CN108034614B - 一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法，该方法所用菌株为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.7250。该方法可用于同时降解人参中氟啶胺、六六六、五氯硝基苯、毒死蜱、滴滴涕5种农药残留，对提高人参安全性有重要的意义。

Description

一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用多粘类芽孢杆菌降解人参中化学农药残留的技术，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法，在人参绿色无公害参产品的生产和加工方面的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)是一种名贵中药材，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，人们对人参需求日益增多。人参在人工种植过程中会发生多种病虫害，农药在人参的生长过程中发挥着重要的防治病虫害作用，因此在人参生长周期被广泛使用。但目前我国人参的病虫害防治水平较低，化学农药的过量使用甚至违规使用时有发生，常造成人参农药残留。农药残留通过食物链在人体内富集，危害人们的身体健康，严重影响人参产品的质量和安全；农药残留使人参无法达到国际的出口标准，极大地影响了我国人参产品的对外贸易；同时农药残留还会造成对大气、水、土壤等环境的污染，破坏生态环境的保护。因此，国内外对人参中农药残留问题尤其关注，如何降低甚至去除人参中农药残留已成为研究热点。降解农药残留对保证人参的安全性及其治疗价值是非常有必要的，对发展我国中药材与世界接轨起着重要作用。人参中农药残留量的多少首先与生长过程中的农药施用种类和用量的多少有关；其次是与种植人参土壤在种植前就受到农药污染的种类和程度有关；再次人参对土壤中的某些农药有富集作用会产生农药累积，人参农药残留代谢缓慢，残留时间长；同时人参中农药残留与人参加工方式也密切关系。降解农药残留的方法有物理方法、化学方法、生物方法。但物理方法与化学方法成本太高且容易造成二次污染，因此只能作为一种辅助手段加以利用。微生物由于其强大的代谢多样性，在农药降解中具有更大的优势，生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点，生物降解农药残留的方法有微生物降解，酶法降解和工程菌降解3种。多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是美国FDA规定可直接用于食品的益生菌，也是我国免于安全性检查的益生菌，安全性极高。多粘类芽孢杆菌不仅在生物防治方面具有很好的应用，而且还在促进人参生长和转化人参皂苷方面有很好作用，但未见利用多粘类芽孢杆菌在降解人参农药残留方面的应用报道，本发明利用多粘类芽孢杆菌对氟啶胺、六六六、五氯硝基苯、毒死蜱、滴滴涕5种农药进行同时降解，为提高人参安全性和保护生态环境提供理论依据和参考。

发明内容

一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法，该方法所用菌株为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 CGMCC No.7250；所述方法为多粘类芽孢杆菌对人参中农药残留的应用，其特征在于，所述降解农药为氟啶胺、六六六、五氯硝基苯、毒死蜱、滴滴涕。

具体实施方式

实例1 一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法

本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法，本发明领域技术人员可借助本发明内容，适当改进参数实现，所有的类似的替换和改动对本领域技术人员是显而易见的，都视为本发明。本发明所述的方法已通过较佳实施例进行描述。相关人员明显能在不脱离本发明内容，精神和范围内对本文所述方法和应用进行改动和适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

试验例1 一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法

1.材料与方法

1.1 材料

五氯硝基苯（PCNB）、毒死蜱、六六六 (BHC)、氟啶胺、滴滴涕(DDT)标准品（购于迪马科技，批号分别为15001、216081393、217021440、5569300、6154527）。多粘类芽孢杆菌来源于本实验室，已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏编号：CGMCCNo.7250。丙酮（分析纯，北京化工厂）、石油醚（分析纯，北京化工厂）、正己烷（色谱纯，Fisher）、葡萄糖、琼脂（国药集团）。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪（SHIMADZU GC-14C）、全波长酶标仪（TECAN Infinite Pro 200）、电子分析天平（SHIMDZU AUY220）、电子恒温水浴锅（余姚市上通温控仪表厂 HHs-6s）。

2.方法

2.1多粘类芽孢杆菌对培养基中5种农药残留的降解

无菌条件下，取1 mL活化后OD₆₀₀值为0.5时的多粘类芽孢杆菌菌液加至浓度均为100 mg/L 的六六六、DDT、五氯硝基苯、毒死蜱、氟啶胺的40ml PDB液体培养基中，28℃，180r/min恒温震荡培养。设不接菌的处理组为对照，分别于0、1、2、3、4、5、6、7d取样5ml。将 5mL样品加入至分液漏斗中，加入15 mL正己烷充分振荡 5 min，静止 10 min，弃下层液体，重复振荡提取3次，弃下层液体后将分液漏斗中液体全部液体转至鸡心瓶，并用5 mL正己烷清洗分液漏斗2次，合并洗液转至鸡心瓶于35 ℃水浴中旋转蒸发至近干，加入5mL正己烷溶解，0.22μm微孔滤膜过滤待净化。

2.2多粘类芽孢杆菌对田间栽培人参中5种农药残留的降解

试验在吉林省靖宇县进行，选取3年生人参地，每个小区3m²，每个处理4次重复，随机排列，并设空白对照小区，见表1。人参展叶期后，各农药均按100 mg/L浓度配制，喷施人参叶面及其土壤，每个小区喷施150ml。喷洒农药 1d 后，每个小区每次喷施浓度为10⁶CFU/ml的多粘类芽孢杆菌150ml，用喷雾器喷洒叶面和土壤，保证人参叶面均匀分布多粘类芽孢杆菌，于秋季采集样品，每个小区采集10株人参茎叶及其根。精密称取阴干样品1.000g，置于100mL三角瓶中，加入丙酮-石油醚（1：4体积比）20mL，超声提取20min，静止，将上清过滤到三角瓶，再加入丙酮-石油醚（1：4体积比）15mL，提取两次每次10min，合并滤液，于40℃水浴浓缩，将残渣用石油醚定容到5mL，加入1mL10%的浓硫酸，振摇1min，于3000r/min离心10min，取上清35℃水浴旋转浓缩至近干，加入5mL正己烷，0.22μm微孔滤膜过滤待净化。

2.3样品的固相萃取净化

用10 mL正己烷预淋洗Florisil固相萃取柱，流出液弃去。将5 mL溶解液倾入Florisil固相萃取柱中，用20 mL正己烷进行洗脱。收集全部洗脱液于鸡心瓶中，于35 ℃水浴中旋转浓缩至近干。用正己烷溶解，并定容至2 mL，取1mL经0.22μm滤膜过滤后供气相色谱测定。降解率(%)=(对照样品残留量-处理样品残留量)/对照样品残留量×100%。

2. 4 气相色谱条件

色谱柱温度：起始温度50℃保持3min，以10℃/min升温至180℃，保持20min，再以10℃/min升温至260℃，保持10min；进样口温度：260℃；检测器温度：300℃；载气：高纯氮气(纯度>99.999%)；载气流量：1mL/min；进样方式：分流进样；进样量：1.0μL。2.5统计分析

所得数据用SPSS 23.0进行统计分析。

3.结果

3.1多粘类芽孢杆菌对培养基中5种农药的降解

多粘类芽孢杆菌对培养基中5种人参农药氟啶胺、六六六、PCNB 、毒死蜱、DDT均有降解作用。在 7d时多粘类芽孢杆菌对氟啶胺、六六六、PCNB 、毒死蜱、DDT降解率分别为94.77%、70.34%、77.92%、78.30%、66.70%，见表2。

3.2多粘类芽孢杆菌对田间栽培人参中5种农药残留的降解

不同次数喷施多粘类芽孢杆菌对大田栽培人参的人参茎叶和根中5种农药氟啶胺、六六六、PCNB 、毒死蜱、DDT残留均有降解作用，5次喷施多粘类芽孢杆菌降解农药残留效果最好。5次喷施多粘类芽孢杆菌对田间栽培人参的人参茎叶中氟啶胺、六六六、PCNB 、毒死蜱、DDT降解率分别为74.18%、55.61%、73.65%、58.13%、46.91%，见表3。5次喷施多粘类芽孢杆菌对田间栽培人参的人参根中氟啶胺、六六六、PCNB 、毒死蜱、DDT降解率分别为66.07%、46.24%、21.05%、72.40%、54.21%，见表4。

4.结论

多粘类芽孢杆菌对农药氟啶胺、六六六、PCNB 、毒死蜱、DDT残留均具有良好的降解效果。

Claims (1)

1.一种多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）同时降解5种农药残留的方法，该方法所用菌株已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 CGMCCNo .7250；所述方法为多粘类芽孢杆菌对人参中农药残留进行降解的应用，所述农药为氟啶胺、六六六、五氯硝基苯、毒死蜱、滴滴涕。