CN105661105A - 一种用于对虾的复方中草药免疫增强剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于对虾的复方中草药免疫增强剂，它包含如下质量比的中草药活性成分：黄芪多糖20%-50%、绿原酸20%-50%、小檗碱20%-50%。该增强剂生产应用后可以替代抗生素和化学药物的使用，显著增强对虾的免疫力及疾病抵抗能力。本发明提取黄芪、杜仲、黄连三种中草药活性成分应用于饲料中，避免了多种药物产生的不良效应；本发明制备简单，成本较低，能够提高对虾养殖业的经济效益。

Description

一种用于对虾的复方中草药免疫增强剂

技术领域

本发明涉及一种水产动物养殖用的免疫增强剂，具体涉及一种用于对虾的复方中草药免疫增强剂，属于水产养殖领域。

背景技术

近年来对虾养殖业快速发展，根据FAO报道，2012年对虾养殖产量约占世界渔业养殖产量的12.8%，在水产养殖业中占据举足轻重的地位。但是由于种质资源退化和养殖环境恶化，对虾养殖病害爆发频繁，严重制约着对虾养殖业的进一步发展。传统防治对虾病害的方法是使用抗生素，然而抗生素的滥用会导致严重的药物残留、耐药性菌株的产生以及环境污染等问题。因此寻找抗生素的替代品已成为各国研究的热点。

中草药作为绿色天然药物，具有毒副作用小、多功效、不易诱发病原菌耐药性、低污染、价格低廉、资源丰富等优势，在水产无公害养殖病害防治中具有广阔的应用前景。目前有关中草药免疫增强剂的研究多为单一中草药，效果不理想，且易使单味中草药用量过大，产生不利影响。中国专利CN1215777C，一种对虾用复方中草药免疫增强剂，采用黄芪、党参、当归、白术、茯苓和甘草进行配伍研究，制得了免疫效果不错的复方中草药制剂；专利号CN103766620A，一种凡纳滨对虾复方中草药免疫增强剂由杜仲、黄芪、金银花、柴胡、虎杖、黄柏、甘草、淫羊藿、五味子、党参组成，提高了对虾生长速度和虾体耐低氧能力，并降低了溶藻弧菌攻毒后的虾体死亡率。可见，中草药复方制剂能够带来良好的免疫效果，但上述的复方制剂中草药种类过于繁多，过犹不及，导致了药物添加量大、有效成分含量使用不明、作用机理不清等的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种适用于对虾的复方中草药免疫增强剂，该制剂针对性的选用三种中草药，提取有效成分，添加到饲料中，增强对虾自身免疫力，提高对虾疾病抵抗力，以弥补现有技术的不足。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

一种用于对虾的复方中草药免疫增强剂，其特征在于，以质量分数计，它包括黄芪多糖20%-50%、绿原酸20%-50%和小檗碱20%-50%。

优选的，所述的复方中草药免疫增强剂中，黄芪多糖：绿原酸：小檗碱的质量比为2：2：1。

优选的，所述的复方中草药免疫增强剂中，黄芪多糖：绿原酸：小檗碱的质量比为1：1：1。

所述的黄芪多糖提取自黄芪，所述的绿原酸提取自杜仲，所述的小檗碱提取自黄连；提取方法（以黄芪为例）为：将黄芪均匀粉碎后，过80目筛，与无水乙醇按照质量体积比为1:10混匀，70℃回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇制备即得黄芪多糖；绿原酸和小檗碱制备同黄芪多糖制备方法。

所述的复方中草药免疫增强剂能够在对虾养殖领域中进行应用，替代传统的抗生素防治对虾病害，显著提高对虾免疫力，应用于对虾养殖病害防治。

本发明的优点和有益效果：

（1）提高了对虾血细胞数量。血细胞数量的高低直接反应出非特异性免疫的强弱。在投喂中草药免疫增强剂的6天内，试验组对虾血细胞数量均显著高于对照组（P<0.05），而投喂6天内对照组无显著差异。

（2）提高了对虾血细胞吞噬活性。血细胞吞噬活性是评价对虾细胞免疫的重要指标，其吞噬能力的高低可直接反映出对虾非特异性免疫能力的大小。在投喂中草药免疫增强剂的6天内，试验组对虾血细胞吞噬活性均显著高于对照组（P<0.05），而投喂6天内对照组无显著差异。

（3）提高了对虾抗菌及溶菌活性。抗菌及溶菌活性是评价对虾体液免疫的重要指标。在投喂中草药免疫增强剂的6天内，试验组对虾抗菌及溶菌活性均显著高于对照组（P<0.05），而投喂6天内对照组无显著差异。

（4）攻毒试验结果表明，试验1组24h免疫保护力为63.5%，48h免疫保护力为55.3%；试验2组24h免疫保护力为77.6%，48h免疫保护力为72.9%。说明了添加本制剂能显著提高凡纳滨对虾对哈维氏弧菌的免疫保护力，且随着添加量的增加，保护力增强。

试验证明了本发明所提供的免疫增强剂能够明显增强对虾的免疫力，提高对虾疾病抵抗力；该增强剂选用黄芪、杜仲、黄连三种中药科学配伍，提取出活性成分应用于饲料中，避免了多种药物产生的不良效应；可以替代抗生素和化学药物的使用，避免了抗生素滥用，为对虾的病害防治和免疫增强剂的开发开辟一条新途径；本发明制备简单，成本较低，能够提高对虾养殖业的经济效益。

附图说明

图1为实施例2中对虾血细胞数量的结果图。

图2为实施例2中对虾血细胞吞噬活性的结果图。

图3为实施例2中对虾血清抗菌活性的结果图。

图4为实施例2中对虾血清溶菌活性的结果图。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1：

复方中草药免疫增强剂及养殖饲料的制备

首先制备中草药活性成分，分别将黄芪、杜仲和黄连均匀粉碎后，与无水乙醇按照1:10的质量体积比混匀，70℃回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇制备成有效成分提取物，即分别制得黄芪多糖、绿原酸和小檗碱。将所得的中草药提取物溶于水后均匀喷洒在基础饲料表面，再利用鱼油包裹饲料，晾干即得到添加有免疫增强剂的基础饲料。

按照上述的制备方法分别制备两种不同浓度的增强剂及相应的养殖饲料。以质量分数计，一种免疫增强剂包括每千克饲料添加黄芪多糖1g、绿原酸1g和小檗碱0.5g；另一种免疫增强剂包括每千克饲料添加黄芪多糖1g、绿原酸1g和小檗碱1g。

上述中草药有效成分的含量可以按照现有文献所提供的方法进行测定。黄芪多糖含量的测定方法参照：山东产黄芪中黄芪多糖和黄芪甲苷的含量测定，山东中医药大学学报，2008年5月第32卷第3期；绿原酸含量的测定方法参照：高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸的含量，ChineseJournalofInformationonTCM,2006,13(1)；小檗碱含量的测定方法参照：萸连巴布膏中盐酸巴马汀和小檗碱的药动学研究，中国实验方剂学杂志，2011年3月第17卷第5期。

实施例2：

复方中草药免疫增强剂对凡纳滨对虾非特异性免疫力的影响

本试验中，发明人将实施例1制备的两种含有中草药免疫增强剂的饲料饲喂凡纳滨对虾，通过分析凡纳滨对虾的非特异性免疫指标，研究本发明对提高凡纳滨对虾免疫力的效果。

1材料与方法

1.1材料

试验用凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）购于青岛市崂山区沙子口对虾养殖厂，体重15.7±2.3g，生物学体长10.8±1.2cm，将凡纳滨对虾饲养于50cm×60cm×40cm的塑料水箱内，每箱随机放养60尾虾。养殖条件为：水温22.9±0.5℃，盐度为34，pH8.0±0.3，日换水2次，日换水量为1/2，连续充气。暂养期间投喂对虾基础饲料。

试验用基础饲料的成分为：以质量分数计，鱼粉34%、豆粕20%、花生粕16.4%、小麦粉22%、大豆磷脂5%、多种维生素0.6%、复合矿物质2%。经实验计算饲料中营养成分为：以质量分数计，粗蛋白42.4%、粗脂肪7.2%、灰分8.4%。

1.2方法

1.2.1试验设计

将试验用对虾分为3组，每组设3个重复，每个重复组放养60尾虾。实验组分为：对照组、试验1组、试验2组；对照组投喂基础饲料，试验1和2组分别投喂实施例1所制备的免疫增强剂基础饲料，其中，试验1组投喂的每千克饲料添加黄芪多糖1g、绿原酸1g和小檗碱0.5g；试验2组投喂的每千克饲料添加黄芪多糖1g、绿原酸1g和小檗碱1g。试验期间，每日投喂，日投喂量均为体重的2%，分别于每天的9:00、16：00时间各投喂一半。

1.2.2测定指标和方法

分别于投喂中草药免疫增强剂后第0、3、6天，以及停药后第1、3、6、10天各取样1次。每次每组随机取凡纳滨对虾8尾，使用消毒的5号针头和1mL注射器直接插入对虾头胸甲后缘围心腔内3mm左右进行采血，抽血前注射器内预先吸入了0.3mL改进的预冷凡纳滨对虾抗凝剂（0.34MNaCl,0.01MKCl,0.01MEDTA-Na₂,0.01MHEPES,pH7.45,渗透压为780mOsm.kg^-1），最终使得抗凝剂和血淋巴的比例为1:1。一部分血淋巴样品进行血细胞数量及吞噬率的测定，剩余血淋巴样品于4℃下800g离心10min后，取蓝色上清，即为血浆样品，进行抗菌活力及溶菌活力的测定。

血细胞数量的测定使用血球计数板在光学显微镜下进行计数；吞噬活性的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：Immuneresponsesandexpressionofimmune-relatedgenesinswimmingcrabPortunustrituberculatusexposedtoelevatedambientammonia-Nstress.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA；抗菌活力、溶菌活力的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：Insectimmunity.PurificationandpropertiesofthreeinduciblebactericidalproteinsfromhemolymphofimmunizedpupaeofHyalophoracecropia.EuropeanJournalofBiochemistry；攻毒保护率的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：DietaryadministrationofGynurabicolor(Roxb.Willd.)DCwaterextractenhancesimmuneresponseandsurvivalrateagainstVibrioalginolyticusandwhitespotsyndromevirusinwhiteshrimpLitopeneausvannamei.Fish&shellfishimmunology.

2结果

2.1血细胞数量

由图1可见：在投喂中草药免疫增强剂的6天内，试验组对虾血细胞数量均显著高于对照组（P<0.05），而投喂6天内对照组无显著差异。两试验组中血细胞数量于投喂第6天达到最高值，且试验2组中血细胞数量显著高于试验1组（P<0.05）。停止投喂中草药免疫增强剂后，两试验组血细胞数量逐渐降低，于停药6天后恢复正常水平。

2.2血细胞吞噬活性

由图2可见：在投喂中草药免疫增强剂6天内，试验组对虾血细胞吞噬活性均显著高于对照组（P<0.05），而投喂6天内对照组无显著差异。两试验组中血细胞吞噬活性于投喂第6天达到最高值，且试验2组中血细胞吞噬活性显著高于试验1组（P<0.05）。停止投喂中草药免疫增强剂后，两试验组血细胞吞噬活性逐渐降低，于停药6天后恢复正常水平。本试验结果表明，复方中草药免疫增强剂能有效提高凡纳滨对虾血细胞数量，且添加量不同其效果也不同，试验2组的效果优于试验1组。

2.3抗菌活性

由图3可见：在投喂中草药免疫增强剂的6天内，试验组对虾抗菌活性均显著高于对照组（P<0.05），而投喂6天内对照组无显著差异。两试验组中抗菌活性于投喂第6天达到最高值，且试验2组中抗菌活性显著高于试验1组（P<0.05）。停止投喂中草药免疫增强剂后，两试验组抗菌活性逐渐降低，于停药6天后恢复正常水平。本试验结果表明，复方中草药免疫增强剂能有效提高凡纳滨对虾血细胞吞噬活性，且添加量不同其效果也不同，试验2组的效果优于试验1组。

2.4溶菌活性

由图4可见：在投喂中草药免疫增强剂的6天内，试验组对虾溶菌活性均显著高于对照组（P<0.05），而投喂6天内对照组无显著差异。两试验组中溶菌活性于投喂第6天达到最高值，且试验2组中溶菌活性显著高于试验1组（P<0.05）。停止投喂中草药免疫增强剂后，两试验组溶菌活性逐渐降低，于停药6天后恢复正常水平。本试验结果表明，复方中草药免疫增强剂能有效提高凡纳滨对虾抗菌及溶菌活性，且添加量不同其效果也不同，试验2组的效果优于试验1组。

2.5攻毒保护率

投喂中草药免疫增强剂6天后，每组随机取30尾虾进行攻毒试验，以10尾虾为一个重复，每个试验组3重复。将溶藻弧菌按1×10⁷cell/mL浓度对试验对虾尾节末端肌肉注射（30μL/尾），结果见表1。经计算，试验1组24h免疫保护力为63.5%，48h免疫保护力为55.3%，试验2组24h免疫保护力为77.6%，48h免疫保护力为72.9%。表明添加中草药能提高凡纳滨对虾对哈维氏弧菌的免疫保护力，且随着添加量的增加，免疫保护力增强。

表1凡纳滨对虾攻毒保护率

另外，中草药免疫增强剂的给药时间极其重要，当机体的免疫功能下降或被抑制时，免疫增强剂能提高机体的免疫能力。本试验中，停止投喂中草药免疫增强剂6天后，对虾各免疫指标恢复正常值。因此本发明所提供的中草药免疫增强剂一个疗程为投喂6天，停药6天。

Claims (5)

1.一种用于对虾的复方中草药免疫增强剂，其特征在于，以质量分数计，它包括黄芪多糖20%-50%、绿原酸20%-50%和小檗碱20%-50%。

2.如权利要求1所述的复方中草药免疫增强剂，其特征在于，黄芪多糖：绿原酸：小檗碱的质量比为2：2：1。

3.如权利要求1所述的复方中草药免疫增强剂，其特征在于，黄芪多糖：绿原酸：小檗碱的质量比为1：1：1。

4.如权利要求1-3任一项所述的复方中草药免疫增强剂，其特征在于，所述的黄芪多糖、绿原酸和小檗碱的提取方法为：分别将黄芪、杜仲和黄连均匀粉碎后，与无水乙醇按照1:10的质量体积比混匀，70℃回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇即得。

5.权利要求1-3任一项所述的复方中草药免疫增强剂在对虾养殖中的应用。