CN105596419A - 一种能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，主要由以下质量份配比的原料制成：五倍子1～20、石榴皮1～20、苏木1～20、丹参1～20。还公开了上述复方中草药制剂在制备具有抑制嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌和罗非鱼链球菌功效的药物中的应用。以及含有上述复方中草药制剂的罗非鱼饲料。该制剂能显著提高罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力，其对无乳链球菌的防治率在52～85％之间，还能有效提高罗非鱼的存活率。该复方中药还对罗非鱼常见病原菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌有良好的抑菌活性。含有上述复方中草药制剂的饲料，安全无毒，其制备工艺简单，可直接添加到商品饲料中。
Description
技术领域
本发明属于中草药饲料添加剂技术领域，具体涉及一种能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂及其应用。
背景技术
近年来，由于高密度养殖，种群退化，环境、气候及养殖水质的恶化等原因，我国罗非鱼养殖业爆发了链球菌为主的细菌性疾病且日趋严重，导致养殖罗非鱼大量死亡，给罗非鱼养殖业造成巨大的经济损失并威胁着产业的健康发展。
迄今为止，从养殖罗非鱼上分离到的链球菌主要有无乳链球菌和海豚链球菌，而目前尤以无乳链球菌的危害为甚，该病具有发病率高、范围广、死亡率高的特点，给罗非鱼养殖造成巨大的经济损失。
大量抗生素的使用也使细菌极易产生坚强的耐药性，对疾病的防控造成困难，给水产品安全和人类健康带来极大隐患。我国中药资源十分丰富，还具有少残留、副作用小，符合无公害水产养殖要求等普遍认可的特点，已经成为研究防治鱼类疾病药物的主要原料。利用中药及其复方制剂能够有效地提高罗非鱼的抗病能力。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，该复方中草药制剂对罗非鱼常见病原菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌有良好的抑菌活性，还能有效地控制罗非鱼链球菌病。
本发明的第二个目的是提供上述能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂在制备具有抑制嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌和罗非鱼链球菌功效的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种罗非鱼饲料，该罗非鱼饲料适口性好，安全无毒，易于产业化。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，主要由以下质量份配比的原料制成：
五倍子1～20、石榴皮1～20、苏木1～20、丹参1～20。
作为本发明的一种优选的技术方案，各原料的质量份配比优选为五倍子5～20、石榴皮5～20、苏木5～20、丹参5～20。
作为本发明的一种最佳的技术方案，各原料的质量份配比为五倍子20、石榴皮5、苏木20、丹参5。
本发明提供的上述能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂的一种优选的制备方法，包括以下步骤：按用量关系取各原料，加水煎煮多次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为0.5～1.5g/mL。
本发明中的复方中草药制剂包括但不限于水剂，还可以是其它剂型，如粉剂、超微粉剂等。
优选的，该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂的制备方法中：加水煎煮3次，合并3次滤液，浓缩至生药含量为1.0g/mL。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂在制备具有抑制嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌和罗非鱼链球菌功效的药物中的应用。
本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：一种罗非鱼饲料，含有上述的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
优选的，所述复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的2～6％。
上述罗非鱼饲料的一种优选的制备方法，包括以下步骤：按用量关系取复方中草药制剂，喷洒至罗非鱼基础饲料上，风干即制得罗非鱼饲料。
本发明具有如下优点：
(1)本发明的复方中草药制剂能有效防治罗非鱼链球菌病，其有效防治率在52～85％之间，对罗非鱼生长性能没有显著性影响，能显著提高血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、溶菌酶活力，显著降低MDA含量；并能显著上调罗非鱼抗病因子MHC-2a、MHC-2b的表达，从而能有效提高罗非鱼的存活率；
(2)该复方中药还对罗非鱼常见病原菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌有良好的抑菌活性；
(3)含有本发明复方中草药制剂的饲料，制备工艺简单，可直接添加到商品饲料中，且不会对饲料的适口性产生影响，安全无毒，所用的中药原料价格低廉，稳定好，易于产业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例15中复方中药饲喂对罗非鱼肝脏、肾脏、脾脏MHC-2a，MHC-2b表达量影响结果。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，其配方通过以下方式筛选获得：
按照五倍子、石榴皮、苏木、丹参分别设计0份、5份、10份、15份、20份五个剂量，按照不同比例正交设计，进行体外抑菌试验，结果如下表1所示。
表1不同水平复方中药体外抑制无乳链球菌正交试验结果
根据表1中的试验结果，确定本发明能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，主要由以下质量份配比的原料制成：五倍子1～20、石榴皮1～20、苏木1～20、丹参1～20。
较佳组方主要由以下质量份配比的原料制成：五倍子5～20、石榴皮5～20、苏木5～20、丹参5～20。
根据正交试验的原理，进行统计学分析，得到最佳配比，最佳由以下质量份配比的原料制成：五倍子20、石榴皮5、苏木20、丹参5。最佳配比也进行了验证试验，抑菌圈在30mm以上。具体如下所示。
按最佳质量份配比，配制复方中药，进行牛津杯抑菌试验，结果如下表2中所示，最佳质量份配比中药效果最佳。
表2最佳质量份配比中药对链球菌的验证试验结果
备注：GDXG-01、GDEL-01、GDXJ-01和GDZX-01均为无乳链球菌分离株；分别分离自仙桂村、二龙村、西镜村和中新村。
实施例2
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，由以下质量份配比的原料制成：
五倍子1、石榴皮20、苏木1、丹参20。
该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂通过以下方法制备获得：按用量关系取各原料，加水煎煮多次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为0.5g/mL。
实施例3
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，由以下质量份配比的原料制成：
五倍子5、石榴皮15、苏木5、丹参15。
该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂通过以下方法制备获得：按用量关系取各原料，加水煎煮多次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为1.0g/mL。
实施例4
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，由以下质量份配比的原料制成：
五倍子10、石榴皮10、苏木10、丹参10。
该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂通过以下方法制备获得：按用量关系取各原料，加水煎煮3次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为1.5g/mL。
实施例5
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，由以下质量份配比的原料制成：
五倍子15、石榴皮5、苏木15、丹参5。
该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂通过以下方法制备获得：按用量关系取各原料，加水煎煮3次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为1.0g/mL。
实施例6
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，由以下质量份配比的原料制成：
五倍子20、石榴皮5、苏木20、丹参5。
该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂通过以下方法制备获得：按用量关系取各原料，加水煎煮3次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为1.0g/mL。
实施例7
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，由以下质量份配比的原料制成：
五倍子20、石榴皮1、苏木20、丹参1。
该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂通过以下方法制备获得：按用量关系取各原料，加水煎煮3次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为1.0g/mL。
实施例8
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，由以下质量份配比的原料制成：
五倍子20、石榴皮5、苏木20、丹参5。
该能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂通过以下方法制备获得：按用量关系取各原料，加水煎煮3次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为1.0g/mL。
实施例9
本实施例提供的罗非鱼饲料，含有实施例2中能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
其中复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的2％。
该罗非鱼饲料的制备方法，包括以下步骤：按用量关系取复方中草药制剂，喷洒至罗非鱼基础饲料上，即制得罗非鱼饲料。
实施例10
本实施例提供的罗非鱼饲料，含有实施例2中能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
其中复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的3％。
该罗非鱼饲料的制备方法同实施例9。
实施例11
本实施例提供的罗非鱼饲料，含有实施例3中能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
其中复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的4％。
该罗非鱼饲料的制备方法同实施例9。
实施例12
本实施例提供的罗非鱼饲料，含有实施例4中能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
其中复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的5％。
该罗非鱼饲料的制备方法同实施例9。
实施例13
本实施例提供的罗非鱼饲料，含有实施例5中能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
其中复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的6％。
该罗非鱼饲料的制备方法同实施例9。
实施例14
本实施例提供的罗非鱼饲料，含有实施例6中能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
其中复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的2％。
该罗非鱼饲料的制备方法同实施例9。
实施例15
采用实施例6中的能提高罗非鱼抗病力的复方中草药制剂，制成罗非鱼饲料，进行
本发明提供了含有能提高罗非鱼抗病力的复方中草药制剂的罗非鱼饲料的使用方法，步骤如下：
(1)按实施例6配比称取中药，水煎三次，过滤，合并三次滤液，浓缩至生药含量1g/mL。按复方中草药制剂，将中药药液按重量配比混合制成0％组、2％组、4％组、6％组添加到基础罗非鱼基础饲料，混匀风干，制成4种试验用饲料。
(2)挑选罗非鱼平均体重为9.92±0.72随机分为4组，放入4个方形水泥池中，每池放3个网箱，每个网箱40尾，分别投喂上述0％、2％、4％、6％复方中药试验饲料，每组设3个重复，试验连续进行6周，连续用充气泵增氧，每日饱饲，于每日上午8:30和下午4:30各投喂一次。暂养2周后开始正式试验，试验期间水温为28±3℃，试验期间水温保持28±3℃，水体DO保持在5mg/L以上，定期换水。
(3)分别与试验开始和结束时称量罗非鱼体重、体长，计算增重率、特定生长率、饵料系数。每个网箱随机选取5尾罗非鱼，计算脏体比、肝体比、脾脏指数。结果如下表3所示，饲喂复方中药对罗非鱼增重率和饵料系数、及其其他
指标均没有显著性影响，复方中药不影响罗非鱼的生长性能。
表3不同水平复方中药对罗非鱼生长性能的影响
备注：表中同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
(4)于结束投喂后的第一天，每个网箱随机选取5尾罗非鱼尾静脉采血，待血清析出后，于4度，4000r/min离心20min，析出血清-80度保存，检测血清中SOD、CAT、GSH-Px、iNOS、T-AOC的活性以及MDA含量。结果如下表4所示，复方中药显著提高血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶活力(CAT)，显著降低MDA含量，提高了血清溶菌酶活力。
表4不同水平复方中药对罗非鱼血清抗氧化活性指标的影响
备注：*表示与对照差异显著。
(5)于结束投喂后的第一天，随机采集饲喂2％复方中药组5条罗非鱼的肝脏、肾脏、鳃、脾组织，提取肝脏、肾脏、鳃、脾组织RNA，反转录cDNA，以罗非鱼L32基因为内参，分别测定罗非鱼肝脏、肾脏、脾组织抗病因子-主要组织相容性复合物MHC-2a,MHC-2b表达水平。如图1所示，饲喂2％剂量复方中药脾脏组织MHC-2b基因的表达水平相较于对照组显著性提高(p<0.05)。饲喂2％剂量复方中药肾脏组织MHC-2a基因的表达水平相较于对照组提高了3.86倍。
实施例16
本实施例提供的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂在制备具有抑制罗非鱼链球菌功效的药物中的应用。具体过程如下：
(1)采用实施例6中的复方中药制剂，分别以罗非鱼基础饲料总质量的2％、4％和6％的添加量添加至罗非鱼基础饲料中，制成罗非鱼饲料，于结束饲喂后的第一天，随机抽取各个网箱10尾鱼，腹腔注射2LD50剂量的无乳链球菌(5×108cfu/mL)，观察15d，每天记录各个网箱罗非鱼死亡率，连续充气，定期换水。试验结束后，计算相对保护率，计算公式如下：相对保护率(％)＝(对照组死亡率—中药组死亡率)/对照组死亡率×100％。
(2)由表5中的结果可见，添加复方中药对罗非鱼的相对保护率在52.17～86.96％之间，显著提高了罗非鱼的存活率。
表5不同水平复方中药对罗非鱼保护率结果
实施例17
本发明提供了复方中草药制剂能有效抑制罗非鱼常见病原菌的方法，步骤如下：
(1)100μL嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌(1×108cfu/mL)均匀涂布在THB平板上，并将平板均分为三等分，每一等分各放一牛津杯，分别加入复方中药(实施例6中配方)、氟苯尼考阳性对照和0.85％灭菌生理盐水阴性对照。放入37℃温箱培养过夜，次日量取抑菌圈直径。
(2)取15×100mm灭菌有棉塞的试管10支，编号排列在试管架上。于每管先加入无菌脑心浸萃液态培养基2.0mL，然后于第1管中加入灭菌的受试中药煎剂2.0mL，混匀后取出2.0mL放入第2管中，依次类推。直到第8管取出2.0mL弃去，配成含中药提取物分别为两倍稀释的各种浓度的液体。第9管不加药物作为对照，以便观察培养基是否适合于细菌生长及检查。第10管加受试中药煎剂2.0mL混匀取出2.0mL弃去，不加细菌，以便观察受试中药是否受污染。混匀后，将平板活菌计数过的脑心浸萃液态培养基培养的实验菌液稀释成1.0×108cfu/mL，取0.1mL分别加入上述1-9管中，混匀后一起放入37℃恒温水浴摇床中培养过夜观察最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。
(3)结果如下表6中所示，复方中药对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌均有良好的抑菌效果，有效抑菌直径在17mm以上，MIC在15.6mg/mL以下。
表6实施例6中的复方中药对气单胞菌体外抑菌试验
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，其特征是主要由以下质量份配比的原料制成：
五倍子1～20、石榴皮1～20、苏木1～20、丹参1～20。
2.根据权利要求1所述的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，其特征是：各原料的质量份配比为五倍子5～20、石榴皮5～20、苏木5～20、丹参5～20。
3.根据权利要求2所述的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂，其特征是：各原料的质量份配比为五倍子20、石榴皮5、苏木20、丹参5。
4.权利要求1-3任一项所述的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂的制备方法，其特征是含以下步骤：按用量关系取各原料，加水煎煮多次后，合并煎煮液，过滤后合并滤液，浓缩至生药含量为0.5～1.5g/mL。
5.权利要求1-3任一项所述的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂在制备具有抑制嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌和罗非鱼链球菌功效的药物中的应用。
6.一种罗非鱼饲料，其特征是含有权利要求1-3任一项所述的能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂和罗非鱼基础饲料。
7.根据权利要求6所述的罗非鱼饲料，其特征是：所述复方中草药制剂的用量为罗非鱼基础饲料总质量的2～6％。
8.权利要求6所述的罗非鱼饲料的制备方法，其特征是包括以下步骤：按用量关系取复方中草药制剂，喷洒至罗非鱼基础饲料上，即制得罗非鱼饲料。
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