CN102895341B - 黄连提取物与纳米银抑菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了黄连提取物与纳米银抑菌组合物，属于中药领域。抑菌组合物中黄连提取液与水溶性纳米银两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7起到协同的作用。本发明的一种黄连提取物与纳米银抑菌组合物与现有的技术相比，解决了常规抑菌方法中黄连抑菌剂用量较大的问题，同时采用两种低剂量的抑菌物质减少了微生物耐药的发生机率、降低了其对人体的毒性，更加的安全。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，尤其涉及一种中药抑菌组合物。
背景技术
黄连属多年生草本，根茎黄色，常分枝，密生多数须根，为毛茛科的黄连，三角叶黄连或者云莲的干燥根茎。其主要分布于四川、贵州、湖南、湖北、陕西南部，具有清热燥湿，泻火解毒的功效。盐酸小檗碱（黄连素）是其主要的有效成分。现代药理实验研究表明黄连具有抗病原微生物作用，同时对金黄色葡萄球菌、大肠埃氏菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎双球菌、痢疾杆菌、炭疽杆菌、流感病毒、乙肝病毒等都具有抑制作用。除此之外，黄连还有降血糖、抗肿瘤、抗腹泻、利胆、抗心律失常、抗炎以及免疫调节等作用。黄连因其具有较高的药用和保健价值，广泛引起了人们关注。
中药制剂浓缩液制成口服液或抑菌组合物、涂覆剂等一次用剂量大，且长期使用影响人体健康。
发明内容
针对黄连抑菌组合物一次用量大和长期使用影响人体健康问题，本发明人经过大量实验，发现纳米银能有效增强黄连提取液抑菌性能，减少黄连抑菌剂的用量，且采用两种低剂量的抑菌组合物，更加的安全。本发明的目的在于提供一种黄连纳米银抑菌组合物，减少黄连抑菌剂一次的用剂量和降低药品对人体的毒性。
本发明提供如下技术方案：
一种抑菌组合物，含有黄连提取液、水溶性纳米银；
黄连提取液制备包括如下步骤：取干药材黄连，加水量为黄连重量的9倍，经95 ℃水浴提取4 h，再经过减压浓缩得到提取液；所得提取液经0.22 μm滤膜过滤。所得提取液经高效液相色谱法对黄连素进行标准定量。
抑制大肠杆菌O157:H7时，黄连提取液、水溶性纳米银的体积比为26.6~30:1。抑制藤黄微球菌时，黄连提取液、水溶性纳米银的体积比为1~1.2:1。在算体积时提取液中黄连素的含量为：28 mg/mL，水溶性纳米银浓度为10 mg/mL。
水溶性纳米银颗粒粒径为3～10 nm，纳米银外表包覆两性聚合物。
水溶性纳米银粒径为3～10 nm，外表为羧基，依照下列方法制备：取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末。依照本方法制备的水溶性纳米银颗粒与黄连提取液具有良好的协同抗菌作用。
本发明还涉及上述抑菌组合物在抑制大肠杆菌O157:H7中的应用。
本发明还涉及上述抑菌组合物在抑制藤黄微球菌中的应用。
本发明的有益效果是：本发明水溶性纳米银的应用能有效增强黄连抑菌性能，降低黄连抑菌剂的用量，更令人意想不到的是两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7和藤黄微球菌起到协同作用，同时本抑菌组合物采用两种低剂量的抑菌物质，相对于使用高剂量的黄连或者水溶性纳米银，更加的安全，可以作为安全可靠地外用涂覆剂等。
附图说明
图1黄连提取液与水溶性纳米银之比为30:1的协同抑菌。
图1a 2 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制结果，图1b 60 μL黄连提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制结果，图1c 30 μL黄连提取液与1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制结果。
图2 黄连提取液与水溶性纳米银之比为26.6:1的协同抑菌
图2a 表示的是1.5 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑菌结果，图2c表示的是40 μL黄连提取液对大肠杆菌O157:H7的抑菌结果，图2c表示的是0.75 μL纳米银、20 μL黄连提取液混合物对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌结果。
图3黄连提取液与水溶性纳米银之比为1的协同抑菌
图3a 表示的是16 μL纳米银对藤黄微球菌的抑菌结果，图3b表示的是16 μL黄连提取液对藤黄微球菌的抑菌结果，图3c表示的是8 μL纳米银、8 μL黄连提取液对藤黄微球菌的协同抑菌结果。
图4黄连提取液与水溶性纳米银之比为5:8的协同抑菌
图4a 表示的是16 μL纳米银对藤黄微球菌的抑菌结果，图4b表示的是10 μL黄连提取液对藤黄微球菌的抑菌结果，图4c表示的是8 μL纳米银与5 μL黄连提取液对藤黄微球菌的协同抑菌结果。
具体实施方式
实施例1
1、黄连提取液的制备过程：称取干药材黄连50 g， 加水量为450 mL，在95 ℃下提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪浓缩得到提取液，经0.22 μm滤膜过滤后，最后再用高效液相色谱法测得提取液中黄连素的含量为：28 mg/mL。
2、水溶性银纳米颗粒制备：
取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末。
3、黄连提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。
a 细菌的培养
挑取LB琼脂培养基上的大肠杆菌O157:H7的单菌落于10 mL LB肉汤培养基中，置于37 ℃培养箱中培养16 h，再按1％的接种量接种于5 mL的LB肉汤培养基中，37 ℃培养4 h后。取1 mL上述菌液用0.1%的蛋白胨水连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106 CFU/mL。
b水溶性纳米银与黄连提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入60 μL黄连提取液（黄连素的含量为28 mg/mL，下同），向2号离心管中加入2 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入30 μL黄连提取液和1 μL浓度为10 mg/mL水溶性纳米银，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用0.1%的蛋白胨水补齐。置于37 ℃培养2 h。每组实验平行三次。
c平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，100、10-1、10-2各取出200μL分别均匀涂
布在LB固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均涂布在
LB固体平板上。平板吹干后，37℃倒置培养12 h，长出菌落后计数，以30-300个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*5
实验结果如下：
| 抑菌剂 | 加入抑菌剂后所能数出的菌落数 |
| 含2 μL 浓度为10 mg/mL羧基化纳米银 | 390 CFU/mL |
| 60 μL黄连提取液 | 1850 CFU/mL |
| 含1 μL浓度为10 mg/mL羧基化纳米银和30 μL黄连提取液 | 0 CFU/mL |
如图1所示，图1a 2 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制结果，图1b 60 μL黄连提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制结果，图1c 30 μL黄连提取液和1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制结果。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少黄连抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7起到协同的作用。
实施例2
1、黄连提取液的制备过程：称取黄连50 g, 加水量为450 mL，在95 ℃下提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪浓缩得到提取液，经0.22 μm滤膜过滤后，最后再用高效液相色谱法测得提取液中黄连素的含量为：28 mg/mL。
2、水溶性银纳米颗粒制备过程。
同实施例1
3、黄连提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用
a 细菌的培养
挑取LB琼脂培养基上的大肠杆菌O157:H7的单菌落于10 mL LB肉汤培养基中，置于37 ℃培养箱中培养16 h，再按1％的接种量接种于5 mL的LB肉汤培养基中，37 ℃培养4 h后。取1 mL上述菌液用0.1%的蛋白胨水连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106 CFU/mL。
b水溶性纳米银与黄连提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入40 μL的黄连提取液（黄连素的含量为：28 mg/mL），向2号离心管中加入1.5 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入20 μL黄连提取液与0.75 μL浓度为10 mg/mL水溶性纳米银，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用0.1%的蛋白胨水补齐。置于37 ℃培养2 h。每组实验平行三次。
c平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，100、10-1、10-2各取出200μL分别均匀涂
布在LB固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均涂布在
LB固体平板上。平板吹干后，37℃倒置培养12 h，长出菌落后计数，以30-300个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*5
实验结果如下：
| 抑菌剂 | 加入抑菌剂后所能数出的菌落数 |
| 含1.5 μL浓度为10 mg/mL羧基化纳米银 | 510 CFU/mL |
| 40 μL黄连提取液 | 2000 CFU/mL |
| 含0.75 μL浓度为10 mg/mL羧基化纳米银和20 μL黄连提取液 | 0 CFU/mL |
如图2所示，图2a 表示的是1.5 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑菌结果，图2b表示的是40 μL黄连提取液对大肠杆菌O157:H7的抑菌结果，图2c表示的是0.75 μL纳米银、20 μL黄连提取液混合物对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌结果。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少黄连抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7起到协同的作用。
实施例3
1、黄连提取液的制备过程：称取黄连50 g, 加水量为450 mL，在95 ℃下提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪浓缩得到提取液，经0.22 μm滤膜过滤后，最后再用高效液相色谱法测得提取液中黄连素的含量为：28 mg/mL
2、水溶性银纳米颗粒制备：
同实施例1
3、黄连提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用
a 细菌的培养
挑取牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的藤黄微球菌单菌落于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30 ℃培养箱中培养24 h，再按1％的接种量接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃培样12 h后。取1 mL上述菌液在用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液中连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106 CFU/mL。
b水溶性纳米银与黄连提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入16 μL黄连提取液（黄连素的含量为：28 mg/mL），向2号离心管中加入16 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入8 μL黄连提取液和8 μL浓度为10 mg/mL水溶性纳米银，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液补齐。置于30 ℃培养6 h。每组实验平行三次。
c平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，10-1、10-2、10-3各取出100μL分别均匀涂
布在牛肉膏蛋白胨固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体平板上。平板吹干后，30℃倒置培养48 h，长出菌落后计数，以20-200个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*10
| 抑菌剂 | 加入抑菌剂后所能数出的菌落数 |
| 含16 μL浓度为10 mg/mL羧基化纳米银 | 3.1 x105 CFU/mL |
| 16 μL黄连提取液 | 200 CFU/mL |
| 含8 μL浓度为10 mg/ml羧基化纳米银+8 μL黄连提取液 | 0 CFU/mL |
如图3所示，图3a 表示的是16 μL纳米银对藤黄微球菌的抑菌结果，图3b表示的是16 μL黄连提取液对藤黄微球菌的抑菌结果，图3c表示的是8 μL纳米银、8 μL黄连提取液对藤黄微球菌的协同抑菌结果。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少黄连抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制藤黄微球菌起到协同的作用。
实施例4
1、黄连提取液的制备过程：称取黄连50 g, 加水量为450 mL，在95 ℃下提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪浓缩得到提取液，经0.22 μm滤膜过滤后，最后再用高效液相色谱法测得提取液中黄连素的含量为：28 mg/mL。
2、水溶性银纳米颗粒制备：
同实施例1。
3、黄连提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用
a 细菌的培养
挑取牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的藤黄微球菌单菌落于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30 ℃培养基中培养24 h，再按1％的接种量接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃培样12 h后。取1 mL上述菌液在用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液中连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106 CFU/mL。
b水溶性纳米银与黄连提取液在抑菌性能上的协同作用
分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入10 μL黄连提取液（黄连素的含量为：28 mg/mL），向2号离心管中加入8 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入5 μL黄连提取液和4 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银水溶性纳米银，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液补齐。置于30 ℃培养6 h。每组实验平行三次。
C 平板计数
将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，10-1、10-2、10-3各取出100μL分别均匀涂
布在牛肉膏蛋白胨固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体平板上。平板吹干后，30℃倒置培养48 h，长出菌落后计数，以20-200个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*10
| 抑菌剂 | 加入抑菌剂后所能数出的菌落数 |
| 含16 μL浓度为10 mg/mL羧基化纳米银 | 4.5 x105 CFU/mL |
| 10 μL黄连提取液 | 1000 CFU/mL |
| 含8 μL浓度为10 mg/mL羧基化纳米银和5 μL黄连提取液 | 100 CFU/mL |
如图4所示，图4a 表示的是16 μL纳米银对藤黄微球菌的抑菌结果，图4b表示的是10 μL黄连提取液对藤黄微球菌的抑菌结果，图4c表示的是8 μL纳米银和5 μL黄连提取液对藤黄微球菌的协同抑菌结果。
实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少黄连抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制藤黄微球菌起到协同的作用。
Claims (2)
1.一种抑制大肠杆菌O157:H7的黄连提取物与纳米银抑菌组合物，其特征在于由黄连提取液、水溶性纳米银组成；所述黄连提取液制备包括如下步骤：取干药材黄连，加水量为黄连重量的9倍，经95℃水浴提取4h，再经过减压浓缩得到提取液，所得提取液经0.22 μm滤膜过滤；所述水溶性纳米银依照下列方法制备：取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末；抑制大肠杆菌O157:H7时，黄连提取液、水溶性纳米银的体积比为26.6~30:1；提取液中黄连素的含量为28 mg/mL，水溶性纳米银浓度为10 mg/mL。
2.如权利要求1所述抑菌组合物在制备抑制大肠杆菌O157:H7药物中的应用。
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