CN115804807B - 一种防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物，由如下重量份数的组分组成：黄连20‑40份、秦皮20‑30份、赤芍20‑30份、前胡10‑20份、玄参10‑20份、款冬10‑20份。本发明还公开了上述中药复方组合物的制备方法与应用。试验证明，本中药复方组合物具有较强的体外抑菌和杀菌效果，并且能较好地控制绵羊肺炎支原体对小鼠的感染和致病性，临床上用于防治绵羊肺炎支原体的感染和致病，安全绿色、药效好，无毒副作用，而且使用方便。

Description

一种防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物及其制备方法与 应用

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物及其制备方法与应用。

背景技术

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)可以引起绵羊、山羊发生纤维素性胸膜肺炎，其感染率极高。虽然绵羊支原体肺炎的死亡率低，但是羊只发病后免疫力降低，容易引起羊生长性能和生产性能下降，混合感染增加，严重影响着养羊业的健康快速发展。随着目前消费者对羊肉和羊奶需求量的不断增加，我国集约化大规模羊场逐渐增加。高密度饲养环境更加加速了羊呼吸道疾病的发展，其中绵羊支原体肺炎的发病率占比最高，给我国养羊业带了巨大经济损失。养殖场在预防和治疗该病中大量广泛使用抗生素类药物，这不仅引起羊群抵抗力下降，发病率提高，还造成严重的耐药性问题，动物产品中抗生素的残留对消费者的健康造成潜在的危害，还严重影响着生态环境的健康。

中草药是我国传统的药物，具有资源丰富、成本低、无残留、毒副作用低等多种优点。因此，筛选高效、安全、低毒、无耐药性的抗绵羊肺炎支原体中药组合物是有效预防和控制绵羊支原体肺炎的关键。但目前尚无特异性的高效中药组合物用于防治绵羊支原体肺炎。

因此，研发一种低毒高效、安全、无耐药性的中药抗菌组合物以预防和控制绵羊肺炎，抑制绵羊肺炎支原体的感染和致病性，扶正防变，提高机体的抵抗力受到广泛重视。但目前尚无针对性的有效的中药组合物用于防治绵羊肺炎。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高效防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物。

本发明还要解决的一个技术问题是提供上述中药复方组合物的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述中药复方组合物的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物，由如下重量份数的组分组成：

黄连20-40份，

秦皮20-30份，

赤芍20-30份，

前胡10-20份，

玄参10-20份，

款冬10-20份。

优选地，上述防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物，由如下重量份数的组分组成：

黄连30份，

秦皮25份，

赤芍25份，

前胡15份，

玄参15份，

款冬12份。

黄连性寒，清热燥湿，导热下行，为君药，秦皮清热泻火，燥湿化痰，赤芍清营凉血，活血祛瘀，均为辅药，佐以前胡清肺化痰，玄参滋阴润肺，清热祛痰，款冬花润肺化痰，止咳平喘。

上述防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物的制备方法，将配方量的黄连、秦皮、赤芍、前胡、玄参、款冬分别干燥、粉碎、过筛后混匀，加水煎煮即得。

其中，优选地是，加10～30倍重量的水，最优选地是，加20倍重量的水。

其中，优选地是，煎煮浓缩至药液浓度达到0.5～2g/mL(所述浓度为中药原料质量与浓缩后的药液体积之比，以下相同)；最优选的是，煎煮浓缩至药液浓度达到1g/mL。

上述中药复方组合物在制备抑制或者杀灭绵羊肺炎支原体药物中的应用也在本发明的保护范围内。

上述中药复方组合物在制备预防或者治疗绵羊支原体肺炎药物中的应用也在本发明的保护范围内。

具体地，所述中药复方组合物的饲喂量为0.5～2mL BW％/d(即每天0.5-2mL/100gBW)。

有益效果：本发明提供的防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物，根据中兽医药学辨证理论和配伍禁忌原则为依据，采用上述有效药物成分相互配伍组合，具有清热燥湿、滋阴清肺、宣肺化痰、止咳平喘之功效，达到防治湿毒肺热咳喘的目的，可抑制和杀灭绵羊肺炎支原体，有效预防和治疗绵羊肺炎支原体引发的呼吸道疾病。其成本低、效力高、绿色安全、无残留、生产和使用方便等优点。

附图说明

图1中药复方组合物抗绵羊肺炎支原体的MIC值。

图2中药复方组合物抗绵羊肺炎支原体的MBC值。

图3中药复方组合物对小鼠感染绵羊肺炎支原体后肺脏病变的影响。

图4中药复方组合物对小鼠感染绵羊肺炎支原体后肺脏中DNA拷贝数的影响。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件、动物试验及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：中药复方抗绵羊肺炎支原体的具体药效学试验：

1.实验用菌株：绵羊肺炎支原体标准菌株Y98由本实验室保存。

2.中药复方的制备方法如下：

组方1：黄连30g、秦皮25g、白头翁25g、桔梗15g、鱼腥草15g；

组方2：黄连30g、秦皮25g、赤芍25g、前胡15g、玄参15g、款冬12g；

组方3：秦皮30g、金银花25g、鱼腥草25g、穿心莲15g、桔梗15g；

以上3个组方的配伍原则如下：

组方1：黄连清热燥湿，为君药，秦皮清热燥湿化痰，白头翁清热凉血，均为辅药，桔梗清化热痰，鱼腥草清肺止咳化痰，均为佐药。

组方2：黄连性寒，清热燥湿，导热下行，为君药，秦皮清热泻火，燥湿化痰，赤芍清营凉血，活血祛瘀，均为辅药，佐以前胡清肺化痰，玄参滋阴润肺，清热祛痰，款冬花润肺化痰，止咳平喘。

组方3：秦皮清热泻火，燥湿化痰，为君药，金银花清热解毒，鱼腥草清肺止咳化痰，均为辅药，桔梗清化热痰，穿心莲清热泻火，均为佐药。

每个组方准确称取各味中药，打粉后用20倍量开水溶解，再煎煮浓缩至药物煎液浓度为1g/mL，用0.45μm微孔滤膜过滤后分装于10mL无菌聚丙烯离心管，用封口膜封口，4℃保存备用。

培养基配制：支原体基础培养基基础中加5％-20％(g/mL)牛血清、0.4％(g/mL)酚红及青霉素(不高于2000U)，调整pH值至7.6，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得，4℃保存备用。支原体基础培养基基础为支原体基础培养基基础HB7025(青岛高科园海博生物技术有限公司)。

4.工作菌液的制备：将冻干的羊肺炎支原体菌株加到培养基中，置37℃恒温培养箱中培养5天，使其连续传代，取第三代变黄的生长菌液，绵羊肺炎支原体菌株浓度为1×10⁸CCU/mL，用培养基10倍系列稀释至1×10⁴CCU/mL，作为工作菌液。

5.MIC(Minimum inhibitory concentration，最小抑菌浓度)值测定：

向无菌96孔细胞培养板的第1孔中加入培养基150μL，第2-12孔中各加入正常培养基100μL；然后向第1孔加入中药复方煎液50μL，混匀后用从第1孔中吸取100μL至第2孔，同样方法从第2孔中吸取100μL至第3孔，依次用微量加样器从第1孔开始二倍系列稀释药液至第10孔，混匀后于第10孔吸取100μL弃去；然后向第1～11孔中分别加入工作菌液100μL，第12孔加入培养基100μL，使得所有孔的液体总体积为200μL，第11孔为阳性对照孔(即生长对照孔)，第12孔为阴性对照孔；药物的终浓度从第1～10孔依次为(单位：mg/mL)125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12mg/mL，每孔滴入无菌液体石蜡油密封，盖上板盖，封口膜封口，置于恒温培养箱内37℃培养。

6.通过培养基的颜色变化来判定结果：

培养基由红色变为黄色或橘黄色且无混浊时，说明有支原体生长，且无污染。培养观察结果，当阳性对照孔(第11孔)颜色由红色变为黄色或橘黄色，且无混浊(同时第12孔阴性对照孔颜色透亮且为红色)时，此时加药孔不再发生颜色变化孔的药物浓度即为最小有效抑制绵羊肺炎支原体生长的药物浓度(最小抑菌浓度，MIC)。实验重复3次(见图1)。

7.支原体药敏判断标准：目前，国内外对中药复方抗支原体的最小抑菌浓度(MIC)仍无统一标准，故以同类试验文献报道的判断标准为依据对MIC进行判定，即MIC≤7.81mg/mL(以生药计)时为敏感，MIC为7.81-250mg/mL(以生药计)时为中度敏感，当MIC＞250mg/mL(以生药计)时为不敏感。

8.由图1可知，三个组方均有体外抑制绵羊肺炎支原体生长繁殖的作用，MIC平均值分别为13.02、3.26和26.04mg/mL，其中组方2对绵羊肺炎支原体的抑制作用最佳，为敏感，组方1抑菌效果较组方3好，均为中度敏感。

9.MBC(Minimum bactericidal concentration，最小杀菌浓度)值测定：

将MIC测定孔中没有发生颜色变化的各加药孔培养液吸取50μL至1.5mL无菌聚丙烯离心管中，再向离心管中加入培养基500μL，使得所有离心管的液体总体积为600μL，同时做一支绵羊肺炎支原体培养基的阴性对照管和接种绵羊肺炎支原体的阳性对照管(即生长对照孔)。将离心管置于恒温培养箱内37℃连续培养7天，观察各离心管中培养基颜色变化，由红色变为黄色或橘黄色且无混浊时，说明有支原体生长，且无污染。此时不再发生颜色变化的离心管对应的MIC测定孔中药物浓度即为绵羊肺炎支原体的最小杀菌药物浓度(即最小杀菌浓度，MBC)。实验重复3次(见图2)。

10.由图2可知，三个组方对绵羊肺炎支原体均具有较好的杀灭效果，三个中药组方的MBC平均值依次为20.83、7.81和52.08mg/mL，其中组方2的杀菌效果最强。

实施例2：

1.动物实验

选用4周龄健康断奶小鼠(公母各半)，随机分为3组，分别为对照组，试验组1和试验组2。每组10只(公母各半)，编号、称重、自由采食和饮水，按常规程序进行管理。试验组1和试验组2小鼠均滴鼻1×10⁸CCU/mL绵羊肺炎支原体40μL感染绵羊肺炎支原体，对照组小鼠滴鼻培养基40μL。感染后第5天开始试验组1小鼠灌服1mL BW％/d剂量中药组合物(实施例1的中药组方2)，对照组和试验组2小鼠均灌服生理盐水。于服药9天后将对照组，试验组1和试验组2小鼠全部处死，剖检观察肺部病理变化。

2.中药组方对小鼠感染绵羊肺炎支原体后肺脏病变和肺脏中绵羊肺炎支原体DNA拷贝数的影响

(1)小鼠感染绵羊肺炎支原体后肺脏病变。

图3显示，对照组的肺组织呈粉红色，正常；试验组1小鼠的肺组织右肺有少量实变，其它肺叶均呈粉红色；而试验组2小鼠的整个左肺完全实变，右肺组织正常，表明中药组方可以对绵羊肺炎支原体有明显的抑制作用，显著降低绵羊肺炎支原体对小鼠的感染和致病性。

(2)小鼠肺脏中绵羊肺炎支原体的DNA拷贝数

试验结束后采集小鼠肺组织，采用荧光定量PCR检测肺组织中绵羊肺炎支原体DNA拷贝数。根据标准曲线换算，由图4可知，试验组1小鼠的肺脏组织绵羊肺炎支原体DNA拷贝数为10^1.91个，均低于2.1；试验组2小鼠肺脏组织绵羊肺炎支原体DNA拷贝数为10^3.89个，均大于3.5，显著高于试验组1(P<0.05)，对照组小鼠肺组织中没有检测到绵羊肺炎支原体DNA拷贝数。

本发明提供了一种防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物，其特征在于，由如下重量份数的组分制成：

黄连30份，

秦皮25份，

赤芍25份，

前胡15份，

玄参15份，

款冬12份。

2.权利要求1所述的防治绵羊支原体肺炎的中药复方组合物的制备方法，其特征在于，将配方量的黄连、秦皮、赤芍、前胡、玄参、款冬分别干燥、粉碎、过筛后混匀，加水煎煮即得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，加10~30倍重量的水。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，加20倍重量的水。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，煎煮浓缩至药液浓度达到0.5~2g/mL。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，煎煮浓缩至药液浓度达到1g/mL。

7.权利要求1所述的中药复方组合物在制备抑制或者杀灭绵羊肺炎支原体药物中的应用。

8.权利要求1所述的中药复方组合物在制备预防或者治疗绵羊支原体肺炎药物中的应用。