CN108159328A - 一种具有抗病毒功效的山奈提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗病毒功效的山奈提取物及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：将山奈溶于乙醇溶液中，得到山奈与乙醇混合溶液；将山奈与乙醇混合溶液置于超声破碎仪中进行超声提取；然后用旋转蒸发仪浓缩，再冷冻干燥制成山奈提取物。本发明的山奈提取物解决了抗病毒药物耐药性的问题，且抗病毒谱广、毒副作用小。

Description

一种具有抗病毒功效的山奈提取物及其制备方法

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，具体地说，涉及一种具有抗病毒功效的山奈提取物及其制备方法。

背景技术

山奈(Kaempferia galanga L.)又名沙姜等，为姜科类多年生宿根草本植物。气辛香，味辛辣，是一种经济价值很高的热带作物，主产于广东、广西。以根茎入药，既是著名的中药，又是著名的香料和食物调味料。据《中国药典》记载，山奈具有行气、止痛、温中和化湿作用，常用于治疗胸腹冷痛、寒湿吐泻、牙痛等症。目前研究表明山奈提取物的生物活性成分，具有较好的抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等多种功效。

动物感染病毒后常造成机体生长缓慢，甚至致死，给畜牧生产带来严重的经济损失，某些人畜共患病毒病还威胁着人类健康。我国因病毒感染导致动物死亡的比率较高，仅次于细菌感染的致死率，且发病率呈上升趋势。目前对病毒病的防治方法主要为疫苗防治，由于病毒变异较快、疫苗质量不稳定、接种时间、亚临床感染等多种因素，导致疫苗接种效果不佳。许多病毒性疾病至今仍缺少可用疫苗以及其他效果确切的防治方法。金刚烷胺、利巴韦林、金刚乙胺等人用抗病毒药物，易产生残留危害人类健康，已完全禁止在兽药上的使用。鉴于化学药物易残留，并且对动物机体危害较大，如何开发新型的抗病毒药物亟待解决。许多中药有良好的抗病毒作用，且抗病毒谱广、毒副作用小、无耐药产生，大多数药物还具有增强机体免疫力的作用。但是存在效果较差，抗病毒作用不稳定等问题，所以，如何从中药中提取具有抗病毒功效的活性物质并且优化制备工艺是一个需要突破的重点问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有抗病毒功效的山奈提取物及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种具有抗病毒功效的山奈提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将山奈溶于乙醇溶液中，得到山奈与乙醇混合溶液；

步骤2、将山奈与乙醇混合溶液置于超声破碎仪中进行超声提取，得到山奈提取液；

步骤3、将山奈提取液用旋转蒸发仪浓缩，将体积浓缩50-100倍，然后进行凝固并过夜，再冷冻干燥制成山奈提取物。

进一步地，所述步骤1中的山奈与乙醇溶液的料液比(g/mL)为1:3～1:6。

进一步地，所述步骤1中的乙醇溶液通过以下方法制得：将无水乙醇与蒸馏水混合，不断搅拌，制备得到体积浓度为30％-90％的乙醇溶液。

进一步地，所述步骤2中的超声提取的功率为50～300W，时间为80～140min。

进一步地，所述步骤3中的浓缩温度为50-60℃，所述凝固温度为-15--25℃，过夜温度为-80℃。

进一步地，所述步骤3中的冷冻干燥温度为-45℃--55℃，冷冻干燥时间为20-28h。

本发明还公开了一种上述的制备方法制备得到的具有抗病毒功效的山奈提取物。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明的山奈提取物解决了抗病毒药物耐药性的问题，且抗病毒谱广、毒副作用小。

2)本发明的山奈提取物不会在动物体内产生药物残留，且不会危害人类健康。

3)目前市面上还没有开发以山奈及其提取物为基础的抗病毒产品，本发明的山奈提取物市场前景大，应用广泛。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明不同浓度山奈提取物对伪狂犬病毒的抑制率；

图2是本发明伪狂犬病毒感染小鼠脑组织中的病毒滴度。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种具有抗病毒功效的山奈提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将山奈按照料液比(g/mL)1:3～1:6溶于乙醇溶液中；其中，乙醇溶液通过以下方法制得：将无水乙醇与蒸馏水混合，不断搅拌制备得到体积浓度为30％-90％的乙醇溶液。

其中，在体积浓度为30％-90％范围内山奈提取物提取率随乙醇浓度的增大而增大，在乙醇浓度达到70％后，提取率达到最高值约1.533mg/g，继续增大乙醇浓度提取率反而降低。

步骤2、在超声破碎仪下，以50～300W的功率，提取80～140min；

其中，超声提取时间对山奈提取物的提取量影响较大，在80～140min范围内山奈提取物提取率随超声时间的增大而增大，在超声时间达到100min后，提取率达到最高值约2.3mg/g，继续增大超声时间提取率反而降低。

在50～300W范围内山奈提取物提取率随超声功率的增大而增大，在超声功率达到200W后，提取率达到最高值约1.58mg/g，继续增大超声功率提取率不再增大。

步骤3、然后用旋转蒸发仪在50-60℃下浓缩，将体积浓缩50-100倍即可，将浓缩液装进烧杯，放到-15--25℃凝固，然后转到-80℃存放过夜，再用冻干机在-45℃--55℃下冷冻干燥20-28h，制成山奈提取物。

实施例1

一种具有抗病毒功效的山奈提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将山奈按照料液比(g/mL)1:6溶于乙醇溶液中；其中，乙醇溶液通过以下方法制得：将无水乙醇与蒸馏水混合，不断搅拌制备得到体积浓度为70％的乙醇溶液；

步骤2、在超声破碎仪下，以200W的功率，提取100min；

步骤3、然后用旋转蒸发仪在55℃下浓缩，将体积浓缩80倍即可，将浓缩液装进烧杯，放到-20℃凝固，然后转到-80℃存放过夜，再用冻干机在-50℃下冷冻干燥24h，制成山奈提取物。

实施例2

一种具有抗病毒功效的山奈提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将山奈按照料液比(g/mL)1:3溶于乙醇溶液中；其中，乙醇溶液通过以下方法制得：将无水乙醇与蒸馏水混合，不断搅拌制备得到体积浓度为90％的乙醇溶液；

步骤2、在超声破碎仪下，以50W的功率，提取140min；

步骤3、然后用旋转蒸发仪在50℃下浓缩，将体积浓缩100倍即可，将浓缩液装进烧杯，放到-15℃凝固，然后转到-80℃存放过夜，再用冻干机在-55℃下冷冻干燥20h，制成山奈提取物。

实施例3

一种具有抗病毒功效的山奈提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将山奈按照料液比(g/mL)1:6溶于乙醇溶液中；其中，乙醇溶液通过以下方法制得：将无水乙醇与蒸馏水混合，不断搅拌制备得到体积浓度为30％的乙醇溶液；

步骤2、在超声破碎仪下，以300W的功率，提取80min；

步骤3、然后用旋转蒸发仪在60℃下浓缩，将体积浓缩50倍即可，将浓缩液装进烧杯，放到-25℃凝固，然后转到-80℃存放过夜，再用冻干机在-45℃下冷冻干燥28h，制成山奈提取物。

下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果：

1.山奈提取物在PK-15细胞上抗伪狂犬病毒活性测定

将PK-15在96孔细胞培养板中长成单层后，弃去培养液，PBS清洗2次，加入已经用细胞维持液稀释的病毒液100μL(100TCID₅₀)，同时加入细胞维持液2倍稀释的不同浓度的药物100μL(200、100、50、25、12.5μg/mL)，置于37℃培养箱中1h，而后吸出每孔中的病毒液，PBS清洗3次，加入含同样浓度药物的细胞维持液，在37℃、5％CO₂条件下培养至病毒对照CPE达75％，加入cck-8试剂，测定每空的吸光度，并计算不同浓度下药物对病毒的抑制率，按照上述Reed-Muech法计算半数抑制浓度(IC₅₀)。结果表明，山奈提取物对伪狂犬病毒的抑制率呈剂量依赖性，在浓度为200μg/mL时，对病毒的抑制率达90.69％(见图1)；半数抑制浓度为55.85±4.76μg/mL。

2.山奈提取物在小鼠体内抑制伪狂犬病毒活性研究

100只SPF小鼠(体重20g±g，雌雄各半)随机分为5组，分别为山奈提取物高、中、低剂量组，空白组和模型组。除空白组(等量生理盐水)以外，小鼠通过腹腔注射0.1mL，感染量为2×10⁴TCID₅₀的病毒；然后药物组小鼠分别灌胃给予剂量为50、25、12.5mg/kg的山奈提取物，空白组和模型组等于等量的生理盐水。在感染后第5天统计存活率，并通过荧光定量PCR技术检测小鼠脑组织中的病毒滴度。结果显示，药物组的存活率分别为40％、60％和90％，模型组存活率为40％，空白组为100％，说明山奈提取物能提高病毒感染小鼠的存活率；小鼠脑组织中的病毒量也显著低于模型组，低剂量组中脑病毒滴度相对于模型组降低了近10倍。

3、不同中药提取物抗伪狂犬病毒活性研究

将PK-15在96孔细胞培养板中长成单层后，弃去培养液，PBS清洗2次，加入细胞维持液稀释的病毒液100μL(100TCID50)，实验组同时加入细胞维持液2倍稀释的不同浓度的中药提取物100μL(200、100、50μg/mL)；病毒组加入细胞维持液100ul；空白组加细胞维持液200ul，置于37℃培养1h。然后吸出病毒液，PBS清洗3次后，每组加入相应浓度的药物，37℃培养72h，然后统计细胞病变情况(CPE)。如表1所示，山奈提取物对伪狂犬病毒的抑制效果最好，在浓度为200ug/ml时，山奈提取物对病毒的抑制率接近90％左右，而银杏叶、槐花、槐角的提取物对伪狂犬病毒基本无抑制作用，细胞病毒情况与病毒对照组相近。

表1不同中药提取物抗伪狂犬病毒活性

注：“-”表示细胞都正常；“+”表示出现低于25％的细胞病变；“++”表示约有25％～50％的细胞病变，“+++”表示出现50％～75％的细胞病变，“++++”表示出现75％～100％的细胞病变。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种具有抗病毒功效的山奈提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将山奈溶于乙醇溶液中，得到山奈与乙醇混合溶液；

步骤2、将山奈与乙醇混合溶液置于超声破碎仪中进行超声提取，得到山奈提取液；

步骤3、将山奈提取液用旋转蒸发仪浓缩，将体积浓缩50-100倍，然后进行凝固并过夜，再冷冻干燥制成山奈提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的山奈与乙醇溶液的料液比(g/mL)为1:3～1:6。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的乙醇溶液通过以下方法制得：将无水乙醇与蒸馏水混合，不断搅拌，制备得到体积浓度为30％-90％的乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的超声提取的功率为50～300W，时间为80～140min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的浓缩温度为50-60℃，所述凝固温度为-15--25℃，过夜温度为-80℃。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的冷冻干燥温度为-45℃--55℃，冷冻干燥时间为20-28h。

7.一种由权利要求1-6中任一权利要求所述的制备方法制备得到的具有抗病毒功效的山奈提取物。