementes a uma concentração de ufc, por semente de: 1 × 101, 1 × 102, 1 × 103, 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010 ou mais. Em aspectos particulares, as composições de tratamento de sementes compreendem cerca de 1 × 104 a cerca de 1 × 108 ufc por semente. Em outros aspectos particulares, as composições de tratamento de sementes compreendem cerca de 1 × 105 a cerca de 1 × 107 ufc por semente. Em outros aspectos, as composições de tratamento de sementes compreendem cerca de 1 × 106 ufc por semente.

[00421] Nos Estados Unidos, cerca de 10% da área plantada com milho é plantada em uma densidade de sementes acima de cerca de 36.000 sementes por acre; 1/3 da área plantada com milho é plantada com uma densidade de sementes entre cerca de 33.000 a 36.000 sementes por acre; 1/3 da área plantada com milho é plantada em uma densidade de sementes entre cerca de 30.000 a 33.000 sementes por acre, e o restante da área é variável. Ver “Corn Seeding Rate Considerations”, escrito por Steve Butzen, disponível em: www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/library/corn-seeding- rate-considerations/.

[00422] A Tabela 20 abaixo utiliza várias concentrações de ufc por semente em uma modalidade de tratamento de sementes contemplada (fileiras) e várias densidades de plantio de área de sementes (1ª coluna: 15K-41K) para calcular a quantidade total de ufc por acre, que seria utilizada em vários cenários agrícolas (isto é, concentração de tratamento de sementes por semente × densidade de sementes plantadas por acre). Assim, se alguém fosse utilizar um tratamento de sementes com 1 × 106 ufc por semente e plantar

30.000 sementes por acre, o conteúdo total de ufc por acre seria 3 × 1010 (ou seja, 30K * 1 × 106). Tabela 20: Cálculo de UFC total por acre para modalidades de tratamento de sementes Popula- ção de milho (ou 1,00 E+02 1,00 E+03 1,00 E+04 1,00 E+05 1,00 E+06 1,00 E+07 1,00 E+08 1,00 E+09 seja, semen- tes por acre)

15.000 1,50E+06 1,50E+07 1,50E+08 1,50E+09 1,50E+10 1,50E+11 1,50E+12 1,50E+13

16.000 1,60E+06 1,60E+07 1,60E+08 1,60E+09 1,60E+10 1,60E+11 1,60E+12 1,60E+13

17.000 1,70E+06 1,70E+07 1,70E+08 1,70E+09 1,70E+10 1,70E+11 1,70E+12 1,70E+13

18.000 1,80E+06 1,80E+07 1,80E+08 1,80E+09 1,80E+10 1,80E+11 1,80E+12 1,80E+13

19.000 1,90E+06 1,90E+07 1,90E+08 1,90E+09 1,90E+10 1,90E+11 1,90E+12 1,90E+13

20.000 2,00E+06 2,00E+07 2,00E+08 2,00E+09 2,00E+10 2,00E+11 2,00E+12 2,00E+13

21.000 2,10E+06 2,10E+07 2,10E+08 2,10E+09 2,10E+10 2,10E+11 2,10E+12 2,10E+13

22.000 2,20E+06 2,20E+07 2,20E+08 2,20E+09 2,20E+10 2,20E+11 2,20E+12 2,20E+13

23.000 2,30E+06 2,30E+07 2,30E+08 2,30E+09 2,30E+10 2,30E+11 2,30E+12 2,30E+13

24.000 2,40E+06 2,40E+07 2,40E+08 2,40E+09 2,40E+10 2,40E+11 2,40E+12 2,40E+13

25.000 2,50E+06 2,50E+07 2,50E+08 2,50E+09 2,50E+10 2,50E+11 2,50E+12 2,50E+13

26.000 2,60E+06 2,60E+07 2,60E+08 2,60E+09 2,60E+10 2,60E+11 2,60E+12 2,60E+13

27.000 2,70E+06 2,70E+07 2,70E+08 2,70E+09 2,70E+10 2,70E+11 2,70E+12 2,70E+13

28.000 2,80E+06 2,80E+07 2,80E+08 2,80E+09 2,80E+10 2,80E+11 2,80E+12 2,80E+13

29.000 2,90E+06 2,90E+07 2,90E+08 2,90E+09 2,90E+10 2,90E+11 2,90E+12 2,90E+13

30.000 3,00E+06 3,00E+07 3,00E+08 3,00E+09 3,00E+10 3,00E+11 3,00E+12 3,00E+13

31.000 3,10E+06 3,10E+07 3,10E+08 3,10E+09 3,10E+10 3,10E+11 3,10E+12 3,10E+13

32.000 3,20E+06 3,20E+07 3,20E+08 3,20E+09 3,20E+10 3,20E+11 3,20E+12 3,20E+13

33.000 3,30E+06 3,30E+07 3,30E+08 3,30E+09 3,30E+10 3,30E+11 3,30E+12 3,30E+13

34.000 3,40E+06 3,40E+07 3,40E+08 3,40E+09 3,40E+10 3,40E+11 3,40E+12 3,40E+13

35.000 3,50E+06 3,50E+07 3,50E+08 3,50E+09 3,50E+10 3,50E+11 3,50E+12 3,50E+13

36.000 3,60E+06 3,60E+07 3,60E+08 3,60E+09 3,60E+10 3,60E+11 3,60E+12 3,60E+13

37.000 3,70E+06 3,70E+07 3,70E+08 3,70E+09 3,70E+10 3,70E+11 3,70E+12 3,70E+13

38.000 3,80E+06 3,80E+07 3,80E+08 3,80E+09 3,80E+10 3,80E+11 3,80E+12 3,80E+13

39.000 3,90E+06 3,90E+07 3,90E+08 3,90E+09 3,90E+10 3,90E+11 3,90E+12 3,90E+13

40.000 4,00E+06 4,00E+07 4,00E+08 4,00E+09 4,00E+10 4,00E+11 4,00E+12 4,00E+13

41.000 4,10E+06 4,10E+07 4,10E+08 4,10E+09 4,10E+10 4,10E+11 4,10E+12 4,10E+13

[00423] Para modalidades em sulco, os micróbios da revelação podem ser aplicados a uma concentração de ufc por acre de: 1 × 106, 3,20 × 1010, 1,60 × 1011, 3,20 × 1011, 8,0 × 1011, 1,6 × 1012, 3,20 × 1012 ou maior. Portanto, em aspectos,

as composições líquidas no sulco podem ser aplicadas a uma concentração de entre cerca de 1 × 106 a cerca de 3 × 1012 ufc por acre.

[00424] Em alguns aspectos, as composições em sulco estão contidas em uma formulação líquida. Nas modalidades de líquido no sulco, os micróbios podem estar presentes em uma concentração de ufc por mililitro de: 1 × 101, 1 × 102, 1 × 103, 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010, 1 × 1011, 1 × 1012, 1 × 1013 ou mais. Em certos aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concentração de cerca de 1 × 106 a cerca de 1 × 1011 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concentração de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1010 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concentração de cerca de 1 × 108 a cerca de 1 × 109 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concentração de até cerca de 1 × 1013 ufc por mililitro. Perfilação transcriptômica de micróbios candidatos

[00425] O trabalho anterior dos inventores envolveu o perfil transcriptômico da cepa CI010 para identificar promotores que são ativos na presença de nitrogênio ambiental. A cepa CI010 foi cultivada em um meio definido, livre de nitrogênio, suplementado com glutamina 10 mM. O RNA total foi extraído desses cultivos (kit QIAGEN RNeasy) e submetido ao sequenciamento de RNAseq via Illumina HiSeq (SeqMatic, Fremont CA). As leituras de sequenciamento foram mapeadas para os dados do genoma CI010 usando Geneious, e genes altamente expressados sob controle de promotores transcricionais proximais foram identificados.

[00426] As tabelas 21-23 listam genes e seu nível de expressão relativa conforme medido por meio do sequenciamento RNASeq do RNA total. As sequências dos promotores proximais foram registradas para uso na mutagênese de vias nif, vias relacionadas à utilização de nitrogênio ou outros genes com um nível de expressão desejado. Tabela 21 Nome Mínimo Máximo comprimento Direção CDS de mureína lipoproteína 2.929.898 2.930.134 237 direta CDS de proteína de membrana 5.217.517 5.217.843 327 direta CDS de proteína de ligação de zinco/cádmio 3.479.979 3.480.626 648 direta CDS de proteína carreadora de acila 4.563.344 4.563.580 237 reversa CDS de ompX 4.251.002 4.251.514 513 direta CDS de proteína de ligação a DNA HU-beta 375.156 375.428 273 direta CDS de sspA 629.998 630.636 639 reversa CDS de tatE 3.199.435 3.199.638 204 reversa CDS de repressor de LexA 1.850.457 1.851.065 609 direta CDS de hisS <3999979 4.001.223 >1245 direta Tabela 22 RNASeq_ RNASeq_WT RNASeq_WT RNASeq_ nifL - - - Confiança Razão de nifL - Contagem Contagem Contagem Absoluta de Expressão Contagem de de de de Expressão Diferen- leitura transcriç leitura transcri- Nome Diferencial cial bruta ão bruta bruta ção bruta CDS de mureína 1000 -1,8 12950,5 10078,9 5151,5 4106,8 lipoproteína CDS de proteína de 1000 -1,3 9522,5 5371,3 5400 3120 membrana

RNASeq_ RNASeq_WT RNASeq_WT RNASeq_ nifL - - - Confiança Razão de nifL - Contagem Contagem Contagem Absoluta de Expressão Contagem de de de de Expressão Diferen- leitura transcriç leitura transcri- Nome Diferencial cial bruta ão bruta bruta ção bruta CDS de proteína de 3,3 1,1 6461 1839,1 5318 1550,6 ligação de zinco/cádmio CDS de proteína 25,6 1,6 1230,5 957,6 1473,5 1174,7 carreadora de acila CDS de ompX 1,7 1,1 2042 734,2 1687,5 621,5 beta CDS de proteína de 6,9 -1,3 1305 881,7 725 501,8 ligação de

DNA HU CDS de sspA 0,2 1 654 188,8 504,5 149,2 CDS de tatE 1,4 1,3 131 118,4 125 115,8 CDS de repressor de 0,1 -1,1 248 75,1 164 50,9 LexA CDS de hisS 0 -1,1 467 69,2 325 49,3 Tabela 23 Prm (Na direção Sequência Sequência Nome direta, região Expressada Vizinha -250 a +10) SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDS de mureína lipoproteína SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 23 CDS de proteína de membrana SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 24 CDS de proteína de ligação SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 25 de zinco/cádmio CDS de proteína carreadora SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 26 de acila CDS de ompX SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 27 CDS de proteína de ligação SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 28 de DNA HU beta CDS de sspA SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 29 CDS de tatE SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 30

Prm (Na direção Sequência Sequência

Nome direta, região Expressada Vizinha -250 a +10) SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

CDS de repressor de LexA SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 31

CDS de hisS SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 32

Tabela 24 - Tabela de cepas Descrição do DNA Mutação Mutação do Nome Linhagem Genótipo mutagênico do gene 1 gene 2 Cepa isolada do gênero CI006 Nenhuma WT Enterobacter (agora Kosakonia) Cepa isolada do CI008 gênero Nenhuma WT Burkholderia Cepa isolada do CI010 Nenhuma WT gênero Klebsiella Cepa isolada do CI019 Nenhuma WT gênero Rahnella Cepa isolada do CI028 gênero Nenhuma WT Enterobacter Cepa isolada do CI050 Nenhuma WT gênero Klebsiella Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM002 Mutante de CI050 ΔnifL::KanR codifica o gene NO: 33 aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à espectinomicina (SpecR) SEQ ID CM011 Mutante de CI019 ΔnifL::SpecR que codifica o gene aadA NO: 34 da estreptomicina 3”-O- adenililtransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM013 Mutant of CI006 ΔnifL::KanR codifica o gene NO: 35 aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido. Ruptura do gene amtB com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM004 Mutante de CI010 ΔamtB::KanR codifica o gene A- NO: 36 fosfotransferase de aminoglicosídeo aph1 inserido. Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM005 Mutante de CI010 ΔnifL::KanR codifica o gene NO: 37 aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido. Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a SEQ ID CM015 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm5 montante do gene ompX NO: 38 inserido (Prm5). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante de um gene não SEQ ID CM021 Mutant of CI006 ΔnifL::Prm2 anotado e os primeiros NO: 39 73 pb desse gene inserido (Prm2). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a

SEQ ID CM023 Mutante de CI006 montante do gene acpP e ΔnifL::Prm4 NO: 40 o primeiro 121bp do gene acpP inserido (Prm4). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp e SEQ ID CM014 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm1 os primeiros 29 pb do NO: 41 gene lpp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lexA 3 SEQ ID CM016 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm9 e os primeiros 21 bp do NO: 42 gene lexA 3 inserido (Prm9).

Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene mntP 1 SEQ ID CM022 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm3 e os primeiros 53 bp do NO: 43 gene mntP 1 inserido (Prm3). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a SEQ ID CM024 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm7 montante do gene sspA NO: 44 inserido (Prm7). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene hisS e SEQ ID CM025 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm10 os primeiros 52 pb do NO: 45 gene hisS inserido (Prm10). Ruptura do gene glnB com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM006 Mutante de CI010 ΔglnB::KanR codifica o gene de NO: 46 aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM017 Mutante de CI028 ΔnifL::KanR codifica o gene NO: 47 aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à espectinomicina (SpecR) SEQ ID CM011 Mutante de CI019 ΔnifL::SpecR que codifica o gene aadA NO: 48 da estreptomicina 3”-O- adenililtransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM013 Mutante de CI006 ΔnifL::KanR codifica o gene NO: 49 aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM005 Mutante de CI010 ΔnifL::KanR codifica o gene NO: 50 aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido. Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp e SEQ ID CM014 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm1 os primeiros 29 pb do NO: 51 gene lpp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a SEQ ID CM015 Mutant of CI006 ΔnifL::Prm5 montante do gene ompX NO: 52 inserido (Prm5). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a

SEQ ID CM023 Mutante de CI006 montante do gene acpP e ΔnifL::Prm4 NO: 53 o primeiro 121bp do gene acpP inserido (Prm4). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) e eliminação do 1287bp após o códon de partida ΔnifL::Prm5 SEQ ID SEQ ID NO: CM029 Mutante de CI006 do gene glnE contendo o ΔglnE-AR_KO1 NO: 54 61 domínio de remoção de adenilil de glutamato- amônia-ligase adenililtransferase (ΔglnE-AR_KO1) Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp e SEQ ID CM014 Mutante de CI006 ΔnifL::Prm1 os primeiros 29 pb do NO: 55 gene lpp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à espectinomicina (SpecR) SEQ ID CM011 Mutante de CI019 ΔnifL::SpecR que codifica o gene aadA NO: 56 da estreptomicina 3”-O- adenililtransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à espectinomicina (SpecR) SEQ ID CM011 Mutantw de CI019 ΔnifL::SpecR que codifica o gene aadA NO: 57 da estreptomicina 3”-O- adenililtransferase inserido. Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à canamicina (KanR) que SEQ ID CM013 Mutante de CI006 ΔnifL::KanR codifica o gene aph1 de NO: 58 aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido. Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à espectinomicina (SpecR) SEQ ID CM011 Mutante de CI019 ΔnifL::SpecR que codifica o gene aadA NO: 59 da estreptomicina 3”-O- adenililtransferase inserido. Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à espectinomicina (SpecR) SEQ ID CM011 Mutante de CI019 ΔnifL::SpecR que codifica o gene aadA NO: 60 da estreptomicina 3”-O- adenililtransferase inserido.

EXEMPLOS

[00427] Os exemplos a seguir são dados com a finalidade de ilustrar várias modalidades da revelação e não se destinam a limitar a presente revelação de qualquer forma. Mudanças na mesma e outros usos que são abrangidos pelo espírito da revelação, como definido pelo escopo das reivindicações, serão reconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Exemplo 1: Remodelação Microbiana Guiada - Uma Plataforma para o Melhoramento Racional de Espécies Microbianas para Agricultura

[00428] Um exemplo de visão geral de uma modalidade da plataforma de Remodelação Microbiana Guiada (GMR) pode ser resumido no esquema da FIG. 1A.

[00429] A FIG. 1A ilustra que a composição do microbioma pode primeiro ser caracterizada e uma espécie de interesse é identificada (por exemplo, para encontrar um micróbio com as características de colonização apropriadas).

[00430] O metabolismo das espécies de interesse pode ser mapeado e vinculado à genética. Por exemplo, a via de fixação de nitrogênio do micróbio pode ser caracterizada. A via que está sendo caracterizada pode ser examinada sob uma variedade de condições ambientais. Por exemplo, a capacidade do micróbio de fixar nitrogênio atmosférico na presença de vários níveis de nitrogênio exógeno em seu ambiente pode ser examinada. O metabolismo do nitrogênio pode envolver a entrada de amônia (NH4+) da rizosfera no citosol da bactéria por meio do transportador AmtB. Amônia e L-glutamato (L-Glu) são catalisados pela glutamina sintetase e ATP em glutamina. A glutamina pode levar à formação de biomassa bacteriana e também pode inibir a expressão do operon nif, isto é, pode ser uma força competitiva quando se deseja que o micróbio fixe nitrogênio atmosférico e excrete amônia. A via de fixação de nitrogênio é caracterizada em grande detalhe nas seções anteriores da especificação.

[00431] Posteriormente, uma alteração genômica não intergenérica direcionada pode ser introduzida no genoma do micróbio, usando métodos incluindo, mas não se limitando a: conjugação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptativa e edição de genes. A alteração genômica não intergenérica direcionada pode incluir uma inserção, ruptura, eliminação, alteração, perturbação, modificação,

etc. do genoma.

[00432] Micróbios remodelados derivados, que compreendem o fenótipo desejado resultante do genótipo subjacente remodelado, são então usados para inocular plantações.

[00433] A presente revelação fornece, em certas modalidades, micróbios remodelados não intergenéricos que são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e fornecer tal nitrogênio a uma planta. Em aspectos, esses micróbios remodelados não intergenéricos são capazes de fixar nitrogênio atmosférico, mesmo na presença de nitrogênio exógeno.

[00434] A FIG. 1B representa uma visão expandida da medição da etapa do microbioma. Em algumas modalidades, a presente revelação encontra espécies microbianas que possuem características de colonização desejadas e, em seguida, utiliza essas espécies no processo de remodelação subsequente.

[00435] A plataforma de Remodelação Microbiana Guiada (RMG) acima mencionada será agora descrita com mais especificidade.

[00436] Em alguns aspectos, a plataforma de RMG compreende as seguintes etapas: A. Isolamento - Obter micróbios do(a) solo, rizosfera, superfície, etc. de uma planta de cultivo de interesse; B. Caracterização - Envolver a caracterização dos micróbios isolados para genótipo/fenótipos de interesse (por exemplo, sequência do genoma, capacidade de colonização, atividade de fixação de nitrogênio, capacidade de solubilização de P, excreção de um metabólito de interesse, excreção de um composto promotor de plantas, etc.)

C. Domesticação - Desenvolvimento de um protocolo molecular para modificação genética não intergenérica do micróbio; D. Campanha e Otimização de Manipulação Genética Não Intergenérica - Geração de cepas microbianas não intergenéricas derivadas com modificações genéticas nas principais vias (por exemplo, genes associados à colonização, genes de fixação/assimilação de nitrogênio, genes de solubilização de P); E. Analítica - Avaliação de cepas não intergenéricas derivadas para fenótipos de interesse tanto in vitro (por exemplo, ensaios ARA) e in planta (por exemplo, ensaios de colonização); F. Iterar Campanha/Análise de Manipulação Genética - Iteração das etapas D e E para melhoria adicional da cepa microbiana.

[00437] Cada uma das etapas do processo da plataforma GMR será agora elaborada abaixo. A. Isolamento de Micróbios

1. Obter uma amostra de solo

[00438] Micróbios serão isolados do solo e/ou raízes de uma planta. Em um exemplo, as plantas serão cultivadas em um laboratório ou uma estufa em pequenos vasos. Amostras de solo serão obtidas em várias áreas agrícolas. Por exemplo, solos com diversas características de textura podem ser coletados, incluindo barro (por exemplo, barro turfoso, argiloso), solo argiloso (por exemplo, argila pesada, argila siltosa), solo arenoso, solo siltoso, solo turfoso, solo calcário e semelhantes.

2. Cultivar plantas de isca

[00439] Sementes de uma planta de isca (uma planta de interesse) (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo, painço, soja, vegetais, frutas, etc.) serão plantadas em cada tipo de solo. Em um exemplo, diferentes variedades de uma planta de isca serão plantadas em vários tipos de solo. Por exemplo, se a planta de interesse for milho, sementes de diferentes variedades de milho, tais como, milho do campo, milho doce, milho tradicional, etc., serão plantadas em vários tipos de solo descritos acima.

3. Colher amostras de solo e/ou raízes e placas em meio apropriado

[00440] As plantas serão colhidas arrancando-as após algumas semanas (por exemplo, 2-4 semanas) de crescimento. Alternativa ao cultivo de plantas em laboratório/estufa, solo e/ou raízes da planta de interesse podem ser coletados diretamente dos campos com diferentes tipos de solo.

[00441] Para isolar micróbios da rizosfera e epífitas, as plantas serão removidas suavemente, saturando o solo com água destilada ou suavemente afrouxando o solo com as mãos para evitar danos às raízes. Se partículas maiores de solo estiverem presentes, essas partículas serão removidas submergindo as raízes em uma poça de água destilada e/ou agitando suavemente as raízes. A raiz será cortada e uma pasta fluida de solo aderida à raiz será preparada colocando a raiz em um(a) placa ou tubo com uma pequena quantidade de água destilada e agitando suavemente a(o) placa/tubo em um agitador ou centrifugando o tubo em baixa velocidade. Essa pasta fluida será processada como descrito abaixo.

[00442] Para isolar endófitos, o excesso de solo nas superfícies radiculares será removido com água deionizada.

Após a remoção do solo, as plantas serão esterilizadas na superfície e enxaguadas vigorosamente em água esterilizada. Uma seção limpa de 1 cm da raiz será retirada da planta e colocada em solução salina tamponada com fosfato contendo esferas de aço de 3 mm. Uma pasta fluida será gerada por agitação vigorosa da solução com um Qiagen TissueLyser II.

[00443] O solo e/ou a pasta de raiz pode(m) ser processado(s) de várias maneiras, dependendo da característica benéfica às plantas desejada dos micróbios a serem isolados. Por exemplo, o solo e a pasta de raiz podem ser diluídos e inoculados em vários tipos de meios de triagem para isolar rizosféricos, endofíticos, epifíticos e outros micróbios associados a plantas. Por exemplo, se a característica benéfica às plantas desejada é a fixação de nitrogênio, então o(a) pasta fluida de solo/raiz será dividida(o) em placas em um meio livre de nitrogênio (por exemplo, meio de ágar Nfb) para isolar micróbios fixadores de nitrogênio. De modo similar, para isolar bactérias solubilizadoras de fosfato (PSB), podem ser usados meios contendo fosfato de cálcio como a única fonte de fósforo. PSB pode solubilizar fosfato de cálcio e assimilar e liberar fósforo em quantidades maiores. Essa reação se manifesta como um halo ou uma zona clara na placa e pode ser usada como uma etapa inicial para isolar PSB.

4. Pegar colônias, purificar culturas e fazer a triagem para a presença de genes de interesse

[00444] As populações de micróbios obtidas na etapa A3 são semeadas para obter colônias únicas (culturas puras). Uma parte da cultura pura é recolocada em suspensão em um meio adequado (por exemplo, uma mistura de R2A e glicerol)

e submetida a análise de PCR para rastrear a presença de um ou mais de genes de interesse. Por exemplo, para identificar bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas), culturas purificadas de micróbios isolados podem ser submetidas a uma análise de PCR para detectar a presença de genes nif que codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio atmosférico em uma forma de nitrogênio disponível para organismos vivos.

5. Banco de uma cultura purificada

[00445] Culturas purificadas de cepas isoladas serão armazenadas, por exemplo a -80 °C, para referência e análise futura. B. Caracterização de Micróbios Isolados

1. Caracterização filogenética e sequenciamento do genoma completo

[00446] Micróbios isolados serão analisados para caracterização filogenética (atribuição de gênero e espécie) e todo o genoma dos micróbios será sequenciado.

[00447] Para a caracterização filogenética, o rDNA 16S do micróbio isolado será sequenciado usando iniciadores de rDNA 16S degenerado para gerar identidade filogenética. As leituras da sequência de rDNA 16S serão mapeadas para um banco de dados para inicialmente atribuir o gênero, a espécie e o nome da cepa para micróbios isolados. O sequenciamento do genoma completo é usado como a etapa final para atribuir gênero/espécie filogenética aos micróbios.

[00448] Todo o genoma dos micróbios isolados será sequenciado para identificar as principais vias. Para o sequenciamento do genoma completo, o DNA genômico será isolado usando um kit de isolamento de DNA genômico (por exemplo, mini kit de DNA QIAmp da QIAGEN) e uma biblioteca de DNA total será preparada usando os métodos conhecidos na técnica. Todo o genoma será sequenciado usando métodos de sequenciamento de alto rendimento (também chamado de Sequenciamento de Próxima Geração) conhecidos na técnica. Por exemplo, Illumina, Inc., Roche e Pacific Biosciences fornecem ferramentas de sequenciamento do genoma completo que podem ser usadas para preparar bibliotecas de DNA total e realizar o sequenciamento do genoma completo.

[00449] A sequência do genoma completo para cada cepa isolada será montada; genes de interesse serão identificados; anotado; e apontados como alvos potenciais para remodelação. Todas as sequências do genoma serão armazenadas em um banco de dados.

2. Ensaio do micróbio quanto à colonização de uma planta hospedeira em uma estufa

[00450] Micróbios isolados serão caracterizados para a colonização de plantas hospedeiras em estufa. Para isso, sementes da planta hospedeira desejada (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo e soja) serão inoculadas com culturas de micróbios isolados individualmente ou em combinação e plantadas no solo. Alternativamente, culturas de micróbios isolados, individualmente ou em combinação, podem ser aplicadas às raízes da planta hospedeira inoculando o solo diretamente sobre as raízes. O potencial de colonização dos micróbios será testado, por exemplo, usando um método de PCR quantitativo (qPCR) descrito em maiores detalhes a seguir.

3. Ensaio do micróbio quanto à colonização da planta hospedeira em testes de campo em pequena escala e isolar o RNA de amostras de raízes colonizadas (ensaios de CAT)

[00451] Micróbios isolados serão avaliados quanto à colonização da planta hospedeira desejada em testes de campo em pequena escala. Adicionalmente, RNA será isolado de amostras de raízes colonizadas para obtenção de dados de transcriptoma da cepa em ambiente de campo. Esses testes de campo em pequena escala são referidos nesse documento como testes de CAT (Colonização e Transcrição), pois esses testes fornecem dados de Colonização e Transcrição para a cepa em um ambiente de campo.

[00452] Para esses testes, as sementes da planta hospedeira (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo e soja) serão inoculadas usando culturas de micróbios isolados individualmente ou em combinação e plantadas no solo. Alternativamente, culturas de micróbios isolados, individualmente ou em combinação, podem ser aplicadas às raízes da planta hospedeira inoculando o solo diretamente sobre as raízes. Os ensaios de CAT podem ser conduzidos em uma variedade de solos e/ou sob várias condições de temperatura e/ou umidade para avaliar o potencial de colonização e obter o perfil de transcriptoma do micróbio em vários tipos de solo e condições ambientais.

[00453] A colonização de raízes da planta hospedeira pelo(s) micróbio(s) inoculado(s) será avaliada, por exemplo, usando um método qPCR como descrito abaixo.

[00454] Em um protocolo, o potencial de colonização de micróbios isolados foi avaliado como a seguir. Um dia após o plantio das sementes de milho, 1 ml de cultura microbiana noturna (meio SOB) foi encharcado bem no local onde a semente estava localizada. 1 mL desta cultura durante a noite foi aproximadamente equivalente a cerca de 10^9 ufc, variando dentro de 3 vezes um do outro, dependendo de qual cepa está sendo usada. Cada muda foi fertilizada 3x por semana com 50 mL de solução de Hoagland modificada suplementada com 2,5mM ou nitrato de amônio 0,25mM. Quatro semanas após o plantio, amostras de raízes foram coletadas para extração de DNA. Os detritos do solo foram lavados com spray de água pressurizada. Essas amostras de tecido foram homogeneizadas usando QIAGEN Tissuelyzer e o DNA foi extraído usando Mini Kit de DNA QIAmp (QIAGEN) de acordo com o protocolo recomendado. O ensaio de qPCR foi realizado usando RT-PCR Mx3005P Stratagene nesses extratos de DNA usando iniciadores que foram projetados (usando o Iniciador BLAST do NCBI) para serem específicos para um loci em cada genoma do micróbio.

[00455] A presença das cópias do genoma do micróbio foi quantificada, o que refletiu o potencial de colonização do micróbio. A identidade da espécie microbiana foi confirmada pelo sequenciamento dos produtos de amplificação por PCR.

[00456] Adicionalmente, o RNA será isolado de raízes colonizadas e/ou amostras de solo e sequenciado.

[00457] Ao contrário do perfil de DNA, um perfil de RNA varia dependendo das condições ambientais. Portanto, o sequenciamento de RNA isolado de raízes e/ou solo colonizada(o)(s) refletirá a atividade de transcrição dos genes in planta na rizosfera.

[00458] O RNA pode ser isolado das amostras de raiz e/ou solo colonizadas em diferentes momentos para analisar as mudanças no perfil de RNA do micróbio colonizado nesses momentos.

[00459] Por exemplo, o RNA pode ser isolado das amostras de raiz e/ou solo colonizadas logo após a fertilização do campo e algumas semanas após a fertilização do campo e sequenciado para gerar o perfil de transcrição correspondente.

[00460] Similarmente, o sequenciamento de RNA pode ser realizado sob condições de alto fosfato e baixo fosfato para entender quais genes são transcricionalmente ativos ou reprimidos sob essas condições.

[00461] Métodos para sequenciamento transcriptômico/de RNA são conhecidos na técnica. Resumidamente, o RNA total será isolado da cultura purificada do micróbio isolado; o cDNA será preparado usando transcriptase reversa; e o cDNA será sequenciado usando ferramentas de sequenciação de alto rendimento descritas acima.

[00462] As leituras de sequenciamento da análise do transcriptoma podem ser mapeadas para a sequência genômica e os promotores transcricionais para os genes de interesse podem ser identificados.

4. Ensaio da atividade benéfica às plantas de micróbios isolados

[00463] A atividade benéfica às plantas de micróbios isolados será avaliada.

[00464] Por exemplo, micróbios fixadores de nitrogênio serão testados para a atividade de fixação de nitrogênio usando um ensaio de redução de acetileno (ARA) ou micróbios solubilizadores de fosfato serão testados para solubilização de fosfato. Qualquer parâmetro de interesse pode ser utilizado e um ensaio apropriado desenvolvido para tal. Por exemplo, os ensaios podem incluir curvas de crescimento para métricas de colonização e ensaios para a produção de fitohormônios como ácido indolacético (IAA) ou giberelinas.

Um ensaio para qualquer atividade benéfica às plantas que seja de interesse pode ser desenvolvido.

[00465] Essa etapa irá confirmar o fenótipo de interesse e eliminar quaisquer falsos positivos.

5. Seleção de candidatos potenciais de micróbios isolados

[00466] Os dados gerados nas etapas acima serão usados para selecionar micróbios para desenvolvimento posterior. Por exemplo, micróbios que mostram uma combinação desejada de potencial de colonização, atividade benéfica às plantas e/ou perfil de DNA e RNA relevante serão selecionados para domesticação e remodelação. C. Domesticação de Micróbios Selecionados

[00467] Os micróbios selecionados serão domesticados; em que os micróbios serão convertidos em uma forma que é geneticamente tratável e identificável.

1. Teste de sensibilidade a antibióticos

[00468] Uma maneira de domesticar os micróbios é manipulá-los com resistência a antibióticos. Para isso, a cepa microbiana do tipo selvagem será testada quanto à sensibilidade a vários antibióticos. Se a cepa for sensível ao antibiótico, então o antibiótico pode ser um bom candidato para uso em ferramentas/vetores genéticos para remodelar a cepa.

2. Projetar e construir um vetor

[00469] Os vetores que são condicionais para sua replicação (por exemplo, um plasmídeo suicida) serão construídos para domesticar os micróbios selecionados (micróbios hospedeiros). Por exemplo, um plasmídeo suicida contendo um marcador de resistência a antibióticos apropriado, um marcador contrasselecionável, uma origem de replicação para manutenção em um micróbio doador (por exemplo, E. coli), um gene que codifica uma proteína fluorescente (GFP, RFP, YFP, CFP, e semelhantes) para triar a inserção através de fluorescência, será construída uma origem de transferência para conjugação no micróbio hospedeiro e uma sequência de polinucleotídeos compreendendo braços de homologia para o genoma hospedeiro com uma variação genética desejada. O vetor pode compreender um sítio SceI e outros elementos adicionais.

[00470] Marcadores de resistência a antibióticos de exemplo incluem marcador de resistência à ampicilina, marcador de resistência à canamicina, marcador de resistência à tetraciclina, marcador de resistência ao cloranfenicol, marcador de resistência à eritromicina, marcador de resistência à estreptomicina, marcador de resistência à espectinomicina, etc. Marcadores contrasselecionáveis de exemplo incluem sacB, rpsL, tetAR, pheS, thyA, lacY, gata-1, ccdB, etc.

3. Geração de micróbios doadores

[00471] Em um protocolo, um plasmídeo suicida contendo um marcador de resistência a antibióticos apropriado, um marcador contrasselecionável, a origem de replicação pir para manutenção em E. coli ST18 contendo o gene do iniciador de replicação pir, um gene que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) para rastrear a inserção através de fluorescência, uma origem de transferência para conjugação no micróbio hospedeiro e uma sequência de polinucleotídeos compreendendo braços de homologia para o genoma hospedeiro com uma variação genética desejada (por exemplo, um promotor de dentro do próprio genoma do micróbio para inserção em uma localização heteróloga) será transformada em E. coli ST18 (um auxotrófico para ácido aminolevulínico, ALA) para gerar micróbios doadores.

4. Misturar micróbios doadores com micróbios hospedeiros

[00472] Micróbios doadores serão misturados com micróbios hospedeiros (micróbios candidatos selecionados da etapa B5) para permitir a integração conjugativa do plasmídeo no genoma do hospedeiro. A mistura de micróbios doador e hospedeiro será semeada em um meio contendo o antibiótico e não contendo ALA. O plasmídeo suicida é capaz de se replicar em micróbios doadores (E. coli ST18), mas não no hospedeiro. Portanto, quando a mistura contendo micróbios doador e hospedeiro é semeada em um meio contendo o antibiótico e não contendo ALA, apenas as células hospedeiras que integraram o plasmídeo em seu genoma serão capazes de crescer e formar colônias no meio. Os micróbios doadores não crescerão devido à ausência de ALA.

5. Confirmar a integração do vetor

[00473] Uma integração adequada do plasmídeo suicida contendo o marcador de proteína fluorescente, o marcador de resistência a antibióticos, o marcador contrasselecionável, etc. no locus pretendido do micróbio hospedeiro será confirmada por fluorescência de colônias na placa e usando PCR de colônia.

6. Isolamento de confirmação de colônia de integração

[00474] Uma segunda rodada de recombinação homóloga nos micróbios hospedeiros fará um desnovelamento da (removerá a) estrutura do plasmídeo deixando a variação genética desejada (por exemplo, um promotor de dentro do próprio genoma do micróbio para inserção em um local heterólogo) integrado no genoma do hospedeiro de uma certa porcentagem de micróbios hospedeiros, enquanto reverte uma certa porcentagem de volta ao tipo selvagem.

[00475] As colônias de micróbios hospedeiros que criaram um desenovelamento da estrutura do plasmídeo (e, portanto, fizeram um desenovelamento do marcador selecionável de contador) podem ser selecionadas cultivando-os em um meio apropriado.

[00476] Por exemplo, se sacB for usado como um marcador contrasselecionável, a perda desse marcador devido à perda da estrutura do plasmídeo será testada pelo crescimento das colônias em um meio contendo sacarose (sacB confere sensibilidade à sacarose). As colônias que crescem nesse meio teriam perdido o marcador sacB e a estrutura do plasmídeo e conteriam a variação genética desejada ou seriam revertidas para o tipo selvagem. Além disso, essas colônias não irão apresentar fluorescência na placa devido à perda do marcador de proteína fluorescente.

[00477] Em alguns isolados, o sacB ou outros marcadores contrasselecionáveis não conferem sensibilidade total à sacarose ou outros mecanismos de contrasseleção, o que requer a triagem de um grande número de colônias para isolar um desenovelamento bem-sucedido. Nesses casos, o desenovelamento pode ser auxiliada pelo uso de um “plasmídeo auxiliar” que se replica independentemente na célula hospedeira e expressa uma endonuclease de restrição, por exemplo, SceI, que reconhece um sítio na estrutura do plasmídeo suicida integrado. A cepa com o plasmídeo suicida integrado é transformada com o plasmídeo auxiliar contendo um marcador de resistência a antibióticos, uma origem de replicação compatível com a cepa hospedeira e um gene que codifica uma endonuclease de restrição controlada por um promotor constitutivo ou induzível. A quebra de fita dupla induzida na estrutura do plasmídeo integrado pela endonuclease de restrição promove a recombinação homóloga para eliminar o plasmídeo suicida. Isso aumenta o número de colônias desenoveladas na placa de contrasseleção e diminui o número de colônias que precisam ser triadas para encontrar uma colônia contendo a mutação desejada. O plasmídeo auxiliar é então removido da cepa por cultura e passagem em série na ausência de seleção de antibiótico para o plasmídeo. As culturas passadas são isoladas para colônias únicas, as colônias são selecionadas e triadas quanto à sensibilidade ao antibiótico usado para a seleção do plasmídeo auxiliar, bem como a ausência do plasmídeo confirmado por PCR de colônia. Finalmente, o genoma é sequenciado e a ausência de DNA do plasmídeo auxiliar é confirmada conforme descrito em D6.

7. Confirmar a integração da variação genética por meio de PCR de colônia

[00478] As colônias que cresceram melhor no meio contendo sacarose (ou outro meio apropriado, dependendo do contador selecionado marcado usado) serão colhidas e a presença da variação genética no local pretendido será confirmada por triagem das colônias usando PCR na colônia.

[00479] Embora esse exemplo descreva um protocolo para domesticar o micróbio e introduzir variação genética no micróbio, um habilitado comum na técnica entenderia que a variação genética pode ser introduzida nos micróbios selecionados usando uma variedade de outras técnicas conhecidas no técnicas como: mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, ZFN, TALENS, sistemas CRISPR (Cas9, Cpf1, etc.), mutagênese química e combinações dos mesmos.

8. Fazer interação nas etapas C2-C7

[00480] Se qualquer uma das etapas C2-C7 falhar em fornecer o resultado pretendido, as etapas serão repetidas para projetar um vetor alternativo que pode compreender diferentes elementos para facilitar a incorporação das variações genéticas desejadas e marcadores no micróbio hospedeiro.

9. Desenvolver um procedimento operacional padrão (SOP)

[00481] Uma vez que as etapas C2-C7 podem ser reproduzidas de forma consistente para uma determinada cepa, as etapas serão usadas para desenvolver um procedimento operacional padrão (SOP) para essa cepa e esse vetor. Esse SOP pode ser usado para melhorar outras características do micróbio benéficas às plantas. D. Campanha e otimização de manipulação genética não intergenérica

1. Identificar genes alvos para otimização

[00482] Micróbios selecionados serão manipulados geneticamente/remodelados para melhorar o desempenho da atividade benéfica às plantas. Para isso, serão identificados genes alvos para melhorar a atividade benéfica às plantas.

[00483] Os genes alvos podem ser identificados de várias maneiras. Por exemplo, os genes de interesse podem ser identificados ao anotar os genes de todo o sequenciamento do genoma de micróbios isolados. Eles podem ser identificados por meio de uma pesquisa bibliográfica. Por exemplo, os genes envolvidos na fixação de nitrogênio são conhecidos na literatura. Esses genes conhecidos podem ser usados como alvos para a introdução de variações genéticas. Os genes alvos também podem ser identificados com base nos dados de sequenciamento de RNA obtidos na etapa B3 (testes de campo em pequena escala para colonização) ou pela realização de sequenciamento de RNA descrito na etapa abaixo.

2. Selecionar promotores para trocas de promotores

[00484] Uma variação genética desejada para melhorar a atividade benéfica às plantas pode compreender a troca de promotor, em que o promotor nativo para um gene alvo é substituído por um promotor mais forte ou mais fraco (quando comparado ao promotor nativo) de dentro do genoma do micróbio, ou promotor regulado de forma diferente (por exemplo, um N-independente). Se a expressão de um gene alvo aumenta a atividade benéfica às plantas (por exemplo, nifA, a expressão do qual aumenta a fixação de nitrogênio em micróbios), o promotor desejado para troca de promotor é um promotor mais forte (em comparação com o promotor nativo do gene alvo) o que aumentaria ainda mais o nível de expressão gênica alvo em comparação com o promotor nativo. Se a expressão de um gene alvo diminui a atividade benéfica às plantas (por exemplo, nifL que regula negativamente a fixação de nitrogênio), o promotor desejado para a troca de promotor é um promotor fraco (em comparação com o promotor nativo do gene alvo) que diminuiria substancialmente o nível de expressão do gene alvo em comparação com o promotor nativo.

Os promotores podem ser inseridos em genes para “inativar” a expressão de um gene, enquanto ao mesmo tempo regula positivamente a expressão de um gene a jusante.

[00485] Os promotores para troca de promotor podem ser selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA. Por exemplo, os dados de sequenciamento de RNA podem ser usados para identificar promotores fortes e fracos, ou promotores constitutivamente ativos versus promotores induzíveis.

[00486] Por exemplo, para identificar promotores fortes e fracos, ou promotores constitutivamente ativos vs. induzíveis, na via de fixação de nitrogênio, micróbios selecionados serão cultivados in vitro sob condições de esgotamento e repletas de nitrogênio; o RNA do micróbio será isolado dessas culturas; e sequenciado.

[00487] Em um protocolo, o perfil de RNA do micróbio sob condições de esgotamento de nitrogênio e repleto de nitrogênio será comparado e os promotores ativos com um nível de transcrição desejado serão identificados. Esses promotores podem ser selecionados para trocar um promotor fraco.

[00488] Os promotores também podem ser selecionados usando os dados de sequenciamento de RNA obtidos na etapa B3 que reflete o perfil de RNA do micróbio in planta na rizosfera da planta hospedeira.

[00489] O sequenciamento de RNA sob várias condições permite a seleção de promotores que: a) são ativos na rizosfera durante o ciclo de crescimento da planta hospedeira sob condições de campo fertilizado, e b) também são ativos sob condições in vitro relevantes para que possam ser rapidamente triados.

[00490] Em um protocolo de exemplo, dados de sequenciamento de RNA in planta de ensaios de colonização (por exemplo, etapa B3) são usados para medir os níveis de expressão de genes em micróbios isolados. Em uma modalidade, o nível de expressão gênica é calculado como leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM). O nível de expressão de vários genes é comparado ao nível de expressão de um gene alvo e pelo menos os 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou 70 principais promotores, associados aos vários genes, que mostram o nível mais alto ou mais baixo de expressão em comparação com o gene alvo, são selecionados como possíveis candidatos para troca de promotor. Assim, olha-se para os níveis de expressão de vários genes em relação a um gene alvo e, em seguida, seleciona-se genes que demonstram expressão aumentada em relação a um gene alvo (ou padrão) e, em seguida, encontra os promotores associados aos referidos genes.

[00491] Por exemplo, se o gene alvo é a regulação positiva de nifA, os primeiros 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 promotores para genes que mostram o nível mais alto de expressão em comparação com nifA são selecionados como possíveis candidatos para troca de promotor.

[00492] Esses candidatos podem ser ainda selecionados com base em dados de sequenciamento de RNA in vitro. Por exemplo, para nifA como o gene alvo, possíveis candidatos a promotores selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA in planta são ainda selecionados pela escolha de promotores com níveis de expressão gênica similares ou aumentados em comparação com nifA sob condições in vitro esgotadas de nitrogênio vs. repletas de nitrogênio.

[00493] O conjunto de promotores selecionados nessa etapa é usado para trocar o promotor nativo do gene alvo (por exemplo, nifA). As cepas remodeladas com promotores trocados são testadas em ensaios in vitro; as cepas com atividade inferior à esperada são eliminadas; e cepas com atividade esperada ou superior à esperada são testadas em campo. O ciclo de seleção do promotor pode ser repetido em cepas remodeladas para melhorar ainda mais sua atividade benéfica às plantas.

[00494] É descrito nesse documento um exemplo de experimento de troca de promotor que foi realizado com base em dados de sequenciamento de RNA in planta e in vitro da cepa de Klebsiella variicola, CI137 para melhorar a característica de fixação de nitrogênio. CI137 foi analisado em ensaios ARA nas concentrações de glutamina 0mM e 5mM e o RNA foi extraído dessas amostras de ARA. O RNA foi sequenciado via NextSeq e um subconjunto de leituras de uma amostra foi mapeado para o genoma CI137 (dados de sequenciamento de RNA in vitro). O RNA foi extraído das raízes de plantas de milho no estágio V5 no ensaio de colonização e atividade (por exemplo, etapa B3) para CI137. Amostras de 6 plantas foram agrupadas; o RNA da amostra agrupada foi sequenciado usando NextSeq, e as leituras foram mapeadas para o genoma CI137 (dados de sequenciamento de RNA in planta). De um total de 2x108 leituras, 7x104 leituras mapeadas para CI137. Os dados de sequenciação de RNA in planta foram usados para classificar os genes na ordem dos níveis de expressão in planta e os níveis de expressão foram comparados com o nível de expressão de nifA nativo. Os primeiros 40 promotores que mostraram o nível de expressão mais alto (com base na expressão gênica) em comparação com o nível de expressão de nifA nativo foram selecionados. Esses 40 promotores foram posteriormente selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA in vitro, onde os promotores com níveis de expressão in vitro aumentados ou semelhantes em comparação com nifA foram selecionados. A lista final de promotores incluiu 17 promotores e 2 versões da maioria dos promotores foram usadas para gerar mutantes de troca de promotor; assim, um total de 30 promotores foram testados. A geração de um conjunto de mutantes CI137 onde nifL foi eliminada parcialmente ou completamente e os 30 promotores inseridos (ΔnifL::Prm) foi tentada. 28 de 30 mutantes foram gerados com sucesso. Os mutantes ΔnifL::Prm foram analisados em ensaios ARA nas concentrações de glutamina 0mM e 5mM e o RNA foi extraído dessas amostras de ARA. Vários mutantes mostraram atividade de ARA menor do que o esperado ou diminuída em comparação com a cepa CI137 WT. Alguns mutantes mostraram atividade de ARA maior do que o esperado.

[00495] Uma pessoa habilitada na técnica apreciaria a partir do exemplo acima que, embora os dados de sequenciamento de RNA in planta e/ou in vitro possam ser usados para selecionar promotores para troca de promotor, a etapa de seleção de promotor é altamente imprevisível e envolve muitos desafios.

[00496] Por exemplo, o sequenciamento de RNA in planta revela principalmente os genes que são altamente expressados; no entanto, é difícil detectar diferenças sutis na expressão gênica e/ou nos genes com baixos níveis de expressão. Por exemplo, em alguns experimentos de sequenciamento de RNA in planta, apenas cerca de 40 de cerca de 5000 genes de um genoma microbiano foram detectados. Assim, a técnica de sequenciação de RNA in planta é útil para identificar genes expressados abundantemente e seus promotores correspondentes; no entanto, a técnica tem dificuldade em identificar genes de baixa expressão e promotores correspondentes e pequenas diferenças entre a expressão gênica.

[00497] Além disso, o perfil de RNA in planta reflete o estado dos genes no momento em que os micróbios foram isolados; no entanto, uma ligeira mudança nas condições de campo pode alterar substancialmente o perfil de RNA de micróbios rizosféricos/epifíticos/endofíticos. Portanto, é difícil prever com antecedência se os promotores selecionados com base em dados de sequenciamento de RNA de um ensaio de campo forneceriam níveis de expressão desejáveis do gene alvo quando cepas remodeladas são testadas in vitro e em campo.

[00498] Adicionalmente, a avaliação in planta consome tempo e recursos; portanto, os experimentos in planta não podem ser realizados com frequência e/ou repetidos rápida ou facilmente. Por outro lado, embora o sequenciamento de RNA in vitro possa ser conduzido de forma relativamente rápida e fácil, as condições in vitro não imitam as condições de campo e os promotores que podem mostrar alta atividade in vitro podem não mostrar atividade comparável in planta.

[00499] Além disso, os promotores muitas vezes não se comportam como previsto em um novo contexto. Portanto, os dados de sequenciação de RNA in planta e in vitro podem, na melhor das hipóteses, servir como um ponto de partida na etapa de seleção do promotor; no entanto, chegar a qualquer promotor particular que forneceria níveis de expressão desejáveis do gene alvo no campo é, em alguns casos, imprevisível.

[00500] Outra limitação na etapa de seleção do promotor é o número de promotores disponíveis. Porque um dos objetivos da presente invenção é fornecer micróbios não transgênicos; promotores para troca de promotor precisam ser selecionados de dentro do genoma ou gênero do micróbio. Assim, ao contrário de uma abordagem transgênica, o presente processo não pode meramente entrar na literatura e encontrar/usar um promotor transgênico bem caracterizado de um organismo hospedeiro diferente.

[00501] Outra restrição é que o promotor deve ser ativo in planta durante uma fase de crescimento desejada. Por exemplo, a maior necessidade de nitrogênio nas plantas é geralmente no final da estação de crescimento, por exemplo, fases vegetativas tardias e reprodutivas iniciais. Por exemplo, no milho, a absorção de nitrogênio é mais alta durante os estágios V6 (6 folhas) até R1 (estágio reprodutivo 1). Portanto, para aumentar a disponibilidade de nitrogênio durante os estágios V6 a R1 do milho, os micróbios remodelados devem apresentar maior atividade de fixação de nitrogênio durante esses estágios do ciclo de vida do milho. Consequentemente, os promotores que são ativos in planta durante os estágios vegetativos tardios e reprodutivos iniciais do milho precisam ser selecionados. Essa restrição não apenas reduz o número de promotores que podem ser testados na troca de promotor, mas também torna a etapa de seleção de promotor imprevisível. Como discutido acima, a imprevisibilidade surge, em parte, porque embora os dados de sequenciamento de RNA de testes de campo em pequena escala (por exemplo, etapa B3) possam ser usados para identificar promotores que são ativos in planta durante um estágio de crescimento desejado, os dados de RNA são baseados no condições de campo (por exemplo, tipo de solo, nível de água no solo, nível de nitrogênio disponível, etc.) no momento da coleta da amostra. Como um habilitado comum na técnica entenderia, as condições de campo podem mudar ao longo do período de tempo dentro do mesmo campo e também mudar substancialmente em vários campos. Assim, os promotores selecionados em uma condição de campo podem não se comportar como esperado em outras condições de campo. De modo similar, os promotores selecionados podem não se comportar como esperado após a troca. Portanto, é difícil prever com antecedência se os promotores selecionados seriam ativos in planta durante uma fase de crescimento desejada de uma planta de interesse.

3. Projetar variações genéticas não intergenéricas

[00502] Com base nas etapas D1 (identificação de genes alvos) e D2 (identificação de promotores para trocas de promotores), variações genéticas não intergenéricas serão projetadas.

[00503] O termo “não intergenérico” indica que a variação genética a ser introduzida no hospedeiro não contém uma sequência de ácidos nucleicos de fora do gênero hospedeiro (isto é, nenhum DNA transgênico). Embora vetores e/ou outras ferramentas genéticas sejam usados para introduzir a variação genética no micróbio hospedeiro, os métodos da presente revelação incluem etapas para desenovelar (remover)

as sequências de vetor estruturais ou outras ferramentas genéticas introduzidas no micróbio hospedeiro deixando apenas a variação genética desejada no genoma do hospedeiro. Assim, o micróbio resultante não é transgênico.

[00504] Variações genéticas não intergenéricas de exemplo incluem uma mutação no gene de interesse que pode melhorar a função da proteína codificada pelo gene; um promotor constitucionalmente ativo que pode substituir o promotor endógeno do gene de interesse para aumentar a expressão gênica; uma mutação que inativará o gene de interesse; a inserção de um promotor de dentro do genoma do hospedeiro em um local heterólogo, por exemplo, inserção do promotor em um gene que resulta na inativação do referido gene e na regulação positiva de um gene a jusante; e similares. As mutações podem ser mutações pontuais, inserções e/ou eliminações (eliminação total ou parcial do gene). Por exemplo, em um protocolo, para melhorar a atividade de fixação de nitrogênio do micróbio hospedeiro, uma variação genética desejada pode compreender uma mutação de inativação do gene nifL (regulador negativo da via de fixação de nitrogênio) e/ou compreender a substituição do promotor endógeno do gene nifH (proteína de ferro nitrogenase que catalisa uma reação chave para fixar o nitrogênio atmosférico) com um promotor constitucionalmente ativo que irá conduzir a expressão gênica nifH constitutivamente.

4. Gerar cepas derivadas não intergenéricas

[00505] Depois de projetar as variações genéticas não intergenéricas, as etapas C2-C7 serão realizadas para gerar cepas derivadas não intergenéricas (isto é, micróbios remodelados).

5. Banco de uma cultura purificada do micróbio remodelado

[00506] Uma cultura purificada do micróbio remodelado será preservada em um banco, de modo que o gDNA possa ser extraído para o sequenciamento do genoma completo descrito abaixo.

6. Confirmar a presença da variação genética desejada

[00507] O DNA genômico do micróbio remodelado será extraído e todo o sequenciamento do genoma será realizado no DNA genômico usando os métodos descritos anteriormente. As leituras resultantes serão mapeadas para as leituras previamente armazenadas no LIMS para confirmar: a) presença da variação genética desejada, e b) ausência completa de mapeamento de leituras para sequências de vetor (por exemplo, estrutura de plasmídeo ou sequência de plasmídeo auxiliar) que foram usadas para gerar o micróbio remodelado.

[00508] Essa etapa permite a detecção sensível de DNA de gênero não hospedeiro (DNA transgênico) que pode permanecer na cepa após o método de desenovelamento da estrutura do vetor (por exemplo, plasmídeo suicida) e pode fornecer um controle para a inserção fora do alvo acidental da variação genética, etc. E. Análise de Micróbios Remodelados

1. Análise da atividade benéfica às plantas

[00509] A atividade benéfica às plantas e a cinética de crescimento dos micróbios remodelados serão avaliadas in vitro.

[00510] Por exemplo, cepas remodeladas para melhorar a função de fixação de nitrogênio serão avaliadas quanto à atividade de fixação de nitrogênio e aptidão por meio de ensaios de redução de acetileno, ensaios de excreção de amônio, etc.

[00511] As cepas remodeladas para melhor solubilização de fosfato serão avaliadas quanto à atividade de solubilização de fosfato.

[00512] Essa etapa permite a triagem rápida, de médio a alto rendimento de cepas remodeladas para os fenótipos de interesse.

2. Análise de colonização e transcrição dos genes alterados

[00513] As cepas remodeladas serão avaliadas quanto à colonização da planta hospedeira na estufa ou no campo usando as etapas descritas em B3. Além disso, o RNA será isolado de amostras de raízes e/ou solo colonizadas e sequenciado para análise da atividade transcricional dos genes alvo. Os genes alvo compreendem os genes que contêm a variação genética introduzida e também podem compreender outros genes que desempenham um papel na característica benéfica às plantas do micróbio.

[00514] Por exemplo, um agrupamento de genes, os genes nif, controla a atividade de fixação de nitrogênio dos micróbios. Usando o protocolo descrito acima, uma variação genética pode ser introduzida em um dos genes nif (por exemplo, uma inserção de promotor), enquanto os outros genes no agrupamento nif estão em sua forma endógena (isto é, sua sequência de genes e/ou a região do promotor não é alterada). Os dados de sequenciamento de RNA serão analisados para a atividade transcricional do gene nif contendo a variação genética e também podem ser analisados para outros genes nif que não são alterados diretamente, pela mudança genética inserida, mas mesmo assim podem ser influenciados pela mudança genética introduzida.

[00515] Essa etapa permite a determinação da adequação das cepas de melhor desempenho in vitro na rizosfera e permite a medição da atividade transcricional de genes alterados in planta. F. Fazer iteração Campanha/Análise de Manipulação Genética

[00516] Os dados de análises in vitro e in planta (etapas E1 e E2) serão usados para transformar mutações benéficas de forma iterativa.

[00517] Além disso, as etapas A-E descritas acima podem ser repetidas para ajustar as características benéficas às plantas dos micróbios. Por exemplo, as plantas serão inoculadas usando cepas microbianas remodeladas na primeira rodada; colhidas após algumas semanas de crescimento; e micróbios do solo e/ou raízes das plantas serão isolados. A atividade funcional (característica benéfica às plantas e potencial de colonização) e o perfil de DNA e RNA de micróbios isolados serão caracterizados, a fim de selecionar micróbios com atividade benéfica às plantas e potencial de colonização melhorados. Os micróbios selecionados serão remodelados para melhorar ainda mais a atividade benéfica às plantas. Micróbios remodelados serão triados para a atividade funcional (característica benéfica às plantas e potencial de colonização) e perfil de RNA in vitro e in planta e as cepas de melhor desempenho serão selecionadas. Se desejado, as etapas A-E podem ser repetidas para melhorar ainda mais a atividade benéfica às plantas dos micróbios remodelados da segunda rodada. O processo pode ser repetido por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais rodadas.

[00518] As etapas de exemplo descritas acima são resumidas na Tabela A abaixo.

Tabela A – Uma Visão Geral de uma Modalidade da Plataforma de Remodelação Microbiana Guiada Etapas Contribuição Formas alternativas

A Isolamento

Obter uma amostra de Fornecer micróbios do solo 1 solo WT para serem isolados Cultivar “plantas de Permitir a seleção de Trigo, sorgo, arroz, milho, 2 isca” de milho em micróbios benéficos às soja, etc. amostra de solo plantas pela rizosfera Colher, limpar e Selecionar os micróbios do Outros meios livres de extrair a amostra de solo para aqueles que a) nitrogênio, outros meios 3 raiz e placa em meio colonizam a raiz e b) seletivos ou de triagem (por livre de nitrogênio fixam nitrogênio exemplo, para solubilização de (especificamente NfB) atmosférico fosfato) Escolher colônias, Selecionar os micróbios purificar culturas e Degenerar iniciadores para para aqueles que contêm o triar a presença de outros genes de interesse, por 4 gene nifH (elimine os nifH usando exemplo, ipdC (biossíntese de falsos positivos da tela iniciadores fitormônios) da mídia) degenerados Banco de uma cultura 5 purificada da cepa

B Caracterização

Sequenciar e montar o genoma da cepa usando Caracterizar o genoma para 1 a plataforma Illumina as principais vias e/ou PacBio Testar o micróbio Trigo, sorgo, arroz, painço, quanto à colonização Selecionar micróbios que soja, etc., outros métodos para 2 de raízes de milho na colonizam bem a planta avaliar a colonização (por estufa (método exemplo, divisão em placas) baseado em qPCR) Teste o micróbio quanto à colonização Conhecidos internamente de raízes de milho em como ensaios “CAT”, eles Ensaios de campo maiores, testes de campo em fornecem dados de outros cultivos, outros métodos 3 pequena escala Colonização e Transcrição para avaliar a colonização (por (método baseado em para a cepa em um ambiente exemplo, plaqueamento) qPCR) e isole o RNA de de campo amostras de raízes colonizadas Ensaiar o micróbio Confirmar o fenótipo de 4 quanto à atividade de fixação de N da cepa fixação de nitrogênio

Etapas Contribuição Formas alternativas em um ensaio de redução de acetileno (ARA) Usar os dados acima para selecionar o Permitir a seleção de micróbio candidato 5 candidatos com maior para posterior potencial domesticação e otimização

C Domesticação

Determinar quais Testar os micróbios marcadores de seleção de quanto à 1 antibióticos podem ser sensibilidade a usados para transformar vários antibióticos ferramentas genéticas Projetar e construir um plasmídeo suicida contendo um marcador de resistência a antibióticos apropriado, marcador contrasselecionável Essas são as “partes” sacB, origem de O plasmídeo pode conter um sítio necessárias para manter o replicação para SceI ou outro marcador plasmídeo e realizar a 2 manutenção em E. coli, contrasselecionável, repórteres conjugação, inserção e GFP para triar a fluorescentes alternativos, “desenovelamento” do inserção por elementos adicionais genoma do hospedeiro fluorescência, origem de transferência para conjugação no hospedeiro, braços de homologia para o genoma do hospedeiro e a mutação desejada.

Transformar o plasmídeo suicida em E. coli ST18 (um Pode usar uma cepa de doador Preparação para auxotrófico para diferente de E. coli ou outro 3 conjugação no hospedeiro; ácido micróbio; marcador auxotrófico manutenção de plasmídeo aminolevulínico, ALA) diferente para gerar células doadoras Misturar as células do O plasmídeo suicida é doador com as células capaz de se replicar em E.

Pode usar uma cepa de doador hospedeiras coli, mas não no diferente de E. coli ou outro 4 receptoras para hospedeiro.

Portanto, a micróbio; marcador auxotrófico conjugar e dividir em divisão em placa da diferente placas no meio mistura em tais placas selecionando o significa que apenas as

Etapas Contribuição Formas alternativas marcador de células hospedeiras que resistência a receberam o plasmídeo e antibióticos e NÃO experimentaram a contendo ALA integração do plasmídeo no cromossomo serão capazes de crescer e formar colônias.

A E. coli ST18 não consegue crescer devido à ausência de ALA.

Confirmar a Confirmar a integração integração do adequada da estrutura do plasmídeo por meio de plasmídeo suicida 5 fluorescência de GFP e contendo GFP, o cassete de a integração no locus resistência a pretendido por meio de antibióticos, o marcador PCR de colônia sacB, etc.

O marcador sacB confere sensibilidade à sacarose; Isolar colônia de as colônias que passaram Marcador de contador integração confirmada por uma segunda rodada de selecionável diferente, 6 em uma placa contendo recombinação homóloga e desenovelamento mediada por sacarose e triar para “desenovelamento” do SceI, etc. colônias não plasmídeo crescerão fluorescentes melhor e não fluorescem na placa.

Após o segundo evento de Triar colônias recombinação homóloga, desenoveladas apenas 50% das colônias 7 para a mutação desenoveladas devem pretendida usando PCR conter a mutação, os na colônia outros 50% serão WT Se qualquer uma das Permitir a solução de etapas 2 a 7 falhar, problemas iterativos de voltar para a etapa 2 8 plasmídeo suicida para e reprojetar com desenvolver um protocolo partes alternativas de trabalho do plasmídeo Uma vez que as etapas 2-7 podem ser realizadas de forma confiável, 9 desenvolver um SOP para essa(e) cepa/plasmídeo a ser usada(o) para Otimização Campanha e otimização D de manipulação genética não

Etapas Contribuição Formas alternativas intergenérica

Identificar genes alvos para otimizar uma via, por exemplo, 1 genes nif através de pesquisa bibliográfica Permitir a seleção de Selecionar promotores promotores que a) são para trocas de ativos na rizosfera promotores usando durante o ciclo de Culturas alternativas; dados de RNAseq crescimento do milho sob condições alternativas de dados coletados in vitro sob 2 condições de campo RNAseq (estufa, campo, in condições esgotadas fertilizado b) também são vitro, o que for relevante para de N e repletas de N, ativos sob condições o fenótipo visado) e in planta da repletas de N in vitro rizosfera do milho para que possam ser (coletado na etapa B3) rapidamente triados.

Projetar mutações não intergenéricas em genes chave: Nenhum DNA de fora do eliminações (gene cromossomo hospedeiro é Alterar sequências reguladoras total ou parcial), 3 adicionado, portanto, o (por exemplo, RBS), RNAs não trocas de promotor ou micróbio resultante é não codificantes, etc. alterações de par de transgênico base única; armazenar esses projetos em nosso LIMS Usar o protocolo Realizamos isso em uma estabelecido, taxa de transferência executar as etapas C2- maior do que a etapa de 4 7 para gerar cepas domesticação - até 20 ou derivadas não mais cepas de uma vez por intergenéricas pessoa. (mutantes) Banco de uma cultura purificada da cepa, 5 extrair gDNA e conduzir WGS via Illumina Mapear as leituras Permitir a detecção muito A remoção do plasmídeo suicida resultantes para os sensível de DNA não é bastante confiável; no projetos armazenados intergenérico que pode entanto, o uso de outros em LIMS para confirmar permanecer na cepa após o plasmídeos estáveis em métodos 6 a) presença da mutação método do plasmídeo alternativos requer essa etapa desejada e b) ausência suicida; confirmar a extra para garantir com total completa de ausência de DNA confiança que nenhum DNA mapeamento de transgênico, controles transgênico que foi previamente leituras para para inserção fora do alvo transformado permaneça na cepa.

Etapas Contribuição Formas alternativas qualquer plasmídeo acidental do plasmídeo suicida ou outras suicida, etc. sequências de plasmídeo usadas para gerar as cepas E Análise Analisar as cepas quanto à atividade de fixação de nitrogênio Permitir a triagem rápida, Qualquer outro ensaio in vitro, in vitro e adequação de médio a alto rendimento por exemplo, solubilização de 1 por meio de ARA, de mutantes para fenótipos fosfato, qPCR para transcrição ensaios de excreção de de interesse de genes específicos, etc. amônio e curvas de crescimento Analisar as cepas para Medir a aptidão das cepas colonização (qPCR) e de melhor desempenho in transcrição de genes vitro na rizosfera; medir 2 alvo e trocados por a transcrição de genes promotor (Nanostring) trocados por promotor in na planta (estufa ou planta campo) Fazer iteração de F Campanha/Análise de manipulação genética Usar dados de análises in vitro e in planta 1 para transformar mutações benéficas de forma iterativa.

As Abordagens Tradicionais para a Criação de Produtos biológicos para a Agricultura Sofrem de Desvantagens Inerentes à sua Metodologia

[00519] Ao contrário da bioprospecção pura de micróbios do tipo selvagem (WT) ou abordagens transgênicas, o GMR permite a otimização genética não intergenérica das principais redes reguladoras dentro do micróbio, o que melhora os fenótipos benéficos às plantas sobre os micróbios WT, mas não apresenta os riscos associados a abordagens transgênicas (por exemplo, função genética imprevisível,

questões públicas e reguladoras). Ver, a FIG. 1C para uma representação de uma abordagem problemática de “bioprospecção tradicional”, que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma GMR ensinada.

[00520] Outros métodos para o desenvolvimento de micróbios para a agricultura são focados no desenvolvimento extensivo de laboratório, que muitas vezes falha na escala de campo, ou em estufa extensiva ou testes de “primeiro em campo” sem uma compreensão dos mecanismos subjacentes/interações planta-micróbio. Ver, a FIG. 1D para uma representação de um sistema problemático de “abordagem de campo para bioprospecção”, que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma GMR ensinada. A plataforma GMR resolve esses problemas de várias maneiras

[00521] Um ponto forte da plataforma GMR é a identificação de promotores ativos, que são ativos em momentos importantes fisiologicamente importantes para uma cultura alvo, e que também são ativos sob condições ambientais específicas e relevantes para a agricultura.

[00522] Como foi explicado, no contexto da fixação de nitrogênio, a plataforma GMR é capaz de identificar sequências promotoras microbianas, que são ativas sob condições ambientais de nitrogênio exógeno elevado, o que permite que o micróbio remodelado fixe nitrogênio atmosférico e o dispense a uma planta de cultivo alvo, sob as condições modernas de cultivo agrícola em linha, e no momento em que a planta precisa mais do nitrogênio fixado. Ver, a FIG. 1E para uma representação do período de tempo no ciclo de crescimento do milho, no qual o nitrogênio é mais necessário para a planta. A plataforma GMR ensinada é capaz de criar micróbios remodelados que fornecem nitrogênio a uma planta de milho no período de tempo em que o nitrogênio é necessário, e também dispensam esse nitrogênio mesmo na presença de nitrogênio exógeno no ambiente do solo.

[00523] Esses promotores podem ser identificados por sequenciamento de RNA da rizosfera e mapeamento de leitura para a sequência do genoma do micróbio, e as principais vias podem ser “reprogramadas” para serem ligadas ou desligadas durante os estágios principais do ciclo de crescimento da planta. Adicionalmente, por meio do sequenciamento do genoma completo de micróbios otimizados e do mapeamento para sequências previamente transformadas, o método tem a capacidade de garantir que nenhuma sequência transgênica seja acidentalmente liberada no campo por meio da inserção fora do alvo de DNA de plasmídeo, retenção de baixo nível de plasmídeos não detectado por PCR ou resistência a antibióticos, etc.

[00524] A plataforma GMR combina essas abordagens avaliando micróbios de forma iterativa no laboratório e no ambiente da planta, levando a micróbios que são robustos sob condições de estufa e de campo, e não apenas sob condições de laboratório.

[00525] Vários aspectos e modalidades da plataforma GMR ensinada podem ser encontrados nas FIGs. 1F-1I. A plataforma GMR culmina na derivação/criação/produção de micróbios remodelados que possuem uma propriedade benéfica às plantas, por exemplo, fixação de nitrogênio.

[00526] Os métodos tradicionais de bioprospecção não são capazes de produzir micróbios tendo as propriedades acima mencionadas.

Propriedades de um Micróbio Remodelado para Fixação de Nitrogênio

[00527] No contexto da remodelação de micróbios para fixação de nitrogênio, existem várias propriedades que o micróbio remodelado pode possuir. Por exemplo, a FIG. 1J representa 5 propriedades que podem ser possuídas por micróbios remodelados da presente revelação.

[00528] Além disso, como pode ser visto no Exemplo 2, foi utilizada a plataforma GMR para produzir bactérias não intergenéricas remodeladas (isto é, Kosakonia sacchari) capazes de fixar nitrogênio atmosférico e dispensar o referido nitrogênio a uma planta de milho, mesmo sob condições em que o nitrogênio exógeno está presente no ambiente. Ver, a FIG. 1K-M, que ilustra que o processo de remodelação com sucesso: (1) desacoplou a expressão de nifA da regulação de nitrogênio endógeno; e (2) melhorou a assimilação e a excreção do nitrogênio fixado.

[00529] Esses micróbios remodelados resultam, em última instância, na melhoria da produtividade do milho, quando aplicados aos cultivos de milho. Ver a FIG. 1N. A plataforma GMR Fornece uma Abordagem para a Fixação e Distribuição de Nitrogênio que Soluciona Preocupações Ambientais Urgentes

[00530] Como explicado anteriormente, o fertilizante de nitrogênio produzido pelo processo industrial Haber-Bosch não é bem utilizado pelo cultivo alvo. A chuva, o escoamento, o calor, a volatilização e o microbioma do solo degradam o fertilizante químico aplicado. Isso equivale não apenas a dinheiro desperdiçado, mas também aumenta a poluição, em vez do rendimento da colheita. Para essa finalidade, as Nações

Unidas calculam que quase 80% do fertilizante são perdidos antes que uma cultura possa utilizá-lo. Consequentemente, a produção e a distribuição de fertilizantes agrícolas modernos não são apenas prejudiciais ao meio ambiente, mas são extremamente ineficientes. Ver a FIG. 1O, ilustrando a ineficiência dos sistemas atuais de dispensação de nitrogênio, que resultam em campos subfertilizados, campos superfertilizados e escoamento de nitrogênio prejudicial ao meio ambiente.

[00531] A plataforma GMR atual e os micróbios remodelados resultantes fornecem uma abordagem melhor para a fixação de nitrogênio e dispensação às plantas. Como será visto nos Exemplos abaixo, os micróbios remodelados não intergenéricos da revelação são capazes de colonizar as raízes de uma planta de milho e alimentar as referidas plantas de milho com nitrogênio atmosférico fixo, mesmo na presença de nitrogênio exógeno. Este sistema de fixação e entrega de nitrogênio - habilitado pela plataforma GMR ensinada - ajudará a transformar a agricultura moderna em um sistema mais ambientalmente sustentável. Exemplo 2: Remodelação Microbiana Guiada - Um Exemplo de Modalidade para a Melhoria Racional da Fixação de Nitrogênio

[00532] Uma diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio pode ser encontrada na natureza, inclusive em solos agrícolas. No entanto, o potencial de um micróbio para fornecer nitrogênio suficiente às culturas para permitir o uso diminuído de fertilizantes pode ser limitado pela repressão dos genes da nitrogenase em solos fertilizados, bem como pela baixa abundância em associação próxima com as raízes das culturas. A identificação, o isolamento e a reprodução de micróbios que se associam intimamente com as principais culturas comerciais podem interromper e melhorar as redes reguladoras que ligam a detecção de nitrogênio e a fixação de nitrogênio e podem desbloquear contribuições significativas de nitrogênio por micróbios associados aos cultivos. Para essa finalidade, foram identificados micróbios fixadores de nitrogênio que se associam e colonizam o sistema radicular do milho. Essa etapa corresponde à “Medir a Composição do Microbioma” representada na FIG. 1A e FIG. 1B.

[00533] Amostras de raízes de plantas de milho cultivadas em solos agronomicamente relevantes foram coletadas e populações microbianas extraídas da rizosfera e da endosfera. O DNA genômico dessas amostras foi extraído, seguido pelo sequenciamento do amplicon 16S para traçar o perfil da composição da comunidade.

[00534] Um micróbio Kosakonia sacchari (cepa PBC6.1) foi isolado e classificado por meio de rRNA 16S e sequenciamento do genoma completo. Esse é um fixador de nitrogênio particularmente interessante, capaz de colonizar a abundância de quase 21% da microbiota associada à raiz (FIG. 2). Para avaliar a sensibilidade da cepa ao nitrogênio exógeno, as taxas de fixação de nitrogênio em cultura pura foram medidas com o ensaio clássico de redução de acetileno (ARA) e níveis variáveis de suplementação de glutamina. As espécies exibiram um alto nível de atividade de fixação de nitrogênio em meios livres de nitrogênio, mas o nitrogênio fixado exógeno reprimiu a expressão gênica nif e a atividade da nitrogenase (Cepa PBC6.1, FIG. 3C, FIG. 3D). Adicionalmente, quando a amônia liberada foi medida no sobrenadante de PBC6.1 cultivado sob condições de fixação de nitrogênio, muito pouca liberação de nitrogênio fixado pode ser detectada (FIG. 3E).

[00535] Nós hipotetizamos que o PBC6.1 poderia ser um contribuidor significativo de nitrogênio fixado em campos fertilizados se as redes reguladoras que controlam o metabolismo do nitrogênio fossem remodeladas para permitir a expressão ótima da nitrogenase e liberação de amônia na presença de nitrogênio fixado.

[00536] Diversidade genética suficiente deve existir no genoma PBC6.1 para permitir uma ampla remodelação fenotípica (como um resultado da remodelação da arquitetura genética subjacente de uma maneira não intergenérica) sem a inserção de transgenes ou elementos reguladores sintéticos. A cepa isolada tem um genoma de pelo menos 5,4 Mbp e um agrupamento de genes de fixação de nitrogênio canônico. As vias de metabolismo de nitrogênio relacionadas em PBC6.1 são similares às do organismo modelo para fixação de nitrogênio, Klebsiella oxytoca m5al.

[00537] Vários nós de rede reguladora de genes foram identificados que podem aumentar a fixação de nitrogênio e subsequente transferência para uma planta hospedeira, particularmente em altas concentrações exógenas de nitrogênio fixado (FIG. 3A). O operon nifLA regula diretamente o resto do agrupamento nif através da ativação transcricional por NifA e repressão dependente de nitrogênio e oxigênio de NifA por NifL. A ruptura de nifL pode abolir a inibição de NifA e melhorar a expressão de nif na presença de oxigênio e nitrogênio fixado exógeno. Além disso, a expressão de nifA sob o controle de um promotor independente de nitrogênio pode desacoplar a biossíntese de nitrogenase da regulação pelo complexo de detecção de nitrogênio NtrB/NtrC.

[00538] A assimilação de nitrogênio fixado pelo micróbio à glutamina pela glutamina sintetase (GS) é reversivelmente regulada pela enzima adenililtransferase (ATase) de dois domínios GlnE através da adenililação e deadenililação de GS para atenuar e restaurar a atividade, respectivamente. O truncamento da proteína GlnE para excluir seu domínio de remoção de adenilil (AR) pode levar à glutamina sintetase constitutivamente adenililada, limitando a assimilação de amônia pelo micróbio e aumentando a amônia intra e extracelular.

[00539] Finalmente, a redução da expressão de AmtB, o transportador responsável pela captação de amônia, pode levar a uma maior amônia extracelular.

[00540] Para gerar fenótipos microbianos racionalmente projetados sem o uso de transgenes, duas abordagens foram empregadas para remodelar a arquitetura genética subjacente do micróbio: (1) criação de eliminações sem marcadores de sequências genômicas que codificam domínios de proteínas ou genes inteiros e (2) religação redes reguladoras por rearranjo de promotores intragenômicos.

[00541] Por meio de um processo de remodelação iterativa, várias cepas derivadas não transgênicas de PBC6.1 foram geradas (Tabela 25). Tabela 25. Lista de cepas de K. sacchari isoladas e derivadas usadas nesse trabalho. Prm, sequência promotora derivada do genoma PBC6.1; ΔglnEAR1 e ΔglnEAR2, diferentes versões truncadas do gene glnE removendo a sequência de domínio de remoção de adenilila. ID de Genótipo cepa PBC6.1 WT PBC6.14 ΔnifL::Prm1 PBC6.15 ΔnifL::Prm5 PBC6.22 ΔnifL::Prm3 PBC6.37 ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR2 PBC6.38 ΔnifL::Prm1 ΔglnEAR1 PBC6.93 ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR2 ΔamtB PBC6.94 ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR1 ΔamtB

[00542] Vários ensaios in vitro foram realizados para caracterizar fenótipos específicos das cepas derivadas. O ARA foi usado para avaliar a sensibilidade da cepa ao nitrogênio exógeno, em que PBC6.1 exibiu repressão da atividade da nitrogenase em altas concentrações de glutamina (FIG. 3D). Em contraste, a maioria das cepas derivadas mostrou um fenótipo desreprimido com níveis variáveis de redução de acetileno observados em altas concentrações de glutamina. As taxas de transcrição de nifA em amostras analisadas por qPCR correlacionaram-se bem com as taxas de redução de acetileno (FIG. 4), apoiando a hipótese de que a ruptura de nifL e a inserção de um promotor independente de nitrogênio para conduzir nifA podem levar à desrepressão do agrupamento nif.

[00543] As cepas com atividade de GlnE ou AmtB alterada mostraram taxas de excreção de amônio marcadamente aumentadas em comparação com cepas de tipo selvagem ou derivadas sem essas mutações (FIG. 3E), ilustrando o efeito desses genótipos na assimilação e recaptação de amônia.

[00544] Dois experimentos foram realizados para estudar a interação de derivados de PBC6.1 (micróbios remodelados) com plantas de milho e quantificar a incorporação de nitrogênio fixado em tecidos vegetais. Primeiramente, as taxas de fixação de nitrogênio microbiano foram quantificadas em um estudo em estufa usando traçadores isotópicos. Resumidamente, as plantas são cultivadas com fertilizante rotulado com 15N e concentrações diluídas de 15N nos tecidos da planta indicam contribuições de nitrogênio fixado de micróbios. Mudas de milho foram inoculadas com cepas microbianas selecionadas e as plantas foram cultivadas até o estágio de crescimento V6. As plantas foram subsequentemente desconstruídas para permitir a medição da colonização microbiana e expressão gênica, bem como a medição das razões 15N/14N em tecidos da planta por espectrometria de massa de razão isotópica (IRMS). A análise do tecido aéreo mostrou uma contribuição pequena e não significativa por PBC6.38 para os níveis de nitrogênio da planta, e uma contribuição significativa por PBC6.94 (p = 0,011). Aproximadamente 20% do nitrogênio encontrado nas folhas de milho acima do solo foram produzidos por PBC6.94, com o restante vindo da semente, mistura de envasamento ou fixação de “fundo” por outros micróbios do solo (FIG. 5C). Isso ilustra que nosso sistema de melhoramento e remodelamento microbiano pode gerar cepas remodeladas capazes de fazer contribuições significativas de nitrogênio às plantas na presença de fertilizante de nitrogênio. A transcrição microbiana dentro dos tecidos da planta foi medida e a expressão do agrupamento do gene nif foi observada em cepas remodeladas derivadas, mas não na cepa de tipo selvagem (FIG. 5B), mostrando a importância da desrepressão de nif para a contribuição de BNF os cultivos sob condições fertilizadas. A colonização da raiz medida por qPCR demonstrou que a densidade de colonização é diferente para cada uma das cepas testadas (FIG. 5A). Uma diferença de 50 vezes na colonização foi observada entre PBC6.38 e PBC6.94. essa diferença pode ser uma indicação de que PBC6.94 reduziu a aptidão na rizosfera em relação a PBC6.38 como resultado de altos níveis de fixação e excreção. Métodos Meios

[00545] O meio mínimo contém (por litro) 25 g de Na2HPO4, 0,1 g de CaCL2-2H2O, 3 g de KH2PO4, 0,25 g de MgSO4·7H2O, 1 g de NaC1, 2,9 mg de FeCl3, 0,25 mg de Na2MoO4·2H2O e 20 g de sacarose. O meio de crescimento é definido como meio mínimo suplementado com 50 ml de glutamina 200 mM por litro. Isolamento de Diazotróficos

[00546] Mudas de milho foram cultivadas a partir de sementes (DKC 66-40, DeKalb, IL) por duas semanas em um ambiente de estufa controlado de 22 °C (noite) a 26 °C (dia) e expostas a ciclos de luz de 16 horas no solo coletado no condado de San Joaquin, CA. As raízes foram colhidas e lavadas com água deionizada estéril para remover o solo em massa. Os tecidos da raiz foram homogeneizados com grânulos de aço inoxidável de 2 mm em um lisador de tecido (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) por três minutos no ambiente 30 e as amostras foram centrifugadas por 1 minuto a 13.000 rpm para separar o tecido das bactérias associadas à raiz. Os sobrenadantes foram divididos em duas frações, e uma foi usada para caracterizar o microbioma por meio do sequenciamento do amplicon de rRNA 16S e a fração restante foi diluída e dividida em placas em meio de caldo isento de nitrogênio (NfB) suplementado com ágar a 1,5%. As placas foram incubadas a 30 °C por 5-7 dias. As colônias que surgiram foram testadas quanto à presença do gene nifH por PCR de colônia com os iniciadores Ueda19f e Ueda406r. O DNA genômico de cepas com um PCR de colônia nifH positivo foi isolado (Mini Kit de DNA QIAamp, Cat N 51306, QIAGEN, Alemanha) e sequenciado (Illumina MiSeq v3, SeqMatic, Fremont, CA). Após a montagem e anotação da sequência, os isolados contendo agrupamentos de genes de fixação de nitrogênio foram utilizados em pesquisas posteriores. Perfilagem de Microbioma de Mudas de Isolamento

[00547] O DNA genômico foi isolado de bactérias associadas à raiz usando o kit de DNA I Genômico ZR-96 (Zymo Research P/N D3011) e os amplicons de rRNA 16S foram gerados usando iniciadores com código de barras nextera direcionados a 799f e 1114r. As bibliotecas de amplicons foram purificadas e sequenciadas com a plataforma Illumina MiSeq v3 (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram classificadas taxonomicamente usando Kraken usando o banco de dados minikraken (FIG. 2). Ensaio de redução de acetileno (ARA)

[00548] Uma versão modificada do Ensaio de Redução de Acetileno foi usada para medir a atividade da nitrogenase sob condições de cultura puras. As cepas foram propagadas a partir de uma única colônia em SOB (RPI, P/N S25040-1000) a 30 °C com agitação a 200 RPM por 24 horas e, em seguida, subcultivadas 1:25 em meio de crescimento e cultivadas aerobicamente por 24 horas (30 °C, 200 RPM). 1 ml da cultura de meio mínimo foi então adicionado a 4 ml de meio mínimo suplementado com glutamina 0 a 10 mM em tubos Hungate herméticos e cultivados anaerobicamente por 4 horas (30 °C, 200 RPM). O espaço livre de 10% foi removido e depois substituído por um volume igual de acetileno por injeção, e a incubação continuou por 1 hora. Subsequentemente, 2 ml de espaço livre foram removidos por meio de uma seringa estanque a gás para quantificação da produção de etileno usando um cromatógrafo de gás Agilent 6850 equipado com um detector por ionização de chama (FID). Ensaio de excreção de amônio

[00549] A excreção de nitrogênio fixado na forma de amônia foi medida usando fermentação descontínua em biorreatores anaeróbicos. As cepas foram propagadas de colônia única em 1 ml/poço de SOB em uma placa DeepWell de 96 poços. A placa foi incubada a 30 °C com agitação a 200 RPM por 24 horas e depois diluída 1:25 em uma nova placa contendo 1 ml/poço de meio de crescimento. As células foram incubadas por 24 horas (30 °C, 200 RPM) e depois diluídas em 1:10 em uma placa nova contendo meio mínimo. A placa foi transferida para uma câmara anaeróbica com uma mistura de gás > 98,5% de nitrogênio, 1,2-1,5% de hidrogênio e <30 ppM de oxigênio e incubada a 1350 RPM, temperatura ambiente por 66-70 horas. A biomassa da cultura inicial foi comparada com a biomassa final medindo a densidade óptica a 590 nm. As células foram então separadas por centrifugação, e o sobrenadante do caldo do reator foi testado para amônia livre usando o kit de Ensaio e Amônia Megazyme (P/N K-AMIAR) normalizado para biomassa em cada momento.

Extração de Microbioma Associado à Raiz

[00550] As raízes foram agitadas suavemente para remover as partículas soltas e os sistemas de raízes foram separados e embebidos em uma solução de estabilização de RNA (Thermo Fisher P/N AM7021) por 30 minutos. As raízes foram então rinsadas brevemente com água deionizada estéril. As amostras foram homogeneizadas usando grânulo batendo com rolamentos de esferas de aço inoxidável de ½ polegada em um lisador de tecido (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) em 2 ml de tampão de lise (Qiagen P/N 79216). A extração do DNA genômico foi realizada com o kit Quick-gDNA ZR-96 (Zymo Research P/N D3010) e a extração do RNA com o kit RNeasy (Qiagen P/N 74104). Ensaio de colonização de raiz

[00551] Quatro dias após o plantio, 1 ml de uma cultura bacteriana durante a noite (aproximadamente 109 de ufc) foi aplicado ao solo acima da semente plantada. As mudas foram fertilizadas três vezes por semana com 25 ml de solução de Hoagland modificada suplementada com nitrato de amônio 0,5 mM. Quatro semanas após o plantio, amostras de raízes foram coletadas e o DNA genômico total (gDNA) foi extraído. A colonização da raiz foi quantificada usando qPCR com iniciadores projetados para amplificar regiões únicas do genoma do tipo selvagem ou da cepa derivada. A eficiência da reação QPCR foi medida usando uma curva padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma alvo. Os dados foram normalizados para cópias do genoma por g de peso fresco usando o peso do tecido e o volume de extração. Para cada experimento, os números de colonização foram comparados com mudas de controle não tratadas.

Estudo do Transcriptoma In Planta

[00552] A perfilagem transcricional de micróbios associados à raiz foi medida em mudas cultivadas e processadas como descrito no Ensaio de Colonização de Raiz. O RNA purificado foi sequenciado usando a plataforma Illumina NextSeq (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram mapeadas para o genoma da cepa inoculada usando bowtie2 usando parâmetros ‘--locais muito-sensíveis’ e uma pontuação de alinhamento mínima de 30. A cobertura em todo o genoma foi calculada usando ferramentas de amostragem. A cobertura diferencial foi normalizada para a expressão gênica de manutenção e visualizada em todo o genoma usando Circos e em todo o agrupamento de genes nif usando DNAplotlib. Adicionalmente, o perfil de transcrição in planta foi quantificado por meio de análise de Nanostring direcionada. O RNA purificado foi processado em um nCounter Sprint (Core Diagnostics, Hayward, CA). Estudo de Diluição de Estufa de 15N

[00553] Um experimento de diluição de fertilizante 15N foi realizado para avaliar a atividade de cepa otimizada na planta. Um meio de plantio contendo N de base mínimo foi preparado usando uma mistura de vermiculita e areia lavada (5 rinsagens em H2O DI). A mistura de areia foi autoclavada por 1 hora a 122 °C e aproximadamente 600 g medidos em vasos de 40 polegadas cúbicas (656 mL), que foram saturados com H2O DI estéril e deixados drenar 24 horas antes do plantio. Sementes de milho (DKC 66-40) foram esterilizadas superficialmente em hipoclorito de sódio a 0,625% por 10 minutos, depois rinsadas cinco vezes em água destilada estéril e plantadas a 1 cm de profundidade. As plantas foram mantidas sob lâmpadas fluorescentes por quatro semanas com duração de 16 horas por dia em temperatura ambiente média de 22 °C (noite) a 26 °C (dia).

[00554] Cinco dias após o plantio, as mudas foram inoculadas com uma suspensão de 1 ml de células embebidas diretamente sobre o coleóptilo emergente. O inoculo foi preparado a partir de 5 mL de culturas durante a noite em SOB, que foram centrifugadas e recolocadas em suspensão duas vezes em 5 mL de PBS para remover SOB residual antes da diluição final para DO de 1,0 (aproximadamente 109 de UFC/mL). As plantas de controle foram tratadas com PBS estéril e cada tratamento foi aplicado a dez plantas replicadas.

[00555] As plantas foram fertilizadas com 25 ml de solução de fertilizante contendo KNO3 2 mM enriquecido com 15N em 5, 9, 14 e 19 dias após o plantio, e a mesma solução sem KNO3 em 7, 12, 16 e 18 dias após plantio. A solução de fertilizante continha (por litro) 3 mmol de CaCl2, 0,5 mmol de KH2PO4, 2 mmol de MgSO4, 17,9 µmol de FeSO4, 2,86 mg de H3BO3, 1,81 mg de MnCl2•4H2O, 0,22 mg de ZnSO4•7H2O, 51 µg de CuSO4•5H2O, 0,12 mg de Na2MoO4•2H2O, e 0,14nmol de NiCl2. Todos os vasos foram regados com H2O DI estéril conforme necessário para manter a umidade do solo consistente sem escoamento.

[00556] Em quatro semanas, as plantas foram colhidas e separadas no nó mais baixo em amostras para gDNA de raiz e extração de RNA e tecido aéreo para IRMS. Os tecidos aéreos foram limpos conforme necessário para remover a areia, colocados inteiros em sacos de papel e secos por pelo menos 72 horas a 60 °C. Uma vez completamente seco, o tecido aéreo total foi homogeneizado por batimento de grânulos e amostras de 5-7 mg foram analisadas por espectrometria de massa por razão de isótopos (IRMS) para 15N pelo Laboratório de Isótopo Estável MBL (The Ecosystems Center, Woods Hole, MA). A porcentagem de NDFA foi calculada usando a seguinte fórmula: % de NDFA = (15N da UTC média - 15N da amostra)/(15N da UTC média) x 100. Exemplo 3: Testes de Campo com Micróbios Remodelados da Revelação - Verão de 2016

[00557] A fim de avaliar a eficácia das cepas remodeladas da presente revelação no crescimento e na produtividade do milho sob vários regimes de nitrogênio, foram conduzidos testes de campo.

[00558] Os testes foram conduzidos com (1) sete subparcelas de seis cepas mais o controle - quatro parcelas principais compreendendo 0, 15, 85 e 100% do retorno máximo ao nitrogênio (MRTN) com verificação local. O controle (apenas UTC) foi conduzido com 10 MRTN 100% mais, 5, 10 ou 15 libras (2,27; 4,54; 6,80 kg). Os tratamentos tiveram quatro repetições.

[00559] Parcelas de milho (mínimo) tinham 4 fileiras de 30 pés (9,14 m) de comprimento, com 124 parcelas por localização. Todas as observações foram feitas nas duas filas centrais das parcelas, e todas as amostras destrutivas foram tiradas das filas externas. As amostras de sementes foram refrigeradas até 1,5 a 2 horas antes do uso.

[00560] Prática agrícola local: A semente era um milho comercial sem tratamento fungicida e inseticida convencional. Todos os tratamentos de sementes foram aplicados por um único especialista em tratamento de sementes para garantir a uniformidade. Data de plantio, taxa de semeadura, controle de ervas daninhas/insetos, etc. foram deixados para as práticas agrícolas locais. Com exceção das aplicações de fungicidas, as práticas de manejo padrão foram seguidas.

[00561] Caracterização do solo: Foram avaliadas a textura e a fertilidade do solo. As amostras de solo foram pré- plantadas para cada repetição para garantir níveis de nitrato residual menores que 50 lbs (22,68 kg)/Ac. Os testemunhos do solo foram retirados de 0 cm a 30 cm. O solo foi ainda caracterizado quanto ao pH, CEC, K e P totais.

[00562] Avaliações: A população inicial de plantas foi avaliada 14 dias após o plantio (DAP)/acre, e foi avaliada posteriormente quanto a: (1) vigor (escala de 1 a 10, com 10 = excelente) 14 DAP & V10; (2) registro de classificações de doenças sempre que os sintomas são evidentes nos gráficos; (3) registrar quaisquer diferenças no alojamento se o alojamento ocorrer nas parcelas; (4) rendimento (Bu/acre), ajustado para umidade padrão pct; (5) peso de teste; e (6) porcentagem de umidade do grão.

[00563] Requisitos de amostragem: O solo foi amostrado em três momentos (antes do início do ensaio, V10-VT, 1 semana pós-colheita). Todos os seis locais e todas as parcelas foram amostradas em 10 gramas por amostra (124 parcelas X 3 momentos X 6 localizações).

[00564] Amostragem de colonização: as amostras de colonização foram coletadas em dois momentos (V10 e VT) para cinco locais e seis momentos (V4, V8, V10, VT, R5 e pós- colheita). As amostras foram coletadas da seguinte forma: (1) de 0% e 100% de MRTN, 60 parcelas por localização; (2) 4 plantas por parcela selecionadas aleatoriamente das linhas externas; (3) 5 gramas de raiz, 8 polegadas de caule e três folhas do topo - ensacadas e identificadas cada uma separadamente - 12/sacas por parcela; (4) cinco localizações (60 parcelas X 2 momentos X 12 sacos/parcela); e uma localização (60 parcelas X 6 momentos X 12 sacos/parcela.

[00565] A determinação do índice de vegetação de diferença normalizada (NDVI) foi feita usando um instrumento Greenseeker em dois momentos (V4 - V6 e VT). Avaliamos cada gráfico em todos as seis localizações (124 gráficos X 2 momentos X 6 locais).

[00566] A análise de raiz foi realizada com Win Rhizo de uma localização que melhor ilustrou a diferenciação do tratamento. Dez plantas por parcela foram amostradas aleatoriamente (5 adjacentes de cada linha externa; as plantas em estágio V3-V4 foram preferidas) e cuidadosamente lavadas para remover o máximo de sujeira razoável. Dez raízes foram colocadas em um saco plástico e rotuladas. Analisado com Análise de Raiz WinRhizo.

[00567] As características do caule foram medidas em todos as seis localizações entre R2 e R5. O diâmetro do caule de dez plantas por parcela na altura de 6” (15,24 cm) foi registrado, assim como o comprimento do primeiro entrenó acima da marca de 6” (15,24 cm). Dez plantas foram monitoradas; cinco plantas consecutivas do centro das duas linhas internas. Seis locais foram avaliados (124 parcelas X 2 medidas X 6 locais).

[00568] Os nitratos de tecido foram analisados em todos as parcelas e em todos as localizações. Um segmento de caule de 8” começando em 6” (15,24 cm) acima do solo quando o milho está entre uma e três semanas após a formação da camada preta; as bainhas das folhas foram removidas. Todos as localizações e parcelas foram avaliadas (6 localizações X 124 parcelas).

[00569] Os seguintes dados meteorológicos foram registrados para todos as localizações, desde o plantio até a colheita: temperaturas máximas e mínimas diárias, temperatura do solo na semeadura, chuva diária mais irrigação (se aplicada) e quaisquer eventos climáticos incomuns, tais como, chuva excessiva, vento, frio ou calor.

[00570] Os dados de rendimento em todos as seis localizações são apresentados na Tabela 26. A taxa de nitrogênio teve um impacto significativo no rendimento, mas as cepas nas taxas de nitrogênio não. No entanto, na taxa de nitrogênio mais baixa, as cepas CI006, CM029 e CI019 numericamente superaram a UTC em 4 a 6 bu/acre. O rendimento também foi aumentado numericamente de 2 a 4 bu/acre pelas cepas CM029, CI019 e CM081 a 15% de MRTN. Tabela 26: Dados de rendimento em todos os seis locais Comprimento Vigor Vigor Diâmetro do do entrenó NDVI NDVI MRTN% YLD (bu) _E _L caule (mm) (pol.) _Veg _Rep 0 143,9 7,0 5,7 18,87 7,18 64,0 70,6 15 165,9 7,2 6,3 19,27 7,28 65,8 72,5 85 196,6 7,1 7,1 20,00 7,31 67,1 74,3 100 197,3 7,2 7,2 20,23 7,37 66,3 72,4 Comprimento Vigor Vigor Diâmetro do NDVI NDVI Cepa YLD (bu) do entrenó _E _L caule (mm) _Veg _Rep (pol.) CI006 (1) 176,6 7,2 6,6 19,56 18,78 66,1 72,3 CM029 (2) 176,5 7,1 6,5 19,54 18,61 65,4 71,9 CM038 (3) 175,5 7,2 6,5 19,58 18,69 65,7 72,8 CI019 (4) 176,0 7,1 6,6 19,51 18,69 65,5 72,9 CM081 (5) 176,2 7,1 6,6 19,57 18,69 65,8 73,1 CM029/CM08 174,3 7,1 6,6 19,83 18,79 66,2 72,5 1 (6) UTC (7) 176,4 7,1 6,6 19,54 18,71 65,9 71,7

Comprimento Vigor Vigor Diâmetro do NDVI NDVI MRTN/Cepa YLD (bu) do entrenó _E _L caule (mm) _Veg _Rep (pol.) 0 1 145,6 7,0 5,6 19,07 7,12 63,5 70,3 0 2 147,0 7,0 5,5 18,74 7,16 64,4 70,4 0 3 143,9 7,0 5,5 18,83 7,37 64,6 70,5 0 4 146,0 6,9 5,7 18,86 7,15 63,4 70,7 0 5 141,7 7,0 5,8 18,82 7,05 63,6 70,9 0 6 142,2 7,2 5,8 19,12 7,09 64,7 69,9 0 7 141,2 7,0 5,8 18,64 7,32 64,0 71,4 15 1 164,2 7,3 6,1 19,09 7,21 66,1 71,5 15 2 167,3 7,2 6,3 19,32 7,29 65,5 72,7 15 3 165,6 7,3 6,3 19,36 7,23 64,8 72,5 15 4 167,9 7,3 6,4 19,31 7,51 66,1 72,3 15 5 169,3 7,2 6,2 19,05 7,32 66,0 72,8 15 6 161,9 7,1 6,3 19,45 7,20 66,2 72,2 15 7 165,1 7,3 6,4 19,30 7,18 66,0 73,3 85 1 199,4 7,3 7,2 19,70 7,32 67,2 74,0 85 2 195,1 7,1 7,2 19,99 7,09 66,5 74,4 85 3 195,0 7,0 7,0 20,05 7,26 67,3 74,6 85 4 195,6 7,2 7,1 20,04 7,29 66,4 74,4 85 5 196,4 7,2 7,0 19,87 7,39 67,3 74,5 85 6 195,1 7,0 6,9 20,35 7,34 67,4 74,4 85 7 199,5 6,9 7,2 19,97 7,48 67,4 74,1 100 1 197,1 7,2 7,3 20,38 7,68 67,5 73,4 100 2 196,5 7,0 7,1 20,11 7,21 65,3 70,2 100 3 197,6 7,5 7,3 20,08 7,42 66,3 73,4 100 4 194,6 7,1 7,1 19,83 7,40 66,1 74,1 100 5 197,4 7,2 7,3 20,53 7,36 66,2 74,3 100 6 198,1 7,2 7,4 20,40 7,16 66,6 73,6 100 7 199,9 7,2 7,2 20,26 7,32 66,2 68,1

[00571] Outra abordagem de análise é apresentada na Tabela 27. A tabela compreende os quatro locais onde a resposta ao nitrogênio foi a maior, o que sugere que o nitrogênio residual disponível foi o mais baixo. Essa abordagem não altera a avaliação de que a taxa de nitrogênio afetou significativamente a produtividade, o que as cepas não afetaram quando calculada a média de todas as taxas de nitrogênio.

No entanto, a vantagem numérica do rendimento na taxa de N mais baixa é mais pronunciada para todas as cepas, particularmente CI006, CM029 e CM029/CM081, onde os rendimentos aumentaram de 8 para 10 bu/acre.

A 15% de MRTN, a cepa CM081 produziu UTC em 5 bu.

Tabela 27: Dados de rendimento em quatro localizações Média de 4 Localizações - SGS, AgIdea, Bennett, RFR YLD Vigor Vigor Diâmetro do caule MRTN% (bu) _E _L (mm) Comprimento do entrenó (pol.) 0 137,8 7,3 5,84 18,10 5,36 15 162,1 7,5 6,63 18,75 5,40 85 199,2 7,4 7,93 19,58 5,62 100 203,5 7,5 8,14 19,83 5,65

YLD Vigor Vigor Diâmetro do caule Cepa (bu) _E _L (mm) Comprimento do entrenó (pol.) CI006 (1) 175,4 7,5 7,08 19,03 5,59 CM029 (2) 176,1 7,4 7,08 19,09 5,39 CM038 (3) 175,3 7,5 7,05 19,01 5,59 CI019 (4) 174,8 7,5 7,16 19,02 5,45 CM081 (5) 176,7 7,4 7,16 19,00 5,53 CM029/CM081 (6) 175,1 7,4 7,17 19,33 5,46 UTC (7) 176,0 7,3 7,27 18,98 5,55

YLD Vigor Vigor Diâmetro do caule MRTN/Cepa (bu) _E _L (mm) Comprimento do entrenó (pol.) 0 1 140,0 7,3 5,69 18,32 5,28 0 2 140,7 7,4 5,69 18,19 5,23 0 3 135,5 7,3 5,63 17,95 5,50 0 4 138,8 7,3 5,81 17,99 5,36 0 5 136,3 7,3 6,06 18,05 5,34 0 6 141,4 7,5 6,00 18,43 5,30 0 7 131,9 7,3 6,00 17,75 5,48

15 1 158,0 7,6 6,44 18,53 5,34 15 2 164,1 7,5 6,56 19,13 5,42 15 3 164,3 7,6 6,63 18,68 5,51 15 4 163,5 7,6 6,81 18,84 5,34 15 5 166,8 7,5 6,63 18,60 5,39 15 6 156,6 7,4 6,56 18,86 5,41 15 7 161,3 7,5 6,81 18,62 5,42

85 1 199,4 7,6 8,00 19,15 5,63 85 2 199,0 7,4 8,09 19,49 5,46

85 3 198,2 7,4 7,75 19,88 5,69 85 4 196,8 7,4 8,00 19,65 5,60 85 5 199,5 7,4 7,75 19,26 5,70 85 6 198,7 7,3 7,81 19,99 5,61 85 7 202,8 7,2 8,13 19,66 5,65 100 1 204,3 7,4 8,19 20,11 6,10 100 2 200,6 7,3 8,00 19,53 5,46 100 3 203,3 7,7 8,19 19,55 5,67 100 4 200,2 7,6 8,00 19,59 5,49 100 5 203,9 7,4 8,19 20,08 5,68 100 6 203,8 7,5 8,31 20,05 5,52 100 7 208,1 7,4 8,13 19,90 5,63

[00572] Os resultados do teste de campo também são ilustrados nas FIGs 9-15. Os resultados indicam que os micróbios da revelação são capazes de aumentar o rendimento da planta, o que aponta para a capacidade dos micróbios ensinados de aumentar a fixação de nitrogênio em uma cultura agrícola importante, isto é, o milho.

[00573] Os resultados baseados em campo validam adicionalmente os métodos revelados de modificação não intergenericamente do genoma de cepas microbianas selecionadas, a fim de trazer resultados agrícolas relevantes em um ambiente de campo ao aplicar as referidas cepas manipuladas a um cultivo.

[00574] FIG. 6 representa a linhagem de cepas remodeladas modificadas que foram derivadas da cepa CI006 (Kosakonia sacchari WT). Os dados de campo demonstram que um derivado manipulado geneticamente da cepa CI006 WT, isto é, CM029, é capaz de produzir resultados numericamente relevantes em um ambiente de campo. Por exemplo, a Tabela 26 ilustra que a 0% de MRTN CM029 rendeu 147,0 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 141,2 bu/acre (um aumento de 5,8 bu/acre). A Tabela 26 também ilustra que a 15% de MRTN CM029 rendeu 167,3 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 165,1 bu/acre (um aumento de 2,2 bu/acre). A Tabela 27 apoia essas conclusões e ilustra que a 0% de MRTN CM029 rendeu 140,7 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 8,8 bu/acre). A Tabela 27 também ilustra que a 15% de MRTN CM029 rendeu 164,1 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 161,3 bu/acre (um aumento de 2,8 bu/acre).

[00575] A FIG. 7 representa a linhagem de cepas remodeladas modificadas que foram derivadas da cepa CI019 (Rahnella aquatilis WT). Os dados de campo demonstram que um derivado manipulado geneticamente da cepa CI019 WT, isto é, CM081, é capaz de produzir resultados numericamente relevantes em um ambiente de campo. Por exemplo, a Tabela 26 ilustra que a 15% e MRTN CM081 rendeu 169,3 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 165,1 bu/acre (um aumento de 4,2 bu/acre). A Tabela 27 apoia essas conclusões e ilustra que a 0% MRTN CM081 rendeu 136,3 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 4,4 bu/acre). A Tabela 27 também ilustra que a 15% de MRTN CM081 rendeu 166,8 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 161,3 bu/acre (um aumento de 5,5 bu/acre).

[00576] Além disso, pode ser visto na Tabela 27 que a combinação de CM029/CM081 a 0% MRTN de rendeu 141,4 bu/acre em comparação com o controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 9,5 bu/acre). Exemplo 4: Testes de Campo com Micróbios Remodelados da Revelação - Verão de 2017

[00577] A fim de avaliar a eficácia das cepas remodeladas da presente revelação no crescimento e na produtividade do milho sob vários regimes de nitrogênio, testes de campo foram conduzidos. Os dados de campo abaixo demonstram que os micróbios não intergenéricos da revelação são capazes de fixar o nitrogênio atmosférico e dispensar o referido nitrogênio a uma planta - resultando em rendimentos aumentados - tanto em um ambiente limitante de nitrogênio, quanto em um ambiente não limitante de nitrogênio.

[00578] Os testes foram conduzidos em sete localizações nos Estados Unidos, com seis localizações geograficamente diversas no meio-oeste. Cinco regimes de nitrogênio foram usados para tratamentos de fertilizantes: 100% da prática agrícola padrão do local/região, 100% menos 25 libras (11,34 kg), 100% menos 50 libras (22,68 kg), 100% menos 75 libras (34,02 kg) e 0%; tudo por acre. As libras de nitrogênio por acre para o regime de 100% dependiam das práticas agrícolas padrão do local/região. Os regimes de nitrogênio mencionados acima variaram de cerca de 153 libras (69,39 kg) por acre a cerca de 180 libras por acre, com uma média de cerca de 164 libras (74,39 kg) de nitrogênio por acre.

[00579] Em cada regime de fertilizante, havia 14 tratamentos. Cada regime teve seis repetições e foi utilizado um desenho de parcela subdividida. Os 14 tratamentos incluíram: 12 micróbios diferentes, 1 UTC com a mesma taxa de fertilizante da parcela principal e 1 UTC com 100% de nitrogênio. No regime de nitrogênio 100%, o segundo UTC é 100 mais 25 libras (11,34 kg).

[00580] Parcelas de milho, no mínimo, tinham 4 linhas de 30 pés de comprimento (30 polegadas (0,76 m) entre linhas) com 420 parcelas por localização. Todas as observações, salvo indicação em contrário, foram tiradas das duas filas centrais das plantas, e todas as amostras destrutivas foram tiradas das filas externas. As amostras de sementes foram refrigeradas até 1,5 a 2 horas antes do uso.

[00581] Prática agrícola local: A semente era um milho comercial aplicado com um tratamento de semente comercial sem coaplicação biológica. A taxa de semeadura, data de plantio, controle de ervas daninhas/insetos, épocas de colheita e outras práticas de controle padrão foram deixadas para as normas de práticas agrícolas locais para as regiões, com exceção da aplicação de fungicida (se necessário).

[00582] Aplicação de micróbios: Os micróbios foram aplicados à semente em um tratamento de sementes sobre sementes que já haviam recebido um tratamento químico normal. As sementes foram revestidas com caldo de fermentação contendo os micróbios.

[00583] Caracterização do solo: Foram avaliadas a textura e a fertilidade do solo. Foram utilizados procedimentos de amostragem de solo padrão, que incluíram testemunhos de solo com profundidades de 0-30 cm e 30-60 cm. A amostragem de solo padrão incluiu uma determinação de nitrato de nitrato, nitrogênio de amônio, nitrogênio total, matéria orgânica e CEC. A amostragem padrão do solo também incluiu uma determinação de pH, potássio total e fósforo total. Para determinar os níveis de fertilizante de nitrogênio, amostras de solo pré-plantio de cada localização foram coletadas para garantir que as regiões de solo de 0-12” e potencialmente de 12” a 24” para nitrato de nitrogênio.

[00584] Antes do plantio e fertilização, amostras de 2ml de solo foram coletadas de 0 a 6-12” do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da linha. (5 regimes de fertilizantes x 6 repetições = trinta amostras de solo).

[00585] Após o plantio (V4-V6), amostras de 2ml de solo foram coletadas de 0 a 6-12” do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da linha. (5 regimes de fertilizantes x 6 repetições = trinta amostras de solo).

[00586] Após a colheita (V4-V6), amostras de solo de 2ml foram coletadas de 0 a 6-12” do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da linha. Amostra de solo pós-colheita adicional coletada em 0-12” do UTC e potencialmente 12-24” do UTC (5 regimes de fertilizantes x 6 repetições = trinta amostras de solo).

[00587] Uma amostra de solo V6-V10 de cada regime de fertilizante (excluindo o tratamento de 100% e 100% + 25 lb (11,34 kg) [no bloco de 100%] para todos os regimes de fertilizante em 0-12” e 12-24”. (5 regimes de fertilizantes x 2 profundidades = 10 amostras por localização).

[00588] Amostra de solo pós-colheita de cada regime de fertilizante (excluindo o tratamento de 100% e 100% + 25 lb (11,34 kg) [no bloco de 100%] para todos os regimes de fertilizante em 0-12” e 12-24”. (5 regimes de fertilizantes x 2 profundidades = 10 amostras por localização).

[00589] Avaliações: A população de planta inicial foi avaliada em ~ 50% UTC e a população de planta final foi avaliada antes da colheita. A avaliação incluiu (1) potencialmente temperatura (sonda de temperatura); (2) vigor (escala de 1-10 com 10 = excelente) em V4 e V8-V10; (3) altura da planta em V8-V10 e V14; (4) rendimento (bushels/acre) ajustado à porcentagem de umidade padrão; (5)

peso de teste; (6) porcentagem de umidade do grão; (7) testes de nitrato de caule na camada preta (420 parcelas x 7 localizações); (8) colonização com 1 planta por parcela em saco zip lock a 0% e 100% de fertilizante em V4-V6 (1 planta x 14 tratamentos x 6 repetições x 2 regimes de fertilizante = 168 plantas); (9) transcriptômica com 1 planta por parcela em saco zip lock a 0% e 100% de fertilizante em V4-V6 (1 planta x 14 tratamentos x 6 repetições x 2 regimes de fertilizante = 168 plantas); (10) Determinação do índice vegetativo de diferença normalizada (NDVI) ou borda vermelha de diferença normalizada (NDRE) usando um instrumento Greenseeker em dois momentos (V4-V6 e VT) para avaliar cada parcela em todos as 7 localizações (420 parcelas x 2 momentos x 7 localizações = 5.880 pontos de dados); (11) características do caule medidas em todos os 7 locais entre R2 e R5, registrando o diâmetro do caule de 10 plantas/parcela a 6” (15,24 cm) de altura, registrar o comprimento do primeiro entrenó acima da marca de 6” (15,24 cm), 10 plantas monitoradas (5 plantas consecutivas do centro de duas linhas internas) (420 plotagens x 10 plantas x 7 localizações = 29.400 pontos de dados).

[00590] Cronograma de monitoramento: Os médicos visitaram todos os ensaios no estágio V3-V4 para avaliar a resposta no início da temporada aos tratamentos e durante o estágio de crescimento reprodutivo para monitorar a maturidade. O cooperador local visitou o teste de pesquisa em uma base contínua.

[00591] Informações meteorológicas: Os dados meteorológicos abrangendo desde o plantio até a colheita foram coletados e consistiram em temperaturas mínimas e máximas diárias, temperatura do solo na semeadura, chuva diária mais irrigação (se aplicada) e eventos climáticos incomuns, tais como, vento excessivo, chuva, frio, calor.

[00592] Relatório de Dados: Incluindo os dados indicados acima, os testes de campo geraram pontos de dados incluindo texturas de solo; espaçamento entre linhas; tamanhos de parcela; irrigação; lavoura; cultivo anterior; taxa de semeadura; população de plantas; insumos de fertilizantes sazonais, incluindo fonte, taxa, momento e colocação; dimensões da área de colheita, método de colheita, tal como manual ou por máquina e por ferramentas de medição usadas (escalas, monitor de rendimento, etc.).

[00593] Resultados: Os resultados selecionados do ensaio de campo acima mencionado são relatados nas FIG. 16 e FIG.

17.

[00594] Na FIG. 16, pode ser visto que um micróbio remodelado da revelação (ou seja, 6-403) resultou em um rendimento mais alto do que a cepa de tipo selvagem (WT) e um rendimento mais alto do que o controle não tratado (UTC). O tratamento de “-25 lb (11,34 kg) de N” utiliza 25 libras (11,34 kg) a menos de N por acre do que as práticas agrícolas padrão da região. O tratamento de UTC “100% de N” destina- se a representar as práticas agrícolas padrão da região, em que 100% da utilização padrão de N é implantada pelo agricultor. O micróbio “6-403” foi depositado como NCMA 201708004 e pode ser encontrado na Tabela 1. Esse é um Kosakonia sacchari mutante (também chamado de CM037) e é uma cepa de progênie mutante de CI006 WT.

[00595] Na FIG. 17, os resultados de rendimento obtidos demonstram que os micróbios remodelados da revelação têm um desempenho consistente em todos as localizações. Além disso, os resultados de rendimento demonstram que os micróbios da revelação têm um bom desempenho tanto em um ambiente estressado por nitrogênio (isto é, um ambiente limitante de nitrogênio), bem como em um ambiente que tem suprimentos suficientes de nitrogênio (isto é, uma condição não limitante de nitrogênio). O micróbio “6-881” (também conhecido como CM094, PBC6.94), e que é uma cepa de Kosakonia sacchari mutante de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1034”, que é uma cepa de Klebsiella variicola mutante de progênie de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712001 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1036”, que é uma cepa de Klebsiella variicola mutante de progênie de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “6-404” (também conhecido como CM38, PBC6.38), e que é uma cepa de Kosakonia sacchari mutante de progênie de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708003 e pode ser encontrado na Tabela 1. Exemplo 5: Gênero de Micróbios Remodelados Não Intergenéricos Benéficos para Sistemas Agrícolas

[00596] Os micróbios remodelados da presente revelação foram avaliados e comparados uns com os outros para a produção de nitrogênio produzido em um acre durante uma temporada. Ver a FIG. 8, FIG. 24 e FIG. 25.

[00597] É a hipótese dos inventores que, para que uma população de micróbios não intergenéricos manipulados geneticamente seja benéfica em um sistema moderno de cultivo em linha, a população de micróbios precisa produzir pelo menos uma libra (0,45 kg) ou mais de nitrogênio por acre por temporada.

[00598] Para essa finalidade, verificou-se surpreendentemente um gênero funcional de micróbios que são capazes de contribuir, inter alia, para: aumentar os rendimentos em colheitas não leguminosas; e/ou diminuir a dependência de um agricultor sobre a aplicação de nitrogênio exógeno; e/ou a capacidade de produzir pelo menos uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre por temporada, mesmo em ambientes não limitantes de nitrogênio, o referido gênero sendo definido pelo produto da capacidade de colonização × mmol de N produzido por micróbio por hora (isto é, a linha dividindo as FIGs. 8, 24 e 25).

[00599] Em relação às FIGs. 8, 24 e 25, certos dados que utilizam micróbios da revelação foram agregados, a fim de representar um mapa de calor das libras de nitrogênio dispensadas por acre na estação por micróbios da revelação, que são registrados como uma função de micróbios por g de peso fresco em mmol de nitrogênio/micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta as imagens maiores estão os micróbios que fornecem menos de uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre na estação, e acima da linha estão os micróbios que fornecem mais de uma libra (0,45 kg) de nitrogênio por acre na estação.

[00600] Dados de campo e Mapa de Calor de Colonização de Tipo Selvagem: Os micróbios utilizados na FIG. 8 mapas de calor foram testados para a produção de N no milho. Para as cepas WT CI006 e CI019, os dados de colonização da raiz do milho foram retirados de um único local de campo. Para as cepas restantes, a colonização foi considerada igual ao nível do campo WT. A atividade de fixação de N foi determinada usando um ensaio ARA in vitro a glutamina 5 mM. A tabela abaixo do mapa de calor na FIG. 8 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio h) junto com o UFC preciso por grama de peso fresco (UFC/g de pf) para cada micróbio mostrado no mapa de calor.

[00601] Mapa de calor de dados de campo: Os dados utilizados na FIG. O mapa de calor 24 é derivado de cepas microbianas testadas para produção de N no milho sob condições de campo. Cada ponto representa lb de N/acre produzido por um micróbio usando dados de colonização de raiz de milho de um único local de campo. A atividade de fixação de N foi determinada usando o ensaio ARA in vitro a 5mM de N na forma de glutamina ou fosfato de amônio. A Tabela 28 abaixo dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio h) juntamente com o UFC preciso por grama de peso fresco (UFC/g de pf) para cada micróbio mostrado no mapa de calor da FIG. 24.

[00602] Mapa de Calor de Dados de Estufa e Laboratório: Os dados utilizados na FIG. 25 o mapa de calor é derivado de cepas microbianas testadas para produção de N no milho sob condições de laboratório e estufa. Cada ponto representa lb de N/acre produzido por uma única cepa. Os pontos brancos representam cepas nas quais os dados de colonização da raiz do milho foram coletados em estufa. Os pontos pretos representam cepas mutantes para as quais os níveis de colonização de raiz de milho são derivados dos níveis médios de colonização de raiz de milho da cepa original de tipo selvagem. Os pontos tracejados representam as cepas parentais de tipo selvagem em seus níveis médios de colonização de raiz de milho de campo. Em todos os casos, a atividade de fixação de N foi determinada por ensaio ARA in vitro a 5 mM de N na forma de glutamina ou fosfato de amônio. A Tabela 29 abaixo fornece o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio h) juntamente com o UFC preciso por grama de peso fresco (UFC/g de pf) para cada micróbio mostrado no mapa de calor da Fig.

25. Tabela 28: FIG. 24 - Mapa de Calor de Dados de Campo Atividade (mmol de Pico de N/Micróbio colonização Estação de N Designação Nome da cepa hora) (UFC/g de pf) Produzido/acre Taxonômica CI006 3,88E-16 1,50E+07 0,24 Kosakonia sacchari 6-404 1,61E-13 3,50E+05 2,28 Kosakonia sacchari 6-848 1,80E-13 2,70E+05 1,97 Kosakonia sacchari 6-881 1,58E-13 5,00E+05 3,20 Kosakonia sacchari 6-412 4,80E-14 1,30E+06 2,53 Kosakonia sacchari 6-403 1,90E-13 1,30E+06 10,00 Kosakonia sacchari CI019 5,33E-17 2,40E+06 0,01 Rahnella aquatilis 19-806 6,65E-14 2,90E+06 7,80 Rahnella aquatilis 19-750 8,90E-14 2,60E+05 0,94 Rahnella aquatilis 19-804 1,72E-14 4,10E+05 0,29 Rahnella aquatilis CI137 3,24E-15 6,50E+06 0,85 Klebsiella variicola 137-1034 1,16E-14 6,30E+06 2,96 Klebsiella variicola 137-1036 3,47E-13 1,30E+07 182,56 Klebsiella variicola 137-1314 1,70E-13 1,99E+04 0,14 Klebsiella variicola 137-1329 1,65E-13 7,25E+04 0,48 Klebsiella variicola 63 3,60E-17 3,11E+05 0,00 Rahnella aquatilis 63-1146 1,90E-14 5,10E+05 0,39 Rahnella aquatilis 1021 1,77E-14 2,69E+07 19,25 Kosakonia pseudosacchari 728 5,56E-14 1445240,09 3,25 Klebsiella variicola Tabela 29: FIG. 25 - Mapa de Calor de Dados de Estufa e Laboratório Atividade (mmol de Pico de Nome da N/Micróbio colonização Temporada de N cepa hora) (UFC/g de pf) Produzido/acre Designação Taxonômica CI006 3,88E-16 1,50E+07 0,24 Kosakonia sacchari 6-400 2,72E-13 1,79E+05 1,97 Kosakonia sacchari 6-397 1,14E-14 1,79E+05 0,08 Kosakonia sacchari

Atividade (mmol de Pico de Nome da N/Micróbio colonização Temporada de N cepa hora) (UFC/g de pf) Produzido/acre Designação Taxonômica CI137 3,24E-15 6,50E+06 0,85 Klebsiella variicola 137-1586 1,10E-13 1,82E+06 8,10 Klebsiella variicola 137-1382 4,81E-12 1,82E+06 354,60 Klebsiella variicola 1021 1,77E-14 2,69E+07 19,25 Kosakonia pseudosacchari 1021-1615 1,20E-13 2,69E+07 130,75 Kosakonia pseudosacchari 1021-1619 3,93E-14 2,69E+07 42,86 Kosakonia pseudosacchari 1021-1612 1,20E-13 2,69E+07 130,75 Kosakonia pseudosacchari 1021-1623 4,73E-17 2,69E+07 0,05 Kosakonia pseudosacchari 1293 5,44E-17 8,70E+08 1,92 Azospirillum lipoferum 1116 1,05E-14 1,37E+07 5,79 Enterobacter sp, 1113 8,05E-15 4,13E+07 13,45 Enterobacter sp, 910 1,19E-13 1,34E+06 6,46 Kluyvera intermedia 910-1246 2,16E-13 1,34E+06 11,69 Kluyvera intermedia 850 7,2301E-16 1,17E+06 0,03 Achromobacter spiritinus 852 5,96E-16 1,07E+06 0,03 Achromobacter marplatensis 853 6,42E-16 2,55E+06 0,07 Microbacterium murale

[00603] Conclusões: Os dados nas FIGs. 8, 24, 25 e as Tabelas 28 e 29 ilustram mais de uma dúzia de membros representativos do gênero descrito (isto é, micróbios à direita da linha nas figuras). Além disso, esses numerosos membros representativos vêm de uma matriz diversificada de gêneros taxonômicos, que podem ser encontrados nas Tabelas 28 e 29. Além disso, verificou-se que vários atributos genéticos que representam uma relação estrutura/função que é encontrada em muitos dos os micróbios. Essas relações genéticas podem ser encontradas nas numerosas tabelas da revelação que estabelecem as modificações genéticas introduzidas pelos inventores, que incluem a introdução de pelo menos uma variação genética em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificante, da rede reguladora genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[00604] Consequentemente, o gênero recém-descoberto é apoiado por: (1) um conjunto de dados robusto, (2) mais de uma dúzia de membros representativos, (3) membros de diversos gêneros taxonômicos e (4) classes de modificações genéticas que definem uma relação estrutura/função, na arquitetura genética subjacente dos membros do gênero. Exemplo 6: Métodos e Ensaios para Detecção de Micróbios Remodelados Não Intergenéricos

[00605] A presente revelação ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detectar os micróbios utilizados nos vários Exemplos acima mencionados. Os ensaios são capazes de detectar as sequências de “junção” de nucleotídeos não naturais nos micróbios remodelados não intergenéricos derivados/mutantes. Essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que indica a presença de uma alteração genética específica em um micróbio.

[00606] As presentes técnicas são capazes de detectar essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos de PCR quantitativos especializados, incluindo iniciadores e sondas concebidos exclusivamente. As sondas podem se ligar às sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural. Ou seja, podem ser usadas sondas de DNA específicas para sequências que consistem em oligonucleotídeos rotulados com um repórter fluorescente, que permite a detecção apenas após a hibridação da sonda com a sua sequência complementar. Os métodos quantitativos podem garantir que apenas a junção de nucleotídeos de ocorrência não natural será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Outro aspecto do método é escolher iniciadores de modo que os iniciadores flanqueiem ambos os lados de uma sequência de junção, de modo que se ocorrer uma reação de amplificação, então a referida sequência de junção estará presente.

[00607] Consequentemente, o DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da revelação usando qPCR. Os iniciadores utilizados na reação qPCR podem ser iniciadores projetados por Primer Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma de tipo selvagem ou regiões únicas de cepas mutantes intergenéricas. A reação qPCR pode ser realizada usando o kit Universal SYBR GreenER qPCR SuperMix (Thermo Fisher P/N 11762100), usando apenas iniciadores de amplificação direta e reversa; alternativamente, o kit Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan contendo um rótulo de corante FAM na extremidade 5’, um extintor ZEN interno e um ligante de sulco menor e supressor extintor na extremidade 3’ (Tecnologias Integradas de DNA).

[00608] Determinados, iniciador, sonda e sequências de junção não nativas - que podem ser usados nos métodos qPCR - estão listados na Tabela 30. Especificamente, as sequências de junção não nativas podem ser encontradas em SEQ ID NOs: 372- 405 e 425-430.

Tabela 30: Detecção Microbiana Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ 1021 ds1131 Acima 304 TGGTGTCCGGGCGAACGTCG 338 TTCTTGGTTCTCTGGAGCG 372 5'- gene nifL N/A N/A N/A CCAGGTGGCACAAATTGTCA CTTTATCGGCATCCTGACT TGGTGTCCGGGCGAACGTCG rompido/Pi GAACTACGACACGACTAACC GAAGAATTTGCAGGCTTCT CCAGGTGGCACAAATTGTCA nfC

GACCGCAGGAGTGTGCGATG TCCCAACCTGGCTTGCACC GAACTACGACACGACTAACC ACCCTGAATATGATGATGGA CGTGCAGGTAGTTGTGATG GACCGCAGGAGTGTGCGATG AACAT ACCCTGAATATGATGATGGA /TTCTTGGTTCTCTGGAGCG CTTTATCGGCATCCTGACTG AAGAATTTGCAGGCTTCTTC CCAACCTGGCTTGCACCCGT

GCAGGTAGTTGTGATGAACA T-3' 1021 ds1131 Abaixo 305 CGGAAAACGAGTTCAAACGG 339 GCGATAGAACTCACTTCAC 373 5'- PinfC/gene N/A N/A N/A CGCGTCCCAATCGTATTAAT GCCCCGAAGGGGGAAGCTG CGGAAAACGAGTTCAAACGG nifL GGCGAGATTCGCGCCACGGA CCTGACCCTACGATTCCCG CGCGTCCCAATCGTATTAAT rompido

AGTTCGCTTAACAGGTCTGG CTATTTCATTCACTGACCG GGCGAGATTCGCGCCACGGA AAGGCGAGCAGCTTGGTATT GAGGTTCAAAATGACCCAG AGTTCGCTTAACAGGTCTGG CGAAC AAGGCGAGCAGCTTGGTATT /GCGATAGAACTCACTTCAC GCCCCGAAGGGGGAAGCTGC CTGACCCTACGATTCCCGCT ATTTCATTCACTGACCGGAG

GTTCAAAATGACCCAGCGAA C-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ 1021 ds1133 N/A 306 CGCCAGAGAGTTGAAATCGA 340 TCCCTGTGCGCCGCGTCGC 374 5'- UTR 5’ e N/A N/A N/A ACATTTCCGTAATACCGCCA CGATGGTGGCCAGCCAACT CGCCAGAGAGTTGAAATCGA ATG/gene TTACCCAGGAGCCGTTCTGG GGCGCGCTACCCGATCCTG ACATTTCCGTAATACCGCCA glnE TTGCACAGCGGAAAACGTTA CTCGATGAACTGCTCGACC TTACCCAGGAGCCGTTCTGG truncado

ACGAAAGGATATTTCGCATG CGAACACGCTCTATCAACC TTGCACAGCGGAAAACGTTA GACGG ACGAAAGGATATTTCGCATG /TCCCTGTGCGCCGCGTCGC CGATGGTGGCCAGCCAACTG GCGCGCTACCCGATCCTGCT CGATGAACTGCTCGACCCGA

ACACGCTCTATCAACCGACG G-3' 1021 ds1145 acima 307 CGGGCGAACGTCGCCAGGTG 341 CGTTCTGTAATAATAACCG 375 5'- gene nifL N/A N/A N/A GCACAAATTGTCAGAACTAC GACAATTCGGACTGATTAA CGGGCGAACGTCGCCAGGTG rompido/Pr GACACGACTAACCGACCGCA AAAAGCGCCCTCGCGGCGC GCACAAATTGTCAGAACTAC m1

GGAGTGTGCGATGACCCTGA TTTTTTTATATTCTCGACT GACACGACTAACCGACCGCA ATATGATGATGGATGCCAGC CCATTTAAAATAAAAAATC GGAGTGTGCGATGACCCTGA CAATC ATATGATGATGGATGCCAGC /CGTTCTGTAATAATAACCG GACAATTCGGACTGATTAAA AAAGCGCCCTCGCGGCGCTT TTTTTATATTCTCGACTCCA

TTTAAAATAAAAAATCCAAT C-3' 1021 ds1145 abaixo 308 TCAACCTAAAAAAGTTTGTG 342 AACTCACTTCACGCCCCGA 376 5'- Prm1/gene N/A N/A N/A TAATACTTGTAACGCTACAT AGGGGGAAGCTGCCTGACC TCAACCTAAAAAAGTTTGTG nifL GGAGATTAACTCAATCTAGA CTACGATTCCCGCTATTTC TAATACTTGTAACGCTACAT rompido

GGGTATTAATAATGAATCGT ATTCACTGACCGGAGGTTC GGAGATTAACTCAATCTAGA ACTAAACTGGTACTGGGCGC AAAATGACCCAGCGAACCG GGGTATTAATAATGAATCGT AGTCG ACTAAACTGGTACTGGGCGC /AACTCACTTCACGCCCCGA AGGGGGAAGCTGCCTGACCC TACGATTCCCGCTATTTCAT TCACTGACCGGAGGTTCAAA

ATGACCCAGCGAACCGAGTC G-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ 1021 ds1148 acima 309 CGGGCGAACGTCGCCAGGTG 343 CGCGTCAGGTTGAACGTAA 377 5'- gene nifL N/A N/A N/A GCACAAATTGTCAGAACTAC AAAAGTCGGTCTGCGCAAA CGGGCGAACGTCGCCAGGTG rompido/ GACACGACTAACCGACCGCA GCACGTCGTCGTCCGCAGT GCACAAATTGTCAGAACTAC Prm7

GGAGTGTGCGATGACCCTGA TCTCCAAACGTTAATTGGT GACACGACTAACCGACCGCA ATATGATGATGGATGCCAGC TTCTGCTTCGGCAGAACGA GGAGTGTGCGATGACCCTGA TTGGC ATATGATGATGGATGCCAGC /CGCGTCAGGTTGAACGTAA AAAAGTCGGTCTGCGCAAAG CACGTCGTCGTCCGCAGTTC TCCAAACGTTAATTGGTTTC

TGCTTCGGCAGAACGATTGG C-3' 1021 ds1148 abaixo 310 AATTTTCTGCCCAAATGGCT 344 AACTCACTTCACGCCCCGA 378 5'- Prm4/gene N/A N/A N/A GGGATTGTTCATTTTTTGTT AGGGGGAAGCTGCCTGACC AATTTTCTGCCCAAATGGCT nifL TGCCTTACAACGAGAGTGAC CTACGATTCCCGCTATTTC GGGATTGTTCATTTTTTGTT rompido

AGTACGCGCGGGTAGTTAAC ATTCACTGACCGGAGGTTC TGCCTTACAACGAGAGTGAC TCAACATCTGACCGGTCGAT AAAATGACCCAGCGAACCG AGTACGCGCGGGTAGTTAAC AGTCG TCAACATCTGACCGGTCGAT /AACTCACTTCACGCCCCGA AGGGGGAAGCTGCCTGACCC TACGATTCCCGCTATTTCAT TCACTGACCGGAGGTTCAAA

ATGACCCAGCGAACCGAGTC G-3' CI006 ds126 N/A 311 GTAACCAATAAAGGCCACCA 345 CCGATCCCCATCACTGTGT 379 5'- UTR 5’ até N/A N/A N/A CGCCAGACCACACGATAGTG GTCTTGTATTACAGTGCCG GTAACCAATAAAGGCCACCA ATG-4bp de ATGGCAACACTTTCCAGCTG CTTCGTCGGCTTCGCCGGT CGCCAGACCACACGATAGTG gene CACCAGCACCTGATGGCCCA ACGAATACGAATGACGCGT ATGGCAACACTTTCCAGCTG amtB/gene TGGTCACACCTTCAGCGAAA TGCAGCTCAGCAACGAAAA CACCAGCACCTGATGGCCCA amtB TTTTG TGGTCACACCTTCAGCGAAA rompido /CCGATCCCCATCACTGTGT

GTCTTGTATTACAGTGCCGC TTCGTCGGCTTCGCCGGTAC GAATACGAATGACGCGTTGC

AGCTCAGCAACGAAAATTTT G-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ CI019 ds172 abaixo 312 TGGTATTGTCAGTCTGAATG 346 CCGTCTCTGAAGCTCTCGG 380 5'- Prm1.2/ SEQ ID SEQ ID N/A AAGCTCTTGAAAAAGCTGAG TGAACATTGTTGCGAGGCA TGGTATTGTCAGTCTGAATG gene nifL NO: 406 NO: 407 GAAGCGGGCGTCGATTTAGT GGATGCGAGCTGGTTGTGT AAGCTCTTGAAAAAGCTGAG rompido CAAGAA TGCCTCG

AGAAATCAGTCCGAATGCCG TTTGACATTACCGATAATG GAAGCGGGCGTCGATTTAGT GTTCGC CAACAAT AGCCGCCAGTTTGTCGAATC TGCCGCGTGAACGGGTGCG AGAAATCAGTCCGAATGCCG CTCACA GTTCAC TTATG AGCCGCCAGTTTGTCGAATC GG /CCGTCTCTGAAGCTCTCGG TGAACATTGTTGCGAGGCAG GATGCGAGCTGGTTGTGTTT TGACATTACCGATAATGTGC

CGCGTGAACGGGTGCGTTAT G-3' CI019 ds172 acima 313 ACCGATCCGCAGGCGCGCAT 347 TGAACATCACTGATGCACA 381 5'- gene nifL N/A N/A N/A TTGTTATGCCAATCCGGCAT AGCTACCTATGTCGAAGAA ACCGATCCGCAGGCGCGCAT rompido/ TCTGCCGCCAGACGGGTTTT TTAACTAAAAAACTGCAAG TTGTTATGCCAATCCGGCAT Prm1.2

GCACTTGAGACACTTTTGGG ATGCAGGCATTCGCGTTAA TCTGCCGCCAGACGGGTTTT CGAGAACCACCGTCTGCTGG AGCCGACTTGAGAAATGAG GCACTTGAGACACTTTTGGG AAGAT CGAGAACCACCGTCTGCTGG /TGAACATCACTGATGCACA AGCTACCTATGTCGAAGAAT TAACTAAAAAACTGCAAGAT GCAGGCATTCGCGTTAAAGC

CGACTTGAGAAATGAGAAGA T-3' CI019 ds175 abaixo 314 CGGGAACCGGTGTTATAATG 348 CCGTCTCTGAAGCTCTCGG 382 5'- Prm3.1/ SEQ ID SEQ ID SEQ ID CCGCGCCCTCATATTGTGGG TGAACATTGTTGCGAGGCA CGGGAACCGGTGTTATAATG gene nifL NO: 408 NO: 409 NO: GATTTCTTAATGACCTATCC GGATGCGAGCTGGTTGTGT CCGCGCCCTCATATTGTGGG rompido CGCCCT GGCATAA 410 TGGGTCCTAAAGTTGTAGTT TTTGACATTACCGATAATG GATTTCTTAATGACCTATCC CATATT CGCACCC /56- GACATTAGCGGAGCACTAAC TGCCGCGTGAACGGGTGCG TGGGTCCTAAAGTTGTAGTT GTGGGG GTTCA FAM/TA

TTATG GACATTAGCGGAGCACTAAC AT ACC /CCGTCTCTGAAGCTCTCGG CGT TGAACATTGTTGCGAGGCAG C/ZEN/ GATGCGAGCTGGTTGTGTTT T CTG TGACATTACCGATAATGTGC AAG

CGCGTGAACGGGTGCGTTAT CTC G-3' TCG GT/3IA BkFQ/

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ CI019 ds175 acima 315 ACCGATCCGCAGGCGCGCAT 349 TACAGTAGCGCCTCTCAAA 383 5'- gene nifL N/A N/A N/A TTGTTATGCCAATCCGGCAT AATAGATAAACGGCTCATG ACCGATCCGCAGGCGCGCAT rompido/ TCTGCCGCCAGACGGGTTTT TACGTGGGCCGTTTATTTT TTGTTATGCCAATCCGGCAT Prm3.1

GCACTTGAGACACTTTTGGG TTCTACCCATAATCGGGAA TCTGCCGCCAGACGGGTTTT CGAGAACCACCGTCTGCTGG CCGGTGTTATAATGCCGCG GCACTTGAGACACTTTTGGG CCCTC CGAGAACCACCGTCTGCTGG /TACAGTAGCGCCTCTCAAA AATAGATAAACGGCTCATGT ACGTGGGCCGTTTATTTTTT CTACCCATAATCGGGAACCG

GTGTTATAATGCCGCGCCCT C-3' CI006 ds20 abaixo 316 TCAACCTAAAAAAGTTTGTG 350 AACTCACTTCACACCCCGA 384 5'- Prm1/gene SEQ ID SEQ ID SEQ ID TAATACTTGTAACGCTACAT AGGGGGAAGTTGCCTGACC TCAACCTAAAAAAGTTTGTG nifL NO: 411 NO: 412 NO: GGAGATTAACTCAATCTAGA CTACGATTCCCGCTATTTC TAATACTTGTAACGCTACAT rompido TAAACT CAAATCG 413 GGGTATTAATAATGAATCGT ATTCACTGACCGGAGGTTC GGAGATTAACTCAATCTAGA GGTACT AAGCGCC /56- ACTAAACTGGTACTGGGCGC AAAATGACCCAGCGAACCG GGGTATTAATAATGAATCGT GGGCGC AGACGGT FAM/AA

AGTCG ACTAAACTGGTACTGGGCGC AACT AT GTTGCC /AACTCACTTCACACCCCGA T/ZEN/ AGGGGGAAGTTGCCTGACCC GACCCT

TACGATTCCCGCTATTTCAT ACGATT TCACTGACCGGAGGTTCAAA CCC/3I ATGACCCAGCGAACCGAGTC ABkFQ/ G-3' CI006 ds20 acima 317 GGGCGACAAACGGCCTGGTG 351 CGTCCTGTAATAATAACCG 385 5'- gene nifL N/A N/A N/A GCACAAATTGTCAGAACTAC GACAATTCGGACTGATTAA GGGCGACAAACGGCCTGGTG rompido/ GACACGACTAACTGACCGCA AAAAGCGCCCTTGTGGCGC GCACAAATTGTCAGAACTAC Prm1

GGAGTGTGCGATGACCCTGA TTTTTTTATATTCCCGCCT GACACGACTAACTGACCGCA ATATGATGATGGATGCCGGC CCATTTAAAATAAAAAATC GGAGTGTGCGATGACCCTGA CAATC ATATGATGATGGATGCCGGC /CGTCCTGTAATAATAACCG GACAATTCGGACTGATTAAA AAAGCGCCCTTGTGGCGCTT TTTTTATATTCCCGCCTCCA

TTTAAAATAAAAAATCCAAT C-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ CI006 ds24 acima 318 GGGCGACAAACGGCCTGGTG 352 GGACATCATCGCGACAAAC 386 5'- gene nifL SEQ ID SEQ ID SEQ ID GCACAAATTGTCAGAACTAC AATATTAATACCGGCAACC GGGCGACAAACGGCCTGGTG rompido/ NO: 414 NO: 415 NO: GACACGACTAACTGACCGCA ACACCGGCAATTTACGAGA GCACAAATTGTCAGAACTAC Prm5 GGTGCA GCGCAGT 416 GGAGTGTGCGATGACCCTGA CTGCGCAGGCATCCTTTCT GACACGACTAACTGACCGCA CTCTTT CTCGTAA /56- ATATGATGATGGATGCCGGC CCCGTCAATTTCTGTCAAA GGAGTGTGCGATGACCCTGA GCATGG ATTGCC FAM/CA

TAAAG ATATGATGATGGATGCCGGC TT GGA /GGACATCATCGCGACAAAC GTG AATATTAATACCGGCAACCA T/ZEN/ CACCGGCAATTTACGAGACT G CGA GCGCAGGCATCCTTTCTCCC TGA

GTCAATTTCTGTCAAATAAA CCC G-3' TGA AT/3IA BkFQ CI006 ds24 abaixo 319 TAAGAATTATCTGGATGAAT 353 AACTCACTTCACACCCCGA 387 5'- Prm5/gene N/A N/A N/A GTGCCATTAAATGCGCAGCA AGGGGGAAGTTGCCTGACC TAAGAATTATCTGGATGAAT nifL TAATGGTGCGTTGTGCGGGA CTACGATTCCCGCTATTTC GTGCCATTAAATGCGCAGCA rompido

AAACTGCTTTTTTTTGAAAG ATTCACTGACCGGAGGTTC TAATGGTGCGTTGTGCGGGA GGTTGGTCAGTAGCGGAAAC AAAATGACCCAGCGAACCG AAACTGCTTTTTTTTGAAAG AGTCG GGTTGGTCAGTAGCGGAAAC /AACTCACTTCACACCCCGA AGGGGGAAGTTGCCTGACCC TACGATTCCCGCTATTTCAT TCACTGACCGGAGGTTCAAA

ATGACCCAGCGAACCGAGTC G-3' CI006 ds30 N/A 320 CGCCAGAGAGTCGAAATCGA 354 TTTAACGATCTGATTGGCG 388 5'- UTR 5’ e N/A N/A N/A ACATTTCCGTAATACCGCGA ATGATGAAACGGATTCGCC CGCCAGAGAGTCGAAATCGA ATG/gene TTACCCAGGAGCCGTTCTGG GGAAGATGCGCTTTCTGAG ACATTTCCGTAATACCGCGA glnE TTGCACAGCGGAAAACGTTA AGCTGGCGCGAATTGTGGC TTACCCAGGAGCCGTTCTGG truncado

ACGAAAGGATATTTCGCATG AGGATGCGTTGCAGGAGGA TTGCACAGCGGAAAACGTTA GGATT ACGAAAGGATATTTCGCATG /TTTAACGATCTGATTGGCG ATGATGAAACGGATTCGCCG GAAGATGCGCTTTCTGAGAG CTGGCGCGAATTGTGGCAGG

ATGCGTTGCAGGAGGAGGAT T-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ CI006 ds31 N/A 321 CGCCAGAGAGTCGAAATCGA 355 GCACTGAAACACCTCATTT 389 5'- UTR 5’ e N/A N/A N/A ACATTTCCGTAATACCGCGA CCCTGTGTGCCGCGTCGCC CGCCAGAGAGTCGAAATCGA ATG/gene TTACCCAGGAGCCGTTCTGG GATGGTTGCCAGTCAGCTG ACATTTCCGTAATACCGCGA glnE TTGCACAGCGGAAAACGTTA GCGCGCTACCCGATCCTGC TTACCCAGGAGCCGTTCTGG truncado

ACGAAAGGATATTTCGCATG TTGATGAATTGCTCGACCC TTGCACAGCGGAAAACGTTA GAATA ACGAAAGGATATTTCGCATG /GCACTGAAACACCTCATTT CCCTGTGTGCCGCGTCGCCG ATGGTTGCCAGTCAGCTGGC GCGCTACCCGATCCTGCTTG

ATGAATTGCTCGACCCGAAT A-3' CI019 ds34 N/A 322 GATGATGGATGCTTTCTGGT 356 GCGCTCAAACAGTTAATCC 390 5'- UTR 5’ e N/A N/A N/A TAAACGGGCAACCTCGTTAA GTCTGTGTGCCGCCTCGCC GATGATGGATGCTTTCTGGT ATG/gene CTGACTGACTAGCCTGGGCA GATGGTCGCGACACAACTT TAAACGGGCAACCTCGTTAA glnE AACTGCCCGGGCTTTTTTTT GCACGTCATCCTTTATTGC CTGACTGACTAGCCTGGGCA truncado

GCAAGGAATCTGATTTCATG TCGATGAACTGCTCGACCC AACTGCCCGGGCTTTTTTTT GCGCA GCAAGGAATCTGATTTCATG /GCGCTCAAACAGTTAATCC GTCTGTGTGCCGCCTCGCCG ATGGTCGCGACACAACTTGC ACGTCATCCTTTATTGCTCG

ATGAACTGCTCGACCCGCGC A-3' CI019 ds70 acima 323 ACCGATCCGCAGGCGCGCAT 357 AGTCTGAACTCATCCTGCG 391 5'- gene nifL N/A N/A N/A TTGTTATGCCAATCCGGCAT GCAGTCGGTGAGACGTATT ACCGATCCGCAGGCGCGCAT rompido/ TCTGCCGCCAGACGGGTTTT TTTGACCAAAGAGTGATCT TTGTTATGCCAATCCGGCAT Prm4

GCACTTGAGACACTTTTGGG ACATCACGGAATTTTGTGG TCTGCCGCCAGACGGGTTTT CGAGAACCACCGTCTGCTGG TTGTTGCTGCTTAAAAGGG GCACTTGAGACACTTTTGGG CAAAT CGAGAACCACCGTCTGCTGG /AGTCTGAACTCATCCTGCG GCAGTCGGTGAGACGTATTT TTGACCAAAGAGTGATCTAC ATCACGGAATTTTGTGGTTG

TTGCTGCTTAAAAGGGCAAA T-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ CI019 ds70 abaixo 324 CATCGGACACCACCAGCTTA 358 CCGTCTCTGAAGCTCTCGG 392 5'- Prm4/gene N/A N/A N/A CAAATTGCCTGATTGCGGCC TGAACATTGTTGCGAGGCA CATCGGACACCACCAGCTTA nifL CCGATGGCCGGTATCACTGA GGATGCGAGCTGGTTGTGT CAAATTGCCTGATTGCGGCC rompido

CCGACCATTTCGTGCCTTAT TTTGACATTACCGATAATG CCGATGGCCGGTATCACTGA GTCATGCGATGGGGGCTGGG TGCCGCGTGAACGGGTGCG CCGACCATTTCGTGCCTTAT TTATG GTCATGCGATGGGGGCTGGG /CCGTCTCTGAAGCTCTCGG TGAACATTGTTGCGAGGCAG GATGCGAGCTGGTTGTGTTT TGACATTACCGATAATGTGC

CGCGTGAACGGGTGCGTTAT G-3' 137 ds799 abaixo 325 TCTTCAACAACTGGAGGAAT 359 GCCATTGAGCTGGCTTCCC 393 5'- PinfC/gene SEQ ID SEQ ID SEQ ID AAGGTATTAAAGGCGGAAAA GACCGCAGGGCGGCACCTG TCTTCAACAACTGGAGGAAT nifL NO: 417 NO: 418 NO: CGAGTTCAAACGGCACGTCC CCTGACCCTGCGTTTCCCG AAGGTATTAAAGGCGGAAAA rompido CTCGGC AGGGTGT 419 GAATCGTATCAATGGCGAGA CTGTTTAACACCCTGACCG CGAGTTCAAACGGCACGTCC AGCATG TAAACAG /56- TTCGCGCCCTGGAAGTTCGC GAGGTGAAGCATGATCCCT GAATCGTATCAATGGCGAGA GACGTA CGGGAAA FAM/AA

GAATC TTCGCGCCCTGGAAGTTCGC A CGG /GCCATTGAGCTGGCTTCCC CAC GACCGCAGGGCGGCACCTGC G/ZEN/ CTGACCCTGCGTTTCCCGCT T CCG GTTTAACACCCTGACCGGAG AAT

GTGAAGCATGATCCCTGAAT CGT C-3' ATC AA/3IA BkFQ/ 137 ds799 acima 326 TCCGGGTTCGGCTTACCCCG 360 AGCGTCAGGTACCGGTCAT 394 5'- gene nifL N/A N/A N/A CCGCGTTTTGCGCACGGTGT GATTCACCGTGCGATTCTC TCCGGGTTCGGCTTACCCCG rompido/ CGGACAATTTGTCATAACTG GGTTCCCTGGAGCGCTTCA CCGCGTTTTGCGCACGGTGT PinfC

CGACACAGGAGTTTGCGATG TTGGCATCCTGACCGAAGA CGGACAATTTGTCATAACTG ACCCTGAATATGATGCTCGA GTTCGCTGGCTTCTTCCCA CGACACAGGAGTTTGCGATG ACCTG ACCCTGAATATGATGCTCGA /AGCGTCAGGTACCGGTCAT GATTCACCGTGCGATTCTCG GTTCCCTGGAGCGCTTCATT GGCATCCTGACCGAAGAGTT

CGCTGGCTTCTTCCCAACCT G-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ 137 ds809 N/A 327 ATCGCAGCGTCTTTGAATAT 361 GCGCTGAAGCACCTGATCA 395 5'- UTR 5’ e SEQ ID SEQ ID SEQ ID TTCCGTCGCCAGGCGCTGGC CGCTCTGCGCGGCGTCGCC ATCGCAGCGTCTTTGAATAT ATG/gene NO: 420 NO: 421 NO: TGCCGAGCCGTTCTGGCTGC GATGGTCGCCAGCCAGCTG TTCCGTCGCCAGGCGCTGGC glnE GAGCCG GCCGTCG 422 ATAGTGGAAAACGATAATTT GCGCGCCACCCGCTGCTGC TGCCGAGCCGTTCTGGCTGC truncado TTCTGG GCTGATA /56- CAGGCCAGGGAGCCCTTATG TGGATGAGCTGCTGGATCC ATAGTGGAAAACGATAATTT CTGCAT GAGG FAM/TT

CAACA CAGGCCAGGGAGCCCTTATG AG ATGGCG /GCGCTGAAGCACCTGATCA C/ZEN/ CGCTCTGCGCGGCGTCGCCG TGAAGC

ATGGTCGCCAGCCAGCTGGC ACCTGA GCGCCACCCGCTGCTGCTGG TCA/3I ATGAGCTGCTGGATCCCAAC ABkFQ/ A-3' 137 ds843 acima 328 TCCGGGTTCGGCTTACCCCG 362 GCCCGCTGACCGACCAGAA 396 5'- gene nifL N/A N/A N/A CCGCGTTTTGCGCACGGTGT CTTCCACCTTGGACTCGGC TCCGGGTTCGGCTTACCCCG rompido/ CGGACAATTTGTCATAACTG TATACCCTTGGCGTGACGG CCGCGTTTTGCGCACGGTGT Prm1.2

CGACACAGGAGTTTGCGATG CGCGCGATAACTGGGACTA CGGACAATTTGTCATAACTG ACCCTGAATATGATGCTCGA CATCCCCATTCCGGTGATC CGACACAGGAGTTTGCGATG TTACC ACCCTGAATATGATGCTCGA /GCCCGCTGACCGACCAGAA CTTCCACCTTGGACTCGGCT ATACCCTTGGCGTGACGGCG CGCGATAACTGGGACTACAT

CCCCATTCCGGTGATCTTAC C-3' 137 ds843 abaixo 329 TCACTTTTTAGCAAAGTTGC 363 GCCATTGAGCTGGCTTCCC 397 5'- Prm1.2/gen N/A N/A N/A ACTGGACAAAAGGTACCACA GACCGCAGGGCGGCACCTG TCACTTTTTAGCAAAGTTGC e nifL ATTGGTGTACTGATACTCGA CCTGACCCTGCGTTTCCCG ACTGGACAAAAGGTACCACA rompido

CACAGCATTAGTGTCGATTT CTGTTTAACACCCTGACCG ATTGGTGTACTGATACTCGA TTCATATAAAGGTAATTTTG GAGGTGAAGCATGATCCCT CACAGCATTAGTGTCGATTT GAATC TTCATATAAAGGTAATTTTG /GCCATTGAGCTGGCTTCCC GACCGCAGGGCGGCACCTGC CTGACCCTGCGTTTCCCGCT GTTTAACACCCTGACCGGAG

GTGAAGCATGATCCCTGAAT C-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ 137 ds853 acima 330 TCCGGGTTCGGCTTACCCCG 364 GCTAAAGTTCTCGGCTAAT 398 5'- gene nifL N/A N/A N/A CCGCGTTTTGCGCACGGTGT CGCTGATAACATTTGACGC TCCGGGTTCGGCTTACCCCG rompido/ CGGACAATTTGTCATAACTG AATGCGCAATAAAAGGGCA CCGCGTTTTGCGCACGGTGT Prm6.2

CGACACAGGAGTTTGCGATG TCATTTGATGCCCTTTTTG CGGACAATTTGTCATAACTG ACCCTGAATATGATGCTCGA CACGCTTTCATACCAGAAC CGACACAGGAGTTTGCGATG CTGGC ACCCTGAATATGATGCTCGA /GCTAAAGTTCTCGGCTAAT CGCTGATAACATTTGACGCA ATGCGCAATAAAAGGGCATC ATTTGATGCCCTTTTTGCAC

GCTTTCATACCAGAACCTGG C-3' 137 ds853 abaixo 331 GTTCTCCTTTGCAATAGCAG 365 GCCATTGAGCTGGCTTCCC 399 5'- Prm6.2/gen N/A N/A N/A GGAAGAGGCGCCAGAACCGC GACCGCAGGGCGGCACCTG GTTCTCCTTTGCAATAGCAG e nifL CAGCGTTGAAGCAGTTTGAA CCTGACCCTGCGTTTCCCG GGAAGAGGCGCCAGAACCGC rompido

CGCGTTCAGTGTATAATCCG CTGTTTAACACCCTGACCG CAGCGTTGAAGCAGTTTGAA AAACTTAATTTCGGTTTGGA GAGGTGAAGCATGATCCCT CGCGTTCAGTGTATAATCCG GAATC AAACTTAATTTCGGTTTGGA /GCCATTGAGCTGGCTTCCC GACCGCAGGGCGGCACCTGC CTGACCCTGCGTTTCCCGCT GTTTAACACCCTGACCGGAG

GTGAAGCATGATCCCTGAAT C-3' 137 ds857 acima 332 TCCGGGTTCGGCTTACCCCG 366 CGCCGTCCTCGCAGTACCA 400 5'- gene nifL N/A N/A N/A CCGCGTTTTGCGCACGGTGT TTGCAACCGACTTTACAGC TCCGGGTTCGGCTTACCCCG rompido/ CGGACAATTTGTCATAACTG AAGAAGTGATTCTGGCACG CCGCGTTTTGCGCACGGTGT Prm8.2

CGACACAGGAGTTTGCGATG CATGGAACAAATTCTTGCC CGGACAATTTGTCATAACTG ACCCTGAATATGATGCTCGA AGTCGGGCTTTATCCGATG CGACACAGGAGTTTGCGATG ACGAA ACCCTGAATATGATGCTCGA /CGCCGTCCTCGCAGTACCA TTGCAACCGACTTTACAGCA AGAAGTGATTCTGGCACGCA TGGAACAAATTCTTGCCAGT

CGGGCTTTATCCGATGACGA A-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ 137 ds857 abaixo 333 GATATGCCTGAAGTATTCAA 367 GCCATTGAGCTGGCTTCCC 401 5'- Prm8.2/gen N/A N/A N/A TTACTTAGGCATTTACTTAA GACCGCAGGGCGGCACCTG GATATGCCTGAAGTATTCAA e nifL CGCAGGCAGGCAATTTTGAT CCTGACCCTGCGTTTCCCG TTACTTAGGCATTTACTTAA rompido

GCTGCCTATGAAGCGTTTGA CTGTTTAACACCCTGACCG CGCAGGCAGGCAATTTTGAT TTCTGTACTTGAGCTTGATC GAGGTGAAGCATGATCCCT GCTGCCTATGAAGCGTTTGA GAATC TTCTGTACTTGAGCTTGATC /GCCATTGAGCTGGCTTCCC GACCGCAGGGCGGCACCTGC CTGACCCTGCGTTTCCCGCT GTTTAACACCCTGACCGGAG

GTGAAGCATGATCCCTGAAT C-3' 63 ds908 abaixo 334 TGGTATTGTCAGTCTGAATG 368 TCTTTAGATCTCTCGGTCC 402 5'- PinfC/gene SEQ ID SEQ ID N/A AAGCTCTTGAAAAAGCTGAG GCCCTGATGGCGGCACCTT TGGTATTGTCAGTCTGAATG nifL NO: 423 NO: 424 GAAGCGGGCGTCGATTTAGT GCTGACGTTACGCCTGCCG AAGCTCTTGAAAAAGCTGAG rompido GGAAAA GGGCGGA

AGAAATCAGTCCGAATGCCG GTACAGCAGGTTATCACCG GAAGCGGGCGTCGATTTAGT CGAGTT CCGAGAG AGCCGCCAGTTTGTCGAATC GAGGCTTAAAATGACCCAG AGAAATCAGTCCGAATGCCG CAACCG ATCTAA TTACC AGCCGCCAGTTTGTCGAATC GC /TCTTTAGATCTCTCGGTCC GCCCTGATGGCGGCACCTTG CTGACGTTACGCCTGCCGGT ACAGCAGGTTATCACCGGAG

GCTTAAAATGACCCAGTTAC C-3' 63 ds908 acima 335 TGCAAATTGCACGGTTATTC 369 TGAATATCACTGACTCACA 403 5'- gene nifL N/A N/A N/A CGGGTGAGTATATGTGTGAT AGCTACCTATGTCGAAGAA TGCAAATTGCACGGTTATTC rompido/ TTGGGTTCCGGCATTGCGCA TTAACTAAAAAACTGCAAG CGGGTGAGTATATGTGTGAT PinfC

ATAAAGGGGAGAAAGACATG ATGCAGGCATTCGCGTTAA TTGGGTTCCGGCATTGCGCA AGCATCACGGCGTTATCAGC AGCCGACTTGAGAAATGAG ATAAAGGGGAGAAAGACATG AAGAT AGCATCACGGCGTTATCAGC /TGAATATCACTGACTCACA AGCTACCTATGTCGAAGAAT TAACTAAAAAACTGCAAGAT GCAGGCATTCGCGTTAAAGC

CGACTTGAGAAATGAGAAGA T-3'

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ 910 ds960 acima 336 TCAGGGCTGCGGATGTCGGG 370 CTGGGGTCACTGGAGCGCT 404 5'- gene nifL N/A N/A N/A CGTTTCACAACACAAAATGT TTATCGGCATCCTGACCGA TCAGGGCTGCGGATGTCGGG rompido/ TGTAAATGCGACACAGCCGG AGAATTTGCCGGTTTCTTC CGTTTCACAACACAAAATGT PinfC

GCCTGAAACCAGGAGCGTGT CCGACCTGGCTGGCCCCTG TGTAAATGCGACACAGCCGG GATGACCTTTAATATGATGC TTCAGGTTGTGGTGATGAA GCCTGAAACCAGGAGCGTGT TATCA GATGACCTTTAATATGATGC /CTGGGGTCACTGGAGCGCT TTATCGGCATCCTGACCGAA GAATTTGCCGGTTTCTTCCC GACCTGGCTGGCCCCTGTTC

AGGTTGTGGTGATGAATATC A-3' 910 ds960 abaixo 337 CGGAAAACGAGTTCAAACGG 371 GCAATAGAACTAACTACCC 405 5'- PinfC/gene N/A N/A N/A CACGTCCGAATCGTATCAAT GCCCTGAAGGCGGTACCTG CGGAAAACGAGTTCAAACGG nifL GGCGAGATTCGCGCCCAGGA CCTGACCCTGCGATTCCCG CACGTCCGAATCGTATCAAT rompido

AGTTCGCTTAACTGGTCTGG TTATTTCATTCACTGACCG GGCGAGATTCGCGCCCAGGA AAGGTGAGCAGCTGGGTATT GAGGCCCACGATGACCCAG AGTTCGCTTAACTGGTCTGG CGACC AAGGTGAGCAGCTGGGTATT /GCAATAGAACTAACTACCC GCCCTGAAGGCGGTACCTGC CTGACCCTGCGATTCCCGTT ATTTCATTCACTGACCGGAG

GCCCACGATGACCCAGCGAC C-3' 137 ds2551 acima 425 CTTCGGCGGCGTGAAGAAGA 427 GCCCGCTGACCGACCAGAA 429 5’- extremidad N/A N/A N/A GTGGTTTTGGTCGCGAGCTG CTTCCACCTTGGACTCGGC CTTCGGCGGCGTGAAGAAGA e 3’ de TCACATTTTGGTCTGCACGA TATACCCTTGGCGTGACGG GTGGTTTTGGTCGCGAGCTG sad( GTTCTGTAATGCGCAGACCG CGCGCGATAACTGGGACTA TCACATTTTGGTCTGCACGA Succinato TCTGGAAAGACCGTCGCTAA CATCCCCATTCCGGTGATC GTTCTGTAATGCGCAGACCG semialdeí- TTACC TCTGGAAAGACCGTCGCTAA do /GCCCGCTGACCGACCAGAA desidroge- CTTCCACCTTGGACTCGGCT nase)/ ATACCCTTGGCGTGACGGCG Prm1.2

CGCGATAACTGGGACTACAT

CCCCATTCCGGTGATCTTAC C-3’ 137 ds2551 abaixo 426 TCACTTTTTAGCAAAGTTGC 428 ATGGCGGCGGTGATCAATA 430 5’- Prm1.2/ N/A N/A N/A ACTGGACAAAAGGTACCACA ACGCAATGCTGGAAGCCAT TCACTTTTTAGCAAAGTTGC glsA2

ATTGGTGTACTGATACTCGA TCTGGCAGAAATCAGGCCG ACTGGACAAAAGGTACCACA CACAGCATTAGTGTCGATTT CTGATTGGCCGCGGTAAAG ATTGGTGTACTGATACTCGA TTCATATAAAGGTAATTTTG TGGCGGATTACATTCCGGC CACAGCATTAGTGTCGATTT GCTGG TTCATATAAAGGTAATTTTG /ATGGCGGCGGTGATCAATA ACGCAATGCTGGAAGCCATT CTGGCAGAAATCAGGCCGCT GATTGGCCGCGGTAAAGTGG CGGATTACATTCCGGCGCTG

Inici- Inicia- Junção a dor dor base Nome da montante/ SEQ 100 bp a montante da SEQ ID 100 bp a jusante da SEQ ID SEQ da Junção Des. da Direto Reverso Sonda CI junção a jusante ID NO junção NO junção NO “/” Indicando junção Junção SEQ SEQ SEQ G-3’

Tabela 31: Micróbios não intergenéricos remodelados Nome da Cepa Genótipo SEQ ID NO

CI006 rDNA 16S - contíguo 5 62

CI006 rDNA 16S - contíguo 8 63

CI019 rDNA 16S 64

CI006 nifH 65

CI006 nifD 66

CI006 nifK 67

CI006 nifL 68 CI006 nifA 69

CI019 nifH 70

CI019 nifD 71

CI019 nifK 72

CI019 nifL 73

CI019 nifA 74

CI006 Prm5 com 500bp de 75 regiões flanqueadoras CI006 operon nifLA - região 76 intergênica a montante mais CDSs nifL e nifA CI006 nifL (Aminoácido) 77

CI006 (Aminoácido) 78

CI006 nifA glnE 79

CI006 glnE_KO1 80

CI006 glnE (Aminoácido) 81

CI006 glnE_KO1 (Aminoácido) 82

CI006 Domínio de GlnE ATase 83 (Aminoácido) CM029 Prm5 inserido na região 84 nifL

Tabela 32: Micróbios não Intergenéricos Remodelados Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável CI63; SEQ ID NO 63 16S N/A N/A CI063 85 CI63; SEQ ID NO 63 nifH N/A N/A CI063 86 CI63; SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados 63 nifD1 N/A CI063 87 como nifD no genoma 63 CI63; SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados 63 nifD2 N/A CI063 88 como nifD no genoma 63

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável CI63; SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados 63 nifK1 N/A CI063 89 como nifD no genoma 63 CI63; SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados 63 nifK2 N/A CI063 90 como nifD no genoma 63 CI63; SEQ ID NO 63 nifL N/A N/A CI063 91 CI63; SEQ ID NO 63 nifA N/A N/A CI063 92 CI63; SEQ ID NO 63 glnE N/A N/A CI063 93 CI63; SEQ ID NO 63 amtB N/A N/A CI063 94 500bp imediatamente a CI63; SEQ ID NO 63 PinfC montante do códon de partida N/A CI063 95 ATG do gene infC

SEQ ID NO CI137 137 16S N/A N/A 96 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados CI137 137 nifH1 N/A 97 como nifH no genoma 137 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados CI137 137 nifH2 N/A 98 como nifH no genoma 137 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados CI137 137 nifD1 N/A 99 como nifD no genoma 137 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados CI137 137 nifD2 N/A 100 como nifD no genoma 137 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados CI137 137 nifK1 N/A 101 como nifK no genoma 137 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados CI137 137 nifK2 N/A 102 como nifK no genoma 137

SEQ ID NO CI137 137 nifL N/A N/A 103

SEQ ID NO CI137 137 nifA N/A N/A 104

SEQ ID NO CI137 137 glnE N/A N/A 105 500bp imediatamente a

SEQ ID NO CI137 137 PinfC montante do códon de partida N/A 106 TTG de infC

SEQ ID NO CI137 137 amtB N/A N/A 107 promotor interna localizado SEQ ID NO no gene nlpI; 299bp iniciando CI137 137 Prm8.2 N/A 108 em 81bp após o A do ATG do gene nlpI

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável 300bp a montante do gene secE

SEQ ID NO CI137 137 Prm6.2 iniciando em 57bp a montante N/A 109 do A do ATG de secE SEQ ID NO 400bp imediatamente a CI137 137 Prm1.2 N/A 110 montante do ATG de gene cspE

SEQ ID NO nenhuma 728 16S N/A N/A 111

SEQ ID NO nenhuma 728 nifH N/A N/A 112 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 728 nifD1 N/A 113 como nifD no genoma 728 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 728 nifD2 N/A 114 como nifD no genoma 728 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 728 nifK1 N/A 115 como nifK no genoma 728 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 728 nifK2 N/A 116 como nifK no genoma 728

SEQ ID NO nenhuma 728 nifL N/A N/A 117

SEQ ID NO nenhuma 728 nifA N/A N/A 118

SEQ ID NO nenhuma 728 glnE N/A N/A 119

SEQ ID NO nenhuma 728 amtB N/A N/A 120

SEQ ID NO nenhuma 850 16S N/A N/A 121

SEQ ID NO nenhuma 852 16S N/A N/A 122

SEQ ID NO nenhuma 853 16S N/A N/A 123

SEQ ID NO nenhuma 910 16S N/A N/A 124

SEQ ID NO nenhuma 910 nifH N/A N/A 125 CDS de cofactor de SEQ ID NO ferro- nenhuma 910 N/A N/A 126 molibdê- nio dinitro- genase

SEQ ID NO nenhuma 910 nifD1 N/A N/A 127

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável

SEQ ID NO nenhuma 910 nifD2 N/A N/A 128

SEQ ID NO nenhuma 910 nifK1 N/A N/A 129

SEQ ID NO nenhuma 910 nifK2 N/A N/A 130

SEQ ID NO nenhuma 910 nifL N/A N/A 131

SEQ ID NO nenhuma 910 nifA N/A N/A 132

SEQ ID NO nenhuma 910 glnE N/A N/A 133

SEQ ID NO nenhuma 910 amtB N/A N/A 134 SEQ ID NO 498bp imediatamente a nenhuma 910 PinfC N/A 135 montante do ATG do gene infC

SEQ ID NO nenhuma 1021 16S N/A N/A 136

SEQ ID NO nenhuma 1021 nifH N/A N/A 137 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1021 nifD1 N/A 138 como nifD no genoma 910 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1021 nifD2 N/A 139 como nifD no genoma 910 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1021 nifK1 N/A 140 como nifK no genoma 910 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1021 nifK2 N/A 141 como nifK no genoma 910

SEQ ID NO nenhuma 1021 nifL N/A N/A 142

SEQ ID NO nenhuma 1021 nifA N/A N/A 143

SEQ ID NO nenhuma 1021 glnE N/A N/A 144

SEQ ID NO nenhuma 1021 amtB N/A N/A 145 500bp imediatamente a

SEQ ID NO nenhuma 1021 PinfC montante do códon de partida N/A 146 ATG do gene infC 348bp inclui os 319bp imediatamente a montante do

SEQ ID NO nenhuma 1021 Prm1 códon de partida ATG do gene N/A 147 lpp e os primeiros 29bp do gene lpp

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável 339bp a montante do gene

SEQ ID NO nenhuma 1021 Prm7 sspA, terminando em 46bp a N/A 148 montante do ATG do gene sspA

SEQ ID NO nenhuma 1113 16S N/A N/A 149

SEQ ID NO nenhuma 1113 nifH N/A N/A 150 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1113 nifD1 N/A 151 como nifD no genoma 1113 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1113 nifD2 N/A 152 como nifD no genoma 1113

SEQ ID NO nenhuma 1113 nifK N/A N/A 153

SEQ ID NO nenhuma 1113 nifL N/A N/A 154 devido a uma lacuna na gene SEQ ID NO montagem de sequência, nós nenhuma 1113 parcial N/A 155 podemos identificar um gene nifA parcial do genoma 1113

SEQ ID NO nenhuma 1113 glnE N/A N/A 156

SEQ ID NO nenhuma 1116 16S N/A 157

SEQ ID NO nenhuma 1116 nifH N/A 158 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1116 nifD1 N/A 159 como nifD no genoma 1116 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1116 nifD2 N/A 160 como nifD no genoma 1116 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1116 nifK1 N/A 161 como nifK no genoma 1116 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1116 nifK2 N/A 162 como nifK no genoma 1116

SEQ ID NO nenhuma 1116 nifL N/A N/A 163

SEQ ID NO nenhuma 1116 nifA N/A N/A 164

SEQ ID NO nenhuma 1116 glnE N/A N/A 165

SEQ ID NO nenhuma 1116 amtB N/A N/A 166

SEQ ID NO nenhuma 1293 16S N/A N/A 167

SEQ ID NO nenhuma 1293 nifH N/A N/A 168

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1293 nifD1 N/A 169 como nifD no genoma 1293 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1293 nifD2 N/A 170 como nifD no genoma 1293 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1293 nifK N/A 171 como nifK no genoma 1293 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1293 nifK1 N/A 172 como nifK no genoma 1293

SEQ ID NO nenhuma 1293 nifA N/A N/A 173

SEQ ID NO nenhuma 1293 glnE N/A N/A 174 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1293 amtB1 N/A 175 como amtB no genoma 1293 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados nenhuma 1293 amtB2 N/A 176 como amtB no genoma 1293 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp 1021- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds1131 1612 177 infC substituídos com a sequência promotora PinfC 1021 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 1021- SEQ ID NO infC com substituídos com a sequência nenhuma ds1131 1612 178 flanco promotora PinfC 1021; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1673bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG 1021- SEQ ID NO glnEΔAR- nenhuma eliminado, resultando em uma ds1133 1612 179 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1673bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma 1021- SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o nenhuma ds1133 1612 180 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp 1021- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds1145 1615 181 rm1 substituídos com a sequência promotora Prm1 1021 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 1021- SEQ ID NO rm1 com substituídos com a sequência nenhuma ds1145 1615 182 flanco promotora rm1 1021; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1673bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG 1021- SEQ ID NO glnEΔAR- nenhuma eliminado, resultando em uma ds1133 1615 183 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1673bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma 1021- SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o nenhuma ds1133 1615 184 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp 1021- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds1145 1619 185 rm1 substituídos com a sequência promotora Prm1 1021 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 1021- SEQ ID NO rm1 com substituídos com a sequência nenhuma ds1145 1619 186 flanco promotora rm1 1021; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável gene glnE com 1673bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG 1021- SEQ ID NO glnEΔAR- nenhuma eliminado, resultando em uma ds1133 1623 187 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1673bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma 1021- SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o nenhuma ds1133 1623 188 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp 1021- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds1148 1623 189 rm7 substituídos com a sequência promotora Prm1 1021 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 1021- SEQ ID NO rm7 com substituídos com a sequência nenhuma ds1148 1623 190 flanco promotora rm1 1021; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG 137- SEQ ID NO glnEΔAR- nenhuma eliminado, resultando em uma ds809 1034 191 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma 137- SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o nenhuma ds809 1034 192 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp 137- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds799 1036 193 infC substituídos com a sequência promotora PinfC 137 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 137- SEQ ID NO infC com substituídos com a sequência nenhuma ds799 1036 194 flanco promotora PinfC 137; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do Elimina- códon de partida ATG ção de eliminado E 36bp eliminados 137- SEQ ID NO nenhuma 36bp de iniciando em 1472bp a jusante nenhuma 1314 195 glnEΔAR- do códon de partida, 2 resultando em uma proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG eliminado E 36bp eliminado Elimina- iniciando em 1472bp a jusante ção de 137- SEQ ID NO do códon de partida, nenhuma 36bp nenhuma 1314 196 resultando em uma proteína glnEΔAR- glnE truncada sem o domínio 2 de remoção de adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp 137- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds857 1314 197 rm8.2 substituídos com a sequência promotora Prm8.2 137 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e rm8.2 137- SEQ ID NO substituídos com a sequência nenhuma com ds857 1314 198 promotora Prm8.2 137; 500bp flanco flanqueando o gene nifL a de 500bp montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do glnEΔAR- códon de partida ATG 2 eliminado E 36bp eliminado 137- SEQ ID NO nenhuma elimina- iniciando em 1472bp a jusante nenhuma 1329 199 ção de do códon de partida, 36bp resultando em uma proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG eliminado E 36bp eliminado glnEΔAR- iniciando em 1472bp a jusante 2 137- SEQ ID NO do códon de partida, nenhuma elimina- nenhuma 1329 200 resultando em uma proteína ção de glnE truncada sem o domínio 36bp de remoção de adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp 137- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds853 1329 201 rm6.2 substituídos com a sequência promotora Prm6.2 137 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e rm6.2 137- SEQ ID NO substituídos com a sequência nenhuma com ds853 1329 202 promotora Prm6.2 137; 500bp flanco flanqueando o gene nifL a de 500bp montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp 137- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds843 1382 203 rm1.2 substituídos com a sequência promotora Prm1.2 137 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e rm1.2 137- SEQ ID NO substituídos com a sequência nenhuma com ds843 1382 204 promotora Prm1.2 137; 500bp flanco flanqueando o gene nifL a de 500bp montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do glnEΔAR- códon de partida ATG 2 eliminado E 36bp eliminado 137- SEQ ID NO nenhuma eliminaç iniciando em 1472bp a jusante nenhuma 1382 205 ão de do códon de partida, 36bp resultando em uma proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG eliminado E 36bp eliminado glnEΔAR- iniciando em 1472bp a jusante 2 137- SEQ ID NO do códon de partida, nenhuma eliminaç nenhuma 1382 206 resultando em uma proteína ão de glnE truncada sem o domínio 36bp de remoção de adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp 137- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds799 1586 207 infC substituídos com a sequência promotora PinfC 137 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 137- SEQ ID NO infC com substituídos com a sequência nenhuma ds799 1586 208 flanco promotora PinfC 137; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG 137- SEQ ID NO glnEΔAR- nenhuma eliminado, resultando em uma ds809 1586 209 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA)

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma 137- SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o nenhuma ds809 1586 210 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG SEQ ID NO glnEΔAR- nenhuma 19-594 eliminado, resultando em uma ds34 211 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o nenhuma 19-594 ds34 212 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, SEQ ID NO ΔnifL::P 845bp de nifL foram nenhuma 19-594 ds180 213 rm6.1 eliminados e substituídos com a sequência promotora Prm1.2 CI019 iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::P 845bp de nifL foram rm6.1 eliminados e substituídos com

SEQ ID NO nenhuma 19-594 com a sequência promotora ds180 214 flanco Prm6.1 CI019; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, SEQ ID NO ΔnifL::P 845bp de nifL foram nenhuma 19-714 ds180 215 rm6.1 eliminados e substituídos com a sequência promotora Prm1.2 CI019 iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL:Pr 845bp de nifL foram SEQ ID NO m6.1 com eliminados e substituídos com nenhuma 19-714 ds180 216 flanco a sequência promotora Prm6.1 de 500bp CI019; 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, SEQ ID NO ΔnifL::P 845bp de nifL foram nenhuma 19-715 ds181 217 rm7.1 eliminados e substituídos com a sequência promotora Prm7.1 CI019 iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::P 845bp de nifL foram rm7.1 SEQ ID NO eliminados e substituídos com nenhuma 19-715 com ds181 218 a sequência promotora Prm76.1 flanco CI019; 500bp flanqueando o de 500bp gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, SEQ ID NO ΔnifL::P 845bp de nifL foram 19-713 19-750 ds172 219 rm1.2 eliminados e substituídos com a sequência promotora Prm1.2 CI019 iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::P 845bp de nifL foram rm1.2 SEQ ID NO eliminados e substituídos com 19-713 19-750 com ds172 220 a sequência promotora Prm1.2 flanco CI019; 500bp flanqueando o de 500bp gene nifL a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, SEQ ID NO ΔnifL::P 845bp de nifL foram 17-724 19-804 ds172 221 rm1.2 eliminados e substituídos com a sequência promotora Prm1.2 CI019 iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::P 845bp de nifL foram rm1.2 SEQ ID NO eliminados e substituídos com 17-724 19-804 com ds172 222 a sequência promotora Prm1.2 flanco CI019; 500bp flanqueando o de 500bp gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG SEQ ID NO glnEΔAR- 17-724 19-804 eliminado, resultando em uma ds34 223 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o 17-724 19-804 ds34 224 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, SEQ ID NO ΔnifL::P 845bp de nifL foram 19-590 19-806 ds175 225 rm3.1 eliminados e substituídos com a sequência promotora CI019 Prm3.1 iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::P 845bp de nifL foram rm3.1 SEQ ID NO eliminados e substituídos com 19-590 19-806 com ds175 226 a sequência promotora CI019 flanco Prm3.1; 500bp flanqueando o de 500bp gene nifL a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG SEQ ID NO glnEΔAR- 19-590 19-806 eliminado, resultando em uma ds34 227 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o 19-590 19-806 ds34 228 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp 63- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds908 1146 229 infC substituídos com a sequência promotora PinfC 63 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 63- SEQ ID NO infC com substituídos com a sequência nenhuma ds908 1146 230 flanco promotora PinfC 63; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp CM015; SEQ ID NO ΔnifL::P 6-397 de nifL foram eliminados e ds24 PBC6.15 231 rm5 substituídos com a sequência promotora Prm5 CI006 iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e CM015; SEQ ID NO rm5 com substituídos com a sequência 6-397 ds24 PBC6.15 232 flanco promotora Prm5 CI006; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp SEQ ID NO ΔnifL::P CM014 6-400 de nifL foram eliminados e ds20 233 rm1 substituídos com a sequência promotora Prm1 CI006 iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e SEQ ID NO rm1 com substituídos com a sequência CM014 6-400 ds20 234 flanco promotora Prm1 CI006; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp CM037; SEQ ID NO ΔnifL::P 6-403 de nifL foram eliminados e ds20 PBC6.37 235 rm1 substituídos com a sequência promotora Prm1 CI006 iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e CM037; SEQ ID NO rm1 com substituídos com a sequência 6-403 ds20 PBC6.38 236 flanco promotora Prm1 CI006; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1644bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG CM037; SEQ ID NO glnEΔAR- 6-403 eliminado, resultando em uma ds31 PBC6.39 237 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1644bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma CM037; SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o 6-403 ds31 PBC6.40 238 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável gene glnE com 1287bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG CM038; SEQ ID NO glnEΔAR- 6-404 eliminado, resultando em uma ds30 PBC6.38 239 1 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp CM038; SEQ ID NO ΔnifL::P 6-404 de nifL foram eliminados e ds20 PBC6.38 240 rm1 substituídos com a sequência promotora Prm1 CI006 iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e CM038; SEQ ID NO rm1 com substituídos com a sequência 6-404 ds20 PBC6.38 241 flanco promotora Prm1 CI006; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1287bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma CM038; SEQ ID NO 1 com proteína glnE truncada sem o 6-404 ds30 PBC6.38 242 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1287bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG CM029; SEQ ID NO glnEΔAR- 6-412 eliminado, resultando em uma ds30 PBC6.29 243 1 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1287bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma CM029; SEQ ID NO 1 com proteína glnE truncada sem o 6-412 ds30 PBC6.29 244 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp CM029; SEQ ID NO ΔnifL::P 6-412 de nifL foram eliminados e ds24 PBC6.29 245 rm5 substituídos com a sequência promotora Prm5 CI006 iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e CM029; SEQ ID NO rm5 com substituídos com a sequência 6-412 ds24 PBC6.29 246 flanco promotora Prm5 CI006; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp CM093; SEQ ID NO ΔnifL::P 6-848 de nifL foram eliminados e ds20 PBC6.93 247 rm1 substituídos com a sequência promotora Prm1 CI006 iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e CM093; SEQ ID NO rm1 com substituídos com a sequência 6-848 ds20 PBC6.93 248 flanco promotora Prm1 CI006; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1644bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG CM093; SEQ ID NO glnEΔAR- 6-848 eliminado, resultando em uma ds31 PBC6.93 249 2 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1644bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma CM093; SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o 6-848 ds31 PBC6.93 250 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável Primeiros 1088bp de gene amtB e 4bp a montante de códon de CM093; SEQ ID NO partida eliminados; 199bp de 6-848 ΔamtB ds126 PBC6.93 251 gene restantes sem um códon de partida; nenhuma proteína amtB é traduzida Primeiros 1088bp de gene amtB ΔamtB e 4bp a montante de códon de CM093; SEQ ID NO com partida eliminados; 199bp de 6-848 ds126 PBC6.93 252 flanco gene restantes sem um códon de 500bp de partida; nenhuma proteína amtB é traduzida gene glnE com 1287bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG CM094; SEQ ID NO glnEΔAR- 6-881 eliminado, resultando em uma ds30 PBC6.94 253 1 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1287bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma CM094; SEQ ID NO 1 com proteína glnE truncada sem o 6-881 ds30 PBC6.94 254 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp CM094; SEQ ID NO ΔnifL::P 6-881 de nifL foram eliminados e ds20 PBC6.94 255 rm1 substituídos com a sequência promotora Prm1 CI006 iniciando em 31bp após o A do códon de partida ATG, 1375bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e CM094; SEQ ID NO rm1 com substituídos com a sequência 6-881 ds20 PBC6.94 256 flanco promotora Prm1 CI006; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável Primeiros 1088bp de gene amtB e 4bp a montante de códon de CM094; SEQ ID NO partida eliminados; 199bp de 6-881 ΔamtB ds126 PBC6.94 257 gene restantes sem um códon de partida; nenhuma proteína amtB é traduzida Primeiros 1088bp de gene amtB ΔamtB e 4bp a montante de códon de CM094; SEQ ID NO com partida eliminados; 199bp de 6-881 ds126 PBC6.94 258 flanco gene restantes sem um códon de 500bp de partida; nenhuma proteína amtB é traduzida iniciando em 20bp após o A do códon de partida ATG, 1379bp 910- SEQ ID NO ΔnifL::P nenhuma de nifL foram eliminados e ds960 1246 259 infC substituídos com a sequência promotora PinfC 910 iniciando em 20bp após o A do códon de partida ATG, 1379bp ΔnifL::P de nifL foram eliminados e 910- SEQ ID NO infC com substituídos com a sequência nenhuma ds960 1246 260 flanco promotora PinfC 910; 500bp de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos PBC6.1, SEQ ID NO 1 de 3 genes de rDNA 16S CI006 16S-1 N/A 6, CI6 261 únicos no genoma CI006 PBC6.1, SEQ ID NO 2 de 3 genes de rDNA 16S CI006 16S-2 N/A 6, CI6 262 únicos no genoma CI006 PBC6.1, SEQ ID NO CI006 nifH N/A N/A 6, CI6 263 PBC6.1, SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados CI006 nifD2 N/A 6, CI6 264 como nifD no genoma CI006 PBC6.1, SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados CI006 nifK2 N/A 6, CI6 265 como nifK no genoma CI006 PBC6.1, SEQ ID NO CI006 nifL N/A N/A 6, CI6 266 PBC6.1, SEQ ID NO CI006 nifA N/A N/A 6, CI6 267 PBC6.1, SEQ ID NO CI006 glnE N/A N/A 6, CI6 268 PBC6.1, SEQ ID NO 3 de 3 genes de rDNA 16S CI006 16S-3 N/A 6, CI6 269 únicos no genoma CI006 PBC6.1, SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados CI006 nifD1 N/A 6, CI6 270 como nifD no genoma CI006

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável PBC6.1, SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados CI006 nifK1 N/A 6, CI6 271 como nifK no genoma CI006 PBC6.1, SEQ ID NO CI006 amtB N/A N/A 6, CI6 272 348bp inclui os 319bp imediatamente a montante do PBC6.1, SEQ ID NO CI006 Prm1 códon de partida ATG do gene N/A 6, CI6 273 lpp e os primeiros 29bp do gene lpp 313bp iniciando em 432bp a montante do códon de partida PBC6.1, SEQ ID NO CI006 Prm5 ATG do gene ompX e terminando N/A 6, CI6 274 119bp a montante do códon de partida ATG do gene ompX

SEQ ID NO 19, CI19 CI019 nifL N/A N/A 275

SEQ ID NO 19, CI19 CI019 nifA N/A N/A 276 SEQ ID NO 1 de 7 genes de rDNA 16S 19, CI19 CI019 16S-1 N/A 277 únicos no genoma CI019 SEQ ID NO 2 de 7 genes de rDNA 16S 19, CI19 CI019 16S-2 N/A 278 únicos no genoma CI019 SEQ ID NO 3 de 7 genes de rDNA 16S 19, CI19 CI019 16S-3 N/A 279 únicos no genoma CI019 SEQ ID NO 4 de 7 genes de rDNA 16S 19, CI19 CI019 16S-4 N/A 280 únicos no genoma CI019 SEQ ID NO 5 de 7 genes de rDNA 16S 19, CI19 CI019 16S-5 N/A 281 únicos no genoma CI019 SEQ ID NO 6 de 7 genes de rDNA 16S 19, CI19 CI019 16S-6 N/A 282 únicos no genoma CI019 SEQ ID NO 7 de 7 genes de rDNA 16S 19, CI19 CI019 16S-7 N/A 283 únicos no genoma CI019 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados 19, CI19 CI019 nifH1 N/A 284 como nifH no genoma CI019 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados 19, CI19 CI019 nifH2 N/A 285 como nifH no genoma CI019 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados 19, CI19 CI019 nifD1 N/A 286 como nifD no genoma CI019 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados 19, CI19 CI019 nifD2 N/A 287 como nifD no genoma CI019 SEQ ID NO 1 de 2 genes únicos anotados 19, CI19 CI019 nifK1 N/A 288 como nifK no genoma CI019 SEQ ID NO 2 de 2 genes únicos anotados 19, CI19 CI019 nifK2 N/A 289 como nifK no genoma CI019

SEQ ID NO 19, CI19 CI019 glnE N/A N/A 290

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável 449bp imediatamente a

SEQ ID NO 19, CI19 CI019 Prm4 montante do ATG do gene dscC N/A 291 2 500bp imediatamente a

SEQ ID NO 19, CI19 CI019 Prm1.2 montante do códon de partida N/A 292 TTG do gene infC 170 bp imediatamente a

SEQ ID NO 19, CI19 CI019 Prm3.1 montante do códon de partida N/A 293 ATG do gene rplN 142bp imediatamente a montante do ATG de uma SEQ ID NO proteína hipotética altamente 19, CI20 CI020 Prm6.1 N/A 294 expressada (anotada como PROKKA_00662 em montagem de CI019 82) SEQ ID NO 293bp imediatamente a 19, CI21 CI021 Prm7.1 N/A 295 montante do ATG do gene lpp gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do 19-375, códon de partida ATG SEQ ID NO glnEΔAR- 19-417, CM67 eliminado, resultando em uma ds34 296 2 CM067 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1650bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnEΔAR- eliminado, resultando em uma 19-375, SEQ ID NO 2 com proteína glnE truncada sem o 19-417, CM67 ds34 297 flanco domínio de remoção de CM067 de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, 19-375, 845bp de nifL foram SEQ ID NO ΔnifL::n 19-417, CM67 eliminados e substituídos com nenhuma 298 ull-v1 CM067 a sequência de 31bp “GGAGTCTGAACTCATCCTGCGATGGGG GCTG”

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::n 845bp de nifL foram 19-375, ull-v1 eliminados e substituídos com

SEQ ID NO 19-417, CM67 com a sequência de 31bp nenhuma 299 CM067 flanco “GGAGTCTGAACTCATCCTGCGATGGGG de 500bp GCTG"; 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, 19-377, SEQ ID NO ΔnifL::n CM69 845bp de nifL foram nenhuma CM069 300 ull-v2 eliminados e substituídos com a sequência de 5bp “TTAAA" iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::n 845bp de nifL foram ull-v2 19-377, SEQ ID NO eliminados e substituídos com CM69 com nenhuma CM069 301 a sequência de 5bp “TTAAA"; flanco 500bp flanqueando o gene nifL de 500bp a montante e a jusante são incluídos iniciando em 221bp após o A 19-389, do códon de partida ATG, SEQ ID NO ΔnifL::P 19-418, CM81 845bp de nifL foram ds70 302 rm4 CM081 eliminados e substituídos com a sequência Prm4 CI19 iniciando em 221bp após o A do códon de partida ATG, ΔnifL::P 845bp de nifL foram 19-389, SEQ ID NO rm4 com eliminados e substituídos com 19-418, CM81 ds70 303 flanco a sequência Prm4 CI19; 500bp CM081 de 500bp flanqueando o gene nifL a montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG 137- SEQ ID NO glnE_KO2 eliminado, resultando em uma ds809 2084 191 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA)

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnE_KO2 eliminado, resultando em uma 137- SEQ ID NO com proteína glnE truncada sem o ds809 2084 192 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp 137- SEQ ID NO ΔnifL- de nifL foram eliminados e ds843 2084 203 Prm1.2 substituídos com a sequência promotora Prm1.2 137 iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp ΔnifL- de nifL foram eliminados e Prm1.2 137- SEQ ID NO substituídos com a sequência com ds843 2084 204 promotora Prm1.2 137; 500bp flanco flanqueando o gene nifL a de 500bp montante e a jusante são incluídos gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG 137- SEQ ID NO glnE_KO2 eliminado, resultando em uma ds809 2237 191 proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (RA) gene glnE com 1290bp imediatamente a jusante do códon de partida ATG glnE_KO2 eliminado, resultando em uma 137- SEQ ID NO com proteína glnE truncada sem o ds809 2237 192 flanco domínio de remoção de de 500bp adenilila (RA); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante são incluídos iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp 137- SEQ ID NO ΔnifL- de nifL foram eliminados e ds843 2237 203 Prm1.2 substituídos com a sequência promotora Prm1.2 137

Nova Junção ID de Associada Cepa SEQ ID NO Genótipo Descrição Cepa Se Aplicável iniciando em 24bp após o A do códon de partida ATG, 1372bp ΔnifL- de nifL foram eliminados e Prm1.2 137- SEQ ID NO substituídos com a sequência com ds843 2237 204 promotora Prm1.2 137; 500bp flanco flanqueando o gene nifL a de 500bp montante e a jusante são incluídos 81bp imediatamente a montante glsA2::P do códon de partida ATG foram 137- SEQ ID NO rm1.2_AT eliminados e substituídos com ds2551 2237 431 G- uma sequência promotora partida Prm1.2 137 81bp imediatamente a montante glsA2::P do códon de partida ATG foram rm1.2_AT eliminados e substituídos com G- 137- SEQ ID NO uma sequência promotora partida ds2551 2237 432 Prm1.2 137; 500bp flanqueando com o promotor Prm1.2 e o gene flanco glsA2 a montante e a jusante de 500bp são incluídos

Exemplo 7: Campanha de Remodelação Microbiana Guiada para a Melhoria Racional de Múltiplas Características Fenotípicas

[00609] Nesse exemplo, as etapas A-F descritas no Exemplo 1 foram usadas para gerar várias cepas derivadas não transgênicas da cepa de Klebsiella variicola tipo selvagem (WT), CI137. Primeiro, a cepa WT, CI137, foi isolada de uma rizosfera, caracterizada e domesticada usando as abordagens descritas nas etapas A-C do Exemplo 1.

[00610] Então, usando as abordagens descritas nas etapas D-F do Exemplo 1, múltiplas características fenotípicas de CI137 foram racionalmente melhoradas sem o uso de transgenes. Por exemplo, para testar se a característica de fixação de nitrogênio da cepa WT pode ser melhorada, vários genes envolvidos na fixação de nitrogênio como descrito ao longo desse pedido foram direcionados para a engenharia de mutações não intergenéricas, os micróbios manipulados geneticamente/remodelados foram analisados para fixação de nitrogênio, e as etapas de manipulação genética e análise foram iteradas para testar se melhorias adicionais podem ser feitas na capacidade de fixação de nitrogênio. Uma vez que uma melhoria substancial na capacidade de fixação de nitrogênio foi alcançada para uma cepa remodelada de CI137, os micróbios foram avaliados quanto à característica de colonização. Como as cepas remodeladas com fixação de nitrogênio melhorada mostraram colonização mais baixa do que a cepa WT, os genes envolvidos na colonização como descrito nesse pedido foram direcionados para a manipulação genética de mutações não intergenéricas para melhorar a colonização, os micróbios manipulados geneticamente/remodelados foram analisados para colonização e a manipulação genética e as etapas de análise foram iteradas.

[00611] Para gerar mutações não intergenéricas através do processo de remodelação iterativa, duas abordagens foram empregadas para remodelar a arquitetura genética subjacente do micróbio: (1) criar eliminações sem marcadores de sequências genômicas que codificam domínios de proteínas ou genes inteiros e (2) religação redes reguladoras por rearranjo de promotores intragenômicos.

[00612] As cepas remodeladas de CI137 obtidas por meio desse processo de remodelação iterativa que apresentaram melhoria na fixação e/ou colonização de nitrogênio são descritas a seguir.

[00613] Para testar se a característica de fixação de nitrogênio da cepa WT, CI137, pode ser melhorada, uma região de pares de bases de 1647 após o códon de partida do gene glnE foi excluída para produzir uma proteína GlnE truncada que não compreende a remoção de adenilila (AR) que resulta em uma glutamina sintetase constitutivamente adenililada. Esse CI137 remodelado é referido nesse documento como 137-1034. 137-1034 pode excretar amônia, enquanto a cepa WT não excreta amônia (FIG. 26). No entanto, 137-1034 mostrou colonização reduzida em comparação com a cepa WT (FIGs. 27-28). A etapa de geração de mutações não intergenéricas foi iterada para remodelar adicionalmente mais 137-1034 e para testar se qualquer melhoria na excreção de amônia pode ser obtida. Para isso, o gene nifL foi excluído de 20 bp após o códon de partida ATG para 87 bp antes do códon de parada TGA e um fragmento de 400 bp da região a montante do gene cspE contendo um promotor do gene cspE foi inserido (Prm1.2) a montante de nifA substituindo a parte excluída. Esse micróbio remodelado é referido nesse documento como 137-2084. Essa cepa mostrou excreção de amônia melhorada acima de 137-1034 (FIG. 26). Quando testado para o potencial de colonização, 137-2084 mostrou uma colonização ligeiramente melhor em comparação com 137-1034; no entanto, seu potencial de colonização ainda era menor em ~ 10 vezes em comparação com a cepa WT (FIGs. 27-28). A etapa de geração de mutações não intergenéricas foi iterada/repetida para testar se o potencial de colonização e a excreção de amônia poderiam ser melhorados. Especificamente, o gene nifL foi eliminado de 20 pb após o códon de partida ATG para 87 pb antes do códon de parada TGA; um fragmento de 400 pb da região a montante do gene cspE contendo um promotor do gene cspE foi inserido (Prm1.2) a montante de nifA substituindo a porção eliminada; e um fragmento de 400 pb da região a montante do gene cspE contendo um promotor do gene cspE foi inserido (Prm1.2) a montante do gene glsA2 substituindo o promotor nativo do gene. Essa cepa é referida nesse documento como 137-2237. 137-2237 mostrou níveis semelhantes de excreção de amônia melhorada como 137-2084 (FIG. 26) e, ao mesmo tempo, o potencial de colonização de 137-2237 foi similar ou ligeiramente melhorado em comparação com a cepa WT (FIGs. 27-28).

[00614] A descrição acima ilustra como as etapas D-F descritas no Exemplo 1 podem ser usadas para iterar mutações não intergenéricas para transformar melhorias em características múltiplas em micróbios remodelados.

[00615] O ensaio de excreção de amônia usado nesse documento é como descrito no Exemplo 2. Ensaio de Colonização

[00616] Resumidamente, as cepas foram cultivadas durante a noite em meio rico (SOB). As densidades ópticas dos meios de cultura contendo as respectivas cepas foram medidas, normalizadas para 1 e 1 mL do meio de cultura foi usado para inocular uma semente de milho durante o plantio em um vaso de cultivo. As plantas foram cultivadas por 3 semanas, depois retiradas dos vasos e as raízes foram lavadas para remover areia solta e detritos. Amostras de tecido radicular foram retiradas da raiz seminal e do primeiro nó (encontrado 1-2 polegadas abaixo da coroa), lavadas em PBS, e uma preparação de gDNA foi feita na solução.

[00617] Células por grama/peso fresco foram determinadas executando as preparações de gDNA através de qPCR usando iniciadores específicos de cepas. Uma descrição mais detalhada do ensaio pode ser encontrada em uma publicação PCT, WO/2019/032926, incorporada nesse documento por referência em sua totalidade.

[00618] As mutações acima descritas feitas na cepa CI137 WT estão resumidas na Tabela 33 abaixo. Tabela 33: Lista de Cepas de K. variicola Isoladas e Derivadas ID de Genótipo Mutação Descrição da mutação cepa Cepa de Klebsiella variicola de 137 WT WT tipo selvagem.

Eliminação de 1647 bp após o códon 137-1034 ΔglnEAR-KO2 ΔglnEAR-KO2 de partida do gene glnE.

Eliminação do gene nifL de 20 pb após ATG (início) a 87 pb antes do TGA (parada) do gene. Um fragmento de 400 pb da região a montante do ΔnifL::Prm1.2 gene cspE contendo um promotor do ΔnifL::Prm1.2, gene cspE foi inserido (Prm1.2) a 137-2084 ΔglnEAR-KO2, montante de nifA substituindo a porção eliminada. Eliminação de 1647 bp após o códon ΔglnEAR-KO2 de partida do gene glnE.

ID de Genótipo Mutação Descrição da mutação cepa Eliminação do gene nifL de 20 pb após ATG (início) a 87 pb antes do TGA (parada) do gene. Um fragmento de 400 pb da região a montante do ΔnifL::Prm1.2 gene cspE contendo um promotor do gene cspE foi inserido (Prm1.2) a montante de nifA substituindo a ΔnifL::Prm1.2, porção eliminada. 137-2337 ΔglnEAR-KO2, Eliminação de 1647 bp após o códon glsA2::Prm1.2 ΔglnEAR-KO2 de partida do gene glnE.

Um fragmento de 400 pb da região a montante do gene cspE contendo um promotor do gene cspE foi inserido glsA2::Prm1.2 (Prm1.2) a montante do gene glsA2 substituindo o promotor nativo do gene.

FORMAS DE REALIZAÇÃO NUMERADAS DA REVELAÇÃO

[00619] Não obstante as reivindicações anexas, a revelação estabelece as seguintes modalidades numeradas:

1. Método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. fornecer uma pluralidade de espécies microbianas que estão associadas a uma planta de interesse alvo; b. sequenciar os genomas da pluralidade de espécies microbianas e caracterizar uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas; c. ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização, genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; d. selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; e. transformar a espécie microbiana candidata com um plasmídeo de transformação compreendendo: i. um marcador de seleção, ii. um marcador de contrasseleção, iii. um fragmento de DNA compreendendo: uma variação genética não intergenérica a ser introduzida na espécie microbiana candidata em um local genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas e braços de homologia para o local genômico alvo que flanqueia a variação genética não intergenérica; e iv. estrutura do plasmídeo, f. selecionar uma espécie microbiana candidata que sofreu uma recombinação homóloga inicial e tem a variação genética não intergenérica integrada no local genômico alvo com base na presença do marcador de seleção no genoma; g. selecionar para uma espécie microbiana candidata que tem a variação genética não intergenérica integrada no local genômico alvo, mas sofreu uma recombinação homóloga adicional que desenovela a estrutura do plasmídeo, com base na ausência do marcador de contrasseleção; h. sequenciar o genoma da espécie microbiana candidata transformada e confirmar a integração da variação genética não intergenérica no local genômico alvo e ausência de qualquer sequência genética do plasmídeo de transformação; e i. repetir as etapas e)-h) uma ou mais vezes, até que uma espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada de desempenhar a função de interesse benéfica às plantas.

[00620] 2. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 1, em que a função de interesse benéfica às plantas é a fixação de nitrogênio.

[00621] 3. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 1, em que a função de interesse benéfica às plantas é a solubilização de fosfato.

[00622] 4. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 1, em que a função de interesse benéfica às plantas é a colonização microbiana.

[00623] 5. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a etapa b) compreende o sequenciamento do genoma completo.

[00624] 6. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-5, em que a etapa b) compreende a caracterização da via de fixação de nitrogênio.

[00625] 7. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-6, em que a etapa b) compreende a caracterização de um conjunto de genes selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase e combinações dos mesmos.

[00626] 8. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a etapa c) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização sob condições de estufa ou laboratório.

[00627] 9. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a etapa c) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização sob condições de campo.

[00628] 10. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a etapa c) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização sob condições de estufa ou laboratório, e também sob condições de campo.

[00629] 11. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-10, em que uma métrica de colonização ensaiada na etapa c) compreende pelo menos um dos seguintes: padrões de colonização espacial, dinâmica de colonização temporal, densidade de colonização ou combinações dos mesmos.

[00630] 12. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de estufa ou laboratório.

[00631] 13. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de estufa ou laboratório e compreende a medição do perfil transcriptômico das espécies microbianas.

[00632] 14. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de estufa ou laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de genes associados à capacidade da espécie microbiana de desempenhar uma função de interesse benéfica às plantas.

[00633] 15. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de estufa ou de laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores.

[00634] 16. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de estufa ou laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras.

[00635] 17. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de estufa ou laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno.

[00636] 18. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de estufa ou laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[00637] 19. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de campo.

[00638] 20. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de campo e compreende a medição do perfil transcriptômico do espécies microbianas.

[00639] 21. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica dos genes associado à capacidade da espécie microbiana de desempenhar uma função de interesse benéfica às plantas.

[00640] 22. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores.

[00641] 23. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras.

[00642] 24. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno.

[00643] 25. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[00644] 26. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre in vitro.

[00645] 27. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre in vitro e compreende a medição do perfil transcriptômico das espécies microbianas.

[00646] 28. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de genes associados com a capacidade da espécie microbiana de desempenhar uma função de interesse benéfica às plantas.

[00647] 29. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores.

[00648] 30. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras.

[00649] 31. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras em condições esgotadas de N e repletas de N.

[00650] 32. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes na etapa c) ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras sob condições esgotadas de N e repletas de N, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[00651] 33. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo.

[00652] 34. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-7, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições em estufa ou laboratório.

[00653] 35. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-7, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[00654] 36. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo.

[00655] 37. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-7, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de estufa ou laboratório.

[00656] 38. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[00657] 39. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-7, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização e genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[00658] 40. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a etapa c) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à capacidade de desempenhar uma função de interesse benéfica às plantas sob condições de estufa ou laboratório.

[00659] 41. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a etapa c) compreende o ensaio de uma pluralidade de espécies microbianas quanto à atividade de fixação de nitrogênio.

[00660] 42. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a etapa c) compreende o ensaio de uma pluralidade de espécies microbianas quanto à atividade de fixação de nitrogênio em um ensaio de redução de acetileno ou ensaio de excreção de amônio.

[00661] 43. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, em que o plasmídeo de transformação da etapa e) é um plasmídeo suicida.

[00662] 44. Método de remodelação microbiana guiada de acordo com qualquer uma das modalidades 1-43, em que a etapa h) compreende o sequenciamento do genoma completo.

[00663] 45. Método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; b. ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização, genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; c. selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; d. introduzir uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata em um local genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas, as referidas variações genéticas não intergenéricas selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações de pares de bases únicas e combinações das mesmas; e. sequenciamento do genoma das espécies microbianas candidatas e confirmação da integração da variação genética não intergenérica no local genômico alvo e ausência de qualquer sequência genética transgênica; e f. repetir as etapas d)-e) uma ou mais vezes, até que uma espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada de desempenhar a função de interesse benéfica às plantas.

[00664] 46. Método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; b. ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização, genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; c. selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; d. introduzir duas ou mais variações genéticas não intergenéricas direcionadas para as espécies microbianas candidatas em dois ou mais locais genômicos alvo, em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas, as referidas variações genéticas intergenéricas selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações de pares de bases únicas e combinações das mesmas; e e. sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata e confirmação da introdução das variações genéticas não intergenéricas nos locais genômicos alvo e ausência de qualquer sequência genética transgênica.

[00665] 47. Método de remodelação microbiana guiada por computador para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, compreendendo:

a. avaliar uma pluralidade de sequências do genoma microbiano completo; b. identificar uma pluralidade de sequências de genes reguladores que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; c. identificar uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; d. selecionar uma sequência de gene regulador e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades; em que as etapas a)-d) ocorrem in silico; e e. fabricar, in vivo, uma célula microbiana remodelada que tem a sequência do gene regulador selecionada operativamente ligada ao gene selecionado associado a uma função benéfica às plantas, melhorando assim a expressão gênica associada a uma função benéfica às plantas.

[00666] 48. Sistema de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. um ou mais processador(es); e b. uma ou mais memória(s) operativamente acoplada(s) a um ou mais processador(es) e tendo instruções armazenadas na(s) mesma(s), que quando executada(s) por um ou mais processador(es), fazem o sistema: i. avaliar uma pluralidade de sequências do genoma microbiano completo; ii. identificar uma pluralidade de sequências de genes reguladores que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante;

iii. identificar uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; e iv. selecionar uma sequência de gene regulador e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades.

[00667] 49. Método de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. ativar um sistema de computador tendo: um ou mais processador(es) e uma memória ou mais memórias operativamente acoplada(s) a um ou mais processador(es) e tendo instruções armazenadas no(s) mesmo(s), fazendo assim com que um ou mais processador(es) execute(m) as instruções e faça o sistema: i. avaliar uma pluralidade de sequências do genoma microbiano completo; ii. identificar uma pluralidade de sequências de genes reguladores que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; iii. identificar uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; iv. selecionar uma sequência de gene regulador e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades; e b. fabricar, in vivo, uma célula microbiana remodelada que tem a sequência do gene regulador selecionada operativamente ligada ao gene selecionado associado a uma função benéfica às plantas, melhorando assim a expressão gênica associada a uma função benéfica às plantas.

[00668] 50. Método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. fornecer uma pluralidade de espécies microbianas que estão associadas a uma planta de interesse alvo; b. ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; c. selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; d. introduzir uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para as espécies microbianas candidatas; e. confirmação da integração da variação genética não intergenérica no local genômico alvo e ausência de qualquer sequência transgenética; e f. repetir as etapas d) e e) uma ou mais vezes, até que a espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada de desempenhar a função de interesse benéfica às plantas.

[00669] 51. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 50, em que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes.

[00670] 52. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 50, compreendendo uma etapa de sequenciamento dos genomas da pluralidade de espécies microbianas obtidas na etapa a) e caracterizando uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma planta função de interesse benéfica às plantas.

[00671] 53. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa d) de introdução de uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata compreende: a. transformar a espécie microbiana candidata com um plasmídeo de transformação compreendendo: i. um marcador de seleção, ii. um marcador de contrasseleção, iii. um fragmento de DNA compreendendo: uma variação genética não intergenérica a ser introduzida na espécie microbiana candidata em um local genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados a uma função de interesse benéfica às plantas e braços de homologia para o local genômico alvo que flanqueia a variação genética não intergenérica, e iv. estrutura do plasmídeo; b. selecionar uma espécie microbiana candidata que sofreu uma recombinação homóloga inicial e tem a variação genética não intergenérica integrada no local genômico alvo com base na presença do marcador de seleção no genoma; e c. selecionar uma espécie microbiana candidata que tem a variação genética não intergenérica integrada no local genômico alvo, mas foi submetida a uma recombinação homóloga adicional que desdobra a estrutura do plasmídeo, com base na ausência do marcador de contrasseleção.

[00672] 54. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa e) de confirmação da integração da variação genética não intergenérica no local genômico alvo e a ausência de qualquer sequência transgenética compreende o sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata transformada.

[00673] 55. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 50, em que a etapa e) compreende a confirmação da ausência de qualquer sequência transgenética do plasmídeo de transformação.

[00674] 56. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a função de interesse benéfica às plantas é a fixação de nitrogênio.

[00675] 57. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a função de interesse benéfica às plantas é a solubilização de fosfato.

[00676] 58. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a função de interesse benéfica às plantas é a colonização microbiana.

[00677] 59. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 52, em que a etapa de sequenciamento compreende o sequenciamento do genoma completo.

[00678] 60. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 52, que compreende a caracterização da via de fixação de nitrogênio.

[00679] 61. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 52, compreendendo a caracterização de um conjunto de genes selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica a glutamina sintetase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, e combinações dos mesmos.

[00680] 62. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 52, compreende a caracterização de um ou mais de genes envolvidos em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina.

[00681] 63. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 52, que compreende a caracterização de um ou mais de genes selecionados do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos.

[00682] 64. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 52, compreendendo a caracterização de um ou mais de genes selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica a glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos.

[00683] 65. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à métrica de colonização sob condições de estufa ou laboratório.

[00684] 66. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à métrica de colonização sob condições de campo.

[00685] 67. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à métrica de colonização sob condições de estufa ou laboratório, e também sob condições de campo.

[00686] 68. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que uma métrica de colonização testada na etapa b) compreende pelo menos um dos seguintes: padrões de colonização espacial, dinâmica de colonização temporal, densidade de colonização ou combinações dos mesmos.

[00687] 69. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de estufa ou de laboratório.

[00688] 70. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto aos genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes ocorre sob condições de estufa ou laboratório e compreende a medição do perfil transcriptômico das espécies microbianas.

[00689] 71. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de estufa ou de laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de genes associados à capacidade da espécie microbiana para realizar uma função de interesse benéfica às plantas.

[00690] 72. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de estufa ou laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores.

[00691] 73. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes ocorre sob condições de estufa ou de laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras.

[00692] 74. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de estufa ou de laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno.

[00693] 75. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de estufa ou de laboratório e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[00694] 76. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto aos genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes ocorre sob condições de campo.

[00695] 77. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de campo e compreende a medição do perfil transcriptômico das espécies microbianas.

[00696] 78. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de genes associados com a capacidade da espécie microbiana de realizar uma função de interesse benéfica às plantas.

[00697] 79. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores.

[00698] 80. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto aos genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras.

[00699] 81. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno.

[00700] 82. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[00701] 83. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes ocorre in vitro.

[00702] 84. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro e compreende a medição do perfil transcriptômico das espécies microbianas.

[00703] 85. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de genes associados à capacidade da espécie microbiana de realizar uma função de interesse benéfica às plantas.

[00704] 86. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladores.

[00705] 87. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras.

[00706] 88. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras sob condições esgotadas de N e repletas de N.

[00707] 89. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro e compreende a medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras sob condições esgotadas de N e repletas de N, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

[00708] 90. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 50, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo.

[00709] 91. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 50, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de estufa ou laboratório.

[00710] 92. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[00711] 93. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo.

[00712] 94. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de estufa ou laboratório.

[00713] 95. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[00714] 96. O método de remodelação microbiana guiada de acordo com a modalidade 51, em que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização e genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições de campo.

[00715] 97. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas sob condições de estufa ou laboratório.

[00716] 98. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à atividade de fixação de nitrogênio.

[00717] 99. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto à atividade de fixação de nitrogênio em um ensaio de redução de acetileno ou ensaio de excreção de amônio.

[00718] 100. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 50, em que o plasmídeo de transformação é um plasmídeo suicida.

[00719] 101. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 54, em que o sequenciamento compreende o sequenciamento do genoma completo.

[00720] 102. Método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; b. ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; c. selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; d. introduzir uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para as espécies microbianas candidatas em um local genômico alvo em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados com uma função de interesse benéfica às plantas; e. confirmar a integração da variação genética não intergenérica no local genômico alvo e ausência de qualquer sequência genética transgênica; e f. repetir as etapas d)-e) uma vez ou mais vezes, até que uma espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada de desempenhar a função de interesse benéfica às plantas.

[00721] 103. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 102, em que a etapa b) compreende o ensaio de genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes.

[00722] 104. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 102, em que na etapa d), as referidas variações genéticas não intergenéricas são selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações de pares de bases únicas e combinações das mesmas.

[00723] 105. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 102, em que a etapa e) compreende o sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata.

[00724] 106. Método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para desempenhar funções benéficas às plantas, compreendendo: a. fornecer uma pluralidade de espécies microbianas; b. ensaio da pluralidade de espécies microbianas quanto a: métricas de colonização e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; c. selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas testadas; d. introduzir duas ou mais variações genéticas não intergenéricas direcionadas para as espécies microbianas candidatas em dois ou mais locais genômicos alvo, em uma ou mais de vias genômicas, ou conjuntos de genes, que estão associados com uma função de interesse benéfica às plantas; e e. confirmar a introdução das variações genéticas não intergenéricas nos locais genômicos alvo e a ausência de qualquer sequência genética transgênica.

[00725] 107. O método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 106, em que a etapa b) compreende o ensaio de genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes.

[00726] 108. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 106, em que na etapa d), as referidas variações genéticas não intergenéricas são selecionadas do grupo que consiste em: eliminações completas de genes, eliminações parciais de genes, inserções de promotores, alterações de pares de bases únicas e combinações das mesmas.

[00727] 109. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a modalidade 106, em que a etapa e) compreende o sequenciamento do genoma das espécies microbianas candidatas.

[00728] Embora modalidades preferidas da presente revelação tenham sido mostradas e descritas nesse documento, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, mudanças e substituições ocorrerão agora para aqueles habilitados na técnica sem se afastar da revelação. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da revelação descritas nesse documento podem ser empregadas na prática da revelação. Pretende-se que as reivindicações a seguir definam o escopo da revelação e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam cobertos por elas.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00729] Todas a(o)s referências, artigos, publicações, patentes, publicações de patentes e pedidos de patentes citados nesse documento são incorporada(o)s por referência em sua totalidade para todos as finalidades.

No entanto, a menção de qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente citados nesse documento não é, e não deve ser tomada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que constituem técnica anterior válida ou fazem parte do comum conhecimento geral em qualquer país do mundo.

Além disso, a Patente U.S.

N 9.975.817, concedida em 22 de maio de 2018 e intitulada: Methods and Compositions for Improving Plant Traits, é incorporada nesse documento por referência.

Além disso, PCT/US2018/013671, depositado em 12 de janeiro de 2018 e intitulado: Methods and Compositions for Improving Plant Traits, é incorporado nesse documento por referência.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Método de remodelação microbiana guiada para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, caracterizado pelo fato de que compreende: a. fornecer uma pluralidade de espécies microbianas que estão associadas a uma planta alvo de interesse; b. fazer ensaio da pluralidade de espécies microbianas para: métricas de colonização e capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas; c. selecionar uma espécie microbiana candidata a partir da pluralidade de espécies microbianas submetidas a ensaio; d. introduzir uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para as espécies microbianas candidatas; e. confirmar a integração da variação genética não intergenérica no local genômico alvo e a ausência de qualquer sequência transgenética; e f. repetir as etapas d) e e) uma ou mais vezes, até que a espécie microbiana candidata tenha adquirido uma capacidade melhorada de realizar a função de interesse benéfica às plantas.

2. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos sob condições ambientais metabolicamente relevantes.

3. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de sequenciamento dos genomas da pluralidade de espécies microbianas obtidas na etapa a) e caracterização de um(a) ou mais de vias genômicas, ou de conjuntos de genes, que estão associado(a)s a uma função de interesse benéfica às plantas.

4. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa d) de introdução de uma ou mais de variações genéticas não intergenéricas direcionadas para a espécie microbiana candidata compreende: a. transformar a espécie microbiana candidata com um plasmídeo de transformação compreendendo (i) um marcador de seleção, (ii) um marcador de contrasseleção, (iii) um fragmento de DNA compreendendo: uma variação genética não intergenérica a ser introduzida na espécie microbiana candidata em um local genômico alvo em um(a) ou mais de vias genômicas, ou de conjuntos de genes, que estão associado(a)s a uma função de interesse benéfica às plantas, e braços de homologia com o local genômico alvo flanqueando a variação genética não intergenérica e (iv) esqueleto do plasmídeo; b. selecionar uma espécie microbiana candidata que sofreu uma recombinação homóloga inicial e tem a variação genética não intergenérica integrada no local genômico alvo com base na presença do marcador de seleção no genoma; e c. selecionar uma espécie microbiana candidata que tem a variação genética não intergenérica integrada no local genômico alvo, mas foi submetida a uma recombinação homóloga adicional que desenovela a estrutura do plasmídeo, com base na ausência do um marcador de contrasseleção.

5. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa e) de confirmação da integração da variação genética não intergenérica no local genômico alvo e ausência de qualquer sequência transgenética compreende o sequenciamento do genoma da espécie microbiana candidata transformada.

6. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a função de interesse benéfica às plantas é a fixação de nitrogênio, solubilização de fosfato, ou colonização microbiana.

7. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de sequenciamento compreende o sequenciamento do genoma completo.

8. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a caracterização da via de fixação de nitrogênio.

9. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende a caracterização de um ou mais de genes envolvidos em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina.

10. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende a caracterização de um ou mais de genes selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ,

um gene associado à biossíntese de uma nitrogenase, bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos.

11. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métrica de colonização sob condições com base em condições de estufa ou laboratório, e/ou também sob condições de campo.

12. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma métrica de colonização submetida a ensaio na etapa b) compreende pelo menos um dos seguintes: padrões de colonização espacial, dinâmica de colonização temporal, densidade de colonização ou combinações dos mesmos.

13. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro, sob condições de estufa ou de laboratório ou de campo e compreende a medição do perfil transcriptômico das espécies microbianas.

14. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro, sob condições com base em estufa ou laboratório ou de campo e compreende a medição da atividade transcriptômica de genes associados à capacidade da espécie microbiana de realizar uma função de interesse benéfica às plantas.

15. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre sob condições com base em estufa ou laboratório ou de campo e compreende pelo menor um de: medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladoras; medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras; medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno; e medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras na presença de nitrogênio exógeno, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado

16. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, ocorre in vitro e compreende compreende pelo menos um de: medição da atividade transcriptômica de sequências de genes reguladoras; medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras; medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras em condições N-depletadas e N-repletas; e medição da atividade transcriptômica de sequências promotoras em condições N-depletadas e N-repletas, em que a referida atividade transcriptômica das sequências promotoras é medida pela quantificação da expressão de um gene regulado.

17. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para métricas de colonização compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições com base em estufa ou laboratório, e/ou condições de campo.

18. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para genes transcricionalmente ativos, sob condições ambientais metabolicamente relevantes, compreende: o cultivo da referida pluralidade de espécies microbianas em associação íntima com uma planta alvo sob condições com base em estufa ou laboratório, e/ou condições de campo.

19. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para a capacidade de realizar uma função de interesse benéfica às plantas sob condições com base em estufa ou laboratório.

20. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende o ensaio de uma pluralidade de espécies microbianas para a atividade de fixação de nitrogênio.

21. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende o ensaio da pluralidade de espécies microbianas para a atividade de fixação de nitrogênio em um ensaio de redução de acetileno ou ensaio de excreção de amônio.

22. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sequenciamento compreende o sequenciamento do genoma completo.

23. Método de remodelação microbiana guiada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa d), as referidas variações genéticas não intergenéricas são selecionadas do grupo que consiste em: deleções de genes completas, deleções de genes parciais, inserções de promotores, alterações de pares de bases únicas e combinações das mesmas.

24. Método de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, caracterizado pelo fato de que compreende: a. acessar uma pluralidade de sequências de genomas microbianos inteiros; b. identificar uma pluralidade de sequências de genes reguladoras que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; c. identificar uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; d. selecionar uma sequência de gene reguladora e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades; em que as etapas a)-d) ocorrem in silico; e e. fabricar, in vivo, uma célula microbiana remodelada que tem a sequência de genes reguladora selecionada operacionalmente ligada ao gene selecionado associado a uma função benéfica às plantas, melhorando assim a expressão do gene associado a uma função benéfica às plantas.

25. Sistema de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um ou mais de processadores; e b. uma ou mais de memórias operacionalmente acopladas a um ou mais de processadores e tendo instruções armazenadas nas mesmas, que quando executadas por um ou mais de processadores, fazem com que o sistema: i. acesse uma pluralidade de sequências de genomas microbianos inteiros; ii. identifique uma pluralidade de sequências de genes reguladoras que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; iii. identifique uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; e iv. selecione uma sequência de genes reguladora e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades.

26. Método de remodelação microbiana guiada computacionalmente para a melhoria racional de micróbios associados a plantas para realizar funções benéficas às plantas, caracterizado pelo fato de que compreende: a. ativar um sistema de computador tendo: um ou mais de processadores e uma ou mais de memórias operacionalmente acopladas a um ou mais de processadores e tendo instruções armazenadas nos mesmos, fazendo assim com que um ou mais processadores execute(m) as instruções e faça(m) com que o sistema: i. acesse uma pluralidade de sequências de genomas microbianos inteiros; ii. identifique uma pluralidade de sequências de genes reguladoras que regulam ativamente a transcrição de um gene sob uma condição ambiental metabolicamente relevante; iii. identifique uma pluralidade de genes associados a uma função benéfica às plantas; iv. selecione uma sequência de genes reguladora e um gene associado a uma função benéfica às plantas a partir das referidas pluralidades; e b. fabrique, in vivo, uma célula microbiana remodelada que tem a sequência de genes reguladora selecionada operacionalmente ligada ao gene selecionado associado a uma função benéfica às plantas, melhorando assim a expressão do gene associado a uma função benéfica às plantas.