CN103250741A - 一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法 - Google Patents

一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103250741A
CN103250741A CN2013100676931A CN201310067693A CN103250741A CN 103250741 A CN103250741 A CN 103250741A CN 2013100676931 A CN2013100676931 A CN 2013100676931A CN 201310067693 A CN201310067693 A CN 201310067693A CN 103250741 A CN103250741 A CN 103250741A
Authority
CN
China
Prior art keywords
genseng
preparation
endogenetic polymexa
bacillus
polymexa bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013100676931A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103250741B (zh
Inventor
郜玉钢
张连学
臧埔
卢宗志
祝彦海
赵岩
杨鹤
王玉方
李�学
赵雪亮
李丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Agricultural University
Original Assignee
Jilin Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Agricultural University filed Critical Jilin Agricultural University
Priority to CN201310067693.1A priority Critical patent/CN103250741B/zh
Publication of CN103250741A publication Critical patent/CN103250741A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103250741B publication Critical patent/CN103250741B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域,具体公开了一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法。本发明所用菌种为人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7250。本发明方法包括：人参内生多粘类芽孢杆菌菌种培养，种子液制备，发酵液制备，成品制备。本发明生物防治菌剂生产操作简单、成本低、菌体发酵完全、芽孢形成率高，为人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养和开发利用打下坚实基础。

Description

一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法
技术领域
本发明涉及一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法，属生物技术领域。 
背景技术
随着环境压力的增大和人们对健康及食品安全要求的提高,微生物农药受到越来越多的重视。目前,用于生防细菌的种类有:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)等。许多生防细菌产生的拮抗物质,抗菌作用是广谱的。多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)中很多菌株作为重要的生防资源，用于多种植物病害的生物防治，美国环境保护署已将其列为可商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。我国许多学者分离到多个多黏类芽孢杆菌生防菌株，分别对黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、稻瘟病、荔枝霜疫霉病等具有较好地抑制作用,但现已报道的多黏类芽孢杆菌主要分离自土壤，少数为植物内生菌，本发明采用人参内生多粘类芽孢杆菌菌株是从人参植株中分离获得的，该菌株的发酵液对人参黑斑病菌（Alternaria panax Whetz）、 人参锈腐菌（Cylindrocarpon destructans Zinns）、人参菌核病菌（Sclerotinia schinsengWang）、人参立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、人参根腐病菌（Fusarium solani App）及人参细菌性软腐病（Erwinia carotovora subsp）等病原菌具有明显的防病效果，表现了良好的生防前景，为了进一步较好地开发利用该菌株进行植物病害的生物防治，本发明系统研究了该菌株的发酵条件，旨在为该菌株生物农药和制剂的开发提供依据。 
发明内容
本发明提供一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法，该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，用于防治人参、西洋参等植物的病害。该方法可应用在制备防治人参、西洋参等植物病害的菌剂或制剂中。 
本发明所述人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 7250。 
本发明所述人参内生多粘类芽孢杆菌制剂的制备方法：将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25℃-35℃培养24h-48h，进行人参内生多粘类芽孢杆菌菌种活化。挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，培养到OD600值为0.5左右，得种子液。将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比2%接种量，接种入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，芽胞形成85%以上时，得发酵液。将人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液经细菌计数后，调整到108CFU/ml，包装，阴凉避光保存。 
具体实施方式
本发明提供了人参内生多粘类芽孢杆菌制剂的制备方法，本发明领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员是显而易见的，都视为本发明。本发明所述人人参内生多粘类芽孢杆菌制剂的制备方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 
下面结合实施例，进一步阐述本发明。 
实施例1 本发明人参内生多粘类芽孢杆菌生防菌菌剂的制备 
1、菌种：人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 7250。
2、人参内生多粘类芽孢杆菌菌种活化 
将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25℃-35℃培养24h-48h。PDA培养基制备方法：马铃薯洗净去皮后称取200g，切成小块，加蒸馏水煮至沸腾后20-30min（马铃薯能用玻璃棒戳破即可），然后用四层纱布过滤，向滤液中加20g葡萄糖及20g琼脂粉，继续加热至溶解，加蒸馏水至1000ml，115℃下高压灭菌20min。温度降至50℃左右时倒入试管中，制成斜面培养基，凝固后倒置24h无菌生长即可使用。
3、人参内生多粘类芽孢杆菌种子液制备 
    挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，培养到OD600值为0.5左右，得种子液。PDB培养基制备方法：马铃薯洗净去皮后称取200g，切成小块，加蒸馏水煮至沸腾后20-30min（马铃薯能用玻璃棒戳破即可），然后用四层纱布过滤，向滤液中加20g葡萄糖，继续加热至溶解，加蒸馏水至1000ml，温度降至50℃左右时倒入三角瓶中，250ml三角瓶中加50ml培养基，包扎后115℃下高压灭菌20min，冷却后备用。
4、人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液制备 
    （1）培养基优化
将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比2%接种量，分别接种入灭菌的PDB培养基、发酵培养基、NB培养基、LB培养基和YEPD培养基中，每个培养基做4个重复。120rpm/min,25℃，培养48h后测定菌株生物量。
结果见表1，由表1可见，人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液制备的最优培养基为PDB培养基。 
表 1 培养基对菌株生物量的影响 
培养基种类 生物量×1010 ( CFU·mL-1)
PDB培养基 2.9
发酵培养基 2.6
NB培养基 1.3
LB培养基 0.8
YEPD培养基 2.5
（2）最佳发酵温度优化
将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液(OD600=0.5)按体积比2%接种量，接种入灭菌的PDB培养基中，在无菌条件下，分别在20℃、 25℃、30℃、35℃震荡培养，每个温度做4个重复。培养48h后测定OD600。
结果见表2，由表2可见，人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液制备的最优发酵温度为25℃。 
表 2温度对菌株生物量的影响 
温度 生物量×1010 ( CFU·mL-1)
20℃ 2.3
25℃ 3.0
30℃ 2.8
35℃ 2.5
（3）最佳发酵时间优化
将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液(OD600=0.5)按体积比2%接种量，接种入灭菌的PDB培养基中，在无菌条件下，120rpm/min,25℃，分别培养0 h、24 h、48 h、72 h后测定OD600。每个时间做4个重复。
结果见表3，由表3可见，人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液制备的最优发酵时间为48h。 
表 3发酵时间对菌株生物量的影响 
发酵时间(h) 生物量×1010 ( CFU·mL-1)
0 0.04
24 2.1
48 2.9
72 2.6
（4）最佳接菌量优化
将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液(OD600=0.5)分别按体积比0.5%、1%、2%、4%接种量，接种入灭菌的PDB培养基中，在无菌条件下，120rpm/min,25℃，48 h后测定OD600。每个接种量做4个重复。
结果见表4，由表4可见，人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液制备的最优接菌量为2%。 
表 4接菌量对菌株生物量的影响 
接菌量(%) 生物量×1010 ( CFU·mL-1)
0.5 1.7
1 2.1
2 3.0
4 2.6
5、人参内生多粘类芽孢杆菌菌剂成品
将人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液经细菌计数后，调整到108CFU/ml，包装，阴凉避光保存。

Claims (6)

1.一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法，即防治人参、西洋参等植物病害的生物菌剂的制备方法。
2.按权利要求1所述，菌种培养：本发明所用菌种为人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 7250。
3.将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25℃-35℃培养24h-48h，活化人参内生多粘类芽孢杆菌菌种。
4.按权利要求1所述，种子液制备：挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，培养到OD600值为0.5左右，得种子液。
5.按权利要求1所述，发酵液制备：将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比2%接种量，接种入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min，25℃培养24h-48h，芽胞形成85%以上时，得发酵液。
6.按权利要求1所述，人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂成品：将人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液经细菌计数后，调整到108CFU/ml，包装，阴凉避光保存。
CN201310067693.1A 2013-03-05 2013-03-05 一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法 Expired - Fee Related CN103250741B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310067693.1A CN103250741B (zh) 2013-03-05 2013-03-05 一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310067693.1A CN103250741B (zh) 2013-03-05 2013-03-05 一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103250741A true CN103250741A (zh) 2013-08-21
CN103250741B CN103250741B (zh) 2015-02-18

Family

ID=48955255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310067693.1A Expired - Fee Related CN103250741B (zh) 2013-03-05 2013-03-05 一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103250741B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663528A (zh) * 2017-04-10 2018-02-06 吉林农业大学 一种Cu2+离子促进多粘类芽孢杆菌转化人参皂苷的方法
CN107711890A (zh) * 2017-07-27 2018-02-23 上海万力华生物科技有限公司 一种多粘类芽孢杆菌杀菌水剂及其制备方法
CN108034614A (zh) * 2018-01-19 2018-05-15 吉林农业大学 一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法
CN110218109A (zh) * 2019-04-30 2019-09-10 黑龙江省科学院自然与生态研究所 一种优质蔓越莓生长调控剂及其制备方法和使用方法
CN114891684A (zh) * 2022-05-27 2022-08-12 长春中医药大学 一种多粘芽孢杆菌及其微生物固体菌剂的制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101407800A (zh) * 2008-11-19 2009-04-15 淮海工学院 来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶及其方法
CN101928680A (zh) * 2009-11-19 2010-12-29 无锡亚克生物科技有限公司 简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41及其应用
CN102250815A (zh) * 2011-07-21 2011-11-23 中国热带农业科学院香料饮料研究所 一种内生多粘类芽孢杆菌
CN102676435A (zh) * 2012-05-24 2012-09-19 福建师范大学福清分校 用于拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101407800A (zh) * 2008-11-19 2009-04-15 淮海工学院 来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶及其方法
CN101928680A (zh) * 2009-11-19 2010-12-29 无锡亚克生物科技有限公司 简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41及其应用
CN102250815A (zh) * 2011-07-21 2011-11-23 中国热带农业科学院香料饮料研究所 一种内生多粘类芽孢杆菌
CN102676435A (zh) * 2012-05-24 2012-09-19 福建师范大学福清分校 用于拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周如军等: "人参锈腐病拮抗生防菌的筛选与鉴定", 《沈阳农业大学学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663528A (zh) * 2017-04-10 2018-02-06 吉林农业大学 一种Cu2+离子促进多粘类芽孢杆菌转化人参皂苷的方法
CN107711890A (zh) * 2017-07-27 2018-02-23 上海万力华生物科技有限公司 一种多粘类芽孢杆菌杀菌水剂及其制备方法
CN108034614A (zh) * 2018-01-19 2018-05-15 吉林农业大学 一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法
CN108034614B (zh) * 2018-01-19 2022-05-27 吉林农业大学 一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法
CN110218109A (zh) * 2019-04-30 2019-09-10 黑龙江省科学院自然与生态研究所 一种优质蔓越莓生长调控剂及其制备方法和使用方法
CN114891684A (zh) * 2022-05-27 2022-08-12 长春中医药大学 一种多粘芽孢杆菌及其微生物固体菌剂的制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103250741B (zh) 2015-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103215210B (zh) 一种西姆芽孢杆菌及其在制备微生物海藻肥料中的应用
CN102533617B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN104498369B (zh) 一种木霉菌及含有该菌的菌剂和它们在防治人参锈腐病中的应用
CN103509740B (zh) 一种用于防治作物镰刀菌病害的绿针假单胞菌及其应用
CN105820981B (zh) 一株高地芽孢杆菌菌剂的制备及应用
CN104531559A (zh) 解淀粉芽孢杆菌Lh-1及其应用
CN103642705B (zh) 一株抑制真菌的梅奇酵母菌及其应用
CN104531545A (zh) 一株萎缩芽孢杆菌株dppg-28及其在作物病害防治方面的应用
CN106754493A (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN103224904B (zh) 红假单胞菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及相应的制备方法和在防治辣椒疫病中的应用
CN103250741B (zh) 一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法
CN103103149A (zh) 土壤枯草芽孢杆菌菌株s001及其菌剂的制备方法和应用
CN107523524A (zh) 一种防治番茄黄萎病的复合菌剂及其制备方法和应用
CN104877926A (zh) 一株拮抗黄栌枯萎病菌的菌株及其应用
CN106434445A (zh) 一种枯草芽孢杆菌bs01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用
CN106701623A (zh) 一株拮抗枸杞根腐病的萎缩芽孢杆菌及其应用
CN104017748B (zh) 内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用
CN105907669A (zh) 一株产挥发性抑菌气体的拮抗菌的筛选、鉴定及应用
CN105349455A (zh) 一株马来西亚链霉菌及其应用
CN102994419A (zh) 一种短小芽孢杆菌lnxm12及其应用
CN105132294B (zh) 一种链格孢菌及其在铁皮石斛抗叶斑病中的应用
CN102719363B (zh) 加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液的制备方法
CN103614306A (zh) 一株酵母菌株及其应用
CN103060234A (zh) 防治重楼根腐病的生防菌株kmxu28及其生防菌剂
CN102443559B (zh) 一株用于防治棉花黄萎病的芽孢杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150218