CN113907097B - 一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于水体环境抑菌剂技术领域，公开了用于增效抑制对虾养殖高盐度水体哈维弧菌的复合提取物。由山石斛提取物40％‑55％、箴兰提取物10％‑22％、莪术提取物30％‑45％组成。具有以下优势：本发明复合提取物对高盐度养殖水体的哈维弧菌有抑制作用，对白虾的安全性较好，对水体中藻类的安全性也较友好；相同使用剂量下，本发明复合提取物对同为弧菌属的副溶血弧菌、溶藻弧菌、气单胞菌等则无明显抑制作用；本发明三种成分具有显著的配伍增效作用，单用时或与和絮凝剂联用均对高盐度养殖水体中哈维弧菌具有良好的抑制作用，与二氧化氯商品联用对高盐度养殖水体中哈维弧菌感染引发的红脚具有显著修复治疗的增效作用。

Description

一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及水体环境抑菌剂技术领域，更具体地，涉及一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物及其制备方法和应用。
背景技术
哈维弧菌属于革兰氏阴性菌，是高盐度水体水产养殖动物的常见致病性弧菌之一，可通过菌体粘附作用引发对虾和海水养殖鱼类的感染，其在夏秋季高温时期的感染性明显高于其他季节。实践表明，高盐度养殖水体对虾感染哈维弧菌后均可导致出血性肠炎，留给养殖户治疗的有利窗口期非常短，治疗不及时可造成大量养殖对虾急性偷死，造成的经济损失也非常严重。因此，将高盐度养殖水体哈维弧菌繁殖量控制在致病性安全阈值以下，有利于降低对虾哈维弧菌的感染率，也有利于提高对虾养殖成功率。
降低水体哈维弧菌异常繁殖，定期使用合规消毒剂是常见外用手段，然而高盐度养殖水体盐度高低不同，同一种合规消毒剂对哈维弧菌的抑制作用是有差异的，对于低盐度的虾塘高盐度养殖水体，哈维弧菌繁殖量较低，使用合规消毒剂具有较好的抑制哈维弧菌的效果，而对于高盐度的虾塘高盐度养殖水体，哈维弧菌的繁殖量非常高，使用合规消毒剂对哈维弧菌的抑制效果较弱，有效抑制的持续期较短，容易出现繁殖量短期上升导致感染复发的问题。虽然外用抗生素或内服抗生素能较好的治疗对虾哈维弧菌感染复发的问题，但抗生素残留导致对虾达不到食品安全的市场准入门槛而卖不出的问题更严重。因此，寻求一种更安全有效低成本的增效抑制水体哈维弧菌的复合成分，对降低对虾发生哈维弧菌风险具有更大的经济价值和社会价值。
发明内容
本发明为了克服现有技术中上述缺陷，首先提供一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物。
本发明的第二个目的是提供上述用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，以重量百分比计，包括40-55％山石斛提取物、10-22％箴兰提取物、30-45％莪术提取物。
优选的，所述的用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，以重量百分比计，包括45-52％山石斛提取物、12-20％箴兰提取物、35-42％莪术提取物。
作为一种最优选的实施方式，所述的用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，以重量百分比计，包括45％山石斛提取物、18％箴兰提取物、37％莪术提取物。
优选的，所述山石斛提取物为山石斛的浓缩提取物，山石斛为兰科麦斛属麦斛兰的含根部全草，优选两年生山石斛含根部全草。
更优选的，所述山石斛提取物通过包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将山石斛鲜摘全草冲洗干净去杂，榨汁机搅碎滤渣取汁，分别获得山石斛初提汁和山石斛滤渣；
S2、将山石斛初提汁在40-45℃下加热将其体积浓缩至原来的1/3至1/2，超声波处理4-6分钟，获得山石斛初提汁预处理物；将山石斛滤渣与浓度为1M的氢氧化钠溶液和蒸馏水按质量体积比的(9-10)：1：(40-50)充分混合，35-40℃下静置24-36h，使用稀盐酸将pH值中和至7.0-7.2，接着将其置于40-45℃下加热将其体积浓缩至原来的1/3至1/2，获得山石斛滤渣预处理物；
S3、按质量体积比，将山石斛初提汁预处理物和山石斛滤渣预处理物按1：(2-4)混合，接着加入蒸馏水100-150体积份和纤维素酶2500-3500IU，装入35-40℃可调温的密闭发酵容器中，加入芽孢菌液态培养基3-8体积份，加入含量为(2.5-5.8)╳108cfu/g的芽孢菌10-30g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为6.2-7.2时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的10％-30％，所获得复合物即为所述山石斛浓缩提取物。
其中，S1榨汁机的功率为2000W的家用榨汁机。
其中，S2超声波处理参数设置为200瓦，时间8秒，间隔15-30秒，全程3-5分钟，超声处理期间，样品容器保持冰浴。
其中，S3无搅拌式超滤浓缩的技术参数如下：环境温度25-30℃条件下，操作压力为0.3～0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50～100L/m2·h为宜。
进一步地，上述的芽孢菌优选为纳豆芽孢杆菌分离株，枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌功能上不能取代本发明分离到的纳豆芽孢杆菌。
进一步地，S3上述培养物离心优选在5000rpm离心，例如5000rpm离心10分钟。
在一个优选的实施方式中，所述山石斛提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将山石斛鲜摘全草冲洗干净去杂，榨汁机搅碎滤渣取汁，分别获得山石斛初提汁和山石斛滤渣；
S2、将山石斛初提汁在43℃下恒温加热将其体积浓缩至原来的1/2，超声波处理4分钟，获得山石斛初提汁预处理物；将山石斛滤渣与浓度为1M的氢氧化钠溶液和蒸馏水按质量体积比的10：1：50充分混合，40℃下静置24-36h，使用稀盐酸将pH值中和至7.0-7.2，接着将其置于45℃下恒温加热将其体积浓缩至原来的1/2，获得山石斛滤渣预处理物；
S3、按质量体积比，将山石斛初提汁预处理物和山石斛滤渣预处理物按1：3混合，接着加入蒸馏水100体积份和纤维素酶2800IU，装入35℃可调温的密闭发酵容器中，加入芽孢菌液态培养基5体积份，加入含量为4╳108cfu/g的芽孢菌20g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为7.0时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的20％，所获得复合物即为所述山石斛浓缩提取物。
其中，所述芽孢菌液态培养基可以为市售的芽孢菌液态培养基，例如进口的Bacillus Mediumbase。所述纤维素酶，为市售工业纤维素酶，纯度为工业级。
优选地，箴兰提取物为经过预处理的箴兰再经发酵和超滤浓缩的获得物。
更优选地，所述箴兰提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将鲜摘箴兰冲洗干净去杂，搅拌机搅碎成泥，按质量体积比与0.5M稀盐酸溶液按1：(1-1.5)进行充分混合，25-30℃环境中静置处理12-16h，利用2-3M氢氧化钠溶液将pH值调到7.0-7.2之间，获得箴兰预处理物；
S2、接着按质量体积比，将箴兰预处理物与1-2M的氯化钠以1：(3-4)进行预混合，并置于90-105℃进行热处理20-30分钟，冷却后获得箴兰预处理热炙物；将箴兰预处理热炙物与芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为6.2-7.2得到培养物，25-28℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的15％-30％，获得浓缩液即为所述的箴兰提取物。
其中，箴兰预处理热炙物：蒸馏水：芽孢菌液态培养基的重量体积比为1：(8-15)：(1-1.8)，芽孢菌的加入量为每质量份箴兰预处理热炙物加入含量为(3-8)╳106cfu/g的菌粉10-30g。
其中，箴兰为兰科石仙桃属石仙桃含根部的全草株，优选2年生的箴兰含根部的全草株。
其中，箴兰、水、芽孢菌液态培养基和芽孢菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将箴兰和芽孢液态培养基混合，再加入芽孢菌混合，最后加入水混合均匀。
其中，S2无搅拌式超滤浓缩的技术参数如下：环境温度25-30℃条件下，操作压力为0.3～0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50～100L/m2·h为宜。
进一步的，上述的芽孢菌优选为纳豆芽孢杆菌分离株，枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌功能上不能取代本发明分离到的纳豆芽孢杆菌。
进一步地，S2上述培养物离心优选在4500rpm离心，例如4500rpm离心10分钟。
在一个优选的实施方式中，所述箴兰提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将鲜摘箴兰冲洗干净去杂，搅拌机搅碎成泥，按质量体积比与稀盐酸溶液按1：1进行充分混合，30℃环境中静置处理16h，利用3M氢氧化钠溶液将pH值调到7.0-7.2之间，获得箴兰预处理物；
S2、接着按质量体积比，将箴兰预处理物与2M的氯化钠以1：4进行预混合，并置于95℃进行热处理25分钟，冷却后获得箴兰预处理热炙物；将箴兰预处理热炙物与芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35℃密闭培养至OD值为7.0得到培养物，26℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的25％，获得浓缩液即为所述的箴兰提取物。
其中，所述芽孢菌液态培养基可以为市售的芽孢菌液态培养基，例如进口的Bacillus Mediumbase。
优选的，上述莪术提取物为莪术根部经过预处理、发酵和超滤浓缩获得的物质。
优选的，所述莪术提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将经过预处理的莪术去杂除尘，按质量体积比计，与氯化钠按1：(1-1.5)混合均匀，再经90-105℃进行热处理10-15分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出莪术获得莪术热炙处理物；
S2、再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得莪术脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得莪术粉碎物；
S3、将莪术粉碎物：蒸馏水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为6.0-7.5得到培养物，25-28℃条件下，过滤收集培养物，3000-5000rpm离心20-30min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，800-1200rpm离心5-10min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的20％-25％，获得浓缩液即为所述的莪术提取物。
其中，S3所述的莪术粉碎物：蒸馏水：芽孢液态培养基按重量体积比1：(8-14)：(3-5)进行混合，芽孢菌的加入量为每质量份莪术粉碎物加入含量为(3-8)╳108cfu/g菌粉10-30g。
其中，所述莪术为优选2年生姜科植物莪术根部。
其中，S1所述预处理的莪术，其操作步骤如下，优选2年生姜科植物莪术根部，浸泡于2-3倍质量体积比的2-3.5M硫酸镁溶液，环境温度25-30℃，24-36h取出，沥干，预处理的莪术含水量为8％-10％，即可。
所述预处理的莪术、蒸馏水、芽孢菌液态培养基和芽孢菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将预处理的莪术和芽孢液态培养基混合，再加入芽孢菌混合，最后加入水混合均匀。
其中，S3无搅拌式超滤浓缩的技术参数如下：环境温度25-30℃条件下，操作压力为0.3～0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50～100L/m2·h为宜。
进一步的，S2所述速冻优选为将预处理的莪术置于-20～-40℃速冻10～12h。
进一步的，S2所述预膨化是将速冻后的预处理的莪术置于真空度90～95KPa，温度70～80℃的条件下油炸膨化3～6min。
进一步的，S2所述真空脱油是将油炸后的预处理的莪术置于转速150～250r/min的条件下脱油6～15min。
进一步的，上述莪术提取物中的水优选无菌蒸馏水。
进一步的，上述的芽孢菌优选为纳豆芽孢杆菌分离株，枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌功能上不能取代本发明分离到的纳豆芽孢杆菌。
在一个优选的实施方式中，所述莪术提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将经过预处理的莪术去杂除尘，按质量百分比计，与氯化钠按1：1混合均匀，再经95℃进行热处理10分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出莪术获得莪术热炙处理物；
S2、再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得莪术脱水干燥物，干燥物过60目筛进行粉碎，获得莪术粉碎物；
S3、将莪术粉碎物：蒸馏水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35℃密闭培养至OD值为7.2得到培养物，25℃条件下，过滤收集培养物，5000rpm离心20min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，800rpm离心5min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的20％，获得浓缩液即为所述的莪术提取物。
其中，所述的莪术粉碎物：蒸馏水：芽孢液态培养基按重量体积比1：12：4进行混合，芽孢菌的加入量为每质量份莪术粉碎物加入含量为4╳108cfu/g菌粉15g。
其中，所述芽孢菌液态培养基可以为市售的芽孢菌液态培养基，例如进口的Bacillus Mediumbase。
其中，所述速冻优选为将莪术置于-30℃速冻12h。
其中，所述预膨化是将速冻后的莪术置于真空度90KPa，温度80℃的条件下油炸膨化5min。
其中，所述真空脱油是将油炸后的莪术置于转速200r/min的条件下脱油6min。
本发明还提供上述用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物的制备方法，包括以下步骤：在25-40℃环境下，将各组分混合，常规超声波乳化均匀即可，所获得的混合液为所述复合提取物。
优选的，所述的超声波处理参数设置为200瓦，时间8秒，间隔15-30秒，全程3-5分钟，超声处理期间，样品容器保持冰浴。
在一个优选实施中，制备一种用于增效抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合提取物的方法，所述方法包括以下步骤：在28℃环境下，将各组分混合，常规超声波乳化均匀即可，所获得的混合液为所述复合提取物。
本发明还提供上述用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物的应用，尤其是针对二氧化氯商品使用时对哈维弧菌具有明显的增效抑制作用，进一步具体为：高盐度养殖水体中哈维弧菌含量≤103cfu/ml，按每亩·米体积使用本发明的复合植物提取物20-30mL，按体积质量比计，与8％含量二氧化氯商品按1：(8-15)共同化水泼洒，4-8h内对高盐度养殖水体中哈维弧菌具有良好的抑制效果，且其效果明显优于本发明按上述剂量单独作用时其对哈维弧菌的抑制效果；当高盐度养殖水体中哈维弧菌含量为105-106cfu/ml，按每亩·米体积使用本发明对50-80mL，按体积质量比计，与8％含量二氧化氯商品按1：(8-15)共同化水泼洒，4-8h内对高盐度养殖水体中哈维弧菌具有良好的抑制效果，且其效果明显优于本发明按上述剂量单独作用时其对哈维弧菌的抑制效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，与水产常用的合规消毒剂相比，本发明复合提取物具有以下优势：
首先，本发明复合提取物对高盐度养殖水体的哈维弧菌有抑制作用，对对虾的安全性较好，对水体中藻类的安全性也较好。
其次，相同使用剂量下，本发明复合提取物对同为弧菌属的副溶血弧菌、溶藻弧菌、气单胞菌等则无明显抑制作用。
最后，本发明复合提取物由山石斛提取物、箴兰提取物和莪术提取物组成，三种成分具有显著的配伍增效作用，单用时对高盐度养殖水体中哈维弧菌具有一定的抑制作用，与二氧化氯商品联用时对高盐度养殖水体中哈维弧菌抑制作用显著提升。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种用于增效抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合提取物，以重量百分比计，所述复合提取物包含：山石斛提取物45％、箴兰提取物18％、莪术提取物37％，在25℃环境下，将各组分混合，常规超声波乳化均匀即可，所获得的混合液为所述复合提取物。
其中，所述山石斛提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：将山石斛鲜摘全草冲洗干净去杂，榨汁机搅碎滤渣取汁，分别获得山石斛初提汁和山石斛滤渣。第一步，将山石斛初提汁在43℃下恒温加热将其体积浓缩至原来的1/2，超声波处理4分钟，获得山石斛初提汁预处理物；第二步，将山石斛滤渣与浓度为1M的氢氧化钠溶液和蒸馏水按质量体积比的10：1：50充分混合，40℃下静置24-36h，使用稀盐酸将pH值中和至7.0-7.2，接着将其置于45℃下恒温加热将其体积浓缩至原来的1/2，获得山石斛滤渣预处理物。第三步，按质量体积比，将山石斛初提汁预处理物和山石斛滤渣预处理物按1：3混合，接着加入蒸馏水100体积份和纤维素酶2800IU，装入35℃可调温的密闭发酵容器中，加入芽孢菌液态培养基5体积份，加入含量为4╳108cfu/g的芽孢菌20g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为7.0时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的20％，所获得复合物即为所述山石斛浓缩提取物。
其中，所述箴兰提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：将鲜摘箴兰冲洗干净去杂，搅拌机搅碎成泥，按质量体积比与稀盐酸溶液按1：1进行充分混合，30℃环境中静置处理16h，利用3M氢氧化钠溶液将pH值调到7.0-7.2之间，获得箴兰预处理物；接着按质量体积比，将箴兰预处理物与2M的氯化钠以1：4进行预混合，并置于95℃进行热处理25分钟，冷却后获得箴兰预处理热炙物；将箴兰预处理热炙物与芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35℃密闭培养至OD值为7.0得到培养物，26℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的25％，获得浓缩液即为所述的箴兰提取物。
其中，所述莪术提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：将经过预处理的莪术去杂除尘，按质量百分比计，与氯化钠按1：1混合均匀，再经95℃进行热处理10分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出莪术获得莪术热炙处理物，再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得莪术脱水干燥物，干燥物过60目筛进行粉碎，获得莪术粉碎物，将莪术粉碎物：蒸馏水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35℃密闭培养至OD值为7.2得到培养物，25℃条件下，过滤收集培养物，5000rpm离心20min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，800rpm离心5min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的20％，获得浓缩液即为所述的莪术提取物。
实验例1本发明复合植物提取物对四种水产致病菌的抑制作用比较
1、试验材料
1.1试验菌种
哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌：均由本课题组保存提供。
1.2试验耗材
TSB肉汤培养基、TCBS肉汤培养基、试管、蒸馏水等若干。
二氧化氯：为含量8％泡腾颗粒商品。
1.3复合植物提取物
本实验所用的本发明所述复合植物提取物，其制备方法同实施例1。
2、试验方法
2.1菌悬液制备
将哈维弧菌、溶藻弧菌分别接种含有TCBS肉汤培养基中，28℃培养16-20h，离心收集菌体，通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法，用PBS将菌体稀释至1×104～5×104cfu/mL的菌悬液。
将嗜水气单胞菌接种于TSB肉汤培养基中，28℃培养16-20h，离心收集菌体，通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法，用PBS将菌体稀释至1×104～5×104cfu/mL的菌悬液。
2.2复合植物提取物的配制
利用灭菌水将复合植物提取物稀释至试验浓度。
2.3MIC测定与结果判定
将4.5mL的试验浓度复合植物提取物和0.5mL菌悬液混合均匀，以PBS替代消毒剂作为对照组，以PBS且不添加菌悬液作为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后，各组反应液分别取0.5mL转接到4.5mL新鲜肉汤中，30-35℃培养24h，观察结果。
若肉汤浑浊表示有菌生长，记为阳性(+)，肉汤澄清表示无菌生长，记为阴性(-)；对照组应该浑浊而空白组应该澄清。澄清的最低消毒剂浓度组的消毒剂浓度为该消毒剂的MIC值。
2.4杀菌率测定与结果判定
将4.5mL的试验浓度复合植物提取物和0.5mL菌悬液混合均匀，以PBS替代消毒剂作为对照组，以PBS且不添加菌悬液做为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后，将各组反应液取100uL涂布，各组3个平行，30-35℃培养24h，计数杀菌率。
对照组菌数应100个以上，则菌悬液菌浓度达1×104-3×104cfu/mL；空白组应无菌生长；通过计算杀菌率评估消毒剂对细菌的杀灭效果：
杀菌率(％)＝(对照组存活菌数－试验组存活菌数)×100/对照组存活菌数。
3、试验结果
下表试验数据表明，复合提取物对哈维弧菌的MIC为0.125mg/L，MIC低于二氧化氯对哈维弧菌MIC的0.5mg/L，同时其对溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌的MIC则分别为8mg/L、8mg/L和16mg/L。由此可见，本发明复合提取物对哈维弧菌有良好的抑制作用，而对溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌的抑制作用则弱于二氧化氯。
表1
Figure BDA0003305915790000091
表2试验数据表明，当复合提取物浓度为0.125mg/L时，其对哈维弧菌的杀菌率超过100％，当复合提取物浓度为0.0625mg/L时，其对哈维弧菌的杀菌率超55％以上；另一方面，当复合提取物浓度≤1mg/L时，其对溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌的杀菌率均为0。
表2
Figure BDA0003305915790000101
4、试验小结
(1)经不同倍数稀释的复合提取物对不同致病菌的抑制作用不同。
(2)当复合提取物稀释浓度为0.125mg/L时，其对哈维弧菌具有良好的专一性抑制作用，其杀菌率为100％。
(3)当复合提取物稀释浓度为0.0625mg/L时，其对哈维弧菌仍具有良好的专一性抑制作用，其杀菌率高达55％以上。
(4)当复合提取物稀释浓度≤4mg/L时，其对溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌不具有抑制作用，其杀菌率为0。
实验例2本发明复合植物提取物组方配伍对哈维弧菌的抑制作用
1、试验材料
1.1、试验菌种
哈维弧菌：均由本课题组保存提供。
1.2、试验耗材
TSB肉汤培养基、TCBS肉汤培养基、试管、蒸馏水等若干。
二氧化氯：为含量8％泡腾颗粒商品。
1.3、复合植物提取物的制备
本实验所用的本发明复合植物提取物，命名为S1，其制备方法同实施例1。
1.4、组方缺失的复合植物提取物的准备
以本发明所述的实施例1制备的复合提取物配方为基础，通过单组分缺失或双组方同时缺失或三组分同时缺失，且缺失组分以PBS等量取代的技术思路，制备山石斛提取物单一缺失的复合提取物、箴兰提取物单一缺失的复合提取物、莪术提取物单一缺失的复合提取物，分别制备仅含有山石斛提取物的复合提取物、仅含有箴兰提取物的复合提取物和仅含有莪术提取物的复合提取物，上述制备的复合提取物依次命名为S2、S3、S4、S5、S6、S7。
2、试验方法
2.1菌悬液制备
将哈维弧菌接种于TCBS肉汤培养基中，28℃培养16-20h，离心收集菌体，通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法，用PBS将菌体稀释至1×104～5×104cfu/mL的菌悬液。
2.2复合植物提取物的配制
利用灭菌水将试验用复合提取物S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7分别稀释至试验浓度。
2.3 MIC测定与结果判定
将4.5mL的试验浓度复合植物提取物和0.5mL菌悬液混合均匀，以PBS替代消毒剂作为对照组，以PBS且不添加菌悬液作为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后，各组反应液分别取0.5mL转接到4.5mL新鲜肉汤中，30-35℃培养24h，观察结果。
若肉汤浑浊表示有菌生长，记为阳性(+)，肉汤澄清表示无菌生长，记为阴性(-)；对照组应该浑浊而空白组应该澄清。澄清的最低消毒剂浓度组的消毒剂浓度为该消毒剂的MIC值。
3、试验结果
表3试验数据表明，复合提取物对哈维弧菌的MIC为0.125mg/L，二氧化氯对哈维弧菌MIC的0.5mg/L，而山石斛提取物、箴兰提取物和莪术提取物依次单一组分缺失时对哈维弧菌的MIC远远高于本发明所述复合提取物，这说明山石斛提取物、箴兰提取物和莪术提取物以单一组分存在时，相较于本发明复合提取物而言，其对哈维弧菌的抑制作用严重弱化。当复合提取物中以双组分同时缺失时，其中以单一含有山石斛提取物、箴兰提取物和莪术提取物的试验组对哈维弧菌的抑制作用严重显著低于本发明的单一成分缺失组，更是显著低于本发明复合提取物。由可见，作为对哈维弧菌具有良好抑制作用的本发明所述复合提取物，山石斛提取物、箴兰提取物和莪术提取物是复合提取物具有抑制哈维弧菌的共同主要成分，当山石斛提取物、箴兰提取物和莪术提取物三种提取物组分单一组分缺失或单一组分存在时，其对哈维弧菌的抑制作用均呈现严重的弱化。
表3
Figure BDA0003305915790000111
Figure BDA0003305915790000121
4、试验小结
(1)山石斛提取物、箴兰提取物和莪术提取物是复合提取物具有抑制哈维弧菌的共同主要成分。
(2)山石斛提取物、箴兰提取物、莪术提取物和蒲公英提取物以单一组分存在或单一组分缺失时，均难以有效的抑制哈维弧菌。
(3)针对哈维弧菌的抑制作用，本发明复合提取物的抑制效果明显优于二氧化氯，而当本发明复合提取物的组分以单一组分存在或单一组分缺失时，其对哈维弧菌的抑制作用则明显弱于二氧化氯。
实验例3本发明复合植物提取物对不同深度水体的哈维弧菌的抑制作用
1、试验材料
1.1、试验菌种
哈维弧菌：均由本课题组保存提供。
1.2、试验耗材
TSB肉汤培养基、TCBS肉汤培养基、试管、蒸馏水、海水盐晶等若干。
二氧化氯：为含量8％泡腾颗粒商品。
1.3、复合植物提取物的制备
本实验所用的本发明复合植物提取物，其制备方法同实施例1。
1.4、试验水源
暴氯24h的自来水，用海水盐晶调节盐度至20格。
2、试验方法
2.1菌株的扩培
从种子批斜面上挑取迟缓爱德华氏菌菌落接种于TSB营养肉汤中，30℃摇床培养20-24h，离心收集菌体，通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法，用PBS将菌体稀释至1011cfu/mL的菌悬液，作为母液。
2.2定量带菌小水体环境模型的构建
将12个容积均为1立方米且高度为2米的水族箱固定在平整的地面上，分别命名为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3，其中A1、A2、A3设置为A系试验平行组，B1、B2、B3设置为B系试验平行组，C1、C2、C3设置为C系试验平行组，D1、D2、D3设置为D系试验平行组，各个试验组以及试验所用到的耗材全部利用二氧化氯喷雾彻底消毒，各水族箱预装暴氯24h的等温灭菌自来水，水深均为1.5米，置于装置有紫外线灭菌的室内环境。
在25-28℃环境温度下，向各系试验平行组分别加入哈维弧菌悬液，直到A、B、C、D系试验平行组各组水体哈维弧菌含量为104cfu/L，持续供氧，维持试验水体溶氧含量全程不低于7mg/L。完成上述试验操作，即视为定量带菌小水体环境模型构建成功。
其中，以距离上层水面20公分的容积区域定义为水环境上层，以水族箱水位中线为界面向上与向下等量扩展共20公分的容积区域定义为水环境中层，以底层水面向上20公分的容积区域定义为水环境下层。
2.3单用本发明复合植物提取物对带菌水环境不同深度的抑菌效果测试
在25-28℃环境温度下，选择A、B、C系试验平行组，造模成功后，通过箱壁固定的方式，在水族箱水环境上层、中层和下层装引水管，静置2h，向A系试验平行组加入本发明复合植物提取物直至终浓度为0.125ppm，B系试验平行组加入聚维酮碘直至终浓度为2ppm，C系试验平行组不加入任何物质，设为空白对照组。
分别于1h、2h、4h、8h、16h、32h、64h，通过引水管从各个平行组抽取水环境上层、中层和下层水样1ml，其中水环境上层水样1ml视为一个水样，1个水样稀释2-4倍，从1个水样2倍稀释液中取100μL滴加并涂布到一个TCBS琼脂培养上，静置5min，每个水样做3个平行，所有涂布水样的平皿置于35℃培养箱中培养20-24h，观察并记录平皿上哈维弧菌的菌落数量。
菌落计数结果判断标准如下：计数时应选取菌落数在30-300之间的平板，若有两个稀释度均在30-300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取其较小数字，公式如下：
每个原始水样的含菌浓度＝稀释倍数×该稀释倍数下对应平皿的菌落计数；
若菌落数低于30，则据实统计记录。
2.4本发明复合植物提取物联用活性物质对带菌水环境不同深度的抑菌效果测试
在25-28℃环境温度下，选择A、C、D系试验平行组，其中A和C组与试验2.3共享试验组，造模成功后，通过箱壁固定的方式，在水族箱水环境上层、中层和下层装引水管，静置2h，向A系试验平行组加入本发明复合植物提取物直至终浓度为0.125ml/L，D系试验平行组加入本发明复合植物提取物与高分子阴离子聚合物，复配浓度为0.125mg/L和0.2mg/L，C系试验平行组不加入任何物质，设为空白对照组。
分别于1h、2h、4h、8h、16h、32h、64h，通过引水管从各个平行组抽取水环境上层、中层和下层水样1ml，其中水环境上层水样1ml视为一个水样，1个水样稀释2-4倍，从1个水样2倍稀释液中取100μL滴加并涂布到一个平皿上，静置5min，每个水样做3个平行，所有涂布水样的平皿置于35℃培养箱中培养20-24h，观察并记录平皿上迟缓爱德华氏菌的菌落数量。
菌落计数结果判断标准如下：计数时应选取菌落数在30-300之间的平板，若有二个稀释度均在30-300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取其较小数字，公式如下：
每个原始水样的含菌浓度＝稀释倍数X该稀释倍数下对应平皿的菌落计数；
若菌落数低于30，则据实统计记录。
3、试验结果
3.1单用本发明复合植物提取物对带菌水环境不同深度的抑菌效果
如表4，带菌水环境造模成功后，不添加任何消毒剂的C系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中哈维弧菌含量都保持增长，而且不同时间点，上层、中层和下层水体中的含量数量都比较接近。与空白对照组相比，添加了二氧化氯的B系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中哈维弧菌含量都呈明显下降，而且不同水层水体中哈维弧菌的含量都比较接近，说明0.5mg/L的二氧化氯对水体的哈维弧菌有较好的抑制作用，但随着时间的持续，二氧化氯对哈维弧菌的抑制效果却在减弱，且从添加了二氧化氯的32-64h期间，水环境上层、中层和下层水体的哈维弧菌出现相较于前16h时的含量有一定的上升。添加了本发明复合提取物的B系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中哈维弧菌含量呈极明显的下降；其中1-16h阶段，本发明复合提取物使用后，对上层水体的哈维弧菌具有完全抑制效果，而对中层和下层水体的哈维弧菌也具有良好的抑制效果，其效果明显优于添加了二氧化氯的B系试验组；32-64h阶段，水环境上层、中层和下层水体的哈维弧菌出现相较于前16h时的含量也仅是轻微上升。
综上所述，本发明复合提取物对水环境不同深度水体哈维弧菌具有明显的抑制作用，也远优于以高于32倍浓度本发明复合提取物的二氧化氯试验组，在使用后的1-64h内，本发明对上层和中层水体哈维弧菌的抑制效果仍然明显估于空白对照组和二氧化氯处理组。
表4
Figure BDA0003305915790000151
3.2发明复合植物提取物联用活性物质对带菌水环境不同深度的抑菌效果
如下表5，带菌水环境造模成功后，不添加任何消毒剂的C系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中哈维弧菌含量都保持增长，而且不同时间点，上层、中层和下层水体中的含量数量都比较接近。与空白对照组相比，添加了本发明复合提取物复配絮凝剂的D系试验组，其水体不同时间点水环境上层、中层水体中哈维弧菌含量呈极明显的下降；其中1-16h阶段，本发明复合提取物使用后，对上层水体的哈维弧菌具有100％抑制效果，而对中层和下层水体的哈维弧菌达到99％以上的抑制效果；当本发明复合提取物与絮凝剂联用，两种成分对哈维弧菌具有更好的联用增效抑菌效果(采样点1h除外)，当絮凝剂完全沉降至底部时，4-16h阶段，本发明复合提取物与絮凝剂联用对上层、中导和下层水哈维弧菌的具有100％抑制作用；32-64h阶段，水环境上层、中层和下层水体的哈维弧菌出现相较于前16h时的含量也仅是极略微上升。相较于添加了本发明复合提取物的B系试验组，絮凝剂的复配联用，可增强本发明复合物对上层和中层水体哈维弧菌的完全抑制作用，对下层水体哈维弧菌也具有显著的抑制作用(1h采样点除外)。
综上所述，本发明复合提取物对水环境不同深度水体哈维弧菌具有明显的抑制作用，与絮凝剂复配联用，可以增强本发明复合提取物对中层和下层水体哈维弧菌的完全抑制效果及持续抑制的时间。
表5
Figure BDA0003305915790000161
4、试验小结
(2)本发明复合提取物对水环境不同深度水体哈维弧菌具有明显的抑制作用。
(3)本发明复合提取物与絮凝剂复配联用，可以增强本发明复合提取物对上层、中层和下层(1h取样点除外)水体哈维弧菌的100％抑制效果及较长的有效抑制时间。
(4)本发明复合提取物与絮凝剂复配联用，1h取样点的显示水体中的哈维弧菌受到抑制，但并未受到完全抑制，主要是由于絮凝剂自上而下的絮凝沉降是一个缓慢过程所致。
实验例4本发明复合植物提取物对哈维弧菌源性红脚的修复作用
1、试验材料
1.1、试验菌种
哈维弧菌：均由本课题组保存提供。
1.2、试验耗材
TCBS肉汤培养基、TCBS琼脂培养基、培养皿、试管、蒸馏水等若干。
二氧化氯：为含量8％的泡腾颗粒商品。
试验南美白对照：规格为200±12支/斤，表观无任何可见的异常病理症状，同批虾群3％比例白虾随机抽检解剖，肝胰腺哈维弧菌携带为阴性，肝肠胞虫、白斑病毒等常见病原的携带也均为阴性。
1.3、复合提取物的制备
本实验所用的本发明所述复合提取物，其制备方法同实施例1。
2、试验方法
2.1、菌株的扩培
从种子批斜面上挑取哈维弧菌菌落接种于TCBS肉汤培养基中，28℃摇床培养20-24h，离心收集菌体，通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法，用PBS将菌体稀释至3x1010cfu/mL的菌悬液，作为母液。
2.2、试验白虾体外浸泡感染模型的构建
试验第1天，从准备用于本次试验的白虾中随机捞取600支，经检测甲壳、脚部、触须等无任何肉眼可见的异常病理症状，视为符合本次感染模型构建的试验白虾的使用要求。将600支试验白虾随机平均分配到12个预装300L暴氯24h的自来水的水族箱中，每个水族箱放入白虾50支，这12个水族箱分别命名A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3，静养12-18h，依次向9个水族箱加入哈维弧菌母液，直至各个水族箱中哈维弧菌的终含量为3x104cfu/L，36-48h期间，观察各水族箱白虾脚部出现红脚的数量，若各水族箱中白虾红脚的数量的虾体支数比例大于10％，且各水族箱中白虾红脚的数量不低于2只，视为体外浸泡感染模型构建成功。
试验期间持续加氧保持各水族箱水体温度为26-28℃，水体溶氧含量不低于7mg/L，不投饲料。其中A1、A2、A3设置为A系试验平行组，B1、B2、B3设置为B系试验平行组，C1、C2、C3设置为C系试验平行组，D1、D2、D3设置为D系试验平行组。
2.3、复合提取物对白虾体外感染造成的红脚的修复作用
试验第48h起，按0.125ml/L、0.25ml/L的终浓度依次向A系(A1、A2、A3)、B系(B1、B2、B3)、加入本发明复合提取物，按0.5mg/L终浓度依次向C系(C1、C2、C3)加入二氧化氯，D系(D1、D2、D3)设置为空白对照组，其对应的水族箱不加入任何消毒剂。各试验组和空白对照组保持12h不换水，随后将各个水族箱中的水全部换为加氧暴氯24h的等温自来水，48h观察白虾红脚是否消失或感染性扩散，以此来判断复合提取物对白虾体外感染造成的红脚的修复作用，其效果判断标准如下：
红脚修复：以单支出现红脚的白虾计，当单支白虾的红脚症状病灶部症状全部消失，若出现在消毒剂处理组，则视为本组添加的物质具有修复白虾哈维弧菌性红脚的修复作用；若出现在空白组，则视为白虾的自愈作用。
Figure BDA0003305915790000171
Figure BDA0003305915790000172
注1：上述公式中，x代表A系、B系、C系；修复数代表该组白虾红脚修复的总数量；初始红脚数代表对照组造模成功时统计的该组出现红脚的总数。
注2：每支试验白虾计入红脚的数量均为6只。
3、试验结果
3.1、试验白虾外浸泡感染模型的构建结果
如下表6，各组试验白虾出现红脚的比例分别为31.3％、28％、27.3％、27.3％和26％，且各出现红脚的试验白虾其红脚病灶数量均大于2处。由此可见，本次试验白虾体外浸泡感染模型构建成功，可以作为下一步评估不同物质对红脚修复作用的病理模型。
表6
Figure BDA0003305915790000181
3.2、各组白虾体外感染造成的红脚的修复结果
如下表7，相同试验条件下，自造模成功后，48h后观察发现：空白对照组没有使用任何消毒剂，出现红脚的试验白虾红脚病灶症状没有消失，而且呈扩散性感染的趋势；浸泡于0.5mg/L二氧化氯的试验白虾，出现红脚的试验白虾红脚病灶症状消失的有75.8％出现修复；浸泡于0.125ml/L复合提取物的试验白虾，出现红脚的试验白虾红脚病灶症状消失的有88.8％出现修复；浸泡于0.25ml/L复合提取物的试验白虾，出现红脚的试验白虾红脚病灶症状消失的有100％出现修复；浸泡于0.125ml/L复合提取物复配0.25mg/L二氧化氯的试验白虾，出现红脚的试验白虾红脚病灶症状消失的有100％出现修复。
综上所述，与空白组和0.5mg/L二氧化氯浸泡组相比，使用本发明复合提取物对体外感染哈维弧菌导致的对虾红脚具有明显的修复效果优势。以使用剂量0.125ml/L对红脚修复率88.8％计，按1亩每米水深，使用83毫升本发明复合提取物即可达到88.8％红脚修复率的效果；而以使用剂量0.25ml/L对红脚修复率100％计，按1亩每米水深，使用167毫升本发明复合提取物即可达到100％红脚修复率的效果；同时当二氧化氯使用浓度降低且与本发明复合提取物联用时，本发明对低浓度二氧化氯抑制哈维弧菌具有增效作用。
表7
Figure BDA0003305915790000191
注：*代表虾体自愈率。
4、试验小结
(1)与空白组和2ppm过硫酸氢钾浸泡组相比，使用本发明复合提取物对体外感染哈维弧菌导致的白虾红脚具有极其明显的修复效果优势。
(2)使用剂量为0.125ppm的本发明复合提取物对哈维弧菌体外感染引发红脚的修复率为94.4％。
(3)使用剂量为0.25ppm的本发明复合提取物对哈维弧菌体外感染引发红脚修复率为100％。
(4)本发明复合提取物对二氧化氯抑制哈维弧菌具有联用增效作用。
实验例5本发明复合植物提取物对水产动物的安全性评估
1、试验材料与方法
1.1、复合植物提取物的制备
本实验所用的本发明所述复合植物提取物，其制备方法同实施例1。
1.2、试验动物
南美白对虾(简称白虾)、金刚虾和草虾：苗种市场直接购买。
1.3、试验对虾的暂养与分组
选择健康白虾600支，分成6个组，每个组100支，每个组下设两个平行组，每个平行组50支，分别随机命名为A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2、F1、F2。
选择健康金刚虾600支，分成6个组，每个组100支，每个组下设两个平行组，每个平行组50支，分别随机命名为H1、H2、J1、J2、K1、K2、L1、L2、M1、M2、N1、N2。
选择健康草虾600支，分成6个组，每个组100支，每个组下设两个平行组，每个平行组50支，分别随机命名为P1、P2、Q1、Q2、R1、R2、S1、S2、T1、T2、V1、V2。
1.4、复合提取物梯度浓度的配制与安全性评估
取本发明复合提取物，按0、0.625ml/L、1.25ml/L、2.5ml/L、5ml/L、10ml/L的终浓度要求，分别评估其48h内对对虾的浸泡安全性，，其对应的试验组分配如下表8。
表8
Figure BDA0003305915790000201
在0、12h、24h三个时间维度下，分别评估终浓度为0、0.625ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm的试验水体中，各个试验组试验对虾的存活情况，并通过以下公式评估复合提取物对不同试验对虾的安全性。
Figure BDA0003305915790000202
1.5、其他耗材
蒸馏水若干，量杯适量。
2、试验结果
如下表9，不同时间点的安全性评估结果表明，本发明复合提取物使用浓度≤10mg/L时，48h的持续浸泡，本发明复合提取物对白虾、金刚虾和草虾具有极高的安全性。
表9
Figure BDA0003305915790000211
3、试验小结
(1)本发明复合提取物对白虾、金刚虾和草虾的安全浓度为≤10mg/L。
(2)本发明复合提取物使用终浓度为10mg/L时，其对白虾、金刚虾和草虾都具有极高的安全性。
综合试验例1-5试验结果可知，本发明复合提取物在合适的使用剂量下，对高盐度养殖水体中哈维弧菌异常繁殖具有良好的抑制作用，且对该菌感染白虾引发红脚也具有良好的修复治疗作用，复配具有沉降作用的絮凝剂联合使用时，本发明复合提取物对上层、中层和下层高盐度水体中哈维弧菌具有增效抑制作用。

Claims (7)

1.一种用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，其特征在于，以重量百分比计，包括40-55%山石斛提取物、10-22%箴兰提取物、30-45%莪术提取物；
所述山石斛提取物为山石斛的浓缩提取物，所述箴兰提取物为经过预处理的箴兰再经发酵和超滤浓缩的获得物，所述莪术提取物为莪术根部经过预处理、发酵和超滤浓缩获得的物质；
所述山石斛提取物通过包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将山石斛鲜摘全草冲洗干净去杂，榨汁机搅碎滤渣取汁，分别获得山石斛初提汁和山石斛滤渣；
S2、将山石斛初提汁在40-45℃下加热将其体积浓缩至原来的1/3至1/2，超声波处理4-6分钟，获得山石斛初提汁预处理物；将山石斛滤渣与浓度为1M的氢氧化钠溶液和蒸馏水按质量体积比的（9-10）：1：（40-50）充分混合，35-40℃下静置24-36h，使用稀盐酸将pH值中和至7.0-7.2，接着将其置于40-45℃下加热将其体积浓缩至原来的1/3至1/2，获得山石斛滤渣预处理物；
S3、按质量体积比，将山石斛初提汁预处理物和山石斛滤渣预处理物按1：（2-4）混合，接着加入蒸馏水100-150体积份和纤维素酶2500-3500IU，装入35-40℃可调温的密闭发酵容器中，加入芽孢菌液态培养基3-8体积份，加入含量为（2.5-5.8）╳108cfu/g的芽孢菌10-30g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为6.2-7.2时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的10%-30%，所获得复合物即为所述山石斛浓缩提取物；
所述箴兰提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将鲜摘箴兰冲洗干净去杂，搅拌机搅碎成泥，按质量体积比与0.5M稀盐酸溶液按1：（1-1.5）进行充分混合，25-30℃环境中静置处理12-16h，利用2-3M氢氧化钠溶液将pH值调到7.0-7.2之间，获得箴兰预处理物；
S2、接着按质量体积比，将箴兰预处理物与1-2M的氯化钠以1：（3-4）进行预混合，并置于90-105℃进行热处理20-30分钟，冷却后获得箴兰预处理热炙物；将箴兰预处理热炙物与芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为6.2-7.2得到培养物，25-28℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的15%-30%，获得浓缩液即为所述的箴兰提取物；
所述莪术提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将经过预处理的莪术去杂除尘，按质量体积比计，与氯化钠按1：（1-1.5）混合均匀，再经90-105℃进行热处理10-15分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出莪术获得莪术热炙处理物；
S2、再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得莪术脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得莪术粉碎物；
S3、将莪术粉碎物：蒸馏水：芽孢液态培养基和芽孢菌混合，35-40℃密闭培养至OD值为6.0-7.5得到培养物，25-28℃条件下，过滤收集培养物，3000-5000rpm离心20-30min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，800-1200rpm离心5-10min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的20%-25%，获得浓缩液即为所述的莪术提取物；
所述芽孢菌为纳豆芽孢杆菌分离株。
2.根据权利要求1所述的用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，其特征在于，以重量百分比计，包括45-52%山石斛提取物、12-20%箴兰提取物、35-42%莪术提取物。
3.根据权利要求1所述的用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，其特征在于，箴兰提取物制备步骤S2所述箴兰预处理热炙物：蒸馏水：芽孢菌液态培养基的重量体积比为1：（8-15）：（1-1.8），芽孢菌的加入量为每质量份箴兰预处理热炙物加入含量为（3-8）╳106cfu/g的菌粉10-30g。
4.根据权利要求1所述的用于抑制高盐度水环境哈维弧菌的复合植物提取物，其特征在于，无搅拌式超滤浓缩的技术参数如下：环境温度25-30℃条件下，操作压力为0.3～0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50～100L/m2·h为宜。
5.权利要求1-4中任一项所述复合植物提取物的制备方法，其特征在于，在25-40℃环境下，将各组分混合，常规超声波乳化均匀即可，所获得的混合液为所述复合提取物。
6.权利要求1至4任一项所述复合植物提取物的应用，其特征在于，所述复合植物提取物用于抑制高盐度养殖水体上层、中层和底层的哈维弧菌的异常繁殖。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述复合植物提取物与二氧化氯商品联合使用。
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