CN113151094A - 一种产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）XK29，于2021年4月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61592。本发明还公开了一种熏蒸制剂的制备方法，包括：将菌株XK 29在LB培养基上活化；从活化的平板上挑取XK 29单菌落，接入LB液体培养基中进行培养，得到XK 29菌悬液；将小麦粒洗净后煮沸，用纱布过滤，将水沥干，进行灭菌处理，得到麦粒固体培养基；在所得麦粒固体培养基中，接种所得XK 29菌悬液后培养。本发明特基拉芽孢杆菌XK29产生的挥发性气体对植物病原菌有强烈的拮抗作用，可显著抑制其致病力，可远距离防治植物病原菌。

Description

一种产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌及其应用，属于微生物应用技术及生物防治领域。

背景技术

甘薯是一种营养丰富、用途广泛的重要粮食作物，在全球广泛种植。甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)侵染引起的黑斑病是甘薯生产中的一种破坏性病害，在甘薯产区广泛分布，在长途运输和采后贮藏过程中极易染病。染病甘薯产生黑斑和苦味，积累毒素，严重影响甘薯的质量和食品安全，给广大种植户和我国的甘薯产业造成了巨大的经济损失。目前我国登记防治甘薯黑斑病的药剂仅有多菌灵、甲基硫菌灵等4种(张德胜等，5种杀菌剂对储藏期甘薯黑斑病的防效及对薯块的安全性评价，植物保护，2015)，新类型杀菌剂的应用近年来也鲜有报道。多菌灵等杀菌剂在甘薯黑腐病的综合防治中得到了广泛的应用。然而，长期使用化学杀菌剂会造成农药残留、环境污染、农药抗药性、威胁人体健康等问题。

黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种土传丝状腐生真菌，在自然界广泛分布，具有较强感染和致病能力。黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是黄曲霉产生的次级代谢产物，为一类基本结构都含有的二呋喃环和香豆素(氧杂萘邻酮)的化合物。1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)癌症研究机构划定为一类天然存在的致癌物，是毒性极强的剧毒物质。其衍生物有约20种(Peng et al.,Current major degradation methods for aflatoxins:Areview,Trends Food Sci Tech,2018)，其中以B1的毒性最大，致癌性最强。花生、玉米、大豆等谷类粮食及油料作物，在其生产和加工以及后续存储过程非常容易被黄曲霉感染，并产生黄曲霉毒素(Silivano et al.,Recent development of aflatoxin contaminationbiocontrol in agricultural products,Biol Control,2019)。黄曲霉毒素超标将引发食品安全问题，已成为我国农产品出口的重大障碍之一，给我国粮油加工和出口企业造成了巨大的经济损失。黄曲霉毒素耐热，理化性质的稳定性使其难以去除，代价昂贵又效果甚微的方法很难应用于大规模实际生产中。臭氧处理、化学农药等化学防治方法会使样本成分和感官发生改变，或造成农药残留，危害人畜健康，对环境造成不可逆的损伤。因此化学农药的使用在实际应用中存在一定困难。

生物防治具有安全、高效、价廉、长效等优点，利用微生物及其代谢产物对果蔬病害进行生物防治，被认为是继化学杀菌剂之后具有潜力的新兴技术(杨冬静等，解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-1对甘薯黑斑病的生物防治效果研究，西南农业学报，2018)。筛选能够对植物病原菌具有防治作用的生防菌株具有十分重要的实际应用价值。

发明内容

为了解决植物病原菌防治中的农药残留、环境污染、危害人类健康等问题，本发明提供了一种可远距离防治植物病原菌的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)XK29及其应用，所述特基拉芽孢杆菌XK29产生的挥发性气体对植物病原菌有强烈的拮抗作用，可显著抑制其致病力。

为达到此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)XK29，于2021年4月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO.61592。其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种熏蒸制剂，包含上述的特基拉芽孢杆菌。

第三方面，本发明提供了一种上述的熏蒸制剂的制备方法，包括：

将菌株XK 29在LB培养基上活化；

从活化的固体培养基上挑取XK 29单菌落，接入LB液体培养基中进行培养，得到XK29菌悬液；

将小麦粒洗净后煮沸，用纱布过滤，将水沥干，进行灭菌处理，得到麦粒固体培养基；

在所得麦粒固体培养基中，接种所得XK 29菌悬液后培养，得到特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂。

优选地，所述活化温度为28-35℃，可以是28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃。

优选地，所述活化时间为12-36h，可以是12h、24h或36h，优选为12-24h，进一步优选为24h。

优选地，所述LB液体培养基体积为10-60mL，可以是10mL、20mL、30mL、40mL、50mL或60mL，优选为20-50mL，进一步优选为30mL。

优选地，所述培养温度为28-35℃，可以是28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃。

优选地，所述培养时间为6-24h，可以是6h、12h、18h或24h，优选为12-18h，进一步优选为12h。

优选地，所述麦粒煮沸至裂开，为菌种提供更大的接种和生长表面。

优选地，所述灭菌条件为：121℃灭菌30min，灭菌2次。

优选地，所述接种的XK 29菌悬液与麦粒固体培养基的体积(μL)/重量(g)比为1/10-24，以是1/10、1/2、1、2、4、6、8、10、12或24，优选为2-10，进一步优选为2。

优选地，所述接种的XK 29菌悬液浓度为10⁶cfu/mL、10⁷cfu/mL或10⁸cfu/mL，进一步优选为10⁸cfu/mL。

优选地，所述的接种方式为将XK 29菌悬液加入麦粒培养基后摇匀数下。

优选地，接种XK 29菌悬液后的培养时间为0-5d，即使用该固体熏蒸制剂的当天培养，培养1d、2d、3d、4d或5d，优选为1-5d，进一步优选为1d。

优选地，培养温度为30℃。

作为本发明第三方面所述方法的优选技术方案，所述方法包括如下步骤：

(1)30℃条件下，将菌株XK 29在LB培养基上活化24h；

(2)从活化的固体培养基上挑取XK 29单菌落，接入30mL LB液体培养基中，30℃培养12h；

(3)将小麦粒洗净后煮沸至裂开，用纱布过滤，将水沥干，121℃灭菌30min，灭菌2次；

(4)在步骤(3)所得麦粒固体培养基中，接种步骤(2)所得菌体浓度为1×10⁸cfu/mL的XK 29菌悬液，接种比例为每克麦粒接种2μL菌悬液，摇匀后，30℃培养1d，得到所述特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂。

第四方面，本发明提供了如第二方面所述特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂的挥发性物质及其收集鉴定方法：

(1)将XK29菌悬液(60μL，10⁸cfu/mL)接种于经高压灭菌的5g小麦种子上，于20mL顶空瓶中28℃下培养7天。在60℃恒温震荡15min后，将50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取头插入样品顶空部分，对其挥发性物质进行GC-MS分离鉴定。

(2)从特基拉芽孢杆菌XK29麦粒培养物挥发性气体中收集获得，包括21种成分，分别为乙偶姻、2-羟基-5-甲基苯乙酮、异戊酸、异丁酸、2-甲基丁酸、2-甲基4氢噻吩-3酮、2-甲基丁酸乙酯、二甲硫基甲烷、3-甲基丁酸乙酯、1,1,3,3-四甲基-1,3-双[(2Z)-戊-2-烯-1-酰氧基]二硅氧烷、9,10-二氢-9-氨基蒽、2,3,5-三硫杂己烷、1-甲氧基-2-丁醇、7,7-二甲基-9-杂三环[6.2.2.0(1,6)]十二烷-10-酮、2-乙基己醛、2,3-二氢苯并呋喃、4-乙基-2-甲氧基苯酚、3-戊醇、正己醇、甲基-2,4-二-O-甲基.β.l-阿拉伯吡喃糖苷、(3S)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢化-3,8-四甲基-5-奥甲醇乙酸酯。

(3)步骤(2)中测定的挥发性物质中含量高于1％的七种化合物，即乙偶姻、2-羟基-5-甲基苯乙酮、异戊酸、异丁酸、2-甲基丁酸、2-甲基4氢噻吩-3酮、甲基-2,4-二-O-甲基.β.l-阿拉伯吡喃糖苷，测定各化合物对甘薯长喙壳菌的抑制率，异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸(5μL)的抑制率为100％，2-甲基四氢噻吩-3-酮(20μL)的抑制率为100％。

第五方面，本发明提供了一种上述的特基拉芽孢杆菌或上述的熏蒸制剂在植物病原菌的广谱抑菌中的应用，所述植物病原菌为甘薯长喙壳菌、古巴假霜霉菌、苹果轮纹病菌、禾谷镰刀病菌、樱桃腐烂病菌、西瓜枯萎病菌、黄曲霉、小麦赤霉病菌、西瓜壳二孢、向日葵菌核中的一种或多种。

第六方面，本发明提供了一种上述的特基拉芽孢杆菌或上述的熏蒸制剂在甘薯采后黑斑病防治中的应用。

第七方面，本发明提供了一种上述的特基拉芽孢杆菌或上述的熏蒸制剂在花生中防控黄曲霉污染的应用。

本发明所达到的有益效果：本发明提供的特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂制备方法简单、成本低、无污染、无残留；该固体熏蒸制剂产生的挥发性抑菌气体能够有效抑制甘薯长喙壳菌、古巴假霜霉菌、苹果轮纹病菌等多种植物病原真菌的生长，能有效防治甘薯采后黑斑病的发生以及防控花生中黄曲霉污染；该固体熏蒸制剂产生的挥发性气体是低沸点、高蒸汽压、易挥发的低分子量化合物，该固体熏蒸制剂作用方式新颖，菌剂无需接触病原菌和果蔬，是一种可实现远距离防控的生物防治方法，对于新型绿色广谱抑菌药物的开发具有极高的研究和应用价值。

附图说明

图1为特基拉芽孢杆菌XK29固体熏蒸制剂产生的挥发性气体成分；

图2为特基拉芽孢杆菌XK29固体熏蒸制剂在平板上对甘薯长喙壳菌生长的抑制作用实验照片，其中A为空白对照组，B为固体熏蒸制剂处理组；

图3为菌悬液接种浓度对特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂抑菌作用影响的实验照片，其中A为空白对照组，B为10⁶cfu/mL浓度组，C为10⁷cfu/mL浓度组；

图4为特基拉芽孢杆菌XK29固体熏蒸制剂的广谱抑菌作用实验照片，其中1为古巴假霜霉菌，2为苹果轮纹病菌，3为禾谷镰刀病菌，4为樱桃腐烂病菌，5为黄曲霉，6为西瓜枯萎病菌，7为小麦赤霉病菌，8为西瓜壳二孢，9为向日葵菌核，A为空白对照组，B为固体熏蒸制剂处理组；

图5为特基拉芽孢杆菌XK29固体熏蒸制剂对甘薯黑斑病的防治作用实验照片，其中A为对照组(甘薯+甘薯长喙壳菌)，B为多菌灵处理组(甘薯+甘薯长喙壳菌+多菌灵)，C为固体熏蒸制剂处理组(甘薯+甘薯长喙壳菌+特基拉芽孢杆菌XK29固体熏蒸制剂)；

图6为特基拉芽孢杆菌XK29固体熏蒸制剂对花生中黄曲霉污染的防控作用实验照片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1、特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂的制备

从斜面上挑取适量菌株XK29培养物，转接至LB固体培养基上，30℃条件下活化24h。挑取XK29单菌落，接入30mL LB液体培养基中，30℃培养12h，将菌体浓度调整为1×10⁸cfu/mL，获得XK 29菌悬液。

将小麦粒洗净后煮沸至裂开，用纱布过滤，将水沥干，121℃灭菌30min，灭菌2次。

待麦粒冷却后，每1克麦粒接种2μL菌悬液，充分摇匀，30℃培养1d，得到所述特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂。

实施例2、特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂挥发性气体成分的收集与鉴定

将XK29菌悬液(60μL，10⁸cfu/mL)接种于经高压灭菌的5g小麦种子上，于20mL顶空瓶中28℃下培养7天。在60℃恒温震荡15min后，将50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取头插入样品顶空部分，顶空萃取温度50℃，萃取时间30min，于250℃下解析4min，对其挥发性物质进行GC-MS分离鉴定。采用DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为高纯氦气，恒流流速1.0mL/min，进样口温度260℃，不分流进样，溶剂延迟1.5min。升温程序为40℃保持3min，以4℃/min升至220℃，保持10min。质谱条件为电子轰击离子源，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，质谱接口温度280℃，电子能量70eV。检测器电压901V，扫描方式为全扫描模式，质量扫描范围m/z 20-650。

采用NIST数据库进行物质定性分析，从特基拉芽孢杆菌XK29麦粒培养物至少产生21种挥发性成分。如图1所示，分别为乙偶姻(RT＝12.34)、2-羟基-5-甲基苯乙酮(RT＝32.721)、异戊酸(RT＝22.042)、异丁酸(RT＝19.652)、2-甲基丁酸(RT＝22.043)、2-甲基4氢噻吩-3酮(RT＝18.584)、2-甲基丁酸乙酯(RT＝6.006)、二甲硫基甲烷(RT＝12.136)、3-甲基丁酸乙酯(RT＝6.377)、1,1,3,3-四甲基-1,3-双[(2Z)-戊-2-烯-1-酰氧基]二硅氧烷(RT＝25.316)、9,10-二氢-9-氨基蒽(RT＝32.645)、2,3,5-三硫杂己烷(RT＝21.794)、1-甲氧基-2-丁醇(RT＝20.795)、7,7-二甲基-9-杂三环[6.2.2.0(1,6)]十二烷-10-酮(RT＝25.271)、2-乙基己醛(RT＝5.106)、2,3-二氢苯并呋喃(RT＝36.142)、4-乙基-2-甲氧基苯酚(RT＝29.613)、3-戊醇(RT＝13.867)、正己醇(RT＝14.302)、甲基-2,4-二-O-甲基.β.l-阿拉伯吡喃糖苷(RT＝22.075)、(3S)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢化-3,8-四甲基-5-奥甲醇乙酸酯(RT＝32.627)。

测定挥发性物质中含量高于1％的七种化合物，即乙偶姻、2-羟基-5-甲基苯乙酮、异戊酸、异丁酸、2-甲基丁酸、2-甲基4氢噻吩-3酮、甲基-2,4-二-O-甲基.β.l-阿拉伯吡喃糖苷，对甘薯长喙壳菌和黄曲霉的抑制率。

表1.主要挥发性物质纯品对甘薯长喙壳菌抑制作用实验结果

如表1所示，异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸(5μL)的抑制率为100％，2-甲基四氢噻吩-3-酮(20μL)的抑制率为100％。

表2.主要挥发性物质纯品对黄曲霉抑制作用实验结果

如表2所示，异戊酸(20μL)、异丁酸(20μL)、2-甲基丁酸(40μL)和2-甲基四氢噻吩-3-酮(60μL)的抑制率为100％。

实施例3、特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂对甘薯长喙壳菌的抑制作用

采用无菌操作的方法，在分隔平板的左边隔室内加入适量的PDA培养基。用无菌的打孔器在生长良好的甘薯长喙壳菌平板外围上打孔，制造出直径为7mm的菌饼，使用接种针将菌饼挑取至PDA平板上。使用无菌的药匙在平板的右边隔室内加入10g特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂。左右两边的培养物被平板内的隔板隔开，不发生接触。用封口膜密封后，将平板放入28℃培养箱中，培养6d。采用十字交叉法，使用游标卡尺测量菌落直径，计算抑制率。

如图2所示，甘薯长喙壳菌7mm菌饼培养6天后，空白对照组甘薯长喙壳菌菌落直径为42.09mm，特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂处理组中菌落直径仍为7mm，抑制率为100％，证明特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂所产生的挥发性气体对甘薯长喙壳菌具有良好的抑菌效果。

实施例4、菌悬液接种浓度对特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂抑菌作用的影响

从斜面上挑取适量菌株XK29培养物，转接至LB固体培养基上，30℃条件下活化24h。挑取XK29单菌落，接入30mL LB液体培养基中，30℃培养12h，将菌体浓度调整为10⁶cfu/mL或10⁷cfu/mL，获得XK 29菌悬液。将小麦粒洗净后煮沸至裂开，用纱布过滤，将水沥干，121℃灭菌30min，灭菌2次。待麦粒冷却后，每1克麦粒接种2μL菌悬液，充分摇匀，30℃培养1d，在分隔平板中检测该制剂对甘薯长喙壳菌的抑制作用。

如图3所示，XK29菌悬液菌体浓度为10⁶cfu/mL或10⁷cfu/mL时，制剂处理组中甘薯长喙壳菌直径分别为11.90mm和9.96mm，抑制率分别为86.03％和91.57％。

实施例5、特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂的广谱抑菌作用

在分隔平板的右边隔室中加入含有10g特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂，在左边隔室的PDA平板中接入7mm的各种植物病原真菌菌饼。左右两边的培养物被平板内的隔板隔开，不发生接触。用封口膜密封后，将平板放入28℃培养箱中，培养6d。采用十字交叉法，使用游标卡尺测量菌落直径，计算抑制率。

如图4所示，特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂对多种植物病原真菌具有广谱抑制作用。对古巴假霜霉菌的抑制率为43.48％，对苹果轮纹病菌的抑制效果为51.00％，对禾谷镰刀病菌的抑制率为42.79％，对樱桃腐烂病菌的抑制率为36.82％，对黄曲霉的抑制率为46.94％，对西瓜枯萎病菌的抑制率为23.83％，对小麦赤霉病菌的抑制率为46.35％，对西瓜壳二孢的抑制率为27.99％，对向日葵菌核的抑制率为100％。因此，特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂具有良好的广谱抑菌性和应用前景。

实施例6、特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂对甘薯黑斑病的防治

选取健康、大小接近的甘薯，自来水洗净后，在1％次氯酸钠溶液中浸泡2min，无菌水冲洗后晾干。用无菌解剖针在甘薯腰部制造20个约5mm深的伤口。晾干后，在伤口处加入20μL浓度为1×10⁶cfu/mL的甘薯长喙壳菌孢子悬液，晾干后加入无菌的餐盒中。在餐盒中远离甘薯的位置放置平皿，加入20g特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂。28℃下培养20d后，检测甘薯发病情况。

如图5所示，对照组甘薯表面出现大面积黑斑和凹陷，横切面组织呈现明显黑斑。特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂处理组显著减轻了黑斑病的发生和危害，熏蒸防治效果与涂抹多菌灵相当。表明特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂能够有效防治甘薯采后黑斑病的发生。

实施例7、特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂在花生中防控黄曲霉污染的应用

取健康的花生籽粒使用0.25％NaClO浸泡消毒30s后，用无菌水冲净，室温晾干后备用。在分隔平板的一个隔室中加入10g特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂，另一个隔室中加入与100μL1×10⁶cfu/mL的黄曲霉孢子悬液混匀的10颗花生籽粒。28℃下培养3d。培养结束后，检查花生籽粒发病情况并测定毒素含量。

如图6所示，对照组中花生籽粒黄曲霉感染严重，表面着生了大量的白色菌丝和黄色分生孢子，黄曲霉毒素AFB₁含量为315.10±10.19μg/kg，黄曲霉毒素AFB₂含量为10.74±0.42μg/kg。特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂处理组的花生籽粒均未见明显白色菌丝和黄色分生孢子，AFB₁含量显下降为12.43±0.67μg/kg，AFB₂未检出。结果表明特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂能够有效控制黄曲霉菌丝和孢子繁殖，显著降低黄曲霉毒素含量，对黄曲霉污染有良好的防治效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一种产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1399

<212> DNA

<213> 特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)

<400> 1

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420

gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540

tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720

gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960

tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020

gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080

ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140

tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200

caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260

gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380

cccgaagtcg gtgaggtaa 1399

Claims (10)

1.一种产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）XK29，于2021年4 月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61592。

2.根据权利要求1所述的产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）XK29, 其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的产挥发性抑菌气体的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）XK29, 其特征在于，所述挥发性抑菌气体包括21种成分，分别为乙偶姻、2-羟基-5-甲基苯乙酮、异戊酸、异丁酸、2-甲基丁酸、2-甲基4氢噻吩-3酮、2-甲基丁酸乙酯、二甲硫基甲烷、3-甲基丁酸乙酯、1,1,3,3-四甲基-1,3-双[(2Z)-戊-2-烯-1-酰氧基]二硅氧烷、9,10-二氢-9-氨基蒽、2,3,5-三硫杂己烷、1-甲氧基-2-丁醇、7,7-二甲基-9-杂三环[6.2.2.0(1,6)]十二烷-10-酮、2-乙基己醛、2,3-二氢苯并呋喃、4-乙基-2-甲氧基苯酚、3-戊醇、正己醇、甲基-2,4-二-O-甲基.β. l-阿拉伯吡喃糖苷、(3S)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢化-3,8-四甲基-5-奥甲醇乙酸酯。

4.一种熏蒸制剂，其特征在于，包含权利要求1-3任意一项所述的特基拉芽孢杆菌。

5.一种权利要求4所述的熏蒸制剂的制备方法，其特征在于，包括：

将菌株XK 29在LB培养基上活化；

从活化的固体培养基上挑取XK 29单菌落，接入LB液体培养基中进行培养，得到XK 29菌悬液；

将小麦粒洗净后煮沸，用纱布过滤，将水沥干，进行灭菌处理，得到麦粒固体培养基；

在所得麦粒固体培养基中，接种所得XK 29菌悬液后培养，得到特基拉芽孢杆菌固体熏蒸制剂。

6.根据权利要求5所述的熏蒸制剂的制备方法，其特征在于，所述活化温度为28-35ºC，活化时间为12-36 h；所述LB液体培养基体积为10-60 mL，培养温度为28-35ºC，培养时间为6-24 h；所述麦粒煮沸至裂开，所述灭菌条件为：121ºC灭菌30 min，灭菌2次。

7.根据权利要求5所述的熏蒸制剂的制备方法，其特征在于，所述接种的XK 29菌悬液与麦粒固体培养基的体积（μL）/重量（g）比为1/10-10；所述接种的XK 29菌悬液浓度为10^{6- 8}cfu/mL；所述的接种方式为将XK 29菌悬液加入麦粒培养基后摇匀数下；接种XK 29菌悬液后的培养时间为0-5 d，培养温度为30ºC。

8.权利要求1-3任意一项所述的特基拉芽孢杆菌或权利要求4所述的熏蒸制剂在植物病原菌的广谱抑菌中的应用，其特征在于，所述植物病原菌为甘薯长喙壳菌、古巴假霜霉菌、苹果轮纹病菌、禾谷镰刀病菌、樱桃腐烂病菌、西瓜枯萎病菌、黄曲霉、小麦赤霉病菌、西瓜壳二孢、向日葵菌核中的一种或多种。

9.权利要求1-3任意一项所述的特基拉芽孢杆菌或权利要求4所述的熏蒸制剂在甘薯采后黑斑病防治中的应用。

10.权利要求1-3任意一项所述的特基拉芽孢杆菌或权利要求4所述的熏蒸制剂在花生中防控黄曲霉污染的应用。

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