CN110157633A - 一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法 - Google Patents
一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体公开了一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法。本发明所用菌种为人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7250。本发明方法包括：一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基配方及其制备方法。本发明一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法，具有生产操作简单，成本低，菌体发酵完全、芽孢形成率高及耐储存优点。为人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养和开发利用打下坚实基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法，属生物技术领域。
背景技术
随着环境压力的增大和人们对健康及食品安全要求的提高,微生物农药受到越来越多的重视。目前,用于生防细菌的种类有:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)等。许多生防细菌产生的拮抗物质,抗菌作用是广谱的。多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)中很多菌株作为重要的生防资源，用于多种植物病害的生物防治，美国环境保护署已将其列为可商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。我国许多学者分离到多个多黏类芽孢杆菌生防菌株，分别对黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、稻瘟病、荔枝霜疫霉病等具有较好地抑制作用,但现已报道的多黏类芽孢杆菌主要分离自土壤，少数为植物内生菌，本发明采用人参内生多粘类芽孢杆菌菌株是从人参植株中分离获得的，该菌株的发酵液对人参黑斑病菌（Alternaria panax Whetz）、 人参锈腐菌（Cylindrocarpon destructans Zinns）、人参菌核病菌（Sclerotinia schinsengWang）、人参立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、人参根腐病菌（Fusarium solani App）及人参细菌性软腐病（Erwinia carotovora subsp）等病原菌具有明显的防病效果，同时，该菌株还具有转化人参皂苷效率高、降低农残活力强等优点。本发明可应用在制备防治人参、西洋参等植物病害、生物转化人参皂苷、降低农药残留的菌剂或制剂中，表现了良好的应用前景。本发明系统研究了该菌株的大规模培养基配方及其制备方法，旨在提高菌体数量的同时，降低生产成本，适于大规模生产，从而为该菌株生物制剂的开发提供依据。
发明内容
本发明一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法，该菌株抑菌谱广、抑菌能力强、生物转化人参皂苷效率高、降低农残活力强；用于防治人参、西洋参等植物的病害，转化人参皂苷，降低农药残留。该方法可应用在制备防治人参、西洋参等植物病害、生物转化人参皂苷、降低农药残留的菌剂或制剂中。
本发明所述人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 7250。
本发明所述一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法：本发明一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基配方为：葡萄糖20g/L，小麦淀粉6g/L，豆粕4g/L；具体制备步骤为：将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25℃培养24h-48h，进行人参内生多粘类芽孢杆菌菌种活化。挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，培养到OD600值为0.5左右，得种子液。将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比5%接种量，接种入灭菌的本发明配方培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，芽胞形成85%以上时，得发酵液。
具体实施方式
本发明提供了一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法，本发明领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员是显而易见的，都视为本发明。本发明所述一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基及其制备方法
1 材料和仪器
1.1 供试菌种
人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 7250，保藏编号为CGMCC No.7250。
1.2 主要培养基原料
小麦淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、玉米淀粉、面粉、豆粕、大豆淀粉、蛋白胨、酵母粉、尿素。
2 方法
2.1大规模培养人参内生多粘类芽孢杆菌菌种活化
将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25℃培养24h-48h。PDA培养基制备方法：马铃薯洗净去皮后称取200g，切成小块，加蒸馏水煮至沸腾后20-30min（马铃薯能用玻璃棒戳破即可），然后用四层纱布过滤，向滤液中加20g葡萄糖及20g琼脂粉，继续加热至溶解，加蒸馏水至1000ml，121℃下高压灭菌20min。温度降至50℃左右时倒入试管中，制成斜面培养基，凝固后倒置24h无菌生长即可使用。
2.2大规模培养基中人参内生多粘类芽孢杆菌种子液制备
挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，培养到OD600值为0.5左右，得种子液。
2.3 大规模培养基中不同C源种类对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响
将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比5%接种量，分别接种灭菌的PDB培养基、20g/L葡萄糖+5g/L小麦淀粉培养基、20g/L葡萄糖+5g/L马铃薯淀粉培养基、20g/L葡萄糖+5g/L红薯淀粉培养基、20g/L葡萄糖培养基+5g/L玉米淀粉培养基、20g/L葡萄糖+5g/L面粉培养基，每个培养基做3个重复。120rpm/min,25℃，培养48h后测定活菌及其芽孢数量，确定培养基最佳C源种类。
2.4大规模培养基中不同浓度最佳C源对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响
在确定了最佳C源种类的基础上，将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比5%接种量，分别接种灭菌的不同浓度最佳C源培养基（最佳C源浓度分别为3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L），每个培养基做3个重复。120rpm/min,25℃，培养48h后测定活菌及其芽孢数量，确定大规模培养基中最佳C源的适宜浓度。
2.5 大规模培养基中不同N源种类对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响
将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比5%接种量，分别接种灭菌的PDB培养基、20g/L葡萄糖+5g/L小麦淀粉+5g/L大豆培养基、20g/L葡萄糖+5g/L小麦淀粉+5g/L蛋白胨培养基、20g/L葡萄糖+5g/L小麦淀粉+5g/L豆粕培养基、20g/L葡萄糖+5g/L小麦淀粉+5g/L酵母粉培养基、20g/L葡萄糖+5g/L小麦淀粉+5g/L尿素培养基（分别制成5g/L单一N源的培养基，）每个培养基做3个重复。120rpm/min,25℃，培养48h后测定活菌及其芽孢数量，确定培养基最佳N源种类。
2.6 大规模培养基中不同浓度最佳N源对多粘类芽孢杆菌活菌数及其芽孢的影响
在确定了最佳N源种类的基础上，将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比5%接种量，分别接种灭菌的不同浓度最佳N源培养基（最佳N源浓度分别为2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L），每个培养基做3个重复。120rpm/min，25℃，培养48h后测定活菌及其芽孢数量，确定大规模培养基中最佳N源的适宜浓度。
2.7不同大规模培养基对不同存储时间多粘类芽孢杆菌活菌数的影响
在确定了最佳C源、N源种类和适宜用量的基础上，将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比5%接种量，分别接种灭菌的不同大规模培养基中（大规模培养基分别为20g/L葡萄糖+6g/L的小麦淀粉组、20g/L葡萄糖+4g/L的豆粕组、20g/L葡萄糖+6g/L的小麦+4g/L豆粕组、PDB组），每个培养基做3个重复。120rpm/min，25℃，培养48h后，常温常压下保存，每隔7d检测一次活菌数，共持续3个月。
2.8活菌计数
取在旋转式摇床上充分震荡即成母液菌悬液，摇匀，进行1:10的倍比稀释，分别制成10-6、10-7、10-8的母液的稀释液。分别吸取0.1mL上述待测稀释菌液于准备好的无菌平板内，用涂布棒涂匀。置于25℃恒温培养箱中培养，并做好相关记录。待平板上菌落长成后进行计数，同时记录稀释倍数和相应的菌落数量，每个平板测定重复三次。
2.9芽孢计数
将菌悬液置于80℃的水浴锅15min杀死营养体，其余步骤参照2.5。
3 结果与分析
3.1大规模培养基中不同C源种类对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响
大规模培养基中不同C源种类对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响见表1。不同C源种类对多粘类芽孢杆菌的活菌及其芽孢数量有显著影响（P＜0.05），多粘类芽孢杆菌大规模培养最佳C源为小麦淀粉。
3.2大规模培养基中不同浓度最佳C源对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响
大规模培养基中不同浓度最佳C源小麦淀粉对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响见表2。不同浓度最佳C源小麦淀粉对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢有显著影响（P＜0.05），多粘类芽孢杆菌大规模培养基中最佳C源小麦淀粉浓度为6g/L。
3.3大规模培养基中不同N源种类对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响
不同N源种类对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响见表3。不同N源种类对多粘类芽孢杆菌的活菌及其芽孢数量有显著影响（P＜0.05），多粘类芽孢杆菌大规模培养最佳N源为豆粕。
3.4大规模培养基中不同浓度最佳N源对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响
大规模培养基中不同浓度最佳N源豆粕对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢的影响见表4。大规模培养基中不同浓度最佳N源豆粕对多粘类芽孢杆菌活菌及其芽孢有显著影响（P＜0.05），多粘类芽孢杆菌大规模培养基中最佳N源豆粕浓度为4g/L。
3.5不同大规模培养基对不同存储时间多粘类芽孢杆菌活菌数的影响
不同大规模培养基对不同存储时间多粘类芽孢杆菌活菌数的影响见表5。由表5可知，不同大规模培养基对不同存储时间多粘类芽孢杆菌活菌数的影响有显著差异（P＜0.05），小麦+豆粕组效果最好。
Claims (1)
1.一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基制备方法，用于防治人参、西洋参等植物的病害，转化人参皂苷，降低农药残留生物菌剂的制备方法，具体步骤为：
（1）一种人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养基配方为：葡萄糖20g/L，小麦淀粉6g/L，豆粕4g/L；
（2）将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25℃培养24h-48h，进行人参内生多粘类芽孢杆菌菌种活化；挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，培养到OD600值为0.5左右，得种子液；将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比5%接种量，接种入灭菌的本发明配方培养基中，120rpm/min,25℃培养24h-48h，芽胞形成85%以上时，得发酵液；
（3）本发明所用菌种为人参内生多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7250。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN108034614A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-05-15 | 吉林农业大学 | 一种多粘类芽孢杆菌同时降解5种农药残留方法 |
| CN114891684A (zh) * | 2022-05-27 | 2022-08-12 | 长春中医药大学 | 一种多粘芽孢杆菌及其微生物固体菌剂的制备方法与应用 |
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2018
- 2018-05-25 CN CN201810513176.5A patent/CN110157633A/zh active Pending
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