CN105648024A - 一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，包括：1）对虾肌肉提取液的制备；2）血细胞培养基的配制；3）对虾血细胞原代培养；4）中草药有效成分的萃取；5）存活率、吞噬活性、抗菌及溶菌活性的测定。本发明在对虾血细胞原代培养体系中添加多种中草药提取物的组合，能够快速筛选出增强免疫效果较好的组合。本方法具有快速，高效，准确，稳定等优点，并且采用细胞培养，相较于传统的养殖模式，检测成本更低。

Description

一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法
技术领域
本发明涉及一种复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，具体涉及一种利用对虾血细胞原代培养进行中草药免疫增强剂组合的快速筛选方法，属于水产养殖和生物筛选技术领域。
背景技术
近年来由于种质资源退化和养殖环境恶化，对虾病害爆发频繁，严重制约着对虾养殖业的发展。预防和治理病害的传统方法是使用抗生素，然而抗生素的广泛使用会导致药物残留、菌株耐药性的产生以及环境污染等问题，最终危及人类自身的健康。因此许多学者研究抗生素的替代物。中草药作为绿色天然药物，具有毒副作用小、多功效、不易诱发病原菌耐药性、低污染、价格低廉、资源丰富等优势，在水产无公害养殖病害防治中具有广阔的应用前景。
目前有关中草药免疫增强剂在生产上往往多种中草药配伍使用。而复合中草药的使用存在添加量大、有效成分含量使用不明、作用机理不清的问题。此外，复合中草药的筛选传统方法是采用养殖实验，实验周期长，易受外界因素影响，无法在短时间内筛选出合适的复方中草药免疫增强剂。并且传统重复筛选方法耗费大量的时间、人力、物力以及财力。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法。该方法能够快速和高效的筛选不同组合的中草药免疫增强剂，以克服现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：
一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，其特征在于，该方法包括首先制备对虾肌肉提取液和血细胞培养基，然后分离对虾血细胞并进行原代培养，同时提取中草药活性成分，再将中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中对血细胞进一步培养，最后测定免疫相关指标。
所述对虾肌肉提取液的制备方法为：幼虾经暂养后，取腹部肌肉加入平衡盐进行匀浆，匀浆后再加入平衡盐溶液进行离心，取上清再次离心，上清液经微孔滤膜过滤后即为制备好的对虾肌肉提取液。
所述对虾血细胞培养基组成为：基础培养基为2×Leibovitz’sL-15，添加质量分数为20%的胎牛血清和20%的所述对虾肌肉提取液，以及添加青霉素钠使其在培养基体系终浓度为100IU·mL-1、添加硫酸链霉素钠使其在培养基体系终浓度为100μg·mL-1和添加两性霉素B使其在培养基体系终浓度为100μg·mL-1。
所述提取对虾血细胞并进行原代培养的具体操作为：首先以海水洗净对虾体表，之后用含有青霉素和链霉素且经过高温消毒的无菌海水暂养1-2d；对对虾体表进行消毒，然后利用吸入抗凝剂的无菌注射器按照抗凝剂：血淋巴体积比为1:1于对虾头胸甲后缘处心脏取血，得到抗凝血样品后进行离心，弃上清得到对虾血细胞，用上述制得的培养基调节血细胞密度并进行接种。
所述中草药选取为黄芪、杜仲、黄连和大黄。
所述中草药活性成分提取操作为：将中草药均匀粉碎后，与无水乙醇按照质量体积比为1:10的比例混匀，70℃回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇即得中草药活性成分。
所述的免疫相关指标为血细胞存活率、血细胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。
所述中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中的添加量为：每毫升培养基中添加黄芪多糖5-30mg、绿原酸3-30mg、小檗碱5-30mg、大黄蒽醌提取物5-30mg。
所述平衡盐组成为：NaCl18.0g·L-1、KCl0.7g·L-1、NaHCO30.5g·L-1、KH2PO40.54g·L-1，调节pH为7.2。
所述的抗凝剂组成为：NaCl26.325g·L-1、KCl0.745g·L-1、EDTA-2Na3.7224g·L-1、HEPES2.383，调节pH为7.0，渗透压为750mOsmkg-1。
本发明的优点和有益效果：本发明利用对虾血细胞原代培养，在培养基中添加多种组合的中草药提取物，培养24h即可以通过测定免疫相关指标，快速筛选出增强免疫效果较好的组合。本方法具有快速，高效，准确，稳定等优点，并且采用血细胞原代培养，相较于传统的养殖模式，检测成本更低。本发明能够快速、精确的筛选出具有免疫增强作用较好的中草药组合。
附图说明
图1实施例中对照组和试验组关于血细胞存活率的结果图。
图2实施例中对照组和试验组关于血细胞吞噬活性的结果图。
图3实施例中对照组和试验组关于抗菌活性的结果图。
图4实施例中对照组和试验组关于溶菌活性的结果图。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。但是本发明的保护范围并不限于该实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例：
本实施例选用凡纳滨对虾作为试验对象，凡纳滨对虾是目前国内对虾养殖的主要品种。并选取了黄芪、黄连、杜仲和大黄四种中草药进行组合，作为快速筛选的免疫增强剂。
实验所用凡纳滨对虾购自青岛市崂山对虾养殖场，虾生物体长为8.0±0.5cm，体色正常，健康活泼。暂养于40cm×50cm×60cm水槽中7天，海水盐度为32，温度为19±0.5℃，pH为8.1，连续充气，日换水两次，每次换水量为1/3-1/2，并投喂对虾配合饲料。
一种对虾用中草药免疫增强剂的快速筛选方法，包括以下步骤：
（1）制备对虾肌肉提取液
幼虾经暂养后，取腹部肌肉5g，加入5mL平衡盐，1500r匀浆2min。再加入15mL平衡盐溶液，10000g离心30min。取上清，16000g离心30min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，-20℃保存。
（2）制备血细胞培养基
基础培养基为2×Leibovitz’sL-15，添加质量分数为20%的胎牛血清和20%的凡纳滨对虾肌肉提取液，以及添加青霉素钠使其在培养基体系终浓度为100IU·mL-1、添加硫酸链霉素钠使其在培养基体系终浓度为100μg·mL-1和添加两性霉素B使其在培养基体系终浓度为100μg·mL-1，并用质量分数为2.5%的HCl和7.5%的NaHCO3调节pH到7.0。
（3）凡纳滨对虾血细胞分离及其原代培养
选取活力好的凡纳滨对虾，以洁净海水洗净对虾体表，用含有1000μg·mL-1青霉素、1000μg·mL-1链霉素且经过高温消毒的无菌海水暂养1-2d。取20尾凡纳滨对虾，实验前先用75％的酒精棉球消毒对虾体表，然后在超净工作台内用预先吸入已消毒的预冷抗凝剂的无菌注射器，按抗凝剂：血淋巴为1:1的体积比于头胸甲后缘处心脏取血，混合于离心管中，取抗凝血样品，4℃、300g离心10min，弃上清，用培养基调节血细胞密度106cell/mL，并接种于5mL圆底离心管，每管200μL。
（4）中草药活性成分的提取
将黄芪、黄连、杜仲和大黄四种中草药分别均匀粉碎后，与无水乙醇按照1:10的质量体积比例混匀，70℃回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇制备成有效成分提取物。采用该方法黄芪制得的主要提取物为黄芪多糖，杜仲为绿原酸，黄连为小檗碱，大黄为大黄蒽醌类。中草药有效成分的含量可以按照现有文献所提供的方法进行测定。黄芪多糖含量的测定方法参照：山东产黄芪中黄芪多糖和黄芪甲苷的含量测定，山东中医药大学学报，2008年5月第32卷第3期；绿原酸含量的测定方法参照：高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸的含量，ChineseJournalofInformationonTCM,2006,13(1)；小檗碱含量的测定方法参照：萸连巴布膏中盐酸巴马汀和小檗碱的药动学研究，中国实验方剂学杂志，2011年3月第17卷第5期；大黄蒽醌提取物含量的测定方法参照：保肝灵颗粒剂中4种大黄蒽醌类成分的大鼠药动学研究。中成药。2013年6月，第35卷，第6期。
（5）中草药配伍的筛选
实验设置为3个组，每组设3个重复。分别为：对照组添加超纯水，试验1组每毫升培养基中添加黄芪多糖8mg、绿原酸3mg、大黄蒽醌提取物7mg，试验2组每毫升培养基中添加黄芪多糖11mg、绿原酸5mg、小檗碱15mg。各试验组于CO2培养箱中25℃密闭培养。培养过程中在第6h、12h、24h进行取样，为后续的指标测定作准备。
（6）指标测定
血细胞存活率的测定方法按照现有文献的方法操作，参照：HPCviabilitymeasurement:trypanblueversusacridineorangeandpropidiumiodide.Transfusion40(6),693–696。吞噬活性的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：Immuneresponsesandexpressionofimmune-relatedgenesinswimmingcrabPortunustrituberculatusexposedtoelevatedambientammonia-Nstress.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA。抗菌活力、溶菌活力的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：Insectimmunity.PurificationandpropertiesofthreeinduciblebactericidalproteinsfromhemolymphofimmunizedpupaeofHyalophoracecropia.EuropeanJournalofBiochemistry。
结果分析：
（1）血细胞存活率
由图1可见：血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，各试验组血细胞存活率与对照组无显著差异，且存活率都大于85%以上。孵育24h内，各试验组血细胞存活率无明显变化。
（2）血细胞吞噬活性
由图2可见：血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，试验组血细胞吞噬活性均显著高于对照组（P<0.05），而每次测定对照组无显著差异。两试验组中血细胞吞噬活性逐渐增高，于24h达到最高值，且试验2组中血细胞吞噬活性显著高于试验1组（P<0.05）。
（3）抗菌活性
由图3可见：血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，试验组抗菌活性均显著高于对照组（P<0.05），而每次测定对照组无显著差异。各试验组中抗菌活性于12h达到最高值，并保持稳定至24h。试验2组中抗菌活性显著高于试验1组（P<0.05）。
（4）溶菌活性
由图4可见：血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，试验组溶菌活性均显著高于对照组（P<0.05），而每次测定对照组无显著差异。各试验组中溶菌活性于12h达到最高值，且试验2组中溶菌活性显著高于试验1组（P<0.05）。
由实验结果可知，试验2组的免疫增强作用高于试验1组，即在24h内，就可以通过免疫相关指标测定，对中草药提取物组合是否能够增强免疫效力有非常明确和直观的判断。说明本方法建立的复方中草药免疫增强剂筛选方法，在24h内能准确筛选出具有较强免疫增强作用的中草药组合，是一种快速、高效、稳定的筛选技术。

Claims (10)

1.一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，其特征在于，该方法包括首先制备对虾肌肉提取液和血细胞培养基，然后分离对虾血细胞并进行原代培养，同时提取中草药活性成分，再将中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中进一步培养，最后测定免疫相关指标。
2.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述对虾肌肉提取液的制备方法为：幼虾经暂养后，取腹部肌肉加入平衡盐进行匀浆，匀浆后再加入平衡盐溶液进行离心，取上清再次离心，上清液经微孔滤膜过滤后即为制备好的对虾肌肉提取液。
3.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述对虾血细胞培养基组成为：基础培养基为2×Leibovitz’sL-15，其中添加质量分数为20%的胎牛血清和20%的所述对虾肌肉提取液，以及青霉素钠、硫酸链霉素钠和两性霉素B。
4.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述分离对虾血细胞并进行原代培养的具体操作为：首先以海水洗净对虾体表，之后用含有青霉素和链霉素双抗的经过高温消毒的无菌海水暂养1-2d；对对虾体表进行消毒，然后利用吸入抗凝剂的无菌注射器按照抗凝剂：血淋巴体积比为1:1的比例于对虾头胸甲后缘处心脏取血，得到取抗凝血样品后进行离心，弃上清得到对虾血细胞，用上述制得的培养基调节血细胞密度并进行接种。
5.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药选取为黄芪、杜仲、黄连和大黄。
6.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药活性成分提取操作为：将中草药均匀粉碎后，与无水乙醇按照质量体积比为1:10的比例混匀，70℃回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇即得中草药活性成分。
7.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述的免疫相关指标为血细胞存活率、血细胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。
8.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中的添加量为每毫升培养基中添加黄芪多糖5-30mg、绿原酸3-30mg、小檗碱5-30mg、大黄蒽醌提取物5-30mg。
9.如权利要求2所述的快速筛选方法，其特征在于，所述平衡盐组成为：NaCl18.0g·L-1、KCl0.7g·L-1、NaHCO30.5g·L-1、KH2PO40.54g·L-1。
10.如权利要求4所述的快速筛选方法，其特征在于，所述的抗凝剂组成为：NaCl26.325g·L-1、KCl0.745g·L-1、EDTA-2Na3.7224g·L-1、HEPES2.383·L-1。
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Application publication date: 20160608

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