CN102895325B - 中药抑菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药抑菌组合物，属于中药领域。抑菌组合物中大黄提取液与水溶性纳米银以比例混合，两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7、藤黄微球菌起到协同的作用。本发明的一种大黄提取物与纳米银抑菌组合物与现有的技术相比，解决了常规抑菌方法中大黄抑菌剂用量较大的问题，同时采用两种低剂量的抑菌物质减少了微生物耐药的发生机率、降低了其对人体的毒性，更加的安全。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，尤其涉及一种中药抑菌组合物。
背景技术
大黄是多种蓼科大黄属的多年生植物的合称，也是中药材的名称。因其喜冷凉气候，且耐寒，故其主要生于山地林缘或草坡的阴湿环境，中药大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效。现代药理研究证明，大黄具有抗菌作用，其中对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、伤寒沙门菌、痢疾杆菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、变形杆菌等都有较强的抑制作用，除此之外，还具有抗肿瘤、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、延缓衰老、调节免疫功能等作用。大黄因其具有较高的药用和保健价值，广泛引起了人们关注。
中药制剂浓缩液制成口服液或抑菌剂、涂覆剂等一次用剂量大，且长期使用影响人体健康。
发明内容
针对大黄抑菌剂一次用量大和长期使用影响人体健康问题，本发明人经过大量实验，发现纳米银能有效增强大黄提取液抑菌性能，减少大黄抑菌剂的用量，且采用两种低剂量的抑菌组合物，更加的安全。本发明的目的在于提供一种大黄纳米银抑菌组合物，减少大黄抑菌剂一次的用剂量和降低药品对人体的毒性。
本发明提供如下技术方案：
一种抑菌组合物，含有大黄提取液、水溶性纳米银；
大黄提取液制备包括如下步骤：加水量为大黄重量的9倍，经95 ℃水浴提取4 h，再经过减压浓缩得到提取液。所得提取液经0.22 μm滤膜过滤。最后提取液经高效液相色谱法对大黄素进行标准定量。
水溶性纳米银颗粒粒径为3～10 nm，纳米银外表包覆两性聚合物。
水溶性纳米银粒径为3～10 nm，外表为羧基，依照下列方法制备：取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末。依照本方法制备的水溶性纳米银颗粒与大黄提取液具有良好的的协同抗菌作用。
抑制大肠杆菌O157:H7时大黄提取液、水溶性纳米银的体积比为 75～100:1
抑制藤黄微球菌时大黄提取液、水溶性纳米银的体积比为和25～50:1。
本发明还涉及上述抑菌组合物在抑制大肠杆菌O157:H7中的应用。
本发明还涉及上述抑菌组合物在抑制藤黄微球菌中的应用
本发明的有益效果是：水溶性纳米银的应用能有效增强大黄抑菌性能，降低大黄抑菌剂的用量，令人意向不到的是，两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7和藤黄微球菌起到协同作用，同时本抑菌组合物采用两种低剂量的抑菌物质，相对于使用高剂量的大黄或者水溶性纳米银，更加的安全，可以作为安全可靠地外用涂覆剂等。
附图说明
图1大黄提取液与纳米银之比为100:1对大肠杆菌O157:H7协同抑菌作用
图1a 200 μL大黄提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1b 2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1c 100 μL大黄提取液与1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。
图2大黄提取液与纳米银之比为75:1对大肠杆菌O157:H7协同抑菌作用
图2a 150 μL大黄提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2b 2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2c 75 μL大黄提取液和1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。
图3大黄提取液与纳米银之比为50:1对藤黄微球菌协同抑菌作用
图3a 800 μL大黄提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图3b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图3c 400 μL大黄提取液和8 μL纳米银藤黄微球菌协同抑菌作用。
图4大黄提取液与纳米银之比为25:1对藤黄微球菌协同抑菌作用
图4a 400 μL大黄提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图4b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图4c 200 μL大黄提取液和8 μL纳米银藤黄微球菌协同抑菌作用。
具体实施方式
实施例1
1、大黄提取液的制备过程：
称取大黄50 g，加水量为450 mL，在95 ℃下提取4 h,经过真空旋转浓缩仪后，用0.22 μm滤膜除去提取液中的杂质和细菌，最后用高效液相色谱法测得提取液中大黄素含量为1.92 μg/g。
2、水溶性银纳米颗粒制备
取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末。
3、大黄提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。
a 、细菌的培养
挑取LB琼脂培养基上的大肠杆菌O157:H7的单菌落于10 mL LB肉汤培养基中，置于37 ℃培养箱中培养16 h，再按1％的接种量接种于5 mL的LB肉汤培养基中，37 ℃培养4 h后。取1 mL上述菌液用0.1%的蛋白胨水连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106 CFU/mL。
b、水溶性纳米银与大黄提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入200 μL大黄提取液（大黄素含量为1.92 μg/g，下同），向2号离心管中加入2 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入100 μL大黄提取液和1 μL浓度为10 mg/mL水溶性纳米银，4号离心管作为空白对照，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用0.1%的蛋白胨水补齐，置于37℃摇床培养箱培养2 h。每组实验平行三次。
c 、平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，100、10-1、10-2各取出200μL分别均匀涂布在
LB固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均涂布在LB
固体平板上。平板吹干后，37 ℃倒置培养12 h，长出菌落后计数，以30-300个菌落形成单
位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*5
实验结果如下：
| 抑菌物质 | 加入抑菌剂后能数出的菌落数 |
| 空白 | 6.5×107 CFU/mL |
| 200 μL的大黄提取液 | 2.6×106 CFU/mL |
| 含2 μL浓度为10 mg/mL的纳米银 | 4.8×102 CFU/mL |
| 含100 μL的大黄提取液与1μL浓度为10 mg/mL的纳米银 | 0 CFU/mL |
如图1所示，图1a 200 μL大黄提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1b 2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1c 100 μL大黄提取液与1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少大黄抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7起到协同的作用。
实施例2
1、大黄提取液的制备过程：
同实施例1。
2、水溶性银纳米颗粒制备
同实施例1。
3、大黄提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。
a 、细菌的培养
挑取LB琼脂培养基上的大肠杆菌O157:H7的单菌落于10 mL LB肉汤培养基中，置于37 ℃培养箱中培养16 h，再按1％的接种量接种于5 mL的LB肉汤培养基中，37 ℃培养4 h后。取1 mL上述菌液用0.1%的蛋白胨水连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106 CFU/mL。
b、水溶性纳米银与大黄提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入150 μL大黄提取液，向2号离心管中加入2 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入75 μL大黄提取液与1 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，4号离心管作为空白对照，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用0.1%的蛋白胨水补齐，置于37℃摇床培养箱培养2 h。每组实验平行三次。
c 、平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，100、10-1、10-2各取出200μL分别均匀涂布在
LB固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均涂布在LB
固体平板上。平板吹干后，37 ℃倒置培养12 h，长出菌落后计数，以30-300个菌落形成单
位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*5
实验结果如下：
| 抑菌物质 | 加入抑菌剂后能数出的菌落数 |
| 空白 | 5.7×106 CFU/mL |
| 150 μL的大黄提取液 | 2.6×106 CFU/mL |
| 含2 μL浓度为10 mg/mL的纳米银 | 4.8×102 CFU/mL |
| 含75 μL的大黄提取液、1 μL浓度为10 mg/mL的纳米银溶液 | 200 CFU/mL |
如图2所示，图2a 150 μL大黄提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2b 2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2c 75 μL大黄提取液和1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少大黄抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7起到协同的作用。
实施例3
1、大黄提取液的制备过程：
同实施例1。
2、水溶性银纳米颗粒制备
同实施例1。
3、大黄提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。
a 、细菌的培养
挑取牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的藤黄微球菌单菌落于5 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30 ℃培养箱中培养24 h，再按1％的接种量接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃培12 h后。取1 mL上述菌液在用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液中连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106～107 CFU/mL。
b、水溶性纳米银与大黄提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入800 μL大黄提取液（其中只加菌液500 μL），向2号离心管中加入16 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入400 μL大黄提取液和8 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，4号离心管作为空白对照，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液补齐。置于30℃摇床培养箱培养6 h，每组实验平行三次。
c 、平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，10-1、10-2、10-3各取出100μL分别均匀涂
布在牛肉膏蛋白胨固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体平板上。平板吹干后，30℃倒置培养48 h，长出菌落后计数，以20-200个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*10
| 抑菌物质 | 加入抑菌剂后能数出的菌落数 |
| 空白 | 1.4×107 CFU/mL |
| 800 μL的大黄提取液 | 2.1×106 CFU/mL |
| 含16 μL浓度为10 mg/mL的纳米银 | 1.3×106 CFU/mL |
| 含400 μL的大黄提取液与8μL浓度为10 mg/mL的纳米银 | 3.5×105 CFU/mL |
如图3所示，图3a 800 μL大黄提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图3b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图3c 400 μL大黄提取液和8 μL纳米银藤黄微球菌协同抑菌作用。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少大黄抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制藤黄微球菌起到协同的作用。
实施例4
1、大黄提取液的制备过程：
同实施例1。
2、水溶性银纳米颗粒制备
同实施例1。
4、大黄提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。
a 、细菌的培养
挑取牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的藤黄微球菌单菌落于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30 ℃培养箱中培养24 h，再按1％的接种量接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃培12 h后。取1 mL上述菌液在用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液中连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106～107 CFU/mL。
b、水溶性纳米银与大黄提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入400 μL大黄提取液，向2号离心管中加入16 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入200 μL大黄提取液和8 μL水溶性纳米银，4号离心管作为空白对照，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液补齐。置于30℃摇床培养箱培养6 h，每组实验平行三次。
c、平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，10-1、10-2、10-3各取出100μL分别均匀涂
布在牛肉膏蛋白胨固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体平板上。平板吹干后，30℃倒置培养48 h，长出菌落后计数，以20-200个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*10
| 抑菌物质 | 加入抑菌剂后能数出的菌落数 |
| 空白 | 1.6×107 CFU/mL |
| 400 μL的大黄提取液 | 2.6×106 CFU/mL |
| 含16 μL浓度为10 mg/mL的纳米银 | 1.54×106 CFU/mL |
| 含200 μL的大黄提取液与8 μL浓度为10 mg/mL的纳米银 | 6.5×105 CFU/mL |
如图4所示，图4a 400 μL大黄提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图4b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图4c 200 μL大黄提取液和8 μL纳米银藤黄微球菌协同抑菌作用。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少大黄抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制藤黄微球菌起到协同的作用。
Claims (3)
1.一种抑制大肠杆菌O157:H7的中药抑菌组合物，其特征在于由大黄提取液、水溶性纳米银组成； 所述大黄提取液制备包括如下步骤：加水量为大黄重量的9倍，经95 ℃水浴提取4 h，再经过减压浓缩得到提取液； 所述水溶性纳米银依照下列方法制备：取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末；大黄提取液、水溶性纳米银的体积比为 75～100:1。
2.如权利要求1所述中药抑菌组合物，其特征在于所得提取液经0.22 μm滤膜过滤。
3.如权利要求1~2任一所述中药抑菌组合物在制备抑制大肠杆菌O157:H7药物中的应用。
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| Title |
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| Optimization of parameters for the synthesis of bimodal Ag nanoparticles;Sang Min Kim et al;《Journal of Industrial and Engineering Chemistry》;20091231(第15期);全文 * |
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