CN107693564A - 一种从蒲公英中提取抗菌成分的方法 - Google Patents

一种从蒲公英中提取抗菌成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种从蒲公英中提取抗菌成分的方法，属于中草药提取技术领域。该方法包括的步骤有：将蒲公英全草干燥再粉碎，得蒲公英粉末；对蒲公英粉末进行两次超声波醇提，合并得醇提物，将醇提物浓缩至无醇味；将浓缩后的醇提物加水配制成醇提物溶液，将醇提物溶液经大孔树脂层析分离，先用去离子水除杂，再用体积浓度为10‑15％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积比为1:3‑4：75的乙醚、正丁醇和三氯乙烷的混合液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。本发明从蒲公英中成功提取到了抗菌活性成份，这些活性成份的获得对于蒲公英在抗菌性方面的研究具有积极意义。

Description

一种从蒲公英中提取抗菌成分的方法
【技术领域】
本发明涉及中草药提取技术领域，具体涉及一种从蒲公英中提取抗菌成分的方法。
【背景技术】
随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药性逐年增加，成为临床医生难以对付的“超级细菌”。同时，抗生素本身具有的毒副作用，对人体和环境也造成威胁。天然药物是从植物、动物和微生物等天然资源中开发出来的药物，具有毒副作用小、耐药性小等优势。目前，在世界范围内的药品市场中，约30％来源于天然产品。从天然产物尤其是从药用植物中寻找新颖的抗菌药物受到国内外研究者的重视。
蒲公英别名黄花地丁、婆婆丁、华花郎等，属于菊科多年生草本植物。蒲公英有利尿、缓泻、退黄疸、利胆等功效。治热毒、痈肿、疮疡、内痈、目赤肿痛、湿热、黄疸、小便淋沥涩痛、疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，牙痛，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛。治急性乳腺炎，淋巴腺炎，瘰疬，疔毒疮肿，急性结膜炎，感冒发热，急性扁桃体炎，急性支气管炎，胃炎，肝炎，胆囊炎，尿路感染等。研究证明，蒲公英的醇提物对金黄色葡萄球菌耐药菌株、溶血性链球菌有较强的杀菌作用。对肺炎双球菌、脑膜炎球菌、白喉杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等及卡他球菌也有一定杀菌作用。因此，从蒲公英中提取抗菌成分对抗菌药物的研究具有积极的意义。然而，目前对蒲公英进行提取的研究工作，大多集中在提取和应用其绿原酸上，对其抗菌成分进行的相关研究较少。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，本发明提供一种从蒲公英中提取抗菌成分的方法，该方法通过筛选提取方法和提取溶剂，能够获得蒲公英中的抗菌成分。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)将蒲公英全草去杂，干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：70-80ml，乙醇的体积浓度为73-78％，超声波提取器的提取功率为300～400W，提取频率为40～45kHz，提取温度为40～60℃，提取时间为10-20分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味；
(4)将浓缩后的醇提物加水配制成浓度为9-12mg/ml、pH值为5-6的醇提物溶液，所述醇提物溶液经大孔树脂层析分离，先用去离子水除杂，再用体积浓度为10-15％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积比为1:3-4：75的乙醚、正丁醇和三氯乙烷的混合液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。
本发明中优选地，步骤(1)中所述干燥是于40～50℃温度下恒温干燥，低温干燥有利于保护有效成分不被破坏。
本发明中优选地，步骤(2)中所述乙醇的体积浓度为76％；控制乙醇体积浓度和料液比可以最大限度提高提取物得率。
本发明中优选地，步骤(2)中所述的超声提取的时间为20分钟，步骤(3)中超声提取的时间为10分钟。
本发明中优选地，步骤(4)中所述大孔树脂为D101或H-103。
本发明中优选地，步骤(4)中所述醇提物溶液过大孔树脂的速度为3～5BV/h；去离子水除杂和体积浓度为10-15％的稀乙醇洗脱除杂时的用量分别为3BV和5BV。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明通过对蒲公英进行超声波醇提后，在经过大孔树脂层析分离等步骤，从蒲公英中成功提取到了抗菌活性成份，这些活性成份的获得对于蒲公英在抗菌性方面的研究具有积极意义。
2、本发明在紫罗兰的提取过程中，通过控制乙醇的浓度和用量、控制超声提取的条件，通过采用大孔树脂层析分离，先用去离子水除杂，再用体积浓度为10-15％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积比为1:3-4：75的乙醚、正丁醇和三氯乙烷的混合液作为洗脱剂洗脱，通过筛选适合的提取剂、并通过优化提纯工艺，更能有针对性地得到栀子中的抗菌活性成份，得到的提取物抗菌活性较好。
【具体实施方式】
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)将蒲公英全草去杂，于40～50℃温度下恒温干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：70ml，乙醇的体积浓度为73％，，超声波提取器的提取功率为300W，提取频率为40kHz，提取温度为40℃，提取时间为20分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味；
(4)将浓缩后的醇提物加水配制成浓度为9mg/ml、pH值为5的醇提物溶液，所述醇提物溶液以5BV/h的速度经大孔树脂D101层析分离，先用3BV去离子水除杂，再用5BV体积浓度为10％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积比为1:3：75的乙醚、正丁醇和三氯乙烷的混合液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。
实施例2
(1)将蒲公英全草去杂，于40～50℃温度下恒温干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：75ml，乙醇的体积浓度为76％，超声波提取器的提取功率为350W，提取频率为40kHz，提取温度为50℃，提取时间为15分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味；
(4)将浓缩后的醇提物加水配制成浓度为10mg/ml、pH值为5.5的醇提物溶液，所述醇提物溶液4BV/h的速度经大孔树脂H-103层析分离，先用3BV去离子水除杂，再用5BV体积浓度为12％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积比为1:4：75的乙醚、正丁醇和三氯乙烷的混合液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。
实施例3
(1)将蒲公英全草去杂，于40～50℃温度下恒温干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：80ml，乙醇的体积浓度为78％，，超声波提取器的提取功率为400W，提取频率为45kHz，提取温度为60℃，提取时间为10分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味；
(4)将浓缩后的醇提物加水配制成浓度为12mg/ml、pH值为6的醇提物溶液，所述醇提物溶液3BV/h的速度经大孔树脂D101层析分离，先用3BV去离子水除杂，再用5BV体积浓度为10-15％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积比为1:3：75的乙醚、正丁醇和三氯乙烷的混合液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。
对比例1
(1)将蒲公英全草去杂，于40～50℃温度下恒温干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：75ml，乙醇的体积浓度为76％，超声波提取器的提取功率为350W，提取频率为40kHz，提取温度为50℃，提取时间为15分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味，得蒲公英醇提物。
对比例2
(1)将蒲公英全草去杂，于40～50℃温度下恒温干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：75ml，乙醇的体积浓度为76％，超声波提取器的提取功率为350W，提取频率为40kHz，提取温度为50℃，提取时间为15分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味；
(4)将浓缩后的醇提物加水配制成浓度为10mg/ml、pH值为5.5的醇提物溶液，所述醇提物溶液4BV/h的速度经大孔树脂H-103层析分离，先用3BV去离子水除杂，再用5BV体积浓度为12％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积浓度为75％的乙醇作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。
对比例3
(1)将蒲公英全草去杂，于40～50℃温度下恒温干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：75ml，乙醇的体积浓度为76％，超声波提取器的提取功率为350W，提取频率为40kHz，提取温度为50℃，提取时间为15分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味；
(4)将浓缩后的醇提物加水配制成浓度为10mg/ml、pH值为5.5的醇提物溶液，所述醇提物溶液4BV/h的速度经大孔树脂H-103层析分离，用3BV去离子水除杂，然后用体积浓度为75％的乙醇作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。
抑菌效果试验
1、菌悬液的制备
在无菌操作台中，挑取金黄色葡萄球菌、结核杆菌、肺炎球菌这3种标准菌株少许，接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，放置于37℃恒温水浴摇床中震荡培养18h。取18h培养的各菌株培养物，用牛肉膏蛋白胨培养基稀释1000倍得菌悬液用于实验。
2、供试液的制备
将本发明所得各实施例和对比例中的抗菌活性物质经冷冻干燥，分别用二甲亚砜溶解，制备成1mg·mL-1的初始浓度，在超净工作台中用0.22μm(尼龙66)的微孔滤膜过滤备用
3、二倍稀释法
对于每个受试样品分别取灭菌试管8支，第1管加入供试液0.2mL，第2-8管中分别加入0.1mL培养基液，取供试液0.1mL加入第2管中，混匀后取0.1mL加入第3管中，依次稀释至第7管，第7管吸出0.1mL弃去，第8管不加药液作为对照。每管加入菌悬液0.9mL，使得1-8管的液体总量均为1mL，受试药液浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.65μg·mL-1。将试管放入恒温培养箱37℃培养24h后，取出试管观察细菌生长情况。如药液管混浊，表示细菌生长，供试药液无抑菌作用；如药液管清亮则表示细菌生长受抑制，其能抑制细菌生长的最大稀释度的药液，即为该样品的最小抑菌浓度(MIC)。
4、抑菌结果
各组提取物对3种细菌的抑菌活性测试结果见下表1。
表1抑菌测试结果
从上表可以看出，采用本发明的方法提取的蒲公英中的提取物，对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、溶血性链球菌有很好的抑制效果，且抑菌效果好于对比例组，说明本发明的提取方法更能有针对性地得到蒲公英中的抗菌活性成份，所得提取物可以用于制作抗菌药物中。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (6)

1.一种从蒲公英中提取抗菌成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将蒲公英全草去杂，干燥至无水，再粉碎、过筛至50～60目，得蒲公英粉末；
(2)将乙醇加入到超声波提取器中，然后加入蒲公英粉末，蒲公英粉末与乙醇的固液比为1g：70-80ml，乙醇的体积浓度为73-78％，超声波提取器的提取功率为300～400W，提取频率为40～45kHz，提取温度为40～60℃，提取时间为10-20分钟，过滤，得到一次提取液和一次滤渣；
(3)将一次滤渣采用与步骤(2)相同的方法再提取一次，得二次提取液和二次滤渣；将两次提取的提取液合并得醇提物；将醇提物浓缩至无醇味；
(4)将浓缩后的醇提物加水配制成浓度为9-12mg/ml、pH值为5-6的醇提物溶液，所述醇提物溶液经大孔树脂层析分离，先用去离子水除杂，再用体积浓度为10-15％的稀乙醇洗脱除杂，最后用体积比为1:3-4：75的乙醚、正丁醇和三氯乙烷的混合液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后低温冷冻干燥得蒲公英抗菌成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述干燥是于40～50℃温度下恒温干燥。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述乙醇的体积浓度为76％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的超声提取的时间为20分钟，步骤(3)中超声提取的时间为10分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述大孔树脂为D101或H-103。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述醇提物溶液过大孔树脂的速度为3～5BV/h；去离子水除杂和体积浓度为10-15％的稀乙醇洗脱除杂时的用量分别为3BV和5BV。
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