CN104491121A - 一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液及其制备方法,所述抗菌精华液包括中药发酵液和植物精油。本发明的有益效果为:本发明是由复方中药与植物精油相混合,纯天然的具有抗菌抗病毒功能的抗菌精华液,用于治疗急慢性鼻炎、支气管炎、过敏性鼻炎和肺炎等呼吸系统感染问题,同时达到清热解毒,预防呼吸道疾病发生的功效。本发明的抗菌精华液天然无化学添加剂,在具有怡人气味的同时,抗菌能力优异,对常见呼吸道病毒及致病菌可达99.9%杀灭率。
Description
技术领域
本发明属于呼吸系统感染领域,具体涉及一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液及其制备方法。
背景技术
呼吸道疾病主要包括哮喘、扁桃体炎、咽炎、支气管炎等,上述这些疾病的发病率较高,目前主要采用西药治疗,西药治疗方案中绝大多数必须使用抗菌素,而这些疾病又是易反复发作的疾病,导致抗菌素的使用级别越来越高。但是众所周知抗菌素的危害又是普遍存在的,调查表明:儿童应用抗菌素5个月后,感染抗药性机率上升到100%,接受5种以上抗菌药的患者,并发药毒反应率高达80%;全国200万聋哑人中的60%左右患者都是儿童期使用抗菌素所造成等,因此,卫生部于2011年10月14日出台了史上最严的《抗菌药临床管理方法》,对抗菌素的使用进行专项整治,以此限制抗菌素乱用。但是,抗菌素乱用现象至今未得到根本改善。抗药菌的变种层出不穷,新研制的抗菌素、疫苗无法追上抗药菌的变异速度。而乱用抗菌素造成的微生物菌群失调及诱发的抗药菌泛滥、内环境污染导致的咽喉、气管壁粘膜组织结构慢性非特异性炎症病变及内生性免疫力、抵抗力防线的崩塌,使呼吸系统疾病的诊断容易,根治很难的现象一直无法解决。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题,本发明的目的在于提供一种由复方中药与植物精油相混合,纯天然的具有抗菌抗病毒功能的用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液。
本发明的另一目的是提供该用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液的制备方法。
本发明所采用的技术方案为:
一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其包括中药发酵液和植物精油。
优选地,所述中药发酵液和植物精油的体积比为1:3-4。
优选地,所述中药发酵液由包括以下重量份的组分制成:百里香4-8份、细辛1-3份、辛夷1-5份、苍耳子1-5份、异叶青兰3-5份和蛇床子2-5份。
优选地,所述植物精油包括以下体积百分比的组分:1.5-2.5%桧木精油、0.5-1.5%肖楠精油、0.5-1%香樟油、0.5-1%茶树精油和94-97%金银花鱼腥草提取液。
本发明采用多种有明显抗菌效果的天然草药及木本挥发油提取物混合制成,具杀毒灭菌、消炎宁神、顺畅呼吸等多种作用:
百里香,属(学名:Thymus mongolicus)是唇形科下的一属,包括大约350种多年生的芳香草本植物,最高约40厘米,生长在欧洲、北非和亚洲。一般是茎部窄细的常绿植物。具有药用价值,可拿来驱蚊,辛,微温。祛风解表,行气止痛,止咳,降压。用于感冒,咳嗽,头痛,牙痛,消化不良,急性胃肠炎,高血压病。
细辛,拉丁名:ASARIRADIXETRHIZOMA,本品为马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛AsarumsieboldiiMiq.var.seoulense,Nakai或华细辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根茎。前二种习称“辽细辛”。夏季果熟期或初秋采挖,除净地上部分和泥沙,阴干。性味归经:辛,温。归心、肺、肾经。功能与主治:祛风散寒,祛风止痛,通窍,温肺化饮。用于风寒感冒,头痛,牙痛,鼻塞流涕,鼻鼽,鼻渊,风湿痹痛,痰饮喘咳。
辛夷,拉丁名:MAGNOLIAEFLOS,本品为木兰科植物望春花MagnoliabiondiiPamp.、玉兰MagnoliadenudataDesr.或武当玉兰MagnoliasprengeriPamp.的干燥花蕾。冬末春初花未开放时采收,除去枝梗,阴干。性味归经:辛,温。归肺、胃经。功能与主治:散风寒,通鼻窍。用于风寒头痛,鼻塞流涕,鼻鼽,鼻渊。
苍耳子,拉丁名:XANTHIIFRUCTUS,本品为菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟带总苞的果实。秋季果实成熟时采收,干燥。除去梗、叶等杂质。性味归经:辛、苦,温;有毒。归肺经。功能与主治:散风寒,通鼻窍,祛风湿。用于风寒头痛,鼻塞流涕,鼻鼽,鼻渊,风疹瘙痒,湿痹拘挛。
异叶青兰(Dracocephalum heterophyllum Benth),唇形科多年生草木,生于高山和高原地区沙质河滩,砾石质山坡和高山草原等地,地上部分可入药,中文药材名青兰。性味:甘,寒。功能与主治:清泻肝热。用于黄疸性肝炎,肝火上升的牙龈肿痛,出血,口腔溃疡。
蛇床子,拉丁名:CNIDIIFRUCTUS,本品为伞形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss的干燥成熟果实。夏、秋二季果实成熟时采收,除去杂质,晒干。性味归经:辛、苦,温;有小毒。归肾经。功能与主治:燥湿祛风,杀虫止痒,温肾壮阳。用于阴痒带下,湿疹瘙痒,湿痹腰痛,肾虚阳痿,宫冷不孕。
鱼腥草属三白草科,蕺菜属野生草本植物,具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋等功效,在传统中药药剂中广泛应用于感染疾病。经过实验室现代化的检测方法,其作用原理被进一步证实。鱼腥草挥发成性成分与诸多因素有关,主要成分包括α-蒎烯2.59%,莰烯0.49%,香桧烯0.32%,β-蒎烯2.59%等。根据实验结果,鱼腥草提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及肺炎链球菌的MIC分别为1/16、1/8、1/16。
金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾,具抗菌,抗病毒,增强免疫,抗炎等多种功效。经色谱分析,其主要成分为:原绿酸、松油烯、9-羟基-2-壬酮等金银花提取物对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的MIC值为0.0312g/mL,对绿脓杆菌的MIC值为0.125g/mL。
茶树、香樟树都为多年生木本植物,具香气。其叶、根、树皮提取物常用作天然植物抗菌素。根据现代研究实验验证,茶树、香樟提取物对大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的MIC值皆可为200μl/L,对金黄色葡萄球菌的MIC值皆为250μl/L,对溶血性链球菌的MIC分别为500μl/L和250μl/L,对肺炎链球菌的MIC分别为1000μl/L和250μl/L。由结果可知,茶树、樟树提取物对常见呼吸道致病菌具有明显的灭菌能力。
肖楠、桧木、雪松、云杉等松柏类含有大量的烯萜类成分,具有抗菌、消炎、顺畅呼吸等功用。我国富有智慧的先民很早以前即发现这些植物的独特之处,根据《本草纲目》记载关于桧木的描述:枝节煮汁酿酒,去风痹、历节风。烧取油,疗疥及虫癞良;以及柏子、叶等“仁性平而不寒不燥,味甘而补、辛而能润,其气清香,能透心肾”。无独有偶,1930年由苏俄列宁格勒大学教授B.P.Toknnh博士提出研究报告,发现受伤的植物会释放出一种抑菌因子,能够抵御病毒与细菌的侵袭。B.P.Toknnh博士将这类植物释放出的天然抗菌因子称为芬多精,且松针类木本植物中芬多精的含量当属植物之最。台湾肖楠(Calocedrus macrolepis var.formosana)为台湾特有的树种,为了分析台湾肖楠叶部精油之化学品系,本研究萃取了12种来源之台湾肖楠叶子精油,经由气相层析-质谱仪(GC-MS)分析共鉴定出27种萜类化合物,精油成分以α-Pinene、Limonene、β-Myrcene、β-Caryophyllene Caryophyllene oxide为主。最强之杀菌活性只要40ppm(百万分之一)的浓度,就足以杀死金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、仙人掌杆菌、表皮葡萄球菌、肠炎弧菌、绿脓杆菌及白色念珠菌等,至于最顽强的肺炎杆菌,亦只需80ppm的肖楠精油即可杀死。桧木精油具有抗菌、抗螨、抗寄生虫、抗霉、抗病毒、抗肿瘤、消炎、降血压等功效。它可以治疗肺结核,对细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气性杆菌、肺炎杆菌、及奇异变形杆菌)的生长有很强的抑制效果。还可利尿、排毒、促进血液循环及心脏活力、减轻高血压及预防血管硬化、促进全身细胞新陈代谢活络。其独特的幽香气味能消除失眠、头痛、缓解焦虑,并可使精神集中、提升工作效率,营造友好气氛。还能帮助情绪不稳定的人,如果忧郁、焦虑、紧张等。对精神压力造成的失眠也有帮助。
本发明根据中医相生相乘原理,将有利于呼吸道系统的植物,百里香、细辛、辛夷、苍耳子、异叶青兰和蛇床子发酵,产生的代谢产物发现具促进伤口修复功能作用。鱼腥草和金银花提取液中的癸酸乙醛(俗称鱼腥草素)为抗菌的有效成分,对卡他球、溶血性链球菌、肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,对大肠杆菌、痢疾杆菌及伤寒杆菌等也有抑制作用。金银花的提取物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定程度的抗菌作用,尤其对耐药性细菌,具有抗生素无法比拟的抑菌活性,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌,是医院感染的主要病原菌之一,可产生多种外毒素,毒性高,侵袭性强,可引起儿童、老年人、免疫力低下者和长期住院患者医院获得性肺炎、化脓性伤口感染和脓毒败血症等疾患,严重感染时常可导致死亡。富含萜烯类的精油对于黏膜的作用相当重要,单萜烯像松科类精油,能激励黏液产生激素而溶解黏液。故有益于呼吸系统。
本发明整个配伍将清热解毒类百里香、细辛、辛夷、苍耳子、异叶青兰和蛇床子的植物发酵物与含有肖楠醇的桧木精油及肖楠精油等植物合成化学物质起了加乘作用,发现抗菌率达99.9%。
本发明中的精油均购于FPI sales Taiwan公司。
制备上述的用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液的方法,所述方法包括以下步骤:
1)按重量份称取百里香、细辛、辛夷、苍耳子、异叶青蓝和蛇床子后混匀,将混匀后的中药混合物破碎至颗粒粒径为15-20目,在破碎后的中药混合物中加入蒸馏水得到中药混合液,所述破碎后的中药混合物与蒸馏水的质量比为1:3,再将中药混合液在超声波中以40KHz的频率处理30分钟;
2)将超声波处理后的中药混合液煮沸后于室温下静置冷却18-24小时;
3)将冷却后的中药混合液置入5升搅拌釜式发酵罐中;在搅拌釜式发酵罐中接入发酵菌种,在26-32℃的温度下,厌氧发酵15-20天,期间每隔3日检查菌落生长状况,当每毫升发酵液中平均含菌量达到2.5×108CFU/mL时,停止发酵;
4)将发酵液用纱布初滤除去药渣,将初滤液在6000r/min的转速下离心5分钟得到过滤液,然后将过滤液在40℃的温度下加入1%粉状活性炭后搅拌40分钟,用真空抽滤去除粉状活性炭和残余杂质得到脱色液;将脱色液在80-90.6KPa下浓缩得到中药发酵液;
5)取金银花和鱼腥草按照1:6的重量比混合,洗净破碎后用水蒸气蒸馏法得到金银花鱼腥草提取液;
6)在步骤4)得到的中药发酵液中加入金银花鱼腥草提取液,再加入桧木精油、肖楠精油、香樟油和茶树精油,得到中药发酵液和植物精油的混合液,将中药发酵液和植物精油的混合液用蒸馏水稀释2-10倍后,即得抗菌精华液。
优选地,步骤3)中在接入发酵菌种之前,在搅拌釜式发酵罐中加入重量为500克,质量比为3:2混合的红糖和豆粉,以满足发酵菌种前期生长所需要的碳源和氮源。
优选地,步骤3)中所述发酵菌种为EM复合菌种,所述EM复合菌种包括芽孢杆菌、双气杆菌、乳酸杆菌、光合细菌、黑曲霉和酵母菌。
本发明抗菌精华液为外用药,擦涂于鼻腔,具体为每次采用本发明的抗菌精华液1-2mL沾湿棉棒,用沾湿有本发明抗菌精华液的棉棒擦涂鼻腔,每天早中晚三次。
本发明的有益效果为:本发明是由复方中药与植物精油相混合,纯天然的具有抗菌抗病毒功能的抗菌精华液,用于治疗急慢性鼻炎、支气管炎、过敏性鼻炎和肺炎等呼吸系统感染问题,同时达到清热解毒,预防呼吸道疾病发生的功效。本发明的抗菌精华液天然无化学添加剂,在具有怡人气味的同时,抗菌能力优异,对常见呼吸道病毒及致病菌可达99.9%杀灭率。
附图说明
图1是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中空白对照组的镜检图一;
图2是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中空白对照组的镜检图二;
图3是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中阴性对照组的镜检图一;
图4是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中阴性对照组的镜检图二;
图5是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中阳性对照组的镜检图一;
图6是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中阳性对照组的镜检图二;
图7是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中实验组的镜检图一;
图8是本发明小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试中实验组的镜检图二。
具体实施方式
实施例1
本发明提供了一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其包括中药发酵液和植物精油。
所述中药发酵液和植物精油的体积比为1:3。
所述中药发酵液由包括以下重量份的组分制成:百里香4份、细辛1份、辛夷1份、苍耳子1份、异叶青兰3份和蛇床子2份。
所述植物精油包括以下体积百分比的组分:1.5%桧木精油、0.5%肖楠精油、0.5%香樟油、0.5%茶树精油和97%金银花鱼腥草提取液。
制备上述的用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液的方法,所述方法包括以下步骤:
1)按重量份称取百里香、细辛、辛夷、苍耳子、异叶青蓝和蛇床子后混匀,将混匀后的中药混合物破碎至颗粒粒径为15目,在破碎后的中药混合物中加入蒸馏水得到中药混合液,所述破碎后的中药混合物与蒸馏水的质量比为1:3,再将中药混合液在超声波中以40KHz的频率处理30分钟;
2)将超声波处理后的中药混合液煮沸后于室温下静置冷却18小时;
3)将冷却后的中药混合液置入5升搅拌釜式发酵罐中;在搅拌釜式发酵罐中加入重量为500克以任意比例混合的红糖水和豆粉,以满足发酵菌种前期生长所需要的碳源和氮源,在搅拌釜式发酵罐中接入EM复合菌种作为发酵菌种,在26-32℃的温度下,厌氧发酵15-20天,期间每隔3日检查菌落生长状况,当每毫升发酵液中平均含菌量达到2.5×108CFU/mL时,停止发酵;
4)将发酵液用纱布初滤除去药渣,将初滤液在6000r/min的转速下离心5分钟得到过滤液,然后将过滤液在40℃的温度下加入1%粉状活性炭后搅拌40分钟,用真空抽滤去除粉状活性炭和残余杂质得到脱色液;将脱色液在80KPa下浓缩得到中药发酵液;
5)取金银花50g和鱼腥草300g,洗净破碎后用水蒸气蒸馏法得到金银花鱼腥草提取液;
6)在步骤4)得到的中药发酵液中加入金银花鱼腥草提取液,再加入桧木精油、肖楠精油、香樟油和茶树精油,得到中药发酵液和植物精油的混合液,将中药发酵液和植物精油的混合液用蒸馏水稀释2倍后,即得抗菌精华液。
实施例2
本发明提供了一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其包括中药发酵液和植物精油。
所述中药发酵液和植物精油的体积比为1:3.5。
所述中药发酵液由包括以下重量份的组分制成:百里香5份、细辛2份、辛夷3份、苍耳子3份、异叶青兰4份和蛇床子3份。
所述植物精油包括以下体积百分比的组分:2%桧木精油、1%肖楠精油、0.8%香樟油、0.8%茶树精油和95.4%金银花鱼腥草提取液。
制备上述的用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液的方法,所述方法包括以下步骤:
1)按重量份称取百里香、细辛、辛夷、苍耳子、异叶青蓝和蛇床子后混匀,将混匀后的中药混合物破碎至颗粒粒径为18目,在破碎后的中药混合物中加入蒸馏水得到中药混合液,所述破碎后的中药混合物与蒸馏水的质量比为1:3,再将中药混合液在超声波中以40KHz的频率处理30分钟;
2)将超声波处理后的中药混合液煮沸后于室温下静置冷却18-24小时;
3)将冷却后的中药混合液置入5升搅拌釜式发酵罐中;在搅拌釜式发酵罐中加入重量为500克,质量比为3:2的红糖和豆粉,以满足发酵菌种前期生长所需要的碳源和氮源,在搅拌釜式发酵罐中接入EM复合菌种作为发酵菌种,在26-32℃的温度下,厌氧发酵15-20天,期间每隔3日检查菌落生长状况,当每毫升发酵液中平均含菌量达到2.5×108CFU/mL时,停止发酵;
4)将发酵液用纱布初滤除去药渣,将初滤液在6000r/min的转速下离心5分钟得到过滤液,然后将过滤液在40℃的温度下加入1%粉状活性炭后搅拌40分钟,用真空抽滤去除粉状活性炭和残余杂质得到脱色液;将脱色液在85KPa下浓缩得到中药发酵液;
5)取金银花50g和鱼腥草300g,洗净破碎后用水蒸气蒸馏法得到金银花鱼腥草提取液;
6)在步骤4)得到的中药发酵液中加入金银花鱼腥草提取液,再加入桧木精油、肖楠精油、香樟油和茶树精油,得到中药发酵液和植物精油的混合液,将中药发酵液和植物精油的混合液用蒸馏水稀释5倍后,即得抗菌精华液。
实施例3
本发明提供了一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其包括中药发酵液和植物精油。
所述中药发酵液和植物精油的体积比为1:4。
所述中药发酵液由包括以下重量份的组分制成:百里香8份、细辛3份、辛夷5份、苍耳子5份、异叶青兰5份和蛇床子5份。
所述植物精油包括以下体积百分比的组分:2.5%桧木精油、1.5%肖楠精油、1%香樟油、1%茶树精油和94%金银花鱼腥草提取液。
制备上述的用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液的方法,所述方法包括以下步骤:
1)按重量份称取百里香、细辛、辛夷、苍耳子、异叶青蓝和蛇床子后混匀,将混匀后的中药混合物破碎至颗粒粒径为20目,在破碎后的中药混合物中加入蒸馏水得到中药混合液,所述破碎后的中药混合物与蒸馏水的质量比为1:3,再将中药混合液在超声波中以40KHz的频率处理30分钟;
2)将超声波处理后的中药混合液煮沸后于室温下静置冷却24小时;
3)将冷却后的中药混合液置入5升搅拌釜式发酵罐中;在搅拌釜式发酵罐中加入重量为500克以任意比例混合的红糖水和豆粉,以满足发酵菌种前期生长所需要的碳源和氮源,在搅拌釜式发酵罐中接入EM复合菌种作为发酵菌种,在26-32℃的温度下,厌氧发酵15-20天,期间每隔3日检查菌落生长状况,当每毫升发酵液中平均含菌量达到2.5×108CFU/mL时,停止发酵;
4)将发酵液用纱布初滤除去药渣,将初滤液在6000r/min的转速下离心5分钟得到过滤液,然后将过滤液在40℃的温度下加入1%粉状活性炭后搅拌40分钟,用真空抽滤去除粉状活性炭和残余杂质得到脱色液;将脱色液在90.6KPa下浓缩得到中药发酵液;
5)取金银花50g和鱼腥草300g,洗净破碎后用水蒸气蒸馏法得到金银花鱼腥草提取液;
6)在步骤4)得到的中药发酵液中加入金银花鱼腥草提取液,再加入桧木精油、肖楠精油、香樟油和茶树精油,得到中药发酵液和植物精油的混合液,将中药发酵液和植物精油的混合液用蒸馏水稀释10倍后,即得抗菌精华液。
本专利研发的呼吸道抗菌精华液通过将多种具有抗菌能力的天然植物成分相混合,经实验表明,可以获得比单一成分(见表1)获得更好的抗菌效果,并且使用过程舒适温和不刺激,对慢性鼻炎、支气管炎、过敏性鼻炎和肺炎等呼吸系统感染具有显著的疗效。与当下市售治疗鼻炎产品相比,具有刺激性小,杀菌力强,纯天然又见效快等诸多优势。
表1单一成分抗菌效果
其中鱼腥草的数据来源于文献王文红.鱼腥草提取物体外抑菌实验研究[J].实用中西医结合临床,2010,1(10):87-88。金银花的数据来源于文献陈寿妮.金银花提取液抑菌活性的研究[J]时珍国医国药,2014,Vol25(3):609-610。
为了说明本发明的效用,下面通过实验数据对本发明作进一步详细的说明:
1抗菌实验
1.1材料:本发明实施例2中的抗菌精华液;供试菌株:大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,肺炎杆菌,肺炎链球菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌购于中国兽医药品检查所;肺炎杆菌,肺炎链球菌由广东微生物研究所提供。
1.2方法
1.2.1悬浊液制备:取菌种于BHI肉汤活化24小时;平板分离单个菌落;挑取单个菌落制成1.5×108CFU/mL的菌悬液。
1.2.2最小抑菌浓度(MIC)测定:参考《消毒技术规范》(中华人民共和国卫生部令(第27号)——《消毒管理办法》2002),将本发明的抗菌精华液,采用试管二倍稀释法,测定最小抑菌浓度(MIC)。取13mm×100mm灭菌具塞试管11支,编号排列于试管架。于每管先各吸取2mL的营养肉汤,然后于第1管中加入本呼吸道抗菌抗病毒药剂2mL,混匀后取出2mL放入第2管中;再混匀取出2mL放入第3管,以此类推,直至第9管取出2mL弃去,由此配置出含有本发明抗菌精华液分别为1:1,1:2,1:4至1:28的各浓度液体。第10管加2mL去离子水作为空白对照;第11管加入2mL本发明抗菌精华液混匀后取出2mL弃去,用以观察药剂是否受到污染。在第1至第10管内接种实验菌,混匀后放入37℃培养箱中培养24hr观察记录结果。以不显示浑浊,细菌未生长的那一支试管的稀释度为最小抑菌浓度(MIC)。
1.2.3抑菌效果测定:在含有100mL灭菌营养肉汤的200mL锥形瓶瓶中接种实验菌,经37℃的温度下,培养10-16小时,使菌液浓度在105-106范围内,用血球计数板测定菌悬液浓度。将本呼吸道抗菌抗病毒药剂以1:10的比例加入菌悬液中。经37℃的温度下,培养24hr小时后,加入染色液用血球计数版测定活菌浓度。
1.3结果与分析
1.3.1抑菌效果测定结果
表2为抑菌效果测定结果,从表2中可知,本发明的抗菌精华液对呼吸道常见致病菌有明显的抑制效果。
表2抑菌效果测定结果
菌株 | 原接菌量(105CFU/mL) | 作用后菌量(CFU/mL) | 抑菌率R(%) |
大肠杆菌 | 2.55 | <1.5 | >99.9 |
金黄色葡萄菌 | 1.37 | <1 | >99.9 |
绿脓杆菌 | 1.54 | <1 | >99.9 |
肺炎杆菌 | 9.35 | <10 | >99.9 |
肺炎链球菌 | 3.85 | <10 | >99.9 |
1.3.2最小抑菌浓度(MIC)测定结果表3为本发明抗菌精华液对各种细菌的最小抑制浓度MIC,由表3可知,对大肠杆菌、绿脓杆菌,本发明抗菌精华液的MIC值为0.0156g/mL,而对金黄色葡萄球菌,肺炎杆菌,肺炎链球菌,本发明抗菌精华液的MIC值为0.0313g/mL。结果说明,本发明抗菌精华液对常见呼吸道致病菌有强效的杀灭作用,特别是大肠杆菌及绿脓杆菌。并且随着浓度增大,抑菌效果增强。
表3本发明抗菌精华液对各种细菌的最小抑菌浓度MIC
注:1、浓度的单位为g/mL,2、表中“-”表示无菌生长,“+”表示有菌生长
2.小鼠肺纤维母细胞毒性反应测试
2.1实验目的
由于各试验物质在使用上会与人体有程度不一的接触,为了避免在使用过程可能产生的有害物质伤害人体,必须审慎测试并评估其使用上的安全性。本研究以体外细胞毒性试验,来测试本专利药剂在使用时可能释放出的物质对细胞产生的毒性。此试验体系为小鼠肺纤维母细胞株,试验物质对细胞毒性试验方法则是根据ISO10993-5,ISO10993-12及ASTM F895-11规范,以琼脂扩散法对细胞外观与单层细胞生长密度做定性观察,最后给予评分。评分的结果可作为判断是否产生细胞毒性的标准,并藉此评估各试验物质在使用上的安全性。
2.2实验设计
2.2.1试验体系
A.细胞株:小鼠肺纤维母细胞株(L929cells,Food Industry Research andDevelopment Institute,StrainNo.BCRC 60091,Bank no.20110506-1-E-01.)
B.型态:单层纺锤型附着生长。
C.培养条件:使用含10%马血清培养基培养,置于饱和水蒸气37±1℃恒温培养箱中,二氧化碳浓度为5±1%。
2.2.2实验试剂
胰蛋白酶溶液、马血清、L-麸酰胺酸溶液、青霉素、完全培养液、纯化琼脂、中性红溶液、丙酮酸钠溶液、基本培养液、磷酸缓冲液。
2.2.3试验物质及对照物质制备
A.试验物质
将本发明抗菌精华液在无菌环境下以无菌操作技术进行制备。取30μL本发明抗菌精华液滴入无菌滤纸圆盘上使饱和并直接接触于琼脂表面,即为试验物质。pH值调整、过滤与离心于本实验中未被执行。
B.对照物质
a.空白对照组:空白试剂对照组为完整细胞培养液(MEM),滴入30μL于无菌滤纸圆盘使的饱和并直接接触于琼脂表面。
b.阳性对照组:阳性对照组为含有ZDEC之聚氨酯片(Polyurethane filmcontaining Zinc Di-Ethyldithio-Carbamate,RM-A,Hatano Research Institute,Japan)萃取液,将此物质以0.2g/mL的比例加入完整细胞培养液(MEM),于37±1℃震荡萃取24±2小时,滴入30μL萃取液于无菌滤纸圆盘使之饱和并直接接触于琼脂表面做为阳性对照组。
c.阴性对照组:阴性对照组为1X磷酸缓冲液,滴30μL于无菌过滤盘使饱和。
d.pH值调整、过滤与离心于本实验中未被执行。
2.2.4体外细胞毒性试验-琼脂扩散法
A.细胞培养方式
a.完整细胞培养液的配置
将435mL基本培养液(MEM)、5mL抗生素溶液(PenicillinStreptomycinsolution)、5mL L-麸酰胺酸溶液(L-Glutamine solution)、5mL丙酮酸钠溶液与50mL马血清均匀混合之后,于4℃中保存。
b.细胞的制备
本试验利用小鼠肺纤维母细胞株(L929cells,Food Industry Research andDevelopment Institute,Strain No.BCRC 60091)来评估细胞毒性。将细胞接种在10cm培养皿中,在含有5±1%二氧化碳、温度37±1℃环境下进行培养。细胞在进行继代培养时,先将细胞以1X磷酸缓冲液清洗过后,在温度37±1℃环境下以胰蛋白酶处理细胞3分钟,此时细胞将从培养皿上脱附。加入适量完整细胞培养液,均匀混合后转移至新的培养皿上进行培养。
B.体外细胞毒性试验
a.将每孔含有3×105cells的6孔细胞培养盘,在含有5±1%二氧化碳、温度37±1℃环境下进行培养24±2小时。
b.培养基的制备
0.11g碳酸氢钠溶解于10mL10X最低需求培养液,并加去离子水约25mL后调整pH值为7.15,再加入1mL抗生素溶液(100XPenicillin-Streptomycin solution,100X)、1mL L-麸酰胺酸溶液(L-Glutaminesolution,100X)、1mL丙酮酸钠(sodium pyruvate,100x)与10mL马血清均匀混合之后,最后以去离子水定量至50mL,并以0.22μm无菌滤膜过滤。过滤后与等量之已灭菌3%纯化琼脂均匀混合后即为1X培养基。
c.将培养液吸除,加入2mL已配制好之1X培养基。
d.在室温中静置使之凝固形成平面。
e.将试验组、阴性及阳性对照组试验物质小心的置放在凝固的培养基上,再放入温度37±1℃的培养箱中进行培养24±2小时。
f.24小时后将试验物质位置标记后并移除试验物质。
g.加入2mL中性红溶液予以染色1小时。
h.染色完成后吸除中性红溶液,在显微镜下观察并记录细胞外观与单层细胞密度。
i.表4为琼脂扩散法的反应等级表,根据表4的标准评估没有被中性红溶液染色的区域和区域内受到毒性影响的细胞数的反应等级。藉由显微镜观察在区域范围内细胞的生长状况是否有畸形、退化、死亡或细胞溶解的情形发生,另外也可以由观察细胞数的密度来判别。
2.2.5实验结果判定方法
定性的结果依据ISO10993-5及ASTM F895-11规范,并以表4作为细胞反应评分基准。评估三重复中个别的等级,再将三重复的等级平均后,即为定性评分,细胞反应等级超过2级,即认为试验物质具有细胞毒性。
表4琼脂扩散法的反应等级表
等级 | 细胞反应 | 毒性反应叙述 |
0 | 无 | 样品下方无可见的为染色区域 |
1 | 细微 | 样品下方有畸形或变性的细胞 |
2 | 轻微 | 仅样品下方可见未染色区域 |
3 | 中度 | 未染色区域超过样品范围但在1cm以内 |
4 | 严重 | 未染色区域超过样品范围达1cm以上 |
2.2.6实验结果
依据表4与图1-8显示,图3-4阴性对照组之细胞生长密度与图1-2空白对照组并无明显差别,并无出现可见之未染色区,因此给予评分为0的无细胞反应。而图5-6阳性对照组未染色区域超越样品范围在1.0公分以内,因此给予评分为3的中度细胞反应。图7-8实验组的细胞生长密度显示样品下方有可见之未染色区,因此给予评分为2的细胞反应等级。
表5实验结果汇总
2.2.7结论
细胞毒性试验全部的反应等级评分结果都整理于表5中。依ISO10993-5及ASTM F895-11反应等级评分的结果显示,本发明抑菌剂对小鼠肺纤维母细胞无细胞毒性。
3.临床案例
案例一:王女士,28岁,白领,晨起或者夜晚或接触过敏原后阵发性喷嚏连续几十个不止、鼻内发痒清水样鼻涕、鼻塞。伴有嗅觉减退多在立刻发作大量清水样鼻涕,有时可不自觉从鼻孔滴下,鼻黏膜苍白、双下甲水肿,总鼻道及鼻底可见清涕或黏涕。下鼻甲与鼻底,鼻中隔紧靠,见不到中鼻甲,或中鼻甲息肉样变,息肉形成,使用本发明抗菌精华液,每天用棉花棒沾湿,早中晚擦鼻腔治疗,经两个月治疗,偶尔打喷嚏、鼻内略发痒,少许鼻涕、鼻塞下鼻甲轻度肿胀,鼻中隔、中鼻甲尚可见,记录为+。再坚持治疗两个月,晨起不再打喷嚏,流鼻涕,鼻黏膜正常,鼻甲清晰可见,为非常成功的治疗个案。
案例二:陈先生,抽烟,有慢性鼻炎史,纺织业者,35岁,因加班忙着赶工把货交给客户,连续几天都熬夜加班,夜晚回家时突然下了一场雨,因淋雨而受凉再加上连续的劳累加班,回家后突然寒战、高热,体温高达40℃,第二天紧急送院治疗。发烧呈稽留热型,伴有头痛、全身肌肉酸软、纳差,可咯出黏液血性痰、铁锈色痰、脓性痰,剧烈胸痛,呈针刺样,随咳嗽或深呼吸而加重,可向肩或腹部放射。下叶肺炎可刺激隔胸膜引起腹痛,白细胞总数13×109个/L,中性白细胞百分比超过75%,痰培养金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌是致病菌,经由医院使用抗生素治疗,陈先生有耐药现象效果不佳,家属提出中西医结合治疗,本发明抗菌精华液,可以杀灭金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌99.9%,后来决定用雾化器配合本专利呼吸道抗菌精华液吸雾治疗3天,脱离危险,从重症病房转入普通病房,观察几天后,一星期出院。
本发明实施例1和实施例3中的抗菌精华液,也同样采用了上述实验,实验结果与上述相同。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其特征在于:其包括中药发酵液和植物精油。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其特征在于:所述中药发酵液和植物精油的体积比为1:3-4。
3.根据权利要求1所述的一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其特征在于:所述中药发酵液由包括以下重量份的组分制成:百里香4-8份、细辛1-3份、辛夷1-5份、苍耳子1-5份、异叶青兰3-5份和蛇床子2-5份。
4.根据权利要求1所述的一种用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液,其特征在于:所述植物精油包括以下体积百分比的组分:1.5-2.5%桧木精油、0.5-1.5%肖楠精油、0.5-1%香樟油、0.5-1%茶树精油和94-97%金银花鱼腥草提取液。
5.制备权利要求1-4之一所述的用于治疗呼吸道疾病的抗菌精华液的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:
1)按重量份称取百里香、细辛、辛夷、苍耳子、异叶青蓝和蛇床子后混匀,将混匀后的中药混合物破碎至颗粒粒径为15-20目,在破碎后的中药混合物中加入蒸馏水得到中药混合液,所述破碎后的中药混合物与蒸馏水的质量比为1:3,再将中药混合液在超声波中以40KHz的频率处理30分钟;
2)将超声波处理后的中药混合液煮沸后于室温下静置冷却18-24小时;
3)将冷却后的中药混合液置入5升搅拌釜式发酵罐中;在搅拌釜式发酵罐中接入发酵菌种,在26-32℃的温度下,厌氧发酵15-20天,期间每隔3日检查菌落生长状况,当每毫升发酵液中平均含菌量达到2.5×108CFU/mL时,停止发酵;
4)将发酵液用纱布初滤除去药渣,将初滤液在6000r/min的转速下离心5分钟得到过滤液,然后将过滤液在40℃的温度下加入1%粉状活性炭后搅拌40分钟,用真空抽滤去除粉状活性炭和残余杂质得到脱色液;将脱色液在80-90.6KPa下浓缩得到中药发酵液;
5)取金银花和鱼腥草按照1:6的重量比混合,洗净破碎后用水蒸气蒸馏法得到金银花鱼腥草提取液;
6)在步骤4)得到的中药发酵液中加入金银花鱼腥草提取液,再加入桧木精油、肖楠精油、香樟油和茶树精油,得到中药发酵液和植物精油的混合液,将中药发酵液和植物精油的混合液用蒸馏水稀释2-10倍后,即得抗菌精华液。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤3)中在接入发酵菌种之前,在搅拌釜式发酵罐中加入重量为500克,质量比为3:2混合的红糖和豆粉,以满足发酵菌种前期生长所需要的碳源和氮源。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤3)中所述发酵菌种为EM复合菌种,所述EM复合菌种包括芽孢杆菌、双气杆菌、乳酸杆菌、光合细菌、黑曲霉和酵母菌。
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