CN112841227B - 一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水体环境抑菌剂技术领域，公开了一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，本发明复合植物提取物属于环境友好型物质，对鱼体安全浓度范围大，不会造成鱼体出现化药残留，也不易引发舒伯特气单胞菌的耐药性，对水体中藻类也没有破坏性。本发明复合提取物作用谱仅对舒伯特气单胞菌有特效，可用于抑制养殖水环境舒伯特气单胞菌的异常繁殖，从而减低水环境舒伯特气单胞菌对鱼体的攻击力；从组方配伍方面看，本发明复合植物提取物的四种成分具有显著的配伍增效作用，不仅对养殖水体中舒伯特气单胞菌具有良好的抑制作用，也对舒伯特气单胞菌感染鱼体表引发的局部红点有明显的消炎收敛作用。

Description

一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物及其 制备方法和应用

技术领域

本发明涉及水体环境抑菌剂技术领域，更具体地，涉及一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物及其制备方法和应用。

背景技术

舒伯特气单胞菌是一种常见的条件性致病菌，其引起鳢科鱼类出现败血症症状和/或内脏类结，好发于生鱼旧鱼棚期4-5月大体重规格阶段和生鱼新鱼定塘后6-8月的小体重规格阶段。生鱼一旦感染发病，在同塘发病鱼作为传染源，往往出现较强的传染性和较高的致死性，日均最高亩均死亡量可超100尾，若处理对症且及时，3-5天可迅速彻底控制病情。

根据传染病防控原则，即控制传染源、切断传播途径和保护易感宿主，目前生产实践中，通过内服敏感抗生素和外泼消毒剂来防治舒伯特气单胞菌是常见的手段，然而上述方案中所用的抗生素不仅会产生药残问题影响食品安全，而且也容易引发病原耐药性的上升，给生产防控该病带来较高的难度；外泼消毒剂主要用于切断发病鱼作为二次传染源的传染途径，常常因为成本因素和安全上限浓度等问题导致使用剂量不足，造成辅助治疗效果大大减弱的现象。在疾病流行前期或流行期，通过抑制水体舒伯特菌气单胞菌的过快繁殖和增强鱼体抗病力，是有效预防舒伯特气单胞菌病暴发的最优方法，可有效的避免疾病发生后快速传播造成死鱼损失的现象，现有技术的抑菌剂多是化学物质复配得到，有较大的安全隐患和环境危害。

发明内容

本发明为了克服现有技术中上述缺陷，首先提供一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物。

本发明的第二个目的是提供上述用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，以重量百分比计，包括30-40％荔枝皮提取物、35-45％金不换鲜叶提取物、15-25％蕨根提取物、1-3％不含碘海水粗盐。

优选的，所述用于水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，以重量百分比计，包括35-40％荔枝皮提取物、40-45％金不换鲜叶提取物、15-23％蕨根提取物、1-2％不含碘海水粗盐。

更优选的，所述用于水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，以重量百分比计，包括38％荔枝皮提取物、42％金不换鲜叶提取物、19％蕨根提取物、1％不含碘海水粗盐。

优选的，所述荔枝皮提取物是经过预处理的荔枝果皮的发酵浓缩物，所述金不换鲜叶提取物为金不换鲜叶经过发酵、热盐炙后的浓缩物，所述蕨根提取物是蕨根经过预处理、发酵后的浓缩物。

更优选的，所述荔枝皮提取物的制备方法为：

S1、荔枝果皮预处理：将荔枝果皮与水、纤维素酶按10：50：1-1.5的比例共同混合，置于30-33℃条件下，间隔1-2h搅拌一次，持续搅拌2-3天后，将搅拌物于30-35℃下烘干至含水量为10-12％；

S2、发酵：将经过预处理的荔枝果皮：水：乳酸菌液态培养基和乳酸菌混合，33-37℃密闭培养至OD值为4.2-5.3得到培养物，将培养物离心去渣，收集上清液；

S3、浓缩：将收集的上清液超滤浓缩至原体积的10％-30％，所获得的浓缩液即为所述荔枝果皮提取物；其中，经过预处理的荔枝果皮：水：乳酸菌液态培养基的重量体积比为1：5-10：2-4，乳酸菌的加入量为每质量份预处理的荔枝果皮加入(2-6)×10⁵cfu。

其中，上述经过预处理的荔枝果皮、水、乳酸菌液态培养基和乳酸菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将经过预处理的荔枝果皮和水混合，再加入乳酸液态培养基混合，最后加入乳酸菌混合。

其中，S3上述浓缩采用超滤浓缩，浓缩条件为：温度25-30℃，操作压力为0.3-0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50-100L/m²·h。

优选的，上述乳酸菌液态培养基可以为市售的乳酸菌液态培养基，例如进口的Lactic-bacteria Midium。

进一步的，上述荔枝果皮提取物中的水优选无菌蒸馏水。

进一步的，上述的乳酸菌优选为肠膜明串珠菌，粪肠乳球菌、干酪乳球菌等乳酸菌功能不能取代本发明肠膜明串珠菌。

进一步的，上述培养物离心优选在5000rpm离心，例如5000rpm离心10分钟。

其中，上述的纤维素酶优选β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶。

作为一种优选的实施方式，上述荔枝皮提取物的制备方法为：

经过预处理的荔枝果皮：水：乳酸菌液态培养基和乳酸菌混合，34-36℃密闭培养至OD值为4.5-5.2得到培养物，将培养物离心去渣，收集上清液，接着在环境温度25-30℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.4-0.5Mpa，超滤膜的膜通量以60L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积的10％-30％的浓缩液即为所述荔枝果皮提取物。

作为一种最优选的实施方式，上述荔枝皮提取物的制备方法为：

经过预处理的荔枝果皮：水：乳酸菌液态培养基的重量体积比为1：8：3，乳酸菌的加入量为每质量份预处理的荔枝果皮加入4╳10⁵cfu，36℃密闭培养至OD值为5.2得到培养物，将培养物离心去渣，收集上清液，接着环境温度28℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.5Mpa，超滤膜的膜通量以60L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积20％的浓缩液即为所述荔枝果皮提取物。

优选的，所述金不换鲜叶提取物的制备方法为：

S1、发酵：将金不换鲜叶、水、芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为3.0-4.5得到培养物，其中，金不换鲜叶：水：芽孢菌液态培养基的重量体积比为1：6-12：2-4，芽孢菌的加入量为每质量份金不换鲜叶加入(3-8)×10⁶cfu；

S2、热盐炙：25-28℃条件下，过滤收集培养物中的经过发酵的金不换鲜叶，置于加温至70-85℃的热锅上，与1/4-1/3质量份的海盐硫酸镁复合物混合炙炒30-50min，以海盐完全溶化时收集含盐金不换叶泥，置于40-45℃条件下烘干至含水量≤8％，并与3-4质量份的水混合，高压灭菌，冷却后取出，离心去渣；

S3、浓缩：离心后收集的上清液超滤浓缩至原体积的10％-25％，获得浓缩液即为所述的金不换鲜叶提取物。

优选的，S3所述浓缩采用超滤浓缩，浓缩条件为：温度25-30℃，操作压力为0.3-0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50-100L/m²·h。

其中，上述金不换鲜叶、水、芽孢菌液态培养基和芽孢菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将金不换鲜叶和芽孢液态培养基混合，再加入芽孢菌混合，最后加入水混合均匀。

进一步的，上述金不换鲜叶提取物中的水优选无菌蒸馏水。

进一步的，上述的芽孢菌优选为多粘芽孢杆菌，枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌功能上不能取代本发明的多粘芽孢杆菌。

进一步的，上述培养物离心优选在3000rpm离心，例如3000rpm离心10分钟。

优选的，S2所述海盐硫酸镁复合物是将不含碘海水粗盐与7水硫酸镁混合，以质量百分比计，不含碘海水粗盐与7水硫酸镁混合质量比为80-90：10-20。

作为一种优选的实施方式，上述金不换鲜叶提取物的制备方法为：将金不换鲜叶、水、芽孢液态培养基和芽孢菌混合，38-40℃密闭培养至OD值为4.0-4.5得到培养物，26-28℃条件下，过滤收集培养物中的经过发酵的金不换鲜叶，置于在加温至78-85℃的热锅上与1/4质量份的海盐硫酸镁复合物混合炙炒35-45min，以海盐完全溶化时收集含盐金不换叶泥，置于42-45℃条件下烘干至含水量≤8％，并与3质量份的水混合，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，离心去渣，接着在环境温度25-30℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.4-0.5Mpa，超滤膜的膜通量以60L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积18％-20％的浓缩液，获得浓缩液即为所述的金不换鲜叶提取物。

作为一种更优选的实施方式，上述金不换鲜叶提取物的制备方法为：将金不换鲜叶、水、芽孢液态培养基和芽孢菌混38℃密闭培养至OD值为4.3得到培养物，28℃条件下，过滤收集培养物中的经过发酵的金不换鲜叶，置于在加温至80℃的热锅上与1/4质量份的海盐硫酸镁复合物混合炙炒40-42min，以海盐完全溶化时收集含盐金不换叶泥，置于45℃条件下烘干至含水量≤8％，并与3质量份的水混合，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，离心去渣，收集上清液，接着在环境温度28℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.4Mpa，超滤膜的膜通量以60L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积18％的浓缩液，获得浓缩液即为所述的金不换鲜叶提取物。

其中，所述芽孢菌液态培养基可以为市售的芽孢菌液态培养基，例如进口的Bacillus Mediumbase。

其中，所述海盐硫酸镁复合物优选不含盐海水粗盐与无水硫酸镁混合，以质量百分比计，不含碘海水粗盐与无水硫酸镁混合质量比为90：10。

优选的，所述蕨根提取物的制备方法为：

S1、蕨根预处理：将蕨根去杂除尘，再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得蕨根脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得蕨根粉碎物；其中，蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基按重量体积比1：6-12：2-4进行混合，芽孢菌的加入量为每质量份蕨根粉碎物加入(3-8)×10⁶cfu；

S2、发酵：将蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为4.0-6.5得到培养物，25-28℃条件下，过滤收集培养物，3000-5000rpm离心20-30min，弃离心上清液，收集离心沉积物，并以离心沉积物的6-10倍质量份加水充分溶解，接着分装密闭，高压灭菌，冷却后取出；

S3、浓缩：离心，将收集的上清液浓缩至原体积的10％-25％，获得浓缩液即为所述的蕨根提取物。

其中，上述蕨根粉碎物、水、芽孢菌液态培养基和芽孢菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将蕨根粉碎物和芽孢液态培养基混合，再加入芽孢菌混合，最后加入水混合均匀。

S3所述浓缩采用超滤浓缩，浓缩条件为：温度25-30℃，操作压力为0.3-0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50-100L/m²·h。

进一步的，上述蕨根优选为含水量≤10％的凤尾蕨科植物蕨的根茎。

进一步的，所述速冻优选为将包裸蕨根置于-20到-40℃，速冻10-12h。

进一步的，所述预膨化是将速冻后的包裸蕨根置于真空度90-95KPa，温度70-80℃的条件下油炸膨化3-6min。

进一步的，所述真空脱油是将油炸后的蕨根置于转速150-250r/min的条件下脱油6-15min。

进一步的，上述蕨根提取物中的水优选无菌蒸馏水。

进一步的，上述的芽孢菌优选为嗜豆芽孢杆菌，枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌功能上不能取代本发明嗜豆芽孢杆菌。

作为一种优选的实施方式，上述蕨根提取物的制备方法为：将蕨根去杂除尘，再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得蕨根脱水干燥物，干燥物过40-50目筛进行粉碎，获得蕨根粉碎物，将蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-38℃密闭培养至OD值为5.0-6.5得到培养物，26-28℃条件下，过滤收集培养物，4000-5000rpm离心25-30min，弃离心上清液，收集离心沉积物，并以离心沉积物的6-9倍质量份加水充分溶解，接着分装密闭，并于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，800-1000rpm离心5-10min，去渣留离心上清液，接着在环境温度25-30℃条件下，将收集的离心上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.4-0.5Mpa，超滤膜的膜通量以50-60L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积18％-20％的浓缩液，获得浓缩液即为所述的蕨根提取物。其中，蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基按重量体积比1：(8-12)：(2-3)进行混合，芽孢菌的加入量为每质量份蕨根粉碎物加入(5-8)×10⁶cfu。

作为一种最优选的实施方式，上述蕨根提取物的制备方法为：将蕨根去杂除尘，再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得蕨根脱水干燥物，干燥物过40-50目筛进行粉碎，获得蕨根粉碎物，将蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，38℃密闭培养至OD值为6.0得到培养物，28℃条件下，过滤收集培养物，4000rpm离心25min，弃离心上清液，收集离心沉积物，并以离心沉积物的8倍质量份加水充分溶解，接着分装密闭，并于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，1000rpm离心5min，去渣留离心上清液，接着在环境温度28℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.4Mpa，超滤膜的膜通量以50L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积20％的浓缩液，获得浓缩液即为所述的蕨根提取物。

其中，所述芽孢菌液态培养基可以为市售的芽孢菌液态培养基，例如进口的Bacillus Mediumbase。

其中，上述蕨根优选为含水量为9.6％的凤尾蕨科植物蕨的根茎。

其中，所述速冻优选为将包裸蕨根置于-30℃速冻12h。

其中，所述预膨化是将速冻后的包裸蕨根置于真空度90KPa，温度80℃的条件下油炸膨化5min。

其中，所述真空脱油是将油炸后的蕨根置于转速200r/min的条件下脱油6min。

其中，上述蕨根提取物中的水优选无菌蒸馏水。

本发明还提供所述复合植物提取物的制备方法，是在15-40℃下，将各组分按比例混合，充分搅拌至不含碘海水粗盐完全溶解即可，所获得的混合液为复合植物提取物。

更优选的，上述复合植物提取物是在25-30℃混合得到；更优选的，上述上述复合植物提取物是在28℃混合得到。

本发明还提供所述复合植物提取物的应用，是将所述复合植物提取物用于抑制养殖水体上层、中层和底层的舒伯特气单胞菌的异常繁殖。

当养殖水体中舒伯特气单胞菌含量≤10³cfu/ml，按每亩·米体积使用本发明复合植物提取物，本发明复合植物提取物在水体环境终浓度为0.075ml/m³时，化水泼洒，4-8h内对养殖水体中舒伯特气单胞菌具有良好的抑制效果；当养殖水体中舒伯特气单胞菌含量为10⁵-10⁶cfu/ml，按每亩·米体积使用本发明复合植物提取物，本发明复合植物提取物在水体环境终浓度为0.15ml/m³时，化水泼洒，4-8h内对养殖水体中舒伯特气单胞菌具有良好的抑制效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，与传统GMP消毒剂安全性相比，本发明复合植物提取物属于环境友好型物质，对鱼体安全浓度范围大，不会造成鱼体出现化药残留，也不易引发舒伯特气单胞菌的耐药性，对水体中藻类也没有破坏性。与传统GMP消毒剂有效性相比，本发明复合提取物作用谱仅对舒伯特气单胞菌有特效，可用于抑制养殖水环境舒伯特气单胞菌的异常繁殖，从而减低水环境舒伯特气单胞菌对鱼体的攻击力；而相同剂量下，本发明复合植物提取物对同为气单胞菌属的嗜水气单胞菌无明显抑制作用，对诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌也无明显抑制作用。从组方配伍方面看，本发明复合植物提取物由荔枝果皮提取物、金不换鲜叶提取物、蕨根提取物和不含碘海水粗盐组成，四种成分具有显著的配伍增效作用，不仅对养殖水体中舒伯特气单胞菌具有良好的抑制作用，也对舒伯特气单胞菌感染鱼体表引发的局部红点有明显的消炎收敛作用。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，以重量百分比计，称取所述复合植物提取物荔枝果皮提取物38份、金不换鲜叶提取物42份、蕨根提取物19份和不含碘海水粗盐1份，在28℃环境下，将上述各组分混合，充分搅拌至不含碘海盐完全溶解即可，所获得的混合液为所述复合植物提取物。

其中，上述荔枝果皮提取物，经由发酵得到：

(1)荔枝果皮预处理：将荔枝果皮、水、纤维素酶按10：50：(1-1.5)的比例共同混合，置于30-33℃条件下，间隔1-2h搅拌一次，持续搅拌2-3天，将上述混合物取出，30-35℃下烘干至含水量为10-12％；

(2)经过预处理的荔枝果皮：水：乳酸菌液态培养基的重量体积比为1：8：3，其中乳酸菌的加入量为每质量份预处理的荔枝果皮加入4×10⁵cfu，混合物36℃密闭培养至OD值为5.2得到培养物，将培养物离心去渣，收集上清液，接着28℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.5Mpa，超滤膜的膜通量以60L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积20％的浓缩液即为所述荔枝果皮提取物。

其中，上述金不换鲜叶提取物经下述步骤得到：金不换鲜叶：水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合38℃密闭培养至OD值为4.3得到培养物，所述金不换鲜叶：水：芽孢液态培养基的重量体积比为1：8：3，芽孢菌的加入量为每质量份金不换鲜叶加入6×10⁶cfu；28℃条件下，过滤收集培养物中的经过发酵的金不换鲜叶，置于加温至80℃的热锅上与1/4质量份的海盐硫酸镁复合物混合炙炒40-42min，以海盐完全溶化时收集含盐金不换叶泥，置于45℃条件下烘干至含水量≤8％，并与3质量份的水混合，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，离心去渣，收集上清液，接着在环境温度28℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.4Mpa，超滤膜的膜通量以50L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积18％的浓缩液，即为所述的金不换鲜叶提取物。

其中，上述蕨根提取物由包含以下步骤的方法制备得到：将蕨根去杂除尘，再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得蕨根脱水干燥物，干燥物过40-50目筛进行粉碎，获得蕨根粉碎物，将蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合38℃密闭培养至OD值为6.0得到培养物，蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基的重量体积比为1：10：3，芽孢菌的加入量为每质量份蕨根粉碎物加入8×10⁶cfu；28℃条件下，过滤收集培养物，4000rpm离心25min，弃离心上清液，收集离心沉积物，并以离心沉积物的8倍质量份加水充分溶解，接着分装密闭，并于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，1000rpm离心5min，去渣留离心上清液，接着在环境温度28℃条件下，将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置，以操作压力为0.4Mpa，超滤膜的膜通量以50L/m²·h为技术参数，所获得的浓缩至原体积20％的浓缩液，获得浓缩液即为所述的蕨根提取物。

实验例1本发明复合植物提取物对常见水产致病菌的抑制作用比较

1、试验材料

1.1试验菌种

舒伯特气单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、诺卡氏菌：均由本课题组保存提供。

聚维酮碘：为含量10％的聚维酮碘溶液。

1.2试验耗材

TSB培养基、培养皿、试管、蒸馏水等若干。

1.3复合植物提取物

本实验所用的本发明所述复合植物提取物，其制备方法同实施例1。

2、试验方法

2.1菌悬液制备

将舒伯特气单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、诺卡氏菌接种于TSB营养肉汤中，30℃培养16-20h，离心收集菌体，通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法，用PBS将菌体稀释至1×10⁴-5×10⁴cfu/mL的菌悬液。

2.2复合植物提取物的配制

利用灭菌水将复合植物提取物稀释至试验浓度。

2.3 MIC测定与结果判定

将4.5mL的试验浓度复合植物提取物和0.5mL菌悬液混合均匀，以PBS替代消毒剂作为对照组，以PBS且不添加菌悬液作为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后，各组反应液分别取0.5mL转接到4.5mL新鲜肉汤中，30-35℃培养24h，观察结果。

若肉汤浑浊表示有菌生长，记为阳性(+)，肉汤澄清表示无菌生长，记为阴性(-)；对照组应该浑浊而空白组应该澄清。澄清的最低消毒剂浓度组的消毒剂浓度为该消毒剂的MIC值。

2.4杀菌率测定与结果判定

将4.5mL的试验浓度复合植物提取物和0.5mL菌悬液混合均匀，以PBS替代消毒剂作为对照组，以PBS且不添加菌悬液做为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后，将各组反应液取100uL涂布，各组3个平行，30-35℃培养24h，计数杀菌率。

对照组菌数应100个以上，则菌悬液菌浓度达1×10⁴-3×10⁴cfu/mL；空白组应无菌生长；通过计算杀菌率评估消毒剂对细菌的杀灭效果：

杀菌率(％)＝(对照组存活菌数－试验组存活菌数)×100/对照组存活菌数。

3、试验结果

表1试验数据表明，复合植物提取物对舒伯特气单胞菌的MIC为0.125mg/L，MIC远远低于聚维酮碘对舒伯特气单胞菌MIC的4mg/L，同时其对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、诺卡氏菌的MIC则分别为8mg/L、4mg/L和8mg/L，则又分别低于聚维酮碘对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、诺卡氏菌的MIC。由此可见，本发明复合植物提取物对舒伯特气单胞菌有良好的抑制作用，而对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、诺卡氏菌的抑制作用则弱于聚维酮碘。

表1

表2试验数据表明，当复合植物提取物浓度为0.25mg/L时，其对舒伯特气单胞菌的杀菌率超过100％，当复合植物提取物浓度为0.125mg/L时，其对舒伯特气单胞菌的杀菌率仍然为100％，当复合植物提取物浓度为0.0625mg/L时，其对舒伯特气单胞菌的杀菌率超50％以上；另一方面，当复合植物提取物浓度为1ppm时，其对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和诺卡氏菌的杀菌率均为0。

表2

实验例2本发明复合植物提取物组方配伍对舒伯特气单胞菌的抑制作用

1、试验材料

1.1复合植物提取物的制备

本实验所用的本发明复合植物提取物，命名为Y，其制备方法同实施例1。

1.2组方缺失的复合植物提取物的准备

以本发明所述的实施例1制备的复合植物提取物配方为基础，通过单组分缺失或双组方同时缺失或三组分同时缺失且缺失组分以PBS等量取代的技术思路，制备荔枝果皮提取物单一缺失的复合植物提取物、金不换鲜叶提取物单一缺失的复合植物提取物、蕨根提取物单一缺失的复合植物提取物、不含碘海水粗盐单一缺失的复合植物提取物，制备荔枝果皮提取物和金不换鲜叶提取物同时缺失的复合植物提取物、荔枝果皮提取物和蕨根提取物同时缺失的复合植物提取物、荔枝果皮提取物和不含碘海水粗盐同时缺失的复合植物提取物、金不换鲜叶提取物和蕨根提取物同时缺失的复合植物提取物、金不换鲜叶提取物和不含碘海水粗盐同时缺失的复合植物提取物、蕨根提取物和不含碘海水粗盐同时缺失的复合植物提取物，分别制备仅含有荔枝果皮提取物的复合植物提取物、仅含有金不换鲜叶提取物的复合植物提取物、仅含有蕨根提取物的复合植物提取物、仅含有不含碘海水粗盐的复合植物提取物，上述制备的复合植物提取物依次命名为A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q。

2、试验方法

2.1菌悬液制备

同实验例1。

2.2复合植物提取物的配制

利用灭菌水将试验用复合植物提取物A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、Y分别稀释至试验浓度。

2.3 MIC测定与结果判定

将4.5mL的试验浓度复合植物提取物和0.5mL菌悬液混合均匀，以PBS替代消毒剂作为对照组，以PBS且不添加菌悬液作为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后，各组反应液分别取0.5mL转接到4.5mL新鲜肉汤中，30-35℃培养24h，观察结果。

若肉汤浑浊表示有菌生长，记为阳性(+)，肉汤澄清表示无菌生长，记为阴性(-)；对照组应该浑浊而空白组应该澄清。澄清的最低消毒剂浓度组的消毒剂浓度为该消毒剂的MIC值。

3、试验结果

表3试验数据表明，复合植物提取物对舒伯特气单胞菌的MIC为0.125mg/L，聚维酮碘对舒伯特气单胞菌MIC的4mg/L，而荔枝果皮提取物、金不换鲜叶提取物、蕨根提取物和不含碘海水粗盐单独组分对舒伯特气单胞菌的MIC远远高于本发明所述复合植物提取物，这说明荔枝果皮提取物、金不换鲜叶提取物、蕨根提取物以单一组分存在时，相较于复合植物提取物而言，其对舒伯特气单胞菌的抑制作用严重弱化。当复合植物提取物中荔枝果皮提取物单一缺失时，其对舒伯特气单胞菌的MIC上升至4mg/L；当复合植物提取物中金不换鲜叶提取物缺失时、复合植物提取物中蕨根提取物缺失时、复合植物提取物中缺失时，这两者对舒伯特气单胞菌MIC均为1mg/L；当复合植物提取物中不含碘海水粗盐缺失时，其对舒伯特气单胞菌MIC均为0.5mg/L。当复合植物提取物中以双组分同时缺失时，其中以含有荔枝果皮提取物同时缺失的试验组对舒伯特气单胞菌的MIC高于含有金不换鲜叶提取物、蕨根提取物和不含碘海水粗盐同时缺失的试验组，由可见，作为对舒伯特气单胞菌具有良好抑制作用的本发明所述复合植物提取物，荔枝果皮提取物是复合植物提取物具有抑制舒伯特气单胞菌的主要组分，而金不换鲜叶提取物、蕨根提取物和不含碘海水粗盐是复合植物提取物具有抑制舒伯特气单胞菌的辅助增效组分。

表3

实验例3本发明复合植物提取物对不同深度水体的舒伯特气单胞菌的抑制作用

1、试验水源

发生舒伯特气单胞菌疾病且日亩均死亡率超1％的生鱼新鱼塘口。

暴氯24h的自来水。

2、试验方法

2.1菌株的扩培

从种子批斜面上挑取舒伯特气单胞菌菌落接种于TSB营养肉汤中，30℃摇床培养20-24h，离心收集菌体，通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法，用PBS将菌体稀释至10¹¹cfu/mL的菌悬液，作为母液。

2.2定量带菌小水体环境模型的构建

将12个容积均为1立方米且高度为2米的水族箱固定在平整的地面上，分别命名为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3，其中A1、A2、A3设置为A系试验平行组，B1、B2、B3设置为B系试验平行组，C1、C2、C3设置为C系试验平行组，D1、D2、D3设置为D系试验平行组，各个试验组以及试验所用到的耗材全部利用二氧化氯喷雾彻底消毒，各水族箱预装暴氯24h的等温灭菌自来水，水深均为1.5米，置于装置有紫外线灭菌的室内环境。

在25-28℃环境温度下，向各系试验平行组分别加入舒伯特气单胞菌悬液，直到A、B、C、D系试验平行组各组水体舒伯特气单胞菌含量为10⁴cfu/L，持续供氧，维持试验水体溶氧含量全程不低于7mg/L。完成上述试验操作，即视为定量带菌小水体环境模型构建成功。

其中，以距离上层水面20公分的容积区域定义为水环境上层，以水族箱水位中线为界面向上与向下等量扩展共20公分的容积区域定义为水环境中层，以底层水面向上20公分的容积区域定义为水环境下层。

2.3单用本发明复合植物提取物对带菌水环境不同深度的抑菌效果测试

在25-28℃环境温度下，选择A、B、C系试验平行组，造模成功后，通过箱壁固定的方式，在水族箱水环境上层、中层和下层装引水管，静置2h，向A系试验平行组加入本发明复合植物提取物直至终浓度为0.125ppm，B系试验平行组加入聚维酮碘直至终浓度为2ppm，C系试验平行组不加入任何物质，设为空白对照组。

分别于1h、2h、4h、8h、16h、32h、64h，通过引水管从各个平行组抽取水环境上层、中层和下层水样1ml，其中水环境上层水样1ml视为一个水样，1个水样稀释2-4倍，从1个水样2倍稀释液中取100μL滴加并涂布到一个平皿上，静置5min，每个水样做3个平行，所有涂布水样的平皿置于35℃培养箱中培养20-24h，观察并记录平皿上舒伯特气单胞菌的菌落数量。

菌落计数结果判断标准如下：计数时应选取菌落数在30-300之间的平板，若有两个稀释度均在30-300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取其较小数字，公式如下：

每个原始水样的含菌浓度＝稀释倍数×该稀释倍数下对应平皿的菌落计数；

若菌落数低于30，则据实统计记录。

2.4本发明复合植物提取物联用活性物质对带菌水环境不同深度的抑菌效果测试

在25-28℃环境温度下，选择A、C、D系试验平行组，其中A和C组与试验2.3共享试验组，造模成功后，通过箱壁固定的方式，在水族箱水环境上层、中层和下层装引水管，静置2h，向A系试验平行组加入本发明复合植物提取物直至终浓度为0.125ppm，D系试验平行组加入本发明复合植物提取物与高分子阴离子聚合物，复配浓度为0.125ppm和0.2ppm，C系试验平行组不加入任何物质，设为空白对照组。

分别于1h、2h、4h、8h、16h、32h、64h，通过引水管从各个平行组抽取水环境上层、中层和下层水样1ml，其中水环境上层水样1ml视为一个水样，1个水样稀释2-4倍，从1个水样2倍稀释液中取100μL滴加并涂布到一个平皿上，静置5min，每个水样做3个平行，所有涂布水样的平皿置于35℃培养箱中培养20-24h，观察并记录平皿上舒伯特气单胞菌的菌落数量。

菌落计数结果判断标准如下：同上。

3、试验结果

3.1单用本发明复合植物提取物对带菌水环境不同深度的抑菌效果

如表4，带菌水环境造模成功后，不添加任何消毒剂的C系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中舒伯特气单胞菌含量都保持增长，而且不同时间点，上层、中层和下层水体中的含量数量都比较接近。与空白对照组相比，添加了聚维酮碘的B系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中舒伯特气单胞菌含量都呈明显下降，而且不同水层水体中舒伯特气单胞菌的含量都比较接近，说明2ppm的聚维酮碘溶液对水体的舒伯特气单胞菌有较好的抑制作用，但仍达不到完全抑制舒伯特气单胞菌的效果，且从添加了聚维酮碘的32-64h期间，水环境上层、中层和下层水体的舒伯特气单胞菌出现相较于前16h时的含量有一定的上升。添加了本发明复合植物提取物的A系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中舒伯特气单胞菌含量呈极明显的下降；其中1-16h阶段，本发明复合植物提取物使用后，对上层水体的舒伯特气单胞菌具有完全抑制效果，而对中层和下层水体的舒伯特气单胞菌具有一定的抑制效果，其效果明显优于添加了聚维酮碘的B系试验组；32-64h阶段，水环境上层、中层和下层水体的舒伯特气单胞菌出现相较于前16h时的含量也仅是轻微上升。

综上所述，本发明复合植物提取物对水环境不同深度水体舒伯特气单胞菌具有明显的抑制作用，且以对上层和中层水体舒伯特气单胞菌的抑制效果更优，也远优于以高于本发明复合植物提取物15倍浓度的聚维酮碘试验组。

表4

3.2发明复合植物提取物联用活性物质对带菌水环境不同深度的抑菌效果

如下表5，带菌水环境造模成功后，不添加任何消毒剂的C系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中舒伯特气单胞菌含量都保持增长，而且不同时间点，上层、中层和下层水体中的含量数量都比较接近。与空白对照组相比，添加了本发明复合植物提取物复配聚合物的D系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层水体中舒伯特气单胞菌含量呈极明显的下降；其中1-16h阶段，本发明复合植物提取物使用后，对上层、中层水体的舒伯特气单胞菌具有完全抑制效果，而对下层水体的舒伯特气单胞菌抑制效果则与聚合物的沉降位置有关，值得指出的是，本发明复合植物提取物复配聚合物联用，起始的前2h可降低至造模时的10％及以下菌含量水平，当聚合完全沉降至底部时，4-16h阶段，本发明复合植物提取物复配聚合物联用则表现为对下层水舒伯特气单胞菌的完全抑制；32-64h阶段，水环境上层、中层和下层水体的舒伯特气单胞菌出现相较于前16h时的含量也仅是轻微上升。相较于添加了本发明复合植物提取物的B系试验组，聚合物的复配使用，可增强本发明复合物对中层和下层水体舒伯特气单胞菌的完全抑制作用。

综上所述，本发明复合植物提取物对水环境不同深度水体舒伯特气单胞菌具有明显的抑制作用，复配聚合物使用，可以增强本发明复合植物提取物对中层和下层水体舒伯特气单胞菌的完全抑制效果及持续抑制的时间。

表5

实验例4本发明复合植物提取物对舒伯特气单胞菌源性体表感染红点病灶的修复作用

1、试验材料

1.1试验用鱼：规格为50±5g/尾，体表无任何可见的异常病理症状，同批鱼群3％比例生鱼随机抽检解剖未发现内脏任何可见的异常病理症状。

2、试验方法

2.1菌株的扩培：同实验例3。

2.2试验鱼体外浸泡感染模型的构建

试验第1天，从准备用于本次试验的生鱼中随机捞取600尾，经检测体表、口腔、鳍条无任何肉眼可见的异常病理症状，视为符合本次感染模型构建的试验鱼使用要求。将600尾试验生鱼随机平均分配到12个预装300L暴氯24h的自来水的的水族箱中，每个水族箱用鱼50尾，这12个水族箱分别命名A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3，静养12-18h，向各水族箱加入去垢剂十二烷基磺酸钠直至其终质量浓度为0.2％，当各个水族箱的试验鱼浸泡5分钟后，试验鱼体表变性的粘液开始呈现局部性脱落，将各个水族箱中的水全部换为加氧暴氯24h的等温自来水，静养2-3h，依次向12个水族箱加入舒伯特气单胞菌母液，直至各个水族箱中舒伯特气单胞菌的终含量为10⁴cfu/L，36-48h期间，观察各水族箱生鱼体表、鳍条和口腔的出现红点的数量，若各水族箱中生鱼体表、鳍条和口腔出现红点的鱼体尾数比例大于10％，且各水族箱中体表、鳍条和口腔出现红点的生鱼其红点病灶数量不低于2处，视为体外浸泡感染模型构建成功。

试验期间持续加氧保持各水族箱水体温度为28-30℃，水体溶氧含量不低于7mg/L，不投饲料。其中A1、A2、A3设置为A系试验平行组，B1、B2、B3设置为B系试验平行组，C1、C2、C3设置为C系试验平行组，D1、D2、D3设置为D系试验平行组。

2.3复合植物提取物对生鱼体外感染造成的红点的修复作用

试验第48h起，按0.195ppm、0.39ppm的终浓度依次向A系(A1、A2、A3)、B系(B1、B2、B3)加入本发明复合植物提取物，按2ppm终浓度依次向C系(C1、C2、C3)加入聚维酮碘，D系(D1、D2、D3)设置为空白对照组，其对应的水族箱不加入任何消毒剂。各试验组和空白对照组保持12h不换水，随后将各个水族箱中的水全部换为加氧暴氯24h的等温自来水，48h观察鱼体红点是否收敛或感染性扩散，以此来判断复合植物提取物对生鱼体外感染造成的红点的修复作用，其效果判断标准如下：

红点结痂：以单尾出现红点的生鱼计，当单尾生鱼的红点全部转归结痂，若出现在消毒剂处理组，则视为本组添加的物质具有消炎收敛伤口的作用；若出现在空白组，则视为鱼体自愈作用。

注：上述公式中，x代表A系、B系、C系；结痂数代表该组生鱼转归结痂的总数量；初始红点数代表对照组造模成功时统计的该组出现红点总数

3、试验结果

3.1试验鱼体外浸泡感染模型的构建结果

如下表6，各组试验生鱼体表出现红点的比例分别为11.3％、12％和10.7％和10.7％，且各出现红点的试验生鱼其体表红点病灶数量均大于2处。由此可见，本次试验生鱼体外浸泡感染模型构建成功，可以作为下一步评估不同物质对红点修复作用的病理模型。

表6

3.2各组生鱼体外感染造成的红点的修复结果

如下表7，相同试验条件下，自造模成功后，48h后观察发现：空白对照组没有使用任何消毒剂，出现红点的试验生鱼体表红点病灶没有任何炎症消除或收敛的转归变化；浸泡于2ppm聚维酮碘的试验生鱼，出现红点的试验生鱼体表红点病灶炎症消除或收敛的有3.9％出现转归结痂变化；浸泡于0.195ppm复合植物提取物的试验生鱼，出现红点的试验生鱼体表红点病灶炎症消除或收敛的有64.4％出现转归结痂变化；浸泡于0.39ppm复合植物提取物的试验生鱼，出现红点的试验生鱼体表红点病灶炎症消除或收敛的有100％出现转归结痂变化。

综上所述，与空白组和2ppm聚维酮碘浸泡组相比，使用本发明复合植物提取物对体外感染舒伯特气单胞菌导致的生鱼体表红点具有极其明显的效果优势。以使用剂量0.195ppm对红点修复促进红点转归结痂率64.4％计，按1亩每米水深，使用130毫升本发明复合植物提取物即可达到64.4％红点修复率的效果；而以使用剂量0.39ppm对红点修复促进红点转归结痂率100％计，按1亩每米水深，使用260毫升本发明复合植物提取物即可达到100％红点修复率的效果。

表7

注：*代表鱼体自愈率。

实验例5本发明复合植物提取物对水产动物的安全性评估

1、试验材料与方法

1.1复合植物提取物的制备

本实验所用的本发明所述复合植物提取物，其制备方法同实施例1。

1.2试验鱼的暂养与分组

选择健康生鱼600尾，分成6个组，每个组100尾，每个组下设两个平行组，每个平行组50尾，分别随机命名为A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2、F1、F2。

选择健康加州鲈600尾，分成6个组，每个组100尾，每个组下设两个平行组，每个平行组50尾，分别随机命名为H1、H2、J1、J2、K1、K2、L1、L2、M1、M2、N1、N2。

选择健康草鱼600尾，分成6个组，每个组100尾，每个组下设两个平行组，每个平行组50尾，分别随机命名为P1、P2、Q1、Q2、R1、R2、S1、S2、T1、T2、V1、V2。

1.3复合植物提取物梯度浓度的配制与安全性评估

取本发明复合植物提取物溶，按0、0.625ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm的终浓度要求，其对应的试验组分配如下表8。

表8

在0、12h、24h三个时间维度下，分别评估终浓度为0、0.625ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm的试验水体中，各个试验组试验鱼的存活情况，并通过以下公式评估复合植物提取物对不同试验鱼的安全性。

1.4其他耗材

蒸馏水若干，量杯适量。

2、试验结果

如下表9，不同时间点的安全性评估结果表明，复合植物提取物对生鱼、加州鲈和草鱼的安全浓度为≤2.5mg/L。当使用终浓度为5-10mg/L时，复合植物提取物对生鱼的安全性优于对加州鲈和草鱼的。

表9

综合试验例1-5试验结果可知，本发明复合植物提取物在合适的使用剂量下，对生鱼养殖水体中舒伯特气单胞菌及该菌感染生鱼引发体表红点具有良好的转化应用前景，复配具有沉降作用的聚合物使用，可以增强复合植物提取物对中层和下层水体舒伯特气单胞菌的抑制作用。

Claims (5)

1.一种用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，其特征在于，以重量百分比计，包括30-40%荔枝皮提取物、35-45%金不换鲜叶提取物、15-25%蕨根提取物、1-3%不含碘海水粗盐；

所述荔枝皮提取物的制备方法为：

S1、荔枝果皮预处理：将荔枝果皮与水、纤维素酶按10：50：1-1.5的比例共同混合，置于30-33℃条件下，间隔1-2h搅拌一次，持续搅拌2-3天后，将搅拌物于30-35℃下烘干至含水量为10-12%；

S2、发酵：将经过预处理的荔枝果皮：水：乳酸菌液态培养基和乳酸菌混合，33-37℃密闭培养至OD值为4.2-5.3得到培养物，将培养物离心去渣，收集上清液；

S3、浓缩：将收集的上清液超滤浓缩至原体积的10%-30%，所获得的浓缩液即为所述荔枝果皮提取物；其中，经过预处理的荔枝果皮：水：乳酸菌液态培养基的重量体积比为1：5-10：2-4，乳酸菌的加入量为每质量份预处理的荔枝果皮加入（2-6）×10⁵cfu；

所述金不换鲜叶提取物的制备方法为：

S1、发酵：将金不换鲜叶、水、芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为3.0-4.5得到培养物，其中，金不换鲜叶：水：芽孢菌液态培养基的重量体积比为1：6-12：2-4，芽孢菌的加入量为每质量份金不换鲜叶加入（3-8）×10⁶cfu；

S2、热盐炙：25-28℃条件下，过滤收集培养物中的经过发酵的金不换鲜叶，置于加温至70-85℃的热锅上，与1/4-1/3质量份的海盐硫酸镁复合物混合炙炒30-50min，以海盐完全溶化时收集含盐金不换叶泥，置于40-45℃条件下烘干至含水量≤8%，并与3-4质量份的水混合，高压灭菌，冷却后取出，离心去渣；

S3、浓缩：离心后收集的上清液超滤浓缩至原体积的10%-25%，获得浓缩液即为所述的金不换鲜叶提取物；

所述金不换鲜叶提取物的制备方法中，所用的芽孢菌为多粘芽孢杆菌；

所述海盐硫酸镁复合物是将不含碘海水粗盐与七水硫酸镁混合，以质量百分比计，不含碘海水粗盐与七水硫酸镁混合质量比为80-90：10-20；

所述蕨根提取物的制备方法为：

S1、蕨根预处理：将蕨根去杂除尘，再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得蕨根脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得蕨根粉碎物；其中，蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基按重量体积比1：6-12：2-4进行混合，芽孢菌的加入量为每质量份蕨根粉碎物加入（3-8）×10⁶cfu；

S2、发酵：将蕨根粉碎物：水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为4.0-6.5得到培养物，25-28℃条件下，过滤收集培养物，3000-5000rpm离心20-30min，弃离心上清液，收集离心沉积物，并以离心沉积物的6-10倍质量份加水充分溶解，接着分装密闭，高压灭菌，冷却后取出；

S3、浓缩：离心，将收集的上清液浓缩至原体积的10%-25%，获得浓缩液即为所述的蕨根提取物；

所述蕨根提取物的制备方法中，所用的芽孢菌为嗜豆芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，其特征在于，以重量百分比计，包括35-40%荔枝皮提取物、40-45%金不换鲜叶提取物、15-23%蕨根提取物、1-2%不含碘海水粗盐。

3.根据权利要求1至2任一项所述的用于抑制水环境舒伯特气单胞菌的复合植物提取物，其特征在于，S3所述浓缩采用超滤浓缩，浓缩条件为：温度25-30℃，操作压力为0.3-0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50-100L/m²·h。

4.权利要求1至2任一项所述复合植物提取物的制备方法，其特征在于，在15-40℃下，将各组分按比例混合，充分搅拌至不含碘海水粗盐完全溶解即可，所获得的混合液为复合植物提取物。

5.权利要求1至2任一项所述复合植物提取物的应用，其特征在于，所述复合植物提取物用于抑制养殖水体上层、中层和底层的舒伯特气单胞菌的异常繁殖。