CN106619887B - 抑杀舒伯特单胞菌的复方中药制剂、制备方法及其应用 - Google Patents

抑杀舒伯特单胞菌的复方中药制剂、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及淡水养殖技术领域，具体而言，涉及一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂、制备方法及其应用。所述复方中药制剂包括乌梅、木瓜两味中药，不仅原料便宜易得，还兼具杀菌抑菌功能，能增强鱼类对舒伯特气单胞菌的抵抗能力，降低患病率和死亡率，为水产动物病害学和舒伯特气单胞菌引起的鱼类细菌性疾病防治实践提供参考依据。

Description

抑杀舒伯特单胞菌的复方中药制剂、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及淡水养殖技术领域，具体而言，涉及一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂、制备方法及其应用。
背景技术
杂交鳢是由乌鳢(Channa argus)与斑鳢(Channa maculata)人工杂交而成的子一代。杂交鳢在鳢科鱼类的养殖过程中占了绝大部分，因其具有良好的杂种优势，不仅具有肉质细腻、味道鲜美、刺少和出肉率高等特点，深受国内外消费者喜爱，还具有补脾利水、去瘀生新、滋补调养等药用价值，可作为创伤、手术和滋补调养的食疗材料，因此杂交鳢成为珠江三角洲等地区水产养殖鱧科鱼类中最主要的养殖品种，但由于大规模、高密度的人工养殖，这种养殖方式会存在导致鱼集体爆发各种疾病的隐患。
舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)属气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromanas)，亦被称为舒氏气单胞菌，为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼，其广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，具有广泛的致病性。近年来，关于舒伯特气单胞菌感染致病的报道很多，给水产养殖业带来一定的经济损失，其感染后引起多种炎症，多为恶性传染。例如在水产养殖生产中，舒伯特气单胞菌容易致使杂交鳢患内脏类结节病，内脏白点等疾病，其感染力强，在现代水产养殖高度集约化的生产中很容易引起大规模的爆发，致使鱼类大面积死亡，造成严重的经济损失。目前，在实际生产中对于舒伯特气单胞菌引起的病害大多以抗生素类和化学药类作为防治药物，但是，这也会导致该致病菌产生抗药性和副作用，以至于对其以后的防治增加新的难题，同时也严重影响了水产品品质。为更好的发展水产无公害化，降低水产经济损失，减少化学药物使用和环境污染，使用绿色药物防治，是当下水产养殖业的一个新突破。
我国拥有丰富的中草药资源，中草药以低残留、对人体健康无害、高效安全等优点符合目前倍受关注的健康养殖的要求。因此，合理地开发利用中草药资源在水产动物养殖中，不仅对动物的营养和促生长以及提高防病抗病能力具有重大意义，同时也符合水产养殖可持续发展的要求。
鉴于此，本发明以舒伯特气单胞菌为研究对象，筛选出对其有较好抑菌作用且毒副作用较小的的复方中药制剂，从而为水产动物病害学和舒伯特气单胞菌引起的鱼类细菌性疾病防治实践提供参考依据。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂，该中药制剂以乌梅和木瓜为原料，不仅选材简单，还兼具杀菌、抑菌功能，能增强鱼类对舒伯特气单胞菌的抵抗能力，降低患病率和死亡率。
本发明的第二目的在于提供一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法，该方法以乌梅和木瓜为原料，采用传统中药熬制工艺，操作简单，原料利用率高，适合规模化生产。
本发明的第三目的在于提供一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂在治疗舒伯特气单胞菌引起细菌性疾病中的应用，该应用对动物提高防病抗病能力具有重大意义，同时也符合养殖业可持续发展的要求。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂，包括下列原料药：乌梅和木瓜。
进一步地，本发明中，所述一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂，所述乌梅和木瓜的质量克数比为(0.5-3):1。
同时，本发明中，该抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法包括如下步骤：将乌梅和木瓜进行恒温干燥，随后粉碎加水浸泡并进行煎煮，然后滤去药渣将药液进行蒸馏浓缩，即得到所述抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂。
进一步地，所述恒温干燥的温度为60-70℃，恒温干燥的时间为3-7h。
进一步地，所述加水浸泡的时间为20-40min。
进一步地，所述浸泡过程中原料药和水的质量比为1/8-1/12。
更进一步地，所述制备方法还进一步包括将浓缩的药液进行加热杀菌并冷藏备用的过程。
更进一步地，所述加热杀菌的温度为110-130℃，时间为15-30min。
此外，本发明还包括该抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂在治疗水产动物中的细菌性疾病的应用。
进一步地，所述水产动物中的细菌性疾病为舒伯特气单胞菌引起的细菌性疾病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂以中草药为研究对象，从丰富的中草药资源中筛选出对水产动物抗病能力、免疫力、抑菌能力等有积极效果的中草药药物，且组方科学、配伍合理，可有效抑制舒伯特气单胞菌感染引起的杂交鳢内脏类结节病、内脏白点等疾病，为水产养殖病害防治和无公害化发展提供间接参考及相关理论依据。
(2)本发明抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂采用传统工艺制备，制备方法简单可操作，能最大限度保留了原中药原料的药效，适合工业化生产和市场推广。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂，包括下列原料药：乌梅和木瓜。
本发明参考《中药方剂研究的正交t值法》中记载的主药分析、辅药交互分析、剂量选择三步法，从多味中药原料中筛选出具有杀菌、抑菌作用的两味中药乌梅和木瓜。
其中，乌梅为蔷薇科杏属植物，其叶、果、根均可入药，主要功能有抑菌、抗肿瘤和抗氧化等功效，用于治疗久咳、久疟、痢疾、便血、钩虫病、牛皮癣等症。此外，有关乌梅提取液的抑菌研究表明，乌梅不仅对大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌等有抑制作用，而且还对一些真菌有抑制作用。
木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠的干燥近成熟果实，其味酸性温，现代医学研究表明，木瓜中含有广谱抗菌作用的齐墩果酸，并且对肠道菌和葡萄球菌有明显抑菌作用。此外还发现，宣木瓜乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对细菌有广谱抗菌作用，既对革兰氏阴性菌(荧光假单胞菌和大肠杆菌)有抑制作用，也对革兰氏阳性菌(枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌)有抑制作用。
本发明以乌梅为君、以木瓜为臣，所制得的复方中草药不仅便宜易得，而且对舒伯特气单胞菌有很好的杀菌、抑菌效果。
在一种优选的实施方式中，该抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂中，乌梅和木瓜的质量克数比为(0.5-3):1。
乌梅和木瓜的质量克数比可以为，但不限制为0.5，1，1.5，2，2.5或3，其中优选乌梅和木瓜的质量克数比为1。
本发明的另一方面提供了一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法，包括如下步骤：将乌梅和木瓜进行恒温干燥，随后粉碎加水浸泡并进行煎煮，然后滤去药渣将药液进行蒸馏浓缩，即得到所述抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂。
在一种优选的实施方式中，将乌梅和木瓜进行恒温干燥的温度为60-70℃，恒温干燥的时间为3-7h。
其中温度可以为，但不限制为：60℃，62℃，64℃，66℃，68℃或70℃；恒温干燥的时间为，但不限制为3h，4h，5h，6h或7h，其中优选5h。
在一种优选的实施方式中，将乌梅和木瓜浸泡的时间为20-40min。
其中乌梅和木瓜的浸泡时间可以为，但不限制为20min，25min，30min，35min或40min。
在一种优选的实施方式中，浸泡过程中原料药和水的质量克数比为1/8-1/12。
其中，原料药和水的质量克数比可以为，但不限制为1/8，1/9，1/10，1/11或1/12，其中优选1/10。
在一种优选的实施方式中，用电炉煎煮30min，随后将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液，并将所得药液合并即得到药液。
在一种优选的实施方式中，蒸馏浓缩为浓缩至药液内乌梅、木瓜提取物的浓度为1g/mL。
上述制备方法还进一步包括将浓缩的药液进行加热杀菌并冷藏备用的过程。
在一种优选的实施方式中，所述加热杀菌是在高压灭菌锅中进行，加热杀菌的温度为110-130℃，时间为15-30min。
所述高压灭菌锅，又称高压蒸气灭菌锅，主要有一个可以密封的桶体、压力表、排气阀、安全阀和电热丝等部件组成。其杀菌原理如下：基于高压灭菌锅是一个密闭的容器，利用电热丝加热水产生的水蒸气密集在容器中，随着水的的煮沸，蒸气压力升高，温度升高，从而达到灭菌的效果。
其中，加热杀菌的温度可以为，但不限制为110℃，115℃，121℃，125℃或130℃，其中优选杀菌温度大于121℃。
加热杀菌的时间可以为，但不限制为15min，20min，25min或30min，其中优选杀菌时间大于20min。
本发明的第三个方面还包括该抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂在制备用于治疗水产动物中细菌性疾病的应用。
其中水产动物中的细菌性疾病为舒伯特气单胞菌引起的细菌性疾病，脊椎动物泛指生活在淡水、海水的脊椎动物，如鱼，进一步地，可以为，经济价值高，高密度养殖容易爆发舒伯特气单胞菌感染致病的大黄鱼、石斑鱼、大菱鲆、草鱼或杂交鳢。
实验例1
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂包括乌梅和木瓜两种中药原料，其筛选过程主要包括两个方面，一是抑杀舒伯特气单胞菌的中草药的筛选，二是抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的筛选。
一、抑杀舒伯特气单胞菌的中草药筛选试验研究
1、材料与方法
1.1、试验材料和仪器
1.1.1、中草药
通过查阅文献，从抗病效果、实用及资源量等方面出发，本试验选取了60种报道有抑菌作用的中草药作为研究对象，所用中草药均购自重庆北碚万和大药房，上述60味中草药包括五倍子、大黄、大青叶、黄柏、毛冬青、黄岑、鱼腥草、金银花、白鲜皮、马齿苋穿心莲、板蓝根、连翘、黄芪、厚朴、蒲公英、白芍、地榆、丁香、知母夏枯草、野菊、木瓜、诃子、茵陈蒿、苦参、百部、五味子、槟榔、甘草、败酱草、田基黄、薄荷、栀子、白头翁、赤芍、龙胆草、秦皮、吴茱萸、金樱子、筋骨草、儿茶、石榴皮、七叶一枝花、虎杖、佩兰、青黛、紫花地丁、马鞭草、千里光、五加皮、乌梅、威灵仙、马兜铃仙鹤草、草果、贯众、瓜蒌子、瓜蒌皮和黄连。
1.1.2、受试菌种
菌株：舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)菌株WL-1，由中国水产科学研究所珠江水产研究所惠赠。
1.1.3、试验试剂
琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨氯化钠、氢氧化钠、酵母浸膏、无水乙醇。
1.1.4、试验仪器
DL型万用电炉；BCD-205F/T冰箱；SB1.T-014电子天平；THZ-82水浴恒温振荡器；BJ-150型高速多功能粉碎机；SW-CJ-2FD型洁净工作台；DHP-9082型电热恒温培养箱；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器；720060DL型移液枪：容量100-1000μl；720070DL型移液枪，容量20-200μl；玻璃三角涂布棒、一次性注射器、接种环、三角瓶、培养皿(90mm)、烧杯、棉签、游标卡尺、直尺、漏斗、量筒、石棉网等实验室常用设备。
1.2、抑杀舒伯特气单胞菌的中草药筛选试验研究
1.2.1、培养基的制备
LB固体培养基：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，加蒸馏水1000mL溶解后调节PH至偏碱性，加2％的琼脂，加热煮沸至琼脂完全融化，分装烧瓶，121℃高压灭菌20min，灭菌后4℃冰箱保存备用。
营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，加1000mL蒸馏水搅拌至完全溶解，调节pH至7.2，分装烧瓶，121℃高压灭菌20min，灭菌后4℃冰箱保存备用。
1.2.2、培养板的制备
把培养皿密封包好后放入灭菌锅中，121℃高温灭菌20min。灭菌后在无菌条件下将无菌LB固体培养基趁热倒入90mm的培养皿中，每个培养皿约加20mL琼脂，待凝固后倒扣在37℃生化培养箱中培养24h，将无污染的培养皿置于4℃冰箱保存备用。
1.2.3、中草药提取液的制备
本试验中草药提取液制备采用煎煮的方法。将购置回来的中草药置于恒温箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后每种中草药取10g放入洁净烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置电炉上煎煮30min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内含原药1g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用
1.2.4、菌悬液的制备
试验菌培养：将菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，再28℃培养24h后，挑取单个菌落，接种到营养肉汤培养基上震荡培养24h。采用平板计数法将菌液稀释到合适浓度，菌液浓度为1×108CFU/mL。
1.2.5、药物敏感性试验
药敏试验采用琼脂扩散法，将培养至对数生长期的菌悬液稀释至浓度约为1×107CFU/mL，使用无菌棉签蘸取菌液轻轻的均匀涂抹在培养基上，涂抹均匀后，用打孔器(直径为6.00mm)在平板上均匀打孔，每个平板上打4个孔，挑出孔内琼脂并用火焰封底，做好标记。每孔加入100μl(1g/mL)药液，然后将之放入28℃培养箱中培养24h；平板取出后，观察孔周围是否有抑菌圈，若有，则用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物做三个重复，同时以无菌水做空白对照。结果判断标准按《中药药理学》介绍的标准：抑菌圈≥20mm，属于极敏；抑菌圈15～19mm属于高敏；抑菌圈10～14mm属于中敏；抑菌圈小于10mm，属于低敏；没有抑菌圈，属于不敏(无抑菌效果)。
1.2.6、二次筛选试验
用营养肉汤培养基以二倍稀释法对提取物进行梯度稀释，取灭菌有硅胶塞的试管10支，编号，每管先加入无菌肉汤培养基2.0mL，然后于第一管中加入灭菌的受试药液2.0mL，混匀后取出2.0mL放入第2管中，依次稀释成8个2倍系列浓度，第9管不加入药液，作阳性对照，最后加入细菌悬液，使细菌浓度达到106CFU/mL，第10管加受试药液2.0mL，混匀后取出2.0mL弃去，不加细菌，作为阴性对照。置28℃摇床中震荡(200r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，无混浊现象所对应的药物浓度就为该中草药对舒伯特气单胞菌的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)，每个浓度重复3次。
1.3、数据处理
采用Excel2003和SPSS13.0软件对数据进行处理，结果均用平均数±标准差(X±SD)表示。
2、结果与分析
2.1、药物敏感性试验结果
表1 60种药物抑菌圈直径及抑菌等级
上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。
通过琼脂扩散法，60种中草药提取液对舒伯特气单胞菌的抑菌效果各不相同，见表1。在1g/mL浓度下，60种中草药中五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅的抑菌效果最显著，其抑菌圈直径大于20mm，为极敏药物；其中威灵仙、千里光、虎杖、石榴皮、黄芩、毛冬青、连翘、厚朴，这8种中草药的抑菌效果次之，其抑菌圈直径在15～20mm之间，属于高敏药物；鱼腥草、薄荷、赤芍、白芍、筋骨草、夏枯草、紫花地丁、槟榔、甘草9种中草药抑菌效果较差，抑菌圈直径在10～15mm之间，属于中敏药物；仙鹤草、马兜铃、茵陈蒿3种中草药抑菌效果不明显，抑菌圈直径小于10mm，属于低敏药物；剩余大青叶等29种中草药无抑菌效果。因此，初步筛选出五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅11味抑菌效果较好的中草药。
2.2、二次筛选试验结果
表2中草药的最小抑菌浓度
利用琼脂扩散法、通过二次筛选实验，初步选定了五倍子、乌梅、地榆等11味中草药，在此基础上进行第二步筛选—二倍稀释法。根据表2，11味中草药最小抑菌浓度结果可知，五倍子和诃子的抑菌效果最好，MIC均为1.95mg/mL；其次为乌梅、地榆、黄连、儿茶和丁香，MIC分别为3.91mg/mL、7.81mg/mL、7.81mg/mL、7.81mg/mL和7.81mg/mL；木瓜、五味子和大黄，MIC分别为15.63mg/mL和31.25mg/mL，抑菌效果较差；最后则为黄柏，MIC为62.5mg/mL。其结果基本与抑菌圈测定结果大致相符。通过抑菌圈直径和MIC的测定结果分析，最终选定五倍子、地榆、大黄、黄柏、乌梅、木瓜和诃子等11味中草药进行复方配伍试验。
3、结论
本试验以患病杂交鳢体内分离的舒伯特气单胞菌为供试菌，采用琼脂扩散法对60味中草药进行抑菌中草药筛选。试验结果表明，初步筛选出的五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅11味中草药，均为高敏药物；其中，乌梅的抑菌效果最佳。采用二倍稀释法进行二次筛选，测定五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅11味中草药的MIC值，结果与其抑菌圈直径大小大致一致，确定选取这11味中草药进行组方试验研究。
将上述筛选得到的11种中药进行进一步筛选，以期望进一步得到抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂。
二、抑杀舒伯特气单胞菌的复方中草药筛选
1、材料与方法
1.1、试验材料
1.1.1、中草药液
上述筛选的五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅药液。
1.1.2、受试菌种
菌株：舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)菌株WL-1，由中国水产科学研究所珠江水产研究所提供。
1.1.3、培养基
营养肉汤培养基、LB固体培养基、生理盐水，按照常规方法配制，121℃高压灭菌20min，灭菌后4℃冰箱保存备用。
1.1.4受试动物
受试动物为杂交鳢购自重庆铜梁区少云镇乌鱼基地，选择体格健康，无病无伤，体表鳞片完整，体重为(80.33±1.94)g。
1.2、试验方法
1.2.1、复方中草药的筛选试验
利用正交t值法和药物之间的交互作用，对初次筛选出的中草药进一步进行筛选和复方配比，步骤为主药的筛选、辅药的交互作用试验。
1.2.1.1、主药的筛选试验设计
将五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅11味中草药各为一个因素，分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K，每种中草药均设水平1(用)和水平2(不用)两个水平(表3)，选用L12(211)正交t值表(表4)进行试验安排。各组通过琼脂扩散法测定抑菌圈，以其为试验指标，每组3个重复，数据越大，抑菌效果越好。
表3主药筛选正交试验设计因素水平表
表4正交t值法L12(211)的组方原则
主药的筛选试验结果见下页。
表5主药筛选实验结果
由上表5可知，地榆、丁香、黄连、大黄的M1＜M2，D值为负值，说明不用此药比用此药的抑菌作用好。故最佳组合为五倍子、诃子、乌梅、木瓜、五味子、黄柏、儿茶，预期药效MM＝23.18+2.89/12＝23.42。乌梅的影响最为显著，应以其作为主药。儿茶、五味子、黄柏在组方中作用较小，故舍去不用。因此选择以显著者乌梅作为主药，不显著者五倍子、诃子、木瓜可能为辅药，4味中草药作为组方进行下面的辅药交互作用试验。
1.2.1.2、辅药的交互作用试验设计
以作用显著的主因素(乌梅)做基础，选用L8(27)正交表(表7)着重分析其他因素与基础因素和彼此间和的交互作用，因素水平表见表6。利用琼脂扩散法，每组3个重复，以抑菌圈直径作为试验指标。
表6辅药交互作用正交试验设计因素水平表
因素 基础因素 乌梅 五倍子 诃子 木瓜
1水平 都用 用 用 用
2水平 都用 不用 不用 不用
表7正交t值法L8(27)的组方原则
组别 1 2 3 4 5 6 7
1 1 1 1 1 1 1 1
2 1 1 1 2 2 2 2
3 1 2 2 2 1 2 2
4 1 2 2 2 2 1 1
5 2 1 1 2 1 1 2
6 2 1 1 2 2 2 1
7 2 2 2 1 1 2 1
8 2 2 2 1 2 1 2
表8辅药交互作用正交试验结果
由上表分析可知，将主药分析中抑菌效果显著者乌梅作为基础因素，用正交表L8(27)分析可能为辅药的五倍子、诃子、木瓜与基础因素乌梅和彼此间和的交互作用试验结果见表8。五倍子M1－M2＜0，D值为负，负效应显著，不用为好。木瓜、诃子(AB)间，[12]＝28.88mm＞[22]＝28.70mm＞[11]＝28.06mm＞[21]＝27.43mm，因此乌梅和木瓜间有协同作用，与诃子间有拮抗作用，舍去为好。
实施例1
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂包括乌梅5g、木瓜10g。
然后按照如下方法制备实施例1中的复方中药制剂：将上述中药混合物置于恒温箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后放入洁净烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置电炉上煎煮30min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内乌梅和木瓜提取物的浓度为1g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用。
实施例2
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂包括乌梅10、木瓜10g。
然后按照如下方法制备实施例2的复方中药制剂：将上述中药混合物置于恒温箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后放入洁净烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置电炉上煎煮30min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内乌梅和木瓜提取物的浓度为1g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用。
实施例3
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂包括乌梅15g、木瓜10g。
然后按照如下方法制备实施例3的复方中药制剂：将上述中药混合物置于恒温箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后放入洁净烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置电炉上煎煮30min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内乌梅和木瓜提取物的浓度为1g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用。
实施例4
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂包括乌梅20g、木瓜10g。
然后按照如下方法制备实施例4的复方中药制剂：将上述中药混合物置于恒温箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后放入洁净烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置电炉上煎煮30min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内乌梅和木瓜提取物的浓度为1g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用。
实施例5
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂包括乌梅25g，木瓜10g。
然后按照如下方法制备实施5的复方中药制剂：将上述中药混合物置于恒温箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后放入洁净烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置电炉上煎煮30min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内乌梅和木瓜提取物的浓度为1g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用。
实施例6
一种抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂包括乌梅30g、木瓜10g。
然后按照如下方法制备实施例6的复方中药制剂：将上述中药混合物置于恒温箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后放入洁净烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置电炉上煎煮30min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程三次，分别得到三次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内含乌梅和木瓜提取物的浓度为1g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用。
实验例2
为表明该复方中药制剂的安全性，现做如下实验。
1、受试动物：受试动物为杂交鳢购自重庆铜梁区少云镇乌鱼基地，选择体格健康、无病无伤、体表鳞片完整、体重为(80.33±1.94)g作为实验备用。
2、受试方法：随机选取杂交鳢140尾，设6个实验组和1个对照组，每组设一个重复，每个重复10尾鱼。每日给实验组1-6的杂交鳢分别灌喂实施例1-6制得的复方中药制剂2000mg/kg，每尾每次以0.2mL灌胃给药，对照组1等量等次以生理盐水灌喂。受试鱼试验前一天禁食，试验过程中不投饵，试验用水为曝气24h的自来水。详细观察7d，并每天记录杂交鳢的运动状态及死亡情况。
表9鱼类急性毒性实验毒性分级标准
鱼起始LC<sub>50(mg/L)</sub> ﹤1 1-100 100-1000 1000-10000 ﹥10000
毒性分级 剧毒 高毒 中等毒性 低毒 微毒(无毒)
通过实验结果观察，在受试动物灌喂给药后观察的一周中，实验组1-6无动物死亡，运动状态比较正常。杂交鳢运动状态观察显示复方中草药对杂交鳢的运动无明显影响，由此可知复方中药组合物对其生长未造成影响，未发现任何毒性反应。在灌胃剂量味2000mg/kg，观察7天未见死亡，试验结果表明，复方中药制剂的LD50≥8×105mg/L,根据上表可知，所获得的复方中药制剂急性毒性分级为微毒(无毒)。
实验例3
为表明该复方中药制剂不同配比的抑菌性，现做如下动物敏感性实验。
1、受试菌种菌株：舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)菌株WL-1，由中国水产科学研究所珠江水产研究所惠赠。
2、培养基的制备
LB固体培养基：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，加蒸馏水1000mL溶解后调节PH至偏碱性，加2％的琼脂，加热煮沸至琼脂完全融化，分装烧瓶，121℃高压灭菌20min，灭菌后4℃冰箱保存备用。
营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，加1000mL蒸馏水搅拌至完全溶解，调节pH至7.2，分装烧瓶，121℃高压灭菌20min，灭菌后4℃冰箱保存备用。
3、培养板的制备
把培养皿密封包好后放入灭菌锅中，121℃高温灭菌20min。灭菌后在无菌条件下将无菌LB固体培养基趁热倒入90mm的培养皿中，每个培养皿约加20mL琼脂，待凝固后倒扣在37℃生化培养箱中培养24h，将无污染的培养皿置于4℃冰箱保存备用。
4、菌悬液的制备
试验菌培养：将菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，再28℃培养24h后，挑取单个菌落，接种到营养肉汤培养基上震荡培养24h。采用平板计数法将菌液稀释到合适浓度，菌液浓度为1×108CFU/mL。
5、药物敏感性试验
药物敏感试验采用琼脂扩散法，即将培养至对数生长期的菌悬液稀释至浓度约为1×107CFU/mL，使用无菌棉签蘸取菌液轻轻的均匀涂抹在培养基上，涂抹均匀后，用打孔器(直径为6.00mm)在平板上均匀打孔，每个平板上4个孔，挑出孔内琼脂并用火焰封底，做好标记。每孔加入100μl(1g/mL)药液，然后将之放入28℃培养箱中培养24h；平板取出后，观察孔周围是否有抑菌圈，若有，则用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物做三个重复，同时以无菌水做空白对照。结果判断标准按《中药药理学》介绍的标准：抑菌圈≥20mm，属于极敏；抑菌圈15～19mm为高敏；抑菌圈10～14mm属于中敏；抑菌圈小于10mm，属于低敏；没有抑菌圈，属于不敏(无抑菌效果)。
表10原料比例的抑菌性实验结果
通过上述实验结果分析可知，当乌梅和木瓜的质量份数比为1/2时，该中药制剂的复方抑菌效果最差，且抑菌圈直径小于单独使用乌梅(即组7)的抑菌圈直径。当乌梅和木瓜的质量份数比为1:1时，该中药制剂的复方抑菌效果最佳，抑菌圈直径达到28.51mm，故该比例的复方中药制剂可用于治疗舒伯特气单胞菌所引起的鱼病。
实验例4
目前关于中草药治疗水产动物疾病的研究报道相对较多，研究发现中草药配比和添加剂量是影响患病水生动物存活率的重要因素。在研究鱼健康状况的因素时，通常考虑以下影响因素：
(1)超氧化物歧化酶(SOD)活性
氧作为环境因子，对生命活动极其重要，但在机体的代谢过程中所产生的氧自由基即活性氧，又对细胞有毒害作用。SOD是生物体内抗氧化防御系统的重要酶之一，在清除生物体内活性氧的过程中起着重要作用。在正常生理状态下机体活性氧的产生和清除处于动态平衡，活性氧在不断产生同时又不断被清除。但在应激状态下体内活性氧产生增加和抗氧化剂的减少能导致氧化应激，对细胞膜造成氧化损伤，影响细胞功能的正常发挥，甚至导致细胞破裂，血溶或器官发生性损伤。机体本身在正常状态下清除过剩氧自由基的能力是评价机体健康的重要指标，因此，SOD对评判免疫刺激剂对鱼体健康状况的影响具有重要意义。
(2)丙二醛(MDA)含量
丙二醛(MDA)是反应体内脂质过氧化水平的敏感指标，是脂质过氧化的最终代谢产物，可以与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联，导致细胞损伤。正常生理状态下，机体内的MDA含量是极低的，其含量的高低可以反映机体细胞受到自由基攻击至损伤的程度。
(3)过氧化氢酶(CAT)
CAT是机体清除氧自由基的重要成分，具有重要的生理功能。在细胞内主要与线粒体及过氧体结合，将细胞代谢产生的毒性物质H2O2迅速加以清除，分解为H2O和O2，从而共同保护血红蛋白、膜蛋白等，还可以减少过氧化脂质生成和对机体的毒害。在健康的鱼体体内，其内环境中自由基的产生与消除处于动态平衡中，当CAT活性降低时，鱼体内的自由基量过多能破坏一些体内重要的生化过程，导致代谢混乱，正常生理功能失调，体内免疫水平下降，潜在的病原被激活使鱼体发病。
(4)酸性磷酸酶(ACP)
ACP是动物代谢过程中重要的调控酶，在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。研究表明，ACP主要参与磷酸酯的代谢，还具有代谢调节、能量转化、信号传导等作用，同时作为溶酶体的标志酶，ACP与溶酶体生理功能的正常发挥密切相关，是水产动物赖以生长、生存的重要酶类之一。
(5)碱性磷酸酶(AKP)
AKP是磷代谢过程中重要的酶类之一，是膜结合酶，几乎存在于机体各种组织中，不仅能催化磷酸单酯水解，还直接参与磷酸基团的转移，是动物体内重要的解毒体系；同时AKP作为动物溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥作用。
现从养殖试验出发，研究该复方中药制剂对在舒伯特气单胞菌各组织酶活性的影响，从该复方中药制剂对杂交鳢超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)五方面进行实验研究，从而为水产病害学和实践提供科学依据。
1、材料和方法
1.1、实验用鱼和中药材
试验用鱼杂交鳢购自重庆铜梁区少云镇乌鱼基地，选择生长状况良好，无病无伤，体表鳞片完整，体重为(22.42±0.99)g，体长(15.45±1.02)cm，以其作为试验鱼。乌梅、木瓜购于重庆北碚区万和大药房。
1.2、实验材料
水缸(规格为3.14×(0.3m)2×0.6m)、玻璃匀浆器、电子天平、分析天平、直尺、离心机、匀浆器、紫外可见分光光度计、37℃恒温水浴箱、冰箱、离心管、解剖工具、一次性注射器、加热棒、温度计；生理盐水(0.86％)、冰醋酸、考马斯亮蓝(G250)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)试剂盒。
1.3、试验饲料配制
以福建大昌生物科技实业公司生产的大昌牌生鱼配合饲料为基础饲料。按上述实施例2的方法制得复方中药制剂，以5％的投饵率计算，称取合适的饲料，然后采用单因子浓度梯度法，按饲料总重的0.5％、1％、2％将药液均匀地喷洒在饲料上，然后置于干燥箱中，在65℃下干燥至饲料水分含量降至10％。以添加量为0％的基础饲料作为对照组，烘干后自封袋密封备用。试验饲料组成及饵料营养成分如表9。
表11试验饵料组成及商品饵料营养成分
1.4、饲养管理
试验按投喂饵料中添加的中草药种类和剂量不同分为对照组(C0)、复方组(F0.5、F1、F2)共4组，每个重复30尾。试验鱼放于水箱中暂养驯化14天后开始正式试验。预实验期间，各组均投喂基础饲料。待每缸鱼摄食正常后，别用基础饲料、添加0.5％、1％和2％的复方中药制剂饲料投喂，试验不间断进行60天。试验期间昼夜用增氧机充氧，必要时用加热棒进行控温，控温水温在23±1.6℃，并严格控制水质。养殖过程中，各组水质一致均为脱氯自来水，昼夜24小时充气，每2天换水一次，每次先放出1/3的水，然后将水注满，等待5min，再放掉1/2水，注满水后，等待5min，最后再放掉所用的水，再将水缸注满。试验期间，投饵严格按照“四定”原则，每天9:00、17:00左右各投喂1次饲料，投喂量为3～5％。在养殖过程中，每15d抽取一定数量的鱼进行称重，逐渐增加投喂量。
1.5、样品采集和处理
在给药后的第60天进行采样，每缸随机取5尾鱼，采用尾静脉采血方法，用一次性无菌注射器抽取非抗凝血，将采集的血液迅速动作轻微地转移至5mL无菌离心管中，于4℃静置8h后，3000r/min冷冻离心15min，收集血清并保存于-80℃超低温冰箱备用。解剖取出鱼的全部内脏后，先用生理盐水润洗，滤纸拭干后再称重；分离出全部肝脏和脾脏，用生理盐水洗净后，拭干称重，将肝脏放入自封袋内，标记后放入-20℃冰箱保存备用；在背部取肌肉0.2～0.3g左右，去皮去刺，生理盐水冲洗后拭干，放入自封袋内封好，标记后放置于-20℃冰箱保存备用。
取肌肉、肝脏组织各1g，放入小烧杯内快速剪碎成小组织块，然后放入5mL离心管中，将离心管放入冰浴中，加入1:10的生理盐水，利用匀浆器研磨，研磨到基本没有颗粒状或成块状物质为准，研磨时，使其浸没在冰水浴中，以避免酶失活。研磨完成后，放入离心机2000r/min离心15min，留上清液并放入-20℃冰箱保存备用。
1.6、酶活性的测定
用试剂盒测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)。所用试剂盒均购自南京建成生物技术研究所，严格按照其说明书进行操作，蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法。
1.7、数据处理采用Excel2003进行数据整理，SPSS13.0进行单因素方差分析，结果用平均值±标准误(X±SE)表示。
2、实验结果和分析
2.1、复方中药制剂对杂交鳢SOD活性的影响
表12不同剂量复方中药制剂对杂交鳢酶活性的影响
复方中药制剂对杂交鳢SOD活力的影响见上表12，由表12可知，在60天的试验期内，在肝脏SOD活性对比试验，中复方组F0.5、F1、F2分别比对照组C0分别提高了11.36％、27.05％和17.27％，与对照组无显著差异(P＞0.05)。
在肌肉SOD活性对比试验中，复方组F0.5、F1、F2分别相对于对照组C0提高了72.89％、25.15％和107.27％，其中F2组肌肉SOD活力高于对照组C0、C1，且有显著差异(P＜0.05)；F0.5、F1略高于对照组C0，但差异不显著(P＞0.05)。
在血清SOD活性对比试验中，复方组F0.5、F1、F2分别相对于对照组C0提高了5.64％、0.28％和7.41％，但差异均不明显(P＞0.05)。
经过上述分析可知，在60天的试验期内，饲料中添加不同剂量的复方中草药制剂后，各添加组血清、肝脏和肌肉组织中的SOD活性与对照组相比，均有不同程度的提高。
2.2、复方中药制剂对杂交鳢MDA含量的影响
表13复方中药制剂对杂交鳢各组织MDA的影响
复方中药制剂对杂交鳢MDA含量的影响见上表13，从表13中可知，在60天的试验期内，在肝脏MDA活性对比试验中，复方组F0.5、F1、F2分别比对照组C0分别降低了7.84％、27.45％和3.92％。
在肌肉MDA活性对比试验中，复方组F0.5、F1、F2的MDA含量均低于对照组C0，复方组F0.5、F1、F2分别降低了60.34％、23.28％和55.17％，均为差异显著(P＜0.05)。
在血清MDA活性对比试验中，复方组F0.5、F1、F2的MDA含量均低于对照组C0，分别降低了12.98％、15.88％和5.19％。
经过上述分析可知，饲料中添加不同含量的复方中草药后，杂交鳢的血清、肝脏和肌肉组织中的MDA含量均有不同程度的降低。
2.3、复方中药制剂对杂交鳢CAT活性的影响
表14复方中药制剂对杂交鳢CAT活性的影响
从中药制剂对杂交鳢CAT活性的影响表14可知，在60天的试验期内，饲料中添加不同剂量的单、复方中草药后，杂交鳢的血清、肝脏和肌肉组织中的CAT活性均有不同程度的变化。其中在肝脏CAT活性对照试验中复方中药制剂F0.5、F1、F2各组CAT活力与对照组C0相比，分别提高了99.60％(P＜0.05)、0.80％(P＞0.05)和86.45％(P＜0.05)，其中F0.5和F2相对于C0均为显著差异。
在肌肉CAT活性对照试验中，复方中药制剂F0.5、F1、F2各组CAT活力与对照组C0相比，分别提高了7.01％、7.49％和38.52％。
在血清CAT活性对照试验中，复方中药制剂F0.5、F1、F2各组CAT活力与对照组C0相比，分别提高了2.38％、22.82％和2.73％。
试验总结：在60天的试验期内，饲料中添加不同剂量的复方中草药制剂后，各添加组血清、肝脏和肌肉组织中的CAT活性与对照组相比，均有不同程度的提高。
2.4、复方中药制剂对杂交鳢ACP活性的影响
表15复方中药制剂对杂交鳢ACP活性的影响
复方中草药对杂交鳢ACP活性的影响见上表15，从表中可知，在60天的试验期内，饲料中添加不同剂量的复方中草药后，杂交鳢的血清、肝脏和肌肉组织中的ACP活性与对照组相比，没有太大的变化。只有在肌肉中F2的ACP活力与对照组C0相比，提高了70.17％，差异显著(P＜0.05)。其他各组未出现差异显著性情况。
2.5、单方和复方中草药对杂交鳢AKP活性的影响
表16中草药对杂交鳢AKP活性的影响
复方中草药对杂交鳢AKP活力的影响见上表16，由表16可知，在60天的试验期内，在肝脏AKP活性对比试验中复方组F0.5、F1、F2分别比对照组C0分别提高了16.08％、10.02％和28.68％，与对照组差异不显著(P＞0.05)。
在肌肉AKP活性对比试验中，复方组F1、F2分别相对于对照组C0提高了37.91％、51.65％和217.58％，其中F2与对照组差异不显著(P＞0.05)。
在血清SOD活性对比试验中，复方组F1、F2分别相对于对照组C0提高了6.7％和1.54％，但差异均不明显(P＞0.05)。
本发明以杂交鳢为实验对象，通过在饲料中添加不同剂量的复方中药制剂，发现肝脏、肌肉、血清中SOD、CAT、ACP和AKP的活性均有明显提高，而MDA活性有不同程度地降低。除杂交鳢外，本发明复方中药制剂还适用于其他脊椎类动物，该试验数据为复方中草药对脊椎类动物非特异性免疫功能的影响提供了重要依据。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (7)

1.抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂在制备用于治疗水产动物中细菌性疾病药物中的应用；
所述水产动物中的细菌性疾病为舒伯特气单胞菌引起的细菌性疾病；
所述抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的原料药为质量克数比为(0.5-3):1的乌梅和木瓜。
2.如权利要求1所述的抑杀舒伯特气单胞菌的复方中草制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将乌梅和木瓜进行恒温干燥，随后粉碎加水浸泡并进行煎煮，然后滤去药渣将药液进行蒸馏浓缩，即得到所述抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂。
3.如权利要求2所述的抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法，其特征在于，所述恒温干燥的温度为60-70℃，恒温干燥的时间为3-7h。
4.如权利要求2所述的抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法，其特征在于，所述加水浸泡的时间为20-40min。
5.如权利要求2所述的抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法，其特征在于，浸泡过程中原料药和水的质量克数比为1/8-1/12。
6.如权利要求2所述的抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还进一步包括将浓缩的药液进行加热杀菌并冷藏备用的过程。
7.如权利要求6所述的抑杀舒伯特气单胞菌的复方中药制剂的制备方法，其特征在于，所述加热杀菌温度为110-130℃，时间为15-30min。
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