CN107837304A - 一种从栀子中提取抗菌成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从栀子中提取抗菌成分的方法，属于中草药提取技术领域。该方法包括的步骤有：将栀子果实干燥粉碎得栀子粉；将栀子粉和氢氧化钙按重量比为95～99:1～5研磨至200～300目，得混合微粉；将混合微粉用乙醇做溶剂，使用单级式连续逆流超声波提取、浓缩得浓缩滤液；将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，用石油醚‑乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，洗脱液浓缩后再经硅胶柱层析分离，再使用硅胶柱纯化，用体积比为40:60的乙腈‑氯仿洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子抗菌成份。本发明从栀子中成功提取到了抗菌活性成份，这些活性成份的获得对于栀子在抗菌性方面的研究具有积极意义。

Description

一种从栀子中提取抗菌成分的方法
【技术领域】
本发明涉及中草药提取技术领域，具体涉及一种从栀子中提取抗菌成分的方法。
【背景技术】
随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药性逐年增加，成为临床医生难以对付的“超级细菌”。同时，抗生素本身具有的毒副作用，对人体和环境也造成威胁。天然药物是从植物、动物和微生物等天然资源中开发出来的药物，具有毒副作用小、耐药性小等优势。目前，在世界范围内的药品市场中，约30％来源于天然产品。从天然产物尤其是从药用植物中寻找新颖的抗菌药物受到国内外研究者的重视。
栀子，中药名。是茜草科植物栀子的果实。栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第l批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用。在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。研究证明，栀子煎剂对白喉杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌有抑制作用，对多种皮肤真菌也有不同程度的抑制作用。因此，从栀子中提取抗菌成分对抗菌药物的研究具有积极的意义。然而，目前对栀子进行提取的研究工作，大多集中在提取和应用栀子黄素成分，用于作为染料，对其抗菌成分进行的相关研究较少。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，本发明提供一种从栀子中提取抗菌成分的方法，该方法通过筛选提取方法和提取溶剂，能够获得栀子中的抗菌成分。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从栀子中提取抗菌成分的方法，包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下干燥后，将栀子粉碎，得栀子粉；
(2)将栀子粉和氢氧化钙按重量比为95～99:1～5研磨至200～300目，得混合微粉；
(3)将混合微粉和体积分数为30-35％的乙醇按料液比1g：20～30ml放入单级式连续逆流超声波提取机中，在频率为20～80KHz、功率为300～500W、温度为40～50℃的超声波作用下超声逆流提取10～30min，过滤提取液，收集得到滤液和滤渣；将滤渣重复超声逆流提取2～3次，重复过滤，最后合并所有滤液；将所有滤液减压蒸馏，回收乙醇，得浓缩滤液；
(4)将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，依次用体积比为20:80、30:70、40:60的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，收集体积比40:60的洗脱液；
(5)将所述体积比40:60洗脱液浓缩至浸膏，浸膏再经硅胶柱层析分离，用体积比为50:50的石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，收集洗脱部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，用体积比为40:60的乙腈-氯仿洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子抗菌成份。
本发明中，优选地，步骤(1)是将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目。
本发明中，优选地，步骤(3)中所述乙醇的体积浓度为30％；所述混合微粉与乙醇的料液比为1g：25ml。
本发明中，优选地，步骤(4)中所述经硅胶柱层析分离时，所述浓缩滤液和硅胶的重量比为1:30-50。
本发明中，优选地，步骤(4)中所述经硅胶柱层析纯化时，所述浓缩滤液和硅胶的重量比为1:20-40。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明通过将栀子果实研磨成微粉后先进行超声波醇提，再经过硅胶柱层析分离核纯化从栀子中成功提取到了抗菌活性成份，这些活性成份的获得对于栀子在抗菌性方面的研究具有积极意义。
2、本发明在栀子的提取过程中，通过控制乙醇的浓度、用量和料液比，通过采用石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱、采用石油醚-乙酸乙酯等度洗脱进行层析分离、采用乙腈-氯仿洗脱进行层析纯化，更能有针对性地得到栀子中的抗菌活性成份，得到的提取物抗菌活性较好。
【具体实施方式】
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种从栀子中提取抗菌成分的方法，包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目，得栀子粉；
(2)将栀子粉和氢氧化钙按重量比为95:5研磨至200～300目，得混合微粉；
(3)将混合微粉和体积分数为30％的乙醇按料液比1g：20ml放入单级式连续逆流超声波提取机中，在频率为20KHz、功率为300W、温度为40℃的超声波作用下超声逆流提取30min，过滤提取液，收集得到滤液和滤渣；将滤渣重复超声逆流提取2次，重复过滤，最后合并所有滤液；将所有滤液减压蒸馏，回收乙醇，得浓缩滤液；
(4)将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:30，依次用体积比为20:80、30:70、40:60的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，收集体积比40:60的洗脱液；
(5)将所述体积比40:60洗脱液浓缩至浸膏，浸膏再经硅胶柱层析分离，用体积比为50:50的石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，收集洗脱部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:20，用体积比为40:60的乙腈-氯仿洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子抗菌成份。
实施例2
一种从栀子中提取抗菌成分的方法，包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目，得栀子粉；
(2)将栀子粉和氢氧化钙按重量比为99:1研磨至200～300目，得混合微粉；
(3)将混合微粉和体积分数为33％的乙醇按料液比1g：25ml放入单级式连续逆流超声波提取机中，在频率为50KHz、功率为400W、温度为45℃的超声波作用下超声逆流提取20min，过滤提取液，收集得到滤液和滤渣；将滤渣重复超声逆流提取2次，重复过滤，最后合并所有滤液；将所有滤液减压蒸馏，回收乙醇，得浓缩滤液；
(4)将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:40，依次用体积比为20:80、30:70、40:60的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，收集体积比40:60的洗脱液；
(5)将所述体积比40:60洗脱液浓缩至浸膏，浸膏再经硅胶柱层析分离，用体积比为50:50的石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，收集洗脱部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:30，用体积比为40:60的乙腈-氯仿洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子抗菌成份。
实施例3
一种从栀子中提取抗菌成分的方法，包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目，得栀子粉；
(2)将栀子粉和氢氧化钙按重量比为97:3研磨至200～300目，得混合微粉；
(3)将混合微粉和体积分数为35％的乙醇按料液比1g：30ml放入单级式连续逆流超声波提取机中，在频率为80KHz、功率为500W、温度为50℃的超声波作用下超声逆流提取10min，过滤提取液，收集得到滤液和滤渣；将滤渣重复超声逆流提取3次，重复过滤，最后合并所有滤液；将所有滤液减压蒸馏，回收乙醇，得浓缩滤液；
(4)将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:50，依次用体积比为20:80、30:70、40:60的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，收集体积比40:60的洗脱液；
(5)将所述体积比40:60洗脱液浓缩至浸膏，浸膏再经硅胶柱层析分离，用体积比为50:50的石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，收集洗脱部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:40，用体积比为40:60的乙腈-氯仿洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子抗菌成份。
对比例1
一种从栀子中提取抗菌成分的方法，包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目，得栀子粉；
(2)将栀子粉和氢氧化钙按重量比为99:1研磨至200～300目，得混合微粉；
(3)将混合微粉和体积分数为33％的乙醇按料液比1g：25ml放入单级式连续逆流超声波提取机中，在频率为50KHz、功率为400W、温度为45℃的超声波作用下超声逆流提取20min，过滤提取液，收集得到滤液和滤渣；将滤渣重复超声逆流提取2次，重复过滤，最后合并所有滤液；将所有滤液减压蒸馏，回收乙醇，得浓缩滤液，将浓缩液干燥得栀子提取物。
对比例2
一种从栀子中提取抗菌成分的方法，包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目，得栀子粉；
(2)将栀子粉和体积分数为33％的乙醇按料液比1g：25ml回流浸提3次；
(3)将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:40，用体积比40:60的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱，收集洗脱液；
(4)将洗脱液浓缩至浸膏，浸膏使用硅胶柱纯化，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:30，用体积比为40:60的乙腈-氯仿洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子抗菌成份。
对比例3
一种从栀子中提取抗菌成分的方法，包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目，得栀子粉；
(2)将栀子粉和氢氧化钙按重量比为99:1研磨至200～300目，得混合微粉；
(3)将混合微粉和体积分数为75％的乙醇按料液比1g：25ml放入单级式连续逆流超声波提取机中，在频率为50KHz、功率为400W、温度为45℃的超声波作用下超声逆流提取20min，过滤提取液，收集得到滤液和滤渣；将滤渣重复超声逆流提取2次，重复过滤，最后合并所有滤液；将所有滤液减压蒸馏，回收乙醇，得浓缩滤液；
(4)将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:40，用体积比为20:80的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，收集洗脱液；
(5)将所述洗脱液浓缩至浸膏，浸膏使用硅胶柱纯化，控制浓缩滤液和硅胶的重量比为1:30，用体积浓度为75％的乙醇洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子提取物。
抑菌效果试验
1、菌悬液的制备
在无菌操作台中，挑取金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、伤寒杆菌这3种标准菌株少许，接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，放置于37℃恒温水浴摇床中震荡培养18h。取18h培养的各菌株培养物，用牛肉膏蛋白胨培养基稀释1000倍得菌悬液用于实验。
2、供试液的制备
将本发明所得各实施例和对比例中的抗菌活性物质经冷冻干燥，分别用二甲亚砜溶解，制备成10mg·mL-1的初始浓度，在超净工作台中用0.22μm(尼龙66)的微孔滤膜过滤备用
3、二倍稀释法
对于每个受试样品分别取灭菌试管8支，第1管加入供试液0.1mL，第2-8管中分别加入0.1mL培养基液，取供试液0.1mL加入第2管中，混匀后取0.1mL加入第3管中，依次稀释至第7管，第7管吸出0.1mL弃去，第8管不加药液作为对照。每管加入菌悬液0.9mL，使得1-8管的液体总量均为1mL，受试药液浓度分别为：1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6μg·mL-1。将试管放入恒温培养箱37℃培养24h后，取出试管观察细菌生长情况。如药液管混浊，表示细菌生长，供试药液无抑菌作用；如药液管清亮则表示细菌生长受抑制，其能抑制细菌生长的最大稀释度的药液，即为该样品的最小抑菌浓度(MIC)。
4、抑菌结果
各组提取物对3种细菌的抑菌活性测试结果见下表1。
表1抑菌测试结果
从上表可以看出，采用本发明的方法提取的栀子中的提取物，对金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、伤寒杆菌有很好的抑制效果，且抑菌效果好于对比例组，说明本发明的提取方法更能有针对性地得到栀子中的抗菌活性成份。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (6)

1.一种从栀子中提取抗菌成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将栀子果实洗净去杂，在真空条件下干燥后，将栀子粉碎，得栀子粉；
(2)将栀子粉和氢氧化钙按重量比为95～99:1～5研磨至200～300目，得混合微粉；
(3)将混合微粉和体积分数为30-35％的乙醇按料液比1g：20～30ml放入单级式连续逆流超声波提取机中，在频率为20～80KHz、功率为300～500W、温度为40～50℃的超声波作用下超声逆流提取10～30min，过滤提取液，收集得到滤液和滤渣；将滤渣重复超声逆流提取2～3次，重复过滤，最后合并所有滤液；将所有滤液减压蒸馏，回收乙醇，得浓缩滤液；
(4)将浓缩滤液经硅胶柱层析分离，依次用体积比为20:80、30:70、40:60的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，收集体积比40:60的洗脱液；
(5)将所述体积比40:60洗脱液浓缩至浸膏，浸膏再经硅胶柱层析分离，用体积比为50:50的石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，收集洗脱部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，用体积比为40:60的乙腈-氯仿洗脱并收集洗脱部分，即得到栀子抗菌成份。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)是将所述栀子果实干燥至含水率在5％以下后，粉碎至20～30目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述乙醇的体积浓度为30％；所述混合微粉与乙醇的料液比为1g：25ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述经硅胶柱层析分离时，所述浓缩滤液和硅胶的重量比为1:30-50。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述经硅胶柱层析纯化时，所述浓缩滤液和硅胶的重量比为1:20-40。
6.权利要求1-5中任一项所得抗菌成分在制作抗菌消炎药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107582599A (zh) * 2017-10-20 2018-01-16 程志鹏 一种从紫罗兰叶中提取抗菌成分的方法及抗菌成分的应用

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