CN111304146A - 一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法 - Google Patents

一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，基于中华绒螯蟹造血因子对造血组织发育的影响，通过构建细胞和动物筛选模型，筛选特异性促进造血组织发育的免疫增强剂并验证其效果，力求从根本上提高中华绒螯蟹的免疫力。

Description

一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建 方法
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，特别涉及一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法。
背景技术
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)属甲壳纲、十足目、弓蟹科的一属，又称毛蟹、河蟹，广泛分布于中国南北沿海各地湖泊、池塘和河流。中华绒螯蟹具有生长快、食性杂、易饲养、病害少等养殖优势，同时因其肉味鲜美、富含低胆固醇蛋白质，作为营养保健食品而风靡全国。70年代起中国开始进行中华绒螯蟹人工育苗，并在繁殖生物学、自然水温育苗等方面进行了初步研究，目前中华绒螯蟹在江苏、安徽和浙江等多个省份均有大量养殖，其2018年的养殖产量达到了756877吨。
近年来，随着养殖规模和养殖密度的不断增大，各种疾病频发，导致中华绒螯蟹养殖业受到极大的挑战。国内已有报道中华绒螯蟹在野生和养殖环境中对多种病毒较为敏感，包括白斑综合征病毒、中华绒螯蟹小核糖核酸病毒和呼肠孤样病毒等。此外，中华绒螯蟹在特定条件下也容易爆发革兰氏阴性细菌病，目前已报道的能够导致中华绒螯蟹发病的细菌包括类立克次体病菌、弧菌科细菌、气单胞菌、假单胞菌和黄杆菌等。中华绒螯蟹的病害防控的传统方式主要以使用抗生素和化学类消毒剂等为主，一方面容易导致耐药菌的出现，另一方面又对养殖环境造成极大的破坏。根据《2019年全国水产养殖用药减量行动方案》要求，多省被列为抗生素减量使用示范省，可用于水产养殖的抗生素种类非常有限。中华绒螯蟹病害发生是机体、病原与水环境三者相互作用的结果，在正常的养殖水环境直接控制病原的手段受限的情况下，增强蟹机体本身的免疫力是解决其养殖病害问题的重要举措。
中草药及其有效成分以其取自天然、毒副作用小、无药物残留和抗药性、对人体健康无害、高效安全以及功能多样化等优点，不但可以解决抗生素等合成药物引发的病原菌耐药性、残留超标、养殖环境污染和微生态平衡破坏等问题，而且完全符合目前发展无公害水产养殖、生产绿色水产品的疾病防治原则，逐渐成为水产药物研究的热点。但目前，关于中草药提高水产动物免疫力的研究多集中于对于机体非特异性免疫的调节，例如李建良研究发现，中华鳖日粮中添加1％和2％的纯中药粉，能够促进细胞免疫功能、提高鳖的成活率和生长效率；李霞等通过向基础饲料中添加不同剂量中药发现，5％添加的中药配方(包括黄芪、白术、防风、百部、仙鹤草、土茯苓)可以有效提高牙鲆免疫力。仅蔡中华等发现大黄、黄莲能使鲤鱼溶菌物质溶菌活性增加以及吞噬细胞吞噬能力增强，并能引起鲤鱼免疫器官重量增加，但具体机制尚不清楚。
中华绒螯蟹等甲壳类主要的免疫防御功能由血细胞介导的体液免疫及细胞免疫执行，包括吞噬作用、包囊作用、黑化作用和溶菌作用，以及抗菌肽、凝集素、酚氧化酶和细胞粘附蛋白等细胞因子的释放。当病原微生物侵袭时，其血细胞数量会经历急剧下降和逐步恢复的过程，该过程中造血组织及血细胞增殖相关细胞因子发挥着重要的作用。现有中华绒螯蟹饲养中使用的中草药类免疫增强剂多是从非特异性免疫着手研究，尚无从中华绒螯蟹免疫器官发育角度开发的免疫增强剂，利用促中华绒螯蟹造血组织发育细胞筛选模型筛选评估免疫增强剂，尚未见该方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，基于中华绒螯蟹造血因子对造血组织发育的影响，通过构建细胞和动物筛选模型，筛选特异性促进造血组织发育的免疫增强剂并验证其效果，力求从根本上提高中华绒螯蟹的免疫力。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，包括以下步骤：
步骤1：造血组织分离及鉴定
从待取样中华绒螯蟹上剥离造血组织，经形态学观察，鉴定并确定其为造血组织后再用于后续步骤；
步骤2：造血组织细胞及培养
将造血组织置于混合消化液中消化，经细胞筛过滤后离心，去除上清液后用L-15培养基重悬细胞，重复操作3遍后，用L-15培养基重悬获得造血组织细胞悬浮液，计数后将细胞浓度调整至1×105cells/mL，置于24℃无CO2恒温培养箱中培养，连续观察7日并拍摄每日细胞形态；
步骤3：免疫增强剂安全浓度测试
3.1将步骤2培养后的造血组织细胞浓度调整至1×105cells/mL，并按200μL/孔加入96孔板，置于24℃无CO2恒温培养箱中培养24h；
3.2选取待选免疫增强剂用L-15培养基溶解后，经0.22μm滤膜过滤后备用；
3.3用L-15培养基对免疫增强剂进行对半稀释，调整各免疫增强剂终浓度至100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.7mg/mL、3.4mg/mL、1.7mg/mL和0.85mg/mL；
3.4将3.1步96孔板中的培养液吸出，用L-15培养基清洗2遍，每孔加入200μL梯度浓度的免疫增强剂，每个浓度3孔重复，于24℃无CO2恒温培养7天；
3.5每日收集1次细胞观察并拍照，以3孔重复不出现细胞病变为安全浓度；
步骤4：免疫增强剂作用关键基因检测
4.1根据中华绒螯蟹Astakine和Beta-actin基因设计荧光定量RT-PCR引物，于安全浓度的免疫增强剂作用细胞后的第1、2、3、4、5、6和7天，收集各孔细胞并提取RNA；
4.2采用反转录试剂盒将提取的RNA合成荧光定量PCR用cDNA第一链；
4.3接着进行荧光定量PCR检测Astakine和Beta-actin基因的CT值，并用2-△△Ct计算后确定不同免疫增强剂作用下Astakine基因的相对表达情况；Beta-actin基因作为内参来矫正；
步骤5：免疫增强剂投喂
5.1制备含免疫增强剂的免疫增强型颗粒饲料和不含免疫增强剂的颗粒饲料；
5.2选择幼蟹(10-20g重)作为实验对象，投免疫增强型颗粒饲料为试验组，投不含免疫增强剂的颗粒饲料为对照组，每日按蟹体重的3％投免疫增强型颗粒饲料和不含免疫增强剂的颗粒饲料；
5.3于特定时间作如下分析：
5.3.1于投喂后的0、1、2、3、4和5周收集蟹造血组织，提取造血组织的RNA并用荧光定量RT-PCR检测Astakine和Beta-actin基因的CT值，用2-△△Ct计算计算Astakine基因的相对表达量；
5.3.2于投喂5周后完整剥离造血组织，并分别对造血组织及蟹体重进行称量，计算造血组织体重比；
5.3.3取造血组织，经4％多聚甲醛固定和HE染色后，分析造血组织细胞团差异；
步骤6：急性攻毒实验
取养殖5周后的蟹，放置于养殖桶中，注射100μL 100μg/mL的脂多糖，于注射后开始连续观察7天并统计总死亡数量，计算死亡率；期间不投喂饲料，不换水。
该免疫增强剂的细胞和动物筛选模型标准如下：1)备选免疫增强剂作用于细胞后，以在作用期内能显著提高细胞Astakine基因表达量的免疫增强剂作为后续饲料制备的备选免疫增强剂；2)免疫增强型饲料投喂期内(5周)，造血组织Astakine基因表达量要高于对照组；3)免疫增强型饲料投喂5周后，造血组织肉眼可见要大于对照组，或造血组织占比体重相对对照组提高5％以上；4)免疫增强型饲料投喂5周后，免疫增强剂作用动物造血组织石蜡切片的HE染色结果可见造血细胞团要多于对照组。
步骤2中所述混合消化液的组成为：Ⅰ型胶原酶0.1wt％，Ⅳ型胶原酶0.1wt％，余量的抗凝剂。
所述抗凝剂配方为：0.45M氯化钠，0.1M葡萄糖，30mM柠檬酸钠，26mM柠檬酸，10mMEDTA，pH 4.6。
步骤2中，混合消化液中37℃消化45min。
4.3步荧光定量PCR反应体系如下：
反应体系：20μL，其中cDNA5μL，10nM的上游引物和下游引物各1μL，3μL PCR gradeH2O，10μL SYBR Green Master。
4.3步荧光定量PCR反应条件如下：预变性95℃10min；45个循环的扩增，每个循环为：95℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸30sec；熔解曲线程序设置为95℃10sec，65℃1min，97℃1sec。
Astakine基因的引物序列如下：
上游引物序列为：5’-GTGGTGGTGTTGGTGCTG-3’(SEQ ID No.1)，
下游引物序列为：5’-ATGTCGTTGGGGTAGTGC-3’(SEQ ID No.2)。
Beta-actin基因的引物序列如下：
上游引物序列为：5’-GCATCCACGAGACCACTTACA-3’(SEQ ID No.3)，
下游引物序列为：5’-CTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3’(SEQ ID No.4)。
5.1步含免疫增强剂的免疫增强型颗粒饲料中免疫增强剂的含量为1wt％。
本发明的有益效果是：
1、提供一种促中华绒螯蟹造血组织发育的免疫增强剂筛选模型，用于筛选适用于中华绒螯蟹免疫系统且能特异性增强其免疫力的免疫增强剂；
2、基于该模型，对筛选的免疫增强剂进行效果评估，确定一种可有效促进中华绒螯蟹造血组织发育和免疫力增强的中草药型免疫增强剂。
附图说明
图1中华绒螯蟹造血组织分离及观察，A.为中华绒螯蟹造血组织所在位置；B为分离后的造血组织；C和D为造血组织Gimesa染色的不同倍数显微镜观察结果；E和F为造血组织HE染色的不同倍数显微镜观察结果。
图2为分离的造血组织原代细胞7天培养每日观察情况。
图3不同免疫增强剂最低安全浓度作用下的造血组织细胞显微镜观察结果。
图4不同种类免疫增强剂最低安全浓度作用下的造血组织细胞核荧光显微观察结果。
图5不同免疫增强剂对培养的造血组织细胞Astakine基因的影响。*标记的代表该时间点基因表达量与对照组有显著性差异。
图6造血组织Astakine基因变化情况。
图7免疫增强剂作用后造血组织发育分析，A为造血组织比较图；B为造血组织体重占比结果；C和D分别是免疫增强剂和对照组造血组织卵泡团HE染色的显微镜观察结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
步骤1：造血组织分离及鉴定
待取样中华绒螯蟹，先后用无菌生理盐水(0.9％氯化钠)和75％酒精擦拭体表。解剖后，造血组织从中华绒螯蟹胃的背腹侧剥离，再用无菌生理盐水清洗3遍。一部分造血组织用4％多聚甲醛固定液(phosphate buffer saline，PBS配制)室温固定15min后，PBS清洗，并保存于4℃后送公司(杭州浩克生物技术有限公司)用于制作石蜡切片，经苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin，HE)和吉姆萨染色法(Gimesa)染色后用于形态学观察，鉴定并确定其为造血组织后再用于后续实验。
从中华绒螯蟹胃部背腹侧分离得到造血组织(图1)，其为单层乳白色半透明的膜状组织，经4％多聚甲醛固定后呈淡黄色团块(图1B)；经Gimesa(图1C-D)及HE染色(图1E-F)染色后，可见造血组织由一系列结缔组织包被的卵泡组成，每个卵泡含有大量的球形细胞。
步骤2：造血组织细胞及培养
造血组织按步骤1方法分离后，置于500μL含有Ⅰ型和Ⅳ型胶原酶质量百分浓度各0.1％(抗凝剂配置，抗凝剂配方为0.45M氯化钠、0.1M葡萄糖、30mM柠檬酸钠、26mM柠檬酸、10mMEDTA，pH 4.6)的混合消化液中37℃消化45min，经细胞筛过滤后1000g离心15min，去除上清液后用L-15(Leibovitz's L-15)培养基重悬细胞，重复操作3遍后，用L-15培养基重悬获得造血组织细胞悬浮液，计数后将细胞浓度调整至1×105cells/mL，置于24℃(无CO2)恒温培养箱中培养，连续观察7日并拍摄每日细胞形态。分离的造血组织细胞经24h培养后，可观察到大量细胞贴壁生长(图2)，细胞较小，普遍呈卵圆形或纺锤形，且在L-15培养基，24℃无CO2条件下可稳定生长至7天以上。
步骤3：免疫增强剂安全浓度测试
将造血组织细胞浓度调整至1×105cells/mL，并按200μL/孔加入96孔板，置于24℃(无CO2)恒温培养箱中培养24h。根据已有文献报道及中草药药理作用，选取待选免疫增强剂(中草药提取物)，免疫增强剂用L-15培养基溶解后，经0.22μm滤膜过滤后备用。用L-15培养基对免疫增强剂进行对半稀释，调整各免疫增强剂终浓度至100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.7mg/mL、3.4mg/mL、1.7mg/mL和0.85mg/mL。将原96孔板中的培养液吸出，用L-15培养基清洗2遍，每孔加入200μL以上调整后的免疫增强剂，每个浓度3孔重复，于24℃(无CO2)恒温培养7天。每日收集1次细胞观察并拍照，吸出孔中培养基，并用PBS清洗2遍，用4％多聚甲醛固定液按步骤1方法固定后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对细胞核进行染色，置于倒置荧光显微镜中观察并拍照，以3孔重复不出现细胞病变(细胞无破裂，细胞核未出现破裂或者染色质皱缩等情况)为安全浓度。
步骤4：免疫增强剂作用关键基因检测
根据中华绒螯蟹Astakine(Genbank：GU002534.1)和Beta-actin(GenBank:HM053699.1)基因设计荧光定量RT-PCR引物(表1)。于免疫增强剂(安全浓度)作用细胞后的第1、2、3、4、5、6和7天，收集各孔细胞并提取RNA。
提取RNA具体操作为：倒出培养液，用PBS清洗一次。每孔生长的培养细胞中加入200μL的RNAiso Plus，轻微晃动，确保使裂解液均匀分布于细胞表面。将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。室温(15-30℃)静置5分钟，然后从核蛋白中分离RNA。向上述匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5分钟。12000×g 4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)。向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。12000×g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。小心弃去上清，加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500×g 4℃离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀后检测RNA纯度(OD260/280)和浓度。
采用TAKARA公司的PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒将提取的RNA合成荧光定量PCR用cDNA第一链，按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。试剂使用量终浓度5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μL，1×Total RNA(反应体系可最大使用500ng的Total RNA)，RNase-Free水补齐到10μL。轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：37℃15min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶的失活反应)，4℃。
荧光定量PCR检测：荧光定量PCR反应体系及反应条件如下，反应体系：20μL，其中cDNA 5μL，10nM的上游引物和下游引物各1μL，3μL PCR grade H2O，10μL SYBR GreenMaster(Roche)。反应条件如下：预变性95℃10min,45个循环的扩增(95℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸30sec)，熔解曲线程序设置为95℃10sec，65℃1min，97℃1sec。所有样品均跑3份重复，检测Astakine和Beta-actin基因的CT值，并用2-△△Ct计算后确定不同免疫增强剂作用下Astakine基因的相对表达情况。
表1待测基因引物及目的片段
Figure BDA0002407704600000071
步骤5：免疫增强剂投喂
委托饲料公司制备含1wt％(免疫增强剂：饲料＝1：100；是1g免疫增强剂和99g普通饲料配比形成)免疫增强剂的免疫增强型颗粒饲料，选择幼蟹(10-20g重量)作为实验对象，每日按蟹重量的3％投喂免疫增强型饲料和不含免疫增强剂的普通饲料。于特定时间作如下分析：1)于投喂后的0、1、2、3、4和5周收集蟹造血组织，造血组织用液氮研磨后，取20-30mg研磨组织，加入1mL RNAiso Plus，轻微晃动，确保使组织均匀分布于裂解液。按步骤4方法提取组织RNA并检测Astakine基因的相对表达量；2)于投喂5周后完整剥离造血组织，并分别对造血组织及蟹体重进行称量，计算造血组织体重比；3)取造血组织，按步骤1方法对进行固定后，制作石蜡切片并进行HE染色，分析造血组织细胞团差异。
步骤6：急性攻毒实验
取养殖5周后的蟹，放置于养殖桶中，注射100μL 100μg/mL的脂多糖，于注射后开始连续观察7天并统计总死亡数量，计算死亡率。养殖期间不投喂饲料，不换水。
这里用脂多糖做急性攻毒实验，是测试免疫保护率。
免疫增强剂的选择标准：
该免疫增强剂的细胞和动物筛选模型标准如下：1)备选免疫增强剂作用于细胞后，以在作用期内能显著提高细胞Astakine基因表达量的免疫增强作为后续饲料制备的备选免疫增强剂；2)免疫增强型饲料投喂期内(5周)，造血组织Astakine基因表达量要高于对照组；3)免疫增强型饲料投喂5周后，造血组织肉眼可见要大于对照组，或造血组织占比体重相对对照组提高5％以上；4)免疫增强型饲料投喂5周后，免疫增强剂作用动物造血组织石蜡切片的HE染色结果可见造血细胞团要多于对照组。
按照实施例1的方法对几种备选免疫增强剂进行评估，备选的免疫增强剂包括白芍(BS)、当归(DG)、龙眼肉(LYR)、何首乌(HSW)和熟地黄(SDH)，上述备选的免疫增强剂均为对应中草药的提取物。试验后的结果分析如下：
图3和4为不同种类免疫增强剂的最低安全浓度筛选的普通显微镜和荧光显微镜观察结果。结果显示50mg/mL终浓度的当归(DG)、龙眼肉(LYR)、何首乌(HSW)和熟地黄(SDH)对细胞无明显伤害，细胞未出现病变，细胞核未出现破裂的现象(图4)；0.84mg/mL终浓度的白芍(BS)对细胞无明显伤害，细胞未出现病变，细胞核未出现破裂的现象(图4)。
图5为中不同免疫增强剂对培养的造血组织原代细胞筛选用免疫基因的检测结果。检测发现白芍及当归作用下Astakine基因表达量有一定程度上升(图5)，其中白芍作用2天后Astakines基因表达量显著升高(P<0.05)，达到初始基因表达量的8.72倍，6天后达到最大值，为初始基因表达量的20.05倍(P<0.05)。其余中草药作用下，该基因表达量未有明显升高。综上，白芍可显著提高Astakine基因的表达量，可用于后续制备免疫增强型饲料并评估。
图6为免疫增强型饲料投喂后，中华绒螯蟹造血组织Astakine基因的变化情况。结果显示免疫增强型饲料投喂后造血组织Astakine基因表达量逐步上升，在第4周时达到初始时的10.55倍，高于对照组。
图7为实例中免疫增强型饲料投喂后造血组织占比体重及血细胞团比较分析。结果显示免疫增强型饲料饲喂组造血组织要大于对照组(图7A)，造血组织占比体重在5周后达到了14.77％，而对照组只有8.13％(图7B)。且免疫增强剂组内含有血细胞团的卵泡数量要多于对照组(图7C-D)。
表2为实例中免疫增强剂饲喂中华绒螯蟹急性攻毒实验结果，免疫增强组存活率为76.47％，要高于对照组。
表2 7天急性攻毒实验的存活率分析
Figure BDA0002407704600000081
根据选择标准，实例中的备选中草药白芍(BS)、当归(DG)、龙眼肉(LYR)、何首乌(HSW)和熟地黄(SDH)，只有白芍(BS)符合标准1。通过制备免疫增强型饲料进行后续评估，结果符合标准2-4。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法
<130> 2020.03
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gtggtggtgt tggtgctg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atgtcgttgg ggtagtgc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
gcatccacga gaccacttac a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
ctcctgcttg ctgatccaca tc 22

Claims (9)

1.一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：造血组织分离及鉴定
从待取样中华绒螯蟹上剥离造血组织，经形态学观察，鉴定并确定其为造血组织后再用于后续步骤；
步骤2：造血组织细胞及培养
将造血组织置于混合消化液中消化，经细胞筛过滤后离心，去除上清液后用L-15培养基重悬细胞，重复操作3遍后，用L-15培养基重悬获得造血组织细胞悬浮液，计数后将细胞浓度调整至1×105cells/mL，置于24℃无CO2恒温培养箱中培养，连续观察7日并拍摄每日细胞形态；
步骤3：免疫增强剂安全浓度测试
3.1将步骤2培养后的造血组织细胞浓度调整至1×105cells/mL，并按200μL/孔加入96孔板，置于24℃无CO2恒温培养箱中培养24h；
3.2选取待选免疫增强剂用L-15培养基溶解后，经0.22μm滤膜过滤后备用；
3.3用L-15培养基对免疫增强剂进行对半稀释，调整各免疫增强剂终浓度至100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.7mg/mL、3.4mg/mL、1.7mg/mL和0.85mg/mL；
3.4将3.1步96孔板中的培养液吸出，用L-15培养基清洗2遍，每孔加入200μL梯度浓度的免疫增强剂，每个浓度3孔重复，于24℃无CO2恒温培养7天；
3.5每日收集1次细胞观察并拍照，以3孔重复不出现细胞病变为安全浓度；
步骤4：免疫增强剂作用关键基因检测
4.1根据中华绒螯蟹Astakine和Beta-actin基因设计荧光定量RT-PCR引物，于安全浓度的免疫增强剂作用细胞后的第1、2、3、4、5、6和7天，收集各孔细胞并提取RNA；
4.2采用反转录试剂盒将提取的RNA合成荧光定量PCR用cDNA第一链；
4.3接着进行荧光定量PCR检测Astakine和Beta-actin基因的CT值，并用2-△△Ct计算后确定不同免疫增强剂作用下Astakine基因的相对表达情况；
步骤5：免疫增强剂投喂
5.1制备含免疫增强剂的免疫增强型颗粒饲料和不含免疫增强剂的颗粒饲料；
5.2选择幼蟹作为实验对象，投免疫增强型颗粒饲料为试验组，投不含免疫增强剂的颗粒饲料为对照组，每日按蟹体重的3％投免疫增强型颗粒饲料和不含免疫增强剂的颗粒饲料；
5.3于特定时间作如下分析：
5.3.1于投喂后的0、1、2、3、4和5周收集蟹造血组织，提取造血组织的RNA并用荧光定量RT-PCR检测Astakine和Beta-actin基因的CT值，用2-△△Ct计算计算Astakine基因的相对表达量；
5.3.2于投喂5周后完整剥离造血组织，并分别对造血组织及蟹体重进行称量，计算造血组织体重比；
5.3.3取造血组织，经4％多聚甲醛固定和HE染色后，分析造血组织细胞团差异；
步骤6：急性攻毒实验
取养殖5周后的蟹，放置于养殖桶中，注射100μL 100μg/mL的脂多糖，于注射后开始连续观察7天并统计总死亡数量，计算死亡率；期间不投喂饲料，不换水。
2.根据权利要求1所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：步骤2中所述混合消化液的组成为：Ⅰ型胶原酶0.1wt％，Ⅳ型胶原酶0.1wt％，余量的抗凝剂。
3.根据权利要求2所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：所述抗凝剂配方为：0.45M氯化钠，0.1M葡萄糖，30mM柠檬酸钠，26mM柠檬酸，10mM EDTA，pH 4.6。
4.根据权利要求1所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：步骤2中，混合消化液中37℃消化45min。
5.根据权利要求1所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：4.3步荧光定量PCR反应体系如下：
反应体系：20μL，其中cDNA 5μL，10nM的上游引物和下游引物各1μL，3μL PCR gradeH2O，10μL SYBR Green Master。
6.根据权利要求5所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：4.3步荧光定量PCR反应条件如下：预变性95℃10min；45个循环的扩增，每个循环为：95℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸30sec；熔解曲线程序设置为95℃10sec，65℃1min，97℃1sec。
7.根据权利要求5所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：Astakine基因的引物序列如下：
上游引物序列为：5’-GTGGTGGTGTTGGTGCTG-3’，
下游引物序列为：5’-ATGTCGTTGGGGTAGTGC-3’。
8.根据权利要求5所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：Beta-actin基因的引物序列如下：
上游引物序列为：5’-GCATCCACGAGACCACTTACA-3’，
下游引物序列为：5’-CTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3’。
9.根据权利要求1所述的一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于：5.1步含免疫增强剂的免疫增强型颗粒饲料中免疫增强剂的含量为1wt％。
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