CN105907669A - 一株产挥发性抑菌气体的拮抗菌的筛选、鉴定及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株产挥发性抑菌气体的拮抗菌株12a及其在防治果蔬病害中的应用。本发明公开的拮抗菌株12a为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，保藏号为CGMCC No.12179。本发明的拮抗菌株12a是在未施用化肥农药的肥城桃园中采集桃树根际土壤分离获得的，其发酵液中产生的挥发性抑菌气体对桃褐腐病(Monilinia fructicola)具有强拮抗作用，同时对链格孢菌(Alternaria mali)引起的苹果褐斑病、由长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis.Et Halsted)引起的甘薯黑斑病、由青霉菌(Penicillium italicum Wehmer)引起的柑橘青霉病和由细交链格孢(Alternaria alternata)引起的冬枣黑斑病也有明显的抑制作用，可以有效防治多种果蔬病害，是一种生防效果好、无污染、防治范围广、安全生态的生物防治潜力菌株，有广阔的市场应用前景。

Description

一株产挥发性抑菌气体的拮抗菌的筛选、鉴定及应用
(一)技术领域
本发明涉及微生物和生物防治领域中的一种拮抗菌的筛选、鉴定和应用，特别是涉及产生挥发性抑菌气体的菌液熏蒸在防治果蔬采后病害中的应用。
(二)背景技术
果蔬采后病害导致的巨大损失已成为全球性的问题。目前，控制果蔬采后病害的主要手段是使用化学杀菌剂，虽然取得较好的防治效果，但是长期使用化学杀菌剂，使病菌产生了抗药性，降低了药剂的防病效果，最终导致化学杀菌剂的使用剂量及其化学残留量大大加重，对人类的健康威胁也加大。因此，迫切需要寻求一些新的、安全高效的防腐技术，来逐步减少化学杀菌剂在采后果蔬上的使用。
借鉴采前作物病害生物防治的思路，人们提出了果蔬采后病害生物防治的设想。生物防治具有不污染环境、无农药残毒、不产生抗药性、处理费用低廉等优点，受到人们的广泛关注。利用拮抗菌控制果蔬采后病害的研究工作始于20世纪80年代，经过10多年的研究已从实验室走向商业化应用，许多研究都证明利用拮抗微生物来控制病害是一项具有潜力的新兴技术。本实验通过研究拮抗菌对采后果蔬病原菌和病害的抑制作用，为实现安全无毒的果蔬采后保鲜提供新方法。
从土壤中分离筛选出拮抗菌株通过菌液中产生的挥发性抑菌气体熏蒸的方法来有效防治果蔬采后病害的技术并不多见，该方法简便高效，可减少采后病害带来的巨大损失，有利于在生产实践中推广应用。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一株能够产生挥发性抑菌气体的拮抗菌株12a，经16S rDNA序列比对鉴定为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，该菌株已于2016年03月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保存登记，保存地址为北京市北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.12179，建议分类命名为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。用该菌株体外产生的挥发性气体控制多种常见的果蔬采后病害，具有安全高效、操作简便的优点。
本发明所采取的技术方案如下。
本发明的拮抗菌株12a的分离筛选方法为：
1、在未施用化肥农药的桃园中采集桃树根际土壤，采用稀释分离法，做好一系列的土壤稀释液10-1、10-2、10-3、10-4，用移液枪分别吸取10-2、10-3、10-4土壤稀释液0.1mL加到NA培养基平板上，用无菌涂布器涂匀，标明编号，放置一小时后将培养皿反转，于37℃中培养。
2、从培养的第二天起，根据菌落形态等特点挑选细菌单菌落，分别移接到NA培养基上，培养48h后用于后续试验。经纯化的菌株于NA斜面培养基上，4℃保存。
3、采用平板对扣法筛选拮抗菌。在PDA平板中央接种桃褐腐菌菌饼，在NA平板中央接种分离的细菌菌饼，将接有菌的培养皿去盖、对扣(接有细菌的放在下方，接有桃褐腐菌的放在上方)、密封，每个处理3皿。室温下培养96h，以不接种细菌的平板作对照，测定其抑菌率。筛选出对桃褐腐菌具有较强拮抗作用的拮抗菌株12a。
本发明的拮抗菌株12a在防治多种果蔬采后病害上的应用的步骤包括：
用振荡培养48h的1000mL拮抗菌菌液熏蒸果实20～30min，将熏蒸过的果实取出室温放置，每果刺1个3mm×3mm×3mm的伤口，再分别接种1×104cfu/mL的相应病原菌的孢子悬浮液20μL，之后在20±1℃贮藏观察。
上述的防治果蔬采后病害的应用中，所述果实为肥城白里桃、元帅苹果、砂糖橘、甘薯苏薯8号、沾化冬枣。
上述的防治果蔬采后病害的应用中，所述果实为处于生理成熟期，无机械伤害，无病虫害，大小均一的果实。
本发明的有益效果在于：
选用拮抗菌菌液产生的挥发性抑菌气体熏蒸果实，此法操作简单、安全性高、对果蔬无残留毒性，具有很高的应用价值。
在处理和贮藏中不使用任何有毒试剂，能高效防治多种果实采后病害，具有广阔的市场前景。
提供一种新型、安全、高效的拮抗菌株，可用于肥城白里桃、砂糖橘、甘薯苏薯8号和沾化冬枣等多种果实采后病害的防治。
(四)附图说明
图1是基于菌株12a的16S rDNA构建的系统发育树。
图2为肥城白里桃未经拮抗菌液熏蒸处理和经拮抗菌菌液熏蒸处理后，贮藏第4天的效果图片。
图3为砂糖橘未经拮抗菌菌液熏蒸处理和经拮抗菌菌液熏蒸处理后，贮藏第5天的效果图片。
图4为沾化冬枣未经拮抗菌菌液熏蒸处理和经拮抗菌菌液熏蒸处理后，贮藏第5天的效果图片。
(五)具体实施方式
下面结合附图表和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
实施例1：拮抗菌株12a的筛选
在未施用化肥农药的桃园中采集桃树根际土壤，采用稀释分离法，做好10-1、10-2、10-3和10-4的土壤稀释液，用移液枪分别吸取10-2、10-3和10-4的土壤稀释液0.1mL加到NA培养基平板上，用无菌涂布器涂匀，标明编号，放置一小时后将培养皿反转，于37℃中培养。从培养的第二天起，根据菌落形态等特点挑选细菌单菌落，分别移接到NA培养基上，培养48h后用于后续试验。经纯化的菌株于NA斜面培养基上，4℃保存。
采用平板对扣法筛选拮抗菌。在PDA平板中央接种桃褐腐菌菌饼，在NA平板中央接种分离的细菌菌饼，将接有菌的培养皿去盖、对扣(接有细菌的放在下方，接有桃褐腐菌的放在上方)、密封，每个处理3皿。室温下培养96h，以不接种细菌的平板作对照，测定其抑菌率。其中，抑菌率(％)＝(对照菌落直径-对峙菌落直径)/对照菌落直径×100。结果表明，拮抗菌12a对桃褐腐菌的的抑制效果最明显，抑菌率可达80.23％。
经过菌种鉴定后，对16S rDNA序列在ncbi核糖体数据库上比对，选择亲缘关系远近不同的16S rDNA序列做系统发育树，12a被鉴定为死谷芽孢杆菌，与Bacillus vallismortis NBRC 101236T(AB681417)有最高的同源性，同源性达99％以上。该菌株已于2016年03月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保存登记，建议分类命名为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，保存地址为北京市北辰西路1号院3号。
实施例2：在防治桃褐腐病上的应用
将保存的拮抗菌12a接种到1000mL NB液体培养基中振荡培养48h后，在密封罐的隔板下层倒置菌液(对照下层无菌液)，上层放置肥城白里桃，用凡士林密封罐盖，熏蒸20min后将果实取出。为使染菌量均一，每果刺1个3mm×3mm×3mm的伤口，再分别接种1×104cfu/mL的桃褐腐菌的孢子悬浮液20μL，将上述处理的果实于20±1℃保湿贮藏，每隔24h测量病斑直径，计算抑菌率，详情见表1。每次每个处理20个果实，该试验重复三次。
生长抑制率＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100％
实施例3：在防治苹果黑斑病上的应用
将保存的拮抗菌12a接种到1000mL NB液体培养基中振荡培养48h后，在密封罐的隔板下层倒置菌液(对照下层无菌液)，上层放置元帅苹果，用凡士林密封罐盖，熏蒸20min后将果实取出。为使染菌量均一，每果刺1个3mm×3mm×3mm的伤口，再分别接种1×104cfu/mL的苹果链格孢菌的孢子悬浮液20μL，将上述处理的果实于20±1℃保湿贮藏，每隔24h测量病斑直径，计算抑菌率，详情见表1。每次每个处理20个果实，该试验重复三次。
生长抑制率＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100％
实施例4：在防治柑橘青霉病上的应用
将保存的拮抗菌12a接种到1000mL NB液体培养基中振荡培养48h后，在密封罐的隔板下层倒置菌液(对照下层无菌液)，上层放置砂糖橘，用凡士林密封罐盖，熏蒸20min后将果实取出。为使染菌量均一，每果刺1个3mm×3mm×3mm的伤口，再分别接种1×104cfu/mL的柑橘青绿霉的孢子悬浮液20μL，将上述处理的果实于20±1℃保湿贮藏，每隔24h测量病斑直径，计算抑菌率，详情见表1。每次每个处理8个果实，该试验重复三次。
生长抑制率＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100％
实施例5：在防治甘薯黑斑病上的应用
将保存的拮抗菌12a接种到1000mL NB液体培养基中振荡培养48h后，在密封罐的隔板下层倒置菌液(对照下层无菌液)，上层放置甘薯，用凡士林密封罐盖，熏蒸30min后将果实取出。每果刺3个3mm×3mm×3mm的伤口，再分别接种1×104cfu/mL的长喙壳菌的孢子悬浮液20μL，将上述处理的果实于20±1℃保湿贮藏，每隔24h测量病斑直径，计算抑菌率，详情见表1。每次每个处理8个果实，该试验重复三次。
生长抑制率＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100％
实施例6：在防治采后沾化冬枣褐斑病上的应用
将保存的拮抗菌12a接种到1000mL NA液体培养基中振荡培养48h后，在密封罐的隔板下层倒置菌液(对照下层无菌液)，上层放置沾化冬枣，用凡士林密封罐盖，熏蒸20min后将果实取出。将上述处理的果实于20±1℃保湿贮藏，每天观察一次，计算自然发病率，详情见表1。每次每个处理40个果实，该试验重复三次。
表1拮抗菌12a对多种果蔬采后病害的控制效果
注：每一列的不同字母(a,b)表示同一种果蔬处理和对照间在P<0.05水平上有显著性差异。
由表1可见，未经拮抗菌12a菌液熏蒸的肥城白里桃、元帅苹果、砂糖橘、甘薯苏薯8号和沾化冬枣 在第2天发病率分别达到37.5％、10％、12.5％、20％和32.5％，而经菌液熏蒸处理的果实第3天才开始发病，而且发病率和病斑直径显著小于对照处理，有较高的抑菌率，说明拮抗菌12a菌液熏蒸可以抑制桃褐腐病、砂糖橘青霉病、甘薯黑斑病和冬枣褐斑病的发病率，抑制病斑扩展，可以有效延缓采后病害的发生，减轻采后病害的侵染情况。
综上所述，本发明提供的可产生挥发性抑制气体的拮抗菌对肥城桃褐腐病、柑橘青绿霉病、甘薯黑斑病、沾化冬枣的采后病害均有较强的拮抗作用，可有效控制多种果实的采后病害，在该领域具有广阔的应用前景。

Claims (9)

1.一株产挥发性抑菌气体的拮抗菌株12a，经16S rDNA鉴定为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。该菌株于2016年3月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了登记和检测，保藏号为：CGMCC No.12179。
2.根据权利要求1所述拮抗菌株12a的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：拮抗菌株的分离纯化和筛选。
3.根据权利要求2所述拮抗菌株12a的筛选方法，其特征在于，所述的拮抗菌的分离纯化包括：在未施用化肥农药的桃园中采集桃树根际土壤，采用稀释分离法，用移液枪分别吸取不同浓度的土壤稀释液加到NA培养基平板上，用无菌涂布器涂匀，标明编号，放置一小时后将培养皿反转，于37℃中培养。从培养的第二天起，根据菌落形态等特点挑选细菌单菌落，分别移接到NA培养基上，培养48h后用于后续试验。经纯化的菌株于NA斜面培养基上，4℃保存。
4.根据权利要求2所述拮抗菌株12a的筛选方法，其特征在于，所述的拮抗菌的筛选包括：采用平板对扣的方法筛选拮抗菌。在PDA平板中央接种桃褐腐菌菌饼，在NA平板中央接种分离的细菌菌饼，将接有菌的培养皿去盖、对扣(接有细菌的放在下方，接有桃褐腐菌的放在上方)、密封，每个处理6皿。室温下培养96h，以不接种细菌的平板作对照，测定其抑菌率。筛选出对桃褐腐菌具有较强拮抗作用的拮抗菌株12a。
5.根据权利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的应用，其特征在于，步骤如下：用振荡培养48h的1000mL菌液产生的挥发性气体熏蒸果实20～30min后，进行处理，然后贮藏。
6.根据权利要求1所述拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的应用，其特征在于，所述处理步骤为将熏蒸过的果实取出室温放置，每果刺1个3mm×3mm×3mm的伤口，再分别接种1×105cfu/mL的相应病原菌的孢子悬浮液20μL。
7.根据权利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的应用，其特征在于，所述贮藏温度为20±1℃。
8.根据权利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的应用，其特征在于，所述果蔬为肥城白里桃、元帅苹果、砂糖橘、甘薯苏薯8号和沾化冬枣。
9.根据权利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的应用，其特征在于，所述果蔬为处于生理成熟期，无机械伤害，无病虫害，大小均一的果蔬。
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