JP2021529522A - 農業用微生物種の合理的改善のためのプラットフォームとしての微生物リモデリング誘導 - Google Patents

農業用微生物種の合理的改善のためのプラットフォームとしての微生物リモデリング誘導 Download PDF

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Abstract

本開示は、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）法を提供する。本明細書中に記載のＧＭＲ法は、植物に有利な機能を野生型微生物を超えるように改善するが、トランスジェニック手法と関連するリスク（例えば、予測不可能な遺伝子機能、公的および規制上の懸念など）を持たないように微生物内の重要な制御ネットワークを非属間で遺伝的に最適化することが可能である。本開示はまた、リモデリングされた微生物およびその組成物を提供する。リモデリングされた微生物およびその組成物を利用すると、農業従事者は、伝統的に合成的に誘導された肥料と関連する栄養素の分解、浸出、または毒素の流出を伴わずに、より生産性が高く、かつ予測可能な収穫高を実現することができるであろう。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２７日出願の米国特許仮出願第６２／６９０，６１９号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
配列表の参照による援用
本明細書とともに電子的に提出した以下のテキストファイルの内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される：ファイル名：ＰＩＶＯ＿００７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日２０１９年６月２６日、ファイルサイズ約６０２キロバイトである配列表のコンピュータ可読形式のコピー。
開示の背景
国際連合食糧農業機関は、人口増加のニーズに対応するためには２０５０年までに世界全体の食糧生産を７０％増加させる必要があると推定しており、この課題は、淡水資源の減少、耕地争奪の激化、エネルギー価格の上昇、投入原価の増加などが挙げられる多くの要因によって深刻化しており、さらなる乾燥、さらなる気温上昇、より過酷な全地球的気候という苦難に対応する作物が必要である。
現在の農業は、この食糧生産に対する需要の増加を満たすと同時に農業にさらに重点を置くことに起因する環境への影響とバランスを取るようには十分に対応していない。
世界的な食糧需要を満たすために必要とされる主な農業資本のうちの１つは窒素肥料である。しかしながら、窒素肥料を生産するために利用される現行の標準的な工業的方法は、ハーバー・ボッシュ法と呼ばれる人工的な窒素固定法であり、この方法は、高温高圧下で金属触媒を使用して水素（Ｈ２）と反応させることにより大気窒素（Ｎ２）をアンモニア（ＮＨ３）に変換する。このプロセスは、資源集約的で環境に有害である。
ハーバー・ボッシュ合成法と対照的に、大気窒素を固定するためのある特定の生物学的システムが進化を遂げている。これらのシステムは、Ｎ２とＨ２との間の反応を触媒するニトロゲナーゼと呼ばれる酵素を利用し、その結果窒素が固定される。例えば、根粒菌は、マメ科植物の根粒の内側に定着されるようになった後に窒素を固定するジアゾ栄養微生物である。窒素固定研究の重要な目的は、この表現型を、マメ科以外の植物、特に、作物栽培学的に重要なイネ科植物（コムギ、イネ、およびトウモロコシなど）に拡張することである。しかしながら、根粒菌とマメ科植物との間の窒素固定共生の発達に関する理解が著しく進展しているにもかかわらず、非マメ科作物に窒素固定根粒を誘導する知識を使用するための道筋は依然として明確ではない。
したがって、大多数の現代の条植え作物農業は、資源集約的で環境に有害なハーバー・ボッシュ法によって生産された窒素肥料を利用する。例えば、ＵＳＤＡは、平均的な米国のトウモロコシ農業従事者が典型的にはエーカーあたり１３０と２００ｌｂとの間（１４６〜２２４ｋｇ／ｈａ）の窒素を散布していることを示している。この窒素は、資源集約的な合成プロセスで生産されるだけでなく、重機による横断／土壌への影響、石油の燃焼、および長時間の労働によって散布される。
さらに、工業的ハーバー・ボッシュ法によって生産された窒素肥料は、標的作物によって十分に利用されない。雨、流出、熱、揮発、および土壌マイクロバイオームが散布した化学肥料を分解する。これは浪費に等しいだけでなく、収穫高と引き換えに汚染を増大させる。この目的のために、国際連合の算出によると、作物が肥料を利用できる前にほぼ８０％の肥料が喪失される。したがって、現代の農業用肥料の生産および送達は、環境に有害なだけでなく、極めて非効率である。
世界的に増大している食糧供給のニーズを満たしながら、資源活用と環境システムへの影響を最小にすることのバランスも取るために、窒素の固定および植物への送達へのより良い手法が緊急に必要とされている。
開示の概要
植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）法を本明細書中に提供する。
１つの態様では、ＧＭＲ法は、（ａ）目的の標的植物と連携する複数の微生物種を準備する工程；（ｂ）前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；（ｃ）前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；（ｄ）１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を前述の候補微生物種に導入する工程；（ｅ）標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認する工程；および（ｆ）前述の候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）およびｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程を含む。
１つの態様では、前述の複数の微生物種をアッセイする工程ｂ）は、前述の複数の微生物種を、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを含む。
１つの態様では、ＧＭＲ法は、工程ａ）で得た前述の複数の微生物種のゲノムを配列決定し、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群を特徴づける工程を含む。
１つの態様では、１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を前述の候補微生物種に導入する工程ｄ）は、（ａ）前述の候補微生物種を、（ｉ）選択マーカー、（ｉｉ）対抗選択マーカー、（ｉｉｉ）ＤＮＡ断片であって、候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に導入すべき非属間遺伝子変異、および前述の非属間遺伝子変異に隣接する前述の標的ゲノム遺伝子座に対するホモロジーアームを含むＤＮＡ断片、および（ｉｖ）プラスミドバックボーンを含む形質転換プラスミドで形質転換する工程；（ｂ）前述のゲノム中の選択マーカーの存在に基づいて、最初の相同組換えを受けており、かつ前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有する候補微生物種を選択する工程；および（ｃ）前述の対抗選択マーカーの非存在に基づいて、前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有するが、プラスミドバックボーンをループアウトするさらなる相同組換えを受けている候補微生物種を選択する工程を含む。
１つの態様では、標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認する工程ｅ）は、前述の形質転換された候補微生物種のゲノムを配列決定すること、および形質転換された候補微生物種のゲノム由来の任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認することを含む。１つの態様では、工程ｅ）は、前述の形質転換プラスミド由来の任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認することを含む。
１つの態様では、ＧＭＲ法は、（ａ）目的の標的植物と連携する複数の微生物種を準備する工程；（ｂ）前述の複数の微生物種のゲノムを配列決定し、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群を特徴づける工程；（ｃ）前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子、および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；（ｄ）前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；（ｅ）前述の候補微生物種を、（ｉ）選択マーカー、（ｉｉ）対抗選択マーカー、（ｉｉｉ）ＤＮＡ断片であって、候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に導入すべき非属間遺伝子変異、および前述の非属間遺伝子変異に隣接する前述の標的ゲノム遺伝子座に対するホモロジーアームを含むＤＮＡ断片；および（ｉｖ）プラスミドバックボーンを含む形質転換プラスミドで形質転換する工程；（ｆ）前述のゲノム中の選択マーカーの存在に基づいて、最初の相同組換えを受けており、かつ前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有する候補微生物種を選択する工程；（ｇ）前述の対抗選択マーカーの非存在に基づいて、前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有するが、プラスミドバックボーンをループアウトするさらなる相同組換えを受けている候補微生物種を選択する工程；（ｈ）前述の形質転換された候補微生物種のゲノムを配列決定し、前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび前述の形質転換プラスミド由来の任意の遺伝的配列の非存在を確認する工程；および（ｉ）候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｅ）〜ｈ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程を含む。
１つの態様では、本明細書中に記載の方法における目的の植物に有利な機能は、窒素固定、リン酸塩可溶化、微生物コロニー化、またはこれらの組合せであり得る。
１つの態様では、前述の複数の微生物種のゲノムを配列決定し、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群を特徴づける工程（例えば、上記の方法の工程ｂ）は、全ゲノム配列決定および／または窒素固定経路を特徴づけることを含む。
１つの態様では、窒素固定経路を特徴づけることは、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組合せからなる群から選択される遺伝子群を特徴づけることを含む。
１つの態様では、微生物コロニー化経路を特徴づけることは、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する１またはそれを超える遺伝子を特徴づけることを含む。
１つの態様では、微生物コロニー化経路を特徴づけることは、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子を特徴づけることを含む。
１つの態様では、微生物コロニー化経路を特徴づけることは、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子を特徴づけることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程は、前述の複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下および／または圃場条件下でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む。
１つの態様では、コロニー化の測定基準は、以下：空間的コロニー化パターン、時間的コロニー化動態、コロニー化の密度、またはこれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程を、温室または実験室ベースの条件下で実施する。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程を、圃場条件下で実施する。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程を、温室または実験室ベースの条件下；圃場条件下；および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程を、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイは、（ｉ）前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定すること；（ｉｉ）前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｉｉｉ）制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｉｖ）プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｖ）外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；および／または（ｖｉ）外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することであって、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、測定することを含む。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程を、圃場条件下で実施し、前述のアッセイは、（ｉ）前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定すること；（ｉｉ）前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｉｉｉ）制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｉｖ）プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｖ）外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；および／または（ｖｉ）外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することであって、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、測定することを含む。
１つの態様では、（例えば、上記方法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイは、（ｉ）前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定すること；（ｉｉ）前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｉｉｉ）制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｉｖ）プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；（ｖ）窒素枯渇条件および窒素充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定すること；および／または（ｖｉ）窒素枯渇条件および窒素充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することであって、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、測定することを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程は、標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程は、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程は、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程は、温室または実験室ベースの条件下および圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程は、標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程は、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程は、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程は、温室または実験室ベースの条件下および圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、（例えば、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて）前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準および代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイする工程は、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む。
１つの態様では、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて前述の複数の微生物種をアッセイする工程は、前述の複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下で目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイすることを含む。
１つの態様では、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｃにおいて前述の複数の微生物種をアッセイする工程は、前述の複数の微生物種を窒素固定活性についてアッセイすることを含む。１つの態様では、窒素固定活性を、アセチレン還元アッセイまたはアンモニウム排出アッセイにおいてアッセイする。
１つの態様では、上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｅで使用される形質転換プラスミドは、自殺プラスミドである。
１つの態様では、前述の形質転換された候補微生物種のゲノムを配列決定し、前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび前述の形質転換プラスミド由来の任意の遺伝的配列の非存在を確認する工程（上記の微生物リモデリング誘導法の工程ｈ）は、全ゲノム配列決定を含む。
１つの態様では、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、（ａ）複数の微生物種を準備する工程；（ｂ）前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；（ｃ）前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；（ｄ）前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に、１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程；（ｅ）前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程；および（ｆ）候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）〜ｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程を含む、微生物リモデリング誘導法を本明細書中に提供する。この実施形態のさらなる態様では、工程ｂ）は、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子をアッセイすることを含む。この実施形態のさらなる態様では、工程ｄ）において、前述の非属間遺伝子変異は、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される。この実施形態のなおさらなる態様では、工程ｅ）は、前述の候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む。
１つの態様では、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、（ａ）複数の微生物種を準備する工程；（ｂ）前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；（ｃ）前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；（ｄ）前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の２またはそれを超える標的ゲノム遺伝子座に、２またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程；および（ｅ）前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の導入および任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程を含む、微生物リモデリング誘導法を本明細書中に提供する。この実施形態のさらなる態様では、工程ｂ）は、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子をアッセイすることを含む。この実施形態のさらなる態様では、工程ｄ）において、前述の非属間遺伝子変異は、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される。この実施形態のさらなる態様では、工程ｅ）は、前述の候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む。
１つの態様では、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、（ａ）複数の微生物種を準備する工程；（ｂ）前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子、および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；（ｃ）前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；（ｄ）前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に、１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程であって、前述の非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、導入する工程；（ｅ）前述の候補微生物種のゲノムを配列決定し、前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程；および（ｆ）候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）〜ｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程を含む、微生物リモデリング誘導法を本明細書中に提供する。
１つの態様では、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、（ａ）複数の微生物種を準備する工程；（ｂ）前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子、および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；（ｃ）前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；（ｄ）前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の２またはそれを超える標的ゲノム遺伝子座に、２またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程であって、前述の非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、導入する工程；および（ｅ）前述の候補微生物種のゲノムを配列決定し、前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の導入および任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程を含む、微生物リモデリング誘導法を本明細書中に提供する。
１つの態様では、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導法であって、（ａ）複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスする工程；（ｂ）代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定する工程；（ｃ）植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定する工程；（ｄ）前述の複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する工程であって、ここで、工程ａ）〜ｄ）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施する、選択する工程；および（ｅ）前述の選択された植物に有利な機能と関連する遺伝子に作動可能に連結された前述の選択された制御遺伝子配列を有し、それにより、前述の植物に有利な機能と関連する遺伝子の発現が改善されているリモデリングされた微生物細胞をｉｎ ｖｉｖｏで製造する工程を含む、微生物リモデリング誘導法を提供する。
１つの態様では、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導システムであって、（ａ）１またはそれを超えるプロセッサ；および（ｂ）前述の１またはそれを超えるプロセッサに動作可能に接続され、かつ命令が格納されている１またはそれを超えるメモリであって、前述の１またはそれを超えるプロセッサによって実行された場合、前述のシステムは、（ｉ）複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスし；（ｉｉ）代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定し；（ｉｉｉ）植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定し；そして（ｉｖ）前述の複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する、１またはそれを超えるメモリを含む、計算による微生物リモデリング誘導システムを提供する。
１つの態様では、植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導法であって、（ａ）１またはそれを超えるプロセッサおよび前述の１またはそれを超えるプロセッサに動作可能に接続され、かつ命令が格納されている１またはそれを超えるメモリを有するコンピュータシステムの実行を開始させ、それにより、前述の１またはそれを超えるプロセッサが前述の命令を実行し、そして前述のシステムが、（ｉ）複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスし；（ｉｉ）代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定し；（ｉｉｉ）植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定し；（ｉｖ）前述の複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する、実行を開始する工程；および（ｂ）前述の選択された植物に有利な機能と関連する遺伝子に作動可能に連結された前述の選択された制御遺伝子配列を有し、それにより、前述の植物に有利な機能と関連する遺伝子の発現が改善されているリモデリングされた微生物細胞をｉｎ ｖｉｖｏで製造する工程を含む、計算による微生物リモデリング誘導法を提供する。
図１Ａは、実施形態に従った微生物リモデリング誘導プロセスの概要を示す。
図１Ｂは、図１Ａに示したマイクロバイオーム組成の測定の拡大図を示す。
図１Ｃは、教示した微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「伝統的なバイオプロスペクティング」手法を示す。
図１Ｄは、教示した微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「バイオプロスペクティングへのフィールドファースト手法」システムを示す。
図１Ｅは、トウモロコシの成長周期中の植物が窒素を最も必要とする時点を示す。
図１Ｆは、リモデリングされた微生物のための圃場開発プロセスの概要を示す。
図１Ｇは、微生物リモデリング誘導プラットフォーム実施形態の概要を示す。
図１Ｈは、計算による微生物リモデリング誘導プラットフォームの概要を示す。
図１Ｉは、微生物リモデリング誘導プラットフォームの態様におけるモデリングと組み合わせた圃場データの使用を示す。
図１Ｊは、本開示のリモデリングされた微生物が保有することができる５つの性質を示す。
図１Ｋは、微生物ＰＢＣ６．１のモデリング手法の略図を示す。
図１Ｌは、リモデリングされた微生物における内因性窒素制御からのｎｉｆＡ発現の分離を示す。
図１Ｍは、リモデリングされた微生物による固定窒素の同化および排出の改善を示す。
図１Ｎは、リモデリングされた微生物に起因するトウモロコシ収穫高の改善を示す。
図１Ｏは、施肥不足の圃場、過剰に施肥された圃場、および環境に有害な窒素流出をもたらす現在の窒素送達システムの非効率さを示す。
図２は、ＰＢＣ６．１が、根連携微生物叢のほぼ２１％の存在量までトウモロコシ根でコロニー化することを示す。存在量データは、ＰＢＣ６．１を接種し、温室条件で成長させたトウモロコシ植物の根圏および内圏の１６Ｓアンプリコン配列決定に基づいている。
図３Ａ〜３Ｅは、高硝酸塩農業土壌に類似する条件下で窒素をｉｎ ｖｉｔｒｏで固定および排出する誘導体微生物を示す。図３Ａは、重要な連結点であるＮｉｆＬ、ＮｉｆＡ、ＧＳ、２ドメインＡＴａｓｅ−ＡＲ酵素として示されているＧｌｎＥ、およびＡｍｔＢを含む、ＰＢＣ６．１において窒素固定および同化を制御する制御ネットワークを示す。図３Ｂは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ分離株ＰＢＣ６．１のゲノムを示す。ゲノムの周りの３つのトラックは、それぞれＰＢＣ６．１、ＰＢＣ６．３８の転写データ、および菌株間の発現差異を示す。図３Ｃは、窒素固定遺伝子クラスターを示し、転写データは、詳細をより詳しく示すための拡大されている。図３Ｄは、様々な濃度の外因性窒素下におけるニトロゲナーゼ活性が、アセチレン還元アッセイで測定されていることを示す。野生型菌株は、グルタミン濃度が増加すると共にニトロゲナーゼ活性の抑制を示すが、誘導体菌株は、様々な程度の頑強性を示す。折れ線グラフにおいて、三角は菌株ＰＢＣ６．２２を示し；円は菌株ＰＢＣ６．１を示し；四角は菌株ＰＢＣ６．１５を示し；菱形は菌株ＰＢＣ６．１４を示す。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的反復物の平均の標準誤差を表わす。図３Ｅは、誘導体菌株によるアンモニアの経時的な排出が、ｍＭ濃度で観察されることを示す。野生型菌株は、固定窒素を排出することが観察されず、培地に蓄積するアンモニアは無視できる程度である。エラーバーは、平均の標準誤差を表わす。
図４は、ＰＢＣ６．１の誘導体菌株におけるｎｉｆＡの転写率が、アセチレン還元速度と相関していたことを示す。ＡＲＡアッセイを、「方法」に記載の通りに実施し、その後、培養物を試料採取し、ｑＰＣＲ分析にかけて、ｎｉｆＡ転写物レベルを決定した。エラーバーは、各測定での少なくとも３つの生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。
図５Ａ〜５Ｃは、温室実験により、トウモロコシ中での微生物窒素固定が実証されていることを示す。図５Ａは、ＰＢＣ６．１誘導体菌株によってトウモロコシ植物に接種した６週間後の微生物コロニー化を示す。エラーバーは、少なくとも８つの生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。図５Ｂは、全ＲＮＡを根から抽出し、その後Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析を行うことにより測定したｎｉｆＨのｉｎ ｐｌａｎｔａ転写を示す。誘導体菌株のみが、根環境にてｎｉｆＨ転写を示す。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。図５Ｃは、植物組織での同位体トレーサーの希釈により測定された微生物窒素固定を示す。誘導体微生物は、植物への固定窒素の実質的な移入を示す。エラーバーは、少なくとも１０の生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。
図６は、菌株ＣＩ００６に由来する改変菌株の系統を示す。
図７は、菌株ＣＩ０１９に由来する改変菌株の系統を示す。
図８は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。ヒートマップの下方にある表は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ Ｎ／微生物 時間）を示している。ヒートマップに使用されている微生物は、トウモロコシでのＮ産生についてアッセイされた。ＷＴ菌株ＣＩ００６およびＣＩ０１９の場合、トウモロコシ根コロニー化データは、単一の圃場現場から得た。残りの菌株の場合、コロニー化は、ＷＴ圃場レベルと同じであると仮定した。Ｎ固定活性は、５ｍＭグルタミンでのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＲＡアッセイを使用して決定した。
図９は、菌株ＣＩ００６に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
図１０は、菌株ＣＭ０２９に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
図１１は、菌株ＣＭ０３８に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
図１２は、菌株ＣＩ０１９に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
図１３は、菌株ＣＭ０８１に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
図１４は、菌株ＣＭ０２９およびＣＭ０８１に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
図１５は、集計したブッシェル増加／喪失として植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
図１６は、２０１７年夏の圃場試験実験の結果を示す。得られた収穫高の結果は、本開示の微生物が、潜在的な肥料置換物としての役目を果たすことができることを実証する。例えば、本開示の微生物（すなわち、６−４０３）の使用は、野生型菌株（ＷＴ）より高い収穫高および未処理対照（ＵＴＣ）よりも高い収穫高をもたらした。「−２５ｌｂ Ｎ」処理では、その地域の標準的農作業よりも１エーカー当たり２５ｌｂ少ないＮが使用される。「１００％Ｎ」ＵＴＣ処理は、その地域の標準的農作業を示すことが意図されており、Ｎの標準的使用の１００％が、農業従事者により配置される。微生物「６−４０３」は、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託され、表１に見出すことができる。これは変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ（ＣＭ０３７とも呼ばれる）であり、ＣＩ００６ ＷＴに由来する後代変異体菌株である。
図１７は、２０１７年夏の圃場試験実験の結果を示す。得られた収穫高の結果は、本開示の微生物が、栽培地全体にわたって一貫して性能を発揮することを実証する。さらに、収穫高の結果は、本開示の微生物が、窒素ストレス環境ならびに十分な窒素供給を有する環境の両方で良好な性能を発揮することを実証する。微生物「６−８８１」（ＣＭ０９４、ＰＢＣ６．９４としても知られている）は、ＣＩ００６ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３４」は、ＣＩ１３７ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３６」は、ＣＩ１３７ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「６−４０４」（ＣＭ３８、ＰＢＣ６．３８としても知られている）は、ＣＩ００６ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託され、表１に見出すことができる。「栄養ストレス」条件は、０％窒素レジメに相当する。「十分な肥料」条件は、１００％窒素レジメに相当する。
図１８は、菌株ＣＩ００６（「６」、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
図１９は、菌株ＣＩ０１９（「１９」、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
図２０は、菌株ＣＩ１３７（「１３７」、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
図２１は、菌株１０２１（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
図２２は、菌株９１０（Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
図２３は、菌株６３（Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
図２４は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。実施例５の表２８は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ Ｎ／微生物 時間）を示している。図２４のデータは、圃場条件におけるトウモロコシ中のＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の圃場現場からのトウモロコシ根コロニー化データを使用した、微生物により産生されたｌｂ Ｎ／エーカーを表わす。Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ Ｎでのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＲＡアッセイを使用して決定した。
図２５は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。実施例５の表２９は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ Ｎ／微生物 時間）を示している。図２５のデータは、実験室および温室条件におけるトウモロコシ中のＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の菌株により産生されたｌｂ Ｎ／エーカーを表わす。白色点は、トウモロコシ根コロニー化データが温室条件で収集された菌株を表わす。黒色点は、トウモロコシ根コロニー化レベルが、野生型親菌株の平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルから導き出されている変異体菌株を表わす。斜線付き点は、平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルの野生型親菌株を表わす。全ての場合で、Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ Ｎでのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＲＡアッセイにより決定した。
図２６は、実施例７に記載のＷＴ ＣＩ１３７菌株および変異体菌株によるアンモニア排出を示す。ＷＴ菌株は、アンモニアを排出することが観察されず、培地に蓄積するアンモニアは無視できる程度であった。
図２７は、植栽３週間後のトウモロコシ中の微生物コロニー化を示す。トウモロコシ種子に、実施例７に記載のＣＩ１３７ ＷＴ菌株および誘導体菌株を植栽時に接種した。
図２８は、図２７由来のデータと同一であるが、方法が少し異なるデータを示す。図２８は、植栽３週間後のトウモロコシ中の平均微生物コロニー化を示す。トウモロコシ種子に、実施例７に記載のＣＩ１３７ ＷＴ菌株および誘導体菌株を植栽時に接種した。
開示の詳細な説明
本開示の種々の実施形態が本明細書に表示および記載されているが、そのような実施形態は例示のために提供されているに過ぎないことは、当業者には明白であろう。当業者により、本開示から逸脱せずに多数の改変、変更、および置換を起想され得る。本明細書に記載の本開示の実施形態の種々の代替形態を用いることができることが理解されるべきである。
肥料使用を増加させることは、それと共に環境上の懸念をもたらし、また、多くの経済的苦境にある地球上の地域では可能でない可能性が高い。さらに、微生物分野の多くの産業関係者が、属間微生物の作出に着目している。しかしながら、属間であると特徴付けられる／分類される操作された微生物には、厳しい規制負担が課せられる。これらの属間微生物は、広範な採用および実施を困難にするより大きな規制負担に直面するだけでなく、厳しい市民の監視の目にさらされる。
現在、非属間であり、非マメ科作物での窒素固定を増加させることが可能である市販の操作された微生物は存在しない。そのような微生物のこの欠如は、真に環境に優しく、より持続可能な２１世紀型農業システムへの導きを支援するために欠けている要素である。
本開示は、前述の問題を解決し、作物中で窒素を容易に固定するように操作されている非属間微生物を提供する。これらの微生物は、属間微生物であると特徴付け／分類されず、したがってそのような厳格な規制負担に直面しないであろう。さらに、教示される非属間微生物は、２１世紀の農業従事者が、かつてなく増加する量の外因性窒素肥料の使用に依存しなくなるように支援する役目を果たすであろう。
定義
本開示を記載する状況（特に、以下の特許請求の範囲の状況）での用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の参照対象の使用は、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、単数および複数を両方とも包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別様の指示がない限り、非限定的用語として解釈されるべきである（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、限定されない」ことを意味する）。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書で別様の指示がない限り、各別個の数値がその範囲内に入ることを個々に参照するための簡略的な方法としての役目を果たすことが意図されているに過ぎず、各別個の数値は、それが本明細書にあたかも個々に記載されているが如く、本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されているありとあらゆる例または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本開示をより良好に説明するためのものに過ぎず、別様に特許請求されない限り、本開示の範囲を限定しない。本明細書中の文言は、任意の特許請求されていない要素を、本開示の実施に不可欠なものであることを示すものとして解釈されるべきでない。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、あらゆる３次元構造も有してもよく、公知か未知かに関わらず、あらゆる機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、以下：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析で規定された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などのうちの１またはそれを超える改変ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド構造への改変は、存在する場合、ポリマー構築の前に付与されてもよく、または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに改変されてもよい。
「ハイブリダイゼーション」は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドを反応させて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック型塩基対により生じてもよく、フーグスティン結合により生じてもよく、または塩基相補性による任意の他の配列特異的様式で生じてもよい。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖複合体を形成する３本またはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの酵素切断などの、より広範なプロセスの工程を構成してもよい。第１の配列に相補的な第２の配列は、第１の配列の「相補体」と呼ばれる。用語「ハイブリダイズ可能な」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応にて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する能力を指す。
「相補性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック型または他の非従来型のいずれかにより別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック型塩基対）を形成することができる、核酸分子中の残基のパーセントを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の隣接残基が全て、第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することになることを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書中で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。相補性パーセントを評価する目的のためなどの配列同一性は、限定されないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照のこと。任意選択で初期設定を使用してもよい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照のこと。任意選択で初期設定を使用してもよい）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを参照のこと。任意選択で初期設定を使用してもよい）を含む任意の適切なアラインメントアルゴリズムにより測定することができる。初期設定パラメータを含む、選択したアルゴリズムの任意の適切なパラメータを使用して、最適なアラインメントを評価することができる。
一般的に、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列との相補性を有する核酸が、主に標的配列とハイブリダイズするが、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般的に配列依存性であり、幾つかの要因に応じて様々である。一般的に、配列が長いほど、その配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。
本明細書中で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へとなど）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称される場合がある。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡスプライシングを含む場合がある。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では相互交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であってもよくまた分岐していてもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。また、これら用語は、改変されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作を包含する。用語「アミノ酸」は、本明細書中で使用される場合、グリシンおよびＤまたはＬの両光学異性体を含む天然および／もしくは非天然のまたは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、用語「およそ」と同義的に使用される。例示的には、量に関する用語「約」の使用は、数値が、言及されている数値のわずかに外側にあること、例えば、プラスまたはマイナス０．１％〜１０％であることを示す。
用語「生物学的に純粋な培養物」または「実質的に純粋な培養物」は、培養物の複製を妨げたり、または通常の細菌学的技法によって検出されたりするほどの量の他の細菌種を含まない、本明細書に記載の細菌種の培養物を指す。
「植物生産性」は、一般的に、植物を成長させる根拠となる植物の成長または発達のあらゆる態様を指す。穀物または野菜などの食用作物の場合、「植物生産性」は、特定の作物から収穫される穀物または果実の収穫高を指す場合がある。本明細書中で使用される場合、植物生産性の改善は、穀物、果実、花、または種々の目的で収穫される他の植物部分の収穫高の改善；茎、葉、および根を含む植物部分の成長の改善；植物成長の促進；葉における高葉緑素含有量の維持；果実数または種子数の増加；果実重量または種子重量の増加；窒素肥料使用量の削減によるＮＯ２排出削減；および植物の成長および発達の類似の改善を、幅広く指す。
食用作物内および周囲の微生物は、それら作物の形質に影響を及ぼす場合がある。微生物により影響を受ける場合がある植物形質としては、以下が挙げられる：収穫高（例えば、穀物生産、バイオマス生成、果実形成、着花）；栄養（例えば、窒素、リン、カリウム、鉄、微量栄養素の獲得）；非生物ストレス管理（例えば、干ばつ耐性、耐塩性、耐熱性）；および生物ストレス管理（例えば、有害生物、雑草、昆虫、真菌、および細菌）。作物形質を変更するための戦略としては、以下が挙げられる：重要な代謝物濃度を増加させること；重要な代謝物に対する微生物影響の経時的動態を変更すること；微生物代謝物産生／分解を新しい環境的要因と関連させること；負の代謝物を減少させること；および代謝物またはそれらの根底をなすタンパク質のバランスを改善させること。
本明細書中で使用される場合、「調節配列」は、オペレーター、プロモーター、サイレンサー、またはターミネーターを指す。
本明細書中で使用される場合、「ｉｎ ｐｌａｎｔａ」は、使用状況に応じて、植物の中、植物の上、または植物と緊密に連携する（例えば、内部寄生性、着生性、または根圏性で連携する）ことを指し得る。植物は、植物の部分、組織、葉、根、根毛、根茎、茎、種子、胚珠、花粉、花、果実などを含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子のネイティブ調節配列または内因性調節配列は、１またはそれを超える属内調節配列と置換されている。
本明細書中で使用される場合、「導入」は、天然の導入ではなく、現代のバイオテクノロジーによる導入を指す。
いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、改変されており、天然に存在する細菌ではない。
いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕ、１０８ｃｆｕ、１０９ｃｆｕ、１０１０ｃｆｕ、１０１１ｃｆｕ、または１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも約１０３ｃｆｕ、約１０４ｃｆｕ、約１０５ｃｆｕ、約１０６ｃｆｕ、約１０７ｃｆｕ、約１０８ｃｆｕ、約１０９ｃｆｕ、約１０１０ｃｆｕ、約１０１１ｃｆｕ、または約１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３〜１０９、１０３〜１０７、１０３〜１０５、１０５〜１０９、１０５〜１０７、１０６〜１０１０、１０６〜１０７ｃｆｕの量で植物中に存在する。
本開示の肥料および外来性窒素は、以下の窒素含有分子：アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア、グルタミンなどを含んでもよい。本開示の窒素源としては、以下のものを挙げることができる：無水アンモニア、硫酸アンモニア、尿素、リン酸二アンモニウム、尿素の形態、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、窒素溶液、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウムなど。
本明細書中で使用される場合、「外因性窒素」は、アンモニア、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、尿酸、アンモニウム酸などを含む、非窒素制限条件下で存在する、土壌、圃場、または増殖培地で容易に利用可能な非大気窒素を指す。
本明細書中で使用される場合、「非窒素制限条件」は、Ｋａｎｔら．（２０１０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６２（４）：１４９９−１５０９）（本明細書中で参考として援用される）に開示されているような、約４ｍＭ窒素を超える濃度で土壌、圃場、培地で利用可能な非大気窒素を指す。
本明細書中で使用される場合、「属間微小生物」は、元々は異なる分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微小生物である。「属間変異」は、「属間微小生物」と相互交換可能に使用することができる。例示的な「属間微小生物」は、レシピエント微小生物とは異なる属の微小生物で最初に同定された可動遺伝要素を含有する微小生物を含む。さらなる説明は、特に、連邦規則集第４０巻セクション７２５．３に見出すことができる。
態様では、本明細書で教示された微生物は、「非属間」であり、これは、微生物が属間ではないことを意味する。
本明細書中で使用される場合、「属内微小生物」は、元々は同じ分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微小生物である。「属内変異」は、「属内微小生物」と相互交換可能に使用することができる。
本明細書中で使用される場合、「導入された遺伝物質」は、レシピエントのゲノムに付加され、レシピエントのゲノムの成分として残留する遺伝物質を意味する。
本明細書中で使用される場合、非属間微小生物の文脈において、用語「リモデリングされた」は、用語「操作された」と同義的に使用される。したがって、「非属間のリモデリングされた微小生物」は、「非属間の操作された微小生物」と同義の意味を有し、相互交換可能に使用されるであろう。さらに、本開示は、「操作された菌株」または「操作された誘導体」または「操作された非属間微生物」を指し得、これらの用語は、「リモデリングされた菌株」または「リモデリングされた誘導体」または「リモデリングされた非属間微生物」と同義的に使用される。
いくつかの実施形態では、窒素固定および同化の遺伝子制御ネットワークは、遺伝子をコードするポリヌクレオチドならびに微生物の窒素固定および／または同化を指示、調整、および／または調節する非コード配列を含み、ｎｉｆクラスター（例えば、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＣ、．．．．．．．ｎｉｆＺ）のポリヌクレオチド配列、窒素制御タンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチド、窒素制御タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎクラスター（例えば、ｇｌｎＡおよびｇｌｎＤ）のポリヌクレオチド配列、ｄｒａＴ、およびアンモニア輸送体／パーミアーゼを含み得る。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶを含んでいてもよい。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶのサブセットを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の窒素を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の窒素を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、重量で約５％〜５０％、約５％〜７５％、約１０％〜５０％、約１０％〜７５％、約１５％〜５０％、約１５％〜７５％、約２０％〜５０％、約２０％〜７５％、約２５％〜５０％、約２５％〜７５％、約３０％〜５０％、約３０％〜７５％、約３５％〜５０％、約３５％〜７５％、約４０％〜５０％、約４０％〜７５％、約４５％〜５０％、約４５％〜７５％、または約５０％〜７５％の窒素を含む。
いくつかの実施形態では、窒素固定の増加および／または植物における１％またはそれを超える窒素の産生は、本開示の細菌に曝露していない対照植物と比較して測定される。細菌の増加または減少は全て、対照細菌と比較して測定される。植物の増加または減少は全て、対照植物と比較して測定される。
本明細書中で使用される場合、「構成的プロモーター」は、ほとんどの条件下でおよび／またはほとんどの発生段階中で活性なプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクター中で構成的プロモーターを使用することは、トランスジェニック細胞または生物を選択するために使用されるタンパク質の高レベル産生；容易な検出および定量化を可能にするレポータータンパク質またはスコア化可能なマーカーの高レベル発現；転写制御系の一部である転写因子の高レベル産生；生物中で遍在活性が必要とされる化合物の産生；および全ての発生段階中に必要とされる化合物の産生などの幾つかの利点がある。非限定的で例示的な構成的プロモーターとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、オパインプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターなどが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「非構成的プロモーター」は、ある特定の条件下で、ある特定のタイプの細胞で、および／またはある特定の発生段階中に活性なプロモーターである。例えば、組織特異的、組織優先的、細胞タイプ特異的、細胞タイプ優先的な誘導性プロモーター、および発生調節下にあるプロモーターは、非構成的プロモーターである。発生調節下にあるプロモーターの例としては、ある特定の組織で優先的に転写を開始させるプロモーターが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「誘導性」または「抑制可能な」プロモーターは、化学因子または環境因子の調節下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気条件、ある特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件などが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織でのみ転写を開始させるプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的な発現は、いくつかの遺伝子制御レベルの相互作用の結果である。したがって、当該分野では、時には、同種のまたは緊密に関連する種に由来するプロモーターを使用して、特定の組織における効率的で信頼性の高い導入遺伝子の発現を達成することが好ましい。これは、特定の組織から単離された組織特異的プロモーターが大量に、科学文献および特許文献の両方に見出されることの主な理由の１つである。
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により制御されるように、核酸配列を単一の核酸断片上で関連させることを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を制御することが可能な（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、そのコード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センス配向性またはアンチセンス配向性で制御配列に作動可能に連結することができる。別の例では、本開示の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’に、または標的ｍＲＮＡの３’に、または標的ｍＲＮＡ内に、直接または間接のいずれかで作動可能に連結することができるか、第１の相補的領域が５’であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’である。
態様では、「植物に複数の非属間細菌を適用する」は、植物（種子、根、茎、組織などの植物部分を含む）を、植物の生活環の任意の段階にて前述の細菌と接触させる（すなわち、曝露する）ための任意の手段を含む。したがって、「植物に複数の非属間細菌を適用する」は、植物（種子、根、茎、組織などの植物部分を含む）を前述の細菌に曝露するための以下の手段のいずれかを含む：植物に噴霧すること、植物に滴下すること、種子被膜として塗布すること、その後種子を植栽することになる圃場に施すこと、種子を既に植栽した圃場に施すこと、成体植物を有する圃場に施すことなど。
本明細書中で使用される場合、「ＭＲＴＮ」は、対窒素最大収益の頭字語であり、実施例の実験処理として使用されている。ＭＲＴＮは、アイオワ州立大学により開発され、情報は、ｃｎｒｃ．ａｇｒｏｎ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕに見出すことができる。ＭＲＴＮは、窒素適用の経済的純収益が最大化される窒素割合である。ＭＲＴＮを算出する手法は、個々の状態のトウモロコシ窒素割合ガイドラインを開発するための地域別手法である。大豆後のトウモロコシ植栽およびトウモロコシ後のトウモロコシ植栽に関して適切な数の研究試験が入手可能であったイリノイ州、アイオワ州、ミシガン州、ミネソタ州、オハイオ州、およびウィスコンシン州の窒素割合試験データが評価された。試験は、噴出施肥、側方施肥、または植栽前／側方分割施肥で適用した窒素で実施され、現場は、ウィスコンシン州の潅漑砂地で示されたものを除いて潅漑されなかった。ＭＲＴＮは、トウモロコシ生産に必要とされる示唆された窒素割合を決定するための方法に明白な差異があること、窒素割合ガイドラインに関する誤解、および適用割合に対する懸念があるため、アイオワ州立大学により開発された。ＭＲＴＮの算出により、実施者は、以下のことを決定することができる：（１）窒素適用の経済的純収益が最大化される窒素割合、（２）窒素の最終増分が、追加の窒素の費用を賄うのに十分大きな収穫高増加を生み出すポイントである経済的に最適な窒素割合、（３）窒素適用に起因するトウモロコシ穀物増加の値、およびより多くの窒素の適用がトウモロコシ収穫高の増加をもたらさない収穫高である最大収穫高。したがって、ＭＲＴＮ計算は、様々な地域でのトウモロコシ作物を最大化しつつ、窒素適用からの金融上の利得を最大化する手段を実施者に提供する。
用語「ｍｍｏｌ」は、ミリモルの略語であり、本明細書中でｍｏｌと略されるモルの１０００分の１（１０−３）である。
本明細書中で使用される場合、「微小生物」または「微生物」という用語は、広義に解釈されるべきである。これらの用語は、相互交換可能に使用され、２つの原核生物ドメインである細菌および古細菌を含むが、それらに限定されない。この用語は、真核生物である真菌および原生生物を包含することもできる。
用語「微生物コンソーシア」または「微生物コンソーシアム」は、個々の微生物種または種の菌株の微生物共同体のサブセットを指し、共通の機能を実施すると説明することができるか、または目的の表現型形質などの認識可能なパラメータに関与する、もしくは結び付く、もしくは相関すると説明することができる。
用語「微生物共同体」は、２またはそれを超える種または菌株を含む微生物の群を意味する。微生物コンソーシアとは異なり、微生物共同体は、共通の機能を実施している必要はないか、または目的の表現型形質などの認識可能なパラメータに関与する、もしくは結び付く、もしくは相関する必要はない。
本明細書中で使用される場合、「単離する」、「単離された」、「単離された微生物」、および類似の用語は、１またはそれを超える微小生物が、特定の環境（例えば、土壌、水、植物組織など）に付随している物質の少なくとも１つから分離されていることを意味することが意図されている。したがって、「単離された微生物」は、その天然に存在する環境に存在せず、むしろ、微生物は、本明細書に記載の種々の技法により、その自然状況から取り出されており、天然に存在しない存在状態に置かれている。したがって、単離された菌株または単離された微生物は、例えば、生物学的に純粋な培養物または胞子（または菌株の他の形態）として存在していてもよい。態様では、単離された微生物は、農業的に許容され得る担体であってもよい許容され得る担体に付随していてもよい。
本開示のある特定の態様では、単離された微生物は、「単離された生物学的に純粋な培養物」として存在する。当業者であれば、特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物は、前述の培養物が、他の生存生物を実質的に含まず、問題としている個々の微生物のみを含むことを示すことを理解するであろう。培養物は、様々な濃度の前述の微生物を含むことができる。本開示では、単離された生物学的に純粋な微生物は、「より純粋でないかまたは不純な物質とは必然的に異なる」ことが多いことが留意される。例えば、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍに関して、４２７ Ｆ．２ｄ １３９４（ＣＣＰＡ１９７０）（精製プロスタグランジンに関する考察）、またＢｅｒｇｙに関して、５９６ Ｆ．２ｄ ９５２（ＣＣＰＡ１９７９）（精製微生物に関する考察）、またＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ＆Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ＆Ｃｏ．に関して、１８９ Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（精製アドレナリンに関するＬｅａｒｎｅｄ Ｈａｎｄの考察）、部分的に支持され部分的に破棄されている１９６ Ｆ．４９６（２ｄ Ｃｉｒ．１９１２）（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。さらに、いくつかの態様では、本開示は、単離された生物学的に純粋な微生物培養物内に見出されなければならない濃度または純度限定に関するある特定の定量的尺度を提供する。ある特定の実施形態では、これらの純度値の存在は、本開示の微生物を、天然の状態で存在する微生物と区別するさらなる属性である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、２５３ Ｆ．２ｄ １５６（４ｔｈ Ｃｉｒ．１９５８）（微生物により産生されるビタミンＢ１２の純度限定に関する考察）を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「個々の単離株」は、１またはそれを超える他の微小生物から分離された後の、微小生物の優位な単一の属、種、または菌株を含む組成物または培養物を意味すると解釈されるべきである。
本開示の微生物は、胞子および／または栄養細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の微生物は、生存可能であるが培養不能な（ＶＢＮＣ）状態の微生物を含む。本明細書中で使用される場合、「胞子」または「胞子（複数）」は、生存および散布に適した、細菌および真菌により生成された構造物を指す。胞子は、一般的には、休眠構造と特徴付けられるが、胞子は、発芽プロセスにより分化することが可能である。発芽は、胞子が、代謝活性、成長、および生殖が可能な栄養細胞へと分化することである。単一の胞子の発芽は、単一の真菌または細菌栄養細胞をもたらす。真菌胞子は、無性生殖の単位であり、一部の場合では、真菌生活環に必要な構造物である。細菌胞子は、通常は、栄養細胞の生存または成長に貢献しない場合がある生存条件の場合の構造物である。
本明細書中で使用される場合、「微生物組成物」は、本開示の１またはそれを超える微生物を含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、植物（種々の植物部分を含む）および／または農業圃場に投与される。
本明細書中で使用される場合、「担体」、「許容され得る担体」、または「農業的に許容され得る担体」は、微生物を共に投与することができ、微生物に有害な影響を及ぼさない希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
窒素固定の制御
いくつかの場合では、窒素固定経路は、遺伝子操作および最適化の標的としての役目を果たす場合がある。本明細書中に記載の方法による制御の標的となり得る１つの形質は、窒素固定である。窒素肥料は、農場における最も大きな運営上の出費であり、トウモロコシおよび小麦のような条植え作物の収穫高を改善させる最大の誘因である。本明細書には、非マメ科作物に再生可能な形態の窒素を送達することができる微生物製品が記載されている。一部の内部寄生菌は、純粋培養での窒素固定に必要な遺伝的特徴を有するが、根本的な技術的難問は、穀類およびイネ科植物の野生型内部寄生菌は、施肥圃場では窒素固定を中止してしまうことである。化学肥料の施肥および圃場土壌中の残留窒素レベルは、微生物に対して、窒素固定の生化学経路を停止するようにシグナルを送る。
肥料の存在下でも窒素を固定してトウモロコシへと移行させることが可能な微生物の開発のためには、窒素固定制御ネットワークの構成成分の転写レベルおよび翻訳後レベルを変更することが有益であり得る。そのため、本明細書中には、制御ネットワークを的確に進化させ、新規の表現型を誘発させるための宿主微生物進化（ＨｏＭＥ）技術が記載されている。また、本明細書中には、トウモロコシから単離された窒素固定内部寄生菌の固有の独自ライブラリーが、窒素ストレスおよび窒素過剰のような異なる環境条件下での微生物および宿主植物の相互作用を取り巻く広範なオーミクスデータと対にして記載されている。いくつかの実施形態では、この技術により、内部寄生菌の遺伝子制御ネットワークを的確に進化させて、圃場に肥料が存在する場合であっても活発に窒素を固定する微生物を産生することが可能になる。また、本明細書中には、トウモロコシ根組織にコロニー化し、施肥されている植物のために窒素を産生する微生物に進化させる技術的可能性の評価ならびに微生物を現代の窒素管理戦略に統合する実現可能性を決定するために、内部寄生菌と、標準的製剤化慣例および多様な土壌との適合性の評価が記載されている。
窒素元素（Ｎ）を化学合成に利用するために、生命体は、窒素固定として公知であるプロセスにおいて、大気中で利用可能な窒素ガス（Ｎ２）を水素と化合させる。生物学的窒素固定は性質がエネルギー集約的であるため、ジアゾトロフ（大気窒素ガスを固定する細菌および古細菌）は、環境中の酸素および利用可能な窒素に応答してｎｉｆ遺伝子クラスターを精巧および厳密に制御するように進化している。Ｎｉｆ遺伝子は、窒素固定に関与する酵素（ニトロゲナーゼ複合体などの）および窒素固定を制御するタンパク質をコードする。Ｓｈａｍｓｅｌｄｉｎ（２０１３．Ｇｌｏｂａｌ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８（４）：８４−９４）には、ｎｉｆ遺伝子およびそれらの産物の詳細な記載が開示されており、この文献は、本明細書中で参考として援用される。本明細書中には、改善された形質を有する植物を産生するための方法であって、第１の植物から細菌を単離する工程；単離された細菌の遺伝子に遺伝子変異を導入して窒素固定を増加させる工程；第２の植物を変異細菌に曝露する工程；第１の植物と比べて改善された形質を有する第２の植物から細菌を単離する工程；および第２の植物から単離された細菌を用いて工程を繰り返す工程を含む方法が記載されている。
プロテオバクテリアでは、ｎｉｆクラスターの正の転写制御因子である、σ５４依存性エンハンサー結合タンパク質ＮｉｆＡが、窒素固定の制御に中心的な役割を果たす。活性ＮｉｆＡの細胞内レベルは、２つの主な因子：ｎｉｆＬＡオペロンの転写およびＮｉｆＬとのタンパク質間相互作用によるＮｉｆＡ活性の阻害により調節される。これらプロセスは両方とも、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、細胞内グルタミンレベルに応答性である。このカスケードは、ＧｌｎＤにより媒介され、ＧｌｎＤは、グルタミンを直接的に感知し、結合グルタミンの非存在または存在に応答して、２つのＰＩＩ制御タンパク質ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化または脱ウリジリル化をそれぞれ触媒する。窒素過剰条件下では、未改変ＧｌｎＢが、ｎｉｆＬＡプロモーターの非活性化シグナルを送る。しかしながら、窒素制限条件下では、ＧｌｎＢは翻訳後修飾を受け、それによりその活性が阻害され、ｎｉｆＬＡオペロンの転写に結び付く。このように、ｎｉｆＬＡ転写は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に調節されている。ＮｉｆＡの翻訳後レベル調節では、ＧｌｎＫは、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルに依存する状況でＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害する。
ＮｉｆＡは、ｎｉｆＬＡオペロンから転写され、そのプロモーターは、別のσ５４依存性制御因子であるリン酸化ＮｔｒＣにより活性化される。ＮｔｒＣのリン酸化状態は、ヒスチジンキナーゼＮｔｒＢにより媒介され、ＮｔｒＢは、脱ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用するが、ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用しない。窒素過剰条件下では、高い細胞内レベルのグルタミンは、ＧｌｎＢの脱ウリジリル化に結び付き、脱ウリジリル化されたＧｌｎＢは、その後ＮｔｒＢと相互作用して、そのリン酸化活性を不活化し、そのホスファターゼ活性を活性化させて、ＮｔｒＣの脱リン酸化およびｎｉｆＬＡプロモーターの不活化がもたらされる。しかしながら、窒素制限条件下では、低レベルの細胞内グルタミンは、ＧｌｎＢのウリジリル化をもたらし、それにより、ＮｔｒＢとのその相互作用が阻害され、ＮｔｒＣのリン酸化およびｎｉｆＬＡオペロンの転写を可能にする。このように、ｎｉｆＬＡ発現は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に調節される。ｎｉｆＡ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、およびｇｌｎＢは全て、本明細書中に記載の方法で変異させることができる遺伝子である。また、これらのプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答する場合がある。
また、ＮｉｆＡの活性は、最も典型的にはＮｉｆＡ活性のＮｉｆＬ媒介性阻害により、環境窒素に応答して翻訳後に制御される。一般的に、ＮｉｆＬとＮｉｆＡとの相互作用は、ＧｌｎＫを介したＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより影響を受けるが、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用の性質は、ジアゾトロフ間で著しく異なる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、両形態のＧｌｎＫが、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害し、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用は、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルにより決定される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、アンモニウム輸送体ＡｍｔＢと相互作用し、これは、ＡｍｔＢによるアンモニウム取り込みを阻止すると共に、ＧｌｎＫを膜に隔離し、ＮｉｆＬによるＮｉｆＡの阻害を可能にする役目を果たす。一方、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉでは、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用およびＮｉｆＡ阻害には、脱ウリジリル化ＧｌｎＫとの相互作用が必要であるが、ＧｌｎＫのウリジリル化は、ＮｉｆＬとの相互作用を阻害する。ｎｉｆＬ遺伝子が欠如したジアゾトロフでは、ＮｉｆＡ活性は、窒素過剰条件下では、ＧｌｎＫおよびＧｌｎＢの両方の脱ウリジリル化形態との相互作用により直接的に阻害されるという証拠が存在する。一部の細菌では、Ｎｉｆクラスターが、ｇｌｎＲにより制御される場合があり、さらにいくつかの場合では、これは、負の制御を含む場合がある。その機序に関わらず、ほとんどの公知ジアゾトロフでは、ＮｉｆＡの翻訳後阻害は、ｎｉｆクラスターの重要な制御因子である。加えて、ｎｉｆＬ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＫおよびｇｌｎＲは、本明細書中に記載の方法で変異させることができる遺伝子である。
多くのジアゾトロフは、ｎｉｆ遺伝子クラスターの転写制御に加えて、ニトロゲナーゼ遮断として公知である、ニトロゲナーゼ酵素自体の直接的翻訳後修飾および阻害の機序を進化させている。これは、窒素過剰条件下でのＦｅタンパク質（ＮｉｆＨ）のＡＤＰリボシル化により媒介され、それにより、ＭｏＦｅタンパク質複合体（ＮｉｆＤＫ）との相互作用が妨害され、ニトロゲナーゼ活性が消失する。ＤｒａＴは、Ｆｅタンパク質のＡＤＰリボシル化およびニトロゲナーゼの遮断を触媒し、ＤｒａＧは、ＡＤＰリボースの除去およびニトロゲナーゼの再活性化を触媒する。ｎｉｆＬＡ転写およびＮｉｆＡ阻害の場合と同様に、ニトロゲナーゼ遮断は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードによっても制御される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＢは、ＤｒａＴと相互作用してＤｒａＴを活性化し、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、ＤｒａＧおよびＡｍｔＢの両方と相互作用して複合体を形成し、ＤｒａＧを膜に隔離する。窒素制限条件下では、ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化形態は、それぞれＤｒａＴおよびＤｒａＧと相互作用せず、ＤｒａＴの不活化およびＤｒａＧのＦｅタンパク質への拡散に結び付き、そこでＡＤＰリボースが除去され、ニトロゲナーゼが活性化される。また、本明細書中に記載の方法では、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、およびｄｒａＴ遺伝子に遺伝子変異を導入することが企図される。
いくつかの内部寄生菌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで窒素を固定する能力を有するが、この遺伝的特徴は、しばしば、圃場では高レベルの外因性化学肥料によりサイレンシングされる。圃場に基づく窒素固定を容易にするために、外因性窒素の感知をニトロゲナーゼ酵素の発現と切り離すことができる。さらに、ニトロゲナーゼ活性の統合を経時的に改善させることは、作物により利用される窒素の産生を増大させる役目を果たす。本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための具体的な標的としては、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子が挙げられる。
本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための追加の標的は、ＮｉｆＡタンパク質である。ＮｉｆＡタンパク質は、典型的には、窒素固定遺伝子発現の活性化因子である。ＮｉｆＡの産生を増加させることにより（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、天然アンモニア感知経路が回避される。加えて、ＮｉｆＡの公知の阻害剤であるＮｉｆＬタンパク質の産生を低減することは、遊離活性ＮｉｆＡレベルの増加にも結び付く。加えて、ｎｉｆＡＬオペロンの転写レベルを増加させることは（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、全体的により高いレベルのＮｉｆＡタンパク質にも結び付く。ｎｉｆＡＬ発現のレベル上昇は、プロモーター自体を変更することにより、またはＮｔｒＢ（元々は高窒素条件中にｎｉｆＡＬオペロンの遮断をもたらすことになるｎｔｒＢおよびｎｔｒＣシグナル伝達カスケードの一部）の発現を低減させることにより達成される。これらまたは本明細書中に記載の任意の他の方法により達成される高レベルのＮｉｆＡは、内部寄生菌の窒素固定活性を増加させる。
本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための別の標的は、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ ＰＩＩシグナル伝達カスケードである。細胞内グルタミンレベルは、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ ＰＩＩシグナル伝達カスケードにより感知される。ＧｌｎＤのウリジリル除去活性を消失させるＧｌｎＤの活性部位変異は、窒素感知カスケードを妨害する。加えて、ＧｌｎＢ濃度の低減は、グルタミン感知カスケードを短絡させる。これらの変異により、細胞を「騙して」窒素制限状態であると認識させ、それにより窒素固定レベル活性を増加させる。また、これらのプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答する場合がある。
ａｍｔＢタンパク質も、本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的である。環境からのアンモニア取り込みは、ａｍｔＢタンパク質の発現レベルを減少させることにより低減させることができる。細胞内アンモニアが存在しないと、内部寄生菌は、アンモニアのレベルが高いことを感知することができず、窒素固定遺伝子の下方制御が防止される。細胞内区画への進入を果たしたアンモニアは全てグルタミンに変換される。細胞内グルタミンレベルは、窒素を感知するための主要な媒介物である。細胞内グルタミンレベルを減少させることにより、細胞が、環境中のアンモニウムレベルが高いことを感知することが防止される。この効果は、グルタミンをグルタメートに変換する酵素であるグルタミナーゼの発現レベルを増加させることにより達成できる。加えて、細胞内グルタミンは、グルタミン合成酵素（アンモニアをグルタミンに変換する酵素）を減少させることによっても低減させることができる。ジアゾトロフでは、固定されたアンモニアは、細胞プロセスに使用されることになるグルタミンおよびグルタメートへと迅速に同化される。アンモニア同化の妨害は、固定窒素を転換して、アンモニアとして細胞から搬出されることを可能にする場合がある。固定されたアンモニアは、主にｇｌｎＡによりコードされているグルタミン合成酵素（ＧＳ）によりグルタミンへと、その後はグルタミンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＧＡＴ）によりグルタミンへと同化される。いくつかの例では、ｇｌｎＳは、グルタミン合成酵素をコードする。ＧＳは、ＧＳアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｎＥ）、つまり、それぞれアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインの活性によりＧＳのアデニリル化および脱アデニリル化の両方を触媒する、ｇｌｎＥによりコードされた二機能性酵素により、翻訳後に制御される。窒素制限条件下では、ｇｌｎＡが発現され、ＧｌｎＥのＡＲドメインは、ＧＳを脱アデニリル化し、ＧＳの活性化を可能にする。窒素過剰条件下では、ｇｌｎＡ発現は中止され、ＧｌｎＥのＡＴドメインは、グルタミンによりアロステリック的に活性化され、ＧＳのアデニリル化および非活性化が引き起こされる。
さらに、ｄｒａＴ遺伝子もまた、本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的であってもよい。細胞により窒素固定酵素が産生されると、ニトロゲナーゼ遮断が、細胞が高窒素条件で固定活性を下方制御する別のレベルを表す。この遮断は、ＤｒａＴの発現レベルを減少させることにより除去することができる可能性がある。
新しい微生物表現型を付与するための方法は、転写レベル、翻訳レベル、および翻訳後レベルで実施することができる。転写レベルでは、プロモーターを変更すること（プロモーターの全てまたは一部の欠失を含む、転写因子に対するシグマ因子親和性または結合部位の変更など）または転写ターミネーターおよびアテニュエータを変更することが含まれる。翻訳レベルでは、リボソーム結合部位での変更、およびｍＲＮＡ分解シグナルを変更することが含まれる。翻訳後レベルでは、酵素の活性部位を変異させること、およびタンパク質間相互作用を変更させることが含まれる。これらの変更は、数多くの方法で達成することができる。発現レベルの低減（または完全な消失）は、天然リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはプロモーターを、強度／効率がより低いものと交換することにより達成することができる。ＡＴＧ開始部位を、ＧＴＧ、ＴＴＧ、またはＣＴＧ開始コドンと交換することができ、それにより、コード領域の翻訳活性の低減がもたらされる。発現の完全な消失は、遺伝子のコード領域をノックアウト（欠失）することにより行うことができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をフレームシフトすると、ＯＲＦに中途終止コドンがもたらされ、非機能性の短縮産物が作成されることになる可能性がある。同様に、インフレーム終止コドンの挿入も、非機能性の短縮産物を作出することになる。ＮまたはＣ末端に分解タグを付加することでも、特定の遺伝子の有効濃度を低減することができる。
反対に、本明細書に記載されている遺伝子の発現レベルは、より強力なプロモーターを使用することにより達成することができる。高窒素レベル条件（または任意の他の条件）中のプロモーター活性を確実に高くするために、高窒素レベル条件における全ゲノムの転写プロファイルを取得し、そのデータセットから、所望の転写レベルを有する活性プロモーターを選択して、弱いプロモーターを置換することができる。弱い開始コドンを、より良好な翻訳開始効率のＡＴＧ開始コドンと交換してもよい。また、弱いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を、より高い翻訳開始効率を有する異なるＲＢＳと交換してもよい。また、加えて、部位特異的変異を実施して、酵素の活性を変更してもよい。
植物に生じる窒素固定のレベルを増加させることは、作物生産に必要とされる化学肥料の量の低減に結びつき、温室効果ガス排出（例えば、亜酸化窒素）を削減することができる。
コロニー化可能性の制御
本明細書中に記載の方法による制御の標的となり得る１つの形質は、コロニー化可能性である。したがって、いくつかの実施形態では、コロニー化に関与する経路および遺伝子は、遺伝子操作および最適化の標的としての役目を果たす場合がある。
いくつかの場合では、菌体外多糖は、植物の細菌コロニー化に関与する場合がある。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、バイオフィルムを産生し得る。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、植物への接着または植物免疫応答からの回避を補助し得る分子を分泌する。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、微生物に対する植物の応答を変化させるシグナル伝達分子を排出し得る。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、局所微小環境を変化させる分子を分泌し得る。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、前述の微生物が近くに存在する植物に適応するために遺伝子発現を変化させることができる。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、局所環境中の植物の存在を検出することができ、それに応じて遺伝子発現を変化させることができる。
いくつかの実施形態では、コロニー化を改善するために、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子は、遺伝子操作および最適化の標的となり得る。
いくつかの実施形態では、菌体外多糖の産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。コロニー化を改善するための標的となり得る菌体外多糖産生酵素をコードする例示的な遺伝子としては、限定されないが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、およびｙｊｂＥが挙げられる。
いくつかの実施形態では、繊維状赤血球凝集素の産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。例えば、繊維状赤血球凝集素をコードするｆｈａＢ遺伝子は、コロニー化を改善するための標的となり得る。
いくつかの実施形態では、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）の産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。例えば、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）前駆体をコードするｐｅｈＡ遺伝子は、コロニー化を改善するための標的となり得る。
いくつかの実施形態では、トレハロースの産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。コロニー化を改善するための標的となり得るトレハロース産生酵素をコードする例示的な遺伝子としては、限定されないが、ｏｔｓＢおよびｔｒｅＺが挙げられる。
いくつかの実施形態では、グルタミンの変換に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。例えば、ｇｌｓＡ２遺伝子は、グルタミンをアンモニウムおよびグルタメートに変換するグルタミナーゼをコードする。ｇｌｓＡ２が上方制御されると、細胞のグルタメートプールが増加し、それにより、細胞が利用可能なＮが増加することによって適応度が改善される。したがって、いくつかの実施形態では、ｇｌｓＡ２遺伝子は、コロニー化を改善するための標的となり得る。
いくつかの実施形態では、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるコロニー化遺伝子を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。
コロニー化可能性を改善するための標的となり得るコロニー化遺伝子は、ＰＣＴ公開ＷＯ／２０１９／０３２９２６号（その全体が、本明細書中で参考として援用される）にも記載されている。
細菌集団の生成
細菌の単離
本明細書中に開示の方法および組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することにより得ることができる。微生物は、種子を粉砕して微生物を単離することにより得ることができる。微生物は、種子を多様な土壌試料に植栽し、組織から微生物を回収することにより得ることができる。加えて、微生物は、植物に外因性微生物を接種し、どの微生物が植物組織に出現するかを決定することにより得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、または塊茎を挙げることができる。
微生物を得るための方法は、細菌を土壌から分離することによるものであってもよい。細菌は、種々の土壌タイプから収集することができる。いくつかの例では、土壌は、高肥沃度または低肥沃度、水分のレベル、ミネラルのレベル、および種々の作付け実施などの形質により特徴付けられ得る。例えば、土壌は、異なる作物が、連続した植栽季節で同じ土壌に植栽される輪作に関与する場合がある。同じ土壌での異なる作物の連続栽培は、ある特定のミネラルの不均衡な欠乏を予防することができる。細菌は、選択された土壌で成長する植物から単離することができる。実生植物は、２〜６週間の栽培で収穫することができる。例えば、少なくとも４００個の分離株を、１ラウンドの収穫で収集することができる。土壌および植物タイプは、植物表現型、ならびにある特定の表現型の下流濃縮を可能にする条件を明らかにする。
微生物を植物組織から単離して、微生物の形質を評価することができる。組織試料を処理するためのパラメータを変化させて、根圏菌、着生菌、または内部寄生菌などの、異なるタイプの連携微生物を単離することができる。分離株を無窒素培地で培養して、窒素固定を実施する細菌を濃縮することができる。あるいは、世界の菌株バンクから微生物を得ることができる。
ｉｎ ｐｌａｎｔａ分析を実施して、微生物の形質を評価する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイスループット処理によりスクリーニングを行うために、植物組織を処理することができる。加えて、非侵襲性測定を使用して、コロニー化などの植物特徴を評価することができる。野生微生物の測定は、植物ごとに得ることができる。また、野生微生物の測定は、圃場でミディアムスループット法を使用して得ることができる。測定は、経時的に逐次的に行うことができる。Ｓｅｔａｒｉａを含むが、それに限定されないモデル植物系を使用することができる。
植物系中の微生物を、植物系での微生物の転写プロファイリングによりスクリーニングすることができる。転写プロファイリングによるスクリーニングの例は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、転写物検出用の分子バーコード、次世代配列決定法、および蛍光マーカーでの微生物のタグ付けの方法を使用することである。マイクロバイオーム、非生物要因、土壌条件、酸素、水分、温度、接種物条件、および根局在化を含むが、それらに限定されない影響要因を測定して、温室でのコロニー化を評価することができる。細菌中での窒素固定は、本明細書中に記載のＩＲＭＳまたはＮａｎｏＳＩＭＳを用いて１５Ｎ気体／肥料（希釈）を測定することにより評価することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、高分解能二次イオン質量分析法である。ＮａｎｏＳＩＭＳ技法は、生物学的試料に由来する化学活性を調査するための様式である。微小生物の代謝を駆動する酸化反応を還元する触媒作用を、細胞レベル、亜細胞レベル、分子レベル、および元素レベルで調査することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、０．１μｍを超える高い空間分解能を提供することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、１３Ｃ、１５Ｎ、および１８Ｏなどの同位体トレーサーの使用を検出することができる。したがって、ＮａｎｏＳＩＭＳは、細胞の化学的活性窒素に対して使用することができる。
ｉｎ ｐｌａｎｔａ分析には、自動化温室を使用することができる。微生物曝露に応答した植物測定基準としては、限定されないが、バイオマス、葉緑体分析、ＣＣＤカメラ、容積トモグラフィー測定が挙げられる。
微生物集団を濃縮するための１つの様式は、遺伝子型によるものである。例えば、標的化プライマーまたは特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである。ジアゾトロフは、窒素固定のプロセス中にｎｉｆＨ遺伝子を発現するため、ｎｉｆＨ遺伝子に対して設計されたプライマーを使用して、ジアゾトロフを同定することができる。また、微生物集団は、単一細胞培養非依存的手法および走化性誘導単離手法により濃縮することができる。あるいは、微生物の標的化単離は、微生物を選択培地で培養することにより実施することができる。微生物集団を所望の形質について濃縮するための計画的な手法は、バイオインフォマティクスデータによってガイドされ得、これは本明細書に記載されている。
バイオインフォマティクスを使用した窒素固定能力を有する微生物の濃縮
バイオインフォマティクスツールを使用して、植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を同定および単離することができ、前述の細菌は、窒素固定を実施する能力に基づいて選択される。高い窒素固定能力を有する微生物は、植物の好ましい形質を促進することができる。ＰＧＰＲを同定するためのバイオインフォマティクス分析モードとしては、限定されないが、ゲノミクス、メタゲノミクス、標的化単離、遺伝子配列決定、トランスクリプトーム配列決定、およびモデリングが挙げられる。
ゲノミクス分析を使用して、ＰＧＰＲを同定し、本明細書中に記載の次世代配列決定法および微生物バージョン管理法により変異の存在を確認することができる。
コロニー化の予測アルゴリズムを使用してＰＧＰＲを同定および単離するためにメタゲノミクスを使用することができる。また、メタデータを使用して、環境試料および温室試料中の操作された菌株の存在を同定することができる。
トランスクリプトーム配列決定を使用して、ＰＧＰＲ表現型に結び付く遺伝子型を予測することができる。加えて、トランスクリプトームデータを使用して、遺伝子発現を変更するためのプロモーターを同定する。トランスクリプトームデータを、全ゲノム配列（ＷＧＳ）と併せて分析して、代謝および遺伝子制御ネットワークのモデルを生成することができる。
微生物の順化
自然界から単離された微生物は、微生物が、遺伝学的に追跡可能および同定可能な形態に変換される順化プロセスを起こす場合がある。微生物を順化させる１つの様式は、抗生物質耐性を用いて微生物を操作することである。抗生物質耐性を操作するプロセスは、野生型微生物菌株の抗生物質感受性を決定することから開始することができる。細菌が抗生物質に感受性である場合、その抗生物質は、抗生物質耐性操作の良好な候補であり得る。その後、組換え法を使用して、抗生物質耐性遺伝子または対抗選択可能な自殺ベクターを、微生物のゲノムに組み込むことができる。対抗選択可能な自殺ベクターは、目的の遺伝子の欠失、選択マーカー、および対抗選択マーカーｓａｃＢからなり得る。対抗選択を使用して、天然微生物ＤＮＡ配列を抗生物質耐性遺伝子と交換することができる。ミディアムスループット法を使用して、複数の微生物を同時に評価して、並行順化を可能にすることができる。順化の代替方法としては、ホーミングヌクレアーゼを使用して、自殺ベクター配列がループアウトすることまたは介在ベクター配列を得ることを防止することを含む。
ＤＮＡベクターは、エレクトロポレーションおよび化学的形質転換を含むいくつかの方法により細菌に導入することができる。ベクターの標準的ライブラリーを形質転換に使用することができる。遺伝子編集法の例は、Ｃａｓ９試験を行って微生物でのＣａｓ９の活性を確実にした後のＣＲＩＳＰＲである。
微生物の非トランスジェニック操作
好ましい形質を有する微生物集団は、定向進化により得ることができる。定向進化（ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）は、自然淘汰プロセスを模倣して、タンパク質または核酸を使用者の設定目標に向かって進化させる手法である。定向進化（ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の例は、ランダム変異を微生物集団に導入した場合、最も好ましい形質を有する微生物を選択し、選択した微生物の増殖を継続させることである。成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）の最も好ましい形質は、窒素固定であってもよい。定向進化法は、各反復後の選択プロセスに基づき、反復性および適応性であってもよい。
高い窒素固定能力を有する植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を生成することができる。ＰＧＰＲの進化は、遺伝子変異の導入により実施することができる。遺伝子変異は、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発、飽和変異誘発、断片シャフリング変異誘発、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的変異誘発、およびそれらの組合せにより導入することができる。これらの手法は、ランダム変異を微生物集団に導入することができる。例えば、変異体は、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発により合成ＤＮＡまたはＲＮＡを使用して生成することができる。変異体は、プラスミド上に含まれるツールを使用して生成することができ、その後にプラスミドは取り除かれる。目的の遺伝子は、限定されないが、ＰＧＰＲ特性の改善、穀類のコロニー化の改善、酸素感受性の増加、窒素固定の増加、およびアンモニア排出の増加が挙げられる、形質の改善を有する他の種に由来するライブラリーを使用して同定することができる。これらのライブラリーに基づき、ＧｅｎｅｉｏｕｓまたはＰｌａｔｙｐｕｓ設計ソフトウェアなどのソフトウェアを使用して、属内遺伝子を設計することができる。変異は、機械学習の支援により設計することができる。変異は、代謝モデルの支援により設計することができる。ａ ｌａ Ｐｌａｔｙｐｕｓを使用して変異の自動設計を実施することができ、Ｃａｓ誘導変異誘発のためのＲＮＡが誘導されることになる。
属内遺伝子を、宿主微生物に移入することができる。加えて、レポーター系も微生物に移入することができる。レポーター系は、プロモーターを特徴付け、形質転換成功を決定し、変異体をスクリーニングし、陰性スクリーニングツールとして作用する。
変異を保持する微生物は、連続継代により培養することができる。微生物コロニーは、微生物の単一変異体を含む。微生物コロニーは、自動コロニーピッカーおよび液体ハンドラーの支援によりスクリーニングされる。遺伝子重複およびコピー数増加を有する変異体は、所望の形質のより高い遺伝子型を発現する。
窒素固定に基づく植物成長促進性微生物の選択
微生物コロニーは、種々のアッセイを使用してスクリーニングして、窒素固定を評価することができる。窒素固定を測定するための１つの様式は、窒素排出が測定される単一の発酵アッセイによる。代替方法は、経時的なインライン試料採取によるアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）である。ＡＲＡは、マイクロチューブアレイのハイスループットプレートで実施することができる。ＡＲＡは、生植物および生植物組織で実施することができる。ＡＲＡアッセイでは、培地処方および培地酸素濃度を変化させることができる。微生物変異体をスクリーニングするための別の方法は、バイオセンサーの使用による。ＮａｎｏＳＩＭＳおよびラマン顕微分光法の使用は、微生物の活性を調査するために使用することができる。また、いくつかの場合では、細菌を、バイオリアクターでの発酵法を使用して培養および増殖させることができる。バイオリアクターは、細菌成長の頑強性を改善させ、細菌の酸素感受性を減少させるように設計されている。中〜高ＴＰプレートに基づくマイクロ発酵槽を使用して、酸素感受性、栄養必要性、窒素固定、および窒素排出を評価する。また、細菌を、競合性のまたは有益な微生物と共培養して、隠れた経路を明らかにすることができる。化学的、比色定量的、または蛍光性の指示薬を使用して、高レベルの窒素を産生する細菌をスクリーニングするために、フローサイトメトリーを使用することができる。細菌を、窒素源の存在下または非存在下で培養してもよい。例えば、細菌を、グルタミン、アンモニア、尿素、または硝酸塩と共に培養してもよい。
微生物リモデリング誘導−概要
微生物リモデリング誘導は、作物マイクロバイオーム内の種の役割を系統的に同定および改善する方法である。いくつかの態様では、特定のグループ分け／カテゴリー化法によれば、この方法は、以下の３つの工程を含む：１）植物−微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連する制御ネットワークを予測することにより候補種を選択すること、２）制御ネットワークおよび微生物のゲノム内の遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的におよび予測可能に改善すること、および３）所望の作物表現型を生成する新しい微生物遺伝子型をスクリーニングおよび選択すること。
菌株の改善を系統的に評価するために、微生物共同体のコロニー化動態を、主要な種による遺伝子活性と関連付けるモデルを作出する。このモデルを使用して、遺伝子標的を、非属間遺伝子リモデリング（すなわち、非トランスジェニック様式での微生物の遺伝子アーキテクチャーの操作）について予測する。このプロセスの実施形態のグラフ図については、図１Ａを参照のこと。
図１Ａに示されているように、作物マイクロバイオームの合理的改善を使用して、土壌生物多様性を増加させ、要となる種の影響を調整し、そして／または重要な代謝経路のタイミングおよび発現を変更することができる。
この目的のために、本発明者らは、作物マイクロバイオーム内の菌株の役割を特定および改善するためのプラットフォームを開発した。いくつかの態様では、本発明者らは、このプロセスを微生物品種改良と呼ぶ。
前述の「微生物リモデリング誘導」プロセスは、実施例（例えば、実施例１の表題「微生物リモデリング誘導−農業用微生物種の合理的な改善のためのプラットフォーム」）にさらに詳述されるであろう。
連続継代
植物形質（例えば、窒素固定）を改善させる細菌の産生は、連続継代により達成することができる。これらの細菌の生産は、１またはそれを超える植物に１またはそれを超える改善された形質を付与することが可能な細菌および／または組成物を同定することに加えて、微生物叢により影響を受ける特定の改善された形質を有する植物を選択することにより行うことができる。植物形質を改善させる細菌を産生するための１つの方法は、（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離する工程；（ｂ）１またはそれを超える細菌に遺伝子変異を導入して、１またはそれを超える変異細菌を産生する工程；（ｃ）複数の植物を変異細菌に曝露する工程；（ｄ）複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離する工程であって、細菌を単離した植物が、複数の植物中の他の植物と比べて改善された形質を有する、工程；および（ｅ）改善された形質を有する植物から単離された細菌（工程（ｄ））を用いて、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む。工程（ｂ）〜（ｄ）は、植物の改善された形質が所望のレベルに達するまで、何回でも（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、またはそれを超える回数）繰り返すことができる。さらに、複数の植物は、１０〜２０個の植物、または２０個もしくはそれを超える、５０個もしくはそれを超える、１００個もしくはそれを超える、３００個もしくはそれを超える、５００個もしくはそれを超える、または１０００個もしくはそれを超える植物などの、２個を超える植物であり得る。
改善された形質を有する植物を得ることに加えて、１またはそれを超える遺伝子（例えば、窒素固定を制御する遺伝子）に導入された１またはそれを超える遺伝子変異を含む細菌を含む細菌集団が得られる。上記の工程を繰り返すことにより、目的の植物形質と相関する集団の最も適切なメンバーを含む細菌の集団を得ることができる。遺伝子分析および／または表現型分析などにより、この集団内の細菌を同定して、それらの有益な特性を決定することができる。工程（ａ）にて、単離された細菌の遺伝子分析を行ってもよい。表現型および／または遺伝子型の情報は、以下のものを含む技法を使用して得ることができる：植物由来の化学成分のハイスループットスクリーニング；遺伝物質のハイスループット配列決定を含む配列決定技法；ディファレンシャルディスプレイ技法（ＤＤＲＴ−ＰＣＲおよびＤＤ−ＰＣＲを含む）；核酸マイクロアレイ技法；ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）；およびｑＲＴ−ＰＣＲ（定量リアルタイムＰＣＲ）。得られた情報を使用して、系統発生分析、またはｒＲＮＡオペロンもしくは他の分類学的に有益な遺伝子座の成分をコードする核酸のマイクロアレイに基づくスクリーニングなどにより、存在する細菌の同一性および活性に関する群生プロファイル情報を得ることができる。分類学的に有益な遺伝子座の例としては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘｌ遺伝子、ｎｉｆＤ遺伝子が挙げられる。集団に存在する分類群を決定するための分類学的プロファイリングの例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４０１５５２８３号に記載されている。細菌の同定は、窒素固定経路に関連する遺伝子などの、１またはそれを超える遺伝子または１またはそれを超えるシグナル経路の活性を特徴付けることを含んでもよい。また、異なる細菌種間の相乗効果的な相互作用（２つの成分を組み合わせることにより、付加的な量を超えて所望の効果が増加すること）が、細菌集団に存在している場合がある。
遺伝子変異−ゲノム変更の位置および供給源
遺伝子変異は、以下からなる群から選択される遺伝子の変異であってもよい：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。遺伝子変異は、以下のからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異であってもよい：グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼａＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼ。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす変異であってもよい：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。遺伝子変異は、以下からなる群から選択される遺伝子の変異であってもよい：ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せ。いくつかの実施形態では、遺伝子変異は、本開示の至る所に記載の任意の遺伝子の変異であってもよい。
遺伝子変異の導入は、１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００個、またはそれを超えるヌクレオチドなどの、標的部位のうちの１またはそれを超えるヌクレオチドの挿入および／または欠失を含んでもよい。本明細書に開示されている方法の１またはそれを超える細菌に導入された遺伝子変異は、ノックアウト変異（例えば、プロモーターの欠失、中途終止コドンを生成する挿入または欠失、全遺伝子の欠失）であってもよく、または、タンパク質ドメインの活性の排除または消失（例えば、活性部位に影響を及ぼす点変異、またはタンパク質産物の関連部分をコードする遺伝子の部分の欠失）であってもよく、または標的遺伝子の制御配列の変更または消失であってもよい。また、異種制御配列、および遺伝子変異が導入されている細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される制御配列が挙げられる、１またはそれを超える制御配列を挿入してもよい。さらに、制御配列は、細菌培養物中または植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択してもよい。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入される所定の遺伝子変異であってもよい。遺伝子変異は、標的部位内のランダム変異であってもよい。遺伝子変異は、１またはそれを超えるヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。いくつかの場合では、形質改善を評価するために細菌を植物に曝露する前に、複数の異なる遺伝子変異（例えば、２、３、４、５、１０個、またはそれを超える）が、単離された細菌のうちの１つまたは複数に導入される。複数の遺伝子変異は、上記のタイプのいずれであってもよく、同じタイプであってもよく、または異なるタイプであってもよく、任意の組合せであってもよい。いくつかの場合では、複数の異なる遺伝子変異は、複数の遺伝子変異が細菌に蓄積され、改善された形質が関連する植物に徐々に付与されるように、連続的に、第１の単離工程後に第１の遺伝子変異を導入し、第２の単離工程後に第２の遺伝子変異を導入することなどによって導入される。
遺伝子変異−ゲノム変更を導入する方法
一般に、用語「遺伝子変異」は、基準ゲノムもしくはその部分または基準遺伝子もしくはその部分などの基準ポリヌクレオチドと比較した、ポリヌクレオチド配列に導入される任意の変更を指す。遺伝子変異は、「変異」と呼ばれる場合もあり、遺伝子変異を含む配列または生物は、「遺伝子バリアント」または「変異体」と呼ばれる場合がある。遺伝子変異は、遺伝子発現、代謝、および細胞シグナル伝達を含むいくつかの生物学的活性の増加または減少などの、任意の数の効果を有し得る。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入されてもよく、またはランダムに導入されてもよい。遺伝子変異を導入するための様々な分子ツールおよび方法が利用可能である。例えば、遺伝子変異は、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発、飽和変異誘発、断片シャフリング変異誘発、相同組換え、組換え操作、ランブダ−Ｒｅｄ媒介性組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的変異誘発、およびそれらの組合せにより導入することができる。遺伝子変異を導入するための化学的方法としては、ＤＮＡを、化学的変異原、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグアニジン、４−ニトロキノリンＮ−オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ−１７０、ホルムアルデヒド、塩酸プロカルバジン、エチレンオキシド、ジメチルニトロソアミン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホラミド、およびビスルファンなどに曝露することが挙げられる。放射線変異誘導因子としては、紫外放射線、γ線、Ｘ線、および高速中性子衝撃が挙げられる。また、例えば、トリメチルソラレンを紫外光と共に使用して、核酸に遺伝子変異を導入することができる。可動ＤＮＡエレメント、例えば転位エレメントのランダムな挿入または標的挿入は、遺伝子変異を生成するための別の適切な方法である。遺伝子変異は、例えば、誤りがちのＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ系での増幅中に核酸に導入することができる。遺伝子変異は、ＤＮＡシャフリング技法（例えば、エクソンシャフリングおよびドメイン交換など）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸に導入することができる。また、遺伝子変異は、細胞のＤＮＡ修復酵素の欠損の結果として核酸に導入することができる。例えば、変異ＤＮＡ修復酵素をコードする変異遺伝子が細胞に存在すると、その細胞のゲノムには、高頻度の変異（すなわち、約１個の変異／１００遺伝子〜１個の変異／１０，０００遺伝子）が生成されることが予想される。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例としては、限定されないが、Ｍｕｔ Ｈ、Ｍｕｔ Ｓ、Ｍｕｔ Ｌ、およびＭｕｔ Ｕ、ならびに他の種におけるそれらのホモログ（例えば、ＭＳＨ１６、ＰＭＳ１２、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、およびＥＲＣＣ−１など）が挙げられる。遺伝子変異を導入するための種々の方法の例示的な記載は、例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ５：１−７；Ｃｈｉａｎｇら．（１９９３）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ２（３）：２１０−２１７；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；ならびに米国特許第６，０３３，８６１号、および同第６，７７３，９００号に提供されている。
微生物に導入される遺伝子変異は、トランスジェニック、シスジェニック、ゲノム内、属内、属間、合成、進化、再構成、またはＳＮＰとして分類することができる。
遺伝子変異を、微生物内の多数の代謝経路に導入して、上記の形質の改善を誘発することができる。代表的な経路としては、硫黄取込み経路、グリコーゲン生合成、グルタミン制御経路、モリブデン取込み経路、窒素固定経路、アンモニア同化、アンモニア排出または分泌、窒素取込み、グルタミン生合成、アナモックス、リン酸塩可溶化、有機酸輸送、有機酸産生、凝集素産生、活性酸素ラジカルスカベンジング遺伝子、インドール酢酸生合成、トレハロース生合成、植物細胞壁分解酵素または経路、根付着遺伝子、菌体外多糖分泌、グルタミン酸合成酵素経路、鉄取込み経路、シデロフォア経路、キチナーゼ経路、ＡＣＣデアミナーゼ、グルタチオン生合成、亜リン酸シグナル伝達遺伝子、クオラムクエンチング経路、チトクロム経路、ヘモグロビン経路、細菌ヘモグロビン様経路、スモールＲＮＡ ｒｓｍＺ、リゾビトキシン生合成、ｌａｐＡ接着タンパク質、ＡＨＬクオラムセンシング経路、フェナジン生合成、環状リポペプチド生合成、および抗生物質産生が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を使用して、所望の変異を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して、侵入核酸のサイレンシングをガイドすることにより、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価物および／もしくは変異体、すなわちＣａｓ９様タンパク質）は、このタンパク質と、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）２つの天然または合成ＲＮＡ分子との結合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然で含有する。いくつかの場合では、２つの分子は、共有結合で連結されて、単一分子（単鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ配置および単一分子ガイドＲＮＡ配置を両方とも包含する）と結合し、それによりＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、このタンパク質が標的核酸配列にガイドされる。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、その天然酵素機能が維持されている場合、標的ＤＮＡを切断して、二本鎖切断を作成し、それによりゲノム変更（すなわち、編集、欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換など）をもたらすことができ、それにより遺伝子発現が変更される。Ｃａｓ９のいくつかの変異体（変異体は、用語Ｃａｓ９様に含まれる）は、ＤＮＡ切断活性が減少するように変更されている（変異体は、いくつかの場合では、標的ＤＮＡの両鎖ではなく１本の鎖を切断し、他の場合には、著しく還元されて、ＤＮＡ切断活性を示さない）。遺伝子変異を導入するためのＣＲＩＳＰＲ系のさらなる例示的な記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号に見出すことができる。
サイクル増幅技法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発では、変異原性プライマーを使用して、所望の変異を導入する。ＰＣＲは、変性、アニーリング、および伸長のサイクルで実施される。ＰＣＲによる増幅後、変異ＤＮＡの選択および親プラスミドＤＮＡの除去は、以下のようにして達成することができる：１）ＰＣＲ中にｄＣＴＰをヒドロキシメチル化ｄＣＴＰで置換し、その後制限酵素で消化して、非ヒドロキシメチル化親ＤＮＡのみを除去する；２）抗生物質耐性遺伝子および研究対象遺伝子を両方とも同時に変異誘発させ、プラスミドを異なる抗生物質耐性を有するように変化させ、新たな抗生物質耐性により、その後の所望の変異の選択が容易にする；３）所望の変異を導入した後、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限酵素Ｄｐｎｌにより親メチル化鋳型ＤＮＡを消化し、それにより変異誘発非メチル化鎖を回収する；または４）変異ＰＣＲ産物を、追加のライゲーション反応で環状化して、変異ＤＮＡの形質転換効率を増加させる。例示的な方法のさらなる記載は、例えば、米国特許第７１３２２６５号、米国特許第６７１３２８５号、米国特許第６６７３６１０号、米国特許第６３９１５４８号、米国特許第５７８９１６６号、米国特許第５７８０２７０号、米国特許第５３５４６７０号、米国特許第５０７１７４３号、および米国特許出願公開第２０１００２６７１４７号に見出すことができる。
部位特異的変異誘発とも呼ばれるオリゴヌクレオチド誘導変異誘発では、典型的には、合成ＤＮＡプライマーが利用される。この合成プライマーは、所望の変異を含有し、目的の遺伝子のＤＮＡとハイブリダイズすることができるように、変異部位付近が鋳型ＤＮＡと相補的である。変異は、単一塩基の変更（点変異）、複数塩基の変更、欠失、または挿入、またはこれらの組合せであってもよい。その後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、一本鎖プライマーを伸長させ、それにより遺伝子の残りを複製する。このように複製された遺伝子は、変異部位を含有し、その後ベクターとしての宿主細胞に導入し、クローニングしてもよい。最後に、変異体をＤＮＡ配列決定により選択して、それらが所望の変異を含有することを確認することができる。
遺伝子変異は、誤りがちのＰＣＲを使用して導入してもよい。この技法では、目的の遺伝子は、配列複製の忠実度が不十分である条件下でＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅される。その結果、増幅産物は、少なくとも１つのエラーを配列に含有する。遺伝子を増幅し、得られた反応産物（複数可）が、鋳型分子と比較して１またはそれを超える変更を配列に含有する場合、得られた産物は、鋳型と比較して変異誘発されている。ランダム変異を導入する別の手段は、細胞を、ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸などの化学的変異原に曝露し（Ｎｅｓｔｍａｎｎ，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ １９７５ Ｊｕｎｅ；２８（３）：３２３−３０）、その後、その遺伝子を含むベクターを宿主から単離することである。
飽和変異誘発は、別の形態のランダム変異誘発であり、特異的部位にまたは遺伝子の狭い領域に、全てのまたはほぼ全ての考え得る変異を生成しようするものである。一般的な意味では、飽和変異誘発は、変異誘発させようとする確定ポリヌクレオチド配列（変異誘発させようとする配列は、例えば１５〜１００，０００塩基長である）に変異原性カセットの完全なセット（各カセットの長さは、例えば１〜５００塩基である）を変異誘発させることから構成されている。したがって、一群の変異（例えば、１から１００個までの範囲の変異）が、変異誘発させようとする各カセットに導入される。１つのカセットに導入される変異のグループ分けは、飽和変異誘発の１ラウンドを施している間に第２のカセットに導入される変異の第２のグループ分けと異なっていてもよく、または同じであり得る。そのようなグループ分けは、欠失、付加、特定のコドンのグループ分け、および特定のヌクレオチドカセットのグループ分けにより例示される。
ＤＮＡシャフリングとも呼ばれる断片シャフリング変異誘発は、有益な変異を迅速に増幅させる方法である。シャフリングプロセスの一例では、ＤＮＡｓｅを使用して、１セットの親遺伝子を、例えば約５０〜１００ｂｐ長の小片に断片化する。その後、これにプライマーを用いないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が続き、十分な重複相同性配列を有するＤＮＡ断片が互いにアニーリングすることになり、その後ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。ＤＮＡ分子のいくつかが親遺伝子のサイズに到達した後も、このＰＣＲ伸長を数ラウンド行う。その後、これらの遺伝子を、今度は、鎖の末端に相補的になるように設計したプライマーを添加した別のＰＣＲで増幅することができる。プライマーは、クローニングベクターへのライゲーションに必要とされる制限酵素認識部位の配列などの追加の配列が、それらの５’末端に付加されてもよい。シャフリング技法のさらなる例は、米国特許出願公開第２００５０２６６５４１号に提供されている。
相同組換え変異誘発は、外因性ＤＮＡ断片と標的ポリヌクレオチド配列との間の組換えを含む。二本鎖切断が生じた後、切断物の５’末端付近のＤＮＡの区画は、切除と呼ばれるプロセスで切り離される。その後のストランド侵入工程では、切断されたＤＮＡ分子の突出３’末端が、切断されていない類似のまたは同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。この方法を使用すると、遺伝子を欠失させ、エクソンを除去し、遺伝子を付加し、点変異を導入することができる。相同組換え変異誘発は、恒久的または暫定的であり得る。典型的には、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別のベクターの成分であってもよく、別個のベクターに含有されていてもよく、または別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼによりニックまたは切断される標的配列内または付近などで相同組換えの鋳型としての役目を果たすように設計されている。鋳型ポリヌクレオチドは、長さが約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、約１５０個、約２００個、約５００個、約１０００個もしくはそれを超え、またはそれを超えるヌクレオチドなど、任意の適切な長さであってもよい。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの部分に相補的である。鋳型ポリヌクレオチドは、最適にアランメントされる場合、標的配列のうちの１またはそれを超えるヌクレオチドと重複してもよい（例えば、約１個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個もしくはそれを超え、またはそれを超えるヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、鋳型配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアランメントされる場合、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から、約１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個またはそれを超えるヌクレオチド内にある。相同組換えの方法に有用な部位特異的ヌクレアーゼの非限定的な例としては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。そのようなヌクレアーゼの使用に関するさらなる記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号および米国特許出願公開第２０１４０３０１９９０号を参照のこと。
化学的変異原または放射線を含む、主に点変異、ならびに短い欠失、挿入、転換、および／または転移を生じる変異原を使用して、遺伝子変異を作出してもよい。変異原としては、限定されないが、エチルメタンスルホン酸、メチルメタンスルホン酸、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素、トリエチルメラミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタンなど）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、およびホルムアルデヒドが挙げられる。
遺伝子変異の導入は、不完全なプロセスであってもよく、細菌の処置集団中のいくつかの細菌は、所望の変異を保持するが、他のものは保持していない。いくつかの場合では、所望の遺伝子変異を保持する細菌が富化されるように、選択圧を加えることが望ましい。伝統的には、遺伝子変異が成功した変異体の選択は、抗生物質耐性遺伝子の挿入または非致死性化合物を致死性代謝物へと変換することが可能な代謝活性の消失の場合など、遺伝子変異により機能が付与または消失されたものを選択することまたはそれらに対して選択することを含んでいた。所望の遺伝子変異のみを導入すればよい（例えば、選択マーカーさえ必要としない）ように、ポリヌクレオチド配列自体に基づく選択圧を加えることも可能である。この場合、選択圧は、遺伝子変異を導入することが求められている基準配列に対して選択が効果的に向けられるように、標的部位に導入される遺伝子変異が欠如したゲノムを切断することを含むことができる。典型的には、切断は、標的部位の１００個のヌクレオチド内で生じる（例えば、標的部位から７５個、５０個、２５個、１０個、またはそれより少数のヌクレオチド内、標的部位でのまたは標的部位内での切断を含む）。切断は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示されてもよい。そのようなプロセスは、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、標的部位での相同組換えを強化するためのプロセスに類似する。その結果、所望の遺伝子変異が欠如した細菌は、修復されずに細胞死に至る切断を受ける可能性がより高い。その後、選択を生き残った細菌を単離し、植物に曝露して、改善された形質の付与を評価するために使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼとして使用して、標的部位に切断を指示してもよい。変異微生物の選択の改善は、Ｃａｓ９を使用して非変異細胞を死滅させることにより得ることができる。その後、植物に変異微生物を接種して共生を再確認し、進化的圧力を作出して、効率的な共生生物を選択する。その後、微生物を植物組織から再単離することができる。非変異体に対する選択に用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系は、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、遺伝子変異の導入に関して上記のものと同様のエレメントを用いることができる。したがって、標的部位に指示された切断は、影響を受ける細胞の死を増強する。
標的部位での切断を特異的に誘導するための他の選択肢は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、およびメガヌクレアーゼなどが利用可能である。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、それにより、亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、固有の標的配列を切断することが可能になる。ＺＦＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、事実上任意の所望のＤＮＡ配列に結合するよう迅速に操作することができ、ＴＡＬＥＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、大型認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを使用して、高度に標的化された様式で配列を置換、排除、または改変することができる。タンパク質工学によりそれらの認識配列を改変することにより、標的配列を変更することができる。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、または動物に関わらず、あらゆるゲノムタイプの改変に使用することができ、通例では、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号１）、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。
遺伝子変異−同定方法
本開示の微生物は、前述の微生物へ導入されている１またはそれを超える遺伝子の改変または変更により同定することができる。前述の遺伝子の改変または変更を同定することができる１つの方法は、遺伝子の改変または変更を同定するのに十分な微生物のゲノム配列の部分を含む配列番号を参照することによる。
さらに、遺伝子の改変または変更がそれらのゲノムに導入されていない微生物（例えば、野生型、ＷＴ）の場合、本開示では、１６Ｓ核酸配列を使用して、前述の微生物を同定することができる。１６Ｓ核酸配列は、「分子マーカー」または「遺伝子マーカー」の例であり、核酸配列の特徴の差異を可視化するための方法で使用される指標を指す。他のそのような指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、またはアイソザイムマーカー、または特定の遺伝子および染色体位置を規定する本明細書中に記載のマーカーの組合せである。マーカーとしては、１６Ｓまたは１８Ｓ ｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、および互いと比較して関係性または特徴の解明に特に有用であることが証明されている小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子と大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子との間に見出される配列である内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列がさらに挙げられる。さらに、本開示は、本明細書中に開示の微生物を同定するために、目的の遺伝子（例えば、ｎｉｆＨ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、ｇｌｎＥ、ａｍｔＢなど）に見出される固有配列を使用する。
主要ｒＲＮＡサブユニット１６Ｓの一次構造は、異なる速度で進化し、ドメインなどの非常に古代の系統および属などのより最近の系統の両方の解明を可能にする保存された領域、可変領域、および超可変領域の特定の組合せを含む。１６Ｓサブユニットの二次構造は、残基の約６７％の塩基対合をもたらすおよそ５０個のヘリックスを含む。これらの高度に保存された二次構造特徴は、機能的に非常に重要であり、多重配列アラインメントおよび系統学的分析における位置的相同性を確保するために使用することができる。これまで数十年間にわたって、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、最も多く配列決定された分類学的マーカーになっており、細菌および古細菌の現在の系統的分類の基盤である（Ｙａｒｚａら．２０１４．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．１２：６３５−４５）。
したがって、ある特定の態様では、本開示は、表２３、２４、３０、３１、および３２におけるいずれかの配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する配列を提供する。
したがって、ある特定の態様では、本開示は、配列番号６２〜３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３１および３２に見出され得る。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７〜２８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する１６Ｓ核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３２に見出され得る。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、２８４〜２９５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３２に見出され得る。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３２に見出され得る。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３０４〜４２４と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物、またはプライマー、またはプローブ、またはノンネイティブジャンクション配列を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３０に見出され得る。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３７２〜４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するノンネイティブジャンクション配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３０に見出され得る。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号７７、７８、８１、８２、または８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３１に見出され得る。
遺伝子変異−検出方法：プライマー、プローブ、およびアッセイ
本開示は、本明細書で教示された微生物の検出に有用なプライマー、プローブ、およびアッセイを教示する。いくつかの態様では、本開示は、ＷＴ親菌株を検出するための方法を提供する。他の態様では、本開示は、ＷＴ菌株に由来する非属間の操作された微生物を検出するための方法を提供する。態様では、本開示は、微生物の非属間遺伝子変更を同定するための方法を提供する。
態様では、本開示のゲノム操作法は、誘導された非属間微生物中の非天然ヌクレオチド「ジャンクション」配列の作出に結び付く。これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを、本明細書で教示された微生物における特定の遺伝子改変の存在を示す特徴的タイプとして使用することができる。
本技法は、固有に設計されたプライマーおよびプローブを含む特化した定量的ＰＣＲ法を使用することにより、これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを検出することができる。いくつかの態様では、本開示のプローブは、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合する。いくつかの態様では、従来のＰＣＲが使用される。他の態様では、リアルタイムＰＣＲが使用される。いくつかの態様では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が使用される。
したがって、本開示は、リアルタイムでＰＣＲ産物を検出するための２つの一般的な方法の使用を包含することができる：（１）任意の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素、および（２）蛍光レポーターで標識されているオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブであって、このプローブがその相補的配列とハイブリダイゼーションした後でのみ検出が可能になる配列特異的ＤＮＡプローブ。いくつかの態様では、天然に存在しないヌクレオチドジャンクションのみが、教示されるプライマーにより増幅されることになり、結果的に、非特異的色素または特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用のいずれかにより検出することができる。他の態様では、本開示のプライマーは、プライマーがジャンクション配列のいずれかの側に隣接するように選択され、したがって、増幅反応が生じると、前述のジャンクション配列が存在する。
本開示の態様は、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列分子それ自体に加えて、穏やかからストリンジェントまでのハイブリダイゼーション条件下で、前述の天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能な他のヌクレオチド分子を含む。いくつかの態様では、穏やかからストリンジェントまでのハイブリダイゼーション条件下で、前述の天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能なヌクレオチド分子は、「ヌクレオチドプローブ」と名付けられる。
態様では、ゲノムＤＮＡを、試料から抽出し、ｑＰＣＲを使用することにより本開示の微生物の存在を定量化するために使用することができる。ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、野生型ゲノムの固有領域または操作された非属間変異体菌株の固有領域を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）により設計されたプライマーであり得る。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ１１７６２１００）キットを使用し、順方向および逆方向増幅プライマーのみを使用して実施することができ、あるいは、Ｋａｐａ Ｐｒｏｂｅ Ｆｏｒｃｅキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ＫＫ４３０１）を、増幅プライマー、ならびに５’末端のＦＡＭ色素標識、内部ＺＥＮクエンチャー、ならびに３’末端の副溝結合剤および蛍光クエンチャーを含むＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて使用してもよい。
ある特定のプライマー、プローブ、およびノンネイティブジャンクション配列は、表３０に列挙されている。ｑＰＣＲ反応効率は、標的ゲノムに由来する既知量のｇＤＮＡから作成される標準曲線を使用して測定することができる。データは、組織重量および抽出容積を使用して、生重量１ｇ当たりのゲノムコピー数に正規化することができる。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、１またはそれを超える核酸配列の増幅を、リアルタイムで定量化する方法である。ＰＣＲアッセイのリアルタイム定量化は、増幅中の目的の核酸および校正標準としての役目を果たすことができる適切な対照核酸配列を比較することにより、ＰＣＲ増幅工程により生成されている核酸の量の決定を可能にする。
ＴａｑＭａｎプローブは、標的核酸配列を定量化するために特異性を増加させることが必要なｑＰＣＲアッセイで使用されることが多い。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に付着されたフルオロフォア、およびプローブの３’末端に付着されたクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドプローブを含む。ＴａｑＭａｎプローブが、プローブの５’および３’末端が依然として互いに緊密に接触したままである場合、クエンチャーは、フルオロフォアからの蛍光シグナル伝達を防止する。ＴａｑＭａｎプローブは、特異的なプライマーセットにより増幅される核酸領域内にアニーリングするように設計されている。Ｔａｑポリメラーゼが、プライマーを伸長し、新生鎖を合成するときに、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にアニーリングしたプローブが分解される。このプローブ分解によりフルオロフォアが放出されるため、クエンチャーへの緊密な近接が破られ、フルオロフォアの蛍光発生が可能になる。ｑＰＣＲアッセイで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォアおよび反応中に存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。
ｑＰＣＲの特徴は、実施者が、従来のＰＣＲアッセイの増幅産物の観察に一般的に必要とされる労働集約的な増幅後のゲル電気泳動調製工程を排除することが可能なことである。従来のＰＣＲに対するｑＰＣＲの利益は大きく、利益としては、速さの増加、使いやすさ、再現性、および定量化能力が挙げられる。
形質の改善
本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または改善させるために用いることができる。導入または改善される形質の例としては、以下が挙げられる：根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収穫高、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、およびプロテオーム発現。植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実の収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された基準農業植物（例えば、改善された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。
導入または改善される好ましい形質は、本明細書に記載されているような窒素固定である。いくつかの場合では、本明細書中に記載の方法から生じる植物は、同一の土壌条件下で栽培された基準農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。さらなる例では、本明細書中に記載の方法から生じる植物は、類似の土壌条件下で栽培された基準農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。
改善される形質は、１またはそれを超える生物ストレス因子または非生物ストレス因子を適用することを含む条件下で評価してもよい。ストレス因子の例としては、非生物ストレス（熱ストレス、塩ストレス、干ばつストレス、寒冷ストレス、および低栄養ストレスなど）および生物ストレス（線虫ストレス、昆虫草食ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス、およびウイルス病原体ストレスなど）が挙げられる。
本開示の方法および組成物により改善された形質は、以前は窒素固定が可能ではなかった植物における窒素固定を含む窒素固定であってもよい。いくつかの場合では、本明細書中に記載の方法により単離された細菌は、植物の窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれよりも多く）を産生し、これは、いかなる遺伝子変異を導入する前の第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれよりも多く）の窒素固定能力の増加に相当し得る。いくつかの場合では、細菌は、植物の窒素のうちの５％またはそれを超える窒素を産生する。所望の窒素固定レベルは、遺伝子変異を導入する工程、複数の植物に曝露する工程、および改善された形質を有する植物から細菌を単離する工程を、１回またはそれを超える回数（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれを超える回数）繰り返した後で達成されてもよい。いくつかの場合では、窒素固定レベルの増強は、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源を補充された肥料の存在下で達成される。窒素固定の程度を評価するための方法は公知であり、それらの例は、本明細書中に記載されている。
微生物品種改良は、作物マイクロバイオーム内の種の役割を系統的に同定および改善するための方法である。この方法は、以下の３つの工程を含む：１）植物−微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連する制御ネットワークを予測することにより候補種を選択すること、２）制御ネットワークおよび遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的におよび予測可能に改善させること、ならびに３）所望の作物表現型を生成する新しい微生物遺伝子型をスクリーニングおよび選択すること。菌株の改善を系統的に評価するために、微生物共同体のコロニー化動態を、主要な種による遺伝子活性と関連付けるモデルを作出する。このモデルを使用して、遺伝子標的を品種改良について予測し、農学的に関連するマイクロバイオームコード形質の改善の選択頻度を改善させる。
農業的に関連する圃場状況で送達された窒素の測定
圃場では、窒素送達量は、コロニー化×活性の関数により決定することができる。
Figure 2021529522
上記の数式は、（１）植物組織１単位当たりの平均コロニー化、および（２）窒素固定量または各微生物細胞により排出されるアンモニア量のいずれかとしての活性を必要とする。１エーカー当たりの窒素のポンド数に変換するために、トウモロコシ成長生理学、例えば植物のサイズおよび根連携系を、経時的に成熟段階の全体にわたって追跡する。
１エーカー−季節当たりの作物に送達された窒素のポンド数は、以下の数式により算出することができる：
Figure 2021529522
植物組織（ｔ）は、栽培時間（ｔ）にわたるトウモロコシ植物組織の生重量である。合理的に計算を行うための値は、Ｒｏｏｔｓ，Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｕｐｔａｋｅ（Ｍｅｎｇｅｌ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ Ｐｕｂ．＃ＡＧＲＹ−９５−０８（Ｒｅｖ．Ｍａｙ−９５．ｐ．１−８．）と題する刊行物に詳述されている。
コロニー化（ｔ）は、栽培季節中の任意の特定の時間ｔにおける、植物組織の生重量１グラム当たりの植物組織内に見出される目的の微生物の量である。単一時点のみが利用可能である場合、単一時点は、季節全体のピークコロニー化速度として正規化され、残りの時点のコロニー化速度は、それに応じて調整される。
活性（ｔ）は、栽培季節中の任意の特定の時間ｔにおいて、Ｎが、目的の微生物により１単位時間当たりに固定される速度である。本明細書中に開示の実施形態では、この活性速度は、５ｍＭグルタミン存在下のｉｎ ｖｉｔｒｏアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）培地でのＡＲＡ、または５ｍＭアンモニウムイオンの存在下のＡＲＡ培地でのアンモニウム排出アッセイにより近似される。
次いで、上記の関数を積分することにより窒素送達量を算出する。上記の変数の値が、設定された時点で個別に測定される場合、それらの時点の間の値は、線形補間を実施することにより近似される。
窒素固定
本明細書中には、植物における窒素固定を増加させるための方法であって、植物を、窒素固定を制御する１またはそれを超える遺伝子に導入された１またはそれを超える遺伝子変異を含む細菌に曝露する工程を含み、細菌が、植物における窒素の１％またはそれを超える（例えば、２％、５％、１０％、またはそれを超える）窒素を産生し、産生が、細菌の非存在下における植物と比較して、少なくとも２倍の窒素固定能力に相当し得る方法が記載されている。細菌は、グルタミン、尿素、硝酸塩、またはアンモニアを補充した肥料の存在下で窒素を産生し得る。遺伝子変異は、上記で提供されている例を任意の数および任意の組合せで含む、本明細書中に記載されている任意の遺伝子変異であり得る。遺伝子変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子に導入されてもよい。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす変異であってもよい：ｎｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。本明細書に開示されている方法のうちの１またはそれを超える細菌に導入される遺伝子変異は、ノックアウト変異であってもよく、または標的遺伝子の制御配列を消失させてもよく、または異種制御配列の挿入、例えば、同一の細菌種または属のゲノム内に見出される制御配列の挿入を含んでもよい。制御配列は、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択することができる。遺伝子変異は、化学的変異誘発により生成されてもよい。工程（ｃ）にて栽培された植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露してもよい。
本明細書中に記載の植物に生じる窒素固定の量は、いくつかの方法で、例えばアセチレン還元（ＡＲ）アッセイにより測定することができる。アセチレン還元アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。特定の細菌が植物に固定窒素を提供している証拠としては、以下を挙げることができる：１）接種すると、総植物Ｎが著しく増加し、好ましくはそれに伴って植物におけるＮ濃度が増加すること；２）接種すると、窒素欠乏症状がＮ制限条件下で緩和されること（緩和には、乾燥物質の増加が含まれるべきである）；３）Ｎ２固定が、１５Ｎ手法（同位体希釈実験であってもよく、１５Ｎ２還元アッセイであってよく、または１５Ｎ天然存在量アッセイであってもよい）の使用により実証されること；４）固定されたＮが、植物タンパク質または代謝物に組み込まれること；および５）これら効果の全てが、未接種の植物または接種菌株の変異体を接種した植物で見られるわけではないこと。
野生型の窒素固定制御カスケードは、入力Ｏ２およびＮＨ４ ＋がＮＯＲゲートを通過し、その出力が、ＡＴＰに加えてＡＮＤゲートに入力されるデジタル論理回路として表すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、微生物が施肥圃場であっても窒素を産生することができるように、この回路に対するＮＨ４ ＋の影響を制御制御カスケードの複数地点で妨害する。しかしながら、本明細書に開示されている方法では、上記回路に対するＡＴＰまたはＯ２の影響を変更すること、または回路を細胞の他の制御カスケードと置換すること、または窒素固定以外の遺伝子回路を変更することも起想される。異種制御系の制御下で機能性産物を生成するように遺伝子クラスターを再操作してもよい。遺伝子クラスターのコード配列の外部および内部の天然制御エレメントを排除することにより、およびそれらを代替制御系と置換することにより、複雑な遺伝子オペロンおよび他の遺伝子クラスターの機能性産物を制御することができ、および／または天然遺伝子が由来していた種以外の異なる種の細胞を含む異種細胞に移動させることができる。合成遺伝子クラスターは、再操作されると、遺伝子回路または他の誘導可能な制御系により調節され、それにより産物の発現を所望のように調節することができる。ロジックゲート、パルス発生器、発振器、スイッチ、またはメモリデバイスとして作用するような発現カセットを設計してもよい。調節性発現カセットは、発現カセットが、酸素、温度、接触、浸透圧ストレス、膜ストレス、または酸化還元センサなどの環境センサとして機能するように、プロモーターに連結することができる。
例として、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＴ、およびｎｉｆＸ遺伝子を、ｎｉｆ遺伝子クラスターから排除してもよい。各アミノ酸配列をコードするＤＮＡをコドンランダム化することにより合成遺伝子を設計することができる。コドン選択を実施して、コドン使用頻度を天然遺伝子のコドン使用頻度からできるだけ逸脱するよう特定する。提案された配列を、制限酵素認識部位、トランスポゾン認識部位、反復配列、シグマ５４およびシグマ７０プロモーター、潜在性リボソーム結合部位、およびｒｈｏ非依存性ターミネーターなどの、あらゆる望ましくない特徴について走査する。合成リボソーム結合部位を、遺伝子の開始コドンを取り囲む１５０ｂｐ（−６０から＋９０まで）が蛍光遺伝子に融合されている蛍光レポータープラスミドを構築することなどにより、各々対応する天然リボソーム結合部位の強度と一致するように選択する。このキメラをＰｔａｃプロモーターの制御下で発現させ、フローサイトメトリーにより蛍光を測定することができる。合成リボソーム結合部位を生成するために、合成発現カセットの１５０ｂｐ（−６０〜＋９０）を使用するレポータープラスミドのライブラリーを生成する。簡潔に述べれば、合成発現カセットは、ランダムＤＮＡスペーサー、ＲＢＳライブラリーをコードする縮重配列、および各合成遺伝子のコード配列からなり得る。複数のクローンをスクリーニングして、天然リボソーム結合部位に最も良好に一致した合成リボソーム結合部位を同定する。このようにして天然オペロンと同じ遺伝子からなる合成オペロンを構築し、機能的な相補性について試験する。合成オペロンのさらなる例示的な記載は、米国特許出願公開第２０１４０３２９３２６号に提供されている。
細菌種
本明細書中に開示の方法および組成物に有用な微生物は、任意の供給源から得ることができる。いくつかの場合では、微生物は、細菌、古細菌、原生動物、または真菌であってもよい。本開示の微生物は、窒素固定微生物、例えば窒素固定細菌、窒素固定古細菌、窒素固定真菌、窒素固定酵母、または窒素固定原生動物であってもよい。本明細書中に開示の方法および組成物に有用な微生物は、胞子形成微生物、例えば胞子形成細菌であってもよい。いくつかの場合では、本明細書中に開示の方法および組成物に有用な細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。いくつかの場合では、細菌は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門の内生胞子形成細菌であってもよい。いくつかの場合では、細菌は、ジアゾトロフであってもよい。いくつかの場合では、細菌は、ジアゾトロフでなくともよい。
本開示の方法および組成物は、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓなどの古細菌と共に使用することができる。
いくつかの場合には、有用であり得る細菌として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｉｚａｗａｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｂｏｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｉｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓとしても公知）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（同義語：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｄｏｒｈｙｔｈｍｏｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｄｕｓａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｄｏｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｕｒｓｔａｋｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｃｏｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓとしても公知）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｒｏｃｃａｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｍａｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｇｒｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｎｉｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ（以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ（以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｕｓｇａｅ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ（以前は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ（以前は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａとして公知）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｒｏｒａｄｉｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒａｓｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓａｒａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ ＡＱ７１９（ＮＲＲＬアクセッション番号Ｂ−２１６６３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＡＱ１７５（ＡＴＣＣアクセッション番号５５６０８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＡＱ １７７（ＡＴＣＣアクセッション番号５５６０９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＡＱ１７８（ＡＴＣＣアクセッション番号５３５２２）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．菌株ＮＲＲＬアクセッション番号Ｂ−３０１４５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、細菌は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉであり得る。
いくつかの場合では、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの種、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍであり得る。
いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される細菌は、シアノバクテリアであってもよい。シアノバクテリア属の例としては、Ａｎａｂａｅｎａ（例えば、Ａｎａｇａｅｎａ ｓｐ．ＰＣＣ７１２０）、Ｎｏｓｔｏｃ（例えば、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）が挙げられる。
いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される細菌は、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ門、例えばＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍに属していてもよい。
いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、公知のＮｉｆＨ遺伝子と相同性である遺伝子を含んでいてもよい。公知のＮｉｆＨ遺伝子の配列は、例えば、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）、またはＢｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｗｗｗ．ｃｓｓ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｂｕｃｋｌｅｙ／ｎｉｆｈ、およびＧａｂｙ，Ｊｏｈｎ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ、「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．」、Ｄａｔａｂａｓｅ ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１）に見出すことができる。いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（Ｇａｂｙ，Ｊｏｈｎ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ、「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．」、Ｄａｔａｂａｓｅ ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書に開示されている方法および組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することにより；種子を粉砕して微生物を単離することにより；多様な土壌試料に種子を植栽し、組織から微生物を回収することにより；または植物に外因性微生物を接種し、微生物が植物組織に出現するか否かを決定することにより得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、塊茎、根、および根茎が挙げられる。いくつかの場合では、細菌は、種子から単離される。試料を処理するためのパラメータを変化させて、根圏菌、着生菌、または内部寄生菌などの、異なるタイプの連携微生物を単離することができる。また、細菌は、第１の植物から初期に分離する代わりに、環境菌株コレクションなどのレポジトリを供給源としてもよい。微生物は、単離された微生物のゲノムを配列決定することにより；ｉｎ ｐｌａｎｔａ群生の組成物をプロファイリングすることにより；群生もしくは単離された微生物のトランスクリプトーム機能性を特徴付けることにより；または選択培地もしくは表現型培地（例えば、窒素固定またはリン酸可溶化表現型）を使用して微生物の特徴をスクリーニングすることにより、遺伝子型および表現型を決定することができる。選択する候補菌株または集団は、配列データ；表現型データ；植物データ（例えば、ゲノム、表現型、および／または収穫高データ）；土壌データ（例えば、ｐＨ、Ｎ／Ｐ／Ｋ含有量、および／またはバルク土壌生物群生）；またはこれらの任意の組合せにより得ることができる。
本明細書中に記載の細菌および細菌を産生するための方法は、有害な植物防御反応を誘導せずに、葉表面、根表面、もしくは内部植物組織で効率的に自己増幅することができる細菌、または植物防御応答に耐性である細菌に適用してもよい。本明細書中に記載の細菌は、窒素が添加されていない培地で植物組織抽出物または葉表面洗浄液を培養することにより単離してもよい。しかしながら、細菌は、培養可能でない場合があり、すなわち、培養可能かどうか公知でないか、当該分野で公知の標準的方法の使用では培養が困難である場合がある。本明細書中に記載の細菌は、内部寄生菌、または着生菌、または植物根圏に生息する細菌（根圏細菌）であってもよい。遺伝子変異を導入する工程、複数の植物に曝露する工程、および改善された形質を有する植物から細菌を単離する工程を、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で得られる細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性であってもよい。内部寄生菌は、病徴を引き起こさずに、または共生構造の形成を誘発せずに、植物の内部に進入する生物であり、植物成長を増強し、植物の栄養を改善させる（例えば、窒素固定により）ことができるため農耕学的に興味深い生物である。細菌は、種子伝染性内部寄生菌であってもよい。種子伝染性内部寄生菌としては、成熟し乾燥した無損傷の（例えば、ひび割れ、目に見える真菌感染、または早期発芽がない）種子に見出される種子伝染性細菌性内部寄生菌などの、イネ化植物または植物の種子に付随するまたは由来する細菌が挙げられる。種子伝染性細菌性内部寄生菌は、種子の表面に付随もしくは由来してもよく、その代わりにまたはそれに加えて、内部種子区画（例えば、表面滅菌種子の）に付随もしくは由来してもよい。いくつかの場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、植物組織内で、例えば種子の内部で複製することが可能である。また、いくつかの場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、乾燥を生き抜くことが可能である。
本開示の方法により単離されるまたは本開示の方法もしくは組成物において使用される細菌は、複数の異なる細菌分類群を組合せで含むことができる。例として、細菌としては、プロテオバクテリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｎ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＨａｌｏｍｏｎａｓなど）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、およびＡｃｅｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍなど）、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄａｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなど）が挙げられ得る。本開示の方法および組成物で使用される細菌は、２つまたはそれを超える種の窒素固定細菌コンソーシアを含んでいてもよい。いくつかの場合では、細菌コンソーシアの１またはそれを超える細菌種は、窒素を固定することが可能であってもよい。いくつかの場合では、細菌コンソーシアの１またはそれを超える種は、窒素を固定する他の細菌の能力を促進または増強することができる。窒素を固定する細菌および窒素固定する他の細菌の能力を増強する細菌は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの例では、細菌菌株は、異なる細菌菌株と組み合わせると、またはある特定の細菌コンソーシアでは、窒素を固定することができる場合があるが、単一培養では窒素を固定することができない場合がある。窒素固定細菌コンソーシアに見出すことができる細菌属の例としては、限定されないが、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、およびＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられる。
本明細書に開示されている方法により産生することができる細菌としては、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．が挙げられる。いくつかの例では、細菌は、以下のものからなる群から選択されてもよい：Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ。いくつかの場合には、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属またはＲａｈｎｅｌｌａ属であり得る。いくつかの場合には、細菌は、Ｆｒａｎｋｉａ属またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属であり得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の例として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｉｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、細菌は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ｓｕｂｓｐ．Ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｏｒｉａｅ、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａであり得る。
いくつかの例では、本開示の方法によって単離された細菌は、以下の分類群：Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｚ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｆｉｐｉａ、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｔｏｐｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ、Ｂｏｓｅａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｈａｌｏｒｅｄｉｖｉｖｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒａｌｉｏｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｄｅｓｅｍｚｉａ、Ｄｅｖｏｓｉａ、Ｄｏｋｄｏｎｅｌｌａ、Ｄｙｅｌｌａ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ／Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｌｉｍｏｎａｓ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ、Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｆｎｉａ、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｈａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｌｅｎｔｚｅａ、Ｌｕｔｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ、Ｍａｓｓｉｌｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｇａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｃｅａｎｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、Ｏｋｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ、Ｏｒｙｚｉｈｕｍｕｓ、Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｅｏａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｅｒｌｕｃｉｄｉｂａｃａ、Ｐｌａｎｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｈｉｎｅｌｌａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、２５ Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ、Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ、Ｔａｔｕｍｅｌｌａ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎａｓ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、ＷＰＳ−２ ｇｅｎｅｒａ ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎｅｌｌａのうちの１またはそれを超えるメンバーであり得る。
いくつかの場合では、以下の属：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、およびＲａｈｎｅｌｌａのうちの少なくとも１つから選択される細菌種が利用される。いくつかの場合では、以下の属：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、およびＲａｈｎｅｌｌａからの細菌種の組合せが利用される。いくつかの場合では、利用される種は、以下：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＲａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓのうちの１またはそれを超える種であり得る。
いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＸ、ｈｅｓＡ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＩ１、およびｎｉｆＩ２を含むモリブデン−鉄ニトロゲナーゼ系を有していてもよい。いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ｖｎｆＤＧ、ｖｎｆＫ、ｖｎｆＥ、ｖｎｆＮ、ｖｕｐＣ、ｖｕｐＢ、ｖｕｐＡ、ｖｎｆＶ、ｖｎｆＲ１、ｖｎｆＨ、ｖｎｆＲ２、ｖｎｆＡ（転写制御因子）を含むバナジウムニトロゲナーゼ系を有していてもよい。いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ａｎｆＫ、ａｎｆＧ、ａｎｆＤ、ａｎｆＨ、ａｎｆＡ（転写制御因子）を含む鉄のみのニトロゲナーゼ系を有していてもよい。いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ｇｌｎＢおよびｇｌｎＫ（窒素シグナル伝達タンパク質）を含むニトロゲナーゼ系を有していてもよい。グラム陽性微生物の窒素代謝に関与する酵素のいくつかの例としては、ｇｌｎＡ（グルタミン合成酵素）、ｇｄｈ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、ｂｄｈ（３−ヒヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ）、グルタミナーゼ、ｇｌｔＡＢ／ｇｌｔＢ／ｇｌｔＳ（グルタミン酸合成酵素）、ａｓｎＡ／ａｓｎＢ（アスパラギン酸−アンモニアリガーゼ／アスパラギン合成酵素）、およびａｎｓＡ／ａｎｓＺ（アスパラギナーゼ）が挙げられる。グラム陽性微生物の窒素輸送に関与するタンパク質のいくつかの例としては、ａｍｔＢ（アンモニウムトランスポーター）、ｇｌｎＫ（アンモニウム輸送の制御因子）、ｇｌｎＰＨＱ／ ｇｌｎＱＨＭＰ（ＡＴＰ依存性グルタミン／グルタミン酸トランスポーター）、ｇｌｎＴ／ａｌｓＴ／ｙｒｂＤ／ｙｆｌＡ（グルタミン様プロトン共輸送トランスポーター）、およびｇｌｔＰ／ｇｌｔＴ／ｙｈｃｌ／ｎｑｔ（グルタミン酸様プロトン共輸送トランスポーター）が挙げられる。
特に興味深い可能性があるグラム陽性微生物の例としては、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｉｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｆｒａｎｋｉａ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｐｈｉｌｕｍ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｒｅｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｉｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｓｐｏｒａ ｓｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、およびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．が挙げられる。
グラム陽性微生物で可能な遺伝子変更のいくつかの例としては、ｇｌｎＲを欠失させて、環境窒素の存在下でのＢＮＦの負の制御を除去すること；ｎｉｆクラスターのすぐ上流に異なるプロモーターを挿入して、環境窒素に応答したＧｌｎＲによる制御を除去すること；ｇｌｎＡを変異させて、ＧＳ−ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化の速度を低減すること；ａｍｔＢを欠失させて、培地からのアンモニウムの取込みを低減させること；ｇｌｎＡを変異させ、それにより構成的にフィードバック阻害（ＦＢＩ−ＧＳ）状態にして、ＧＳ−ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化を低減させることが挙げられる。
いくつかの場合では、ｇｌｎＲは、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種におけるＮの代謝および固定の主要な制御因子である。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＲを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＥまたはｇｌｎＤを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含んでいてもよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＷＬＹ７８は、ｇｌｎＢの遺伝子、または古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに見出されるそのホモログであるｎｉｆＩ１およびｎｉｆＩ２を含んでいない。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、様々であってもよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｉｘａ Ｅ６８１は、ｇｌｎＫおよびｇｄｈを欠如し、いくつかの窒素化合物トランスポーターを有するが、ａｍｔＢのみが、ＧｌｎＲにより制御されると考えられる。別の例では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ２は、ｇｌｎＫ、ｇｄｈ、およびほとんどの他の中心的な窒素代謝遺伝子を有し、はるかにより少数の窒素化合物トランスポーターを有するが、ＧｌｎＲにより制御されるｇｌｎＰＨＱを有する。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ ＳＢＲ５は、標準ｇｌｎＲＡオペロン、ｆｄｘ遺伝子、主要ｎｉｆオペロン、二次ｎｉｆオペロン、およびａｎｆオペロン（鉄のみのニトロゲナーゼをコードする）を含んでいる。推定上のｇｌｎＲ／ｔｎｒＡ部位が、これらのオペロンの各々の上流に見出された。ＧｌｎＲは、ａｎｆオペロンを除き、上記オペロンの全てを制御することができる。ＧｌｎＲは、二量体として、これらの制御配列の各々に結合することができる。
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ Ｎ固定菌株は、以下の２つの部分群に分類することができる：最小限のｎｉｆ遺伝子クラスターのみを含む部分群Ｉ；ならびに最小限のクラスターに加えて、ｎｉｆＸとｈｅｓＡとの間にある特徴付けられていない遺伝子、および多くの場合はｎｉｆＨ、ｎｉｆＨＤＫ、ｎｉｆＢＥＮなどのｎｉｆ遺伝子の一部が重複している他のクラスター、またはバナジウム（ｖａｎａｄａｉｕｍ）ニトロゲナーゼ（ｖｎｆ）もしくは鉄のみのニトロゲナーゼ（ａｎｆ）遺伝子をコードするクラスターを含む部分群ＩＩ。
いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ−７０プロモーターから転写される９つの遺伝子を有する最小限のｎｉｆクラスターを含んでいてもよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｆクラスターは、窒素または酸素により負に制御されてもよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ−５４を産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＷＬＹ７８は、シグマ−５４の遺伝子を含んでいない。いくつかの場合では、ｎｉｆクラスターは、ｇｌｎＲおよび／またはＴｎｒＡにより制御されてもよい。いくつかの場合では、ｎｉｆクラスターの活性は、ｇｌｎＲおよび／またはＴｎｒＡの活性を変更することにより変更されてもよい。
Ｂａｃｉｌｌｉでは、グルタミン合成酵素（ＧＳ）は、高濃度の細胞内グルタミンによりフィードバック阻害され、シフト・イン・コンファメーションを引き起こす（ＦＢＩ−ＧＳと呼ばれる）。Ｎｉｆクラスターは、いくつかのＢａｃｉｌｌｉ種では、制御因子ＧｌｎＲおよびＴｎｒＡに対して個別の結合部位を含む。ＧｌｎＲは、過剰な細胞内グルタミンおよびＡＭＰの存在下で結合し、遺伝子発現を抑制する。ＧｌｎＲの役割は、高窒素利用可能条件下で、グルタミンおよびアンモニウムの流入および細胞内産生を防止することであってもよい。ＴｎｒＡは、限定的な細胞内グルタミンの存在下および／またはＦＢＩ−ＧＳの存在下で結合し、および／または遺伝子発現を活性化する（または抑制する）ことができる。いくつかの場合では、Ｂａｃｉｌｌｉ ｎｉｆクラスターの活性は、ＧｌｎＲの活性を変更することにより変更することができる。
フィードバック阻害されたグルタミン合成酵素（ＦＢＩ−ＧＳ）は、ＧｌｎＲに結合し、認識配列に対するＧｌｎＲの結合を安定化することができる。いくつかの細菌種は、ｎｉｆクラスターの上流にＧｌｎＲ／ＴｎｒＡ結合部位を有する。ＦＢＩ−ＧＳおよびＧｌｎＲの結合を変更することにより、ｎｉｆ経路の活性を変更することができる。
微生物の供給源
細菌（または本開示に従う任意の微生物）は、その土壌、植物、真菌、動物（無脊椎動物を含む）、ならびに湖および川の堆積物、水、および生物相を含む他の生物相を含む任意の一般的陸生環境；海洋環境、その生物相および堆積物（例えば、海水、海泥、海洋植物、海洋無脊椎動物（例えば、海綿動物）、海洋脊椎動物（例えば、魚類））；陸生および海洋性地圏（表土および岩石、例えば、粉砕された地中岩石、砂、および粘土）；氷雪圏およびその融雪氷水；大気（例えば、濾過空気粉塵、雲、および雨滴）；都市環境、工業環境、および他の人為的環境（例えば、コンクリート、道路側溝、屋根表面、および道路表面に蓄積された有機物および無機物）から得ることができる。
細菌（または本開示に従う任意の微生物）が得られる植物は、１またはそれを超える望ましい形質を有する植物、例えば、特定の環境でまたはある特定の目的の条件下で自然に成長する植物であってもよい。例として、ある特定の植物は、砂質土壌および高塩分の砂地で、もしくは極端な温度下で、もしくは水がほとんどなくとも自然に成長することができ、または環境に存在するある特定の有害生物または疾患に耐性であってもよく、商品作物は、そのような条件下で成長することが望ましい場合があり、そのような条件が、例えば特定の地理的位置において利用可能な唯一の条件である場合は特にそうである。さらなる例としては、細菌は、そのような環境で栽培された商品作物から、またはより具体的には、任意の特定の環境で栽培された作物のうち目的の形質を最も良好に示す作物植物個体：例えば、塩分制限土壌で栽培された作物のうち最も迅速に成長する植物、深刻な虫害もしくは疾患流行に曝露された作物のうち最も被害が少なかった植物、または繊維含量および油分含量などを含む、ある特定の代謝物および他の化合物の所望の量を有する植物、または望ましい色、味、もしくは匂いを示す植物から収集してもよい。細菌は、以前に参照されているような環境中の真菌および他の動物相および植物相、土壌、水、堆積物、ならびに他の要素を含む、目的の環境に生じる目的の植物または任意の物質から収集してもよい。
細菌（または本開示に従う任意の微生物）は、植物組織から単離してもよい。この単離は、例えば、根、茎葉、および植物再生組織を含む、植物の任意の適切な組織から行ってもよい。例として、植物から単離するための従来の方法は、典型的には、目的の植物物質（例えば、根長、または茎長、葉）を無菌切除すること、適切な溶液（例えば、２％次亜塩素酸ナトリウム）で表面を滅菌してから、植物物質を、微生物培養用の栄養培地に配置することを含む。あるいは、表面を滅菌した植物物質を滅菌液中（通常は、水）で粉砕し、粉砕した植物物質の小片を含む懸濁液を、選択的であってもよくまたは非選択的であってもよい（例えば、リンの供給源としてフィチン酸のみを含有する）適切な固体寒天培地（複数可）の表面に播種してもよい。この手法は、単離されたコロニーを形成し、個々に摘取して栄養培地のプレートから分離することができ、さらに周知の方法により単一種に精製することができる細菌に特に有用である。あるいは、植物根または葉試料を表面滅菌せず、穏やかな洗浄のみを行って、表面に生息する着生微生物を単離プロセスに含めてもよく、または植物の根、茎、もしくは葉の小片を寒天培地の表面に押しつけてから離し、その後上記のように個々のコロニーを単離することにより、着生微生物を別々に単離してもよい。この手法は、例えば、細菌に特に有用である。あるいは、根に付着している少量の土を洗い流さずに、したがって植物根圏でコロニー化する微生物を含むように、根を処理してもよい。そうでなければ、根に付着している土壌を取り出し、希釈し、適切な選択的および非選択的培地の寒天上に播種して、根圏細菌の個々のコロニーを単離してもよい。
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
本開示の微生物寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条項に基づいてなされた。
出願人は、米国特許規則第１．８０８条（ａ）（２）に準じて、「寄託されている材料の公衆への提供可能性に関して寄託者によって課せられている制限の全てが、特許が付与されたとき、取消不能の条件で撤回される」ことを申し立てる。この陳述は、この項の段落（ｂ）（すなわち、米国特許規則第１．８０８条（ｂ））に従うことを条件とする。
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉは、現在、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉとして再分類されており、この生物の名称は、本明細書全体にわたって相互交換可能に使用され得る。
図６および図７に示されているように、本開示の多数の微生物は、２つの野生型菌株に由来する。菌株ＣＩ００６は、以前はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（前述のＫｏｓａｋｏｎｉａへの再分類を参照）に分類されていた細菌種であり、図６には、ＣＩ００６に由来する変異体の系統が同定されている。菌株ＣＩ０１９は、Ｒａｈｎｅｌｌａ属に分類されている細菌種であり、図７には、ＣＩ０１９に由来する変異体の系統が同定されている。図６および図７に関して、名称にＣＭを含む菌株は、前述のＣＭ菌株のすぐ左側に示されている菌株の変異体である。ＣＩ００６ Ｋｏｓａｋｏｎｉａ野生型（ＷＴ）およびＣＩ０１９ Ｒａｈｎｅｌｌａ ＷＴの寄託情報は、下記の表１に見出される。
本出願に記載されているいくつかの微小生物は、２０１７年１月６日または２０１７年８月１１日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託された。前述のように、寄託は全て、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づいてなされた。前述のブダペスト条約寄託に関する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａのアクセッション番号および寄託日は、表１に提供されている。
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ（ＷＴ）、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ（ＷＴ）、およびバリアント／リモデリングされたＫｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１月６日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０１００１号、第２０１７０１００３号、および第２０１７０１００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。
バリアント／リモデリングされたＫｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０８００４号、第２０１７０８００３号、および第２０１７０８００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ（ＷＴ）の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、ＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０８００１号が割り当てられた。２つのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａのバリアント／リモデリングされた菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１２月２０日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７１２００１号および第２０１７１２００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。
表１：ブダペスト条約に基づいて寄託された微小生物
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単離された生物学的に純粋な微小生物
本開示は、ある特定の実施形態では、特に農業に適用される単離された生物学的に純粋な微小生物を提供する。開示される微小生物は、単離された生物学的に純粋な状態で使用することができ、組成物に製剤化することもできる（例示的な組成物の説明は、下記のセクションを参照）。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微小生物の少なくとも２つのメンバーを含む微生物組成物、ならびに前述の微生物組成物を使用するための方法を提供する。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微生物の使用により植物中の窒素固定を調整するための方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表１に示されているものである。他の態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表１の微小生物から誘導される。例えば、表１の微小生物の菌株、子孫、変異体、または誘導体が、本明細書で提供されている。本開示では、表１に列挙されている微生物のあらゆる考え得る組合せが企図され、前述の組合せは微生物コンソーシアを形成することがある。表１の微生物は、個々にまたは任意の組合せのいずれでもよく、本開示で言及されている任意の植物、活性分子（合成、有機など）、アジュバント、担体、栄養補助剤、または生物学的製剤と組み合わせることができる。
いくつかの態様では、本開示は、表２〜８にグループ分けした種を含む微生物組成物を提供する。いくつかの態様では、種々の微生物種を含むこれらの組成物は、微生物コンソーシアまたは微生物コンソーシアムと名付けられる。
表２〜８に関して、文字Ａ〜Ｉは、以下のように定義した、本開示の微小生物の非限定的な選択を表す：
Ａ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０１００１を有する微生物；
Ｂ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０１００３を有する微生物；
Ｃ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０１００２を有する微生物；
Ｄ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００４を有する微生物；
Ｅ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００３を有する微生物；
Ｆ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００２を有する微生物；
Ｇ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００１を有する微生物；
Ｈ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７１２００１を有する微生物；および
Ｉ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７１２００２を有する微生物。
表２：８菌株および９菌株の組成物
Figure 2021529522
 表３：７菌株組成物
Figure 2021529522
 表４：６菌株組成物
Figure 2021529522
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 表５：５菌株組成物
Figure 2021529522
 表６：４菌株組成物
Figure 2021529522
 表７：３菌株組成物
Figure 2021529522
 表８：２菌株組成物
Figure 2021529522
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、表２〜８由来の任意の群メンバーから選択され得る。
農業組成物
本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物は、液体、泡沫、または乾燥製品の形態であってもよい。また、本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物を使用して、植物形質を改善させることができる。いくつかの例では、細菌集団を含む組成物は、乾燥粉末、粉末および水のスラリー、または流動性種子処理剤の形態であってもよい。細菌集団を含む組成物は、種子の表面にコーティングしてもよく、液体形態であってもよい。
組成物は、連続撹拌槽型反応器、回分反応器などのバイオリアクターで、および農場で製造することができる。いくつかの例では、組成物は、ジャグなどの容器中でまたはミニバルクで保管することができる。いくつかの例では、組成物は、ボトル、ジャー、アンプル、パッケージ、入れ物、袋、箱、ビン、封筒、紙箱、容器、サイロ、発送容器、トラック荷台、および／またはケースからなる群から選択される物体内で保管することができる。
また、組成物は、植物形質を改善させるために使用することができる。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、種子にコーティングしてもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、実生にコーティングしてもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、種子の表面にコーティングしてもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、種子の表面上方の層としてコーティングしてもよい。いくつかの例では、種子にコーティングされる組成物は、液体形態であってもよく、乾燥製品形態であってもよく、泡沫形態であってもよく、粉末および水のスラリー形態であってもよく、または流動性種子処理剤であってもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を種子および／または実生に、噴霧、浸漬、コーティング、封入、および／または散布することにより、１またはそれを超える組成物を種子および／または実生に適用してもよい。いくつかの例では、複数の細菌または細菌集団を、植物の種子および／または実生にコーティングすることができる。いくつかの例では、細菌組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種を超える細菌は、以下の属：Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓのうちの１つから選択され得る。
いくつかの例では、内部寄生性組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種を超える細菌および細菌集団は、以下の科：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、およびＰｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。
いくつかの例では、内部寄生性組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種（ｎｉｇｈｔ）、少なくとも１０種、または１０種を超える細菌および細菌集団は、以下の科：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。
組成物の例としては、商業的に重要な農業作物、例えば、モロコシ、キャノーラ、トマト、イチゴ、オオムギ、イネ、メイズ、およびコムギのための種子コーティングを挙げることができる。また、組成物の例としては、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、および脂肪種子のための種子コーティングを挙げることができる。本明細書で提供される種子は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）であってもよく、非ＧＭＯであってもよく、有機的なものであってもよく、従来のものであってもよい。いくつかの例では、組成物を、植物の地上部に噴霧してよく、植物の種子が植栽されている植溝に挿入するか、土壌に灌水するか、組成物の懸濁液中に根を浸漬することによって適用してもよい。いくつかの例では、組成物は、細胞生存、および宿主植物での人為的接種およびコロニー化の能力を維持する適切な様式で脱水してもよい。細菌種は、１０８〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌの間の濃度で組成物中に存在してもよい。いくつかの例では、組成物は、モリブデンイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらイオンの組合せなどの微量金属イオンで補充されてもよい。本明細書中に記載の組成物の例におけるイオンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの間であってもよい。また、組成物のいくつかの例は、ベータ−グルカン、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、細菌性細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）、糖、畜乳、または他の適切な担体などの担体と共に製剤化されてもよい。いくつかの例では、泥炭または植栽用物質を担体として使用してもよく、または組成物がバイオポリマーに捕捉されているバイオポリマーを担体として使用してもよい。本明細書中に記載の細菌集団を含む組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含有量の維持、果実数または種子数の増加、および果実単位重量または種子単位重量の増加など、植物形質を改善させることができる。
本明細書中に記載の細菌集団を含む組成物は、種子の表面上にコーティングしてもよい。そのため、本明細書中に記載の１またはそれを超える細菌でコーティングされた種子を含む組成物も企図される。種子コーティングは、細菌集団を、多孔性の化学的に不活性な粒状担体と混合することにより形成することができる。あるいは、組成物は、種子が植栽される植溝内に直接挿入してもよく、植物葉に噴霧してもよく、または根を組成物の懸濁液に浸漬することにより適用してもよい。有効量の組成物を使用して、植物の根に隣接する心土領域に生存可能な細菌増殖を定植させてもよく、または植物の葉に生存可能な細菌増殖を定植させてもよい。一般的に、有効量は、改善された形質（例えば、所望のレベルの窒素固定）を有する植物をもたらすのに十分な量である。
本明細書中に記載の細菌組成物は、農業的に許容され得る担体を使用して製剤化することができる。これらの実施形態に有用な製剤は、粘着付与剤、微生物安定化剤、殺真菌剤、抗菌剤、保存剤、安定化剤、界面活性剤、抗錯体剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植植物成長調節物質、肥料、殺鼠剤、乾燥剤、殺菌剤、栄養素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含んでいてもよい。いくつかの例では、組成物は、長期保存可能であり得る。例えば、本明細書中に記載の組成物はいずれも、農業的に許容され得る担体（例えば、天然に存在しない肥料などの肥料、天然に存在しない付着剤などの付着剤、および天然に存在しない農薬などの農薬のうちの１つまたは複数）を含み得る。天然に存在しない付着剤は、例えば、ポリマー、コポリマー、または合成ろうであり得る。例えば、本明細書中に記載されているコーティングされた種子、実生、または植物はいずれも、種子コーティングにそのような農業的に許容され得る担体を含有することができる。本明細書中に記載の組成物または方法のいずれにおいても、農業的に許容され得る担体は、天然に存在しない化合物（例えば、天然に存在しない肥料、天然に存在しない付着剤（ポリマー、コポリマー、もしくは合成ろうなど）、または天然に存在しない農薬）であり得るか、含み得る。農業的に許容され得る担体の非限定的な例は、以下に記載されている。農業的に許容され得る担体のさらなる例は、当該分野で公知である。
いくつかの場合では、細菌は、農業的に許容され得る担体と混合される。担体は、固体担体または液体担体、ミクロスフェア、粉末、およびエマルジョンなどが含まれる種々の形態であり得る。担体は、安定性、湿潤性、または分散性の増加などの様々な特性を付与するいくつかの担体のいずれか１つまたは複数であってもよい。非イオン性界面活性剤またはイオン性界面活性剤、またはそれらの組合せであり得る天然または合成の界面活性剤などの湿潤剤が、組成物中に含まれ得る。また、単離された細菌を含む組成物を製剤化するために、油中水型乳濁液を使用することができる（例えば、米国特許第７，４８５，４５１号を参照のこと）。調製することができる適切な製剤としては、水和性粉末、顆粒、ゲル、寒天片またはペレット、および増粘剤など、ならびにマイクロカプセル化粒子など、流動性水溶液、水性懸濁液、油中水型乳濁液などの液体などが挙げられる。製剤は、穀物またはマメ科植物産物、例えば、粉砕した穀物もしくは豆、穀物もしくは豆に由来するブロスもしくは粉末、デンプン、糖、または油を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、農業担体は、土壌であってもよく、または植物生育培地であってもよい。使用することができる他の農業担体としては、水、肥料、植物系の油、湿潤薬、またはそれらの組合せが挙げられる。あるいは、農業担体は、顆粒、ペレット、または懸濁液を含む、珪藻土、ローム、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種子鞘、他の植物および動物産物、または組合せなどの固形物であってもよい。限定されないが、ローム、砂、または粘土などの中のペスタ（ｐｅｓｔａ）（粉末およびカオリン粘土）、寒天または粉末に基づくペレットなどの、前述の成分のいずれかの混合物も担体として企図される。製剤は、オオムギ、イネ、もしくは種子、植物部分、サトウキビバガス、穀物処理に由来する殻もしくは柄、建築現場廃物に由来する粉砕された植物材料もしくは木材、紙、織物、もしくは木材の再利用に由来するおが屑もしくは繊維片などの他の生物学的材料などの細菌の食料源を含んでもよい。
例えば、肥料を使用して、成長促進または、種子、実生、もしくは植物への栄養素の供給を支援することができる。肥料の非限定的な例としては、窒素、リン、カリウム、カルシウム、硫黄、マグネシウム、ホウ素、塩化物、マンガン、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、およびセレン（またはそれらの塩）が挙げられる。肥料のさらなる例としては、１またはそれを超えるアミノ酸、塩、炭水化物、ビタミン、グルコース、ＮａＣｌ、酵母抽出物、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、グリセロール、バリン、Ｌ−ロイシン、乳酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸水素カリウム、キシロース、リキソース、およびレシチンが挙げられる。１つの実施形態では、製剤は、他の活性剤が物質（例えば、種子の表面）に結合するのを支援するために、粘着付与剤または粘着物質（接着剤と呼ばれる）を含み得る。そのような薬剤は、他の化合物（例えば、生物学的ではない調節剤）を含有することができる担体を細菌と組み合わせて、コーティング組成物を生成するために有用である。そのような組成物は、植物または種子の周囲にコーティングを作出して、微生物および他の薬剤と植物または植物部分との接触の維持を支援する。１つの実施形態では、粘着剤は、以下からなる群から選択される：アルギン酸塩、ゴム、デンプン、レシチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、アルカリホルモノネチネート、ヘスペレチン、ポリ酢酸ビニル、ケファリン、アラビアゴム、キサンタンガム、鉱油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビノ−ガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランガム、ポリスチレン、ポリビニル、カルボキシメチルセルロース、ガッチゴム、およびポリオキシエチレン−ポリオキシブチレンブロックコポリマー。
いくつかの実施形態では、粘着剤は、例えば、カルナウバろう、みつろう、中国ろう、セラックろう、鯨ろう、カンデリラろう、キャスターろう、オーリクリーろう、および米ぬかろうなどのろう、ポリサッカリド（例えばデンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサン）、脂肪、油、タンパク質（例えば、ゼラチンおよびゼイン）、アラビアガム、ならびにシェラックであり得る。接着剤は、天然に存在しない化合物、例えばポリマー、コポリマー、およびろうであり得る。例えば、接着剤として使用することができるポリマーの非限定的な例としては、以下が挙げられる：ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（例えば、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アシルアミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレン。
いくつかの例では、付着剤、抗真菌剤、成長制御剤、および農薬（例えば、殺虫剤）のうちの１つまたは複数は、天然に存在しない化合物（例えば、任意の組合せの）である。農業的に許容され得る担体のさらなる例としては、分散物質（例えば、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートＰＶＰＩＶＡ Ｓ−６３０）、界面活性剤、結合剤、および充填剤が挙げられる。
製剤は、界面活性剤を含むこともできる。界面活性剤の非限定的な例としては、Ｐｒｅｆｅｒ ２８（Ｃｅｎｅｘ）、Ｓｕｒｆ−Ｎ（ＵＳ）、Ｉｎｈａｎｃｅ（Ｂｒａｎｄｔ）、Ｐ−２８（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＰａｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ）などの窒素−界面活性剤ブレンドが挙げられる；エステル化種子油としては、Ｓｕｎ−Ｉｔ ＩＩ（ＡｍＣｙ）、ＭＳＯ（ＵＡＰ）、Ｓｃｏｉｌ（Ａｇｓｃｏ）、Ｈａｓｔｅｎ（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＭｅｓ−１００（Ｄｒｅｘｅｌ）が挙げられる；有機シリコーン界面活性剤としては、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ７７（ＵＡＰ）、Ｓｉｌｉｋｉｎ（Ｔｅｒｒａ）、Ｄｙｎｅ−Ａｍｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｋｉｎｅｔｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｓｙｌｇａｒｄ ３０９（Ｗｉｌｂｕｒ−Ｅｌｌｉｓ）、およびＣｅｎｔｕｒｙ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）が挙げられる。１つの実施形態では、界面活性剤は、０．０１％ｖ／ｖ〜１０％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。別の実施形態では、界面活性剤は、０．１％ｖ／ｖ〜１％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。
ある特定の場合では、製剤は、微生物安定剤を含む。そのような薬剤としては、乾燥剤として分類することができる任意の化合物または化合物の混合物を含むことができる乾燥剤を挙げることができ、化合物（複数可）は、液体接種物に対して実際に乾燥効果を有するような濃度で使用されるか否かを問わない。そのような乾燥剤は、理想的には、使用される細菌集団と適合性を有し、微生物集団が種子へと適用されても生存し、乾燥しても生存する能力を促進すると予想される。適切な乾燥剤の例としては、トレハロース、スクロース、グリセロール、およびメチレングリコールのうちの１つまたは複数が挙げられる。他の適切な乾燥剤としては、限定されないが、非還元糖および糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）が挙げられる。製剤に導入される乾燥剤の量は、重量／容積で約５％から約５０％まで、例えば、約１０％〜約４０％の間、約１５％〜約３５％の間、または約２０％〜約３０％の間の範囲であり得る。いくつかの場合では、製剤は、殺真菌剤、抗菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節物質、殺鼠剤、殺菌剤、または栄養素などの薬剤を含有することが有利である。いくつかの例では、薬剤は、種子表面伝染性病原体から保護する保護剤を含んでもよい。いくつかの例では、保護剤は、いくらかのレベルで土壌伝染性病原体を調節することができる。いくつかの例では、保護剤は、主に種子表面で有効であり得る。
いくつかの例では、殺真菌剤は、化学的かまたは生物学的かに関わらず、真菌の成長を阻害することができるか、真菌を死滅させることができる化合物または薬剤を含んでいてもよい。いくつかの例では、殺真菌剤は、静真菌性または殺真菌性であり得る化合物を含んでいてもよい。いくつかの例では、殺真菌剤は、保護剤であり得るか、主に種子表面で有効であり、種子表面伝染性病原体から保護し、いくらかのレベルで土壌伝染性病原体を調節する薬剤であってもよい。保護剤である殺真菌剤の非限定的な例としては、カプタン、マネブ、チラム、またはフルジオキソニルが挙げられる。
いくつかの例では、殺真菌剤は、出芽中の実生に吸収され、宿主植物組織内部の真菌を阻害または死滅させることができる浸透移行性殺真菌剤であってもよい。種子処理に使用される浸透移行性殺真菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アゾキシストロビン、カルボキシン、メフェノキサム、メタラキシル、チアベンダゾール、トリフロキシストロビン、ならびにジフェノコナゾール、イプコナゾール、テブコナゾール、およびトリチコナゾールを含む種々のトリアゾール殺真菌剤。メフェノキサムおよびメタラキシルは、主に、水生カビ真菌ＰｙｔｈｉｕｍおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａを標的とするために使用される。病原性真菌種の感受性に微妙な差異があるため、または植物の殺真菌剤分布もしくは感受性に差異があるためのいずれかのため、植物種に応じて、ある殺真菌剤は、他の殺真菌剤よりも好ましい。いくつかの例では、殺真菌剤は、細菌または真菌などの生物学的制御因子であり得る。そのような生物は、病原性真菌に寄生性であってもよく、または真菌を死滅させるかもしくはそうでなければ真菌の成長を防止することができる毒素もしくは他の物質を分泌してもよい。任意のタイプの殺真菌剤、特に植物に対して一般に使用されるものを、種子組成物中の調節剤として使用することができる。
いくつかの例では、種子コーティング組成物は、抗細菌特性を有する調節剤を含む。１つの実施形態では、抗細菌特性を有する調節剤は、本明細書中の他所に記載されている化合物から選択される。別の実施形態では、化合物は、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、オキソリン酸、またはゲンタマイシンである。種子コーティング組成物の一部分として使用することができる抗細菌化合物の他の例としては、ジクロロフェンおよびベンジルアルコールヘミホルマールに基づくもの（ＩＣＩのＰｒｏｘｅｌ（登録商標）またはＴｈｏｒ ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＲＳ、およびＲｏｈｍ＆ＨａａｓのＫａｔｈｏｎ（登録商標）ＭＫ２５）、ならびにアルキルイソチアゾリノンおよびベンゾイソチアゾリノンなどのイソチアゾリノン誘導体に基づくもの（Ｔｈｏｒ ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＭＢＳ）が挙げられる。
いくつかの例では、成長制御因子は、以下からなる群から選択される：アブシジン酸、アミドクロル、アンシミドール、６−ベンジルアミノプリン、ブラシノリド、ブトラリン、クロルメコート（塩化クロルメコート）、塩化コリン、シクラニリド、ダミノジド、ジケグラック、ジメチピン、２，６−ジメチルプリジン、エテホン、フルメトラリン、フルルプリミドール、フルチアセト、フォルクロルフェヌロン、ジベレリン酸、イナベンフィド、インドール−３−酢酸、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メピクアト（塩化メピクアト）、ナフタレン酢酸、Ｎ−６−ベンジルアデニン、パクロブトラゾール、プロヘキサジオンホスホロトリチオエート、２，３，５−トリ−ヨード安息香酸、トリネキサパック−エチル、およびウニコナゾール。成長制御因子の追加の非限定的な例としては、ブラシノステロイド、サイトカイニン（例えば、キネチンおよびゼアチン）、オーキシン（例えば、インドリル酢酸およびアスパラギン酸インドリルアセチル）、フラボノイドおよびイソフラボノイド（ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｉｄ）（例えば、ホルモノネチンおよびジオスメチン）、フィトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｉｘｉｎ）（例えば、グリセオリン）、およびフィトアレキシン誘導性オリゴ糖（例えば、ペクチン、キチン、キトサン、ポリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、およびオリゴガラクツロン酸）、ならびにジベレリン（ｇｉｂｅｌｌｅｒｉｎ）が挙げられる。そのような薬剤は、理想的には、製剤が適用される農業用の種子または実生と適合性を有する（例えば、植物の成長または健康に有害であるべきではない）。さらに、薬剤は、理想的には、ヒト、動物、または工業使用に関して安全性の懸念を引き起こさないものである（例えば、安全性の問題がないか、または化合物は、十分に不安定であり、植物に由来する商品植物製品に含まれる化合物の量は無視できる程度である）。
線虫拮抗性生物防除剤のいくつかの例としては、ＡＲＦ１８；３０ Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｓｐｐ．；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｐ．；Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ ｓｐｐ．；Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ ｓｐｐ．；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｐ．；Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｓｐｐ．；Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．；Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．；Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐｐ．；Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．；Ｐｏｃｈｏｎｉａ ｓｐｐ．；Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．；嚢状体−樹枝状体菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．；Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．；およびＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。特に好ましい線虫拮抗性生物防除剤としては、ＡＲＦ１８、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ ｈｅｔｅｒｏｎｅｍａ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｖｉｘｅｎｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔｅｎｓｉｓ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｅｃａｎｉｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｇｅｐｈｙｒｏｐａｇｕｍ、Ｍｙｒｏｔｅｈｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ、Ｐｏｃｈｏｎｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｅ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｈａｓｅｏｌｉ、嚢状体−樹枝状体菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｔｈｏｒｎｅｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｎｉｓｈｉｚａｗａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｒａｍｏｓａ、Ｐａｓｔｒｕｅｉａ ｕｓａｇｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ菌株Ｇ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。
栄養素のいくつかの例は、窒素肥料（尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、無加圧窒素溶液、アンモニア水、無水アンモニア、チオ硫酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、尿素−ホルムアルデヒド、ＩＢＤＵ、ポリマー被覆尿素、硝酸カルシウム、ウレアホルム、およびメチレン尿素が含まれるが、これらに限定されない）、リン肥料（リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、ポリリン酸アンモニウム、濃縮過リン酸石灰、および重過リン酸石灰など）、およびカリ肥料（塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硝酸カリウムなど）からなる群から選択することができる。そのような組成物は、種子被膜組成物内の遊離塩またはイオンとして存在することができる。あるいは、栄養素／肥料は、経時的な持続放出を提供するように錯体化またはキレート化され得る。
殺鼠剤のいくつかの例としては、２−イソバレリルインダン−１，３−ジオン、４−（キノキサリン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド、アルファ−クロロヒドリン、リン化アルミニウム、ａｎｔｕ、酸化ヒ素、炭酸バリウム、ビスチオセミ、ブロジファコウム、ブロマジオロン、ブロメタリン、シアン化カルシウム、クロラロース、クロロファシノン、コレカルシフェロール、クマクロル、クマフリル、クマテトラリル、クリミジン、ジフェナコウム、ジフェチアロン、ジファシノン、エルゴカルシフェロール、フロクマフェン、フルオロアセトアミド、フルプロパジン、フルプロパジン塩酸酸、シアン化水素、ヨードメタン、リンダン、リン化マグネシウム、臭化メチル、ノルボルミド、ホサセチン、ホスフィン、リン、ピンドン、亜ヒ酸カリウム、ピリヌロン、シリロシド、亜砒酸ナトリウム、シアン化ナトリウム、フルオロ酢酸ナトリウム、ストリキニーネ、硫酸タリウム、ワルファリン、およびリン化亜鉛からなる物質の群から選択されるものを挙げることができる。
液体形態、例えば、溶液または懸濁液では、細菌集団は、水または水溶液に混合または懸濁することができる。適切な液体希釈剤または担体としては、水、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体が挙げられる。
固体組成物は、泥炭、コムギ、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、珪藻土、フラー土、および低温滅菌土などの適切に分割された固体担体内にまたは固体担体上に細菌集団を分散させることにより調製することができる。そのような製剤が水和性粉末として使用される場合、非イオン性、陰イオン性、両性、または陽イオン性の分散剤および乳化剤などの生物学的適合性を示す分散剤を使用することができる。
製剤時に使用される固体担体としては、例えば、カオリン粘土、パイロフィライト、ベントナイト、モンモリロナイト、珪藻土、酸性白土、バーミキュライト、およびパーライトなどの鉱物担体、ならびに硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム、および炭酸カルシウムなどの無機塩が挙げられる。また、小麦粉、小麦ふすま、および米ぬかなどの有機微細粉末を使用してもよい。液体担体としては、ダイズ油および綿実油などの植物油、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコールなどが挙げられる。
有害生物
本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える農薬と組み合わせられる。
本開示の微生物と組み合わせられる農薬は、下記の任意の有害生物を標的にし得る。
「有害生物」としては、限定されないが、昆虫、真菌、細菌、線虫、コダニ、およびマダニなどが挙げられる。害虫としては、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ａｎｏｐｌｕｒａ、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａなど、特に、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａおよびＣｏｌｅｏｐｔｅｒａの目から選択される昆虫が挙げられる。
当業者は、全ての化合物が全ての有害生物に同様に有効なわけではないことを認識するであろう。本開示の微生物と組み合わせることができる化合物は、害虫に活性を示すことができ、害虫としては、経済的に重要な農学、森林、温室、苗畑の観賞植物、食物および繊維、公衆衛生および動物衛生、家庭用および商業用の構造物、家庭用品および貯蔵製品の有害生物が挙げられ得る。
前述のように、本開示の農業組成物（本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る）を、実施形態で、１またはそれを超える農薬と組み合わせる。これらの農薬は、以下の有害生物のうちのいずれかに対して活性であり得る：
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の幼虫としては、制限されないが、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科のヨトウムシ、ネキリムシ、シャクトリムシ、およびタバコガ：Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｊ Ｅ Ｓｍｉｔｈ（ツマジロクサヨトウ）；Ｓ．ｅｘｉｇｕａ Ｈｕｂｎｅｒ（シロイチモンジョトウ）；Ｓ．ｌｉｔｕｒａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（ハスモンヨトウ（ｔｏｂａｃｃｏ ｃｕｔｗｏｒｍ）、ハスモンヨトウ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ Ｗａｌｋｅｒ（ベルタアーミーワーム）；Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コナガ）；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ Ｈｕｆｎａｇｅｌ（タマナヤガ）；Ａ．ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（ウェスタンカットワーム）；Ａ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グラニュレートカットワーム）；Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ Ｈｕｂｎｅｒ（コットンリーフワーム）；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ Ｈｕｂｎｅｒ（キャベツシャクトリムシ）；Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ Ｗａｌｋｅｒ（ソイビーンルーパー）；Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ Ｈｕｂｎｅｒ（ハッショウマメイモムシ）；Ｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グリーンクローバーワーム）；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（オオタバコガ幼虫）；Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ（ヨトウムシ）；Ａｔｈｅｔｉｓ ｍｉｎｄａｒａ Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｍｃｄｕｎｎｏｕｇｈ（ラフスキンドカットワーム）；Ｅｕｘｏａ ｍｅｓｓｏｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ（ダークサイディッドカットワーム）；Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（スピニーボールワーム）；Ｅ．ｖｉｔｔｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（スポッテドボールワーム）；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ Ｈｕｂｎｅｒ（オオタバコガ）；Ｈ．ｚｅａ Ｂｏｄｄｉｅ（アメリカタバコガまたはコットンボールワーム）；Ｍｅｌａｎｃｈｒａ ｐｉｃｔａ Ｈａｒｒｉｓ（ゼブラキャタピラー）；Ｅｇｉｒａ（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ）ｃｕｒｉａｌｉｓ Ｇｒｏｔｅ（シトラスカットワーム）；Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科由来の穿孔動物、ケースベアラー、ウェブワーム、コーンワーム、およびスケルトナイザー：Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ Ｈｕｂｎｅｒ（セイヨウアワノメイガ）；Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ Ｗａｌｋｅｒ（ネーブルオレンジワーム（ｎａｖａｌ ｏｒａｎｇｅｗｏｒｍ））；Ａｎａｇａｓｔａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ Ｚｅｌｌｅｒ（スジコナマダラメイガ）；Ｃａｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ Ｗａｌｋｅｒ（アーモンドモス）；Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ（ニカメイガ）；Ｃ．ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、（ソルガムボーラー）；Ｃｏｒｃｙｒａ ｃｅｐｈａｌｏｎｉｃａ Ｓｔａｉｎｔｏｎ（ライスモス）；Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ Ｃｌｅｍｅｎｓ（コーンルートウェブワーム）；Ｃ．ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ Ｚｉｎｃｋｅｎ（シバツトガ）；Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ Ｇｕｅｎｅｅ（イネタテハマキ）；Ｄｅｓｍｉａ ｆｕｎｅｒａｌｉｓ Ｈｕｂｎｅｒ（グレープリーフフォールダー）；Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（メロンワーム）；Ｄ．ｎｉｔｉｄａｌｉｓ Ｓｔｏｌｌ（ピックルワーム）；Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ Ｄｙａｒ（サウスウェスタンコーンボーラー）、Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（サトウキビメイガ）；Ｅｏｒｅｕｍａ ｌｏｆｔｉｎｉ Ｄｙａｒ（メキシカンライスボーラー）；Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ Ｈｕｂｎｅｒ（タバコ（カカオ）モス）；Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（オオハチミツガ）；Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ（ソッドウェブワーム）；Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ Ｈｕｌｓｔ（サンフラワーモス）；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ Ｚｅｌｌｅｒ（モロコシマダラメイガ）；Ａｃｈｒｏｉａ ｇｒｉｓｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（レサーワックスモス）；Ｌｏｘｏｓｔｅｇｅ ｓｔｉｃｔｉｃａｌｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ビートウェブワーム）；Ｏｒｔｈａｇａ ｔｈｙｒｉｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ（ティーツリーウェブモス）；Ｍａｒｕｃａ ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ Ｇｅｙｅｒ（ビーンポッドボーラー）；Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ Ｈｕｂｎｅｒ（ノシメマダラメイガ）；Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ Ｗａｌｋｅｒ（イエローステムボーラー）；Ｕｄｅａ ｒｕｂｉｇａｌｉｓ Ｇｕｅｎｅｅ（セロリリーフタイヤー）；ならびに以下のＴｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科のハマキムシ、アオムシ、種子蠕虫、および果実蠕虫：Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（ウェスタンブラックヘディッドバッドワーム）；Ａ．ｖａｒｉａｎａ Ｆｅｒｎａｌｄ（イースタンブラックヘディッドバッドワーム）；Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ Ｗａｌｋｅｒ（フルーツツリーリーフローラー）；Ａ．ｒｏｓａｎａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヨーロピアンリーフローラー）；および他のＡｒｃｈｉｐｓ種、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｖｏｎ Ｒｏｓｓｌｅｒｓｔａｍｍ（サマーフルーツハマキガ）；Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（バンディットサンフラワーモス）；Ｃｙｄｉａ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（フィルバートワーム）；Ｃ．ｐｏｍｏｎｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コドリンガ（ｃｏｌｄｉｎｇ ｍｏｔｈ））；Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ Ｃｌｅｍｅｎｓ（バリアゲイティドリーフローラー）；Ｐ．ｓｔｕｌｔａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（オムニボラスリーフローラー）；Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ Ｄｅｎｉｓ ＆ Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（ヨーロピアングレープバインモス）；Ｓｐｉｌｏｎｏｔａ ｏｃｅｌｌａｎａ Ｄｅｎｉｓ ＆ Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（アイスポッティッドバッドモス）；Ｅｎｄｏｐｉｚａ ｖｉｔｅａｎａ Ｃｌｅｍｅｎｓ（グレープベリーモス）；Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ Ｈｕｂｎｅｒ（バインモス）；Ｂｏｎａｇｏｔａ ｓａｌｕｂｒｉｃｏｌａ Ｍｅｙｒｉｃｋ（ブラジリアンアップルリーフローラー）；Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ Ｂｕｓｃｋ（ナシノヒメシンクイ）；Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ Ｒｉｌｅｙ（サンフラワーバッドモス）；Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｓｐｐ．；Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｓｐｐ．が挙げられる。
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目で選択される他の農学有害生物としては、制限されないが、Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ（フォールカンカーワーム）；Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ Ｚｅｌｌｅｒ（ピーチツウィッグボーラー）；Ａｎｉｓｏｔａ ｓｅｎａｔｏｒｉａ Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ（オレンジストライプドオークワーム）；Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（チャイニーズオークタッサーモス）；Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（カイコ）；Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ Ｂｕｓｃｋ（コットンリーフパーフォレイター）；Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（アルファルファキャタピラー）；Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ Ｇｒｏｔｅ ＆ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ウォルナットキャタピラー）；Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ Ｔｓｃｈｅｔｗｅｒｉｋｏｖ（シベリアンシルクモス）、Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ Ｈｕｂｎｅｒ（エルムスパンワーム）；Ｅｒａｎｎｉｓ ｔｉｌｉａｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ（リンデンシャクトリムシ）；Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（シロバネドクガ）；Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（グレープリーフスケルトナイザー）；Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ ｏｌｉｖｉａｅ Ｃｏｃｋｒｅｌｌ（レンジキャタピラー）；Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ Ｄｒｕｒｙ（アメリカシロヒトリ）；Ｋｅｉｆｅｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（トマトピンワーム）；Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ Ｈｕｌｓｔ（イースタンヘムロックルーパー）；Ｌ．ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ ｌｕｇｕｂｒｏｓａ Ｈｕｌｓｔ（ウェスタンヘムロックルーパー）；Ｌｅｕｃｏｍａ ｓａｌｉｃｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サテンモス）；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（マイマイガ）；Ｍａｎｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ（ファイブスポッティッドホークモス、トマトホーンワーム）；Ｍ．ｓｅｘｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ（トマトホーンワーム（ｔｏｍａｔｏ ｈｏｍｗｏｒｍ）、タバコホーンワーム）；Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ウインターモス）；Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｖｅｒｎａｔａ Ｐｅｃｋ（スプリングカンカーワーム）；Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ Ｃｒａｍｅｒ（ジャイアントスワローテールオレンジドッグ）；Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｐａｃｋａｒｄ（カリフォルニアオークワーム）；Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ Ｓｔａｉｎｔｏｎ（ミカンハモグリガ）；Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（スポッティッドテンチフォームリーフマイナー）；Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ラージホワイトバタフライ）；Ｐ．ｒａｐａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（スモールホワイトバタフライ）；Ｐ．ｎａｐｉ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（グリーンべインドホワイトバタフライ）；Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ Ｒｉｌｅｙ（アーティチョークプルームモス）；Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コナガ）；Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ Ｓａｕｎｄｅｒｓ（ピンクボールワーム）；Ｐｏｎｔｉａ ｐｒｏｔｏｄｉｃｅ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ ａｎｄ Ｌｅｃｏｎｔｅ（サザンキャベツワーム）；Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ Ｇｕｅｎｅｅ（オムニボラスルーパー）；Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ（レッドハンプドキャタピラー）；Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ ｃｅｒｅａｌｅｌｌａ Ｏｌｉｖｉｅｒ（アングモアグレインモス）；Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（パインプロセショナリーキャタピラー）；Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ Ｈｕｍｍｅｌ（ウェビングクローズモス）；Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ Ｍｅｙｒｉｃｋ（トマトキバガ）；Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（アーミンモス）；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ Ｇｕｅｎｅｅ；Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｓｐｐ．およびＯｒｇｙｉａ ｓｐｐ．；Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（セイヨウアワノメイガ）；タネバエ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ（タマナヤガ）が挙げられる。
Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目の幼虫および成虫としては、Ａｎｔｈｒｉｂｉｄａｅ科、Ｂｒｕｃｈｉｄａｅ科、およびＣｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ科由来のゾウムシ（制限されないが、以下が挙げられる：Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ Ｂｏｈｅｍａｎ（ワタミハナゾウムシ）；Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ Ｋｕｓｃｈｅｌ（イネミズゾウムシ）；Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（グラナリアコクゾウムシ）；Ｓ．ｏｒｙｚａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ココクゾウムシ）；Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（クローバーリーフウィービル）；Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ ＬｅＣｏｎｔｅ（サンフラワーステムウィービル）；Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ ＬｅＣｏｎｔｅ（レッドサンフラワーシードウィービル）；Ｓ．ｓｏｒｄｉｄｕｓ ＬｅＣｏｎｔｅ（グレイサンフラワーシードウィービル）；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ（メイズビルバグ））；Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ科のノミハムシ、キューカンバービートル、ルートワーム、ハムシ、ジャガイモハムシ、およびハモグリムシ（制限されないが、以下が挙げられる：Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ Ｓａｙ（コロラドハムシ）；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ＬｅＣｏｎｔｅ（ウェスタンコーンルートワーム）；Ｄ．ｂａｒｂｅｒｉ Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｌａｗｒｅｎｃｅ（ノーザンコーンルートワーム）；Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ Ｂａｒｂｅｒ（サザンコーンルートワーム）；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ（ミノハムシ）；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ Ｇｏｅｚｅ（クルシファーフリービートル）；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ（キスジノミハムシ）；Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グレープコラスピス）；Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（クビアカクビボソハムシ）；Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（サンフラワービートル））；Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ科由来のビートル（制限されないが、以下が挙げられる：Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ Ｍｕｌｓａｎｔ（メキシカンビーンビートル））；Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ科由来のコガネムシおよび他のビートル（制限されないが、以下が挙げられる：Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｎｅｗｍａｎ（マメコガネ）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ａｒｒｏｗ（ノーザンマスクドチェイファー、ホワイトグラブ）；Ｃ．ｉｍｍａｃｕｌａｔａ Ｏｌｉｖｉｅｒ（サザンマスクドチェイファー、ホワイトグラブ）；Ｒｈｉｚｏｔｒｏｇｕｓ ｍａｊａｌｉｓ Ｒａｚｏｕｍｏｗｓｋｙ（ヨーロピアンチェイファー）；Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ（ホワイトグラブ）；Ｌｉｇｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ Ｄｅ Ｇｅｅｒ（キャロットビートル））；Ｄｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ科由来のカーペットビートル；Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ科由来のコメツキムシ：Ｅｌｅｏｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．；Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｓｐｐ．；Ｌｉｍｏｎｉｕｓ ｓｐｐ．；Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｓｐｐ．；Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ ｓｐｐ．；Ａｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．；Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ科由来のキクイムシおよびＴｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ科由来のビートル；Ｃｅｒｏｔｏｍａ ｔｒｉｆｕｒｃａｔｅ（ビーンリーフビートル）；ならびにコメツキムシが挙げられる。
Ｄｉｐｔｅｒａ目の成体および幼体としては、ハモグリムシＡｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ Ｌｏｅｗ（コーンブロッチリーフマイナー）；小昆虫（制限されないが、以下が挙げられる：Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ Ｃｏｑｕｉｌｌｅｔｔ（ソルガムミッジ）；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ Ｓａｙ（ヘシアンバエ）；Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ Ｇｅｈｉｎ（ムギアカタマバエ）；Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ Ｆｅｌｔ、（サンフラワーシードミッジ））；ミバエ（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）、Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ミバエ）；ウジ（制限されないが、以下が挙げられる：Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ Ｍｅｉｇｅｎ（タネバエ）；Ｄ．ｃｏａｒｃｔａｔａ Ｆａｌｌｅｎ（ウィートバルブフライ）、および他のＤｅｌｉａ ｓｐｐ．、Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｆｉｔｃｈ（ムギキモグリバエ）；Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（イエバエ）；Ｆａｎｎｉａ ｃａｎｉｃｕｌａｒｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ、Ｆ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ Ｓｔｅｉｎ（ヒメイエバエ）；Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サシバエ））；フェイスフライ、ノサシバエ、ホホアカクロバエ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ ｓｐｐ．；Ｐｈｏｒｍｉａ ｓｐｐ．および他のマスコイドフライペスト、ウマバエＴａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．；ボットフライ Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．；Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．；ウシバエＨｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．；メクラアブＣｈｒｙｓｏｐｓ ｓｐｐ．；Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ ｏｖｉｎｕｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヒツジシラミバエ）および他のＢｒａｃｈｙｃｅｒａ、カＡｅｄｅｓ ｓｐｐ．；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．；Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．；ブユＰｒｏｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．；Ｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．；ヌカカ、スナバエ、シアリド、および他のＮｅｍａｔｏｃｅｒａが挙げられる。
制限されないが、以下などのＨｅｍｉｐｔｅｒａ目およびＨｏｍｏｐｔｅｒａ目の成虫および若虫：Ａｄｅｌｇｉｄａｅ科由来のカサアブラムシ、Ｍｉｒｉｄａｅ科由来のプラントバグ、Ｃｉｃａｄｉｄａｅ科由来のセミ、ヨコバイ、Ｅｍｐｏａｓｃａ ｓｐｐ．；Ｃｉｃａｄｅｌｌｉｄａｅ科由来、Ｃｉｘｉｉｄａｅ科、Ｆｌａｔｉｄａｅ科、Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ科、Ｉｓｓｉｄａｅ科、およびＤｅｌｐｈａｃｉｄａｅ科由来のプラントホッパー、Ｍｅｍｂｒａｃｉｄａｅ科由来のツノゼミ、Ｐｓｙｌｌｉｄａｅ科由来のサイリッド、Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ科由来のコナジラミ、Ａｐｈｉｄｉｄａｅ科由来のアブラムシ、Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒｉｄａｅ科由来のネアブラムシ、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｉｄａｅ科由来のコナカイガラムシ、Ａｓｔｅｒｏｌｅｃａｎｉｄａｅ科、Ｃｏｃｃｉｄａｅ科、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｉｄａｅ科、Ｄｉａｓｐｉｄｉｄａｅ科、Ｅｒｉｏｃｏｃｃｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｅｚｉｉｄａｅ科、Ｐｈｏｅｎｉｃｏｃｏｃｃｉｄａｅ科、およびＭａｒｇａｒｏｄｉｄａｅ科由来のカイガラムシ、Ｔｉｎｇｉｄａｅ科由来のグンバイムシ、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科由来のカメムシ、シンチバグ、Ｂｌｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．；およびＬｙｇａｅｉｄａｅ科由来の他のシードバグ、Ｃｅｒｃｏｐｉｄａｅ科由来のアワフキムシ、Ｃｏｒｅｉｄａｅ科由来のスカッシュバグ、ならびにＰｙｒｒｈｏｃｏｒｉｄａｅ科由来のツツガムシおよびコットンステイナー。
Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ目由来の農学的に重要なメンバーとしては、限定されないが、以下がさらに挙げられる：Ａｃｙｒｔｈｉｓｉｐｈｏｎ ｐｉｓｕｍ Ｈａｒｒｉｓ（エンドウヒゲナガアブラムシ）；Ａｐｈｉｓ ｃｒａｃｃｉｖｏｒａ Ｋｏｃｈ（マメアブラムシ）；Ａ．ｆａｂａｅ Ｓｃｏｐｏｌｉ（マメクロアブラムシ）；Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ Ｇｌｏｖｅｒ（ワタアブラムシ、メロンアフィッド）；Ａ．ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ Ｆｏｒｂｅｓ（コットンルートアフィッド）；Ａ．ｐｏｍｉ Ｄｅ Ｇｅｅｒ（アップルアフィッド）；Ａ．ｓｐｉｒａｅｃｏｌａ Ｐａｔｃｈ（スパイリアアフィッド）；Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ（フォックスグラブアフィッド）；Ｃｈａｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｆｒａｇａｅｆｏｌｉｉ Ｃｏｃｋｅｒｅｌｌ（ストロベリーアフィッド）；Ｄｉｕｒａｐｈｉｓ ｎｏｘｉａ Ｋｕｒｄｊｕｍｏｖ／Ｍｏｒｄｖｉｌｋｏ（ロシアンウィートアフィッド）；Ｄｙｓａｐｈｉｓ ｐｌａｎｔａｇｉｎｅａ Ｐａａｓｅｒｉｎｉ（ロージーアップルアフィッド）；Ｅｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ Ｈａｕｓｍａｎｎ（ウーリーアップルアフィッド）；Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ダイコンアブラムシ）；Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ｐｒｕｎｉ Ｇｅｏｆｆｒｏｙ（ミーリープラムアフィッド）；Ｌｉｐａｐｈｉｓ ｅｒｙｓｉｍｉ Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ（ニセダイコンアブラムシ）；Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ ｄｉｒｒｈｏｄｕｍ Ｗａｌｋｅｒ（シリアルアフィッド）；Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ Ｔｈｏｍａｓ（ポテトアフィッド）；Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ Ｓｕｌｚｅｒ（ピーチポテトアフィッド、グリーンピーチアフィッド）；Ｎａｓｏｎｏｖｉａ ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ Ｍｏｓｌｅｙ（レタスアフィッド）；Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｓｐｐ．（ルートアフィッドおよびゴールアフィッド）；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ Ｆｉｔｃｈ（トウモロコシアブラムシ）；Ｒ．ｐａｄｉ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（バードチェリーオートアフィッド）；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ Ｒｏｎｄａｎｉ（グリーンバグ）；Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ Ｆｏｒｂｅｓ（イエローシュガーケーンアフィッド）；Ｓｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（イングリッシュグレインアフィッド）；Ｔｈｅｒｉｏａｐｈｉｓ ｍａｃｕｌａｔａ Ｂｕｃｋｔｏｎ（スポッティッドアルファアフィッド）；Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ ａｕｒａｎｔｉｉ Ｂｏｙｅｒ ｄｅ Ｆｏｎｓｃｏｌｏｍｂｅ（コミカンアブラムシ）およびＴ．ｃｉｔｒｉｃｉｄａ Ｋｉｒｋａｌｄｙ（ブラウンシトラスアフィッド）；Ｍｅｌａｎａｐｈｉｓ ｓａｃｃｈａｒｉ（シュガーケーンアフィッド）；Ａｄｅｌｇｅｓ ｓｐｐ．（カサアブラムシ）；Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ ｄｅｖａｓｔａｔｒｉｘ Ｐｅｒｇａｎｄｅ（ペカンフィロキセラ）；Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ（タバコホワイトフライ、スイートポテトホワイトフライ）；Ｂ．ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉｉ Ｂｅｌｌｏｗｓ ＆ Ｐｅｒｒｉｎｇ（シルバーリーフホワイトフライ）；Ｄｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｃｉｔｒｉ Ａｓｈｍｅａｄ（シトラスホワイトフライ）；Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅｕｓ（バンデッドウイングドホワイトフライ）およびＴ．ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ Ｗｅｓｔｗｏｏｄ（グリーンハウスホワイトフライ）；Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ Ｈａｒｒｉｓ（ポテトリーフホッパー）；Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ Ｆａｌｌｅｎ（スモーラーブラウンプラントホッパー）；Ｍａｃｒｏｌｅｓｔｅｓ ｑｕａｄｒｉｌｉｎｅａｔｕｓ Ｆｏｒｂｅｓ（アスターリーフホッパー）；Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ Ｕｈｌｅｒ（グリーンリーフホッパー）；Ｎ．ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ Ｓｔａｌ（ライスリーフホッパー）；Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ Ｓｔａｌ（ブラウンプラントホッパー）；Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ Ａｓｈｍｅａｄ（トウモロコシウンカ）；Ｓｏｇａｔｅｌｌａ ｆｕｒｃｉｆｅｒａ Ｈｏｒｖａｔｈ（セジロウンカ）；Ｓｏｇａｔｏｄｅｓ ｏｒｉｚｉｃｏｌａ Ｍｕｉｒ（ライスデルファシド）；Ｔｙｐｈｌｏｃｙｂａ ｐｏｍａｒｉａ ＭｃＡｔｅｅ（ホワイトアップルリーフホッパー）；Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｏｕｒａ ｓｐｐ．（グレープリーフホッパー）；Ｍａｇｉｃｉｃａｄａ ｓｅｐｔｅｎｄｅｃｉｍ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（周期ゼミ）；Ｉｃｅｒｙａ ｐｕｒｃｈａｓｉ Ｍａｓｋｅｌｌ（イセリアカイガラムシ）；Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓｕｓ Ｃｏｍｓｔｏｃｋ（サンホセカイガラムシ）；Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｉｔｒｉ Ｒｉｓｓｏ（シトラスミーリーバグ）；Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（他のミーリーバグ複合物）；Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ ｐｙｒｉｃｏｌａ Ｆｏｅｒｓｔｅｒ（ペアシラ）；Ｔｒｉｏｚａ ｄｉｏｓｐｙｒｉ Ａｓｈｍｅａｄ（カキノキキジラミ）。
Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目由来の種としては、制限されないが、以下が含まれる：Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ Ｓａｙ（グリーンスティンクバグ）；Ａｎａｓａ ｔｒｉｓｔｉｓ Ｄｅ Ｇｅｅｒ（スカッシュバグ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ Ｓａｙ（チンチバグ）；Ｃｏｒｙｔｈｕｃａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（コットンレースバグ）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ ｍｏｄｅｓｔａ Ｄｉｓｔａｎｔ（トマトバグ）；Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ ｓｕｔｕｒｅｌｌｕｓ Ｈｅｒｒｉｃｈ−Ｓｃｈａｆｆｅｒ（コットンステイナー）；Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ Ｓａｙ（ブラウンスティングバグ）；Ｅ．ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ Ｐａｌｉｓｏｔ ｄｅ Ｂｅａｕｖａｉｓ（ワンスポッティッドスティンクバグ）；Ｇｒａｐｔｏｓｔｅｔｈｕｓ ｓｐｐ．（シードバグの複合物）；Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ ｃｏｒｃｕｌｕｓ Ｓａｙ（リーフフッテッドパインシードバグ）；Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ Ｐａｌｉｓｏｔ ｄｅ Ｂｅａｕｖａｉｓ（ターニッシュドプラントバグ）；Ｌ．Ｈｅｓｐｅｒｕｓ Ｋｎｉｇｈｔ（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）；Ｌ．ｐｒａｔｅｎｓｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コモンメドウバグ）；Ｌ．ｒｕｇｕｌｉｐｅｎｎｉｓ Ｐｏｐｐｉｕｓ（ヨーロピアンターニッシュドプラントバグ）；Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ ｐａｂｕｌｉｎｕｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コモングリーンキャプシド）；Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サザングリーンスティンクバグ）；Ｏｅｂａｌｕｓ ｐｕｇｎａｘ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（イネカメムシ）；Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ ｆａｓｃｉａｔｕｓ Ｄａｌｌａｓ（ラージミルクウィードバグ）；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ Ｒｅｕｔｅｒ（コットンフリーホッパー）。
Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ（Ｃａｌｏｃｏｒｉｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｇｍｅｌｉｎ（ストロベリーバグ）；Ｏｒｔｈｏｐｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ；Ｐｌｅｓｉｏｃｏｒｉｓ ｒｕｇｉｃｏｌｌｉｓ Ｆａｌｌｅｎ（アップルキャプシド）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ ｍｏｄｅｓｔｕｓ Ｄｉｓｔａｎｔ（トマトバグ）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ ｎｏｔａｔｕｓ Ｄｉｓｔａｎｔ（サックフライ）；Ｓｐａｎａｇｏｎｉｃｕｓ ａｌｂｏｆａｓｃｉａｔｕｓ Ｒｅｕｔｅｒ（ホワイトマークドフリーホッパー）；Ｄｉａｐｈｎｏｃｏｒｉｓ ｃｈｌｏｒｉｏｎｉｓ Ｓａｙ（ハニーロカストプラントバグ）；Ｌａｂｏｐｉｄｉｃｏｌａ ａｌｌｉｉ Ｋｎｉｇｈｔ（オニオンプラントバグ）；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ Ｒｅｕｔｅｒ（コットンフリーホッパー）；Ａｄｅｌｐｈｏｃｏｒｉｓ ｒａｐｉｄｕｓ Ｓａｙ（ラピッドプラントバグ）；Ｐｏｅｃｉｌｏｃａｐｓｕｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（フォーラインドプラントバグ）；Ｎｙｓｉｕｓ ｅｒｉｃａｅ Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ（フォールスチンチバグ）；Ｎｙｓｉｕｓ ｒａｐｈａｎｕｓ Ｈｏｗａｒｄ（フォールスチンチバグ）；Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サザングリーンスティンクバグ）；Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｓｐｐ．；Ｃｏｒｅｉｄａｅ ｓｐｐ．；Ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｄａｅ ｓｐｐ．；Ｔｉｎｉｄａｅ ｓｐｐ．；Ｂｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ ｓｐｐ．；Ｒｅｄｕｖｉｉｄａｅ ｓｐｐ．ａｎｄ Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ ｓｐｐ．など）。
以下の成虫および幼虫：Ａｃａｒｉ目（ダニ）（Ａｃｅｒｉａ ｔｏｓｉｃｈｅｌｌａ Ｋｅｉｆｅｒ（ウィートカールマイト）；Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ Ｍｕｌｌｅｒ（ホモノハダニ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｉｄａｅ科のハダニおよびアカハダニ：Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｕｌｍｉ Ｋｏｃｈ（リンゴハダニ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ Ｋｏｃｈ（ツースポッティッドスパイダーマイト）；（Ｔ．ｍｃｄａｎｉｅｌｉ ＭｃＧｒｅｇｏｒ（マクダニエルマイト）；Ｔ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（カルミンスパイダーマイト）；Ｔ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ Ｕｇａｒｏｖ ＆ Ｎｉｋｏｌｓｋｉ（ストロベリースパイダーマイト）；Ｔｅｎｕｉｐａｌｐｉｄａｅ科のフラットマイト：Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ ｌｅｗｉｓｉ ＭｃＧｒｅｇｏｒ（オンシツヒメハダニ）；Ｅｒｉｏｐｈｙｉｄａｅ科のサビダニおよびバドマイト、他のフォイラーフィーディングマイト、ならびにヒトおよび動物の健康に重要なダニ（すなわち、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｔｉｄａｅ科のイエダニ、Ｄｅｍｏｄｉｃｉｄａｅ科のニキビダニ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｉｄａｅ科の穀物ダニ、Ｉｘｏｄｉｄａｅ目のマダニ：Ｉｘｏｄｅｓ ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ Ｓａｙ（シカダニ）；Ｉ．ｈｏｌｏｃｙｃｌｕｓ Ｎｅｕｍａｎｎ（オーストラリアンパラレシスチック）；Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ Ｓａｙ（アメリカイヌカクマダニ）；Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（アメリカキララマダニ）、ならびにＰｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ科、Ｐｙｅｍｏｔｉｄａｅ科、およびＳａｒｃｏｐｔｉｄａｅ科のキュウセンヒゼンダニなど）。
Ｔｈｙｓａｎｕｒａ目の害虫（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（セイヨウシミ）；Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｐａｃｋａｒｄ（マダラシミ）など）。
さらなる節足動物の有害生物としては、以下が挙げられる：Ａｒａｎｅａｅ目のクモ（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｒｅｃｌｕｓａ Ｇｅｒｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍｕｌａｉｋ（ドクイトグモ）およびＬａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（クロゴケグモ）など）およびＳｃｕｔｉｇｅｒｏｍｏｒｐｈａ目のムカデ（Ｓｃｕｔｉｇｅｒａ ｃｏｌｅｏｐｔｒａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ゲジ）など）。
カメムシおよび他の関連する昆虫の上科としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科に属する種（Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ、Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ ｈａｌｙｓ、Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ ｇｕｉｌｄｉｎｉ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｔｒｉｓｔｉｇｍｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｍｅｌａｃａｎｔｈｕｓ、およびＢａｇｒａｄａ ｈｉｌａｒｉｓ（Ｂａｇｒａｄａ Ｂｕｇ））、Ｐｌａｔａｓｐｉｄａｅ科に属する種（Ｍｅｇａｃｏｐｔａ ｃｒｉｂｒａｒｉａ−マルカメムシ）およびＣｙｄｎｉｄａｅ科に属する種（Ｓｃａｐｔｏｃｏｒｉｓ ｃａｓｔａｎｅａルートスティンクバグ）、ならびにＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに属する種（限定されないが、以下が挙げられる：コナガ（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ Ｂｏｄｄｉｅ）；ソイビーンルーパー（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ Ｗａｌｋｅｒ）およびハッショウマメイモムシ（例えば、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ Ｈｕｂｎｅｒ））。
線虫としては、根瘤線虫、シスト線虫、および病変線虫などの寄生線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．ａｎｄ Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．が挙げられる）；特に、シスト線虫のメンバー（限定されないが、以下が挙げられる：Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズシストセンチュウ）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（テンサイシストセンチュウ）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ（ムギシストセンチュウ）およびＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ（ジャガイモシストセンチュウ））が挙げられる。病変線虫としては、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．が挙げられる。
農薬および本開示の微生物を含む殺有害生物組成物
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える農薬と組み合わせられる。農薬としては、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤などを挙げることができる。
いくつかの実施形態では、農薬／微生物組成物を、組成物の形態で適用することができ、耕作地または処理すべき植物に、他の化合物と同時または連続して適用することができる。これらの化合物は、肥料、除草薬、抗凍結剤、界面活性剤、界面活性物質、殺有害生物石鹸、ドルマントオイル、ポリマー、および／または１回の適用後に標的領域の長期間投与可能な持続放出性または生分解性の担体製剤であり得る。また、これらの化合物は、必要に応じて、製剤分野で慣習的に使用されているさらなる農業的に許容され得る担体、界面活性剤、または適用を促進するアジュバントを含む、選択的な除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺微生物剤、殺アメーバ剤、農薬、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、またはこれらの調製物のうちのいくつかの混合物であり得る。適切な担体（すなわち、農業的に許容され得る担体）およびアジュバントは、固体または液体であり得、処方テクノロジーで通常使用されている物質（例えば、天然または再生された鉱物、溶媒、分散物質、湿潤剤、固着剤、粘着付与剤、結合剤、または肥料）に相当する。同様に、製剤は、餌に調製され得るか、殺有害生物製剤の標的有害生物に摂食または摂取させるための有害生物トラップに作出され得る。
本開示の微生物と組み合わせることができる例示的な化学的組成物としては、以下が挙げられる：
果実／野菜除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リヌロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロ・スルフロン・ゴワン、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム；果実／野菜殺虫剤：アルジカルブ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、ダイアジノン、マラチオン、アバメクチン、シフルトリン／ベータシフルトリン、エスフェンバレラート、ランブダ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、トルフェンピラド、クロチアニジン、スピロジクロフェン、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、シアジピル、スピノテラム、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロール、シフルメトフェン、シアノピラフェン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、ホルチアザート、フェナミホス、カデュサホス、ピリプロキシフェン、フェンブタチンオキシド、ヘキシチアゾクス、メトミル、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２、２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン；果実野菜殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、ＥＢＤＣ、サルファー、チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、シモキサニル、フルアジナム、ホセチル、イプロジオン、クレソキシム−メチル、メタラキシル／メフェノキサム、トリフロキシストロビン、エタボキサム、イプロバリカルブ、トリフロキシストロビン、フェンヘキサミド、オキスポコナゾールフマル酸塩、シアゾファミド、フェナミドン、ゾキサミド、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、シフルフェナミド、ボスカリド；
穀類除草剤：イソプロツロン、ブロモキシニル、ロキシニル、フェノキシ類、クロルスルフロン、クロジナホップ、ジクロホップ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルオロキシピル、メトスルフロン、トリアスルフロン、フルカルバゾン、ヨードスルフロン、プロポキシカルバゾン、ピコリン−アフェン、メソスルフロン、ベフルブタミド、ピノキサデン、アミドスルフロン、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロン、フルピルスルフロン、スルホスルフロン、ピラスルホトール、ピロクススラム、フルフェナセット、トラルコキシジム、ピロキサスルホン；穀類殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、シプロジニル、フェンプロピモルフ、エポキシコナゾール、クレソキシム−メチル、キノキシフェン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、シメコナゾール、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストロビン、プロチオコナゾール、フルオキサストロビン；穀類殺虫剤：ジメトアート、ランブダ−シハロトリン、デルタメトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、クロルフィリホス、メタミドホス、オキシデメソンメチル、ピリミカルブ、メチオカルブ；
メイズ除草剤：アトラジン、アラクロル、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、Ｓ−ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、Ｓ−メトラクロル、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン；メイズ殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ランブダ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、トリフルモロン、テフルトリン、テブピリム−ホス、エチプロール、シアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト；メイズ殺真菌剤：フェニトロパン、チラム、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；
イネ除草剤：ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シアロ−フォプ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメフォン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメフォン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノクスラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；イネ殺虫剤：ダイアジノン、フェニトロチオン、フェノブカルブ、モノクロトホス、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、カルタップ、メタミドホス、エトフェンプロックス、トリアゾホス、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ；イネ殺真菌剤：チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド、エジフェンホス、フェリムゾン、イプロベンホス、イソプロチオラン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、ジクロシメット、フェノキサニル、シメコナゾール、チアジニル；
ワタ除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバック−ナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ランブダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、γシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール、プロフェノホス、トリアゾホス、エンドスルファン；ワタ殺真菌剤：エトリジアゾール、メタラキシル、キントゼン；
ダイズ除草剤：アラクロル、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモクス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ殺虫剤：ランブダ−シハロトリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、γおよびランブダシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β−シフルトリン；ダイズ殺真菌剤：アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール；
テンサイ除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメサート、フェンメジファム、トリアラート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ／ランブダシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、シアキシピル、フィプロニル、カルボフラン；
キャノーラ除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロル、トリフルラリン エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；キャノーラ殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル、イプロジオン、プロクロラズ、ビンクロゾリン；キャノーラ殺虫剤：カルボフランオルガノホスフェート、ピレスロイド、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネト−フラン、β−シフルトリン、γおよびランブダシハロトリン、τ−フルバレリエート、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン。
殺虫剤および本開示の微生物を含む殺虫組成物
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える殺虫剤と組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、殺虫組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して適用することができる。殺虫剤としては、炭酸アンモニウム、ケイ酸カリウム水溶液、ホウ酸、硫酸銅、元素硫黄、石灰硫黄合剤、スクロースオクタノアートエステル、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２、２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、アバメクチン、ノテノン、フェナザキン、フェンピロキシメート、ピリダベン、ピリメディフェン、テブフェンピラド、トルフェンピラド、アセフェート、エマメクチン安息香酸塩、レピメクチン、ミルベメクチン、ヒドロプレン（ｈｄｒｏｐｒｅｎｅ）、キノプレン、メトプレン、フェノキシカルブ、ピリプロキシフェン、臭化アルキル（ｍｅｔｈｒｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ）および他のハロゲン化アルキル、フルフリルフルオリド、クロロピクリン、ホウ砂、八ホウ酸二ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、メタホウ酸ナトリウム、吐酒石、ダゾメット、メタム、ピメトロジン、ピリフルキナゾン、フロフェンテジン、ジフロビダジン、ヘキシチアゾクス、ビフェナゼート、チアメトキサム、イミダクロプリド、フェンピロキシメート、アザジラクチン、ペルメトリン、エスフェンバレラート、アセタミプリド、ビフェントリン、インドキサカルブ、アザジラクチン、ピレトリン、イミダクロプリド、β−シフルトリン、スルホテップ、テブピリムホス、テメホス、テルブホス、テトラクロロビンホス、チオメトン、トリアゾホス、アラニカルブ、アルジカルブ、ベンジオカルブ、ベンフルラカルブ、ブトカルボキシム、ブトキシカルボキシム、カルバリル、カルボフラン、カルボスルファン、エチオフェンカルブ、フェノブカルブ、ホルメタナート、フラチオカルブ、イソプロカルブ、メチオカルブ、メチミル、メトルカルブ、オキサミル、プリミカルブ、プロポクスル、チオジカルブ、チオファノックス、トリアザマート、トリメタカルブ、ＸＭＣ、キシリルカルブ、アセフェート、アザメチホス、アジンホス−エチル、アジンホス−メチル、カズサホス、クロロエトキシフォックス、トリクロルホン、バミドチオン、クロルダン、エンドスルファン、エチプロール、フィプロニル、アクリナトリン、アレトリン、ビフェントリン、ビオアレトリン、ビオアレテリン Ｘ−シクロペンテニル、ビオレスメトリン、シクロトリン、シフルトリン、シハロトリン、シペルメトリン、シフェノトリン［（１Ｒ）−ｔｒａｎｓ−異性体］、デルタメトリン、エンペントリン［（ＥＺ）−（１Ｒ）−異性体］、エスフェンバレラート、エトフェンプロックス、フェンプロパトリン、フェンバレラート、フルシトリナート、フルメトリン、ハルフェンプロックス、カダトリン、フェノトリン［（１Ｒ）−ｔｒａｎｓ−異性体］ プラレトリン、ピレトリン（除虫菊）、レスメトリン、シラフルオフェン、テフルトリン、テトラメトリン、テトラメトリン［（１Ｒ）−異性体］、トラロメトリン、トランスフルトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、β−シペルメトリン、ｄ−ｃｉｓ−ｔｒａｎｓアレトリン、ｄ−ｔｒａｎｓアレトリン、γ−シハロトリン、λ−シハロトリン、τ−フルバリナート、θ−シペルメトリン、ζ−シペルメトリン、メトキシクロル、ニコチン、スルホキサフロール、アセタミプリド、クロチアニジン、ジノテフラン、イミダクロプリド、ニテンピラム、チアクロプリド、チアメトキサン、テブプリムホス、β−シフルトリン、クロチアニジン、フロニカミド、ヒドラメチルノン、アミトラズ、フルベンジアミド、ブロラントラニプロール、ランブダシハロトリン、スピノサド、γシハロトリン、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ、トウガラシオレオレジン抽出物、ニンニク油、カルバリル、クロルピリホス、スルホキサフロール、ランブダシハロトリン、クロルフェンビンホス、クロルメホス、クロルピリホス、クロルピリホス−メチル、クマホス、シアノホス、デメトン−Ｓ−メチル、ダイアジノン、ジクロルボス／ＤＤＶＰ、ジクロトホス、ジメトアート、ジメチルビンホス、ジスルホトン、ＥＰＮ、エチオン、エトプロホス、ファムフル、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、ホスチアゼート、ヘプテノホス、イミシアホス、イソフェンホス、イソプロピルＯ−（メトキシアミノチオ−ホスホリル）サリチラート、イソキサチオン、マラチオン、メカルバム、メタミドホス、メチダチオン、メビンホス、モノクロトホス、ナレド、オメトアート、オキシデメトン−メチル、パラチオン、パラチオン−メチル、フェントエート、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ホキシム、ピリミホス−メチル、プロフェノホス、プロペタムホス、プロチオホス、ピラクロホス、ピリダフェンチオン、キナルホスフルアクリピリム、テブフェノジド、クロルアントラニリプロール、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ、テルブホス、鉱油、フェンプロパトリン、メタルデヒド、デルタメトリン、ダイアジノン、ジメトアート、ジフルベンズロン、ピリプロキシフェン、ローズマリー油（ｒｅｏｓｅｍａｒｙ ｏｉｌ）、ペパーミント油、グラニオール、アザジラクチン、ピペロニルブトキシド、シアントラニリプロール、αシペルメトリン、テフルトリン、ピメトロジン、マラチオン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ジコホール、ブロモプロピラート、ベンゾキシマート、アザジラクチン、フロニカミド、ダイズ油、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ菌株ＰＲＡＡ４−１、ζシペルメトリン、ホスメット、メトキシフェノジド、パラフィン系オイル、スピロテトラマト、メトミル、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ菌株Ｆ５２、エトプロップ、テトラジホン、プロパルギット、フェンブタチンオキシド、アゾシクロチン、シヘキサチン、ジアフェンチウロン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、エトキサゾール、フルピラジフロン、アザジラクチン、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ、シフルメトフェン、アザジラクチン、キノメチオナート（ｃｈｉｎｏｍｅｔｈｉｏｎａｔ）、アセフェート、Ｉｓａｒｉａ ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅａ Ａｐｏｐｋａ菌株９７、テトラホウ酸ナトリウム十水和物、エマメクチン安息香酸塩、クリオライト、スピネトラム、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ抽出物、ノバルロン、ジノテフラン、カルバリル、アセキノシル、フルピラジフロン、リン酸鉄、カオリン、ブプロフェジン、シロマジン、クロマフェノジド、ハロフェノジド、メトキシフェノジド、テブフェノジド、ビストリフルロン、クロルフルアズロン、ジフルベンズロン、フルシクロクスロン、フルフェノクスロン、ヘキサフルムロン、ルフェヌロン、ノカルロン、ノビフルムロン、テフルベンズロン、トリフルムロン、ベンスルタップ、カルタップ塩酸塩、チオシクラム、チオスルタップ−ナトリウム、ＤＮＯＣ、クロルフェナピル、スルフラミド、ホレート、トルフェンピラド、スルホキサフロール、ニーム油、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ菌株ＳＡ−１０、シロマジン、熱殺菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．、シアントラニリプロール、シエノピラフェン、シフルメトフェン、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化カルシウム、リン化アルミニウム、リン化カルシウム、ホスフィン、リン化亜鉛、スピロジクロフェン（ｓｐｒｉｏｄｉｃｌｏｆｅｎ）、スピロメシフェン、スピロテトラマト、メタフルミゾン、フルベンジアミド、ピフルブミド、オキサミル、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ａｉｚａｗａｉ、エトキサゾール、およびエスフェンバレラートが挙げられる。
表９．種々の作用様式に関連し、本開示の微生物と組み合わせることができる殺虫剤の例
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 表１０．本開示の微生物と組み合わせることができる農薬リストの例
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殺虫剤としては、協力剤または活性化因子であって、それら自体は有毒でも殺虫性もないと見なされるが、殺虫剤と協力するか、殺虫剤の活性を増強するために殺虫剤と共に使用される材料である協力剤または活性化因子も挙げられる。協力剤（ｓｙｎｇｅｒｇｉｓｔ）または活性化因子としては、ピペロニルブトキシドが挙げられる。
バイオラショナル農薬
殺虫剤は、バイオラショナルであり得るか、バイオ農薬または生物農薬としても公知であり得る。バイオラショナルは、特定の標的有害生物（複数可）（例えば、昆虫、雑草、植物病（線虫が含まれる）、および脊椎動物の有害生物）に有害または致死的に作用し、固有の作用様式を有し、ヒト、栽培植物、および家畜に無害であり、野生動物および環境に対する有害作用がほとんど無いか全く無い天然起源の任意の物質（または天然起源の物質に類似した人工物質）を指す。
バイオラショナル殺虫剤（またはバイオ農薬もしくは生物農薬）を、以下のようにグループ分けすることができる：（１）生化学物質（ホルモン、酵素、フェロモン、および天然作用因子（昆虫および植物の成長調節物質など））、（２）微生物（ウイルス、細菌、真菌、原生動物、および線虫）、または（３）植物導入保護剤（ＰＩＰ）−主に、トランスジェニック植物（例えば、Ｂｔトウモロコシ）。
バイオ農薬、すなわち、生物農薬としては、広義には、生きている微小生物または天然物から製造され、植物有害生物の防除のために販売されている薬剤が含まれ得る。バイオ農薬は、以下であり得る：微小生物、生化学物質、および信号化学物質。バイオ農薬としては、ペプチド、タンパク質、および核酸（二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、およびヘアピンＤＮＡまたはヘアピンＲＮＡなど）も挙げられ得る。
細菌、真菌、卵菌、ウイルス、および原生動物は全て、害虫の生物学的防除のために使用される。最も広く使用されている微生物バイオ農薬は、昆虫病原性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）であり、これは、細菌胞子の形成中に、感受性を示す昆虫によって消費された場合に腸細胞を溶解することができるタンパク質結晶（Ｂｔδ−内毒素）を産生する。微生物Ｂｔバイオ農薬は、発酵タンク中で大量生産され、噴霧可能な製品として製剤化される細菌胞子およびδ−内毒素結晶からなる。Ｂｔは、脊椎動物に有害ではなく、ヒトに安全であり、生物および環境に有益である。したがって、Ｂｔスプレーは、選択性レベルおよび安全性レベルが高いことが望ましいと見なされる場合や、合成化学殺虫剤耐性に問題がある場合の、果実作物および野菜作物に対する有害生物の管理のための成長中の戦略である。また、Ｂｔスプレーは、メイズ、ダイズ、およびワタなどの商品作物に使用されているが、植物の遺伝子改変の出現で、農業従事者は、Ｂｔトランスジェニック作物品種の生産を増加させている。
他の微生物殺虫剤としては、昆虫病原性バキュロウイルスに基づいた製品が挙げられる。節足動物に病原性を示すバキュロウイルスは、ウイルスファミリーに属し、ヌクレオカプシドにパッケージングされた巨大な共有結合閉環状の二本鎖ＤＮＡゲノムを保有する。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目、およびＤｉｐｔｅｒａ目の昆虫から７００を超えるバキュロウイルスが同定されている。バキュロウイルスは、通常、その宿主昆虫に対する特異性が高いので、環境、ヒト、他の植物、および有用生物に対して安全である。異なる害虫を防除するために、世界で５０を超えるバキュロウイルス製品が使用されている。米国および欧州では、Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ顆粒ウイルス（ＣｐＧＶ）は、リンゴ用のコドリンガに対する大量放飼用バイオ農薬として使用されている。米国における最大のリンゴ生産者であるワシントン州では、１３％のリンゴ作物に対してＣｐＧＶを使用している。ブラジルでは、ダイズ毛虫Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓの核多角体ウイルスを、１９９０年代中頃に４００万ｈａ（およそ３５％）までのダイズ作物に使用していた。Ｇｅｍｓｔａｒ（登録商標）（Ｃｅｒｔｉｓ ＵＳＡ）などのウイルスは、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ種およびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種の幼虫の防除に利用可能である。
少なくとも１７０種の昆虫病原性真菌に基づいた異なるバイオ農薬製品が、温室作物、果実、および露地野菜、ならびに商品作物の少なくとも５つの昆虫目およびダニ目用に開発されている。大部分の製品は、子嚢菌類Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａまたはＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅに基づく。また、Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅは、アフリカおよびオーストラリアにおけるイナゴおよびバッタ有害生物の防除のために開発されており、イナゴ管理用として国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）で推奨されている。
合衆国で登録されているいくつかの微生物農薬は、Ｋａｂａｌｕｋら．２０１０の表１６（Ｋａｂａｌｕｋ，Ｊ．Ｔ．ら．（ｅｄ．）．２０１０．Ｔｈｅ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｊｕｒｉｓｄｉｃｔｉｏｎｓ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．ＩＯＢＣ Ｇｌｏｂａｌ．９９ｐｐ．）に列挙されており、選択国で登録された微生物農薬は、Ｈｏｅｓｃｈｌｅ−Ｚｅｌｅｄｏｎら．２０１３の付録４（Ｈｏｅｓｃｈｌｅ−Ｚｅｌｅｄｏｎ，Ｉ．，Ｐ．Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｋｕｍａｒ．（２０１３）．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ．ＳＰ−ＩＰＭ Ｓｅｃｒｅｔａｒｉａｔ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＩＴＡ），Ｉｂａｄａｎ，Ｎｉｇｅｒｉａ．４３ ｐｐ．）に列挙されており、これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
植物は、草食動物からの摂食を阻止する多種多様な二次代謝産物を産生する。これらの二次代謝産物のいくつかを、バイオ農薬として使用することができる。バイオ農薬としては、例えば、ピレトリンが挙げられ、これは、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉａｅｆｏｌｉｕｍによって産生される即効性の殺虫化合物である。ピレトリンは哺乳動物への毒性が低いが、散布後急速に分解される。この持続性の短さから、合成ピレトリン（ピレスロイド）の開発が急がれた。最も広く使用されている植物性化合物はニーム油であり、これは、Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａの種子から抽出した殺虫化合物質である。土壌放線菌によって合成された二次代謝産物に基づいた２つの有効性の高い農薬が利用できるが、これらは、規制当局によってあたかも合成化学農薬であるかのような評価を受けている。スピノサドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ由来の２つのマクロライド化合物の混合物である。これは哺乳動物に対する毒性が非常に低く、残渣は圃場で迅速に分解される。農業従事者および栽培者は、１９９７年のその導入後から広く使用してきたが、ミカンキイロアザミウマなどのいくつかの重要な有害生物で既に耐性が生じている。アバメクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓによって産生される大環状ラクトン化合物である。これは、ある範囲の有害生物種に対して有効であるが、これもまた、例えば、ハダニ科のダニで耐性が生じている。
いくつかの生物由来のペプチドおよびタンパク質が、殺有害生物性を有することが見出されている。おそらく最も突出しているのは、クモ毒液由来のペプチドである（Ｋｉｎｇ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｃ．（２０１３）Ｓｐｉｄｅｒ−ｖｅｎｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．５８：４７５−４９６）。クモ毒液ペプチドにおけるジスルフィド結合の固有の配置により、プロテアーゼ耐性が極めて高い。結果として、これらのペプチドは、昆虫の腸内および血リンパ内での安定性が高く、これらの多くは経口で有効である。このペプチドは、昆虫神経系における広範な受容体およびイオンチャネルを標的にする。殺虫ペプチドの他の例としては、以下が挙げられる：電位開口型Ｎａ＋チャネルに作用するイソギンチャク毒液（Ｂｏｓｍａｎｓ，Ｆ．ａｎｄ Ｔｙｔｇａｔ，Ｊ．（２００７）Ｓｅａ ａｎｅｍｏｎｅ ｖｅｎｏｍ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ Ｎａ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｎ．４９（４）：５５０−５６０）；いくつかの害虫（カ、いくつかのアブラムシ、および穀類のゾウムシなど）に致死作用を有するマメ科植物の種子由来のＰＡ１ｂ（エンドウマメアルブミン１、サブユニットｂ）ペプチド（Ｅｙｒａｕｄ，Ｖ．ら．（２０１３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｙｓｔｉｎｅ Ｋｎｏｔ Ｂｉｏｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ ＰＡ１ｂ（Ｐｅａ Ａｌｂｕｍｉｎ １ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｂ）．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（１２）：ｅ８１６１９）；および受容昆虫内のＣａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）ウレアーゼの酵素加水分解によって生成される内部１０ｋＤａペプチド（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｈ．Ｓ．，ら（２０１４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｊａｂｕｒｅｔｏｘ，ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｊａｃｋ ｂｅａｎ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）ｕｒｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８４０：９３５−９４４）。市販のペプチド殺虫剤の例としては、Ｓｐｅａｒ（商標）−Ｔ（温室内での野菜および観葉植物におけるアザミウマの処理用）、Ｓｐｅａｒ（商標）−Ｐ（コロラドハムシの防除用）、およびＳｐｅａｒ（商標）−Ｃ（鱗翅目の有害生物からの作物の防御用）（Ｖｅｓｔａｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）が含まれる。副芽胞結晶毒素（ＰＣ）と呼ばれるＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｃｕｓ由来の新規の殺虫タンパク質は、カイコおよびＣｒｙ１Ａｃ耐性Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ菌株に対して経口病原性活性および致死性を示す（Ｌｉｎ，Ｐ．ら（２０１５）ＰＣ，ａ ｎｏｖｅｌ ｏｒａｌ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｃｕｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｏｓｔ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｖｉａ ＡＰＮ ａｎｄ ＢｔＲ−１７５．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１１１０１）。
信号化学物質は、同種または異種の個体の挙動を変化させるある生物によって産生される化学信号である。作物防御のために最も広く使用されている信号化学物質は、昆虫性フェロモンであり、これらのうちのいくつかは、現在、合成することができ、大量捕獲、誘引殺虫システム、および交尾妨害によるモニタリングまたは有害生物防除のために使用されている。世界的に、交尾妨害は、６６０，０００ｈａで利用されており、果樹園の作物で特に有用である。
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック殺虫形質」は、１またはそれを超える有害生物に有害な核酸またはポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている植物が示す形質を指す。１つの実施形態では、本開示の植物は、１またはそれを超える本開示の有害生物のうちのいずれかからの付着および／または寄生に耐性を示す。１つの実施形態では、この形質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の植物性殺虫タンパク質（ＶＩＰ）、植物由来のレクチンおよびプロテイナーゼの阻害剤、テルペノイド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．由来のコレステロールオキシダーゼ、昆虫キチナーゼおよび真菌キチン分解酵素、細菌殺虫タンパク質および初期認識耐性遺伝子の発現を含む。別の実施形態では、この形質は、有害生物に有毒なＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓタンパク質の発現を含む。１つの実施形態では、Ｂｔタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質（結晶タンパク質）である。Ｂｔ作物としては、Ｂｔトウモロコシ、Ｂｔワタ、およびＢｔダイズが挙げられる。Ｂｔ毒素は、Ｃｒｙファミリーに由来し得（例えば、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅら，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１２を参照のこと）、これらは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、およびＤｉｐｔｅｒａに対して特に有効である。
Ｂｔ Ｃｒｙ毒素およびＣｙｔ毒素は、細菌の宿主の細胞膜に挿入するか、細胞膜を横切って移動するために高次構造の変化を受ける水溶性タンパク質として分泌される膜孔形成毒素（ＰＦＴ）として公知の細菌毒素クラスに属する。ＰＦＴには、以下の２つの主な群が存在する：（ｉ）α−ヘリックス領域が膜貫通孔を形成するα−ヘリックス毒素、および（ｉｉ）各単量体由来のβシートヘアピンから構成されるβ−バレルの形成によって膜に挿入されるβ−バレル毒素。Ｐａｒｋｅｒ ＭＷ，Ｆｅｉｌ ＳＣ，“Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ；８８（１）：９１−１４２を参照のこと。ＰＦＴの第１のクラスとしては、コリシン、外毒素Ａ、ジフテリア毒素などの毒素、また、Ｃｒｙ３ドメイン毒素が挙げられる。他方では、アエロリジン、α−ヘモリシン、炭疽防御抗原、パーフリンゴリシンＯとしてのコレステロール依存性毒素、およびＣｙｔ毒素は、β−バレル毒素に属する（同上）。一般に、ＰＦＴ産生細菌はその毒素を分泌し、これらの毒素は、宿主細胞表面に存在する特定の受容体と相互作用する。ほとんどの場合、ＰＦＴは、受容体結合後に宿主プロテアーゼによって活性化され、挿入構成要素であるオリゴマー構造の形成が誘導される。最後に、ほとんどの場合、タンパク質のモルテン・グロビュール状態を誘導するｐＨの低下によって膜挿入が誘発される（同上）。
Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質を産生するトランスジェニック作物が開発されたことで、化学殺虫剤の代わりに環境に優しい代替物が用いられている。トランスジェニック植物では、Ｃｒｙ毒素が継続的に産生され、この毒素によって分解ならびに昆虫が咀嚼や穿孔に至ることから防御される。植物におけるＣｒｙタンパク質産生は、植物固有のコドン使用頻度を用いたｃｒｙ遺伝子の操作、推定スプライシングシグナル配列の除去およびプロトキシンのカルボキシ末端領域の欠失によって改良されている。Ｓｃｈｕｌｅｒ ＴＨ，ら，“Ｉｎｓｅｃｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；１６：１６８−１７５を参照のこと。昆虫耐性作物を使用することで、これらのトランスジェニック作物が植栽される耕作地の化学農薬の使用が著しく減少した。Ｑａｉｍ Ｍ，Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ Ｄ，“Ｙｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｒｏｐｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３ Ｆｅｂ ７；２９９（５６０８）：９００−２を参照のこと。
公知のＣｒｙタンパク質としては、以下が挙げられる：限定されないが、以下が挙げられるδ−内毒素：δ−内毒素遺伝子のＣｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ４、Ｃｒｙ５、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１０、Ｃｒｙ１１、Ｃｒｙ１２、Ｃｒｙ１３、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ１６、Ｃｒｙ１７、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ１９、Ｃｒｙ２０、Ｃｒｙ２１、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ２４、Ｃｒｙ２５、Ｃｒｙ２６、Ｃｒｙ２７、Ｃｒｙ２８、Ｃｒｙ２９、Ｃｒｙ３０、Ｃｒｙ３１、Ｃｒｙ３２、Ｃｒｙ３３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ３８、Ｃｒｙ３９、Ｃｒｙ４０、Ｃｒｙ４１、Ｃｒｙ４２、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ４４、Ｃｒｙ４５、Ｃｒｙ４６、Ｃｒｙ４７、Ｃｒｙ４９、Ｃｒｙ５１、Ｃｒｙ５２、Ｃｒｙ５３、Ｃｒｙ５４、Ｃｒｙ５５、Ｃｒｙ５６、Ｃｒｙ５７、Ｃｒｙ５８、Ｃｒｙ５９．Ｃｒｙ６０、Ｃｒｙ６１、Ｃｒｙ６２、Ｃｒｙ６３、Ｃｒｙ６４、Ｃｒｙ６５、Ｃｒｙ６６、Ｃｒｙ６７、Ｃｒｙ６８、Ｃｒｙ６９、Ｃｒｙ７０、およびＣｒｙ７１クラスならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの細胞溶解性ｃｙｔｌおよびｃｙｔ２遺伝子。
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫タンパク質のこれらのクラスのメンバーとしては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｃｒｙ１Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５３）；Ｃｒｙ１Ａａ２（アクセッション番号アクセッション番号ＡＡＡ２２５５２）；Ｃｒｙ１Ａａ３（アクセッション番号ＢＡＡ００２５７）；Ｃｒｙ１Ａａ４（アクセッション番号ＣＡＡ３１８８６）；Ｃｒｙ１Ａａ５（アクセッション番号ＢＡＡ０４４６８）；Ｃｒｙ１Ａａ６（アクセッション番号ＡＡＡ８６２６５）；Ｃｒｙ１Ａａ７（アクセッション番号ＡＡＤ４６１３９）；Ｃｒｙ１Ａａ８（アクセッション番号１２６１４９）；Ｃｒｙ１Ａａ９（アクセッション番号ＢＡＡ７７２１３）；Ｃｒｙ１Ａａ１０（アクセッション番号ＡＡＤ５５３８２）；Ｃｒｙ１Ａａ１１（アクセッション番号ＣＡＡ７０８５６）；Ｃｒｙ１Ａａ１２（アクセッション番号ＡＡＰ８０１４６）；Ｃｒｙ１Ａａ１３（アクセッション番号ＡＡＭ４４３０５）；Ｃｒｙ１Ａａ１４（アクセッション番号ＡＡＰ４０６３９）；Ｃｒｙ１Ａａ１５（アクセッション番号ＡＡＹ６６９９３）；Ｃｒｙ１Ａａ１６（アクセッション番号ＨＱ４３９７７６）；Ｃｒｙ１Ａａ１７（アクセッション番号ＨＱ４３９７８８）；Ｃｒｙ１Ａａ１８（アクセッション番号ＨＱ４３９７９０）；Ｃｒｙ１Ａａ１９（アクセッション番号ＨＱ６８５１２１）；Ｃｒｙ１Ａａ２０（アクセッション番号ＪＦ３４０１５６）；Ｃｒｙ１Ａａ２１（アクセッション番号ＪＮ６５１４９６）；Ｃｒｙ１Ａａ２２（アクセッション番号ＫＣ１５８２２３）；Ｃｒｙ１Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２６１３）；Ｃｒｙ１Ａｂ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２５６１）；Ｃｒｙ１Ａｂ４（アクセッション番号ＢＡＡ０００７１）；Ｃｒｙ１Ａｂ５（アクセッション番号ＣＡＡ２８４０５）；Ｃｒｙ１Ａｂ６（アクセッション番号ＡＡＡ２２４２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ７（アクセッション番号ＣＡＡ３１６２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ８（アクセッション番号ＡＡＡ２２５５１）；Ｃｒｙ１Ａｂ９（アクセッション番号ＣＡＡ３８７０１）；Ｃｒｙ１Ａｂ１０（アクセッション番号Ａ２９１２５）；Ｃｒｙ１Ａｂ１１（アクセッション番号Ｉ１２４１９）；Ｃｒｙ１Ａｂ１２（アクセッション番号ＡＡＣ６４００３）；Ｃｒｙ１Ａｂ１３（アクセッション番号ＡＡＮ７６４９４）；Ｃｒｙ１Ａｂ１４（アクセッション番号ＡＡＧ１６８７７）；Ｃｒｙ１Ａｂ１５（アクセッション番号ＡＡ０１３３０２）；Ｃｒｙ１Ａｂ１６（アクセッション番号ＡＡＫ５５５４６）；Ｃｒｙ１Ａｂ１７（アクセッション番号ＡＡＴ４６４１５）；Ｃｒｙ１Ａｂ１８（アクセッション番号ＡＡＱ８８２５９）；Ｃｒｙ１Ａｂ１９（アクセッション番号ＡＡＷ３１７６１）；Ｃｒｙ１Ａｂ２０（アクセッション番号ＡＢＢ７２４６０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２１（アクセッション番号ＡＢＳ１８３８４）；Ｃｒｙ１Ａｂ２２（アクセッション番号ＡＢＷ８７３２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２３（アクセッション番号ＨＱ４３９７７７）；Ｃｒｙ１Ａｂ２４（アクセッション番号ＨＱ４３９７７８）；Ｃｒｙ１Ａｂ２５（アクセッション番号ＨＱ６８５１２２）；Ｃｒｙ１Ａｂ２６（アクセッション番号ＨＱ８４７７２９）；Ｃｒｙ１Ａｂ２７（アクセッション番号ＪＮ１３５２４９）；Ｃｒｙ１Ａｂ２８（アクセッション番号ＪＮ１３５２５０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２９（アクセッション番号ＪＮ１３５２５１）；Ｃｒｙ１Ａｂ３０（アクセッション番号ＪＮ１３５２５２）；Ｃｒｙ１Ａｂ３１（アクセッション番号ＪＮ１３５２５３）；Ｃｒｙ１Ａｂ３２（アクセッション番号ＪＮ１３５２５４）；Ｃｒｙ１Ａｂ３３（アクセッション番号ＡＡＳ９３７９８）；Ｃｒｙ１Ａｂ３４（アクセッション番号ＫＣ１５６６６８）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３６）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３７）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３８）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＢＧ８８８５８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３１）；Ｃｒｙ１Ａｃ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３８）；Ｃｒｙ１Ａｃ３（アクセッション番号ＣＡＡ３８０９８）；Ｃｒｙ１Ａｃ４（アクセッション番号ＡＡＡ７３０７７）；Ｃｒｙ１Ａｃ５（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３９）；Ｃｒｙ１Ａｃ６（アクセッション番号ＡＡＡ８６２６６）；Ｃｒｙ１Ａｃ７（アクセッション番号ＡＡＢ４６９８９）；Ｃｒｙ１Ａｃ８（アクセッション番号ＡＡＣ４４８４１）；Ｃｒｙ１Ａｃ９（アクセッション番号ＡＡＢ４９７６８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１０（アクセッション番号ＣＡＡ０５５０５）；Ｃｒｙ１Ａｃ１１（アクセッション番号ＣＡＡ１０２７０）；Ｃｒｙ１Ａｃ１２（アクセッション番号Ｉ１２４１８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１３（アクセッション番号ＡＡＤ３８７０１）；Ｃｒｙ１Ａｃ１４（アクセッション番号ＡＡＱ０６６０７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１５（アクセッション番号ＡＡＮ０７７８８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１６（アクセッション番号ＡＡＵ８７０３７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１７（アクセッション番号ＡＡＸ１８７０４）；Ｃｒｙ１Ａｃ１８（アクセッション番号ＡＡＹ８８３４７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１９（アクセッション番号ＡＢＤ３７０５３）；Ｃｒｙ１Ａｃ２０（アクセッション番号ＡＢＢ８９０４６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２１（アクセッション番号ＡＡＹ６６９９２）；Ｃｒｙ１Ａｃ２２（アクセッション番号ＡＢＺ０１８３６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２３（アクセッション番号ＣＡＱ３０４３１）；Ｃｒｙ１Ａｃ２４（アクセッション番号ＡＢＬ０１５３５）；Ｃｒｙ１Ａｃ２５（アクセッション番号ＦＪ５１３３２４）；Ｃｒｙ１Ａｃ２６（アクセッション番号ＦＪ６１７４４６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２７（アクセッション番号ＦＪ６１７４４７）；Ｃｒｙ１Ａｃ２８（アクセッション番号ＡＣＭ９０３１９）；Ｃｒｙ１Ａｃ２９（アクセッション番号ＤＱ４３８９４１）；Ｃｒｙ１Ａｃ３０（アクセッション番号ＧＱ２２７５０７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３１（アクセッション番号ＧＵ４４６６７４）；Ｃｒｙ１Ａｃ３２（アクセッション番号ＨＭ０６１０８１）；Ｃｒｙ１Ａｃ３３（アクセッション番号ＧＱ８６６９１３）；Ｃｒｙ１Ａｃ３４（アクセッション番号ＨＱ２３０３６４）；Ｃｒｙ１Ａｃ３５（アクセッション番号ＪＦ３４０１５７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３６（アクセッション番号ＪＮ３８７１３７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３７（アクセッション番号ＪＱ３１７６８５）；Ｃｒｙ１Ａｄ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４０）；Ｃｒｙ１Ａｄ２（アクセッション番号ＣＡＡ０１８８０）；Ｃｒｙ１Ａｅ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２４１０）；Ｃｒｙ１Ａｆ１（アクセッション番号ＡＡＢ８２７４９）；Ｃｒｙ１Ａｇ１（アクセッション番号ＡＡＤ４６１３７）；Ｃｒｙ１Ａｈ１（アクセッション番号ＡＡＱ１４３２６）；Ｃｒｙ１Ａｈ２（アクセッション番号ＡＢＢ７６６６４）；Ｃｒｙ１Ａｈ３（アクセッション番号ＨＱ４３９７７９）；Ｃｒｙ１Ａｉ１（アクセッション番号ＡＡ０３９７１９）；Ｃｒｙ１Ａｉ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８０）；Ｃｒｙ１Ａ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３９）；Ｃｒｙ１Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ２９８９８）；Ｃｒｙ１Ｂａ２（アクセッション番号ＣＡＡ６５００３）；Ｃｒｙ１Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＫ６３２５１）；Ｃｒｙ１Ｂａ４（アクセッション番号ＡＡＫ５１０８４）；Ｃｒｙ１Ｂａ５（アクセッション番号ＡＢ０２０８９４）；Ｃｒｙ１Ｂａ６（アクセッション番号ＡＢＬ６０９２１）；Ｃｒｙ１Ｂａ７（アクセッション番号ＨＱ４３９７８１）；Ｃｒｙ１Ｂｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４４）；Ｃｒｙ１Ｂｂ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８２）；Ｃｒｙ１Ｂｃ１（アクセッション番号ＣＡＡ８６５６８）；Ｃｒｙ１Ｂｄ１（アクセッション番号ＡＡＤ１０２９２）；Ｃｒｙ１Ｂｄ２（アクセッション番号ＡＡＭ９３４９６）；Ｃｒｙ１Ｂｅ１（アクセッション番号ＡＡＣ３２８５０）；Ｃｒｙ１Ｂｅ２（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８７）；Ｃｒｙ１Ｂｅ３（アクセッション番号ＡＣＶ９６７２０）；Ｃｒｙ１Ｂｅ４（アクセッション番号ＨＭ０７００２６）；Ｃｒｙ１Ｂｆ１（アクセッション番号ＣＡＣ５０７７８）；Ｃｒｙ１Ｂｆ２（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８０）；Ｃｒｙ１Ｂｇ１（アクセッション番号ＡＡ０３９７２０）；Ｃｒｙ１Ｂｈ１（アクセッション番号ＨＱ５８９３３１）；Ｃｒｙ１Ｂｉ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７００）；Ｃｒｙ１Ｃａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３０３９６）；Ｃｒｙ１Ｃａ２（アクセッション番号ＣＡＡ３１９５１）；Ｃｒｙ１Ｃａ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４３）；Ｃｒｙ１Ｃａ４（アクセッション番号ＣＡＡ０１８８６）；Ｃｒｙ１Ｃａ５（アクセッション番号ＣＡＡ６５４５７）；Ｃｒｙ１Ｃａ６［１］（アクセッション番号ＡＡＦ３７２２４）；Ｃｒｙ１Ｃａ７（アクセッション番号ＡＡＧ５０４３８）；Ｃｒｙ１Ｃａ８（アクセッション番号ＡＡＭ００２６４）；Ｃｒｙ１Ｃａ９（アクセッション番号ＡＡＬ７９３６２）；Ｃｒｙ１Ｃａ１０（アクセッション番号ＡＡＮ１６４６２）；Ｃｒｙ１Ｃａ１１（アクセッション番号ＡＡＸ５３０９４）；Ｃｒｙ１Ｃａ１２（アクセッション番号ＨＭ０７００２７）；Ｃｒｙ１Ｃａ１３（アクセッション番号ＨＱ４１２６２１）；Ｃｒｙ１Ｃａ１４（アクセッション番号ＪＮ６５１４９３）；Ｃｒｙ１Ｃｂ１（アクセッション番号Ｍ９７８８０）；Ｃｒｙ１Ｃｂ２（アクセッション番号ＡＡＧ３５４０９）；Ｃｒｙ１Ｃｂ３（アクセッション番号ＡＣＤ５０８９４）；Ｃｒｙ１Ｃｂ様（アクセッション番号ＡＡＸ６３９０１）；Ｃｒｙ１Ｄａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３８０９９）；Ｃｒｙ１Ｄａ２（アクセッション番号Ｉ７６４１５）；Ｃｒｙ１Ｄａ３（アクセッション番号ＨＱ４３９７８４）；Ｃｒｙ１Ｄｂ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３４）；Ｃｒｙ１Ｄｂ２（アクセッション番号ＡＡＫ４８９３７）；Ｃｒｙ１Ｄｃ１（アクセッション番号ＡＢＫ３５０７４）；Ｃｒｙ１Ｅａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３７９３３）；Ｃｒｙ１Ｅａ２（アクセッション番号ＣＡＡ３９６０９）；Ｃｒｙ１Ｅａ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４５）；Ｃｒｙ１Ｅａ４（アクセッション番号ＡＡＤ０４７３２）；Ｃｒｙ１Ｅａ５（アクセッション番号Ａ１５５３５）；Ｃｒｙ１Ｅａ６（アクセッション番号ＡＡＬ５０３３０）；Ｃｒｙ１Ｅａ７（アクセッション番号ＡＡＷ７２９３６）；Ｃｒｙ１Ｅａ８（アクセッション番号ＡＢＸ１１２５８）；Ｃｒｙ１Ｅａ９（アクセッション番号ＨＱ４３９７８５）；Ｃｒｙ１Ｅａ１０（アクセッション番号ＡＤＲ００３９８）；Ｃｒｙ１Ｅａ１１（アクセッション番号ＪＱ６５２４５６）；Ｃｒｙ１Ｅｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４６）；Ｃｒｙ１Ｆａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４８）；Ｃｒｙ１Ｆａ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４７）；Ｃｒｙ１Ｆａ３（アクセッション番号ＨＭ０７００２８）；Ｃｒｙ１Ｆａ４（アクセッション番号ＨＭ４３９６３８）；Ｃｒｙ１Ｆｂ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３５）；Ｃｒｙ１Ｆｂ２（アクセッション番号ＢＡＡ２５２９８）；Ｃｒｙ１Ｆｂ３（アクセッション番号ＡＡＦ２１７６７）；Ｃｒｙ１Ｆｂ４（アクセッション番号ＡＡＣ１０６４１）；Ｃｒｙ１Ｆｂ５（アクセッション番号ＡＡ０１３２９５）；Ｃｒｙ１Ｆｂ６（アクセッション番号ＡＣＤ５０８９２）；Ｃｒｙ１Ｆｂ７（アクセッション番号ＡＣＤ５０８９３）；Ｃｒｙ１Ｇａ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３３）；Ｃｒｙ１Ｇａ２（アクセッション番号ＣＡＡ７０５０６）；Ｃｒｙ１Ｇｂ１（アクセッション番号ＡＡＤ１０２９１）；Ｃｒｙ１Ｇｂ２（アクセッション番号ＡＡ０１３７５６）；Ｃｒｙ１Ｇｃ１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８１）；Ｃｒｙ１Ｈａ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３６）；Ｃｒｙ１Ｈｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ７９６９４）；Ｃｒｙ１Ｈｂ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８６）；Ｃｒｙ１Ｈ様（アクセッション番号ＡＡＦ０１２１３）


；Ｃｒｙ１Ｉａ１（アクセッション番号ＣＡＡ４４６３３）；Ｃｒｙ１Ｉａ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５４）；Ｃｒｙ１Ｉａ３（アクセッション番号ＡＡＣ３６９９９）；Ｃｒｙ１Ｉａ４（アクセッション番号ＡＡＢ００９５８）；Ｃｒｙ１Ｉａ５（アクセッション番号ＣＡＡ７０１２４）；Ｃｒｙ１Ｉａ６（アクセッション番号ＡＡＣ２６９１０）；Ｃｒｙ１Ｉａ７（アクセッション番号ＡＡＭ７３５１６）；Ｃｒｙ１Ｉａ８（アクセッション番号ＡＡＫ６６７４２）；Ｃｒｙ１Ｉａ９（アクセッション番号ＡＡＱ０８６１６）；Ｃｒｙ１Ｉａ１０（アクセッション番号ＡＡＰ８６７８２）；Ｃｒｙ１Ｉａ１１（アクセッション番号ＣＡＣ８５９６４）；Ｃｒｙ１Ｉａ１２（アクセッション番号ＡＡＶ５３３９０）；Ｃｒｙ１Ｉａ１３（アクセッション番号ＡＢＦ８３２０２）；Ｃｒｙ１Ｉａ１４（アクセッション番号ＡＣＧ６３８７１）；Ｃｒｙ１Ｉａ１５（アクセッション番号ＦＪ６１７４４５）；Ｃｒｙ１Ｉａ１６（アクセッション番号ＦＪ６１７４４８）；Ｃｒｙ１Ｉａ１７（アクセッション番号ＧＵ９８９１９９）；Ｃｒｙ１Ｉａ１８（アクセッション番号ＡＤＫ２３８０１）；Ｃｒｙ１Ｉａ１９（アクセッション番号ＨＱ４３９７８７）；Ｃｒｙ１Ｉａ２０（アクセッション番号ＪＱ２２８４２６）；Ｃｒｙ１Ｉａ２１（アクセッション番号ＪＱ２２８４２４）；Ｃｒｙ１Ｉａ２２（アクセッション番号ＪＱ２２８４２７）；Ｃｒｙ１Ｉａ２３（アクセッション番号ＪＱ２２８４２８）；Ｃｒｙ１Ｉａ２４（アクセッション番号ＪＱ２２８４２９）；Ｃｒｙ１Ｉａ２５（アクセッション番号ＪＱ２２８４３０）；Ｃｒｙ１Ｉａ２６（アクセッション番号ＪＱ２２８４３１）；Ｃｒｙ１Ｉａ２７（アクセッション番号ＪＱ２２８４３２）；Ｃｒｙ１Ｉａ２８（アクセッション番号ＪＱ２２８４３３）；Ｃｒｙ１Ｉａ２９（アクセッション番号ＪＱ２２８４３４）；Ｃｒｙ１Ｉａ３０（アクセッション番号ＪＱ３１７６８６）；Ｃｒｙ１Ｉａ３１（アクセッション番号ＪＸ９４４０３８）；Ｃｒｙ１Ｉａ３２（アクセッション番号ＪＸ９４４０３９）；Ｃｒｙ１Ｉａ３３（アクセッション番号ＪＸ９４４０４０）；Ｃｒｙ１Ｉｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ８２１１４）；Ｃｒｙ１Ｉｂ２（アクセッション番号ＡＢＷ８８０１９）；Ｃｒｙ１Ｉｂ３（アクセッション番号ＡＣＤ７５５１５）；Ｃｒｙ１Ｉｂ４（アクセッション番号ＨＭ０５１２２７）；Ｃｒｙ１Ｉｂ５（アクセッション番号ＨＭ０７００２８）；Ｃｒｙ１Ｉｂ６（アクセッション番号ＡＤＫ３８５７９）；Ｃｒｙ１Ｉｂ７（アクセッション番号ＪＮ５７１７４０）；Ｃｒｙ１Ｉｂ８（アクセッション番号ＪＮ６７５７１４）；Ｃｒｙ１Ｉｂ９（アクセッション番号ＪＮ６７５７１５）；Ｃｒｙ１Ｉｂ１０（アクセッション番号ＪＮ６７５７１６）；Ｃｒｙ１Ｉｂ１１（アクセッション番号ＪＱ２２８４２３）；Ｃｒｙ１Ｉｃ１（アクセッション番号ＡＡＣ６２９３３）；Ｃｒｙ１Ｉｃ２（アクセッション番号ＡＡＥ７１６９１）；Ｃｒｙ１Ｉｄ１（アクセッション番号ＡＡＤ４４３６６）；Ｃｒｙ１Ｉｄ２（アクセッション番号ＪＱ２２８４２２）；Ｃｒｙ１Ｉｅ１（アクセッション番号ＡＡＧ４３５２６）；Ｃｒｙ１Ｉｅ２（アクセッション番号ＨＭ４３９６３６）；Ｃｒｙ１Ｉｅ３（アクセッション番号ＫＣ１５６６４７）；Ｃｒｙ１Ｉｅ４（アクセッション番号ＫＣ１５６６８１）；Ｃｒｙ１Ｉｆ１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８２）；Ｃｒｙ１Ｉｇ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０１）；Ｃｒｙ１Ｉ様（アクセッション番号ＡＡＣ３１０９４）；Ｃｒｙ１Ｉ様（アクセッション番号ＡＢＧ８８８５９）；Ｃｒｙ１Ｊａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４１）；Ｃｒｙ１Ｊａ２（アクセッション番号ＨＭ０７００３０）；Ｃｒｙ１Ｊａ３（アクセッション番号ＪＱ２２８４２５）；Ｃｒｙ１Ｊｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ９８９５９）；Ｃｒｙ１Ｊｃ１（アクセッション番号ＡＡＣ３１０９２）；Ｃｒｙ１Ｊｃ２（アクセッション番号ＡＡＱ５２３７２）；Ｃｒｙ１Ｊｄ１（アクセッション番号ＣＡＣ５０７７９）；Ｃｒｙ１Ｋａ１（アクセッション番号ＡＡＢ００３７６）；Ｃｒｙ１Ｋａ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８３）；Ｃｒｙ１Ｌａ１（アクセッション番号ＡＡＳ６０１９１）；Ｃｒｙ１Ｌａ２（アクセッション番号ＨＭ０７００３１）；Ｃｒｙ１Ｍａ１（アクセッション番号ＦＪ８８４０６７）；Ｃｒｙ１Ｍａ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６５９）；Ｃｒｙ１Ｎａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６４８）；Ｃｒｙ１Ｎｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６７８）；Ｃｒｙ１様（アクセッション番号ＡＡＣ３１０９１）；Ｃｒｙ２Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３５）；Ｃｒｙ２Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＡ８３５１６）；Ｃｒｙ２Ａａ３（アクセッション番号Ｄ８６０６４）；Ｃｒｙ２Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＣ０４８６７）；Ｃｒｙ２Ａａ５（アクセッション番号ＣＡＡ１０６７１）；Ｃｒｙ２Ａａ６（アクセッション番号ＣＡＡ１０６７２）；Ｃｒｙ２Ａａ７（アクセッション番号ＣＡＡ１０６７０）；Ｃｒｙ２Ａａ８（アクセッション番号ＡＡ０１３７３４）；Ｃｒｙ２Ａａ９（アクセッション番号ＡＡ０１３７５０）；Ｃｒｙ２Ａａ１０（アクセッション番号ＡＡＱ０４２６３）；Ｃｒｙ２Ａａ１１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８４）；Ｃｒｙ２Ａａ１２（アクセッション番号ＡＢ１８３６７１）；Ｃｒｙ２Ａａ１３（アクセッション番号ＡＢＬ０１５３６）；Ｃｒｙ２Ａａ１４（アクセッション番号ＡＣＦ０４９３９）；Ｃｒｙ２Ａａ１５（アクセッション番号ＪＮ４２６９４７）；Ｃｒｙ２Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４２）；Ｃｒｙ２Ａｂ２（アクセッション番号ＣＡＡ３９０７５）；Ｃｒｙ２Ａｂ３（アクセッション番号ＡＡＧ３６７６２）；Ｃｒｙ２Ａｂ４（アクセッション番号ＡＡ０１３２９６）；Ｃｒｙ２Ａｂ５（アクセッション番号ＡＡＱ０４６０９）；Ｃｒｙ２Ａｂ６（アクセッション番号ＡＡＰ５９４５７）；Ｃｒｙ２Ａｂ７（アクセッション番号ＡＡＺ６６３４７）；Ｃｒｙ２Ａｂ８（アクセッション番号ＡＢＣ９５９９６）；Ｃｒｙ２Ａｂ９（アクセッション番号ＡＢＣ７４９６８）；Ｃｒｙ２Ａｂ１０（アクセッション番号ＥＦ１５７３０６）；Ｃｒｙ２Ａｂ１１（アクセッション番号ＣＡＭ８４５７５）；Ｃｒｙ２Ａｂ１２（アクセッション番号ＡＢＭ２１７６４）；Ｃｒｙ２Ａｂ１３（アクセッション番号ＡＣＧ７６１２０）；Ｃｒｙ２Ａｂ１４（アクセッション番号ＡＣＧ７６１２１）；Ｃｒｙ２Ａｂ１５（アクセッション番号ＨＭ０３７１２６）；Ｃｒｙ２Ａｂ１６（アクセッション番号ＧＱ８６６９１４）；Ｃｒｙ２Ａｂ１７（アクセッション番号ＨＱ４３９７８９）；Ｃｒｙ２Ａｂ１８（アクセッション番号ＪＮ１３５２５５）；Ｃｒｙ２Ａｂ１９（アクセッション番号ＪＮ１３５２５６）；Ｃｒｙ２Ａｂ２０（アクセッション番号ＪＮ１３５２５７）；Ｃｒｙ２Ａｂ２１（アクセッション番号ＪＮ１３５２５８）；Ｃｒｙ２Ａｂ２２（アクセッション番号ＪＮ１３５２５９）；Ｃｒｙ２Ａｂ２３（アクセッション番号ＪＮ１３５２６０）；Ｃｒｙ２Ａｂ２４（アクセッション番号ＪＮ１３５２６１）；Ｃｒｙ２Ａｂ２５（アクセッション番号ＪＮ４１５４８５）；Ｃｒｙ２Ａｂ２６（アクセッション番号ＪＮ４２６９４６）；Ｃｒｙ２Ａｂ２７（アクセッション番号ＪＮ４１５７６４）；Ｃｒｙ２Ａｂ２８（アクセッション番号ＪＮ６５１４９４）；Ｃｒｙ２Ａｃ１（アクセッション番号ＣＡＡ４０５３６）；Ｃｒｙ２Ａｃ２（アクセッション番号ＡＡＧ３５４１０）；Ｃｒｙ２Ａｃ３（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８５）；Ｃｒｙ２Ａｃ４（アクセッション番号ＡＢＣ９５９９７）；Ｃｒｙ２Ａｃ５（アクセッション番号ＡＢＣ７４９６９）；Ｃｒｙ２Ａｃ６（アクセッション番号ＡＢＣ７４７９３）；Ｃｒｙ２Ａｃ７（アクセッション番号ＣＡＬ１８６９０）；Ｃｒｙ２Ａｃ８（アクセッション番号ＣＡＭ０９３２５）；Ｃｒｙ２Ａｃ９（アクセッション番号ＣＡＭ０９３２６）；Ｃｒｙ２Ａｃ１０（アクセッション番号ＡＢＮ１５１０４）；Ｃｒｙ２Ａｃ１１（アクセッション番号ＣＡＭ８３８９５）；Ｃｒｙ２Ａｃ１２（アクセッション番号ＣＡＭ８３８９６）；Ｃｒｙ２Ａｄ１（アクセッション番号ＡＡＦ０９５８３）；Ｃｒｙ２Ａｄ２（アクセッション番号ＡＢＣ８６９２７）；Ｃｒｙ２Ａｄ３（アクセッション番号ＣＡＫ２９５０４）；Ｃｒｙ２Ａｄ４（アクセッション番号ＣＡＭ３２３３１）；Ｃｒｙ２Ａｄ５（アクセッション番号ＣＡ０７８７３９）；Ｃｒｙ２Ａｅ１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３６２）；Ｃｒｙ２Ａｆ１（アクセッション番号ＡＢ０３０５１９）；Ｃｒｙ２Ａｆ２（アクセッション番号ＧＱ８６６９１５）；Ｃｒｙ２Ａｇ１（アクセッション番号ＡＣＨ９１６１０）；Ｃｒｙ２Ａｈ１（アクセッション番号ＥＵ９３９４５３）；Ｃｒｙ２Ａｈ２（アクセッション番号ＡＣＬ８０６６５）；Ｃｒｙ２Ａｈ３（アクセッション番号ＧＵ０７３３８０）；Ｃｒｙ２Ａｈ４（アクセッション番号ＫＣ１５６７０２）；Ｃｒｙ２Ａｉ１（アクセッション番号ＦＪ７８８３８８）；Ｃｒｙ２Ａｊ（アクセッション番号）；Ｃｒｙ２Ａｋ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６０）；Ｃｒｙ２Ｂａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５８）；Ｃｒｙ３Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３６）；Ｃｒｙ３Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２５４１）；Ｃｒｙ３Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＡ６８４８２）；Ｃｒｙ３Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＡ２２５４２）；Ｃｒｙ３Ａａ５（アクセッション番号ＡＡＡ５０２５５）；Ｃｒｙ３Ａａ６（アクセッション番号ＡＡＣ４３２６６）；Ｃｒｙ３Ａａ７（アクセッション番号ＣＡＢ４１４１１）；Ｃｒｙ３Ａａ８（アクセッション番号ＡＡＳ７９４８７）；Ｃｒｙ３Ａａ９（アクセッション番号ＡＡＷ０５６５９）；Ｃｒｙ３Ａａ１０（アクセッション番号ＡＡＵ２９４１１）；Ｃｒｙ３Ａａ１１（アクセッション番号ＡＡＷ８２８７２）；Ｃｒｙ３Ａａ１２（アクセッション番号ＡＢＹ４９１３６）；Ｃｒｙ３Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３４９８３）；Ｃｒｙ３Ｂａ２（アクセッション番号ＣＡＡ００６４５）；Ｃｒｙ３Ｂａ３（アクセッション番号ＪＱ３９７３２７）；Ｃｒｙ３Ｂｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３４）；Ｃｒｙ３Ｂｂ２（アクセッション番号ＡＡＡ７４１９８）；Ｃｒｙ３Ｂｂ３（アクセッション番号Ｉ１５４７５）；Ｃｒｙ３Ｃａ１（アクセッション番号ＣＡＡ４２４６９）；Ｃｒｙ４Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＡ６８４８５）；Ｃｒｙ４Ａａ２（アクセッション番号ＢＡＡ００１７９）；Ｃｒｙ４Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＤ３０１４８）；Ｃｒｙ４Ａａ４（アクセッション番号ＡＦＢ１８３１７）；Ｃｒｙ４Ａ様（アクセッション番号ＡＡＹ９６３２１）；Ｃｒｙ４Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３０３１２）；Ｃｒｙ４Ｂａ２（アクセッション番号ＣＡＡ３０１１４）；Ｃｒｙ４Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３７）；Ｃｒｙ４Ｂａ４（アクセッション番号ＢＡＡ００１７８）；Ｃｒｙ４Ｂａ５（アクセッション番号ＣＡＤ３００９５）；Ｃｒｙ４Ｂａ様（アクセッション番号ＡＢＣ４７６８６）；Ｃｒｙ４Ｃａ１（アクセッション番号ＥＵ６４６２０２）；Ｃｒｙ４Ｃｂ１（アクセッション番号ＦＪ４０３２０８）；Ｃｒｙ４Ｃｂ２（アクセッション番号ＦＪ５９７６２２）；Ｃｒｙ４Ｃｃ１（アクセッション番号ＦＪ４０３２０７）；Ｃｒｙ５Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ６７６９４）；Ｃｒｙ５Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ６７６９３）；Ｃｒｙ５Ａｃ１（アクセッション番号Ｉ３４５４３）；Ｃｒｙ５Ａｄ１（アクセッション番号ＡＢＱ８２０８７）；Ｃｒｙ５Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＡ６８５９８）；Ｃｒｙ５Ｂａ２（アクセッション番号ＡＢＷ８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Ｄａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１２３９８０）；Ｃｒｙ５Ｅａ１（アクセッション番号ＨＭ４８５５８０）；Ｃｒｙ５Ｅａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１２４０３８）；Ｃｒｙ６Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５７）；Ｃｒｙ６Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＭ４６８４９）；Ｃｒｙ６Ａａ３（アクセッション番号ＡＢＨ０３３７７）；Ｃｒｙ６Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５８）；Ｃｒｙ７ Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５１）；Ｃｒｙ７Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２１１２０）；Ｃｒｙ７Ａｂ２（アクセッション番号ＡＡＡ２１１２１）；Ｃｒｙ７Ａｂ３（アクセッション番号ＡＢＸ２４５２２）；Ｃｒｙ７ Ａｂ４（アクセッション番号ＥＵ３８０６７８）；Ｃｒｙ７ Ａｂ５（アクセッション番号ＡＢＸ７９５５５）；Ｃｒｙ７ Ａｂ６（アクセッション番号ＡＣＩ４４００５）；Ｃｒｙ７ Ａｂ７（アクセッション番号ＡＤＢ８９２１６）；Ｃｒｙ７ 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Ｊ４９９３８９）；Ｃｒｙ３０Ｆａ１（アクセッション番号ＡＣＩ２２６２５）；Ｃｒｙ３０Ｇａ１（アクセッション番号ＡＣＧ６００２０）；Ｃｒｙ３０Ｇａ２（アクセッション番号ＨＱ６３８２１７）；Ｃｒｙ３１Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＢ１１７５７）；Ｃｒｙ３１Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＬ８７４５８）；Ｃｒｙ３１Ａａ３（アクセッション番号ＢＡＥ７９８０８）；Ｃｒｙ３１Ａａ４（アクセッション番号ＢＡＦ３２５７１）；Ｃｒｙ３１Ａａ５（アクセッション番号ＢＡＦ３２５７２）；Ｃｒｙ３１Ａａ６（アクセッション番号ＢＡ１４４０２６）；Ｃｒｙ３１Ａｂ１（アクセッション番号ＢＡＥ７９８０９）；Ｃｒｙ３１Ａｂ２（アクセッション番号ＢＡＦ３２５７０）；Ｃｒｙ３１Ａｃ１（アクセッション番号ＢＡＦ３４３６８）；Ｃｒｙ３１Ａｃ２（アクセッション番号ＡＢ７３１６００）；Ｃｒｙ３１Ａｄ１（アクセッション番号ＢＡ１４４０２２）；Ｃｒｙ３２Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＧ３６７１１）；Ｃｒｙ３２Ａａ２（アクセッション番号ＧＵ０６３８４９）；Ｃｒｙ３２Ａｂ１（アクセッション番号ＧＵ０６３８５０）；Ｃｒｙ３２Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７８６０１）；Ｃｒｙ３２Ｃａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７８６０２）；Ｃｒｙ３２Ｃｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０８）；Ｃｒｙ３２Ｄａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７８６０３）；Ｃｒｙ３２Ｅａ１（アクセッション番号ＧＵ３２４２７４）；Ｃｒｙ３２Ｅａ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６８６）；Ｃｒｙ３２Ｅｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６３）；Ｃｒｙ３２Ｆａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５６）；Ｃｒｙ３２Ｇａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５７）；Ｃｒｙ３２Ｈａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６１）；Ｃｒｙ３２Ｈｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６６）；Ｃｒｙ３２Ｉａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６７）；Ｃｒｙ３２Ｊａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８５）；Ｃｒｙ３２Ｋａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８８）；Ｃｒｙ３２Ｌａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８９）；Ｃｒｙ３２Ｍａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９０）；Ｃｒｙ３２Ｍｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０４）；Ｃｒｙ３２Ｎａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９１）；Ｃｒｙ３２Ｏａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０３）；Ｃｒｙ３２Ｐａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０５）；Ｃｒｙ３２Ｑａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０６）；Ｃｒｙ３２Ｒａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０７）；Ｃｒｙ３２Ｓａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０９）；Ｃｒｙ３２Ｔａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７１０）；Ｃｒｙ３２Ｕａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５５）；Ｃｒｙ３３Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＬ２６８７１）；Ｃｒｙ３４Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０３４１）；Ｃｒｙ３４Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６０）；Ｃｒｙ３４Ａａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３２）；Ｃｒｙ３４Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３０）；Ｃｒｙ３４Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＧ４１６７１）；Ｃｒｙ３４Ａｃ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０１１８）；Ｃｒｙ３４Ａｃ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６２）；Ｃｒｙ３４Ａｃ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２９）；Ｃｒｙ３４Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６５）；Ｃｒｙ３４Ｂａ２（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３３）；Ｃｒｙ３４Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３１）；Ｃｒｙ３５Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０３４２）；Ｃｒｙ３５Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６１）；Ｃｒｙ３５Ａａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２８）；Ｃｒｙ３５Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２５）；Ｃｒｙ３５Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＧ４１６７２）；Ｃｒｙ３５Ａｂ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６３）；Ｃｒｙ３５Ａｂ３（アクセッション番号ＡＹ５３６８９１）；Ｃｒｙ３５Ａｃ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０１１７）；Ｃｒｙ３５Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６６）；Ｃｒｙ３５Ｂａ２（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２７）；Ｃｒｙ３５Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２６）；Ｃｒｙ３６Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５５８）；Ｃｒｙ３７ Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＦ７６３７６）；Ｃｒｙ３８Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５５９）；Ｃｒｙ３９Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７２０１６）；Ｃｒｙ４０Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７２０１８）；Ｃｒｙ４０Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＣ７７６４８）；Ｃｒｙ４０Ｃａ１（アクセッション番号ＥＵ３８１０４５）；Ｃｒｙ４０Ｄａ１（アクセッション番号ＡＣＦ１５１９９）；Ｃｒｙ４１Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＤ３５１５７）；Ｃｒｙ４１Ａｂ１（アクセッション番号ＢＡＤ３５１６３）；Ｃｒｙ４１Ｂａ１（アクセッション番号ＨＭ４６１８７１）；Ｃｒｙ４１Ｂａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４０９９６５２）；Ｃｒｙ４２Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＤ３５１６６）；Ｃｒｙ４３Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＤ１５３０１）；Ｃｒｙ４３Ａａ２（アクセッション番号ＢＡＤ９５４７４）；Ｃｒｙ４３Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＤ１５３０３）；Ｃｒｙ４３Ｃａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６７６）；Ｃｒｙ４３Ｃｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９５）；Ｃｒｙ４３Ｃｃ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９６）；Ｃｒｙ４３様（アクセッション番号ＢＡＤ１５３０５）；Ｃｒｙ４４Ａａ（アクセッション番号ＢＡＤ０８５３２）；Ｃｒｙ４５Ａａ（アクセッション番号ＢＡＤ２２５７７）；Ｃｒｙ４６Ａａ（アクセッション番号ＢＡＣ７９０１０）；Ｃｒｙ４６Ａａ２（アクセッション番号ＢＡＧ６８９０６）；Ｃｒｙ４６Ａｂ（アクセッション番号ＢＡＤ３５１７０）；Ｃｒｙ４７ Ａａ（アクセッション番号ＡＡＹ２４６９５）；Ｃｒｙ４８Ａａ（アクセッション番号ＣＡＪ１８３５１）；Ｃｒｙ４８Ａａ２（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４５）；Ｃｒｙ４８Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４６）；Ｃｒｙ４８Ａｂ（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４８）；Ｃｒｙ４８Ａｂ２（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４９）；Ｃｒｙ４９Ａａ（アクセッション番号ＣＡＨ５６５４１）；Ｃｒｙ４９Ａａ２（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４１）；Ｃｒｙ４９Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４３）；Ｃｒｙ４９Ａａ４（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４４）；Ｃｒｙ４９Ａｂ１（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４２）；Ｃｒｙ５０Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＥ８６９９９）；Ｃｒｙ５０Ｂａ１（アクセッション番号ＧＵ４４６６７５）；Ｃｒｙ５０Ｂａ２（アクセッション番号ＧＵ４４６６７６）；Ｃｒｙ５１Ａａ１（アクセッション番号ＡＢ１１４４４４）；Ｃｒｙ５１Ａａ２（アクセッション番号ＧＵ５７０６９７）；Ｃｒｙ５２Ａａ１（アクセッション番号ＥＦ６１３４８９）；Ｃｒｙ５２Ｂａ１（アクセッション番号ＦＪ３６１７６０）；Ｃｒｙ５３Ａａ１（アクセッション番号ＥＦ６３３４７６）；Ｃｒｙ５３Ａｂ１（アクセッション番号ＦＪ３６１７５９）；Ｃｒｙ５４Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＡ５２１９４）；Ｃｒｙ５４Ａａ２（アクセッション番号ＧＱ１４０３４９）；Ｃｒｙ５４Ｂａ１（アクセッション番号ＧＵ４４６６７７）；Ｃｒｙ５５Ａａ１（アクセッション番号ＡＢＷ８８９３２）；Ｃｒｙ５４Ａｂ１（アクセッション番号ＪＱ９１６９０８）；Ｃｒｙ５５Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＥ３３５２６）；Ｃｒｙ５６Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＵ５７４９９）；Ｃｒｙ５６Ａａ２（アクセッション番号ＧＱ４８３５１２）；Ｃｒｙ５６Ａａ３（アクセッション番号ＪＸ０２５５６７）；Ｃｒｙ５７Ａａ１（アクセッション番号ＡＮＣ８７２６１）；Ｃｒｙ５８Ａａ１（アクセッション番号ＡＮＣ８７２６０）；Ｃｒｙ５９Ｂａ１（アクセッション番号ＪＮ７９０６４７）；Ｃｒｙ５９Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＲ４３７５８）；Ｃｒｙ６０Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＵ２４７８２）；Ｃｒｙ６０Ａａ２（アクセッション番号ＥＡ０５７２５４）；Ｃｒｙ６０Ａａ３（アクセッション番号ＥＥＭ９９２７８）；Ｃｒｙ６０Ｂａ１（アクセッション番号ＧＵ８１０８１８）；Ｃｒｙ６０Ｂａ２（アクセッション番号ＥＡ０５７２５３）；Ｃｒｙ６０Ｂａ３（アクセッション番号ＥＥＭ９９２７９）；Ｃｒｙ６１Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ０３５０８７）；Ｃｒｙ６１Ａａ２（アクセッション番号ＨＭ１３２１２５）；Ｃｒｙ６１Ａａ３（アクセッション番号ＥＥＭ１９３０８）；Ｃｒｙ６２Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ０５４５０９）；Ｃｒｙ６３Ａａ１（アクセッション番号ＢＡ１４４０２８）；Ｃｒｙ６４Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＪ０５３９７）；Ｃｒｙ６５Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ４６１８６８）；Ｃｒｙ６５Ａａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１２３８３８）；Ｃｒｙ６６Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ４８５５８１）；Ｃｒｙ６６Ａａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４０９９９４５）；Ｃｒｙ６７Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ４８５５８２）；Ｃｒｙ６７Ａａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１４８８８２）；Ｃｒｙ６８Ａａ１（アクセッション番号ＨＱ１１３１１４）；Ｃｒｙ６９Ａａ１（アクセッション番号ＨＱ４０１００６）；Ｃｒｙ６９Ａａ２（アクセッション番号ＪＱ８２１３８８）；Ｃｒｙ６９Ａｂ１（アクセッション番号ＪＮ２０９９５７）；Ｃｒｙ７０Ａａ１（アクセッション番号ＪＮ６４６７８１）；Ｃｒｙ７０Ｂａ１（アクセッション番号ＡＤ０５１０７０）；Ｃｒｙ７０Ｂｂ１（アクセッション番号ＥＥＬ６７２７６）；Ｃｒｙ７１Ａａ１（アクセッション番号ＪＸ０２５５６８）；Ｃｒｙ７２Ａａ１（アクセッション番号ＪＸ０２５５６９）；Ｃｙｔ１Ａａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３１８２）；Ｃｙｔ１Ａｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９８７９３）；Ｃｙｔ１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３７１９６）；Ｃｙｔ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ１４１４７）；およびＣｙｔ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５２０４３）。
また、δ−内毒素の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：米国特許第５，８８０，２７５号、同第７，８５８，８４９号、同第８，５３０，４１１号、同第８，５７５，４３３号、および同第８，６８６，２３３号のＣｒｙ１Ａタンパク質；米国特許第８，３０４，６０４号、同第８，３０４，６０５、および同第８，４７６，２２６号のＤＩＧ−３毒素またはＤＩＧ−１１毒素（ｃｒｙタンパク質（Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ３Ａなど）のａ−ヘリックス１および／またはａ−ヘリックス２バリアントのＮ末端欠失）；米国特許出願第１０／５２５，３１８号のＣｒｙ１Ｂ；米国特許第６，０３３，８７４号のＣｒｙ１Ｃ；米国特許第５，１８８，９６０号および同第６，２１８，１８８号のＣｒｙ１Ｆ；米国特許第７，０７０、９８２号；同第６，９６２，７０５号、および同第６，７１３，０６３号のＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ）；米国特許第７，０６４，２４９号のＣｒｙ２タンパク質（Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質など））；少なくとも２つの異なるＣｒｙタンパク質の可変領域と保存ブロックとの固有の組合せの融合によって作出されたＣｒｙ３Ａタンパク質（制限されないが、操作されたハイブリッド殺虫タンパク質（ｅＨＩＰ）が挙げられる）（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４）；Ｃｒｙ４タンパク質；Ｃｒｙ５タンパク質；Ｃｒｙ６タンパク質；米国特許第７，３２９，７３６号、同第７，４４９，５５２号、同第７，８０３，９４３号、同第７，４７６，７８１号、同第７，１０５，３３２、７，３７８，４９９号、および同第７，４６２，７６０号のＣｒｙ８タンパク質；Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９Ｅ、およびＣｒｙ９Ｆファミリーのメンバー（米国特許第８，８０２，９３３号のＣｒｙ９Ｄタンパク質および米国特許第８，８０２，９３４号のＣｒｙ９Ｂタンパク質が挙げられる）などのＣｒｙ９タンパク質；Ｎａｉｍｏｖ，ら，（２００８），“Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，”７４：７１４５−７１５１のＣｒｙ１５タンパク質；米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５、および同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ２２、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質；米国特許第６，２４８，５３５号、同第６，３２６，３５１号、同第６，３９９，３３０号、同第６，９４９，６２６号、同第７，３８５，１０７号、および同第７，５０４，２２９号のＣｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥＴ３４タンパク質；米国特許出願公開第２００６／０１９１０３４号、同第２０１２／０２７８９５４号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３９００４号のＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４ホモログ；米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１、および同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ３５Ａｂ１タンパク質；Ｃｒｙ４６タンパク質、Ｃｒｙ５１タンパク質、Ｃｒｙ二成分毒素；ＴＩＣ９０１または関連毒素；米国特許出願公開第２００８／０２９５２０７号のＴＩＣ８０７；ＰＣＴＵＳ２００６／０３３８６７号のＥＴ２９、ＥＴ３７、ＴＩＣ８０９、ＴＩＣ８１０、ＴＩＣ８１２、ＴＩＣ１２７、ＴＩＣ１２８；米国特許第８，５１３，４９４号のＴＩＣ８５３毒素、米国特許第８，２３６，７５７号のＡＸＭＩ−０２７、ＡＸＭＩ−０３６、およびＡＸＭＩ−０３８；米国特許第７，９２３，６０２号のＡＸＭＩ−０３１、ＡＸＭＩ−０３９、ＡＸＭＩ−０４０、ＡＸＭＩ−０４９；ＷＯ２００６／０８３８９１号のＡＸＭＩ−０１８、ＡＸＭＩ−０２０、およびＡＸＭＩ−０２１；ＷＯ２００５／０３８０３２号のＡＸＭＩ−０１０；ＷＯ２００５／０２１５８５号のＡＸＭＩ−００３；米国特許出願公開第２００４／０２５０３１１号のＡＸＭＩ−００８；米国特許出願公開第２００４／０２１６１８６号のＡＸＭＩ−００６；米国特許出願公開第２００４／０２１０９６５号のＡＸＭＩ−００７；米国特許出願公開第２００４／０２１０９６４号ＡＸＭＩ−００９；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１７号のＡＸＭＩ−０１４；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１６号のＡＸＭＩ−００４；ＷＯ２００６／１１９４５７号のＡＸＭＩ−０２８およびＡＸＭＩ−０２９；ＷＯ２００４／０７４４６２号のＡＸＭＩ−００７、ＡＸＭＩ−００８、ＡＸＭＩ−００８０ｒｆ２、ＡＸＭＩ−００９、ＡＸＭＩ−０１４、およびＡＸＭＩ−００４；米国特許第８，０８４，４１６号のＡＸＭＩ−１５０；米国特許出願公開第２０１１／００２３１８４号のＡＸＭＩ−２０５；米国特許出願公開第２０１１／０２６３４８８号のＡＸＭＩ−０１１、ＡＸＭＩ−０１２、ＡＸＭＩ−０１３、ＡＸＭＩ−０１５、ＡＸＭＩ−０１９、ＡＸＭＩ−０４４、ＡＸＭＩ−０３７、ＡＸＭＩ−０４３、ＡＸＭＩ−０３３、ＡＸＭＩ−０３４、ＡＸＭＩ−０２２、ＡＸＭＩ−０２３、ＡＸＭＩ−０４１、ＡＸＭＩ−０６３、およびＡＸＭＩ−０６４；米国特許出願公開第２０１０／０１９７５９２号のＡＸＭＩ−Ｒ１および関連タンパク質；ＷＯ２０１１／１０３２４８号のＡＸＭＩ２２１Ｚ、ＡＸＭＩ２２２ｚ、ＡＸＭＩ２２３ｚ、ＡＸＭＩ２２４ｚ、およびＡＸＭＩ２２５ｚ；ＷＯ２０１１／１０３２４７号および米国特許第８，７５９，６１９号のＡＸＭＩ２１８、ＡＸＭＩ２１９、ＡＸＭＩ２２０、ＡＸＭＩ２２６、ＡＸＭＩ２２７、ＡＸＭＩ２２８、ＡＸＭＩ２２９、ＡＸＭＩ２３０、およびＡＸＭＩ２３１；米国特許第８，３３４，４３１号のＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、ＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ−１６３、およびＡＸＭＩ−１８４；米国特許出願公開第２０１０／０２９８２１１号のＡＸＭＩ−００１、ＡＸＭＩ−００２、ＡＸＭＩ−０３０、ＡＸＭＩ−０３５、およびＡＸＭＩ−０４５；米国特許出願公開第２００９／０１４４８５２号のＡＸＭＩ−０６６およびＡＸＭＩ−０７６；米国特許第８，３１８，９００号のＡＸＭＩ１２８、ＡＸＭＩ１３０、ＡＸＭＩ１３１、ＡＸＭＩ１３３、ＡＸＭＩ１４０、ＡＸＭＩ１４１、ＡＸＭＩ１４２、ＡＸＭＩ１４３、ＡＸＭＩ１４４、ＡＸＭＩ１４６、ＡＸＭＩ１４８、ＡＸＭＩ１４９、ＡＸＭＩ１５２、ＡＸＭＩ１５３、ＡＸＭＩ１５４、ＡＸＭＩ１５５、ＡＸＭＩ１５６、ＡＸＭＩ１５７、ＡＸＭＩ１５８、ＡＸＭＩ１６２、ＡＸＭＩ１６５、ＡＸＭＩ１６６、ＡＸＭＩ１６７、ＡＸＭＩ１６８、ＡＸＭＩ１６９、ＡＸＭＩ１７０、ＡＸＭＩ１７１、ＡＸＭＩ１７２、ＡＸＭＩ１７３、ＡＸＭＩ１７４、ＡＸＭＩ１７５、ＡＸＭＩ１７６、ＡＸＭＩ１７７、ＡＸＭＩ１７８、ＡＸＭＩ１７９、ＡＸＭＩ１８０、ＡＸＭＩ１８１、ＡＸＭＩ１８２、ＡＸＭＩ１８５、ＡＸＭＩ１８６、ＡＸＭＩ１８７、ＡＸＭＩ１８８、ＡＸＭＩ１８９；米国特許出願公開第２０１０／０００５５４３号のＡＸＭＩ０７９、ＡＸＭＩ０８０、ＡＸＭＩ０８１、ＡＸＭＩ０８２、ＡＸＭＩ０９１、ＡＸＭＩ０９２、ＡＸＭＩ０９６、ＡＸＭＩ０９７、ＡＸＭＩ０９８、ＡＸＭＩ０９９、ＡＸＭＩ１００、ＡＸＭＩ１０１、ＡＸＭＩ１０２、ＡＸＭＩ１０３、ＡＸＭＩ１０４、ＡＸＭＩ１０７、ＡＸＭＩ１０８、ＡＸＭＩ１０９、ＡＸＭＩ１１０、ＡＸＭＩ１１１、ＡＸＭＩ１１２、ＡＸＭＩ１１４、ＡＸＭＩ１１６、ＡＸＭＩ１１７、ＡＸＭＩ１１８、ＡＸＭＩ１１９、ＡＸＭＩ１２０、ＡＸＭＩ１２１、ＡＸＭＩ１２２、ＡＸＭＩ１２３、ＡＸＭＩ１２４、ＡＸＭＩ１２５７、ＡＸＭＩ１２６８、ＡＸＭＩ１２７、ＡＸＭＩ１２９、ＡＸＭＩ１６４、ＡＸＭＩ１５１、ＡＸＭＩ１６１、ＡＸＭＩ１８３、ＡＸＭＩ１３２、ＡＸＭＩ１３８、ＡＸＭＩ１３７、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２２３５９８号のＡＸＭＩ２７０、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２２３５９９号のＡＸＭＩ２７９、ｃｒｙタンパク質（米国特許第８，３１９，０１９号の改変タンパク質分解部位を有するＣｒｙ１ＡおよびＣｒｙ３Ａなど）；米国特許出願公開第２０１１／００６４７１０のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＶＢＴＳ ２５２８由来のＣｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａａ、およびＣｒｙ１Ｃａ毒素タンパク質。他のＣｒｙタンパク質が当業者に周知である。Ｎ．Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，ら，“Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，”（１９９８）Ｖｏｌ ６２：８０７−８１３を参照のこと；ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ／のＮ．Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，ら，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｏｘｉｎ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”（２０１６）も参照のこと。
トランスジェニック植物形質としてのＣｒｙタンパク質の使用は、当業者に周知であり、Ｃｒｙ−トランスジェニック植物（制限されないが、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａｃ＋Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｆａ２、Ｃｒｙ１Ｆ＋Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１、Ｖｉｐ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ９ｃ、およびＣＢＩ−Ｂｔを発現する植物が挙げられる）は、規制当局から承認されている。Ｓａｎａｈｕｊａら，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ａ ｃｅｎｔｕｒｙ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”（２０１１）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｐｒｉｌ ９（３）：２８３−３００およびｃｅｒａ−ｇｍｃ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ａｃｔｉｏｎ＝ｇｍ＿ｃｒｏｐ＿ｄａｔａｂａｓｅ（先頭に「ｗｗｗ」を付けたワールド・ワイド・ウェブでアクセス可能）のＣＥＲＡ（２０１０）ＧＭ Ｃｒｏｐ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＣＥＲＡ），ＩＬＳＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）を参照のこと。また、以下などの当業者に周知の１つを超える殺有害生物タンパク質を植物内で発現させることができる：Ｖｉｐ３ＡｂおよびＣｒｙ１Ｆａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８２）；Ｃｒｙ１ＢＥおよびＣｒｙ１Ｆ（ＵＳ２０１２／０３１１７４６）；Ｃｒｙ１ＣＡおよびＣｒｙ１ＡＢ（ＵＳ２０１２／０３１１７４５）；Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙＣａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８１）；Ｃｒｙ１ＤＡおよびＣｒｙ１ＢＥ（ＵＳ２０１２／０３３１５９０）；Ｃｒｙ１ＤＡおよびＣｒｙ１Ｆａ（ＵＳ２０１２／０３３１５８９）；Ｃｒｙ１ＡＢおよびＣｒｙ１ＢＥ（ＵＳ２０１２／０３２４６０６）；Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ２ＡａならびにＣｒｙ１１およびＣｒｙ１Ｅ（ＵＳ２０１２／０３２４６０５）；Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５ＡｂおよびＣｒｙ６Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６９）；Ｃｒｙ３４Ａｂ／ＶＣｒｙ３５ＡｂおよびＣｒｙ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６８）；Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｆ（ＵＳ２０１４０１８２０１８）；ならびにＣｒｙ３ＡおよびＣｒｙ１ＡｂまたはＶｉｐ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１１６１７０）。また、殺有害生物タンパク質としては、殺虫リパーゼ（米国特許第７，４９１，８６９号の脂質アシルヒドロラーゼ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどに由来するコレステロールオキシダーゼ（Ｐｕｒｃｅｌｌら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５：１４０６−１４１３）が挙げられる）が挙げられる。
また、殺有害生物タンパク質としては、ＶＩＰ（植物性殺虫タンパク質）毒素が挙げられる。昆虫病原性細菌は、封入体内または副芽胞結晶内に蓄積される殺虫タンパク質（前述のＣｒｙおよびＣｙｔタンパク質など）および培養培地に分泌される殺虫タンパク質を産生する。後者には、Ｖｉｐタンパク質があり、このタンパク質は、そのアミノ酸同一性に従って４つのファミリーに分類される。Ｖｉｐ１およびＶｉｐ２タンパク質は二成分毒素として作用し、ＣｏｌｅｏｐｔｅｒａおよびＨｅｍｉｐｔｅｒａのいくつかのメンバーに有毒である。Ｖｉｐ１成分は昆虫の中腸膜内の受容体に結合すると考えられており、Ｖｉｐ２成分は、細胞に侵入し、細胞でアクチンに対するそのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示して、マイクロフィラメント形成を妨害する。Ｖｉｐ３は、Ｖｉｐ１またはＶｉｐ２と配列が類似しておらず、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの多種多様なメンバーに有毒である。その作用様式は、Ｖｉｐ３Ａタンパク質がＣｒｙタンパク質と結合部位を共有しないにも関わらず、タンパク質分解活性化、中腸上皮膜への結合、および穿孔形成に関して、Ｃｒｙタンパク質の作用様式と類似することが示されている。後者の性質により、Ｖｉｐタンパク質は、昆虫耐性を妨害するか遅延させ、殺虫範囲を広げるために、トランスジェニック植物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ処理作物（Ｂｔ作物））中でＣｒｙタンパク質と組み合わせるのに良好な候補である。Ｃｒｙタンパク質と組み合わせたＶｉｐ３Ａａタンパク質を発現するＢｔワタおよびＢｔメイズには、商業的に栽培される品種が存在する。ごく最近に報告されたＶｉｐ４ファミリーについては、標的昆虫は依然として見出されていない。Ｃｈａｋｒｏｕｎら，“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｖｉｐ）ｆｒｏｍ Ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２０１６ Ｍａｒ ２；８０（２）：３２９−５０を参照のこと。ＶＩＰは、米国特許第５，８７７，０１２号、同第６，１０７，２７９号、同第６，１３７，０３３号、同第７，２４４，８２０号、同第７，６１５，６８６号、および同第８，２３７，０２０号などに見出され得る。他のＶＩＰタンパク質が当業者に周知である（ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｖｉｐ．ｈｔｍｌ（先頭に「ｗｗｗ」を付けたワールド・ワイド・ウェブでアクセス可能）を参照のこと）。
また、殺有害生物タンパク質としては、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓなどの生物から得ることができる毒素複合体（ＴＣ）タンパク質が挙げられる（米国特許第７，４９１，６９８号および同第８，０８４，４１８を参照のこと）。いくつかのＴＣタンパク質は「独立型」殺虫活性を有し、他のＴＣタンパク質は、同一の所与の生物によって産生される独立型毒素の活性を増強する。「独立型」ＴＣタンパク質（例えば、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ由来）の毒性を、異なる属の供給生物由来の１またはそれを超えるＴＣタンパク質「増強物質」によって増強することができる。ＴＣタンパク質には、３つの主なタイプが存在する。本明細書中で言及する場合、クラスＡタンパク質（「タンパク質Ａ」）は、独立型毒素である。クラスＢタンパク質（「タンパク質Ｂ」）およびクラスＣタンパク質（「タンパク質Ｃ」）は、クラスＡタンパク質の毒性を増強する。クラスＡタンパク質の例は、ＴｃｂＡ、ＴｃｄＡ、ＸｐｔＡ１、およびＸｐｔＡ２である。クラスＢタンパク質の例は、ＴｃａＣ、ＴｃｄＢ、ＸｐｔＢ１Ｘｂ、およびＸｐｔＣ１ Ｗｉである。クラスＣタンパク質の例は、ＴｃｃＣ、ＸｐｔＣ１Ｘｂ、およびＸｐｔＢ１ Ｗｉである。また、殺有害生物タンパク質としては、クモ、ヘビ、およびサソリの毒液タンパク質が挙げられる。クモ毒液ペプチドの例としては、制限されないが、リコトシキシン−１ペプチドおよびその変異体（米国特許第８，３３４，３６６）が挙げられる。
いくつかの現在登録されているＰＩＰを、表１１に列挙する。また、トランスジェニック植物は、昆虫遺伝子に指向するｄｓＲＮＡを発現するように操作されている（Ｂａｕｍ，Ｊ．Ａ．ら（２００７）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１３２２−１３２６；Ｍａｏ，Ｙ．Ｂ．ら（２００７）Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａ ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｐｌａｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡｉ ｉｍｐａｉｒｓ ｌａｒｖａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｇｏｓｓｙｐｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１３０７−１３１３）。有害生物がトランスジェニック植物を摂食することによって有害生物内にＲＮＡ干渉を誘発することができる。したがって、有害生物が摂食すると、有害生物が傷害を受けるか死滅する。
表１１．本開示の微生物と組み合わせることができる植物導入保護剤の例のリスト
Figure 2021529522
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いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の農薬を、任意の１またはそれを超える本開示の微生物と共に利用することができ、植物またはその一部（種子が挙げられる）に適用することができる。
除草剤
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える除草剤と組み合わせられる。
本明細書中に記載の方法にしたがって産生された細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載の特徴を有する組成物は、１またはそれを超える除草剤をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、除草組成物は、植物および／または植物の一部に適用される。いくつかの実施形態では、除草組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して適用することができる。
除草剤としては、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、アセトクロル、アシフルオルフェン、アラクロル、アメトリン、アトラジン、アミノピラリド、ベネフィン、ベンスルフロン、ベンスリド、ベンタゾン、ビシクロピロン、ブロマシル、ブロモキシニル、ブチラート、カルフェントラゾン、クロリムロン、クロルスルフロン、クレトジム、クロマゾン、クロピラリド、クロランスラム、シクロアート、ＤＣＰＡ、デスメジファム、ジカンバ、ジクロベニル、ジクロホップ、ジクロスラム、ジフルフェンゾピル、ジメテナミド、ジクワット、ジウロン、ＤＳＭＡ、エンドタール、ＥＰＴＣ、エタルフルラリン、エトフメサート、フェノキサプロップ、フルアジホップ−Ｐ、フルカルブゾン、フルフェナセット、フルメツラム、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルオメツロン、フルロキシピル、ホメサフェン、ホラムスルフロン、グルホシネート、グリホサート、ハロスルフロン、ヘキサジノン、イマザメタベンズ、イマザモクス、イマザピク、イマザキン、イマゼタピル、イソキサフルトール、ラクトフェン、リヌロン、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、メソトリオン、メトラクロル−ｓ、メトリブジン、インダジフラム、メトスルフロン、モリネート、ＭＳＭＡ、ナプロパミド、ナプタラム、ニコスルフロン、ノルフルラゾン、オリザリン、オキサジアゾン、オキシフルオルフェン、パラコート、ペラルゴン酸、ペンジメタリン、フェンメジファム、ピクロラム、プリミスルフロン、プロジアミン、プロメトリン、プロナミド、プロパニル、プロスルフロン、ピラゾン、ピリチオアク、キンクロラック、キザロホップ、リムスルフロン、Ｓ−メトラクロル、セトキシジム、シデュロン、シマジン、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホスルフロン、テブチウロン、テンボトリオン、テルバシル、チアゾピル、チフェンスルフロン、チオベンカルブ、トプラメゾン、トラルコキシジム、トリアラート、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリクロピル、トリフルラリン、およびトリフルスルフロンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の除草剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用することができる。
除草製品としては、ＣＯＲＶＵＳ、ＢＡＬＡＮＣＥ ＦＬＥＸＸ、ＣＡＰＲＥＮＯ、ＤＩＦＬＥＸＸ、ＬＩＢＥＲＴＹ、ＬＡＵＤＩＳ、ＡＵＴＵＭＮ ＳＵＰＥＲ、およびＤＩＦＬＥＸＸ ＤＵＯが挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、以下の表１２中に記載の任意の１またはそれを超える除草剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に教示の微生物と共に利用してよく、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部に適用することができる。
表１２．本開示の微生物と組み合わせることができる除草剤の例のリスト
Figure 2021529522
Figure 2021529522
Figure 2021529522
殺真菌剤
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える殺真菌剤と組み合わせられる。
本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物は、１またはそれを超える殺真菌剤をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、殺真菌組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して適用することができる。殺真菌剤としては、アゾキシストロビン、カプタン、カルボキシン、エタボキサム、フルジオキソニル、メフェノキサム、フルジオキソニル、チアベンダゾール、チアベンダズ、イプコナゾール、マンコゼブ、シアゾファミド、ゾキサミド、メタラキシル、ＰＣＮＢ、メタコナゾール、ピラクロストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＱＳＴ ７１３、セダキサン、チアメトキサム、フルジオキソニル、チラム、トルクロホス−メチル、トリフロキシストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＭＢＩ ６００、ピラクロストロビン、フルオキサストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株ＱＳＴ ２８０８、クロロタロニル、銅、フルトリアホール、フルキサピロキサド、マンコゼブ、グルジオキソニル、ペンチオピラド、トリアゾール、プロピコナオゾール、プロチオコナゾール、テブコナゾール、フルオキサストロビン、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、クオールス、テトラコナゾール、トリフロキシストロビン、シプロコナゾール、フルトリアホール、ＳＤＨＩ、ＥＢＤＣ、セダキサン、ＭＡＸＩＭ ＱＵＡＴＴＲＯ（グルジオキソニル、メフェノキサム、アゾキシストロビン、およびチアベンダズ）、ＲＡＸＩＬ（テブコナゾール、プロチオコナゾール、メタラキシル、およびエトキシル化獣脂アルキルアミン）、およびベンゾビンジフルピルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の殺真菌剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用してよい。
殺線虫剤
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える殺線虫剤と組み合わせられる。
本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物は、１またはそれを超える殺線虫剤をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、殺線虫組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して適用することができる。殺線虫剤は、Ｄ−Ｄ、１，３−ジクロロプロペン、エチレンジブロミド、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン、臭化メチル、クロロピクリン、メタムナトリウム、ダゾメット、メチルイソチオシアナート、テトラチオ炭酸ナトリウム、アルジカルブ、アルドキシカルブ、カルボフラン、オキサミル、エトプロップ、フェナミホス、カズサホス、ホスチアゼート、テルブホス、フェンスルホチオン、ホレート、ＤｉＴｅｒａ、クランドサン、シンコシン、ヨウ化メチル、プロパルギルブロミド、２，５−ジヒドロキシメチル−３，４−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）、任意の１またはそれを超えるアベルメクチン、アジ化ナトリウム、フルフラール、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ、アバメクトリン、チアメトキサム、フルジオキソニル、クロチアンジン、サリチル酸、およびベンゾ−（１，２，３）−チアジアゾール−７−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステルから選択してよい。
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の殺線虫剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用してよい。
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の殺線虫剤、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、および／または農薬を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用してよい。
肥料、窒素安定剤、およびウレアーゼ阻害剤
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える肥料、窒素安定剤、またはウレアーゼ阻害剤と組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、肥料は、本開示の方法および細菌と組み合わせて使用される。肥料としては、とりわけ、無水アンモニア、尿素、硝酸アンモニウム、および尿素−硝酸アンモニウム（ＵＡＮ）組成物が挙げられる。いくつかの実施形態では、芽出し肥および／または根付け肥を、本開示の方法および細菌と組み合わせて使用する。
いくつかの実施形態では、窒素安定剤を、本開示の方法および細菌と組み合わせて使用する。窒素安定剤としては、ニトラピリン、２−クロロ−６−（トリクロロメチル）ピリジン、Ｎ−ＳＥＲＶＥ ２４、ＩＮＳＴＩＮＣＴ、ジシアンジアミド（ＤＣＤ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ウレアーゼ阻害剤を、本開示の方法および細菌と組み合わせて使用する。ウレアーゼ阻害剤としては、Ｎ−（ｎ−ブチル）−チオリン酸トリアミド（ＮＢＰＴ）、ＡＧＲＯＴＡＩＮ、ＡＧＲＯＴＡＩＮ ＰＬＵＳ、およびＡＧＲＯＴＡＩＮ ＰＬＵＳ ＳＣが挙げられる。さらに、本開示は、ＡＧＲＯＴＡＩＮ ＡＤＶＡＮＣＥＤ １．０、ＡＧＲＯＴＡＩＮ ＤＲＩ−ＭＡＸＸ、およびＡＧＲＯＴＡＩＮ ＵＬＴＲＡの利用を企図する。
さらに、安定化形態の肥料を使用することができる。例えば、安定化形態の肥料は、安定化された尿素系顆粒中に４６％の窒素を含むＳＵＰＥＲ Ｕであり、ＳＵＰＥＲＵは、ウレアーゼならびに脱窒、浸出、および揮発から保護するための硝化阻害剤を含む。ＮＩＴＡＭＩＮなどの安定化された葉面を標的にする肥料を使用しても良い。
芽出し肥料は、トウモロコシ圃場で一般的に使用される。芽出し肥は、植栽時に種子と共に数ポンドの栄養素を適用することを含む。芽出し肥は、実生の活力を増大させるために使用される。
本明細書中で使用され得る遅滞放出または制御放出される肥料は、以下を必要とする：基準となる「栄養素が迅速に利用可能な肥料」（硝酸アンモニウムまたは尿素、リン酸アンモニウムまたは塩化カリウムなど）よりも適用後の植物の取り込みおよび使用が遅延するか、植物が利用できる期間が有意に長い形態の植物栄養素を含む肥料。そのような最初の利用の遅延または連続利用可能期間の延長は、様々な機序によって生じ得る。これらの機序としては、半透性コーティング、吸蔵、タンパク質材料、または他の化学的形態、水溶性低分子量化合物の加水分解の遅延、または他の未知の手段による材料の水溶性の調節が挙げられる。
本明細書中で使用され得る安定化窒素肥料は、以下を必要とする：窒素安定剤が添加されている肥料。窒素安定剤は、肥料に添加される物質であり、土壌中の肥料の窒素成分を尿素のＮまたはアンモニアのＮ形態に維持する時間を延長する。
本明細書中で使用され得る硝化阻害剤は、以下を必要とする：アンモニアのＮから硝酸のＮへの生物学的酸化を阻害する物質。いくつかの例としては、以下が挙げられる：（１）２−クロロ−６−（トリクロロメチル−ピリジン）、一般名Ｎｉｔｒａｐｙｒｉｎ、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製造；（２）４−アミノ−１，２，４−６−トリアゾール−ＨＣｌ、一般名ＡＴＣ、Ｉｓｈｉｈａｄａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製造；（３）２，４−ジアミノ−６−トリクロロ−メチルトリアジン、一般名ＣＩ−１５８０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ製造；（４）ジシアンジアミド、一般名ＤＣＤ、Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ製造；（５）チオ尿素、一般名ＴＵ、Ｎｉｔｔｏ Ｒｙｕｓｏ製造；（６）１−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、一般名ＭＴ、Ｎｉｐｐｏｎ製造；（７）２−アミノ−４−クロロ−６−メチル−ピラミジン、一般名ＡＭ、Ｍｉｔｓｕｉ Ｔｏａｔｓｕ製造；（８）３，４−ジメチルピラゾールホスファート（ＤＭＰＰ）、ＢＡＳＦ製造；（９）１−アミド−２−チオ尿素（ＡＳＵ）、Ｎｉｔｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄ．製造；（１０）アンモニウムチオサルファート（ＡＴＳ）；（１１）１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＨＰＬＣ）；（１２）５−エチレンオキシド−３−トリクロロ−メチル（ｍｅｔｈｌｙ）１，２，４−チオジアゾール（Ｔｅｒｒａｚｏｌｅ）、Ｏｌｉｎ Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ製造；（１３）３−メチルピラゾール（３−ＭＰ）；（１４）１−カルバモイル（ｃａｒｂａｍｏｙｌｅ）−３−メチル−ピラゾール（ＣＭＰ）；（１５）Ｎｅｅｍ；および（１６）ＤＭＰＰ。
本明細書中で使用され得るウレアーゼ阻害剤は、以下を必要とする：酵素ウレアーゼによる尿素に対する加水分解作用を阻害する物質。何千もの化学物質が土壌ウレアーゼ阻害剤と評価されている（Ｋｉｓｓ ａｎｄ Ｓｉｍｉｈａｉａｎ，２００２）。しかしながら、試験された多数の化合物のうちで、無毒性で、低濃度で有効であり、安定であり、尿素と適合し（固体および溶液）、土壌で分解し、安価であるという必要条件を満たすものはほんの一部にすぎない。ウレアーゼ阻害剤を、その構造および酵素ウレアーゼとの想定される相互作用にしたがって分類することができる（Ｗａｔｓｏｎ，２０００，２００５）。ウレアーゼ阻害剤には、以下の４つの主なクラスが提唱されている：（ａ）スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基と相互作用する試薬（スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）試薬）、（ｂ）ヒドロキサマート、（ｃ）農業作物保護化学物質、および（ｄ）尿素および関連化合物の構造類似体。Ｎ−（ｎ−ブチル）チオリン酸トリアミド（ＮＢＰＴ）、フェニルホスホロジアミダート（ＰＰＤ／ＰＰＤＡ）、およびヒドロキノンは、おそらく最も徹底的に研究されたウレアーゼ阻害剤である（Ｋｉｓｓ ａｎｄ Ｓｉｍｉｈａｉａｎ，２００２）。Ｎ−（２−ニトロフェニル）リン酸トリアミド（２−ＮＰＴ）およびチオ硫酸ジアンモニウム（ＡＴＳ）を用いた研究および実用性試験も行われている。有機リン化合物は、尿素の構造類似体であり、酵素の活性部位を遮断するウレアーゼ活性の最も有効な阻害剤のうちのいくつかである（Ｗａｔｓｏｎ，２００５）。
トウモロコシのための種子殺虫処理（ＩＳＴ）
トウモロコシ種子処理は、通常、以下の３つの範囲の有害生物を標的にする：線虫、実生の病害真菌、および昆虫。
殺虫剤による種子処理は、通常、種子処理パッケージの主な構成要素である。今日利用可能なほとんどのトウモロコシ種子は、殺真菌剤および殺虫剤を含む基本パッケージが付属している。いくつかの態様では、種子処理のための殺虫剤の選択肢としては、ＰＯＮＣＨＯ（クロチアニジン）、ＣＲＵＩＳＥＲ／ＣＲＵＩＳＥＲ ＥＸＴＲＥＭＥ（チアメトキサム）、およびＧＡＵＣＨＯ（イミダクロプリド）が挙げられる。これら３つの製品は全て、ネオニコチノイド化学物質である。２５０（．２５ｍｇ ＡＩ／種子）の割合のＣＲＵＩＳＥＲおよびＰＯＮＣＨＯは、トウモロコシに利用可能な最も一般的な基本オプションのうちのいくつかである。いくつかの態様では、処置のための殺虫剤の選択肢としては、ＣＲＵＩＳＥＲ２５０チアメトキサム、ＣＲＵＩＳＥＲ２５０（チアメトキサム）＋ＬＵＭＩＶＩＡ（クロルアントラニリプロール）、ＣＲＵＩＳＥＲ５００（チアメトキサム）、およびＰＯＮＣＨＯ ＶＯＴＩＶＯ１２５０（クロチアニジンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ Ｉ−１５８２）が挙げられる。
Ｐｉｏｎｅｅｒの基本的な殺虫剤種子処理パッケージは、ＣＲＵＩＳＥＲ２５０からなり、ＰＯＮＣＨＯ／ＶＯＴＩＶＯ１２５０も併用できる。ＶＯＴＩＶＯは、線虫から防御する生物剤である。
トウモロコシ、ダイズ、およびワタを含むＭｏｎｓａｎｔｏの製品は、ＡＣＣＥＬＥＲＯＮ処理アンブレラに分類される。Ｄｅｋａｌｂトウモロコシ種子は、ＰＯＮＣＨＯ２５０が標準で付属している。また、生産者は、ＰＯＮＣＨＯ／ＶＯＴＩＶＯにアップグレードする選択肢もあり、その場合、ＰＯＮＣＨＯを５００の割合で適用する。
Ａｇｒｉｓｕｒｅ、Ｇｏｌｄｅｎ Ｈａｒｖｅｓｔ、およびＧａｒｓｔは、殺真菌剤およびＣＲＵＩＳＥＲ２５０を含む基本パッケージを有する。ＡＶＩＣＴＡ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｒｎも利用可能であり；これは、ＣＲＵＩＳＥＲ５００、殺真菌剤、および線虫防御剤を含む。ＣＲＵＩＳＥＲ ＥＸＴＲＥＭＥは、種子処理パッケージとして利用可能な別の選択肢である；しかしながら、ＣＲＵＩＳＥＲの量は従来のＣＲＵＩＳＥＲ種子処理と同一である（すなわち、２５０、５００、または１２５０）。
別の選択肢は、利用可能な最小限の殺虫剤での処理を購入し、最終段階で業者に種子の処理を依頼することである。
市販のトウモロコシ用のＩＳＴを、以下の表１３に列挙し、前述のＩＳＴは、本明細書に教示の１またはそれを超える微生物と組み合わせることができる。
表１３．本開示の微生物と組み合わせることができる種子処理（ＩＳＴを含む）の例のリスト
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 Ｆ＝殺真菌剤；Ｉ＝殺虫剤；Ｎ＝殺線虫剤；Ｐ＝植物成長調節物質
作物に対する細菌集団の適用
本明細書中に記載されている細菌または細菌集団の組成物は、植溝で、タルク中でまたは種子処理剤として適用することができる。組成物は、バルク、ミニバルク、袋、またはタルク中の種子パッケージに適用することができる。
植栽者は、処理された種子を植栽し、従来の様式に従って２条で、または耕うんを必要としない様式で作物を栽培することができる。種子は、コントロールホッパーまたは個別のホッパーを使用して散布することができる。また、種子は、加圧空気を使用してまたは手作業で散布することができる。種子配置は、可変作業技術を使用して実施することができる。さらに、本明細書中に記載されている細菌または細菌集団を、可変作業技術を使用して適用してよい。いくつかの例では、細菌は、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、擬似穀類の種子、および脂肪種子に適用することができる。穀類の例としては、オオムギ、フォニオ、オート麦、パルマーグラス、ライ麦、トウジンビエ、モロコシ、スペルトコムギ、テフ、ライコムギ、およびコムギが挙げられ得る。擬似穀類の例としては、ブレッドナッツ、ソバ、ガマ、チーア、亜麻、アマランス子実、ハンザ、キノア、およびゴマを挙げるられ得る。いくつかの例では、種子は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機的なもの、または従来のものであり得る。
マイクロ肥料、ＰＧＲ、除草剤、殺虫剤、および殺真菌剤などの添加剤を追加で使用して、作物を処理することができる。添加剤の例としては、作物保護剤（殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤など）、増強剤（着色剤、ポリマー、植込錠、下塗剤、および消毒剤など）、および他の薬剤（接種剤、ＰＧＲ、軟化剤、および微量栄養素など）が挙げられる。ＰＧＲは、根成長、開花、または茎伸長に影響を及ぼす天然または合成の植物ホルモンであり得る。ＰＧＲとしては、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、およびアブシジン酸（ＡＢＡ）を挙げることができる。
組成物は、液体肥料と組み合わせて植溝で適用することができる。いくつかの例では、液体肥料は、タンクに保持してもよい。ＮＰＫ肥料は、ナトリウム、亜リン酸、およびカリウムという主要栄養素を含む。
組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含有量の維持、果実または種子数の増加、および果実または種子単位重量の増加などの、植物形質を改善させることができる。本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または改善させるために用いることができる。導入または改善される形質の例としては、以下が挙げられる：根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収穫高、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、低窒素ストレスへの耐性、窒素使用効率、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、代謝物のレベルの調整、プロテオーム発現。植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実の収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された基準農業植物（例えば、導入および／または改善された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。いくつかの例では、植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、類似条件下で栽培された基準農業植物（例えば、導入されたおよび／または改善された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。
宿主植物の農学的形質としては、限定されないが、以下が挙げられ得る：油含有量の変更、タンパク質含有量の変更、種子炭水化物組成の変更、種子油組成の変更、および種子タンパク質組成の変更、化学物質耐性、耐寒性、老化遅延、病害耐性、干ばつ耐性、穂重、成長改善、健康増強（ｈｅａｌｔｈ ｅ４ｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）、耐熱性、除草剤耐性、草食動物耐性、窒素固定の改善、窒素利用の改善、根アーキテクチャーの改善、水使用効率の改善、バイオマスの増加、根長の増加、種子重量の増加、苗条長さの増加、収穫高の増加、水制限条件下での収穫高の増加、穀粒質量、穀粒水分含有量、金属耐性、穂数、１穂当たりの穀粒数、さや数、栄養増強、病原体耐性、害虫耐性、光合成能力の改善、塩分耐性、緑維持、活力改善、成熟種子の乾燥重量の増加、成熟種子の生重量の増加、１植物当たりの成熟種子数の増加、葉緑素含有量の増加、１植物当たりのさや数の増加、１植物当たりのさや長の増加、１植物当たりのしおれた葉の数の減少、１植物当たりの重度にしおれた葉の数の減少、および１植物当たりのしおれていない葉の数の増加、前述の種子処理剤製剤を用いずに種子から成長させた同系統植物と比較した、代謝物質レベルの検出可能なモジュレーション、転写物レベルの検出可能なモジュレーション、およびプロテオームの検出可能なモジュレーション。
いくつかの場合では、接種される植物の植物要素と同じ種の植物から単離された細菌または細菌集団を植物に接種する。例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）の１つの品種に通常見出される細菌または細菌集団を、その天然の状態では前述の細菌および細菌集団を欠如するＺｅａ ｍａｙｓの別の品種の植物の植物要素に付随させる。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、接種される植物の植物要素と関連する植物種に属する植物に由来する。例えば、Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ Ｉｌｔｉｓら（ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｔｅｏｓｉｎｔｅ）に通常見出される細菌および細菌集団を、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）に適用するか、またはその逆である。いくつかの場合では、接種される植物の植物要素とは異種である細菌および細菌集団を植物に接種する。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、別の種の植物に由来する。例えば、通常は双子葉植物に見出される細菌および細菌集団を、単子葉植物に適用するか（例えば、ダイズ由来細菌および細菌集団をトウモロコシに接種する）、またはその逆である。他の場合では、植物に接種しようとする細菌および細菌集団は、接種されている植物の関連種に由来する。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、関連分類群に、例えば関連種に由来する。別の種の植物は、農業植物であってもよい。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、任意の宿主植物要素に接種されるように設計された組成物の一部分である。
いくつかの例では、細菌または細菌集団は外因性であり、細菌および細菌集団は、接種される植物とは異なる植物から単離される。例えば、１つの実施形態では、細菌または細菌集団は、接種される植物と同じ種の異なる植物から単離することができる。いくつかの場合では、細菌または細菌集団は、接種される植物に付随する種から単離することができる。
いくつかの例では、本明細書中に記載の細菌および細菌集団は、１つの組織タイプから別のタイプへと移動させることが可能である。例えば、種子の外側にコーティングした後の植物の成熟組織内での細菌および細菌集団の本開示の検出および単離により、種子外側から成熟中の植物の栄養組織内へと移動するそれらの能力が実証される。したがって、１つの実施形態では、細菌の集団および細菌集団は、種子外側から植物の栄養組織内へと移動することが可能である。１つの実施形態では、植物の種子にコーティングされた細菌および細菌集団は、種子が植物状態へと発芽すると、植物の異なる組織へと局在化することが可能である。例えば、細菌および細菌集団は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、毛状突起、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、および木部を含む植物の組織のいずれか１つに局在化することが可能であり得る。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根および／または根毛に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化される。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することが可能である。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニー化する。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の表面に存在する（すなわち、その存在は、植物外側、または植物のエピスフィアに検出可能に存在する）ように、植物にコロニー化することができる。さらなる他の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
また、組成物の有効性は、作物の相対的成熟度または作物発熱単位（ＣＨＵ）を測定することにより評価することができる。例えば、細菌集団をトウモロコシに適用することができ、トウモロコシ成長を、トウモロコシ穀粒の相対的成熟度、またはトウモロコシ穀粒が最大重量になる時間により評価することができる。また、作物発熱単位（ＣＨＵ）を使用して、トウモロコシ作物の成熟度を予測することができる。ＣＨＵは、作物が成長する際の一日の最高温度を測定することにより熱蓄積量を決定する。
例では、細菌は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、毛状突起、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、および木部を含む植物の組織のいずれか１つに局在化してもよい。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化される。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、または果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニー化する。さらに別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の表面に存在するように、植物にコロニー化することができる。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
作物に適用される細菌組成物の有効性は、限定されないが、植栽率、播種活力、根の強度、干ばつ耐性、植物丈、ドライダウン、および検査重量を含む、作物成長の種々の特徴を測定することにより評価することができる。
植物種
本明細書中に記載の方法および細菌は、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、およびＴｒｉｔｉｃｅａｅ属の植物などの様々な植物のいずれにも適切である。適切な植物の他の非限定的な例としては、コケ類、地衣類、および藻類が挙げられる。いくつかの場合では、食用作物、繊維作物、油用作物、森林またはパルプおよび製紙業の植物、バイオ燃料生産用の原料、および／または観賞植物などの植物は、経済的、社会的、および／または環境的な価値を有する。いくつかの例では、植物は、穀物、小麦粉、デンプン、シロップ、粗挽き粉、油、フィルム、パッケージング、栄養補給製品、パルプ、動物飼料、魚飼料、工業化学用のバルク剤、シリアル製品、加工ヒト用食品、糖、アルコール、および／またはタンパク質などの経済的に価値のある製品を生産するために使用され得る。作物植物の非限定的な例としては、メイズ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、雑穀、オートムギ、ライコムギ、ソバ、スイートコーン、サトウキビ、タマネギ、トマト、イチゴ、およびアスパラガスが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法および細菌は、種々のそのトランスジェニック植物、非トランスジェニック植物、およびハイブリッド植物のうちのいずれかに適切である。
いくつかの例では、本明細書中に開示の方法および組成物を使用して得ることができるかまたは改善させることができる植物としては、農業、園芸、バイオ燃料分子および他の化学物質を生産するためのバイオマス、ならびに／または林業に重要であるかまたは興味深い植物を挙げることができる。それらの植物のいくつかの例としては、パイナップル、バナナ、ココナッツ、ユリ、グラスピー、およびイネ科植物；ならびに、例えば、エンドウ、アルファルファ、オオブドウホオズキ、メロン、ヒヨコマメ、チコリー、クローバ、ケール、レンズマメ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ダイコン、キャベツ、アブラナ、リンゴの木、ブドウ、ワタ、ヒマワリ、シロイヌナズナ、キャノーラ、柑橘類（オレンジ、マンダリン、キンカン、レモン、ライム、グレープフルーツ、タンジェリン、タンジェロ、シトロン、およびザボンを含む）、コショウ、豆、レタス、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（モロコシ、スーダン）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（エネルギーケーン）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンヒエ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐｐ．、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ（ライ麦）、Ｓａｌｉｘ ｓｐｐ．（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｐｐ．（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｓｐｐ．（ｔｒｉｔｉｃｕｍ−２５ コムギ×ライ麦）、タケ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アブラヤシ）、Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ（ナツメヤシ）、Ａｒｃｈｏｎｔｏｐｈｏｅｎｉｘ ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｎａ（ユスラヤシ）、Ｓｙａｇｒｕｓ ｒｏｍａｎｚｏｆｆｉａｎａ（ジョウオウヤシ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ（ｃａｓｓａｙａ））、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｌｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ（トウガラシおよびアマトウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）、Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ、Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｌｉｖａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ、Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｉｃｈｉｃｕｍ ａｕｔｕｍｎａｌｅ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ５ ｓｐｐ．、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ、Ｄａｔｕｒａ ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ｓｐｐ．、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｓｐｐ．、Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｉｎｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｐｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｃｏｃａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｗｏｒｎｏｒｉｉ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ ｓｐｐ．、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ ｓｅｒｒａｔｕｍ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ ｓｅｒｒａｔａ）、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、Ｈｅｖｅａ ｓｐｐ．（ゴム）、Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ（ミント）、Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ（ミント）、Ｂｉｘａ ｏｒｅｌｌａｎａ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｒｏｓａ ｓｐｐ．（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐｐ．（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オート麦）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、およびＬｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．（ライ麦）などの双子葉植物を挙げることができる。
いくつかの例では、単子葉植物を使用することができる。単子葉植物は、Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｏｒｃｈｉｄａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、およびＺｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ目に属する。Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅの綱に属する植物は、Ｃｙｃａｄａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、Ｇｎｅｔａｌｅｓ、およびＰｉｎａｌｅｓである。いくつかの例では、単子葉植物は、メイズ、イネ、コムギ、オオムギ、およびサトウキビからなる群から選択することができる。
いくつかの例では、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ａｓｔｅｒａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｍｉｄｄｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂ ａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｓａｎｔａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、およびＶｉｏｌａｔｅｓの目に属するものを含む双子葉植物を使用することができる。いくつかの例では、双子葉植物は、ワタ、ダイズ、コショウ、およびトマトからなる群から選択することができる。
いくつかの場合では、改善される植物は、実験条件に容易に適合しない。例えば、作物植物は、十分に成長するのに時間が長くかかり過ぎるため、改善された形質を複数の繰り返しで連続的に評価することが実際上できない場合がある。したがって、細菌が最初に単離される第１の植物および／または遺伝子操作した細菌を適用する複数の植物は、所望の条件下での評価をより行い易い植物などのモデル植物であってもよい。モデル植物の非限定的な例としては、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属が挙げられる。その後、モデル植物を使用して本開示の方法により単離された細菌の能力を、別のタイプの植物（例えば、作物植物）に適用して、改善された形質の付与を確認することができる。
本明細書に開示されている方法により改善させることができる形質としては、例えば、成長速度、植物丈、重量、色、味、臭い、植物による１またはそれを超える化合物（例えば、代謝物、タンパク質、薬物、炭水化物、油、および任意の他の化合物を含む）の産生の変化を含む植物の任意の観察可能な特徴が挙げられる。遺伝子型情報に基づいて植物を選択することも起想される（例えば、細菌に応答した植物遺伝子発現のパターンを含むこと、または窒素固定の増加に関連するものなどの遺伝子マーカーの存在を同定すること）。また、植物は、ある特定の特徴または形質（望ましい特徴または形質など）の存在ではなく、ある特定の特徴または形質（望ましくない特徴または形質など）の非存在、抑制、または阻害に基づいて選択してもよい。
非遺伝子改変メイズ
本明細書中に記載の方法および細菌は、種々の非遺伝子改変メイズ植物またはその一部のいずれかに適切である。いくつかの態様では、トウモロコシは有機栽培される。さらに、本明細書中に記載の方法および細菌は、以下の非遺伝子改変のハイブリッド、品種、系統などのいずれかに適切である。いくつかの実施形態では、トウモロコシ品種は、一般に、以下の６つのカテゴリーに分類される：スイートコーン、フリントコーン、ポップコーン、デントコーン、ポッドコーン、およびフラワーコーン。
スイートコーン
イエローｓｕ品種としては、Ｅａｒｌｉｖｅｅ、Ｅａｒｌｙ Ｓｕｎｇｌｏｗ、Ｓｕｎｄａｎｃｅ、Ｅａｒｌｙ Ｇｏｌｄｅｎ Ｂａｎｔａｍ、Ｉｏｃｈｉｅｆ、Ｍｅｒｉｔ、Ｊｕｂｉｌｅｅ、およびＧｏｌｄｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｂａｎｔａｍが含まれる。ホワイトｓｕ品種としては、Ｔｒｕｅ Ｐｌａｔｉｎｕｍ、Ｃｏｕｎｔｒｙ Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｑｕｅｅｎ、およびＳｔｏｗｅｌｌ’ｓ Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎが挙げられる。バイカラーｓｕ品種としては、Ｓｕｇａｒ＆Ｇｏｌｄ、Ｑｕｉｃｋｉｅ、Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｕｔｔｅｒ＆Ｓｕｇａｒ、Ｓｕｇａｒ Ｄｏｔｓ、Ｈｏｎｅｙ＆Ｃｒｅａｍが挙げられる。マルチカラーｓｕ品種としては、Ｈｏｏｋｅｒｓ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｌａｙ、Ｐａｉｎｔｅｄ Ｈｉｌｌ、Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ／Ａｚｔｅｃが挙げられる。
イエローｓｅ品種としては、Ｂｕｔｔｅｒｇｏｌｄ、Ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ、Ｓｐｒｉｎｇ Ｔｒｅａｔ、Ｓｕｇａｒ Ｂｕｎｓ、Ｃｏｌｏｒｏｗ、Ｋａｎｄｙ Ｋｉｎｇ、Ｂｏｄａｃｉｏｕｓ Ｒ／Ｍ、Ｔｕｘｅｄｏ、Ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ、Ｍｅｒｌｉｎ、Ｍｉｒａｃｌｅ、およびＫａｎｄｙ Ｋｏｒｎ ＥＨが挙げられる。ホワイトｓｅ品種としては、Ｓｐｒｉｎｇ Ｓｎｏｗ、Ｓｕｇａｒ Ｐｅａｒｌ、Ｗｈｉｔｅｏｕｔ、Ｃｌｏｕｄ Ｎｉｎｅ、Ａｌｐｉｎｅ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｋｉｎｇ、およびＡｒｇｅｎｔが挙げられる。バイカラーｓｅ品種としては、Ｓｕｇａｒ Ｂａｂｙ、Ｆｌｅｅｔ、Ｂｏｎ Ｊｏｕｒ、Ｔｒｉｎｉｔｙ、Ｂｉ−Ｌｉｃｉｏｕｓ、Ｔｅｍｐｔａｔｉｏｎ、Ｌｕｓｃｉｏｕｓ、Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｃｃｏｒｄ、Ｂｒｏｃａｄｅ、Ｌａｎｃｅｌｏｔ、Ｐｒｅｃｉｏｕｓ Ｇｅｍ、Ｐｅａｃｈｅｓ ａｎｄ Ｃｒｅａｍ Ｍｉｄ ＥＨ、およびＤｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｒ／Ｍが挙げられる。マルチカラーｓｅ品種としては、Ｒｕｂｙ Ｑｕｅｅｎが挙げられる。
イエローｓｈ２品種としては、Ｅｘｔｒａ Ｅａｒｌｙ Ｓｕｐｅｒ Ｓｗｅｅｔ、Ｔａｋｅｏｆｆ、Ｅａｒｌｙ Ｘｔｒａ Ｓｗｅｅｔ、Ｒａｖｅｌｉｎｅ、Ｓｕｍｍｅｒ Ｓｗｅｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｋｒｉｓｐｙ Ｋｉｎｇ、Ｇａｒｒｉｓｏｎ、Ｉｌｌｉｎｉ Ｇｏｌｄ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、Ｐａｓｓｉｏｎ、Ｅｘｃｅｌ、Ｊｕｂｉｌｅｅ ＳｕｐｅｒＳｗｅｅｔ、Ｉｌｌｉｎｉ Ｘｔｒａ Ｓｗｅｅｔ、およびＣｒｉｓｐ ‘Ｎ Ｓｗｅｅｔが挙げられる。ホワイトｓｈ２品種としては、Ｓｕｍｍｅｒ Ｓｗｅｅｔ Ｗｈｉｔｅ、Ｔａｈｏｅ、Ａｓｐｅｎ、Ｔｒｅａｓｕｒｅ、Ｈｏｗ Ｓｗｅｅｔ Ｉｔ Ｉｓ、およびＣａｍｅｌｏｔが挙げられる。バイカラーｓｈ２品種としては、Ｓｕｍｍｅｒ Ｓｗｅｅｔ Ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｒａｄｉａｎｃｅ、Ｈｏｎｅｙ ‘Ｎ Ｐｅａｒｌ、Ａｌｏｈａ、Ｄａｚｚｌｅ、Ｈｕｄｓｏｎ、およびＰｈｅｎｏｍｅｎａｌが挙げられる。
イエローｓｙ品種としては、Ａｐｐｌａｕｓｅ、Ｉｎｆｅｒｎｏ、Ｈｏｎｅｙｔｒｅａｔ、およびＨｏｎｅｙ Ｓｅｌｅｃｔが挙げられる。ホワイトｓｙ品種としては、Ｓｉｌｖｅｒ Ｄｕｃｈｅｓｓ、Ｃｉｎｄｅｒｅｌｌａ、Ｍａｔｔａｐｏｉｓｅｔｔ、Ａｖａｌｏｎ、およびＣａｐｔｉｖａｔｅが挙げられる。バイカラーｓｙ品種としては、Ｐａｙ Ｄｉｒｔ、Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、Ｃｈａｒｉｓｍａ、Ｓｙｎｅｒｇｙ、Ｍｏｎｔａｕｋ、Ｋｒｉｓｔｉｎｅ、Ｓｅｒｅｎｄｉｐｉｔｙ／Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、およびＣａｍｅｏが挙げられる。
イエロー強甘味種としては、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ １ｄｄＡ、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ １１ｄｄ、Ｍｉｒａｉ １３１Ｙ、Ｍｉｒａｉ １３０Ｙ、Ｖｉｓｉｏｎ、およびＭｉｒａｉ ００２が挙げられる。ホワイト強甘味種としては、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ ３ｄｄａ、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ ３１ｄｄ、Ｍｉｒａｉ ４２１Ｗ、ＸＴＨ ３６７３、およびＤｅｖｏｔｉｏｎが挙げられる。バイカラー強甘味種としては、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ ２ｄｄａ、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ ２１ｄｄ、Ｋｉｃｋｏｆｆ ＸＲ、Ｍｉｒａｉ ３０８ＢＣ、Ａｎｔｈｅｍ ＸＲ、Ｍｉｒａｉ ３３６ＢＣ、Ｆａｎｔａｓｔｉｃ ＸＲ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ｍｉｒａｉ ３０１ＢＣ、Ｓｔｅｌｌａｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｒｅａｍ、Ｍｉｒａｉ ３５０ＢＣ、およびＯｂｓｅｓｓｉｏｎが挙げられる。
フリントコーン
フリントコーン品種としては、Ｂｒｏｎｚｅ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｃａｎｄｙ Ｒｅｄ Ｆｌｉｎｔ、Ｆｌｏｒｉａｎｉ Ｒｅｄ Ｆｌｉｎｔ、Ｇｌａｓｓ Ｇｅｍ、Ｉｎｄｉａｎ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ（Ｒａｉｎｂｏｗ）、Ｍａｎｄａｎ Ｒｅｄ Ｆｌｏｕｒ、Ｐａｉｎｔｅｄ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ｐｅｔｍｅｃｋｙ、Ｃｈｅｒｏｋｅｅ Ｗｈｉｔｅ Ｆｌｏｕｒが挙げられる。
ポップコーン
ポップコーン品種としては、Ｍｏｎａｒｃｈ Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ、Ｍｉｄｎｉｇｈｔ Ｂｌｕｅ、Ｒｕｂｙ Ｒｅｄ、Ｍｉｘｅｄ Ｂａｂｙ Ｒｉｃｅ、Ｑｕｅｅｎ Ｍａｕｖｅ、Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｆｌａｋｅ、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ、Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｂｌｕｅ Ｓｈａｍａｎ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｃｏｌｏｒｅｄ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｐｉｎｋ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｄｕｔｃｈ Ｂｕｔｔｅｒ Ｆｌａｖｏｒ、およびＲｅｄ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙが挙げられる。
デントコーン
デントコーン品種としては、Ｂｌｏｏｄｙ Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｂｌｕｅ Ｃｌａｒａｇｅ、Ｏｈｉｏ Ｂｌｕｅ Ｃｌａｒａｇｅ、Ｃｈｅｒｏｋｅｅ Ｗｈｉｔｅ Ｅａｇｌｅ、Ｈｉｃｋｏｒｙ Ｃａｎｅ、Ｈｉｃｋｏｒｙ Ｋｉｎｇ、Ｊｅｌｌｉｃｏｒｓｅ Ｔｗｉｎ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｒａｉｎｂｏｗ、Ｄａｙｍｏｎ Ｍｏｒｇａｎ’ｓ Ｋｎｔ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｌｅａｍｉｎｇ、Ｌｅａｍｉｎｇ’ｓ Ｙｅｌｌｏｗ、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ’ｓ Ｂｌｕｅ Ｇｉａｎｔ、Ｎｅａｌ Ｐａｙｍａｓｔｅｒ、Ｐｕｎｇｏ Ｃｒｅｅｋ Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｒｅｉｄ’ｓ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｅｎｔ、Ｒｏｔｔｅｎ Ｃｌａｒａｇｅ、およびＴｅｎｎｅｓｓｅｅ Ｒｅｄ Ｃｏｂが挙げられる。
いくつかの実施形態では、トウモロコシ品種としては、Ｐ１６１８Ｗ、Ｐ１３０６Ｗ、Ｐ１３４５、Ｐ１１５１、Ｐ１１９７、Ｐ０５７４、Ｐ０５８９、およびＰ０１５７が挙げられる。Ｗ＝ホワイトコーン。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法および細菌は、本明細書中に記載のメイズ品種の任意のハイブリッドに適切である。
遺伝子改変メイズ
本明細書中に記載の方法および細菌は、遺伝子改変メイズ植物またはその一部の任意のハイブリッド、品種、系統などに適切である。
さらに、本明細書中に記載の方法および細菌は、１またはそれを超える国で承認されている任意の以下の遺伝子改変メイズイベントに適切である：３２１３８（３２１３８ ＳＰＴ Ｍａｉｎｔａｉｎｅｒ）、３２７２（ＥＮＯＧＥＮ）、３２７２×Ｂｔ１１、３２７２×ｂｔ１１×ＧＡ２１、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、３２７２×ＧＡ２１、３２７２×ＭＩＲ６０４、３２７２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、４１１４、５３０７（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｄｕｒａｃａｄｅ）、５３０７×ＧＡ２１、５３０７×ＭＩＲ６０４×Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｄｕｒａｃａｄｅ ５１２２）、５３０７×ＭＩＲ６０４×Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１×ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｄｕｒａｃａｄｅ ５２２２）、５９１２２（ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＲＷ）、５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、５９１２２×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＯＮ８１０、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、５９１２２×ＮＫ６０３（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ ＲＷ ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ ２）、５９１２２×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、６７６、６７８、６８０、３７５１ ＩＲ、９８１４０、９８１４０×５９１２２、９８１４０×ＴＣ１５０７、９８１４０×ＴＣ１５０７×５９１２２、Ｂｔ１０（Ｂｔ１０）、Ｂｔ１１［Ｘ４３３４ＣＢＲ、Ｘ４７３４ＣＢＲ］（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＣＢ／ＬＬ）、Ｂｔ１１×５３０７、Ｂｔ１１×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４、Ｂｒ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｍ５３、Ｍ５６、ＤＡＳ−５９１２２−７、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＴＣ１５０７、ＴＣ１５０７×ＤＡＳ−５９１２２−７、Ｂｔ１１×５９１２２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＧＴ／ＣＢ／ＬＬ）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ２１００）、ＢＴ１１×ＭＩＲ１６２×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３１１０）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３１００）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３１１１／ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ４）、Ｂｔ１１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＭＯＮ８９０３４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９０３４、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９０３４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＲ１６２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３２２０）、ＢＴ１１×ＭＩＲ６０４（Ａｇｒｉｓｕｒｅ ＢＣ／ＬＬ／ＲＷ）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１７６［１７６］（ＮａｔｕｒＧａｒｄ ＫｎｏｃｋＯｕｔ／Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ）、ＢＶＬＡ４３０１０１、ＣＢＨ−３５１（ＳＴＡＲＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、ＤＡＳ４０２７８（ＥＮＬＩＳＴ Ｍａｉｚｅ）、ＤＡＳ４０２７８×ＮＫ６０３、ＤＢＴ４１８（Ｂｔ Ｘｔｒａ Ｍａｉｚｅ）、ＤＬＬ２５［Ｂ１６］、ＧＡ２１（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｍａｉｚｅ／ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＧＴ）、ＧＡ２１×ＭＯＮ８１０（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｙｉｅｌｄｇａｒｄ Ｍａｉｚｅ）、ＧＡ２１×Ｔ２５、ＨＣＥＭ４８５、ＬＹ０３８（ＭＡＶＥＲＡ Ｍａｉｚｅ）、ＬＹ０３８×ＭＯＮ８１０（ＭＡＶＥＲＡ Ｙｉｅｌｄｇａｒｄ Ｍａｉｚｅ）、ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ）、ＭＩＲ１６２×５３０７、ＭＩＲ１６２×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９ＯＥ３４、ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ６０４（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＲＷ）、ＭＩＲ６０４×５３０７、ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＧＴ／ＲＷ）、ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７ ｘＧＡ２１、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＯＮ８０１［ＭＯＮ８０１００］、ＭＯＮ８０２、ＭＯＮ８０９、ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ、ＭＡＩＺＥＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８１０×ＭＯＮ８８０１７（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ ＶＴ Ｔｒｉｐｌｅ）、ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８３２（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｍａｉｚｅ）、ＭＯＮ８６３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｒｏｏｔｗｏｒｍ ＲＷ、ＭＡＸＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８６３×ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｐｌｕｓ）、ＭＯＮ８６３×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｐｌｕｓ ｗｉｔｈ ＲＲ）、ＭＯＮ８６３×ＮＫ６０３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ ＲＷ＋ＲＲ）、ＭＯＮ８７４０３、ＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８７４１９、ＭＯＮ８７４２７（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｍａｉｚｅ）、ＭＯＮ８７４２７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８７４１１×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８７４１１×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＴＣ１５ＯＥ７×ＭＯＮ８８ＯＥ１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４６０（ＧＥＮＵＩＴＹ ＤＲＯＵＧＨＴＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４６０×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８７４６０、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７（ＧＥＮＵＩＴＹ ＶＴ Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｒｏ）、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３（ＧＥＮＵＩＴＹ ＶＴ Ｄｏｕｂｌｅ Ｐｒｏ）、ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２（ＧＥＮＵＩＴＹ ＳＭＡＲＴＳＴＡＸ）、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３（ＰＯＷＥＲ ＣＯＲＥ）、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＭＩＲ１６２、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＭＩＲ１６２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＧＡ２１、ＭＳ３（ＩＮＶＩＧＯＲ Ｍａｉｚｅ）、ＭＳ６（ＩＮＶＩＧＯＲ Ｍａｉｚｅ）、ＭＺＨＧ０ＪＧ、ＭＺＩＲ０９８、ＮＫ６０３（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ ２ Ｍａｉｚｅ）、ＮＫ６０３×ＭＯＮ８１０×４１１４×ＭＩＲ６０４、ＮＫ６０３×ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ ＣＢ＋ＲＲ）、ＮＫ６０３×Ｔ２５（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、Ｔ１４（ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、Ｔ２５（ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、Ｔ２５×ＭＯＮ８１０（ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｍａｉｚｅ）、ＴＣ１５０７（ＨＥＲＣＵＬＥＸ Ｉ、ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＣＢ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ ＸＴＲＥＭＥ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×５３０７、ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＴＣ１５０７×５９１２２（ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ ＸＴＲＡ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＮＫ６０３（ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡ ＲＲ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＴＣ１５０


７×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＴＲＩＳＥＣＴ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３（ＨＥＲＣＵＬＥＸ Ｉ ＲＲ）、ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ６２７５、およびＶＣＯ−０１９８１−５。
さらなる遺伝子改変植物
本明細書中に記載の方法および細菌は、任意の種々の遺伝子改変植物またはその一部に適切である。
さらに、本明細書中に記載の方法および細菌は、１またはそれを超える国で承認されている任意の以下の遺伝子改変植物イベントに適切である。
表１４−本開示の微生物と組み合わせることができるイネ形質
Figure 2021529522
 表１５−本開示の微生物と組み合わせることができるアルファルファ形質
Figure 2021529522
 表１６−本開示の微生物と組み合わせることができるコムギ形質
Figure 2021529522
 表１７−本開示の微生物と組み合わせることができるヒマワリ形質
Figure 2021529522
 表１８−本開示の微生物と組み合わせることができるダイズ形質
Figure 2021529522
Figure 2021529522
 表１９−本開示の微生物と組み合わせることができるトウモロコシ形質
Figure 2021529522
Figure 2021529522
Figure 2021529522
Figure 2021529522
Figure 2021529522
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Figure 2021529522
Figure 2021529522
Figure 2021529522
Figure 2021529522
Figure 2021529522
以下は表１９中の略語の定義である。ＡＭ−ＹＧＣＢ、ＨＸ１、ＬＬ、ＲＲ２を用いたＯＰＴＩＭＵＭ ＡＣＲＥＭＡＸ害虫防御システム。ＡＭＴ−ＲＷ、ＹＧＣＢ、ＨＸ１、ＬＬ、ＲＲ２を用いたＯＰＴＩＭＵＭ ＡＣＲＥＭＡＸ ＴＲＩＳＥＣＴ害虫防御システム。ＡＭＸＴ−（ＯＰＴＩＭＵＭ ＡＣＲＥＭＡＸ ＸＴｒｅｍｅ）。ＨＸＸ−ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡは、ＨｅｒｃｕｌｅｘＩ遺伝子およびＨｅｒｃｕｌｅｘＲＷ遺伝子を含む。ＨＸ１−セイヨウアワノメイガ、サウスウェスタンコーンボーラー、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、ウエスタンビーンカットワーム、モロコシマダラメイガ、サザンコーンストークボーラー、およびサトウキビメイガから防御し；アメリカタバコガを抑制するＨＥＲＣＵＬＥＸ Ｉ昆虫防御遺伝子を含む。ＬＬ−ＬＩＢＥＲＴＹ除草剤耐性のためのＬＩＢＥＲＴＹＬＩＮＫ遺伝子を含む。ＲＲ２−ラベルの指示にしたがって適用したときにラベルのグリホサート除草剤の過剰適用に対する安全性を作物に提供するＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｃｏｒｎ２形質を含む。ＹＧＣＢ−セイヨウアワノメイガ、サウスウェスタンコーンボーラー、およびサザンコーンストークボーラーに対する高レベルの抵抗性；アメリカタバコガおよび一般的なストークボーラーに対する中程度の抵抗性；およびツマジロクサヨトウに対する平均を超える抵抗性を付与するＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ遺伝子を含む。ＲＷ−ＡＧＲＩＳＵＲＥルートワーム抵抗性形質を含む。Ｑ−感受性を示すセイヨウアワノメイガ、サウスウェスタンコーンボーラー、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、モロコシマダラメイガ、サザンコーンストークボーラー、ストークボーラー、サトウキビメイガ、およびアメリカタバコガから防御するか抑制し；また、感受性を示すウェスタンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、およびメキシカンコーンルートワームに原因する幼虫被害から防御し；（１）Ｃｒｙ１Ｆタンパク質およびＣｒｙ３４ａｂ１タンパク質およびＣｒｙ３５ａｂ１タンパク質を産生するＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡ昆虫防御遺伝子、（２）ｍＣｒｙ３Ａタンパク質を産生する遺伝子を含むＡＧＲＩＳＵＲＥ ＲＷ形質、および（３）Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質を産生するＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ遺伝子を含む。
農業組成物の適用の濃度および速度
上記のように、教示される微生物を含む本開示の農業組成物は、数多くの様式で植物に適用することができる。２つの特定の態様では、本開示は、インファロー処理剤または種子処理剤を企図する。
種子処理剤の実施形態の場合、本開示の微生物は、様々な濃度で種子上に存在することができる。例えば、微生物は、１種子当たり：１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、またはそれを超えるｃｆｕ濃度で種子処理剤に見出すことができる。特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０４〜約１×１０８ｃｆｕを含む。他の特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕを含む。他の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０６ｃｆｕを含む。
合衆国では、トウモロコシ作付面積の約１０％は、１エーカー当たり約３６，０００種子を超える種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３３，０００〜３６，０００種子の種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３０，０００〜３３，０００種子の種子密度で植栽され、残りの作付面積は、様々である。ｗｗｗ．ｐｉｏｎｅｅｒ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ａｇｒｏｎｏｍｙ／ｌｉｂｒａｒｙ／ｃｏｒｎ−ｓｅｅｄｉｎｇ−ｒａｔｅ−ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ／で入手可能であるＳｔｅｖｅ Ｂｕｔｚｅｎ著「Ｃｏｒｎ Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｒａｔｅ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」を参照のこと。
下記の表２０では、企図されている種子処理剤実施形態における１種子当たりの種々のｃｆｕ濃度（行）および種々の種子作付け植栽密度（第１のカラム：１５Ｋ〜４１Ｋ）を使用して、１エーカー当たりのｃｆｕの合計量を算出しており、これが、種々の農業シナリオで使用されることになる（すなわち、１種子当たりの種子処理剤濃度×１エーカー当たりの植栽種子密度）。したがって、１種子当たり１×１０６ｃｆｕで種子処理剤を使用し、１エーカー当たり３０，０００種子を植栽する場合、１エーカー当たりの総ｃｆｕ含有量は、３×１０１０（すなわち、３０Ｋ＊１×１０６）であろう。
表２０：種子処理剤実施形態の１エーカー当たりの総ＣＦＵの計算
Figure 2021529522
Figure 2021529522
インファロー実施形態の場合、本開示の微生物は、１×１０６、３．２０×１０１０、１．６０×１０１１、３．２０×１０１１、８．０×１０１１、１．６×１０１２、３．２０×１０１２、またはそれを超える１エーカー当たりのｃｆｕ濃度で適用することができる。したがって、態様では、液体インファロー組成物は、１エーカー当たり約１×１０６〜約３×１０１２ｃｆｕの濃度で適用することができる。
いくつかの態様では、インファロー組成物は、液体製剤に含まれる。液体インファロー実施形態では、微生物は、１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、またはそれを超える１ミリリットル当たりのｃｆｕ濃度で存在していてもよい。ある特定の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０６〜約１×１０１１ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり最大約１×１０１３ｃｆｕの濃度の微生物を含む。
候補微生物のトランスクリプトームプロファイリング
本発明者らによる以前の作業には、環境窒素の存在下で活性なプロモーターを同定するために、菌株ＣＩ０１０のトランスクリプトームプロファイリングが必要であった。菌株ＣＩ０１０を、１０ｍＭグルタミンで補充された無窒素特定培地で培養した。これら培養から全ＲＮＡを抽出し（ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙキット）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）によりＲＮＡｓｅｑ配列決定に供した。配列決定リードを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓを使用してＣＩ０１０ゲノムデータにマッピングし、近位転写プロモーターの調節下で高度に発現された遺伝子を同定した。
表２１〜２３は、全ＲＮＡのＲＮＡＳｅｑ配列決定により測定された、遺伝子およびそれらの相対的発現レベルを列挙している。ｎｉｆ経路、窒素利用関連経路、または所望の発現レベルを有する他の遺伝子の変異誘発に使用するための近位プロモーターの配列を記録している。
表２１
Figure 2021529522
Figure 2021529522
 表２２
Figure 2021529522
 表２３
Figure 2021529522
 表２４−菌株の表
Figure 2021529522
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以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を示すために記載しており、いかなる様式においても本開示を制限することを意図しない。特許請求の範囲によって定義される本開示の意図の範囲内に含まれる変更および他の用途が、当業者に認識されるであろう。
実施例１：微生物リモデリング誘導−農業用微生物種の合理的改善のためのプラットフォーム
微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームの実施形態の概要の例を、図１Ａの略図中にまとめることができる。
図１Ａは、マイクロバイオームの構成要素を最初に特徴づけることができ、（例えば、適切なコロニー化特徴を有する微生物を見出すために）目的の種を同定することを示す。
目的の種の代謝をマッピングし、遺伝的特質に関連付けることができる。例えば、微生物の窒素固定経路を特徴づけることができる。特徴づけられる経路を、ある範囲の環境条件下で試験することができる。例えば、微生物がその環境における種々のレベルの外因性窒素の存在下で大気窒素を固定する能力を試験することができる。窒素の代謝は、ＡｍｔＢトランスポーターによる根圏から細菌のサイトゾル内へのアンモニア（ＮＨ４ ＋）の進入が関与し得る。アンモニアおよびＬ−グルタメート（Ｌ−Ｇｌｕ）は、グルタミン合成酵素およびＡＴＰによりグルタミンへと触媒される。グルタミンは、細菌バイオマスを形成させることができ、また、ｎｉｆオペロンの発現を阻害することができる（すなわち、グルタミンは、微生物に大気窒素（ａｔｍｏｓｔｐｈｅｒｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を固定してアンモニアを排出させたい場合の競合力であり得る）。窒素固定経路は、本明細書の前のセクションに極めて詳細に特徴づけられている。
その後、コンジュゲーションおよび組換え、化学的変異誘発、適応進化、および遺伝子編集が挙げられるが、これらに限定されない方法を使用して、標的化非属間ゲノム変更を微生物のゲノムに導入することができる。標的化非属間ゲノム変更は、ゲノムの挿入、破壊、欠失、変更、撹乱、改変などを含むことができる。
次いで、リモデリングされた基本的な遺伝子型に起因する所望の表現型を含む誘導体のリモデリングされた微生物を使用して、作物に接種する。
本開示は、一定の実施形態では、大気窒素を固定し、そのような窒素を植物に供給することができる非属間のリモデリングされた微生物を提供する。態様では、これらの非属間のリモデリングされた微生物は、外因性窒素の存在下でさえも大気窒素を固定することができる。
図１Ｂは、マイクロバイオームの測定工程の拡大図を示す。いくつかの実施形態では、本開示は、所望のコロニー化の特徴を有する微生物種を見出し、次いで、その後のリモデリングプロセスでこれらの種を利用する。
前述の微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームを、ここに、より具体的に記載するであろう。
態様では、ＧＭＲプラットフォームは、以下の工程を含む：
Ａ．単離−目的の作物の土壌、根圏、表面などから微生物を得ること；
Ｂ．特徴づけ−単離された微生物を、目的の遺伝子型／表現型（例えば、ゲノム配列、コロニー化能力、窒素固定活性、Ｐの可溶化能力、目的の代謝産物の排出、植物促進化合物の排出など）について特徴づけることを含む。
Ｃ．順化−微生物の非属間遺伝子改変のための分子プロトコールを開発すること；
Ｄ．非属間操作キャンペーンおよび最適化−重要経路の遺伝子（例えば、コロニー化関連遺伝子、窒素固定／同化遺伝子、Ｐ可溶化遺伝子）が改変された誘導体の非属間微生物菌株の生成；
Ｅ．分析−ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、ＡＲＡアッセイ）およびｉｎ ｐｌａｎｔａ（例えば、コロニー化アッセイ）の両方で目的の表現型について誘導された非属間菌株を評価すること。
Ｆ．操作キャンペーン／分析の反復−微生物菌株をさらに改善するための工程ＤおよびＥの反復。
各ＧＭＲプラットフォームプロセス工程を、ここで、以下に詳述するであろう。
Ａ．微生物の単離
１．土壌試料を得る
微生物を、土壌および／または植物の根から単離するであろう。１つの例では、植物を、小型の鉢に入れて実験室または温室で成長させるであろう。土壌試料を、種々の農業地域から得るであろう。例えば、多様なテクスチャ特徴を有する土壌（ローム（例えば、泥炭粘土ローム、砂質ローム）、粘土質の土（例えば、重粘土、シルト質粘土）、砂質土、シルト質土、泥炭土、および白亜質土などが挙げられる）を収集することができる。
２．ベイト植物の成長
ベイト植物（目的の植物）（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、雑穀、ダイズ、野菜、果実など）の種子を各土壌型に植栽するであろう。１つの例では、異なる品種のベイト植物を、種々の土壌型に植栽するであろう。例えば、目的の植物がトウモロコシである場合、異なる品種のトウモロコシ（圃場トウモロコシ、スイートコーン、ヘリテージコーンなど）の種子を、上記の種々の土壌型に植栽するであろう。
３．土壌および／または根試料の採取ならびに適切な培地上へのプレーティング
数週間（例えば、２〜４週間）成長させた後に、植物を引き抜くことによって植物を収穫するであろう。実験室／温室で植物を成長させる代わりに、目的の植物の土壌および／または根を、異なる土壌型を有する圃場から直接採取することができる。
根圏微生物および着生菌を単離するために、根の損傷を回避するために土壌を蒸留水でぬらすか、手作業で土壌を穏やかにほぐすことによって、植物を穏やかに取り出すであろう。より大きな土壌粒子が存在する場合、これらの粒子を、流れのない蒸留水に根を浸漬し、そして／または根を穏やかに振ることによって除去するであろう。根を切断し、根に固着している土壌のスラリーを、少量の蒸留水を有するプレートまたはチューブ中に根を入れ、振盪機上でプレート／チューブを穏やかに浸透するか、チューブを低速で遠心分離することによって調製するであろう。このスラリーを、上記のように処理するであろう。
内部寄生菌を単離するために、根表面の過剰な土壌を脱イオン水で除去するであろう。土壌を除去した後、植物を表面滅菌し、滅菌水で入念にすすぐであろう。洗浄された、１ｃｍ区画の根を植物から切除し、３ｍｍの鋼鉄ビーズを含有するリン酸緩衝生理食塩水に入れるであろう。Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩで溶液を激しく振とうすることにより、スラリーを生成するであろう。
土壌および／または根スラリーを、単離すべき微生物の所望の植物に有利な形質に応じた種々の方法で処理することができる。例えば、土壌および根のスラリーを希釈し、種々のタイプのスクリーニング培地上に接種して、根圏性微生物、内部寄生性微生物、着生性微生物、および他の植物連携微生物を単離することができる。例えば、所望の植物に有利な形質が窒素固定である場合、土壌／根スラリーを、無窒素培地（例えば、Ｎｆｂ寒天培地）上にプレートして、窒素固定微生物を単離するであろう。同様に、リン溶解細菌（ＰＳＢ）を単離するために、唯一のリン供給源としてリン酸カルシウムを含む培地を使用することができる。ＰＳＢは、リン酸カルシウムを溶解し、より大量のリンを同化して放出する。この反応は、植物上にハローまたは透明帯として出現し、最初のＰＳＢ単離工程として使用することができる。
４．コロニーの選別、培養物の精製、目的の遺伝子の存在についてのスクリーニング
工程Ａ３で得た微生物集団を画線して単一コロニー（純粋な培養物）を得た。純粋培養物の一部を、適切な培地（例えば、Ｒ２Ａとグリセロールの混合物）に再懸濁し、ＰＣＲ分析に供して１または複数の目的の遺伝子の存在についてスクリーニングする。例えば、窒素固定細菌（ジアゾトロフ）を同定するために、単離した微生物の精製培養物をＰＣＲ分析に供して、大気窒素の、生命体に利用可能な窒素形態への固定に関与する酵素をコードするｎｉｆ遺伝子の存在を検出することができる。
５．精製培養物の保管
単離菌株の精製培養物を、さらなる参照および分析のために、例えば、−８０℃で保存するであろう。
Ｂ．単離した微生物の特徴づけ
１．系統学的特徴づけおよび全ゲノム配列決定
単離した微生物を、系統学的特徴づけ（属および種の割り付け）のために分析し、微生物の全ゲノムを配列決定するであろう。
系統学的特徴づけのために、単離した微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡを、系統学的同一性を得るために縮重１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用して配列決定するであろう。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のリードをデータベースにマッピングして、最初に単離した微生物の属名、種名、および菌株名を割り付けるであろう。全ゲノム配列決定を、微生物に系統学的な属／種を割り付けるための最終工程として使用する。
単離した微生物の全ゲノムを配列決定して、重要経路を同定するであろう。全ゲノム配列決定のために、ゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮのＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット）を使用して単離し、総ＤＮＡライブラリーを、当該分野で公知の方法を使用して調製するであろう。全ゲノムを、当該分野で公知のハイスループット配列決定（次世代配列決定とも呼ばれる）法を使用して配列決定するであろう。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｈｅ、およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、総ＤＮＡライブラリーを調製し、全ゲノム配列決定を行うために使用することができる全ゲノム配列決定ツールを提供している。
各単離した菌株の全ゲノム配列を、アセンブリし；目的の遺伝子を同定し；注釈づけし；リモデリングのための潜在的な標的として記録するであろう。全ゲノム配列を、データベース内に保存するであろう。
２．温室における宿主植物のコロニー化についての微生物のアッセイ
単離された微生物を、温室における宿主植物のコロニー化について特徴づけるであろう。このために、所望の宿主植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、およびダイズ）の種子に、単離した微生物の培養物を個別または組み合わせて接種し、土壌に植栽するであろう。あるいは、個別または組合せの単離した微生物の培養物を、根上の土壌に直接接種することによって、宿主植物の根に適用することができる。微生物のコロニー化可能性を、例えば、以下により詳細に記載した定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を使用してアッセイするであろう。
３．小規模圃場試験における宿主植物のコロニー化についての微生物のアッセイおよびコロニー化した根試料からのＲＮＡの単離（ＣＡＴ試験）
単離した微生物を、小規模圃場試験における所望の宿主植物のコロニー化について評価するであろう。さらに、ＲＮＡをコロニー化根試料から単離して、圃場環境における菌株についてのトランスクリプトームデータを得るであろう。これらの小規模圃場試験によって圃場環境における菌株のコロニー化および転写物のデータが提供されるので、これらの試験を、本明細書中で、ＣＡＴ（コロニー化および転写物）試験と称する。
これらの試験のために、宿主植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、およびダイズ）の種子に、単離した微生物の培養物を個別または組み合わせて使用して接種し、土壌に植栽するであろう。あるいは、個別または組合せの単離した微生物の培養物を、根上の土壌に直接接種することによって、宿主植物の根に適用することができる。ＣＡＴ試験を、種々の土壌中および／または種々の温度および／または水分条件下で実施して、コロニー化可能性を評価し、種々の土壌型および環境条件における微生物のトランスクリプトームプロフィールを得ることができる。
接種された微生物（複数可）による宿主植物の根のコロニー化を、例えば、下記のｑＰＣＲ法を使用して評価するであろう。
１つのプロトコールでは、単離した微生物のコロニー化可能性を、以下の通り評価した。トウモロコシ種子を植栽した１日後に、１ｍｌの微生物の一晩培養物（ＳＯＢ培地）で、種子が位置していたまさしくそのスポットを浸した。この一晩培養物の１ｍＬは、約１０９ｃｆｕとほぼ等しく、使用されている菌株に応じて互いに３倍以内で変動した。各実生を、２．５ｍＭまたは０．２５ｍＭのいずれかの硝酸アンモニウムを補充した５０ｍＬ改変ホーグランド溶液で週３回施肥した。植栽した４週間後、ＤＮＡを抽出するために根試料を収集した。加圧水噴霧を使用して土壌残屑を洗い流した。その後、ＱＩＡＧＥＮ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒを使用して、これら組織試料をホモジナイズしてから、推奨プロトコールに従ってＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＤＮＡを抽出した。微生物のゲノムの各々の遺伝子座に特異的であるように設計した（ＮＣＢＩのＰｒｉｍｅｒ ＢＬＡＳＴを使用して）プライマーを使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５Ｐ ＲＴ−ＰＣＲを使用して、これらＤＮＡ抽出物のｑＰＣＲアッセイを実施した。
微生物のコロニー化可能性を反映する微生物のゲノムコピーの存在について定量した。微生物種の同一性を、ＰＣＲ増幅産物を配列決定することによって確認した。
さらに、ＲＮＡを、コロニー化した根および／または土壌試料から単離し、配列決定するであろう。
ＤＮＡプロフィールと異なり、ＲＮＡプロフィールは、環境条件に応じて変動する。したがって、コロニー化された根および／または土壌から単離したＲＮＡの配列決定は、根圏におけるｉｎ ｐｌａｎｔａでの遺伝子の転写活性を反映するであろう。
ＲＮＡを、コロニー化した根および／または土壌試料から異なる時点で単離して、これらの時点でのコロニー化した微生物のＲＮＡプロフィールの変化を分析することができる。
例えば、ＲＮＡを、圃場への施肥直後および圃場への施肥から数週間後にコロニー化した根および／または土壌試料から単離し、配列決定して、対応する転写プロフィールを生成することができる。
同様に、ＲＮＡ配列決定を、高リン酸塩条件下および低リン酸塩条件下で実施して、これらの条件下でどの遺伝子の転写が活性であり、または抑制されるのかを理解することができる。
トランスクリプトーム／ＲＮＡ配列決定法は、当該分野で公知である。簡潔に述べれば、総ＲＮＡを、単離した微生物の精製培養物から単離し；逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを調製し；ｃＤＮＡを、上記のハイスループット配列決定ツールを使用して配列決定するであろう。
トランスクリプトーム分析由来の配列決定のリードをゲノム配列にマッピングし、目的の遺伝子の転写プロモーターを同定することができる。
４．単離した微生物の植物に有利な活性のアッセイ
単離した微生物の植物に有利な活性を評価するであろう。
例えば、窒素固定微生物を、アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）を使用して窒素固定活性についてアッセイするか、リン溶解微生物をリン酸塩可溶化についてアッセイするであろう。目的のに任意のパラメータを利用し、そのようなパラメータに適切なアッセイを開発することができる。例えば、アッセイは、コロニー化の測定基準のための成長曲線およびインドール酢酸（ＩＡＡ）またはジベレリンのような植物ホルモンの産生のためのアッセイを含み得る。目的の任意の植物に有利な（ｐｌａｎｔ−ｂｅｎｆｉｃｉａｌ）活性についてのアッセイを開発することができる。
この工程は、目的の表現型を確認し、任意の偽陽性を排除するであろう。
５．単離した微生物由来の潜在的候補の選択
上記工程で生成したデータを使用して、さらなる開発のための微生物を選択するであろう。例えば、コロニー化可能性、植物に有利な活性、ならびに／または関連するＤＮＡおよびＲＮＡのプロフィールの所望の組合せを示す微生物を、実証およびモデリングのために選択するであろう。
Ｃ．選択した微生物の順化
選択した微生物を順化するであろう；ここで、順化は、微生物を遺伝的に追跡可能かつ同定可能な形態に変換するであろう。
１．抗生物質感受性についての試験
微生物を順化するための１つの方法は、抗生物質耐性を有する微生物に操作することである。このために、野生型微生物菌株を、種々の抗生物質に対する感受性について試験するであろう。菌株が抗生物質に耐性を示す場合、抗生物質は、菌株をリモデリングするための遺伝的ツール／ベクターで用いるための良好な候補であり得る。
２．ベクターの設計および構築
選択した微生物（宿主微生物）を順化するための、複製に条件を有するベクター（例えば、自殺プラスミド）を構築するであろう。例えば、適切な抗生物質耐性マーカー、対抗選択マーカー、ドナー微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の維持のための複製起点、蛍光によって挿入についてスクリーニングするための蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、およびＣＦＰなど）をコードする遺伝子、宿主微生物へのコンジュゲーションのための移入起点、および所望の遺伝子変異を有する宿主ゲノムに対するホモロジーアームを含むポリヌクレオチド配列を含む自殺プラスミドを構築するであろう。ベクターは、ＳｃｅＩ部位および他のさらなるエレメントを含んでよい。
例示的な抗生物質耐性マーカーとしては、アンピシリン耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー、エリスロマイシン耐性マーカー、ストレプトマイシン耐性マーカー、スペクチノマイシン耐性マーカーなどが挙げられる。例示的な対抗選択マーカーとしては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｌａｃＹ、ｇａｔａ−１、ｃｃｄＢなどが挙げられる。
３．ドナー微生物の生成
１つのプロトコールでは、適切な抗生物質耐性マーカー、対抗選択マーカー、ｐｉｒ複製開始遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＴ１８の保持のためのλｐｉｒ 複製起点、蛍光によって挿入についてスクリーニングするための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、宿主微生物へのコンジュゲーションのための移入起点、および所望の遺伝子変異を有する宿主ゲノムに対するホモロジーアームを含むポリヌクレオチド配列（例えば、非相同の位置への挿入のための微生物自体のゲノム内部のプロモーター）を含む自殺プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ１８（アミノレブリン酸ＡＬＡの栄養要求株）に形質転換して、ドナー微生物を生成するであろう。
４．ドナー微生物の宿主微生物との混合
ドナー微生物を宿主微生物（工程Ｂ５由来の選択した候補微生物）と混合して、宿主ゲノムにプラスミドをコンジュゲーションによって組み込むであろう。ドナー微生物と宿主微生物の混合物を、抗生物質を含むが、ＡＬＡを含まない培地にプレートするであろう。自殺プラスミドは、ドナー微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ１８）中で複製することができるが、宿主中では複製できない。したがって、ドナー微生物および宿主微生物を含む混合物を、抗生物質を含むが、ＡＬＡを含まない培地にプレートする場合、ゲノムにプラスミドを組み込んだ宿主細胞のみが、培地上で増殖し、コロニーを形成することができるであろう。ドナー微生物は、ＡＬＡが存在しないと増殖しないであろう。
５．ベクター組み込みの確認
宿主微生物の意図する遺伝子座への蛍光タンパク質マーカー、抗生物質耐性マーカー、対抗選択マーカーなどを含む自殺プラスミドの適切な組み込みを、プレート上のコロニーの蛍光およびコロニーＰＣＲの使用によって確認するであろう。
６．画線による組み込みコロニーの確認
宿主微生物における第２ラウンドの相同組換えでは、プラスミドバックボーンをループアウト（除去）し、それにより、ある特定の割合の宿主微生物の宿主ゲノムに組み込まれた所望の遺伝子変異（例えば、非相同の位置への挿入のための微生物自体のゲノム内部のプロモーター）が残される一方で、ある特定の割合の宿主微生物が野生型に戻るであろう。
プラスミドバックボーンがループアウトされている（したがって、対抗選択マーカーがループアウトされている）宿主微生物のコロニーを、適切な培地上でコロニーを増殖させることによって選択することができる。
例えば、ｓａｃＢを対抗選択マーカーとして使用する場合、プラスミドバックボーンの喪失に起因するこのマーカーの喪失を、スクロースを含む培地上でコロニーを増殖させることによって試験するであろう（ｓａｃＢはスクロース感受性を付与する）。この培地上で増殖するコロニーは、ｓａｃＢマーカーおよびプラスミドバックボーンを喪失しており、所望の遺伝子変異を含むか、野生型に戻っているであろう。または、これらのコロニーは、蛍光タンパク質マーカーの喪失に起因して、プレート上で蛍光を発しないであろう。
いくつかの分離株では、ｓａｃＢまたは他の対抗選択マーカーは、スクロースに対する完全な感受性または他の対抗選択機序を付与せず、首尾の良いループアウトを単離するために多数のコロニーをスクリーニングする必要がある。これらの場合、宿主細胞内で独立して複製し、組み込まれた自殺プラスミドバックボーン中の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｃｅＩ）を発現する「ヘルパープラスミド」の使用によってループアウトを補助してもよい。自殺プラスミドが組み込まれた菌株を、抗生物質耐性マーカー、宿主菌株と適合する複製起点、および制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターによって調節されるヘルパープラスミドで形質転換する。制限エンドヌクレアーゼによって組み込まれたプラスミドバックボーン中に誘導された二本鎖分解物は、相同組換えを促進して自殺プラスミドをループアウトする。これにより、対抗選択プレート上でのコロニーのループアウト数が増加し、所望の変異を含むコロニーを見出すためにスクリーニングを必要とするコロニー数が減少する。次いで、プラスミドを抗生物質選択することなく培養および連続継代することによって菌株からヘルパープラスミドが除去される。継代培養物を単一コロニーについて画線し、コロニーを選別し、ヘルパープラスミドの選択のために使用された抗生物質に対する感受性について、コロニーＰＣＲによって確認されたプラスミドの非存在についてもスクリーニングする。最後に、ゲノムを配列決定し、ヘルパープラスミドＤＮＡの非存在を、Ｄ６に記載のように確認する。
７．コロニーＰＣＲによる遺伝子変異の組み込みの確認
スクロース含有培地（または使用した対抗選択マーカー（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｄ）に応じた他の適切な培地）上でより良好に増殖したコロニーを選別し、意図する遺伝子座での遺伝子変異の存在を、コロニーＰＣＲを使用したコロニーのスクリーニングによって確認するであろう。
この実施例は、微生物の順化および微生物への遺伝子変異の導入のための１つのプロトコールを記載しているが、当業者は、当該分野で公知の種々の他の技術（ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発、飽和変異誘発、断片シャフリング変異誘発、相同組換え、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）、化学的変異誘発、およびこれらの組合せなど）を使用して、選択した微生物に遺伝子変異を導入することができることを理解するであろう。
８．工程Ｃ２〜Ｃ７の反復
工程Ｃ２〜Ｃ７のうちのいずれかが意図する結果を提供することができない場合、宿主微生物への所望の遺伝子変異およびマーカーの組み込みを容易にするための異なるエレメントを含み得る代替ベクターが設計されるように前述の工程を繰り返すであろう。
９．標準操作手順（ＳＯＰ）の創出
所与の菌株について工程Ｃ２〜Ｃ７を一貫して再現できる時点で、前述の工程を使用して、前述の菌株およびベクターのための標準操作手順（ＳＯＰ）を創出するであろう。このＳＯＰを使用して、微生物の他の植物に有益な形質を改善することができる。
Ｄ．非属間操作キャンペーンおよび最適化
１．最適化のための遺伝子標的の同定
選択した微生物を、植物に有利な活性の性能が改善されるように操作／リモデリングするであろう。このために、植物に有利な活性を改善するための遺伝子標的を同定するであろう。
遺伝子標的を、種々の方法で同定することができる。例えば、単離した微生物の全ゲノム配列決定から遺伝子を注釈づける一方で、目的の遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子を、文献検索によって同定することができる。例えば、窒素固定に関与する遺伝子は、文献中で公知である。これらの公知の遺伝子を、遺伝子変異の導入のための標的として使用することができる。遺伝子標的を、工程Ｂ３（コロニー化のための小規模圃場試験）で得たＲＮＡ配列決定データに基づくか、以下の工程に記載のＲＮＡ配列決定の実施によって同定することもできる。
２．プロモーター交換のためのプロモーターの選択
植物に有利な活性の改善に望ましい遺伝子変異は、標的遺伝子のネイティブプロモーターを、微生物のゲノム内部のより強力であるか、より弱いプロモーター（ネイティブプロモーターと比較した場合）、または制御が異なるプロモーター（例えば、Ｎ独立性）と置換するプロモーター交換を含むことができる。標的遺伝子が発現すると植物に有利な活性が増大する場合（例えば、発現すると微生物における窒素固定を増強するｎｉｆＡ）、プロモーター交換に望ましいプロモーターは、（標的遺伝子のネイティブプロモーターと比較して）強力なプロモーターであり、ネイティブプロモーターと比較して標的遺伝子の発現レベルをさらに増大させるであろう。標的遺伝子が発現すると植物に有利な活性が減少する場合（例えば、窒素固定を下方制御するｎｉｆＬ）、プロモーター交換に望ましいプロモーターは、（標的遺伝子のネイティブプロモーターと比較して）弱いプロモーターであり、ネイティブプロモーターと比較して標的遺伝子の発現レベルを実質的に低下させるであろう。プロモーターを遺伝子に挿入して、遺伝子発現を「ノックアウト」することができると同時に、下流遺伝子の発現を上方制御することができる。
プロモーター交換のためのプロモーターを、ＲＮＡ配列決定データに基づいて選択することができる。例えば、ＲＮＡ配列決定データを使用して、強いプロモーターおよび弱いプロモーター（すなわち、構成性に活性なプロモーター対誘導性プロモーター）を同定することができる。
例えば、窒素固定経路における強いプロモーターおよび弱いプロモーター（すなわち、構成性に活性なプロモーター対誘導性プロモーター）を同定するために、選択した微生物を、窒素枯渇条件および窒素充足条件下にてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し；微生物のＲＮＡを、これらの培養物から単離し；配列決定するであろう。
１つのプロトコールでは、窒素枯渇条件および窒素充足条件下での微生物のＲＮＡプロフィールを比較し、所望の転写レベルを有する活性プロモーターを同定するであろう。これらのプロモーターを、弱いプロモーターを交換するように選択することができる。
プロモーターを、宿主植物根圏におけるｉｎ ｐｌａｎｔａでの微生物のＲＮＡプロフィールを反映する工程Ｂ３で得たＲＮＡ配列決定データを使用して選択することもできる。
種々の条件下でのＲＮＡ配列決定により、以下のプロモーターの選択が可能である：ａ）施肥圃場条件における宿主植物の成長周期中に根圏で活性なプロモーター、ｂ）関連ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件においても活性であるので、迅速にスクリーニングすることができるプロモーター。
例示的プロトコールでは、コロニー化アッセイ（例えば、工程Ｂ３）由来のｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡ配列決定データを使用して、単離した微生物における遺伝子の発現レベルを測定する。１つの実施形態では、遺伝子発現レベルを、１００万のマッピングされたリードあたりのキロベースあたりのリード（ＲＰＫＭ）として計算する。種々の遺伝子の発現レベルを標的遺伝子の発現レベルと比較し、標的遺伝子と比較して最高または最低の発現レベルを示す種々の遺伝子と関連する少なくとも上位１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０のプロモーターを、プロモーター交換の有力な候補として選択する。したがって、標的遺伝子のと比較して種々の遺伝子の発現レベルを観察し、次いで、標的（または標準）遺伝子と比較して発現の増加を実証している遺伝子を選択し、前述の遺伝子に関連するプロモーターを見出す。
例えば、標的遺伝子がｎｉｆＡの上方制御である場合、ｎｉｆＡと比較して最高レベルの発現を示す遺伝子の最初の１０、２０、３０、４０、５０、または６０のプロモーターを、プロモーター交換の有力候補として選択する。
これらの候補を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ配列決定データに基づいてさらに絞り込むことができる。例えば、標的遺伝子としてのｎｉｆＡについて、ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡ配列決定データに基づいて選択したプロモーターの有力候補を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの窒素枯渇条件対窒素充足条件下でｎｉｆＡと比較して遺伝子発現レベルが類似するか増大したプロモーターを選択することによって、さらに選択する。
この工程で選択されたプロモーターセットを使用して、標的遺伝子のネイティブプロモーター（例えば、ｎｉｆＡ）を交換する。交換されたプロモーターを有するリモデリングされた菌株を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで試験し；活性が予想より低い菌株を排除し；予想される活性を有するか、活性が予想より高い菌株を圃場で試験する。プロモーター選択サイクルを、リモデリングされた菌株に対して繰り返して、その植物に有利な活性をさらに改善することができる。
窒素固定形質を改善するためにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株ＣＩ１３７由来のｉｎ ｐｌａｎｔａおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ配列決定データに基づいて実施した例示的なプロモーター交換試験をここに記載する。ＣＩ１３７を、０ｍＭおよび５ｍＭのグルタミン濃度でのＡＲＡアッセイで分析し、ＲＮＡをこれらのＡＲＡ試料から抽出した。ＲＮＡをＮｅｘｔＳｅｑによって配列決定し、１つの試料由来のリードのサブセットをＣＩ１３７ゲノムにマッピングした（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ配列決定データ）。ＣＩ１３７についてのコロニー化および活性アッセイ（例えば、工程Ｂ３）においてＶ５期のトウモロコシ植物の根からＲＮＡを抽出した。６つの植物由来の試料をプールし；プールした試料由来のＲＮＡを、ＮｅｘｔＳｅｑを使用して配列決定し、リードをＣＩ１３７ゲノム（ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡ配列決定データ）にマッピングした。２×１０８個の総リードのうち、７×１０４リードをＣＩ１３７にマッピングした。ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡ配列決定データを使用して、ｉｎ ｐｌａｎｔａでの発現レベル順に遺伝子を順位付けし、発現レベルをネイティブｎｉｆＡ発現レベルと比較した。ネイティブｎｉｆＡ発現レベルと比較して（遺伝子発現に基づいて）最高の発現レベルを示した最初の４０プロモーターを選択した。これらの４０プロモーターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ配列決定データに基づいてさらに絞り込み、ｎｉｆＡと比較してｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルが増加したか類似するプロモーターを選択した。プロモーターの最終リストは１７プロモーターを含んでおり、ほとんどのプロモーターの２バージョンを使用してプロモーター交換変異体を生成した；したがって、合計で３０プロモーターを試験した。ｎｉｆＬが部分的または完全に欠失し、３０プロモーターが挿入された一連のＣＩ１３７変異体（ΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ）の生成を試みた。３０変異体のうち２８変異体が首尾よく生成された。ΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ変異体を、０ｍＭおよび５ｍＭのグルタミン濃度でのＡＲＡアッセイで分析し、ＲＮＡをこれらのＡＲＡ試料から抽出した。いくつかの変異体は、予想されるＡＲＡ活性またはＷＴ ＣＩ１３７菌株と比較して低いＡＲＡ活性を示した。予想より高いＡＲＡ活性を示した変異体は少数であった。
当業者は、上記の実施例から、ｉｎ ｐｌａｎｔａおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ配列決定データを使用してプロモーター交換用のプロモーターを選択することができる一方で、プロモーター選択工程が全く予測不可能であり、多くの課題を抱えていることを認識するであろう。
例えば、ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡ配列決定は、主に、高発現の遺伝子を明らかにする；しかしながら、遺伝子発現の軽微な相違および／または発現レベルの低い遺伝子を検出することは困難である。例えば、いくつかのｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡ配列決定試験では、微生物ゲノム由来の約５０００個の遺伝子からたった約４０個の遺伝子しか検出しなかった。したがって、ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡ配列決定技術は、大量に発現された遺伝子およびその対応するプロモーターを同定するのに有用である；しかしながら、この技術は、低発現遺伝子および対応するプロモーターならびに遺伝子発現間の小さな相違を同定するのは困難である。
さらに、ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＲＮＡプロフィールは、微生物が単離された時点の遺伝子の状態を反映する；しかしながら、圃場条件の僅かな変化が、根圏性／着生性／内部寄生性微生物のＲＮＡプロフィールを実質的に変化させ得る。したがって、リモデリングされた菌株をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび圃場で試験したときに、１つの圃場試験のＲＮＡ配列決定データに基づいて選択されたプロモーターが、標的遺伝子を所望のレベルで発現させるかどうかを事前に予想することは困難である。
さらに、ｉｎ ｐｌａｎｔａ評価は、多大な時間および資源を必要とする；したがって、ｉｎ ｐｌａｎｔａ実験を、頻繁に実施し、そして／または迅速または容易に繰り返すことはできない。他方では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ配列決定は比較的迅速かつ容易に実施することができるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件は圃場条件を模倣しておらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高活性を示し得るプロモーターはｉｎ ｐｌａｎｔａで類似の活性を示さない可能性がある。
さらに、プロモーターは、新規の状況で予想通りに挙動しないことが多い。したがって、ｉｎ ｐｌａｎｔａおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ配列決定データは、せいぜいプロモーターセクションでの出発点としては役立ち得る；しかしながら、圃場で標的遺伝子を所望のレベルで発現させる任意の特定のプロモーターに行き着くことは、いくつかの例では、予想不可能である。
プロモーターセクションの工程における別の制限は、利用可能なプロモーターの数である。本発明の目的の１つが非トランスジェニック微生物を提供することであるので；プロモーター交換のためのプロモーターを、微生物のゲノム内部、すなわち、属内部から選択する必要がある。したがって、トランスジェニック手法と異なり、本プロセスは、論文に記載することができないだけでなく、異なる宿主生物由来の十分に特徴づけられたトランスジェニックプロモーターを見出す／使用することもできない。
別の制約は、プロモーターが所望の成長期にｉｎ ｐｌａｎｔａで活性でなければならないことである。例えば、植物において窒素が最も必要であるのは、一般に、成長期間の後期（例えば、栄養成長の後期および生殖成長の初期）である。例えば、トウモロコシでは、窒素取り込みは、Ｖ６期（第６葉期）からＲ１（生殖成長期１）期の間が最も高い。したがって、トウモロコシのＶ６期からＲ１期の間の窒素利用を増加させるために、リモデリングされた微生物は、トウモロコシ生活環のこれらの期間に最も高い窒素固定活性を示さなければならない。したがって、トウモロコシの栄養成長の後期および生殖成長の初期の間にｉｎ ｐｌａｎｔａで活性なプロモーターを選択する必要がある。この制約は、プロモーター交換で試験することができるプロモーター数が減少するだけでなく、プロモーター選択工程を予測不可能にする。上記で考察されるように、理由の一部として、小規模圃場試験（例えば、工程Ｂ３）由来のＲＮＡ配列決定データを使用して、所望の成長期にｉｎ ｐｌａｎｔａで活性なプロモーターを同定することができるが、ＲＮＡデータは試料採取時の圃場条件（例えば、土壌のタイプ、土壌中の水レベル、利用可能な窒素レベルなど）に基づくことにより、予測不可能になる。当業者が理解するように、圃場条件は、同一圃場内で経時的に変化し得、また、種々の圃場で実質的に変化し得る。したがって、ある圃場条件下で選択したプロモーターは、別の圃場条件下で予想通りに挙動しない場合がある。同様に、選択したプロモーターは、交換後に予想通りに挙動しない場合がある。したがって、選択したプロモーターが目的の植物の所望の成長期にｉｎ ｐｌａｎｔａで活性であるかどうかを事前に予測することは困難である。
３．非属間遺伝子変異の設計
工程Ｄ１（遺伝子標的の同定）およびＤ２（プロモーター交換のためのプロモーターの同定）に基づいて、非属間遺伝子変異を設計するであろう。
用語「非属間」は、宿主に導入されるべき遺伝子変異が宿主の属外由来の核酸配列を含まない（すなわち、トランスジェニックＤＮＡが存在しない）ことを示す。宿主微生物に遺伝子変異を導入するためにベクターおよび／または他の遺伝子ツールが使用されるにもかかわらず、本開示の方法は、宿主微生物に導入されたバックボーンベクター配列または他の遺伝子ツールをループアウト（除去）して、宿主ゲノム内に所望の遺伝子変異のみが残される工程を含む。したがって、得られた微生物は非トランスジェニックである。
例示的な非属間遺伝子変異としては、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を改善し得る目的の遺伝子の変異；目的の遺伝子の発現を増加させるために目的の遺伝子の内因性プロモーターと置換することができる構成性に活性なプロモーター；目的の遺伝子を不活化する変異；および非相同の位置への宿主ゲノム内部由来のプロモーターの挿入（例えば、ある遺伝子を不活化し、下流遺伝子を下方制御する、前述の遺伝子へのプロモーターの挿入）などが挙げられる。変異は、点変異、挿入、および／または欠失（遺伝子の完全な欠失または部分的な欠失）であり得る。例えば、１つのプロトコールでは、宿主微生物の窒素固定活性を改善するために、所望の遺伝子変異は、ｎｉｆＬ遺伝子（窒素固定経路の負の制御因子）の変異を不活化することを含み、そして／またはｎｉｆＨ遺伝子の内因性プロモーター（大気窒素を固定するための重要な反応を触媒するニトロゲナーゼ鉄タンパク質）を、ｎｉｆＨ遺伝子発現を構成性に駆動する構成性に活性なプロモーターと置換することを含み得る。
４．非属間誘導体菌株の生成
非属間遺伝子変異の設計後、工程Ｃ２〜Ｃ７を実施して、非属間誘導体菌株（すなわち、リモデリングされた微生物）を生成するであろう。
５．リモデリングされた微生物の精製培養物の保管
リモデリングされた微生物の精製培養物を、下記の全ゲノム配列決定のためにｇＤＮＡを抽出することができるようにバンクに保存するであろう。
６．所望の遺伝子変異の存在の確認
リモデリングされた微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、前述の方法を使用してゲノムＤＮＡに対して全ゲノム配列決定を行うであろう。得られたリードを、ＬＩＭＳに以前に保存したリードにマッピングして、以下を確認するであろう：ａ）所望の遺伝子変異の存在、およびｂ）リモデリングされた微生物を生成するために使用したベクター配列（例えば、プラスミドバックボーンまたはヘルパープラスミド配列）にマッピングされたリードが完全に存在しないこと。
この工程は、ベクターバックボーン（例えば、自殺プラスミド）ループアウト法後に菌株に残存し得る非宿主属のＤＮＡ（トランスジェニックＤＮＡ）を高感度に検出可能であり、遺伝子変異などの偶発性のオフターゲット挿入を調節することができる。
Ｅ．リモデリングされた微生物の分析
１．植物に有利な活性の分析
リモデリングされた微生物の植物に有利な活性および成長速度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価するであろう。
例えば、窒素固定機能の改善のためにリモデリングされた菌株を、アセチレン還元アッセイ、アンモニウム排出アッセイなどによって窒素固定活性および適応度について評価するであろう。
リン酸塩可溶化の改善のためにリモデリングされた菌株を、リン酸塩可溶化活性について評価するであろう。
この工程により、リモデリングされた菌株を目的の表現型についてミディアムスループットからハイスループットで迅速にスクリーニング可能である。
２．コロニー化および変化した遺伝子の転写の分析
リモデリングされた菌株を、Ｂ３に記載の工程を使用して、温室または圃場のいずれかで宿主植物のコロニー化について評価するであろう。さらに、ＲＮＡを、コロニー化した根および／または土壌試料から単離し、配列決定して標的遺伝子の転写活性を分析するであろう。標的遺伝子は、導入された遺伝子変異を含む遺伝子を含み、微生物の植物に有益な形質で役割を果たす他の遺伝子も含んでよい。
例えば、遺伝子（ｎｉｆ遺伝子）のクラスターは、微生物の窒素固定活性を調節する。上記のプロトコールを使用して、遺伝子変異を、ｎｉｆ遺伝子のうちの１つに導入することができ（例えば、プロモーター挿入）、それに対して、ｎｉｆクラスター中の他の遺伝子は、内因性形態である（すなわち、これらの遺伝子配列および／またはプロモーター領域は変化しない）。ＲＮＡ配列決定データを、遺伝子変異を含むｎｉｆ遺伝子の転写活性について分析し、また、直接変化していない他のｎｉｆ遺伝子について、挿入された遺伝子の変化によって分析することもできるが、導入遺伝子の変化に影響を受け得る。
この工程は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで上位の菌株の根圏における適応度を決定可能であり、変化した遺伝子の転写活性をｉｎ ｐｌａｎｔａで測定可能である。
Ｆ．操作キャンペーン／分析の反復
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析およびｉｎ ｐｌａｎｔａ分析（工程Ｅ１およびＥ２）由来のデータを使用して、有利な変異の掛け合わせを反復するであろう。
さらに、上記の工程Ａ〜Ｅを繰り返して、微生物の植物に有利な形質を微調整することができる。例えば、第１ラウンドで、モデリングした微生物菌株を使用して植物に接種し；数週間成長させた後に収穫し；土壌および／または植物の根由来の微生物を単離するであろう。植物に有利な活性およびコロニー化可能性が改善された微生物を選択するために、単離した微生物の機能活性（植物に有利な形質およびコロニー化可能性）ならびにＤＮＡおよびＲＮＡプロフィールを特徴づけるであろう。選択した微生物を、植物に有利な活性がさらに改善されるようにリモデリングするであろう。リモデリングされた微生物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｐｌａｎｔａで機能活性（植物に有利な形質およびコロニー化可能性）およびＲＮＡプロフィールについてスクリーニングし、上位の菌株を選択するであろう。必要に応じて、工程Ａ〜Ｅを繰り返して、第２ラウンド由来のリモデリングされた微生物の植物に有利な活性をさらに改善することができる。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるラウンド数でプロセスを繰り返すことができる。
上記工程の例を、以下の表Ａに要約する。
表Ａ−微生物リモデリング誘導プラットフォームの実施形態の概要
Figure 2021529522
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農業用の生物製剤を作出するための伝統的な手法は、その方法に固有の欠点がある
野生型（ＷＴ）微生物の純粋なバイオプロスペクティングやトランスジェニック手法と異なり、ＧＭＲは、微生物内の重要な制御ネットワークを非属間で遺伝的に最適化可能であり、それにより、ＷＴ微生物より植物に有益な表現型が改善されるが、トランスジェニック手法に関連するリスク（例えば、予測不可能な遺伝子機能、公的および規制上の懸念）を持たない。教示したＧＭＲプラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「伝統的なバイオプロスペクティング」手法の描写については、図１Ｃを参照のこと。
農業用微生物の他の開発方法は、圃場規模では失敗することが多い大規模な研究室での開発、または根底にある機序／植物−微生物相互作用の理解のない大規模な温室試験もしくは「フィールドファースト」試験のいずれかに注目している。教示したＧＭＲプラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「バイオプロスペクティングへのフィールドファースト手法」システムの描写については、図１Ｄを参照のこと。
ＧＭＲプラットフォームは、これらの問題を多数の方法で解決する
ＧＭＲプラットフォームの強みの１つは、標的作物にとって鍵となる生理学的に重要な時期に活性であり、特定の農業的に関連する環境条件下でも活性である活性プロモーターの同定である。
説明されてきたように、窒素固定状況において、ＧＭＲプラットフォームは、高外因性窒素の環境条件下で活性な微生物プロモーター配列を同定することができ、それにより、リモデリングされた微生物は、現代農業の条植え作物条件下および標的作物が窒素固定を最も必要とするときに大気窒素を固定し、窒素を送達することが可能である。トウモロコシの成長周期中の植物が窒素を最も必要とする時点の描写については、図１Ｅを参照のこと。教示したＧＭＲプラットフォームは、窒素が必要とされる時期に窒素をトウモロコシ植物に供給し、また、土壌環境において外因性窒素が存在する場合でさえもそのような窒素を送達するリモデリングされた微生物を作出することができる。
これらのプロモーターを、根圏ＲＮＡ配列決定および微生物ゲノム配列へのリードのマッピングによって同定することができ、重要経路を、植物の成長周期の重要な時期にオンまたはオフされるように「再プログラミング」することができる。さらに、最適化された微生物の全ゲノム配列決定および事前に形質転換された配列へのマッピングにより、本方法は、プラスミドＤＮＡのオフターゲット挿入（ＰＣＲまたは抗生物質耐性などによって検出されない低レベルのプラスミドの保持）によるトランスジェニック配列の圃場への偶発的放出を確実になくすことができる。
ＧＭＲプラットフォームは、実験室および植物環境において微生物を反復して評価し、それにより、実験室条件のみよりもむしろ温室および圃場条件において頑強な微生物を得ることによって、これらの手法を組み合わせている。
教示のＧＭＲプラットフォームの種々の態様および実施形態を、図１Ｆ〜１Ｉに見出すことができる。ＧＭＲプラットフォームは、植物に有益な性質（例えば、窒素固定）を保有するリモデリングされた微生物を誘導／作出／産生する。
伝統的なバイオプロスペクティング法は、前述の性質を有する微生物を産生することができない。
窒素固定のためにリモデリングされた微生物の性質
窒素固定のための微生物リモデリングの文脈では、リモデリングされた微生物が所有し得る性質はいくつか存在する。例えば、図１Ｊは、本開示のリモデリングされた微生物が所有することができる５つの性質を示す。
さらに、実施例２に見られるように、本発明者らは、ＧＭＲプラットフォームを利用して、環境中に外因性窒素が存在する条件下でさえも、大気窒素を固定し、前述の窒素をトウモロコシ植物に送達することができるリモデリングされた非属間細菌（すなわち、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ）を産生した。リモデリングプロセスが、首尾よく、（１）内因性窒素制御からｎｉｆＡ発現を分離し；（２）固定された窒素の同化および排出を改善したことを示す図１Ｋ〜Ｍを参照のこと。
これらのリモデリングされた微生物は、最終的に、トウモロコシ作物に適用したときにトウモロコシの収穫高を改善する。図１Ｎを参照のこと。
ＧＭＲプラットフォームは、窒素の固定および送達への手法を提供し、環境負荷懸念を解決する
前に説明した通り、工業的ハーバー・ボッシュ法によって生産された窒素肥料は、標的作物によって十分に利用されない。雨、流出、熱、揮発、および土壌マイクロバイオームが散布した化学肥料を分解する。これは浪費に等しいだけでなく、収穫高と引き換えに汚染を増大させる。この目的のために、国際連合の算出によると、作物が肥料を利用できる前にほぼ８０％の肥料が喪失される。したがって、現代の農業用肥料の生産および送達は、環境に有害なだけでなく、極めて非効率である。施肥不足の圃場、過剰に施肥された圃場、および環境に有害な窒素流出をもたらす現在の窒素送達システムの非効率さを示す図１Ｏを参照のこと。
このＧＭＲプラットフォームおよび得られるリモデリングされた微生物は、窒素の固定および植物への送達への良好な手法を提供する。以下の実施例に認められるように、本開示の非属間のリモデリングされた微生物は、トウモロコシ植物の根にコロニー化し、外因性窒素の存在下でさえも、固定化した大気窒素を前述のトウモロコシ植物に強制的に供給することができる。教示のＧＭＲプラットフォームによって可能なこの窒素の固定および送達システムは、現代の農業をより環境上持続可能なシステムに変換するのに役立つであろう。
実施例２：微生物リモデリング誘導−窒素固定を合理的に改善するための例示的な実施形態
多様な窒素固定細菌を、農業土壌を含む自然界に見出すことができる。しかしながら、作物に十分な窒素を提供して肥料使用の減少を可能にする微生物の能力は、施肥土壌ではニトロゲナーゼ遺伝子が抑制されること、ならびに作物根と緊密に連携する存在量が低いことにより制限される場合がある。重要な商品作物と緊密に連携する微生物の同定、単離、および品種改良は、窒素感知および窒素固定を関連付ける制御ネットワークを破壊または改善させ、作物に連携する微生物による著しい窒素寄与を開放する可能性がある。この目的のため、トウモロコシの根系と連携し、コロニー化する窒素固定微生物を同定した。この工程は、図１Ａおよび図１Ｂに示した「マイクロバイオーム組成を測定する」に対応する。
農学的に関連する土壌で栽培されたトウモロコシ植物の根試料を収集し、根圏および内圏から微生物集団を抽出した。これらの試料からゲノムＤＮＡを抽出し、その後１６Ｓアンプリコンを配列決定して、共同体組成をプロファイリングした。
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ微生物（菌株ＰＢＣ６．１）を単離し、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび全ゲノム配列決定により分類した。これは、根連携微生物叢のほぼ２１％の存在量までコロニー化することができる特に興味深い窒素固定菌である（図２）。外因性窒素に対する菌株感受性を評価するため、純粋培養での窒素固定割合を、古典的アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）で、グルタミン添加補充レベルを変えて測定した。この種は、無窒素培地にて高レベルの窒素固定活性を示したが、外因性固定窒素は、ｎｉｆ遺伝子発現およびニトロゲナーゼ活性を抑制した（菌株ＰＢＣ６．１、図３Ｃ、図３Ｄ）。加えて、窒素固定条件で増殖したＰＢＣ６．１の上清に放出されたアンモニアを測定したところ、非常に少量の固定窒素放出しか検出することができなかった（図３Ｅ）。
本発明者らは、ＰＢＣ６．１が、固定窒素の存在下で最適なニトロゲナーゼ発現およびアンモニア放出を可能にするように窒素代謝を調節する制御ネットワークをリモデリングすれば、施肥圃場において固定窒素の重要な寄与菌になり得ると仮定した。
導入遺伝子または合成制御エレメントを挿入せずに（非属間様式での基礎遺伝子アーキテクチャーのリモデリングの結果として）幅広い表現型リモデリングを可能にするためには、十分な遺伝的多様性が、ＰＢＣ６．１ゲノム内に存在しなければならない。単離された菌株は、少なくとも５．４Ｍｂｐのゲノムおよび標準的窒素固定遺伝子クラスターを有する。ＰＢＣ６．１の関連窒素代謝経路は、窒素固定のモデル生物であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ｍ５ａｌの窒素代謝経路に類似している。
特に、高い外因性固定窒素濃度において、窒素固定およびその後の宿主植物への移入を増大させることができるいくつかの遺伝子制御ネットワーク連結点を同定した（図３Ａ）。ｎｉｆＬＡオペロンは、ＮｉｆＡによる転写活性化ならびにＮｉｆＬによるＮｉｆＡの窒素および酸素依存性抑制を介してｎｉｆクラスターの残りを直接的に制御する。ｎｉｆＬの破壊は、酸素および外因性固定窒素の両方の存在下でＮｉｆＡの阻害を消失させ、ｎｉｆ発現を改善させることができる。さらに、窒素非依存性プロモーターの調節下でのｎｉｆＡの発現は、ニトロゲナーゼ生合成を、ＮｔｒＢ／ＮｔｒＣ窒素感知複合体による制御から切り離すことができる。
微生物による、グルタミン合成酵素（ＧＳ）による固定窒素のグルタミンへの同化は、２ドメインアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴａｓｅ）酵素ＧｌｎＥによって、ＧＳのアデニリル化および脱アデニル化を介して活性をそれぞれ減弱および回復させることにより可逆的に制御される。ＧｌｎＥタンパク質を短縮してそのアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠失させると、グルタミン合成酵素が構成性にアデニリル化され、それにより、微生物によるアンモニア同化を制限し、細胞内および細胞外アンモニアを増加させることができる。
最後に、アンモニア取込みを担うトランスポーターであるＡｍｔＢの発現を低下させると、細胞外アンモニアを増加させることができる。
導入遺伝子を使用せずに合理的に設計された微生物表現型を生成するために、以下の２つの手法を用いて、微生物の基礎遺伝子アーキテクチャーをリモデリングした：（１）タンパク質ドメインをコードするゲノム配列または全ゲノムのマーカー無し欠失を作出すること、および（２）ゲノム内プロモーター再編成により制御ネットワークを書き換えること。
反復リモデリングプロセスにより、ＰＢＣ６．１のいくつかの非トランスジェニック誘導体菌株を生成した（表２５）。
表２５．この研究で使用した単離された誘導体Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉ菌株のリスト。Ｐｒｍ、ＰＢＣ６．１ゲノムに由来するプロモーター配列；ΔｇｌｎＥＡＲ１およびΔｇｌｎＥＡＲ２、アデニリル除去ドメイン配列を除去したｇｌｎＥ遺伝子の異なる短縮型。
Figure 2021529522
いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、誘導体菌株の特定の表現型を特徴付けた。ＡＲＡを使用して、外因性窒素に対する菌株感受性を評価し、ここで、ＰＢＣ６．１は、高グルタミン濃度でニトロゲナーゼ活性の抑制を示した（図３Ｄ）。対照的に、ほとんどの誘導体菌株は、抑制解除された表現型を示し、高グルタミン濃度で観察されたアセチレン還元のレベルは様々であった。ｑＰＣＲにより分析した試料中のｎｉｆＡ転写速度は、アセチレン還元速度と良好に相関し（図４）、ｎｉｆＬ破壊およびｎｉｆＡを駆動する窒素非依存性プロモーターの挿入が、ｎｉｆクラスター抑制解除に結び付き得るという仮説が支持された。
変更されたＧｌｎＥまたはＡｍｔＢ活性を有する菌株は、野生型またはこれらの変異を有していない誘導体菌株と比較して、顕著に増加したアンモニウム排出速度を示し（図３Ｅ）、アンモニアの同化および再取込みに対するこれらの遺伝子型の効果が示された。
２つの実験を実施して、ＰＢＣ６．１誘導体（リモデリングされた微生物）とトウモロコシ植物との相互作用を研究し、植物組織内への固定窒素の組込みを定量化した。まず、微生物窒素固定の割合を、温室研究にて同位体トレーサーを使用して定量化した。簡潔に述べれば、植物を１５Ｎ標識肥料を用いて栽培し、植物組織における１５Ｎの希釈濃度は、微生物からの固定窒素の寄与を示す。トウモロコシ実生に、選択された微生物菌株を接種し、植物をＶ６成長段階まで栽培した。その後、植物を解体して、微生物コロニー化および遺伝子発現の測定、ならびに同位体比質量分析法（ＩＲＭＳ）による植物組織中の１５Ｎ／１４Ｎ比の測定を可能にした。地上部分組織の分析は、植物窒素レベルに対するＰＢＣ６．３８の寄与が少なく有意ではなく、ＰＢＣ６．９４の寄与は有意であった（ｐ＝０．０１１）ことを示した。地上トウモロコシ葉に見出された窒素のおよそ２０％が、ＰＢＣ６．９４により産生され、残りは種子、ポッティングミックス、または他の土壌伝播性微生物による「バックグラウンド」固定に由来していた（図５Ｃ）。これは、本発明者らの微生物品種改良およびリモデリングのパイプラインが、窒素肥料の存在下で植物に対して著しい窒素寄与を行うことが可能なリモデリングされた菌株を生成することができることを示す。植物組織内での微生物転写を測定し、ｎｉｆ遺伝子クラスターの発現は、リモデリングされた誘導体菌株では観察されたが、野生型菌株では観察されず（図５Ｂ）、ＢＮＦが施肥条件で作物に寄与するためには、ｎｉｆ抑制解除が重要であることが示された。ｑＰＣＲにより測定された根コロニー化は、コロニー化密度が、試験した菌株の各々で異なることを実証した（図５Ａ）。ＰＢＣ６．３８とＰＢＣ６．９４との間には、コロニー化に５０倍の差があることが観察された。この差異は、ＰＢＣ６．９４が、高レベルの固定および排出の結果として、ＰＢＣ６．３８よりも根圏での適応度が低減されたことを示すものであり得る。
方法
培地
最少培地は、２５ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．１ｇのＣａＣＬ２−２Ｈ２Ｏ、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＮａＣ１、２．９ｍｇのＦｅＣｌ３、０．２５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および２０ｇのスクロースを含む（１リットル当たり）。増殖培地は、１リットル当たり５０ｍｌの２００ｍＭグルタミンを補足した最少培地であると規定される。
ジアゾトロフの単離
トウモロコシ実生を、２２℃（夜間）から２６℃（日中）までに制御された温室環境で種子（ＤＫＣ ６６−４０，ＤｅＫａｌｂ，ＩＬ）から２週間成長させ、Ｓａｎ Ｊｏａｑｕｉｎ Ｃｏｕｎｔｙ、ＣＡから収集された土壌中で１６時間光サイクルに曝露した。根を収穫し、無菌脱イオン水で洗浄して、バルク土壌を除去した。根組織を、ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ，Ｑｉａｇｅｎ Ｐ／Ｎ ８５３００）で２ｍｍステンレス鋼ビーズを用いて、設定３０で３分間ホモジナイズし、試料を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、組織を根連携細菌から分離した。上清を、２つの画分に分割し、１つを１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコン配列決定によるマイクロバイオームの特徴付けに使用し、残りの画分を希釈し、１．５％寒天を補足した無窒素ブロス（ＮｆＢ）培地にプレーティングした。プレートを、３０℃で５〜７日間にわたってインキュベートした。出現したコロニーを、ｎｉｆＨ遺伝子の存在に関して、プライマーＵｅｄａ１９ｆおよびＵｅｄａ４０６ｒを用いたコロニーＰＣＲにより試験した。ｎｉｆＨコロニーＰＣＲが陽性である菌株からゲノムＤＮＡを単離し（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，カタログ番号５１３０６，ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、配列決定した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｖ３，ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）。配列を組み立てて注釈を付けた後、窒素固定遺伝子クラスターを含む分離株を、下流研究に使用した。
単離実生のマイクロバイオームプロファイリング
ゲノムＤＮＡを、ＺＲ−９６ゲノムＤＮＡ Ｉキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ／Ｎ Ｄ３０１１）を使用して根連携細菌から単離し、７９９ｆおよび１１１４ｒを標的とするｎｅｘｔｅｒａバーコード付きプライマーを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンを生成した。アンプリコンライブラリーを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｖ３プラットフォーム（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で配列決定した。読取りは、Ｋｒａｋｅｎを使用し、ｍｉｎｉｋｒａｋｅｎデータベースを使用して、分類学的に分類した（図２）。
アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）
アセチレン還元アッセイの変法を使用して、純粋培養条件におけるニトロゲナーゼ活性を測定した。菌株を、ＳＯＢ（ＲＰＩ，Ｐ／Ｎ Ｓ２５０４０−１０００）中で２４時間３０℃にて２００ＲＰＭで振盪して単一のコロニーから増殖させ、その後１：２５で増殖培地にて継代培養し、２４時間にわたって好気的に増殖させた（３０℃、２００ＲＰＭ）。その後、１ｍｌの最少培地培養物を、気密性Ｈｕｎｇａｔｅチューブ中の０〜１０ｍＭグルタミンを補足した４ｍｌの最少培地に添加し、４時間にわたって嫌気的に増殖させた（３０℃、２００ＲＰＭ）。１０％ヘッドスペースを取り出し、その後注射により等容積のアセチレンと入れ替え、１時間にわたってインキュベーションを継続した。続いて、２ｍｌのヘッドスペースを気密シリンジで取り出し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ６８５０ガスクロマトグラフを使用して、エチレン産生を定量化した。
アンモニウム排出アッセイ
アンモニア形態の固定窒素の排出を、嫌気性バイオリアクターでのバッチ発酵を使用して測定した。菌株を、９６ウェルＤｅｅｐＷｅｌｌプレートの１ｍｌ／ウェルＳＯＢで単一コロニーから増殖させた。プレートを、３０℃にて２４時間２００ＲＰＭで振盪してインキュベートし、その後１ｍｌ／ウェルの増殖培地を含む新たなプレートに１：２５希釈した。細胞を、２４時間（３０℃、２００ＲＰＭ）でインキュベートし、その後、最少培地を含む新たなプレートに１：１０希釈した。プレートを、＞９８．５％窒素、１．２〜１．５％水素、および＜３０ｐｐＭ酸素の混合気体を有する嫌気性チャンバーに移し、室温で６６〜７０時間にわたって１３５０ＲＰＭでインキュベートした。初期培養バイオマスを、５９０ｎｍの光学濃度を測定することにより最終バイオマスと比較した。その後、細胞を遠心分離により分離し、リアクターブロスの上清を、Ｍｅｇａｚｙｍｅアンモニアアッセイキット（Ｐ／Ｎ Ｋ−ＡＭＩＡＲ）を使用して、遊離アンモニアについてアッセイし、各時点でバイオマスに対して正規化した。
根連携マイクロバイオームの抽出
根を穏やかに振って、固着していない粒子を除去し、根系を分離し、ＲＮＡ安定化溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ ＡＭ７０２１）に３０分間浸漬した。その後、根を、無菌脱イオン水で手短にすすいだ。試料を、ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ、Ｑｉａｇｅｎ Ｐ／Ｎ ８５３００）で１／２インチステンレス鋼ボールベアリングを用いたビーズビーティングを使用して２ｍｌの溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ Ｐ／Ｎ ７９２１６）中でホモジナイズした。ＺＲ−９６ Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ／Ｎ Ｄ３０１０）を用いてゲノムＤＮＡ抽出を実施し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｐ／Ｎ ７４１０４）を使用してＲＮＡ抽出を実施した。
根コロニー化アッセイ
植栽４日後に、１ｍｌの細菌一晩培養物（およそ１０９ｃｆｕ）を、植栽した種子の上方の土壌に適用した。実生に、０．５ｍＭ硝酸アンモニウムを補足した２５ｍｌの改変Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液を週３回施肥した。植栽４週間後に、根試料を収集し、全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。根コロニー化を、野生型または誘導体菌株ゲノムのいずれかの固有領域を増幅するように設計されたプライマーによるｑＰＣＲを使用して定量化した。ＱＰＣＲ反応効率を、標的ゲノムに由来する既知量のｇＤＮＡから生成された標準曲線を使用して測定した。データを、組織重量および抽出容積を使用して、生重量１ｇ当たりのゲノムコピー数に対して正規化した。各実験で、コロニー化数を未処理対照実生と比較した。
Ｉｎ Ｐｌａｎｔａ トランスクリプトミクス
根連携微生物の転写プロファイリングを、成長させた実生で測定し、根コロニー化アッセイに記載されているように処理した。精製ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用して配列決定した。読取りを、「−−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｌｏｃａｌ」パラメータおよび最低アラインメントスコア３０を使用したｂｏｗｔｉｅ２を使用して、接種した菌株のゲノムにマッピングした。ゲノムにわたる網羅範囲を、ｓａｍｔｏｏｌｓを使用して算出した。網羅範囲の差異を、ハウスキーピング遺伝子発現に対して正規化し、Ｃｉｒｃｏｓを使用してゲノムにわたって、およびＤＮＡｐｌｏｔｌｉｂを使用してｎｉｆ遺伝子クラスターにわたって視覚化した。加えて、ｉｎ ｐｌａｎｔａ転写プロファイルを、標的化Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析により定量化した。精製ＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｓｐｒｉｎｔ（Ｃｏｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で処理した。
１５Ｎ希釈温室研究
１５Ｎ肥料希釈実験を実施して、最適化菌株活性をｉｎ ｐｌａｎｔａで評価した。最小限のバックグラウンドＮを含む植栽媒体を、バーミキュライトおよび水洗砂（ＤＩ Ｈ２Ｏで５回リンスした）の混合物を使用して調製した。砂混合物を、１２２℃で１時間オートクレーブし、およそ６００ｇを４０立方インチ（６５６ｍＬ）のポットに量り取り、それを無菌ＤＩ Ｈ２Ｏで飽和させ、植栽前に２４時間排水させた。トウモロコシ種子（ＤＫＣ６６−４０）を、０．６２５％次亜塩素酸ナトリウム中で１０分間表面滅菌し、その後、滅菌蒸留水で５回リンスし、１ｃｍの深さに植栽した。植物を、平均して２２℃（夜間）〜２６℃（日中）の室温にて１６時間日長で４週間にわたって蛍光灯下で維持した。
植栽５日後、１ｍｌの細胞懸濁物を出現しつつある子葉鞘に直接浸して、実生に接種した。接種物は、ＳＯＢでの５ｍｌ一晩培養物から調製した。一晩培養物を遠沈し、５ｍｌのＰＢＳに２回再懸濁して、残留ＳＯＢを除去してから、最終的に１．０のＯＤに希釈した（およそ１０９ＣＦＵ／ｍｌ）。対照植物を、無菌ＰＢＳで処理し、各処理物（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を１０個の重複植物に適用した。
植栽の５、９、１４、および１９日後に２％１５Ｎ富化２ｍＭ ＫＮＯ３を含む２５ｍｌ肥料溶液を植物に施肥し、植栽の７、１２、１６、および１８日後にＫＮＯ３を含まない同じ溶液で施肥した。肥料溶液は、３ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ ＫＨ２ＰＯ４、２ｍｍｏｌ ＭｇＳＯ４、１７．９μｍｏｌ ＦｅＳＯ４、２．８６ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｍｇ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２２ｍｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５１μｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１２ｍｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および０．１４ｎｍｏｌ ＮｉＣｌ２を含んでいた（１リットル当たり）。ポットは全て、必要に応じて無菌ＤＩ Ｈ２Ｏで灌水して、流出のない一貫した土壌水分を維持した。
４週間で植物を収穫し、最も低い節で分離して、根ｇＤＮＡおよびＲＮＡ抽出ならびにＩＲＭＳ用地上部分組織の試料とした。地上部分組織を、必要に応じて拭いて砂を除去し、全体を紙袋に入れ、６０℃で少なくとも７２時間乾燥させた。完全に乾燥したら、全地上部分組織をビーズビーティングでホモジナイズし、ＭＢＬ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｔｈｅ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ，ＭＡ）が、５〜７ｍｇの試料を、δ１５Ｎの同位体比質量分析法（ＩＲＭＳ）で分析した。ＮＤＦＡパーセントは下記式を使用して算出した：％ＮＤＦＡ＝（ＵＴＣのδ１５Ｎの平均−試料のδ１５Ｎ）／（ＵＴＣのδ１５Ｎの平均）×１００。
実施例３：本開示のリモデリングされた微生物による圃場試験−２０１６年夏
様々な窒素レジメ下におけるトウモロコシ成長および生産性に対する本開示のリモデリングされた菌株の有効性を評価するため、圃場試験を実施した。
試験は、（１）６つの菌株＋対照の７つのサブプロット処理で実施した−４つの主プロットは、現地検証された０、１５、８５、および１００％の対窒素最大収益（ＭＲＴＮ）を含んでいた。対照（ＵＴＣのみ）は、１０個の１００％ＭＲＴＮ＋５、１０、または１５ポンドで実施した。処理は、４つの反復物を有していた。
トウモロコシのプロット（最小）は、長さ３０フィートの４条であり、１栽培地当たり１２４プロットであった。観察は全て、プロットの中央２条から得、破壊的試料採取は全て、外側の条から得た。種子試料は、使用前の１．５〜２時間まで冷蔵した。
現地農作業：種子は、従来の殺真菌剤および殺虫剤処理をしていない市販トウモロコシであった。種子処理剤は全て、均一性を担保するために１人の種子処理専門家により適用された。植栽日付、播種割合、雑草／昆虫管理などは、現地農作業に従った。殺真菌剤適用を除いて、標準的管理実務に従った。
土壌特徴付け：土性および土壌肥沃度を評価した。各反復物の土壌試料を予め植栽して、５０ｌｂ／Ａｃよりも低い残留硝酸塩レベルを保証した。０ｃｍから３０ｃｍまでの土壌コアを採取した。土壌を、ｐＨ、ＣＥＣ、ＫおよびＰの総量についてさらに特徴付けた。
評価：初期植物集団を、１４日の植栽後日数（ＤＡＰ）／エーカーで評価し、さらに以下について評価した：（１）活力（１〜１０のスケール、Ｗ／１０＝優秀）１４ＤＡＰおよびＶ１０；（２）プロットに症状が明らかになった際は常に病害ランクを記録する；（３）プロットに倒伏が生じた場合は、倒伏のあらゆる差異を記録する；（４）標準的水分率に調整された収穫高（Ｂｕ／エーカー）；（５）重量を試験する；および（６）穀物水分率。
試料採取要件：３つの時点（試験開始前、Ｖ１０〜ＶＴ、収穫１週後）で土壌を試料採取した。６つの栽培地全ておよびプロット全てを、１試料当たり１０グラムで試料採取した（１２４プロット×３時点×６栽培地）。
コロニー化試料採取：コロニー化試料を、５つの栽培地では２つの時点（Ｖ１０およびＶＴ）で、および６つの時点（Ｖ４、Ｖ８、Ｖ１０、ＶＴ、Ｒ５、および収穫後）で収集した。試料は、以下のように収集した：（１）０％〜１００％ＭＲＴＮは、１栽培地当たり６０プロット；（２）外側の条から無作為に選択された１プロット当たり４つの植物；（３）５グラムの根、８インチの茎、および上部３枚の葉。袋詰めし、各々に個別に識別子を割り当て、１プロット当たり１２／袋；（４）５つの栽培地（６０プロット×２時点×１２袋／プロット）；および１つの栽培地（６０プロット×６時点×１２袋／プロット）。
正規化差植生指数（ＮＤＶＩ）を、２つの時点（Ｖ４〜Ｖ６およびＶＴ）にて、Ｇｒｅｅｎｓｅｅｋｅｒ機器を使用して決定した。６つの栽培地全てで各プロットを評価した（１２４プロット×２時点×６栽培地）。
最も良好に処理差異を示した１つの栽培地の根分析を、Ｗｉｎ Ｒｈｉｚｏを用いて実施した。１プロット当たり１０個の植物を、無作為に試料採取し（各外側条の隣接する５個；Ｖ３〜Ｖ４段階の植物が好ましかった）、穏やかに洗浄して、できるだけ合理的に泥を除去した。１０個の根をビニール袋に入れ、ラベルを付けた。ＷｉｎＲｈｉｚｏ Ｒｏｏｔ Ａｎａｌｙｓｉｓで分析した。
６箇所の栽培地全てにおいてＲ２〜Ｒ５の茎の特徴を測定した。１プロット当たり１０個の植物の６インチの高さの茎直径を記録し、６インチマークよりも上方の最初の節間の高さも記録した。１０個の植物をモニタリングした；２つの内側条の中央から連続５個の植物。６箇所の栽培地を評価した（１２４プロット×２測定×６栽培地）。
組織硝酸塩を、全てのプロットおよび全ての栽培地で分析した。トウモロコシがブラックレイヤーを形成した１〜３週後に、土壌の上方６インチから始まる茎の８インチ区画の葉鞘を取り出した。全ての栽培地およびプロットを評価した（６栽培地×１２４プロット）。
以下の天候データを、植栽から収穫までの全ての栽培地で記録した：１日の最高および最低温度、播種時の土壌温度、１日の降雨量＋灌水（該当する場合）、ならびに過度の雨、風、低温、または高温などのあらゆる異常気象。
６箇所の栽培値全てにわたる収穫高データを表２６に示す。窒素比率は、収穫高に有意な影響を示したが、菌株はどの窒素比率でも影響を示さなかった。しかしながら、最低の窒素比率では、菌株ＣＩ００６、ＣＭ０２９、およびＣＩ０１９は、ＵＴＣよりも数的に４〜６ｂｕ／エーカーだけ収穫高が高かった。また、菌株ＣＭ０２９、ＣＩ０１９、およびＣＭ０８１による収穫高は、１５％ＭＲＴＮでは、２〜４ｂｕ／エーカーだけ数的に増加した。
表２６：６箇所の栽培地全体にわたる収穫高データ
Figure 2021529522
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別の分析手法を表２７に示す。この表には、窒素に対する応答が最も大きかった４箇所の栽培地が含まれており、窒素に対する応答が最も大きかったことは、利用可能な残留窒素が最も低かったことを示唆する。この手法は、窒素比率が収穫高に有意な影響を及ぼし、菌株は全ての窒素比率にわたって平均すると影響を及ぼさなかったという評価を変更しない。しかしながら、全ての菌株では、Ｎ比率が最も低い場合に数値的収穫高がより顕著に有利であり、特にＣＩ００６、ＣＭ０２９、およびＣＭ０２９／ＣＭ０８１では、収穫高が８から１０ｂｕ／エーカーまで増加した。１５％ＭＲＴＮでは、菌株ＣＭ０８１は、収穫高がＵＴＣよりも５ｂｕだけ多かった。
表２７：４箇所の栽培地にわたる収穫高データ
４箇所の栽培地平均−ＳＧＳ、ＡｇＩｄｅａ、Ｂｅｎｎｅｔｔ、ＲＦＲ
Figure 2021529522
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また、圃場試験の結果を、図９〜１５に示す。結果は、本開示の微生物が、植物収穫高を増加させることができることを示しており、これは、教示される微生物が、重要な農業作物、すなわちトウモロコシ中で窒素固定を増加させることができることを示している。
圃場に基づく結果から、選択された微生物菌株のゲノムを非属間的に改変して、前述の操作された菌株を作物に適用した場合に圃場設定にて農業的に関連する結果を得るのに開示の方法が有効であることがさらに確認される。
図６は、菌株ＣＩ００６（ＷＴ Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ）に由来する改変菌株の系統を示す。圃場データは、ＣＩ００６ ＷＴ菌株の操作された誘導体、すなわちＣＭ０２９が、圃場設定にて数的に関連する結果をもたらすことができることを実証している。例えば、表２６は、ＣＭ０２９が、０％ＭＲＴＮでは、１４１．２ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４７．０ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（５．８ｂｕ／エーカーの増加）。また、表２６は、ＣＭ０２９が、１５％ＭＲＴＮでは、１６５．１ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６７．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（２．２ｂｕ／エーカーの増加）。表２７は、これらの結果を支持し、ＣＭ０２９が、０％ＭＲＴＮでは、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４０．７ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（８．８ｂｕ／エーカーの増加）。また、表２７は、ＣＭ０２９が、１５％ＭＲＴＮでは、１６１．３ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６４．１ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（２．８ｂｕ／エーカーの増加）。
図７は、菌株ＣＩ０１９（ＷＴ Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ）に由来する改変菌株の系統を示す。圃場データは、ＣＩ０１９ ＷＴ菌株の操作された誘導体、すなわちＣＭ０８１が、圃場設定にて数的に関連する結果をもたらすことができることを実証している。例えば、表２６は、ＣＭ０８１が、１５％ＭＲＴＮでは、１６５．１ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６９．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（４．２ｂｕ／エーカーの増加）。表２７は、これらの結果を支持し、ＣＭ０８１が、０％ＭＲＴＮでは、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１３６．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（４．４ｂｕ／エーカーの増加）。また、表２７は、ＣＭ０８１が、１５％ＭＲＴＮでは、１６１．３ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６６．８ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（５．５ｂｕ／エーカーの増加）。
さらに、表２７では、ＣＭ０２９／ＣＭ０８１の組合せが、０％ＭＲＴＮにて、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４１．４ｂｕ／エーカーの収穫高であったこと（９．５ｂｕ／エーカーの増加）を理解することができる。
実施例４：本開示のリモデリングされた微生物による圃場試験−２０１７年夏
様々な窒素レジメ下におけるトウモロコシ成長および生産性に対する本開示のリモデリングされた菌株の有効性を評価するため、圃場試験を実施した。下記の圃場データは、本開示の非属間微生物が、大気窒素を固定し、前述の窒素を植物に送達し、窒素制限環境ならびに非窒素制限環境の両方で収穫高の増加をもたらすことができることを実証している。
試験は、合衆国の７箇所の栽培地で実施し、６箇所は、地理的に多様な米国中西部の栽培地であった。肥料処理には５つの窒素レジメを使用した：サイト／地域の標準農作業の１００％、１００％−２５ポンド、１００％−５０ポンド、１００％−７５ポンド、および０％；全て１エーカー当たり。１００％レジメの１エーカー当たりの窒素のポンド数は、サイト／地域の標準農作業に依存した。前述の窒素レジメは、１エーカー当たり約１５３ポンドから１エーカー当たり約１８０ポンドまでの範囲であり、平均で１エーカー当たり約１６４ポンドの窒素であった。
各肥料レジメ内には、１４の処理を行った。各レジメでは、６つの反復物を有し、分割プロットデザインを使用した。以下の１４の処理が含まれていた：１２の異なる微生物、主プロットと同じ肥料割合の１つのＵＴＣ、および１００％の窒素を有する１つのＵＴＣ。１００％窒素レジメでは、第２のＵＴＣは、１００＋２５ポンドである。
トウモロコシのプロットは、最低で、長さ３０フィートの４条であり（条間は３０インチ）、１栽培地当たり４２０プロットであった。観察は全て、別様の記載がない限り、植物の中央２条から得、破壊的試料採取は全て、外側の条から得た。種子試料は、使用前の１．５〜２時間まで冷蔵した。
現地農作業：種子は、市販の種子処理剤が適用された市販のトウモロコシであり、生物学的な同時適用を受けていなかった。播種比率、植栽日時、雑草／昆虫管理、収穫時期、および他の標準的管理実務は、殺真菌剤適用（必要な場合）を除き、その地域の現地農作業の基準に従った。
微生物適用：微生物を、通常の化学処理を既に受けた種子への種子処理において、種子に適用した。微生物を含む発酵ブロスで種子をコーティングした。
土壌特徴付け：土性および土壌肥沃度を評価した。標準的な土壌試料採取手順を使用し、試料は、０〜３０ｃｍおよび３０〜６０ｃｍの深さの土壌コアを含んでいた。標準的な土壌試料採取は、硝酸性窒素、アンモニウム窒素、総窒素、有機物、およびＣＥＣの決定を含んでいた。標準的な土壌試料採取は、ｐＨ、総カリウム量、および総亜リン酸量の決定をさらに含んでいた。窒素肥料レベルを決定するため、０〜１２インチ、可能であれば１２インチから２４インチの土壌領域が硝酸性窒素用に確実に採取されるように、各栽培地の植栽前土壌試料を採取した。
植栽および施肥前に、２ｍｌの土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１反復物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。（５つの肥料レジメ×６反復物＝３０個の土壌試料）。
植栽後（Ｖ４〜Ｖ６）、２ｍｌ土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１反復物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。（５つの肥料レジメ×６反復物＝３０個の土壌試料）。
収穫後（Ｖ４〜Ｖ６）、２ｍｌ土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１反復物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。追加の収穫後土壌試料を、ＵＴＣの０〜１２インチから、および潜在的にＵＴＣの１２〜２４インチから収集した（５つの肥料レジメ×６反復物＝３０個の土壌試料）。
全ての肥料レジメで０〜１２インチおよび１２〜２４インチのＶ６〜Ｖ１０土壌試料を各肥料レジメから得た（１００％および１００％＋２５ｌｂの処理を除く［１００％ブロック］）。（５つの肥料レジメ×２つの深さ＝１栽培地当たり１０個の試料）。
全ての肥料レジメで０〜１２インチおよび１２〜２４インチの収穫後土壌試料を、各肥料レジメから得た（１００％および１００％＋２５ｌｂの処理を除く［１００％ブロック］）。（５つの肥料レジメ×２つの深さ＝１栽培地当たり１０個の試料）。
評価：初期植物集団を、約５０％ＵＴＣで評価し、最終植物集団を、収穫前に評価した。評価は、（１）可能であれば温度（温度プローブ）；（２）Ｖ４およびＶ８〜Ｖ１０での活力（１〜１０のスケール、１０＝優秀）；（３）Ｖ８〜Ｖ１０およびＶ１４での植物丈；（４）標準水分率に調整された収穫高（ブッシェル／エーカー）；（５）重量の試験；（６）穀物水分率；（７）ブラックレイヤーでの茎硝酸塩試験（４２０プロット×７栽培地）；（８）Ｖ４〜Ｖ６における０％および１００％肥料のジップロック（登録商標）袋中の１プロット当たり１植物のコロニー化（１植物×１４処理×６反復物×２肥料レジメ＝１６８植物）；（９）Ｖ４〜Ｖ６における０％および１００％肥料のジップロック（登録商標）袋中の１プロット当たり１植物のトランスクリプトミクス（１植物×１４処理×６反復物×２肥料レジメ＝１６８植物）；（１０）Ｇｒｅｅｎｓｅｅｋｅｒ機器を使用して２時点（Ｖ４〜Ｖ６およびＶＴ）で７箇所の栽培地全ての各プロットを評価するための正規化差植生指数（ＮＤＶＩ）または正規化差レッドエッジ（ＮＤＲＥ）の決定（４２０プロット×２時点×７栽培地＝５，８８０データポイント）；（１１）１０植物／プロットの６インチの高さの茎直径を記録し、６インチマークよりも上方の最初の節間の長さを記録し、１０植物（２つの内側条の中央からの連続５つの植物）をモニターすることにより、７箇所の栽培地全てにてＲ２〜Ｒ５で測定した茎特徴（４２０プロット×１０植物×７栽培地＝２９，４００データポイント）を含んでいた。
モニタリングスケジュール：Ｖ３〜Ｖ４の段階で実施者が全ての試験地を訪れて、処理に対する初期季節応答を評価し、生殖成長段階中に成熟度をモニタリングした。現地協力者が、継続的に研究試験地を訪れた。
天候情報：植栽から収穫までにわたって天候データを収集した。天候データは、１日最低および最高温度；播種時の土壌温度；１日の降雨量＋灌水（該当する場合）；ならびに過度の風、雨、低温、高温などの異常な気象事象で構成されていた。
データ報告：上記に示されているデータを含めて、圃場試験は、土性；条間隔；プロットサイズ；灌水；耕うん；以前の作物；播種比率；植物集団；供給源、割合、タイミング、および配置を含む季節性の肥料投入；収穫面積、手作業または機械などによる収穫方法、ならびに使用される測定ツール（秤、収穫高モニターなど）を含むデータポイントを生成した。
結果：前述の圃場試験の選択された結果を、図１６および図１７に報告している。
図１６では、本開示の微生物（すなわち、６−４０３）が、野生型菌株（ＷＴ）よりも高い収穫高をもたらし、未処理対照（ＵＴＣ）よりも高い収穫高をもたらしたことがわかる。「−２５ｌｂ Ｎ」処理では、その地域の標準的農作業よりも１エーカー当たり２５ｌｂ少ないＮが使用される。「１００％Ｎ」ＵＴＣ処理は、その地域の標準的農作業を示すことが意図されており、Ｎの標準的使用の１００％が、農業従事者により配置される。微生物「６−４０３」は、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託され、表１に見出すことができる。これは変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ（ＣＭ０３７とも呼ばれる）であり、ＣＩ００６ ＷＴに由来する後代変異体菌株である。
図１７では、得られた収穫高の結果は、本開示のリモデリングされた微生物が、栽培地全体にわたって一貫して性能を発揮することを実証している。さらに、収穫高の結果は、本開示の微生物が、窒素ストレス環境（すなわち、窒素制限環境）ならびに十分な窒素供給を有する環境（すなわち、非窒素制限条件）の両方で良好な性能を発揮することを実証している。微生物「６−８８１」（ＣＭ０９４、ＰＢＣ６．９４としても知られている）は、ＣＩ００６ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３４」は、ＣＩ１３７ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３６」は、ＣＩ１３７ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「６−４０４」（ＣＭ３８、ＰＢＣ６．３８としても知られている）は、ＣＩ００６ ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託され、表１に見出すことができる。
実施例５：農業システムに有益な非属間のリモデリングされた微生物の属
本開示のリモデリングされた微生物を、一季節にわたって１エーカーで産生された窒素産生量について、相互に評価および比較した。図８、図２４、および図２５を参照のこと。
本発明者らは、操作された非属間微生物の集団が現代の条植え作物の農業システムに有益であるためには、微生物の集団は、１季節当たり１エーカー当たり少なくとも１ポンドまたはそれを超える窒素を産生する必要があるという仮説を立てている。
そのためには、本発明者らは、驚くべきことに、とりわけ、非マメ科作物の収穫高の増加；および／または外因性窒素の適用の際の農業従事者への依存の低減；および／または非窒素制限環境下でさえも、１季節当たり１エーカー当たり少なくとも１ポンドの窒素を産生する能力に寄与することができる機能的な微生物の属を発見した。前述の属は、コロニー化能力×１時間当たり１微生物当たりのＮ産生量（ｍｍｏｌ）の積により規定される（すなわち、図８、２４、および２５の分割線）。
図８、２４、および２５に関して、本開示の微生物を使用したある特定のデータを、本開示の微生物により１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示すために集計した。そられは、窒素／微生物−時間のｍｍｏｌにより、生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録されている。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドを超える窒素を送達する微生物である。
圃場データおよび野生型コロニー化ヒートマップ：図８のヒートマップに使用されている微生物を、トウモロコシでのＮ産生についてアッセイした。ＷＴ菌株ＣＩ００６およびＣＩ０１９の場合、トウモロコシ根コロニー化データは、単一の圃場現場から得た。残りの菌株の場合、コロニー化は、ＷＴ圃場レベルと同じであると仮定した。Ｎ固定活性は、５ｍＭグルタミンでのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＲＡアッセイを使用して決定した。図８のヒートマップの下にある表は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ Ｎ／微生物 時間）を示している。
圃場データヒートマップ：図２４のヒートマップに使用されているデータは、圃場条件におけるトウモロコシでのＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の圃場現場からのトウモロコシ根コロニー化データを使用した、微生物により産生されたｌｂ Ｎ／エーカーを表わす。Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ Ｎでのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＲＡアッセイを使用して決定した。下記の表２８は、図２４のヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ Ｎ／微生物 時間）を示している。
温室および実験室データヒートマップ：図２５のヒートマップに使用されているデータは、実験室および温室条件におけるトウモロコシでのＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の菌株により産生されたｌｂ Ｎ／エーカーを表わす。白色点は、トウモロコシ根コロニー化データが温室条件で収集された菌株を表わす。黒色点は、トウモロコシ根コロニー化レベルが、野生型親菌株の平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルから導き出されている変異体菌株を表わす。斜線付き点は、平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルの野生型親菌株を表わす。全ての場合で、Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ Ｎでのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＲＡアッセイにより決定した。下記の表２９は、図２５のヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ Ｎ／微生物 時間）を示す。
表２８：図２４−圃場データヒートマップ
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 表２９：図２５−温室および実験室データヒートマップ
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結論：図８、２４、２５ならびに表２８および２９のデータは、記載されている属の１ダースを超える代表的なメンバーを示す（すなわち、図中の線の右側の微生物）。さらに、これら多数の代表的なメンバーは、多様な一連の分類学的属に由来し、それらは、上記の表２８および２９に見出すことができる。またさらに、本発明者らは、微生物の多くに見出される構造／機能関連性を示す多数の遺伝子属性を発見した。これらの遺伝子関連性は、本発明者らにより導入された遺伝子改変（窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに少なくとも１つの遺伝子変異を導入することが挙げられる）を示す本開示の多数の表に見出すことができる。
したがって、新たに発見された属は、（１）ロバストなデータセット、（２）１ダースを超える代表的なメンバー、（３）多様な分類学的属に由来するメンバー、および（４）属メンバーの基本的な遺伝子アーキテクチャーにおいて構造／機能関連性を規定する遺伝子改変のクラスにより支持される。
実施例６：非属間のリモデリングされた微生物を検出するための方法およびアッセイ
本開示は、種々の前述の実施例で使用された微生物の検出に有用なプライマー、プローブ、およびアッセイを教示する。アッセイは、誘導／変異非属間リモデリング微生物の非天然ヌクレオチド「ジャンクション」配列を検出することができる。これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを、微生物における特定の遺伝子変更の存在を示す特徴のタイプとして使用することができる。
本技法は、固有に設計されたプライマーおよびプローブを含む特化した定量的ＰＣＲ法を使用することにより、これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを検出することができる。プローブは、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合し得る。すなわち、プローブがその相補的配列とハイブリダイゼーションした後でのみ検出が可能である蛍光レポーターで標識されているオリゴヌクレオチドで構成される配列特異的ＤＮＡプローブを使用することができる。この定量的な方法では、天然に存在しないヌクレオチドジャンクションのみが、教示されるプライマーにより増幅されることになり、結果的に、非特異的色素または特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用のいずれかにより検出することができることが保証され得る。この方法の別の態様は、プライマーがジャンクション配列のいずれかの側に隣接するようにプライマーを選択することであり、したがって、増幅反応が生じる場合、前述のジャンクション配列が存在する。
したがって、ゲノムＤＮＡを試料から抽出し、ｑＰＣＲの使用により本開示の微生物の存在を定量化するために使用することができる。ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、野生型ゲノムの固有領域または操作された非属間変異体菌株の固有領域を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）により設計されたプライマーであり得る。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ１１７６２１００）キットを使用し、順方向および逆方向増幅プライマーのみを使用して実施することができ、あるいは、Ｋａｐａ Ｐｒｏｂｅ Ｆｏｒｃｅキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ＫＫ４３０１）を、増幅プライマー、ならびに５’末端のＦＡＭ色素標識、内部ＺＥＮクエンチャー、ならびに３’末端の副溝結合剤および蛍光クエンチャーを含むＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて使用してもよい。
ある特定のプライマー、プローブ、および非天然ジャンクション配列（ｑＰＣＲ法で使用することができる）は、下記の表３０に列挙されている。具体的には、ノンネイティブジャンクション配列は、配列番号３７２〜４０５および４２５〜４３０に見出すことができる。
表３０：微生物検出
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 表３１：リモデリングされた非属間微生物
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 表３２：リモデリングされた非属間微生物
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実施例７：複数の表現型形質の合理的な改善のための微生物リモデリング誘導キャンペーン
この実施例では、実施例１に記載の工程Ａ〜Ｆを使用して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ野生型（ＷＴ）菌株ＣＩ１３７のいくつかの非トランスジェニック誘導体菌株を生成した。第１に、実施例１の工程Ａ〜Ｃに記載の手法を使用して、ＷＴ菌株ＣＩ１３７を、根圏から単離し、特徴づけ、および順化した。
次いで、実施例１の工程Ｄ〜Ｆに記載の手法を使用して、ＣＩ１３７の複数の表現型形質は、導入遺伝子を使用せずに合理的に改善された。例えば、ＷＴ菌株の窒素固定形質を改善することができるかどうかを試験するために、本出願の至る所に記載の窒素固定に関与する種々の遺伝子を、非属間変異を操作するために標的にし、操作された／リモデリングされた微生物を窒素固定について分析し、さらなる改善によって窒素固定能を得ることができるかどうかを試験するために操作および分析工程を反復した。ＣＩ１３７のリモデリングされた菌株について窒素固定能が実質的に改善された時点で、微生物をコロニー化形質について評価した。窒素固定が改善されたリモデリングされた菌株がＷＴ菌株よりコロニー化しなかった場合、本出願に記載のコロニー化に関与する遺伝子を非属間変異を標的にしてコロニー化が改善されるように操作し、操作された／リモデリングされた微生物をコロニー化について分析し、これらの操作および分析工程を反復した。
反復リモデリングプロセスによって非属間変異を得るために、以下の２つの手法を用いて、微生物の基礎遺伝子アーキテクチャーをリモデリングした：（１）タンパク質ドメインをコードするゲノム配列または全ゲノムのマーカー無し欠失を作出すること、および（２）ゲノム内プロモーター再編成により制御ネットワークを書き換えること。
この反復リモデリングプロセスによって得られた、窒素固定および／またはコロニー化が改善されたＣＩ１３７のリモデリングされた菌株を以下に記載する。
ＷＴ菌株ＣＩ１３７の窒素固定形質を改善することができるかどうかを試験するために、ｇｌｎＥ遺伝子の開始コドン後の１６４７塩基対領域を欠失させて、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを含まず、その結果、グルタミン合成酵素が構成性にアデニリル化される短縮ＧｌｎＥタンパク質を産生した。このリモデリングされたＣＩ１３７を、本明細書中で１３７−１０３４と称する。１３７−１０３４は、アンモニアを排出することができたのに対して、ＷＴ菌株はアンモニアを排出しなかった（図２６）。しかしながら、１３７−１０３４は、ＷＴ菌株と比較してコロニー化が減少した（図２７〜２８）。１３７−１０３４をさらにリモデリングし、アンモニア排出を任意に改善することができるかどうかを試験するために、非属間変異を生成する工程を反復した。これについて、ｎｉｆＬ遺伝子のＡＴＧ開始コドン後の２０ｂｐからＴＧＡ終止コドン前の８７ｂｐまでを欠失させ、ｃｓｐＥ遺伝子のプロモーターを含むｃｓｐＥ遺伝子の上流領域由来の４００ｂｐ断片を、欠失部分の代わりにｎｉｆＡの上流（Ｐｒｍ１．２）に挿入した。このリモデリングされた微生物を、本明細書中で１３７−２０８４と称する。この菌株は、１３７−１０３４よりアンモニア排出が改善された（図２６）。コロニー化可能性について試験した場合、１３７−２０８４は、１３７−１０３４と比較してコロニー化がわずかに改善された；しかしながら、そのコロニー化可能性は、ＷＴ菌株と比較して依然として約１／１０であった（図２７〜２８）。非属間変異を得る工程を反復して／繰り返して、コロニー化可能性およびアンモニア排出の両方を改善することができるかどうかを試験した。具体的には、ｎｉｆＬ遺伝子のＡＴＧ開始コドン後の２０ｂｐからＴＧＡ終止コドン前の８７ｂｐまでを欠失させ；ｃｓｐＥ遺伝子のプロモーターを含むｃｓｐＥ遺伝子の上流領域由来の４００ｂｐ断片を、欠失部分の代わりにｎｉｆＡの上流に挿入し（Ｐｒｍ１．２）；ｃｓｐＥ遺伝子のプロモーターを含むｃｓｐＥ遺伝子の上流領域由来の４００ｂｐ断片を、遺伝子のネイティブプロモーターの代わりにｇｌｓＡ２遺伝子の上流に挿入した（Ｐｒｍ１．２）。この菌株を本明細書中で１３７−２２３７と称する。１３７−２２３７は、アンモニア排出の改善レベルは１３７−２０８４と類似しており（図２６）、同時に、１３７−２２３７のコロニー化可能性は、ＷＴ菌株と比較して類似していたか、わずかに改善された（図２７〜２８）。
上記は、非属間変異を繰り返して、リモデリングされた微生物の複数の形質を順次改善することを可能にするための実施例１に記載の工程Ｄ〜Ｆの使用方法を示す。
本明細書中で使用したアンモニア排出アッセイは、実施例２に記載している。
コロニー化アッセイ
簡潔に述べれば、菌株を富化培地（ＳＯＢ）中で一晩成長させた。各菌株を含む培養培地の光学密度を測定し、１に正規化し、１ｍＬの培養培地を使用して、植木鉢に植栽中のトウモロコシ種子に接種した。植物を３週間成長させ、次いで、鉢から取り出し、根を洗浄して解れた砂および破片を除去した。根組織の試料を、種子根および第１節（冠部から１〜２インチ下部に見出される）から採取し、ＰＢＳで洗浄し、解明のためにｇＤＮＡを調製した。
細胞／グラム／生重量を、菌株特異的プライマーを使用してｇＤＮＡ調製物をｑＰＣＲに供することによって決定した。アッセイのより詳細な説明を、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１９／０３２９２６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。
ＣＩ１３７ ＷＴ菌株に対する上記の変異を、以下の表３３にまとめている。
表３３：単離された誘導体Ｋ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株のリスト
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 本開示の番号を付けた実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号を付けた実施形態について記載している：
１．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．目的の標的植物と連携する複数の微生物種を準備する工程；
ｂ．前述の複数の微生物種のゲノムを配列決定し、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群を特徴づける工程；
ｃ．前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子、および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
ｄ．前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
ｅ．前述の候補微生物種を、
ｉ．選択マーカー、
ｉｉ．対抗選択マーカー、
ｉｉｉ．ＤＮＡ断片であって、候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に導入すべき非属間遺伝子変異、および前述の非属間遺伝子変異に隣接する前述の標的ゲノム遺伝子座に対するホモロジーアームを含むＤＮＡ断片；および
ｉｖ．プラスミドバックボーン
を含む形質転換プラスミドで形質転換する工程；
ｆ．前述のゲノム中の選択マーカーの存在に基づいて、最初の相同組換えを受けており、かつ前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有する候補微生物種を選択する工程；
ｇ．前述の対抗選択マーカーの非存在に基づいて、前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有するが、プラスミドバックボーンをループアウトするさらなる相同組換えを受けている候補微生物種を選択する工程；
ｈ．前述の形質転換された候補微生物種のゲノムを配列決定し、前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび前述の形質転換プラスミド由来の任意の遺伝的配列の非存在を確認する工程；および
ｉ．候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｅ）〜ｈ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程
を含む、微生物リモデリング誘導法。
２．前述の目的の植物に有利な機能が窒素固定である、実施形態１に記載の微生物リモデリング誘導法。
３．前述の目的の植物に有利な機能がリン酸塩可溶化である、実施形態１に記載の微生物リモデリング誘導法。
４．前述の目的の植物に有利な機能が微生物コロニー化である、実施形態１に記載の微生物リモデリング誘導法。
５．工程ｂ）が、全ゲノム配列決定を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
６．工程ｂ）が、窒素固定経路を特徴づけることを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
７．工程ｂ）が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組合せからなる群から選択される遺伝子群を特徴づけることを含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
８．工程ｃ）が、前述の複数の微生物種を、温室または実験室下ベースの条件でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
９．工程ｃ）が、前述の複数の微生物種を、圃場条件でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１０．工程ｃ）が、前述の複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下で、そしてまた圃場条件でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１１．工程ｃ）でアッセイされるコロニー化の測定基準が、以下：空間的コロニー化パターン、時間的コロニー化動態、コロニー化の密度、またはこれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１２．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１３．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１４．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１５．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１６．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１７．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１８．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
１９．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２０．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２１．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２２．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２３．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２４．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２５．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２６．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２７．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２８．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
２９．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３０．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３１．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、Ｎ枯渇条件およびＮ充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３２．前述の複数の微生物種を工程ｃ）において代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、Ｎ枯渇条件およびＮ充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３３．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３４．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３５．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３６．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３７．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３８．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
３９．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準および代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
４０．工程ｃ）が、前述の複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下で目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイすることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
４１．工程ｃ）が、前述の複数の微生物種を窒素固定活性についてアッセイすることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
４２．工程ｃ）が、前述の複数の微生物種を、アセチレン還元アッセイまたはアンモニウム排出アッセイにおいて窒素固定活性についてアッセイすることを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
４３．工程ｅ）の前述の形質転換プラスミドが自殺プラスミドである、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
４４．工程ｈ）が、全ゲノム配列決定を含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の微生物リモデリング誘導法。
４５．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．複数の微生物種を準備する工程；
ｂ．前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子、および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
ｃ．前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
ｄ．前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に、１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程であって、前述の非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、導入する工程；
ｅ．前述の候補微生物種のゲノムを配列決定し、前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程；および
ｆ．候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）〜ｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程
を含む、微生物リモデリング誘導法。
４６．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．複数の微生物種を準備する工程；
ｂ．前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子、および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
ｃ．前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
ｄ．前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の２またはそれを超える標的ゲノム遺伝子座に、２またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程であって、前述の非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、導入する工程；および
ｅ．前述の候補微生物種のゲノムを配列決定し、前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の導入および任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程
を含む、微生物リモデリング誘導法。
４７．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスする工程；
ｂ．代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定する工程；
ｃ．植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定する工程；
ｄ．前述の複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する工程であって、ここで、工程ａ）〜ｄ）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施する、選択する工程；および
ｅ．前述の選択された植物に有利な機能と関連する遺伝子に作動可能に連結された前述の選択された制御遺伝子配列を有し、それにより、前述の植物に有利な機能と関連する遺伝子の発現が改善されているリモデリングされた微生物細胞をｉｎ ｖｉｖｏで製造する工程
を含む、計算による微生物リモデリング誘導法。
４８．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導システムであって、
ａ．１またはそれを超えるプロセッサ；および
ｂ．前述の１またはそれを超えるプロセッサに動作可能に接続され、かつ命令が格納されている１またはそれを超えるメモリであって、前述の１またはそれを超えるプロセッサによって実行された場合、前述のシステムは、
ｉ．複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスし；
ｉｉ．代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定し；
ｉｉｉ．植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定し；そして
ｉｖ．前述の複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する、
１またはそれを超えるメモリを含む、計算による微生物リモデリング誘導システム。
４９．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．１またはそれを超えるプロセッサおよび前述の１またはそれを超えるプロセッサに動作可能に接続され、かつ命令が格納されている１またはそれを超えるメモリを有するコンピュータシステムの実行を開始させ、それにより、前述の１またはそれを超えるプロセッサが前述の命令を実行し、そして前述のシステムが、
ｉ．複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスし；
ｉｉ．代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定し；
ｉｉｉ．植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定し；
ｉｖ．前述の複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する、実行を開始する工程；および
ｂ．前述の選択された植物に有利な機能と関連する遺伝子に作動可能に連結された前述の選択された制御遺伝子配列を有し、それにより、前述の植物に有利な機能と関連する遺伝子の発現が改善されているリモデリングされた微生物細胞をｉｎ ｖｉｖｏで製造する工程
を含む、計算による微生物リモデリング誘導法。
５０．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．目的の標的植物と連携する複数の微生物種を準備する工程；
ｂ．前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
ｃ．前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
ｄ．１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を前述の候補微生物種に導入する工程；
ｅ．標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認する工程；および
ｆ．前述の候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）およびｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程
を含む、微生物リモデリング誘導法。
５１．前述の工程ｂ）が、前述の複数の微生物を、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５２．工程ａ）で得た前述の複数の微生物種のゲノムを配列決定し、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群を特徴づける工程を含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５３．前述の１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を前述の候補微生物種に導入する工程ｄ）が、
ａ．前述の候補微生物種を、
ｉ．選択マーカー、
ｉｉ．対抗選択マーカー、
ｉｉｉ．ＤＮＡ断片であって、候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に導入すべき非属間遺伝子変異、および前述の非属間遺伝子変異に隣接する前述の標的ゲノム遺伝子座に対するホモロジーアームを含むＤＮＡ断片、および
ｉｖ．プラスミドバックボーン
を含む形質転換プラスミドで形質転換する工程；
ｂ．前述のゲノム中の選択マーカーの存在に基づいて、最初の相同組換えを受けており、かつ前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有する候補微生物種を選択する工程；および
ｃ．前述の対抗選択マーカーの非存在に基づいて、前述の標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前述の非属間遺伝子変異を有するが、プラスミドバックボーンをループアウトするさらなる相同組換えを受けている候補微生物種を選択する工程
を含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５４．前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認する工程ｅ）が、前述の形質転換された候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５５．前述の工程ｅ）が、前述の形質転換プラスミド由来の任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認することを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５６．前述の目的の植物に有利な機能が窒素固定である、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５７．前述の目的の植物に有利な機能がリン酸塩可溶化である、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５８．前述の目的の植物に有利な機能が微生物コロニー化である、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
５９．前述の配列決定する工程が全ゲノム配列決定を含む、実施形態５２に記載の微生物リモデリング誘導法。
６０．窒素固定経路を特徴づける工程を含む、実施形態５２に記載の微生物リモデリング誘導法。
６１．ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組合せからなる群から選択される遺伝子群を特徴づける工程を含む、実施形態５２に記載の微生物リモデリング誘導法。
６２．菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する１またはそれを超える遺伝子を特徴づける工程を含む、実施形態５２に記載の微生物リモデリング誘導法。
６３．ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子を特徴づける工程を含む、実施形態５２に記載の微生物リモデリング誘導法。
６４．ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子を特徴づける工程を含む、実施形態５２に記載の微生物リモデリング誘導法。
６５．工程ｂ）が、前述の複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
６６．工程ｂ）が、前述の複数の微生物種を、圃場条件下でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
６７．工程ｂ）が、前述の複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下で、そしてまた圃場条件でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
６８．工程ｂ）でアッセイされるコロニー化の測定基準が、以下：空間的コロニー化パターン、時間的コロニー化動態、コロニー化の密度、またはこれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
６９．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施する、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７０．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７１．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７２．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７３．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７４．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７５．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７６．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施する、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７７．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７８．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
７９．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８０．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８１．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８２．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前述のアッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８３．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８４．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８５．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、前述の微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８６．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８７．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８８．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、Ｎ枯渇条件およびＮ充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
８９．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前述のアッセイが、Ｎ枯渇条件およびＮ充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前述のプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
９０．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
９１．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
９２．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
９３．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
９４．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
９５．前述の複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
９６．前述の複数の微生物種をコロニー化の測定基準および代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前述の複数の微生物種を成長させることを含む、実施形態５１に記載の微生物リモデリング誘導法。
９７．工程ｂ）が、前述の複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下で目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイすることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
９８．工程ｂ）が、前述の複数の微生物種を窒素固定活性についてアッセイすることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
９９．工程ｂ）が、前述の複数の微生物種を、アセチレン還元アッセイまたはアンモニウム排出アッセイにおいて窒素固定活性についてアッセイすることを含む、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
１００．前述の形質転換プラスミドが自殺プラスミドである、実施形態５０に記載の微生物リモデリング誘導法。
１０１．前述の配列決定することが、全ゲノム配列決定を含む、実施形態５４に記載の微生物リモデリング誘導法。
１０２．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．複数の微生物種を準備する工程；
ｂ．前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
ｃ．前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
ｄ．前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に、１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程；
ｅ．前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程；および
ｆ．候補微生物種が前述の目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）〜ｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程
を含む、微生物リモデリング誘導法。
１０３．前述の工程ｂ）が、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子をアッセイすることを含む、実施形態１０２に記載の微生物リモデリング誘導法。
１０４．工程ｄ）において、前述の非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１０２に記載の微生物リモデリング誘導法。
１０５．工程ｅ）が、前述の候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む、実施形態１０２に記載の微生物リモデリング誘導法。
１０６．植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
ａ．複数の微生物種を準備する工程；
ｂ．前述の複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
ｃ．前述のアッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
ｄ．前述の候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の２またはそれを超える標的ゲノム遺伝子座に、２またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程；および
ｅ．前述の標的ゲノム遺伝子座での前述の非属間遺伝子変異の導入および任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程
を含む、微生物リモデリング誘導法。
１０７．工程ｂ）が、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子をアッセイすることを含む、実施形態１０６に記載の微生物リモデリング誘導法。
１０８．工程ｄ）において、前述の非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１０６に記載の微生物リモデリング誘導法。
１０９．工程ｅ）が、前述の候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む、実施形態１０６に記載の微生物リモデリング誘導法。
本開示の好ましい実施形態を本明細書中に示し、説明しているが、かかる実施形態をほんの一例として提供していることが当業者に明らかであろう。当業者であるならば、本開示を逸脱することなく、多数の変形形態、変更形態、および置換形態を思いつくであろう。本開示の実施において、本明細書中に記載の開示の実施形態の種々の代替形態を使用することができると理解すべきである。以下のクレームは、本開示の範囲を定義しており、これらのクレームおよびその均等物の範囲内の方法および構造物がクレームの対象とされることが意図される。
参照による援用
本明細書中に引用された全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。しかしながら、本明細書中に引用された任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、前述の文献が有効な先行技術を構成することや、任意の国家の周知の一般的知識の一部を形成することの承認や示唆の任意の形態と見なされず、また見なされないものとする。さらに、２０１８年５月２２日に発行された、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｉｔｓ」の米国特許第９，９７５，８１７号は、本明細書中で参考として援用される。さらに、２０１８年１月１２日に発行された、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｉｔｓ」のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３６７１号は、本明細書中で参考として援用される。

Claims (63)

  1. 植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
    ａ．目的の標的植物と連携する複数の微生物種を準備する工程；
    ｂ．前記複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
    ｃ．前記アッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
    ｄ．１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を前記候補微生物種に導入する工程；
    ｅ．標的ゲノム遺伝子座での前記非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認する工程；および
    ｆ．前記候補微生物種が前記目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）およびｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程
    を含む、微生物リモデリング誘導法。
  2. 前記工程ｂ）が、前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下で転写活性な遺伝子についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  3. 工程ａ）で得た前記複数の微生物種のゲノムを配列決定し、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群を特徴づける工程を含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  4. 前記１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を前記候補微生物種に導入する工程ｄ）が、
    ａ．前記候補微生物種を、（ｉ）選択マーカー、（ｉｉ）対抗選択マーカー、（ｉｉｉ）ＤＮＡ断片であって、候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に導入すべき非属間遺伝子変異、および前記非属間遺伝子変異に隣接する前記標的ゲノム遺伝子座に対するホモロジーアームを含むＤＮＡ断片、および（ｉｖ）プラスミドバックボーンを含む形質転換プラスミドで形質転換すること；
    ｂ．前記ゲノム中の選択マーカーの存在に基づいて、最初の相同組換えを受けており、かつ前記標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前記非属間遺伝子変異を有する候補微生物種を選択すること；および
    ｃ．前記対抗選択マーカーの非存在に基づいて、前記標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた前記非属間遺伝子変異を有するが、プラスミドバックボーンをループアウトするさらなる相同組換えを受けている候補微生物種を選択すること
    を含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  5. 前記標的ゲノム遺伝子座での前記非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認する工程ｅ）が、前記形質転換された候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  6. 前記工程ｅ）が、前記形質転換プラスミド由来の任意のトランスジェネティック配列の非存在を確認することを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  7. 前記目的の植物に有利な機能が窒素固定である、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  8. 前記目的の植物に有利な機能がリン酸塩可溶化である、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  9. 前記目的の植物に有利な機能が微生物コロニー化である、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  10. 前記配列決定する工程が全ゲノム配列決定を含む、請求項３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  11. 窒素固定経路を特徴づける工程を含む、請求項３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  12. ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組合せからなる群から選択される遺伝子群を特徴づける工程を含む、請求項３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  13. 菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する１またはそれを超える遺伝子を特徴づける工程を含む、請求項３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  14. ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子を特徴づける工程を含む、請求項３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  15. ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子を特徴づける工程を含む、請求項３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  16. 工程ｂ）が、前記複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  17. 工程ｂ）が、前記複数の微生物種を、圃場条件下でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  18. 工程ｂ）が、前記複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下で、そしてまた圃場条件でコロニー化の測定基準についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  19. 工程ｂ）でアッセイされるコロニー化の測定基準が、以下：空間的コロニー化パターン、時間的コロニー化動態、コロニー化の密度、またはこれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  20. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施する、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  21. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前記アッセイが、前記微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  22. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前記アッセイが、前記微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  23. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前記アッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  24. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前記アッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  25. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前記アッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  26. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、温室または実験室ベースの条件下で実施し、前記アッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前記プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  27. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施する、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  28. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前記アッセイが、前記微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  29. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前記アッセイが、前記微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  30. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前記アッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  31. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前記アッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  32. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前記アッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  33. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、圃場条件下で実施し、前記アッセイが、外因性窒素の存在下でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前記プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  34. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  35. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前記アッセイが、前記微生物種のトランスクリプトームプロフィールを測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  36. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前記アッセイが、前記微生物種が目的の植物に有利な機能を果たす能力と関連する遺伝子のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  37. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前記アッセイが、制御遺伝子配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  38. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前記アッセイが、プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  39. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前記アッセイが、Ｎ枯渇およびＮ充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  40. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、前記アッセイが、Ｎ枯渇およびＮ充足条件でプロモーター配列のトランスクリプトーム活性を測定することを含み、ここで、前記プロモーター配列のトランスクリプトーム活性を、制御された遺伝子の発現を定量することによって測定する、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  41. 前記複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、標的植物と緊密に連携させて前記複数の微生物種を成長させることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  42. 前記複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前記複数の微生物種を成長させることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  43. 前記複数の微生物種をコロニー化の測定基準についてアッセイする工程が、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前記複数の微生物種を成長させることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  44. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、標的植物と緊密に連携させて前記複数の微生物種を成長させることを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  45. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、温室または実験室ベースの条件下で標的植物と緊密に連携させて前記複数の微生物種を成長させることを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  46. 前記複数の微生物種を代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子についてアッセイすることが、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前記複数の微生物種を成長させることを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  47. 前記複数の微生物種をコロニー化の測定基準および代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子ついてアッセイすることが、圃場条件下で標的植物と緊密に連携させて前記複数の微生物種を成長させることを含む、請求項２に記載の微生物リモデリング誘導法。
  48. 工程ｂ）が、前記複数の微生物種を、温室または実験室ベースの条件下で目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  49. 工程ｂ）が、前記複数の微生物種を窒素固定活性についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  50. 工程ｂ）が、前記複数の微生物種を、アセチレン還元アッセイまたはアンモニウム排出アッセイにおいて窒素固定活性についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  51. 前記形質転換プラスミドが自殺プラスミドである、請求項１に記載の微生物リモデリング誘導法。
  52. 前記配列決定することが、全ゲノム配列決定を含む、請求項５に記載の微生物リモデリング誘導法。
  53. 植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
    ａ．複数の微生物種を準備する工程；
    ｂ．前記複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
    ｃ．前記アッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
    ｄ．前記候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の標的ゲノム遺伝子座に、１またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程；
    ｅ．前記標的ゲノム遺伝子座での前記非属間遺伝子変異の組み込みおよび任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程；および
    ｆ．候補微生物種が前記目的の植物に有利な機能を果たす改善された能力を獲得するまで、工程ｄ）〜ｅ）を１回またはそれを超える回数で繰り返す工程
    を含む、微生物リモデリング誘導法。
  54. 前記工程ｂ）が、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子をアッセイすることを含む、請求項５３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  55. 工程ｄ）において、前記非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  56. 工程ｅ）が、前記候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む、請求項５３に記載の微生物リモデリング誘導法。
  57. 植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための微生物リモデリング誘導法であって、
    ａ．複数の微生物種を準備する工程；
    ｂ．前記複数の微生物種を、コロニー化の測定基準および目的の植物に有利な機能を果たす能力についてアッセイする工程；
    ｃ．前記アッセイされた複数の微生物種から候補微生物種を選択する工程；
    ｄ．前記候補微生物種の、目的の植物に有利な機能と関連する１またはそれを超えるゲノム経路または遺伝子群中の２またはそれを超える標的ゲノム遺伝子座に、２またはそれを超える標的にした非属間遺伝子変異を導入する工程；および
    ｅ．前記標的ゲノム遺伝子座での前記非属間遺伝子変異の導入および任意のトランスジェニック遺伝子配列の非存在を確認する工程
    を含む、微生物リモデリング誘導法。
  58. 工程ｂ）が、代謝的に適切な環境条件下での転写活性な遺伝子をアッセイすることを含む、請求項５７に記載の微生物リモデリング誘導法。
  59. 工程ｄ）において、前記非属間遺伝子変異が、全遺伝子欠失、部分的遺伝子欠失、プロモーター挿入、単一塩基対の変化、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５７に記載の微生物リモデリング誘導法。
  60. 工程ｅ）が、前記候補微生物種のゲノムを配列決定することを含む、請求項５７に記載の微生物リモデリング誘導法。
  61. 植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導法であって、
    ａ．複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスする工程；
    ｂ．代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定する工程；
    ｃ．植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定する工程；
    ｄ．前記複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する工程であって、ここで、工程ａ）〜ｄ）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施する、選択する工程；および
    ｅ．前記選択された植物に有利な機能と関連する遺伝子に作動可能に連結された前記選択された制御遺伝子配列を有し、それにより、前記植物に有利な機能と関連する遺伝子の発現が改善されているリモデリングされた微生物細胞をｉｎ ｖｉｖｏで製造する工程
    を含む、計算による微生物リモデリング誘導法。
  62. 植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導システムであって、
    ａ．１またはそれを超えるプロセッサ；および
    ｂ．前記１またはそれを超えるプロセッサに動作可能に接続され、かつ命令が格納されている１またはそれを超えるメモリであって、前記１またはそれを超えるプロセッサによって実行された場合、前記システムは、
    ｉ．複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスし；
    ｉｉ．代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定し；
    ｉｉｉ．植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定し；そして
    ｉｖ．前記複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する、
    １またはそれを超えるメモリを含む、計算による微生物リモデリング誘導システム。
  63. 植物連携微生物が植物に有利な機能を果たすように合理的に改善するための計算による微生物リモデリング誘導法であって、
    ａ．１またはそれを超えるプロセッサおよび前記１またはそれを超えるプロセッサに動作可能に接続され、かつ命令が格納されている１またはそれを超えるメモリを有するコンピュータシステムの実行を開始させ、それにより、前記１またはそれを超えるプロセッサが前記命令を実行し、そして前記システムが、
    ｉ．複数の微生物の全ゲノム配列にアクセスし；
    ｉｉ．代謝的に適切な環境条件下で遺伝子の転写を能動的に制御する複数の制御遺伝子配列を同定し；
    ｉｉｉ．植物に有利な機能と関連する複数の遺伝子を同定し；
    ｉｖ．前記複数の遺伝子から、制御遺伝子配列および植物に有利な機能と関連する遺伝子を選択する、実行を開始する工程；および
    ｂ．前記選択された植物に有利な機能と関連する遺伝子に作動可能に連結された前記選択された制御遺伝子配列を有し、それにより、前記植物に有利な機能と関連する遺伝子の発現が改善されているリモデリングされた微生物細胞をｉｎ ｖｉｖｏで製造する工程
    を含む、計算による微生物リモデリング誘導法。
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