BR112016019341B1 - Composição, uso da composição, célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, e, método para produção de uma proteína carreadora n-glicosilada - Google Patents
Composição, uso da composição, célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, e, método para produção de uma proteína carreadora n-glicosilada Download PDFInfo
- Publication number
- BR112016019341B1 BR112016019341B1 BR112016019341-5A BR112016019341A BR112016019341B1 BR 112016019341 B1 BR112016019341 B1 BR 112016019341B1 BR 112016019341 A BR112016019341 A BR 112016019341A BR 112016019341 B1 BR112016019341 B1 BR 112016019341B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- coli
- antigen
- specific embodiment
- host cell
- carrier protein
- Prior art date
Links
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 249
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 248
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 224
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title claims description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 468
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 361
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 354
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 353
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 188
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 101
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 96
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 79
- 108010089072 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycotransferase Proteins 0.000 claims description 60
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims description 35
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 34
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 33
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 24
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 24
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 claims description 16
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims description 15
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 15
- 101710102974 O-acetyl transferase Proteins 0.000 claims description 14
- XCCTYIAWTASOJW-UHFFFAOYSA-N UDP-Glc Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 claims description 14
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 101150057996 rfaL gene Proteins 0.000 claims description 12
- 108060002399 dTDP-4-dehydrorhamnose 3,5-epimerase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000029589 dTDPglucose 4,6-dehydratase Human genes 0.000 claims description 10
- 108091000032 dTDPglucose 4,6-dehydratase Proteins 0.000 claims description 10
- 108020003540 O-antigen polymerase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 7
- 101150052803 gtrS gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000625 opsonophagocytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 claims description 6
- 108020004469 Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 101710147195 Hemolysin A Proteins 0.000 claims description 6
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 6
- 101150094414 gtrA gene Proteins 0.000 claims description 6
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 6
- 101150035941 gtrB gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101710198480 Clumping factor A Proteins 0.000 claims description 4
- 101710198481 Clumping factor B Proteins 0.000 claims description 4
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 claims description 4
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 4
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 2
- 101900032831 Streptococcus pneumoniae Pneumolysin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010017836 1,3-alpha-D-glucan synthase Proteins 0.000 claims 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 72
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 56
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 abstract description 45
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 44
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 41
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 40
- -1 for example Substances 0.000 abstract description 39
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 37
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 abstract description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 27
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 391
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 216
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 121
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 121
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 111
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 96
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 95
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 82
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 81
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 58
- 108050006599 Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 58
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 56
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 56
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 50
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 47
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 43
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 41
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 33
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 30
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 27
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 23
- 229940031351 tetravalent vaccine Drugs 0.000 description 22
- 101150068841 wzyE gene Proteins 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 20
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 20
- 101100248161 Escherichia coli (strain K12) rfbX gene Proteins 0.000 description 19
- 101100264107 Escherichia coli (strain K12) wzxC gene Proteins 0.000 description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 19
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 19
- 101150032360 wzxE gene Proteins 0.000 description 19
- 101710164436 Listeriolysin O Proteins 0.000 description 18
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 18
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 15
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 15
- 101150078780 rmlD gene Proteins 0.000 description 15
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 15
- XOCCAGJZGBCJME-VAYLDTTESA-N N-Acetyl-L-Fucosamine Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H]1O XOCCAGJZGBCJME-VAYLDTTESA-N 0.000 description 14
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 14
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 14
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 14
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 14
- 101150061409 rfbD gene Proteins 0.000 description 14
- 101150099889 rmlA gene Proteins 0.000 description 14
- 101150043440 rmlB gene Proteins 0.000 description 14
- 101150016581 rmlC gene Proteins 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 101100416564 Escherichia coli (strain K12) rfbA gene Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- UFPHFKCTOZIAFY-NTDVEAECSA-N ditrans,polycis-undecaprenyl phosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/COP(O)(O)=O UFPHFKCTOZIAFY-NTDVEAECSA-N 0.000 description 13
- 101150055510 rfbB gene Proteins 0.000 description 13
- 101150117748 rfbC gene Proteins 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 101150105580 wbbL gene Proteins 0.000 description 13
- 101100263941 Escherichia coli (strain K12) wbbJ gene Proteins 0.000 description 12
- 101100263942 Escherichia coli (strain K12) wbbK gene Proteins 0.000 description 12
- 241000288113 Gallirallus australis Species 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 12
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 10
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241001621104 Escherichia coli O6 Species 0.000 description 10
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 10
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 238000004305 normal phase HPLC Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241001455504 Escherichia coli O2 Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 101150068826 pglB gene Proteins 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 8
- 241000481005 Escherichia coli O1 Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 7
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 6
- 101710167675 Outer membrane protein P5 Proteins 0.000 description 6
- 101710195197 Peptidoglycan-binding protein ArfA Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 5
- INJACODUUNZJCO-NAGKVERXSA-N UDP-N-acetyl-beta-L-fucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 INJACODUUNZJCO-NAGKVERXSA-N 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N edaravone Chemical compound O=C1CC(C)=NN1C1=CC=CC=C1 QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 description 5
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 229960005256 sulbactam Drugs 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 4
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 3
- 241001543249 Escherichia coli O25 Species 0.000 description 3
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 3
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 3
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 3
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 3
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 206010013990 dysuria Diseases 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 3
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzenesulfonamide;5-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000034628 Celiac artery compression syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 2
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 2
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- BBWBEZAMXFGUGK-UHFFFAOYSA-N bis(dodecylsulfanyl)-methylarsane Chemical compound CCCCCCCCCCCCS[As](C)SCCCCCCCCCCCC BBWBEZAMXFGUGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 229960003324 clavulanic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229940047766 co-trimoxazole Drugs 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- ZOSQFDVXNQFKBY-CGAXJHMRSA-N dTDP-beta-L-rhamnose Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 ZOSQFDVXNQFKBY-CGAXJHMRSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100000062 no-observed-adverse-effect level Toxicity 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- 101150017134 wecA gene Proteins 0.000 description 2
- AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N (-)-Florfenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CF)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N 0.000 description 1
- XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-ketoconazole Chemical compound C1CN(C(=O)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2C=NC=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N 0.000 description 1
- KMEGBUCIGMEPME-LQYKFRDPSA-N (2s,5r,6r)-6-[[(2r)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;(1r,4s)-3,3-dimethyl-2,2,6-trioxo-2$l^{6}-thiabicyclo[3.2.0]heptane-4-carboxylic acid Chemical compound O=S1(=O)C(C)(C)[C@H](C(O)=O)C2C(=O)C[C@H]21.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 KMEGBUCIGMEPME-LQYKFRDPSA-N 0.000 description 1
- XWMVMWTVLSLJGY-FAJPTIRJSA-N (2s,5r,6r)-6-[[(2r)-2-carboxy-2-thiophen-3-ylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;(2r,3z,5r)-3-(2-hydroxyethylidene)-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21.C=1([C@@H](C(O)=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)C=CSC=1 XWMVMWTVLSLJGY-FAJPTIRJSA-N 0.000 description 1
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N 0.000 description 1
- SOVUOXKZCCAWOJ-HJYUBDRYSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-9-[[2-(tert-butylamino)acetyl]amino]-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=C(NC(=O)CNC(C)(C)C)C(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O SOVUOXKZCCAWOJ-HJYUBDRYSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDLWHQDACQUCJR-ZAMMOSSLSA-N (6r,7r)-7-[[(2r)-2-azaniumyl-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino]-8-oxo-3-[(e)-prop-1-enyl]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)/C=C/C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 WDLWHQDACQUCJR-ZAMMOSSLSA-N 0.000 description 1
- MMRINLZOZVAPDZ-LSGRDSQZSA-N (6r,7r)-7-[[(2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetyl]amino]-3-[(1-methylpyrrolidin-1-ium-1-yl)methyl]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid;chloride Chemical compound Cl.S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1C[N+]1(C)CCCC1 MMRINLZOZVAPDZ-LSGRDSQZSA-N 0.000 description 1
- YWKJNRNSJKEFMK-PQFQYKRASA-N (6r,7r)-7-[[(2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetyl]amino]-8-oxo-3-(5,6,7,8-tetrahydroquinolin-1-ium-1-ylmethyl)-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(C[N+]=3C=4CCCCC=4C=CC=3)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 YWKJNRNSJKEFMK-PQFQYKRASA-N 0.000 description 1
- MINDHVHHQZYEEK-UHFFFAOYSA-N (E)-(2S,3R,4R,5S)-5-[(2S,3S,4S,5S)-2,3-epoxy-5-hydroxy-4-methylhexyl]tetrahydro-3,4-dihydroxy-(beta)-methyl-2H-pyran-2-crotonic acid ester with 9-hydroxynonanoic acid Natural products CC(O)C(C)C1OC1CC1C(O)C(O)C(CC(C)=CC(=O)OCCCCCCCCC(O)=O)OC1 MINDHVHHQZYEEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N (E)-roxithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=N/OCOCCOC)/[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N 0.000 description 1
- XUBOMFCQGDBHNK-JTQLQIEISA-N (S)-gatifloxacin Chemical compound FC1=CC(C(C(C(O)=O)=CN2C3CC3)=O)=C2C(OC)=C1N1CCN[C@@H](C)C1 XUBOMFCQGDBHNK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 description 1
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MOMFXATYAINJML-UHFFFAOYSA-N 2-Acetylthiazole Chemical group CC(=O)C1=NC=CS1 MOMFXATYAINJML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHVPQPYKVGDNFY-DFMJLFEVSA-N 2-[(2r)-butan-2-yl]-4-[4-[4-[4-[[(2r,4s)-2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazin-1-yl]phenyl]-1,2,4-triazol-3-one Chemical compound O=C1N([C@H](C)CC)N=CN1C1=CC=C(N2CCN(CC2)C=2C=CC(OC[C@@H]3O[C@](CN4N=CN=C4)(OC3)C=3C(=CC(Cl)=CC=3)Cl)=CC=2)C=C1 VHVPQPYKVGDNFY-DFMJLFEVSA-N 0.000 description 1
- ACTOXUHEUCPTEW-BWHGAVFKSA-N 2-[(4r,5s,6s,7r,9r,10r,11e,13e,16r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-5-[(2s,4r,5s,6s)-4,5-dihydroxy-4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy-4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-10-[(2s,5s,6r)-5-(dimethylamino)-6-methyloxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-2-o Chemical compound O([C@H]1/C=C/C=C/C[C@@H](C)OC(=O)C[C@@H](O)[C@@H]([C@H]([C@@H](CC=O)C[C@H]1C)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@](C)(O)C2)[C@@H](C)O1)N(C)C)O)OC)[C@@H]1CC[C@H](N(C)C)[C@@H](C)O1 ACTOXUHEUCPTEW-BWHGAVFKSA-N 0.000 description 1
- VKJOGYLRXNAHPO-UHFFFAOYSA-N 2-aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N.NC(=O)C1=CC=CC=C1N VKJOGYLRXNAHPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YELMWJNXDALKFE-UHFFFAOYSA-N 3h-imidazo[4,5-f]quinoxaline Chemical class N1=CC=NC2=C(NC=N3)C3=CC=C21 YELMWJNXDALKFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo-2,3-dihydro-7H-[1,4]oxazino[2,3,4-ij]quinoline-6-carboxylic acid Chemical compound FC1=CC(C(C(C(O)=O)=C2)=O)=C3N2C(C)COC3=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 101100066491 Aneurinibacillus thermoaerophilus fdtA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100066492 Aneurinibacillus thermoaerophilus fdtB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100066493 Aneurinibacillus thermoaerophilus fdtC gene Proteins 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SQ 26917 Natural products O=C1N(S(O)(=O)=O)C(C)C1NC(=O)C(=NOC(C)(C)C(O)=O)C1=CSC(N)=N1 WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 206010056396 Asymptomatic bacteriuria Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 101100345766 Bacillus subtilis (strain 168) mnaA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005034 Bladder discomfort Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000589986 Campylobacter lari Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010020326 Caspofungin Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- GNWUOVJNSFPWDD-XMZRARIVSA-M Cefoxitin sodium Chemical compound [Na+].N([C@]1(OC)C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 GNWUOVJNSFPWDD-XMZRARIVSA-M 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000283070 Equus zebra Species 0.000 description 1
- 244000089409 Erythrina poeppigiana Species 0.000 description 1
- 101100155531 Escherichia coli (strain K12) ispU gene Proteins 0.000 description 1
- 241001070169 Escherichia coli 83972 Species 0.000 description 1
- 241001522750 Escherichia coli CFT073 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 208000002513 Flank pain Diseases 0.000 description 1
- UIOFUWFRIANQPC-JKIFEVAISA-N Floxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=C(F)C=CC=C1Cl UIOFUWFRIANQPC-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-UHFFFAOYSA-N Fusicsaeure Natural products C12C(O)CC3C(=C(CCC=C(C)C)C(O)=O)C(OC(C)=O)CC3(C)C1(C)CCC1C2(C)CCC(O)C1C IECPWNUMDGFDKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101100002119 Gallus gallus ARF5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- JUZNIMUFDBIJCM-ANEDZVCMSA-N Invanz Chemical compound O=C([C@H]1NC[C@H](C1)SC=1[C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1 JUZNIMUFDBIJCM-ANEDZVCMSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006154 MacConkey agar Substances 0.000 description 1
- 206010027566 Micturition urgency Diseases 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- MVTQIFVKRXBCHS-SMMNFGSLSA-N N-[(3S,6S,12R,15S,16R,19S,22S)-3-benzyl-12-ethyl-4,16-dimethyl-2,5,11,14,18,21,24-heptaoxo-19-phenyl-17-oxa-1,4,10,13,20-pentazatricyclo[20.4.0.06,10]hexacosan-15-yl]-3-hydroxypyridine-2-carboxamide (10R,11R,12E,17E,19E,21S)-21-hydroxy-11,19-dimethyl-10-propan-2-yl-9,26-dioxa-3,15,28-triazatricyclo[23.2.1.03,7]octacosa-1(27),6,12,17,19,25(28)-hexaene-2,8,14,23-tetrone Chemical compound CC(C)[C@H]1OC(=O)C2=CCCN2C(=O)c2coc(CC(=O)C[C@H](O)\C=C(/C)\C=C\CNC(=O)\C=C\[C@H]1C)n2.CC[C@H]1NC(=O)[C@@H](NC(=O)c2ncccc2O)[C@@H](C)OC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CC(=O)CCN2C(=O)[C@H](Cc2ccccc2)N(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C1=O)c1ccccc1 MVTQIFVKRXBCHS-SMMNFGSLSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710204495 O-antigen ligase Proteins 0.000 description 1
- 101150065340 O16 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010036018 Pollakiuria Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100032859 Protein AMBP Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 101900161471 Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 208000008718 Pyuria Diseases 0.000 description 1
- 235000009776 Rathbunia alamosensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241001353149 Shigella flexneri 6 Species 0.000 description 1
- 241001353427 Shigella flexneri Y Species 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 239000004187 Spiramycin Substances 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 1
- 206010050822 Suprapubic pain Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010053950 Teicoplanin Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKDDRNSBRWANNC-UHFFFAOYSA-N Thienamycin Natural products C1C(SCCN)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(C(O)C)C21 WKDDRNSBRWANNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 1
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000196 Urinary abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000026723 Urinary tract disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012931 Urologic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 239000004188 Virginiamycin Substances 0.000 description 1
- 108010080702 Virginiamycin Proteins 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- NTXGVHCCXVHYCL-RDQGWRCRSA-N all-trans-undecaprenyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\COP(O)(=O)OP(O)(O)=O NTXGVHCCXVHYCL-RDQGWRCRSA-N 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940024554 amdinocillin Drugs 0.000 description 1
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 1
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 1
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 1
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 1
- 229960003644 aztreonam Drugs 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N aztreonam Chemical compound O=C1N(S([O-])(=O)=O)[C@@H](C)[C@@H]1NC(=O)C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)\C1=CSC([NH3+])=N1 WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- 229960003034 caspofungin Drugs 0.000 description 1
- JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N caspofungin Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3CC[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](NCCN)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCCC[C@@H](C)C[C@@H](C)CC)[C@H](O)CCN)=CC=C(O)C=C1 JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N 0.000 description 1
- 229960005361 cefaclor Drugs 0.000 description 1
- QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N cefaclor Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(Cl)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)N)=CC=CC=C1 QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N 0.000 description 1
- 229960004841 cefadroxil Drugs 0.000 description 1
- NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N cefadroxil monohydrate Chemical compound O.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N 0.000 description 1
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 description 1
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 1
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 1
- 229960003719 cefdinir Drugs 0.000 description 1
- RTXOFQZKPXMALH-GHXIOONMSA-N cefdinir Chemical compound S1C(N)=NC(C(=N\O)\C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(C=C)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)=C1 RTXOFQZKPXMALH-GHXIOONMSA-N 0.000 description 1
- 229960002100 cefepime Drugs 0.000 description 1
- 229960002129 cefixime Drugs 0.000 description 1
- OKBVVJOGVLARMR-QSWIMTSFSA-N cefixime Chemical compound S1C(N)=NC(C(=N\OCC(O)=O)\C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(C=C)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)=C1 OKBVVJOGVLARMR-QSWIMTSFSA-N 0.000 description 1
- 229960003791 cefmenoxime Drugs 0.000 description 1
- HJJDBAOLQAWBMH-YCRCPZNHSA-N cefmenoxime Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NN=NN1C HJJDBAOLQAWBMH-YCRCPZNHSA-N 0.000 description 1
- 229960004682 cefoperazone Drugs 0.000 description 1
- GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N cefoperazone Chemical compound O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2C(C(O)=O)=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21 GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 229960002682 cefoxitin Drugs 0.000 description 1
- 229960000466 cefpirome Drugs 0.000 description 1
- DKOQGJHPHLTOJR-WHRDSVKCSA-N cefpirome Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(C[N+]=3C=4CCCC=4C=CC=3)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 DKOQGJHPHLTOJR-WHRDSVKCSA-N 0.000 description 1
- 229960005090 cefpodoxime Drugs 0.000 description 1
- WYUSVOMTXWRGEK-HBWVYFAYSA-N cefpodoxime Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC)C(O)=O)C(=O)C(=N/OC)\C1=CSC(N)=N1 WYUSVOMTXWRGEK-HBWVYFAYSA-N 0.000 description 1
- 229960002580 cefprozil Drugs 0.000 description 1
- 229950009592 cefquinome Drugs 0.000 description 1
- 229960000484 ceftazidime Drugs 0.000 description 1
- NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N ceftazidime pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)C=2N=C(N)SC=2)CC=1C[N+]1=CC=CC=C1 NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N 0.000 description 1
- UNJFKXSSGBWRBZ-BJCIPQKHSA-N ceftibuten Chemical compound S1C(N)=NC(C(=C\CC(O)=O)\C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=CCS[C@@H]32)C(O)=O)=O)=C1 UNJFKXSSGBWRBZ-BJCIPQKHSA-N 0.000 description 1
- 229960005229 ceftiofur Drugs 0.000 description 1
- ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N ceftiofur Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC(=O)C1=CC=CO1 ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N 0.000 description 1
- VOAZJEPQLGBXGO-SDAWRPRTSA-N ceftobiprole Chemical compound S1C(N)=NC(C(=N\O)\C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(\C=C/4C(N([C@H]5CNCC5)CC\4)=O)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)=N1 VOAZJEPQLGBXGO-SDAWRPRTSA-N 0.000 description 1
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N chembl2367892 Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(O)C=C(C=4)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CC=4C=C(Cl)C(O5)=CC=4)C(=O)N3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1Cl)=CC=C1OC1=C(O[C@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)NC(C)=O)C5=CC2=C1 DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N 0.000 description 1
- BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N chembl530 Chemical compound N(/[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)=C\N1CCCCCC1 BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 229910052729 chemical element Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 1
- HHTOWVWIVBSOKC-UHFFFAOYSA-N cis,trans-5'-hydroxythalidomide Chemical compound O=C1NC(=O)C(O)CC1N1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O HHTOWVWIVBSOKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 1
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 1
- 229950001320 clinafloxacin Drugs 0.000 description 1
- QGPKADBNRMWEQR-UHFFFAOYSA-N clinafloxacin Chemical compound C1C(N)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN(C3CC3)C2=C1Cl QGPKADBNRMWEQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 1
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 1
- 229960003326 cloxacillin Drugs 0.000 description 1
- LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N cloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 101150075361 cps3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229960002488 dalbavancin Drugs 0.000 description 1
- 108700009376 dalbavancin Proteins 0.000 description 1
- 229960002615 dalfopristin Drugs 0.000 description 1
- 108700028430 dalfopristin Proteins 0.000 description 1
- SUYRLXYYZQTJHF-VMBLUXKRSA-N dalfopristin Chemical compound O=C([C@@H]1N(C2=O)CC[C@H]1S(=O)(=O)CCN(CC)CC)O[C@H](C(C)C)[C@H](C)\C=C\C(=O)NC\C=C\C(\C)=C\[C@@H](O)CC(=O)CC1=NC2=CO1 SUYRLXYYZQTJHF-VMBLUXKRSA-N 0.000 description 1
- 229960005484 daptomycin Drugs 0.000 description 1
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N daptomycin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 description 1
- 210000000852 deltoid muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229960001585 dicloxacillin Drugs 0.000 description 1
- YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N dicloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=C(Cl)C=CC=C1Cl YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000895 doripenem Drugs 0.000 description 1
- AVAACINZEOAHHE-VFZPANTDSA-N doripenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](CNS(N)(=O)=O)C1 AVAACINZEOAHHE-VFZPANTDSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960000740 enrofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229960002770 ertapenem Drugs 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960003760 florfenicol Drugs 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 229960004273 floxacillin Drugs 0.000 description 1
- 229960004884 fluconazole Drugs 0.000 description 1
- RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N fluconazole Chemical compound C1=NC=NN1CC(C=1C(=CC(F)=CC=1)F)(O)CN1C=NC=N1 RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229960004675 fusidic acid Drugs 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical compound O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 229960001430 garenoxacin Drugs 0.000 description 1
- NJDRXTDGYFKORP-LLVKDONJSA-N garenoxacin Chemical compound N([C@@H](C1=CC=2)C)CC1=CC=2C(C=1OC(F)F)=CC=C(C(C(C(O)=O)=C2)=O)C=1N2C1CC1 NJDRXTDGYFKORP-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- 229960003923 gatifloxacin Drugs 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960003170 gemifloxacin Drugs 0.000 description 1
- ZRCVYEYHRGVLOC-HYARGMPZSA-N gemifloxacin Chemical compound C1C(CN)C(=N/OC)/CN1C(C(=C1)F)=NC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 ZRCVYEYHRGVLOC-HYARGMPZSA-N 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005256 gram-negative cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000004857 imidazopyridinyl group Chemical class N1C(=NC2=C1C=CC=N2)* 0.000 description 1
- 229960002182 imipenem Drugs 0.000 description 1
- ZSKVGTPCRGIANV-ZXFLCMHBSA-N imipenem Chemical compound C1C(SCC\N=C\N)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@H]([C@H](O)C)[C@H]21 ZSKVGTPCRGIANV-ZXFLCMHBSA-N 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 229960004130 itraconazole Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960004125 ketoconazole Drugs 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 1
- 229960003907 linezolid Drugs 0.000 description 1
- TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N linezolid Chemical compound O=C1O[C@@H](CNC(=O)C)CN1C(C=C1F)=CC=C1N1CCOCC1 TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960001977 loracarbef Drugs 0.000 description 1
- JAPHQRWPEGVNBT-UTUOFQBUSA-N loracarbef Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(Cl)CC[C@@H]32)C([O-])=O)=O)[NH3+])=CC=CC=C1 JAPHQRWPEGVNBT-UTUOFQBUSA-N 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002260 meropenem Drugs 0.000 description 1
- DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N meropenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](C(=O)N(C)C)C1 DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229960004023 minocycline Drugs 0.000 description 1
- 201000002266 mite infestation Diseases 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003702 moxifloxacin Drugs 0.000 description 1
- FABPRXSRWADJSP-MEDUHNTESA-N moxifloxacin Chemical compound COC1=C(N2C[C@H]3NCCC[C@H]3C2)C(F)=CC(C(C(C(O)=O)=C2)=O)=C1N2C1CC1 FABPRXSRWADJSP-MEDUHNTESA-N 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960003128 mupirocin Drugs 0.000 description 1
- 229930187697 mupirocin Natural products 0.000 description 1
- DDHVILIIHBIMQU-YJGQQKNPSA-L mupirocin calcium hydrate Chemical compound O.O.[Ca+2].C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1O[C@H]1C[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCCCCCCC([O-])=O)OC1.C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1O[C@H]1C[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCCCCCCC([O-])=O)OC1 DDHVILIIHBIMQU-YJGQQKNPSA-L 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N netilmycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@]([C@H](NC)[C@@H](O)CO1)(C)O)NCC)[C@H]1OC(CN)=CC[C@H]1N ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229960000564 nitrofurantoin Drugs 0.000 description 1
- NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N nitrofurantoin Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 description 1
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229960001699 ofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N ortho-aminobenzoylamine Natural products NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 229960004236 pefloxacin Drugs 0.000 description 1
- FHFYDNQZQSQIAI-UHFFFAOYSA-N pefloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCN(C)CC1 FHFYDNQZQSQIAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 229960002292 piperacillin Drugs 0.000 description 1
- WCMIIGXFCMNQDS-IDYPWDAWSA-M piperacillin sodium Chemical compound [Na+].O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C([O-])=O)C(C)(C)S[C@@H]21 WCMIIGXFCMNQDS-IDYPWDAWSA-M 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960005224 roxithromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TUPFOYXHAYOHIB-WZGOVNIISA-M sodium;(2s,5r,6r)-6-[[(2s)-2-[(4-ethyl-2,3-dioxopiperazine-1-carbonyl)amino]-2-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylate;(2s,3s,5r)-3-methyl-4,4,7-trioxo-3-(triazol-1-ylmethyl)-4$l^{6}-thia-1-azabicyclo[3.2.0]h Chemical compound [Na+].C([C@]1(C)S([C@H]2N(C(C2)=O)[C@H]1C(O)=O)(=O)=O)N1C=CN=N1.O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@@H](C=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C([O-])=O)C(C)(C)S[C@@H]21 TUPFOYXHAYOHIB-WZGOVNIISA-M 0.000 description 1
- 229960004954 sparfloxacin Drugs 0.000 description 1
- DZZWHBIBMUVIIW-DTORHVGOSA-N sparfloxacin Chemical compound C1[C@@H](C)N[C@@H](C)CN1C1=C(F)C(N)=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN(C3CC3)C2=C1F DZZWHBIBMUVIIW-DTORHVGOSA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 229960001294 spiramycin Drugs 0.000 description 1
- 229930191512 spiramycin Natural products 0.000 description 1
- 235000019372 spiramycin Nutrition 0.000 description 1
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 208000026843 stiff neck Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N sulbactam Chemical compound O=S1(=O)C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 229960005404 sulfamethoxazole Drugs 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N sulphamethoxazole Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005494 tarnishing Methods 0.000 description 1
- 229960001608 teicoplanin Drugs 0.000 description 1
- 229960003250 telithromycin Drugs 0.000 description 1
- LJVAJPDWBABPEJ-PNUFFHFMSA-N telithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@]2(OC(=O)N(CCCCN3C=C(N=C3)C=3C=NC=CC=3)[C@@H]2[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@]1(C)OC)C)CC)[C@@H]1O[C@H](C)C[C@H](N(C)C)[C@H]1O LJVAJPDWBABPEJ-PNUFFHFMSA-N 0.000 description 1
- 229960001114 temocillin Drugs 0.000 description 1
- BVCKFLJARNKCSS-DWPRYXJFSA-N temocillin Chemical compound N([C@]1(OC)C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C(C(O)=O)C=1C=CSC=1 BVCKFLJARNKCSS-DWPRYXJFSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004659 ticarcillin Drugs 0.000 description 1
- OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N ticarcillin Chemical compound C=1([C@@H](C(O)=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)C=CSC=1 OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N 0.000 description 1
- 229960004089 tigecycline Drugs 0.000 description 1
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 1
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 1
- 229960000497 trovafloxacin Drugs 0.000 description 1
- WVPSKSLAZQPAKQ-CDMJZVDBSA-N trovafloxacin Chemical compound C([C@H]1[C@@H]([C@H]1C1)N)N1C(C(=CC=1C(=O)C(C(O)=O)=C2)F)=NC=1N2C1=CC=C(F)C=C1F WVPSKSLAZQPAKQ-CDMJZVDBSA-N 0.000 description 1
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 1
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 1
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 101150103517 uppS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 208000014001 urinary system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229960003842 virginiamycin Drugs 0.000 description 1
- 235000019373 virginiamycin Nutrition 0.000 description 1
- 229960004740 voriconazole Drugs 0.000 description 1
- BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N voriconazole Chemical compound C1([C@H](C)[C@](O)(CN2N=CN=C2)C=2C(=CC(F)=CC=2)F)=NC=NC=C1F BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N 0.000 description 1
- 101150111133 wbbJ gene Proteins 0.000 description 1
- 101150046824 wbbK gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N zeven Chemical compound C=1C([C@@H]2C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=C4)C(=O)NCCCN(C)C)=O)[C@H](O)C5=CC=C(C(=C5)Cl)OC=5C=C6C=C(C=5O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O5)C(O)=O)NC(=O)CCCCCCCCC(C)C)OC5=CC=C(C=C5)C[C@@H]5C(=O)N[C@H](C(N[C@H]6C(=O)N2)=O)C=2C(Cl)=C(O)C=C(C=2)OC=2C(O)=CC=C(C=2)[C@H](C(N5)=O)NC)=CC=C(O)C=1C3=C4O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N 0.000 description 1
Abstract
COMPOSIÇÃO, USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, CÉLULA HOSPEDEIRA PROCARIÓTICA, E, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA CARREADORA N-GLICOSILADA. É provido aqui um novo polissacarídeo de E. Coli O, O25B. São também providas aqui células hospedeiras compreendendo enzimas (por exemplo, glicosiltransferases) usadas na produção de O25B. As células hospedeiras providas aqui produzem bioconjugados de O25B, em que os ditos bioconjugados compreendem O25b ligados à uma proteína carreadora. São também providas aqui composições por exemplo, composições farmacêuticas compreendendo O25B e/ou bioconjugados compreendendo O25B. Tais composições podem ser usadas como vacinas contra infecção com ExPEC e podem compreender adicionalmente um ou mais bioconjugados adicionais.
Description
[001] São aqui descritos a estrutura do antígeno de E. COLI O25B, bem como o uso de O25B, métodos de preparação de O25B, e bioconjugados compreendendo O25B. Os requerentes identificaram o aglomerado de genes de E. COLI como responsável pela produção de O25B e caracterizaram completamente a estrutura do antígeno O25B. Dessa maneira, são aqui fornecidos são ácidos nucleicos capazes de produzir O25B em células hospedeiras. São também aqui fornecidas células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras recombinadas por engenharia genética, compreendendo ácidos nucleicos capazes de produzir O25B. Tais células hospedeiras podem ser usadas para gerar bioconjugados compreendendo O25B ligado à uma proteína carreadora, que pode ser usada, por exemplo, na formulação de terapêuticos (por exemplo, vacinas). O antígeno O O25B aqui descrito também é usado na geração de anticorpos, os quais podem ser usados, por exemplo, em métodos terapêuticos tal como imunização passiva de sujeitos. São aqui fornecidas adicionalmente as composições compreendendo O25B, sozinhas ou em combinação com outros antígenos de E. COLI (por exemplo, O1, O2, e O6 e subsorotipos dos mesmos), para uso em métodos terapêuticos, por exemplo, vacinação de hospedeiros contra infecção com E. COLI (por exemplo, patogênica extra-intestinal, tal como E. COLI uropatogênica).
[002] E. COLI patogênica extra-intestinal (ExPEC) causa uma ampla variedade de infecções que são responsáveis por morbidade, mortalidade e custos significativos anualmente. As infecções do trato urinário estão entre as condições mais frequentes causadas por ExPEC em seres humanos.
[002] E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC) causa uma ampla variedade de infecções que são responsáveis por morbidade, mortalidade e custos significativos anualmente. As infecções do trato urinário estão entre as condições mais frequentes causadas por ExPEC em seres humanos. Entretanto, as condições associadas ao risco de vida, tais como meningite e sepse, também são causadas por ExPEC.
[003] A resistência bacteriana aos antibióticos é uma grande preocupação na luta contra infecção bacteriana, e cepas de E. coli multirresistentes aos medicamentos (MDR) estão se tornando mais e mais prevalentes. Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; e Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10):1165-1176. Assim, o desenvolvimento de vacinas eficientes contra ExPEC é necessário.
[004] Em um aspecto, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo ácidos nucleicos que codificam enzimas (por exemplo, glicosiltransferases) capazes de produzir o novo polissacarídeo aqui descrito, E. coli O25B. São também fornecidas aqui células hospedeiras compreendendo ácidos nucleicos que codificam enzimas (por exemplo, glicosiltransferases) capazes de produzir outros antígenos de E. coli, por exemplo, O25A, O1, O2, e O6, e subsorotipos dos mesmos. As células hospedeiras aqui fornecidas podem expressar naturalmente ácidos nucleicos específicos para a produção de um antígeno O de interesse, ou as células hospedeiras podem ser preparadas para expressar tais ácidos nucleicos, isto é, em certas modalidades, os ditos ácidos nucleicos são heterólogos às células hospedeiras. Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam enzimas adicionais ativas na N- glicosilação de proteínas, por exemplo, a célula hospedeira aqui fornecida pode compreender adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase ou ácidos nucleicos que codificam outras glicosiltransferases. Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem um ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora, por exemplo, uma proteína na qual oligossacarídeos e/ou polissacarídeos podem ser anexados para formar um bioconjugado. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli. Ver seção 5.3.
[005] Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO:12), ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO:12). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[006] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec163), ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec163). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X- Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[007] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec177), ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec177). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X- Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[008] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica geneticamente modificada para compreender (por exemplo, por introdução de um ou mais vetores/plasmídeos na célula hospedeira) um, dois, três, quatro, ou mais dos seguintes genes (ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um dos seguintes genes): rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2), rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), wekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10), e/ou wbbL (SEQ ID NO:11). Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, uma oligossacaril transferase heteróloga). Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[009] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica geneticamente modificada para compreender (por exemplo, por introdução de um ou mais vetores/plasmídeos na célula hospedeira) um, dois, três, quatro, ou mais dos seguintes (i) dTDP-Glicose 4,6-desidratase; (ii) dTDP-6-Desoxi-D-glicose 3,5-epimerase; (iii) Glicose-1- fosfato timidililtransferase; (iv) dTDP-4-desidroramnose 3,5-epimerase; (v) flipase de antígeno O; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase; (vii) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- glicosiltransferase; (viii) polimerase de antígeno O; (ix) O-acetil transferase; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- glicosiltransferase; e/ou (xi) dTDP- Rha: GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, uma oligossacaril transferase heteróloga). Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[0010] Em certas modalidades, as células hospedeiras procarióticas aqui fornecidas compreendem uma eliminação ou inativação funcional de um ou mais genes. Ver Seção 5.3.1. Em uma modalidade específica, um ou mais do gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS, ou o aglomerado de genes rfb (ou um gene ou genes no aglomerado rfb) é eliminado ou funcionalmente inativado do genoma de uma célula hospedeira procariótica aqui fornecida.
[0011] As proteínas carreadoras expressas pelas células hospedeiras procarióticas aqui fornecidas podem ser selecionadas de qualquer das proteínas carreadoras conhecidas pelos versados na técnica, por exemplo, exotoxina A desintoxicada de P. aeruginosa (EPA; ver, por exemplo, Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, proteína de ligação de maltose (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetânico, hemolisina A desintoxicada de S. aureus, fator de aglutinação A, fator de aglutinação B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina lábil ao calor de E. coli, variantes desintoxicados de enterotoxina lábil ao calor de E. coli, subunidade B de toxina da cólera (CTB), toxina da cólera, variantes desintoxicados de toxina da cólera, proteína Sat de E. coli, o domínio passageiro de proteína Sat de E. coli, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae e variantes desintoxicados dos mesmos, AcrA de C. jejuni, e glicoproteínas naturais de C. jejuni. Em uma modalidade específica, a proteína carreadora expressa por uma célula hospedeira procariótica aqui fornecida é exotoxina desintoxicada de Pseudomonas (EPA). Em certas modalidades, a proteína carreadora de um célula hospedeira aqui fornecida compreende uma sequência sinal para alvejar a proteína carreadora no espaço periplasmático da célula hospedeira. Em uma modalidade específica, a sequência sinal é de DsbA de E. coli, porina A de membrana externa de E. coli (OmpA), proteína de ligação de maltose de E. coli (MalE), pectato liase de Erwinia carotovorans (PelB), FlgI, NikA, ou endoxilanase de Bacillus sp. (XynA), enterotoxina LTIIb lábil ao calor de E. coli, endoxilanase XynA de Bacillus, ou flagelina de E. coli (FlgI). Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína carreadora expressa pelas células hospedeiras aqui fornecidas foi geneticamente modificada (por exemplo, por meio de técnicas recombinantes) para codificar uma ou mais da sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); e/ou a sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em certas modalidades, as proteínas carreadoras expressas pelas células hospedeiras aqui fornecidas compreendem dois, três, quatro, cinco ou mais das ditas sequências de consenso. Ver Seção 5.3.2.
[0012] Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de produzir uma proteína carreadora N-glicosilada (aqui também referida como um bioconjugado) que compreende uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) N-ligada a um antígeno O de E. coli (por exemplo, E. coli O25B), o dito método compreendendo cultivar uma célula hospedeira aqui descrita em condições adequadas para a produção de proteínas, e purificar a proteína carreadora N-glicosilada. Métodos para produzir proteínas que usam células hospedeiras, por exemplo, E. coli, e isolar proteínas produzidas pelas células hospedeiras, são bem conhecidos na técnica. Ver Seção 5.3.
[0013] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos bioconjugados produzidos pelas células hospedeiras aqui fornecidas. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) N-ligada a E. coli O25B. Ver Seção 5.4.
[0014] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um composto da fórmula O25B, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, a proteína carreadora é N-ligada ao antígeno O da fórmula O25B.
[0015] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um composto da fórmula O25B’, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, a proteína carreadora é N-ligada ao antígeno O da fórmula O25B’.
[0016] Em um outro aspecto, é aqui fornecido um antígeno O isolado from uma cepa um ExPEC de E. coli, em que a dita cepa produz O25B. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isolado da cepa E. coli upec138. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isolado da cepa E. coli upec163. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isolado da cepa E. coli upec177. Ver Seção 5.2.
[0017] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma população de macromoléculas isoladas da fórmula O25B, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, n de pelo menos 80 % das macromoléculas na população está entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20.
[0018] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma população de macromoléculas isoladas da fórmula O25B’, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, n de pelo menos 80 % das macromoléculas na população está entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20.
[0019] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos métodos de gerar anticorpos anti-O25B usando O25B e/ou um bioconjugado compreendendo O25B. São aqui fornecidos adicionalmente anticorpos produzidos de acordo com tais métodos. Ver Seção 5.5.
[0020] Em um outro aspecto, são aqui fornecidas composições, por exemplo, composições farmacêuticas, compreendendo os bioconjugados aqui fornecidos e/ou as macromoléculas (ou populações das mesmas) aqui fornecidas. Ver Seção 5.6.
[0021] Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo uma macromolécula que compreende uma estrutura da fórmula O25B: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20.
[0022] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo uma macromolécula que compreende uma estrutura da fórmula O25B’: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20.
[0023] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado aqui descrito, em que o dito bioconjugado compreende uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um composto da fórmula O25B, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, a proteína carreadora é N-ligada ao antígeno O da fórmula O25B’.
[0024] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado aqui descrito, em que o dito bioconjugado compreende uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um composto da fórmula O25B’, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, a proteína carreadora é N-ligada ao antígeno O da fórmula O25B’.
[0025] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas aqui fornecidas compreendem um ou mais antígenos O adicionais de E. coli, em que os ditos antígenos não são O25B (por exemplo, a fórmula O25B ou a fórmula O25B’), por exemplo, antígenos O de E. coli (por exemplo, ExPEC) sem ser aqueles de um sorotipo de E. coli O25B, e/ou um ou mais bioconjugados compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de E. coli, em que o dito antígeno não é O25B (por exemplo, a fórmula O25B ou a fórmula O25B’). Tais composições podem compreender uma ou mais macromoléculas adicionais compreendendo um antígeno O de ExPEC e/ou um ou mais bioconjugados adicionais, por exemplo, uma macromolécula O1A, O2, e/ou O6 e/ou um bioconjugado O1A, O2, e/ou O6.
[0026] Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo uma ou mais macromoléculas adicionais compreendendo um antígeno O de ExPEC e/ou um ou mais bioconjugados adicionais, além de uma macromolécula O25B (por exemplo, uma macromolécula compreendendo a fórmula O25B ou a fórmula O25B’) e/ou um bioconjugado O25B (por exemplo, um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada à fórmula O25B ou à fórmula O25B’), em que as ditas macromoléculas adicionais compreendem uma estrutura selecionada do grupo que consiste em:
[0027] Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um, dois, três, quatro, cinco, seis, ou sete macromoléculas ou bioconjugados compreendendo as ditas macromoléculas, além de uma macromolécula O25B (por exemplo, uma macromolécula compreendendo a fórmula O25B ou a fórmula O25B’) e/ou um bioconjugado O25B (por exemplo, um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada à fórmula O25B ou a fórmula O25B’), em que as ditas macromoléculas adicionais compreendem uma estrutura selecionada do grupo que consiste em:
[0028] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B), ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B) e (ii) uma macromolécula O1 ou um bioconjugado compreendendo O1. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1C.
[0029] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B), ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B) e (ii) uma macromolécula O2 ou um bioconjugado compreendendo O2. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B.
[0030] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B), ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B) e (ii) uma macromolécula O6 (por exemplo, uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação (O6Glc) ou um monossacarídeo GlcNAc de ramificação(O6GlcNAc)) ou um bioconjugado compreendendo O6. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O6 é uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação (O6Glc).
[0031] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo pelo menos dois dos seguintes: (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B) ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B); (ii) uma macromolécula O1 ou um bioconjugado compreendendo O1; (iii) um O2 ou um bioconjugado compreendendo O2; e/ou (iv) uma macromolécula O6 (por exemplo, uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação ou um monossacarídeo GlcNAc de ramificação) ou um bioconjugado compreendendo O6. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1C. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O6 é uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação (aqui também referida como O6Glc).
[0032] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo uma macromolécula O25B, uma macromolécula O1A, uma macromolécula O2, e uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação. Em certas modalidades, as ditas macromoléculas são conjugadas nas proteínas carreadoras.
[0033] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos métodos de prevenir infecção de um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, por ExPEC, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade farmaceuticamente eficiente de uma composição (por exemplo, uma composição imunogênica) aqui descrita. Ver Seção 5.7.
[0034] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos métodos de tratar infecção de um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, em que o sujeito é infectado com ExPEC, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade farmaceuticamente eficiente de uma composição (por exemplo, uma composição imunogênica) aqui descrita. Ver Seção 5.7.
[0035] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos métodos de induzir uma resposta imune contra ExPEC em um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade farmaceuticamente eficiente de uma composição (por exemplo, uma composição imunogênica) aqui descrita. Ver Seção 5.7.
[0036] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos métodos de induzir a produção de anticorpos opsonofagocíticos contra ExPEC em um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade farmaceuticamente eficiente de uma composição (por exemplo, uma composição imunogênica) aqui descrita. Ver Seção 5.7.
[0037] OPS: polissacarídeo O; o antígeno O de bactérias Gram- negativas. OPS são também descritos aqui como antígeno O.
[0038] Aglomerado rfb: um aglomerado de genes (por exemplo, um aglomerado de genes de E. coli) que codifica maquinaria enzimática capaz de sintetizar uma estrutura principal de antígeno O. O termo aglomerado rfb pode ser aplicado a qualquer aglomerado biossintético de antígeno O, incluindo aqueles das bactérias que não pertencem ao gênero Escherichia.
[0039] waaL: o gene ligase do antígeno O que codifica uma enzima ligada à membrana com um sítio ativo localizado no periplasma. A enzima codificada transfere antígeno O ligado ao undecaprenilfosfato (UPP) para uma parte central de lipídeo A, formando lipopolissacarídeo.
[0040] wecA: o primeiro gene codificado no aglomerado wec. A proteína codificada catalisa a transferência de um GlcNAc-fosfato de UDP- GlcNAc para UPP, para formar GlcNAc ligado à UPP.
[0041] ECA: antígeno comum à enterobactéria.
[0042] RU: unidade repetida. Da maneira aqui usada, o RU é definida igual à unidade repetida biológica, BRU. A BRU descreve a RU de um antígeno O como este é sintetizado in vivo.
[0043] UPP: undecaprenilpirofosfato.
[0044] LLO: oligossacarídeo ligado à lipídeo.
[0045] 2AB: 2 amino benzamida.
[0046] MS: espectroscopia de massa.
[0047] O25B: o termo O25B se refere ao antígeno O O25B de E. coli aqui identificado (um subsorotipo de E. coli sorotipo O25). Referência ao O25B inclui aqui a fórmula O25B e a fórmula O25B’, ambas identificadas anteriormente.
[0048] O25A: o termo O25A se refere ao antígeno O25A de E. coli (um subsorotipo de E. coli sorotipo O25). Referência ao O25A inclui aqui a fórmula O25A e a fórmula O25A’, ambas identificadas anteriormente.
[0049] O1A: o termo O1A se refere ao antígeno O1A de E. coli (um subsorotipo de E. coli sorotipo O1). Referência ao O1A inclui aqui a fórmula O1A e a fórmula O1A’, ambas identificadas anteriormente.
[0050] O1B: o termo O1B se refere ao antígeno O1B de E. coli (um subsorotipo de E. coli sorotipo O1). Referência ao O1B inclui aqui a fórmula O1B e a fórmula O1B’, ambas identificadas anteriormente.
[0051] O1C: o termo O1C se refere ao antígeno O1C de E. coli (um subsorotipo de E. coli sorotipo O1). Referência ao O1C inclui aqui a fórmula O1C e a fórmula O1C’, ambas identificadas anteriormente.
[0052] O2: o termo O2 se refere ao antígeno O2 de E. coli (E. coli sorotipo O2). Referência ao O2 inclui aqui a fórmula O2 e a fórmula O2’, ambas identificadas anteriormente.
[0053] O6: o termo O6 se refere ao antígeno O6 de E. coli (E. coli sorotipo O6). Referência ao O6 inclui aqui a fórmula O6 e a fórmula O6’, ambas identificadas anteriormente.
[0054] Bioconjugado: o termo bioconjugado se refere ao conjugado entre uma proteína (por exemplo, uma proteína carreadora) e um antígeno, por exemplo, um antígeno O (por exemplo, O25B) preparado em um ambiente de célula hospedeira, em que a maquinaria da célula hospedeira liga o antígeno O à proteína (por exemplo, N-ligações). Glicoconjugados incluem bioconjugados, bem como conjugados de antígeno de açúcar (por exemplo, oligo e polissacarídeos)-proteína preparados por outros meios, por exemplo, por ligação química da proteína e antígeno de açúcar.
[0055] O termo “cerca de,” quando usado junto com um número, se refere a qualquer número em ±1, ±5 ou ±10 % do número referenciado.
[0056] Da maneira aqui usada, o termo “quantidade eficiente”, no contexto de administrar uma terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) a um sujeito, se refere à quantidade de uma terapia que apresenta um(s) efeito(s) profilático(s) e/ou terapêutico(s). Em certas modalidades, uma “quantidade eficiente” se refere à quantidade de uma terapia que é suficiente para atingir um, dois, três, quatro, ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade de uma infecção por ExPEC ou sintoma associado à esta; (ii) reduzir a duração de uma infecção por ExPEC ou sintoma associado à esta; (iii) prevenir a progressão de uma infecção por ExPEC ou sintoma associado à esta; (iv) causar a regressão de uma infecção por ExPEC ou sintoma associado à esta; (v) prevenir o desenvolvimento ou início de uma infecção por ExPEC, ou sintoma associado à esta; (vi) prevenir a recorrência de uma infecção por ExPEC ou sintoma associado à esta; (vii) reduzir a falência dos órgãos associada à uma infecção por ExPEC; (viii) reduzir a hospitalização de um sujeito com uma infecção por ExPEC; (ix) reduzir o tempo de hospitalização de um sujeito com uma infecção por ExPEC; (x) aumentar a sobrevivência de um sujeito com uma infecção por ExPEC; (xi) eliminar uma infecção por ExPEC em um sujeito; (xii) inibir ou reduzir a replicação de ExPEC em um sujeito; e/ou (xiii) aumentar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de uma outra terapia.
[0057] Da maneira aqui usada, o termo “em combinação”, no contexto da administração de duas ou mais terapias a um sujeito, se refere ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo “em combinação” não se restringe à ordem na qual as terapias são administradas a um sujeito. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) pode ser administrada antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subsequente à (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas após) administração de uma segunda terapia em um sujeito.
[0058] Da maneira aqui usada, o termo “sujeito” se refere a um animal (por exemplo, pássaros, répteis e mamíferos). Em uma outra modalidade, um sujeito é um mamífero, incluindo um não-primata (por exemplo, um camelo, burro, zebra, vaca, porco, cavalo, ovelha, cabra, gato, cachorro, rato e camundongo) e um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé e um humano). Em certas modalidades, um sujeito é um animal não humano. Em algumas modalidades, um sujeito é um animal de fazenda ou doméstico (por exemplo, um cachorro, gato, cavalo, ovelha, cabra, porco, burro ou galinha). Em uma outra modalidade, um sujeito é um humano. Em uma outra modalidade, um sujeito é um bebê. Em uma outra modalidade, um sujeito é uma criança. Em uma outra modalidade, um sujeito é um adulto humano. Em uma outra modalidade, um sujeito é um humano idoso. Em uma outra modalidade, um sujeito é um bebê prematuro. Os termos “sujeito” e “paciente” podem ser aqui usados indiferentemente.
[0059] Da maneira aqui usada, o termo “bebê prematuro” se refere a um bebê nascido com menos de 37 semanas de gestação.
[0060] Da maneira aqui usada, o termo “bebê” se refere a um recém- nascido até 1 ano de idade.
[0061] Da maneira aqui usada, o termo “criança pequena” se refere a um humano que tem 1 ano até 3 anos de idade.
[0062] Da maneira aqui usada, o termo “criança” se refere a um humano que tem 1 ano até 18 anos de idade.
[0063] Da maneira aqui usada, o termo “adulto humano” se refere a um humano que tem 18 anos ou mais.
[0064] Da maneira aqui usada, o termo “humano idoso” se refere a um humano com 65 anos ou mais.
[0065] Figura 1: Via para a biossíntese de O25A. Setas indicam conversões enzimáticas individuais, nomes de enzima são indicados. Os açúcares ativados por nucleotídeo são preparados no citoplasma tanto por enzimas fornecidas no aglomerado do antígeno O quanto por enzimas próprias da célula hospedeira Gram-negativa. Uma glicosilfosfato transferase (WecA) adiciona D-GlcNAc fosfato ao undecaprenil fosfato (UP), formando GlcNAc-UPP. Glicosiltransferases especificas então alongam a molécula de UPP-GlcNAc adicionalmente, adicionando monossacarídeos, formando o oligossacarídeo de unidade biológica repetida (BRU) (WekABC WbuB). A ordem de enzimas indicada não se refere à sequência de eventos durante a síntese de BRU (indicado por < >). BRU é a seguir invertida no espaço periplasmático por Wzx. Wzy polimeriza linearmente BRU periplasmática para formar o polissacarídeo de antígeno O. O tamanho do polímero é controlado por Wzz. Muitos oligo-e polissacarídeos bacterianos são montados em UPP e a seguir transferidos para outras moléculas, isto é, UPP é uma plataforma de construção geral para oligo- e polissacarídeo em bactérias. Em E. coli, e na maioria das outras bactérias gram negativas, o antígeno O é transferido de UPP para a parte principal do lipídeo A pela enzima WaaL de E. coli, para formar lipopolissacarídeo (LPS).
[0066] Figura 2: aglomerado rfb, estrutura, e via para a síntese de antígeno O dependente de wzx/wzy, exemplificado pelo aglomerado rfb e antígeno O de E. coli O25A. A. É exibido a estrutura do aglomerado rfb de E. coli cepa E47a, localizada entre os genes galFand gnd. Os genes são mostrados como setas e o preenchimento é indicado de acordo com a função do produto de genes: preto são os genes para a biossíntese de monossacarídeo ativado por nucleotídeo, que não são parte do repertório próprio de E. coli (aqueles são codificados em outro local no genoma), listras diagonais pretas/brancas são glicosiltransferases responsáveis por adicionar unidades únicas de monossacarídeo às BRUs, flipase wzx e polimerase wzy. B. Estrutura química da BRU do antígeno O25A O apresentada (ver Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4).
[0067] Figura 3. A. Estruturas de O25A, O25B, e O16 BRU. B. comparação de biossíntese do aglomerado de antígeno O (aglomerado rfb) entre O25A, O25B, e O16. Os genes preenchidos com preto são genes envolvidos na biossíntese de monossacarídeo ativado por nucleotídeo, as listras diagonais são os genes previstos de glicosiltransferase, o preenchimento cinza indica genes que processam ou transportam BRU, e as listras verticais mostram homologia com O-acetiltransferase. As caixas cinza indicam pontuações de homologia de 25 % entre os genes; os valores detalhados são indicados. As setas finas pretas e cinza mostram o local de anelamento de oligonucleotídeos por tipagem por PCR para wzy (específico de O25A e O25B) e a região O25B 3’ (específico de O25B).
[0068] Figura 4. Distribuição de sorotipo do estudo de epidemiologia. Os sorotipos de antígeno O de E. coli identificados em amostras de epécimes de UTI adquiridos na comunidade foram agrupados de acordo com a ocorrência.
[0069] Figura 5. Análise de manchamento pela prata e Western de LPS de isolados clínicos com um fenótipo de aglutinação positivo O25. Os números da cepa são identificados abaixo das canaletas do gel. Os clones individuais foram crescidos e a biomassa normalizada OD foi coletada por centrifugação. Os precipitados foram dissolvidos em tampão SDS PAGE Lammli e tratados com proteinase K para hidrolisar todas as proteínas na amostra. A manchamento pela prata padrão foi aplicada ao gel PAGE mostrado em A, e a sondagem de membranas de nitrocelulose contendo material eletrotransferido de géis identicamente corridos com antissoro de aglutinação O25 comercial é mostrada em B.
[0070] Figura 6. Traços 2AB HPLC de amostras O25A e O25B. Amostras LLO marcadas com 2AB de cepas upec138 (linha pontilhada) e upec436 (linha sólida) foram preparados. Os picos foram coletados e as estruturas de BRU correspondentes deduzidas do padrão de fragmentação MS/MS detalhadas na figura 7 são indicados por setas.
[0071] Figura 7. As séries de íon de fragmentação MS/MS obtidas de picos indicados na figura 6 em tempos de eluição 50’ e 62’ de íons mãe m/z=1022 (A; da cepa upec138) ou m/z=1021 (B; de upec_436). As séries de íon são mostradas em relação ao desenho da provável BRU.
[0072] Figura 8. Desacetilação de amostra de LLO marcada com 2AB derivada de um isolado clínico positivo O25B. O pico específico de O25B no tempo de eluição 50’, obtido de LLOs marcados com 2AB de um isolado clínico com o genótipo O25B, foi coletado e analisado por HPLC de fase normal após tratamento com NaOH (linha sólida) ou sem (linha pontilhada) para hidrólise de grupos O-acetil do programa de patente especial ND Cal.
[0073] Figura 9. Análise da composição de monossacarídeo de bioconjugados O25A e O25B. Os bioconjugados O25 foram produzidos, purificados, e processados para análise de composição de monossacarídeo. Os traços de HPLC C18 de amostras são mostrados. As amostras derivadas de O25A (sólido) e O25B (pontilhado) são comparadas à uma mistura de monossacarídeos de fontes comerciais (Glc, GlcNAc, Rha, FucNAc). Os tempos de eluição dos monossacarídeos são indicados por setas.
[0074] Figura 10. Caracterização de bioconjugados O25A. O volume final purificado de bioconjugados 4S-EPA-O25A foi analisado por SDS PAGE e visualizado por coloração direta de Coomassie (C) e Western blotting usando tanto anti-soro anti-EPA quanto anti-soro anti-O25.
[0075] Figura 11. Caracterização de bioconjugados O25B. O volume final purificado de bioconjugados 4S-EPA-O25B foi analisado por SDS PAGE e visualizado por coloração direta de Coomassie (C) e Western blotting usando tanto anti-soro anti-EPA quanto anti-soro anti-O25.
[0076] Figura 12. Biossíntese genética e estrutura química de antígeno O O1. A. O aglomerado rfb e genes que flanqueiam da cepa E. coli O1A G1632 (número de acesso GU299791) é mostrado. Os códigos de cor para listras preta, cinza são os mesmos para a figura 2, descritos anteriormente. B. Estruturas químicas de BRU dos subsorotipos O1 são mostradas.
[0077] Figura 13. Análise de LPS de isolados clínicos com um fenótipo de aglutinação positivo O1. A. Manchamento pela prata e B. Western blotting usando anti-soro anti-O1.
[0078] Figura 14. Identificação de O1A em isolados clínicos O1. Amostras de LLO marcadas com 2AB de isolados clínicos O1 foram analisadas por impressão digital de LLO. A. Traços de HPLC de fase normal de 60’ para frente são mostrados. A linha de base para cada amostra foi deslocada para visualizar picos de co-migração. O número upec indica a cepa clínica. B. Séries de íon por fragmentação MS/MS de m/z=1849,6 (aduto de Na+). O desenho determina o padrão de íon de fragmentação e prováveis quebras de ponte glicosídica em um oligossacarídeo de 2 BRU de O1A.
[0079] Figura 15. Bioconjugados O1. Teste de expressão em escala menor de glicoproteína EPA-O1 por células de E. coli (W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL) transformadas com um plasmídeo de expressão EPA (pGVXN659) e cinco diferentes plasmídeos de expressão pglB: A, p114: expressão de códon não otimizado, marcação com HA contendo pglB; B, p939: códon optimizado, marcação com HA contendo pglB; C, p970: códon optimizado, marcação com HA removeu pglB; D, códon otimizado, contendo marcação com HA, sítio de glicosilação natural N534Q removeu pglB; e, códon otimizado, marcação com HA removida, sítio de glicolisação natural N534Q removeu pglB. As células foram crescidas e induzidas com arabinose e IPTG, após incubação por toda a noite a 37 °C, as células foram coletadas e os extratos de proteína periplasmática foram preparadas. Os extratos foram então separados por SDS PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose por electrotransferência, e imunodetectados usando um anti-soro EPA.
[0080] Figura 16. Bioconjugados descritos na figura 15, detectados com soro anti-O1.
[0081] Figura 17. Estruturas genéticas e químicas O6. A. Biossíntese de aglomerado de antígeno O (aglomerado rfb) e genes que flanqueiam E. coli CFT073 (Genbank AE014075.1). Prováveis funções de gene de acordo com BLAST são indicados e genes específicos para a biossíntese de antígeno O O6 são indicados. B. Estruturas químicas de estruturas O6 BRU relatadas (Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225).
[0082] Figura 18. Identificação de O6 com Glc de ramificação. Amostras de LLO marcadas com 2AB de isolados clínicos O6 foram analisados por impressão digital de LLO. A. Traços de HPLC de fase normal de 60’ para frentes são mostrados. Os extratos foram preparados de cepas de referência CCUG11309 (linha sólida fina) e 11311 (traçado) contendo ramificações de Glc e GlcNAC. A sobreposição mostra diferenças evidentes em tempos de eluição das BRUs indicadas. B. Extratos de isolados clínicos indicados por número upec são comparados às cepas de referência de A.
[0083] Figura 19. Biossíntese genética e estruturas químicas do antígeno O O2. A. aglomerado de biossíntese de antígeno O (aglomerado rfb) e genes que flanqueiam da cepa E. coli G1674 (número de acesso GU299792). Os códigos de cor de listra preta e cinza são da maneira descrita nas figuras prévias (por exemplo, Fig. 2). B. Estrutura química de BRU do antígeno O2.
[0084] Figura 20. Análise de LPS de isolados clínicos com um fenótipo de aglutinação positivo O2. A. Manchamento pela prata. B. Western blotting usando anti-O2 anti-soro.
[0085] Figura 21. Análise OPS da cepa W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. Um cromatograma da análise de LLO marcado com 2AB por HPLC de fase normal é mostrado.
[0086] Figura 22. Reconhecimento de LPS O25A e O25B por antissoros anti-O25A e anti-O25B MBP em uma análise por Western blotting. Duas membranas de nitrocelulose que foram obtidas após eletrotransferência de amostras de LPS preparadas a partir de upec436 (O25A) e upec138 (O25B), e separadas por um SDS-PAGE. O padrão de carga foi idêntico para ambas as membranas, canaleta esquerda: LPS O25A LPS de upec438, canaleta do meio: LPS O25B de upec 138. Bioconjugados MBP foram usados para imunização de coelhos. Painel esquerdo: anti-soro anti O25B-MBP; painel direito: anti-soro anti O25A-MBP.
[0087] Figura 23. Espectros MS/MS de OPS O2 BRU. Espectro MS/MS de aduto de Na+ com m/z=989,4 de pico de eluição em 43,5 minutos, de extratos de LLO marcado com 2AB da cepa CCUG25. O desenho de O2 BRU e a série de íon Y associadas é indicada, confirmando a sequência esperada de monossacarídeo.
[0088] Figura 24. Bioconjugados EPA contendo os antígenos O1A, O2 e O6 usados no estudo pré-clínico. Os glicanos OPS foram produzidos e purificados, e analisados por SDS PAGE, e visualizados por coloração com Coomassie.
[0089] Figura 25 mostra titulações médias por ELISA obtidas com soros de ratos imunizados com O1A-EPA (G1), apenas proteína carreadora (G10), TBS (G11), ou uma composição tetravalente composta de EPA-O1A, O2, O6Glc, e O25B (G12), sondados contra uma placa de ELISA revestida com O1A-LPS purificado a partir da cepa upec032.
[0090] Figura 26 mostra titulações médias por ELISA obtidas com soros de ratos imunizados com O2 -EPA (G4), apenas proteína carreadora (G10), TBS (G11), ou uma composição tetravalente composta de EPA-O1A, O2, O6Glc, e O25B (G12), sondados contra uma placa de ELISA revestida com LPS O2 purificado a partir da cepa CCUG25.
[0091] Figura 27 mostra titulações médias por ELISA obtidas com soros de ratos imunizados com O6Glc-EPA (G7), apenas proteína carreadora (G10), TBS (G11), ou uma composição tetravalente composta de EPA-O1A, O2, O6Glc, e O25B (G12), sondados contra uma placa de ELISA revestida com O6Glc-LPS purificado a partir da cepa CCUG11309.
[0092] Figura 28 mostra titulações médias de ELISA obtidas com soros de ratos imunizados com O25B-EPA (G9), apenas proteína carreadora (G10), TBS (G11), ou uma composição tetravalente composta de O1A, O2, O6Glc, e O25B (G12), sondada contra uma placa de ELISA revestida com LPS O25Bpurificado da cepa upec177.
[0093] Figura 29: Índices de opsonização de soros derivados de ratos pré-imunização (círculos cheios) comparados aos 42 dias pós-imunização (quadrados preenchidos) com uma dose inicial e duas doses de reforço de doses indicadas de vacina monovalente. (A) imunização com O2-EPA; (B) imunização com O6-EPA; (C) imunização com O25B-EPA.
[0094] Figura 30: Titulações de ELISA obtidas com soros de sujeitos humanos vacinados com uma vacina tetravalente compreendendo os antígenos de E. coli O1A, O2, O6Glc, e O25B. Um aumento significativo nas titulações de ELISA entre pós (30 dias após a infecção) e pré-infecção (dia 1) foi observado apenas nos grupos vacinados (*, representa significância estatística).
[0095] Figura 31: Índice opsônico (OI) obtido com soros de sujeitos humanos vacinados com uma vacina tetravalente compreendendo os antígenos de E. coli O1A, O2, O6Glc, e O25B. Resposta imune da maneira indicada por OI contra placebo e componentes da vacina tetravalente (O1A- EPA (31A), O2-EPA (31B), O6Glc-EPA (31C), e O25B-EPA (31D)) antes e após a injeção são representadas. Pré-injeção, definido como dia 1, é representado por V2 (visita 2), e pós-injeção, definido como dia 30, é representado por V4 (visita 4). Um aumento significativo no OI entre pós e pré-injeção (indicado por *, onde múltiplos * representam maior grau de significância) foi observado apenas nos grupos vacinados. NS, nenhuma diferença significativa.
[0096] Figura 32: Titulações de ELISA (expresso como valores de EC50) de soros de sujeitos vacinados com LPS O25A (barras pretas) e LPS O25B (barras cinza), no dia 1 (pré-vacinação) e após 30 dias (após a vacinação). Um aumento estatisticamente significativo nas titulações de ELISA entre pós-injeção (30 dias após a injeção) e pré-injeção (dia 1) foi observado para ambos os sorotipos: LPS O25A (barras pretas) e LPS O25B (barras cinza).
[0097] Figura 33: Reatividade de soros de sujeitos vacinados com cepas de E. coli que expressam O25A (linhas pretas) e O25B (linhas cinza). Linha cinza pontilhada: cepa de sorotipo O75, um controle negativo. Figura 33 demonstra que os anticorpos IgG séricos, induzidos por vacina de sujeitos vacinados, respondem fortemente às cepas O25A e O25B.
[0098] São aqui descritos a estrutura do antígeno de E. coli O25B, bem como usos de O25B, métodos de preparação de O25B, e bioconjugados compreendendo de O25B. Os requerentes identificaram o aglomerado de genes de E. coli responsável pela produção de O25B e caracterizaram completamente a estrutura do antígeno O25B. Dessa maneira, são aqui fornecidos ácidos nucleicos capazes de produzir O25B em células hospedeiras. São também fornecidas aqui células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras genética e recombinantemente modificadas, compreendendo ácidos nucleicos capazes de produzir O25B. Tais células hospedeiras podem ser usadas para gerar bioconjugados compreendendo O25B ligado a uma proteína carreadora, que pode ser usado em, por exemplo, a formulação de terapêuticos (por exemplo, vacinas). O antígeno O O25B aqui descrito também é usado na geração de anticorpos, os quais podem ser usados, por exemplo, em métodos terapêuticos tal como imunização passiva de sujeitos. São aqui fornecidas adicionalmente composições compreendendo O25B, sozinho ou em combinação com outros antígenos de E. coli (por exemplo, O1, O2, e O6 e subsorotipos dos mesmos), para uso em métodos terapêuticos, por exemplo, vacinação de hospedeiros contra infecção com E. coli (por exemplo, E. coli uropatogênica).
[0099] Em um aspecto, são aqui fornecidos ácidos nucleicos isolados relacionados à produção de O25B, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam uma ou mais proteínas de um aglomerado de E. coli O25B rfb. Os versados na técnica entenderão que, em virtude da degeneração do código genético, uma proteína com uma sequência específica de aminoácido pode ser codificada por vários ácidos nucleicos diferentes. Assim, os versados na técnica entenderão que um ácido nucleico aqui fornecido pode ser alterado, de maneira tal que sua sequência seja diferente de uma sequência aqui fornecida, sem afetar a sequência de aminoácido da proteína codificada pelo ácido nucleico.
[00100] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO:12). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de genes que é cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:12. Upec138 é um exemplo de uma cepa de E. coli de sorotipo O25B. Os versados na técnica entenderão que outras cepas deste sorotipo podem agora ser facilmente obtidas de isolados clínicos, de acordo com métodos aqui descritos, e exemplos de tais outras cepas são upec177 e upec163. Consequentemente, onde quer que um aglomerado de genes rfb ou genes individuais de tal aglomerado de tais cepas O25B sejam aqui mencionados, significa que incluem os aglomerados de genes correspondentes ou genes de outras cepas O25B. Igualmente, as sequências fornecidas podem ser encontradas sequenciando o aglomerado de genes rfbs ou, se desejado, de genes individuais de tais outros isolados, e fornecerão sequências homólogas que codificam proteínas homólogas ao aglomerado de genes ou gene. Em qualquer das modalidades onde um aglomerado homólogo de genes ou gene é mencionado, referindo-se à um aglomerado de genes ou gene com um certo percentual, tal sequência homóloga codifica preferivelmente a(s) proteína(s) com a mesma função que aquelas da cepa ou sequência de referência.
[00101] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec163). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de genes que é cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec163).
[00102] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec177). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um ácido nucleico que codifica um aglomerado de genes que é cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec177).
[00103] Em uma outra modalidade, são aqui fornecidos ácidos nucleicos que codificam proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb.
[00104] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:1, o gene rmlB do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:1.
[00105] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:2, o gene rmlD do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:2.
[00106] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:3, o gene rmlA do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:3.
[00107] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:4, o gene rmlC do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:4.
[00108] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:5, o gene wzx do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:5.
[00109] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:6, o gene wekA do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:6.
[00110] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:7, o gene wekB do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:7.
[00111] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:8, o gene wzy do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:8.
[00112] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:9, o gene wbbJ do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:9.
[00113] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:10, o gene wbbK do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:10.
[00114] Em uma modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido compreende ou consiste em SEQ ID NO:11, o gene wbbL do aglomerado de E. coli O25B rfb. Em uma outra modalidade específica, um ácido nucleico que codifica uma proteína de um aglomerado de E. coli O25B rfb aqui fornecido é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:11.
[00115] Em um outro aspecto, são aqui fornecidas proteínas codificadas pelos ácidos nucleicos aqui fornecidos. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido dTDP-Glicose 4,6-desidratase, codificado por SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido dTDP- 6-Desoxi-D-glicose 3,5-epimerase, codificado por SEQ ID NO:2. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido Glicose-1-fosfato timidililtransferase, codificado por SEQ ID NO:3. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido dTDP-4-desidroramnose 3,5-epimerase, codificado por SEQ ID NO:4. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido flipase de antígeno O, codificado por SEQ ID NO:5. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc- UPP α-1,3- ramnosiltransferase, codificado por SEQ ID NO:6. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6- glicosiltransferase, codificado por SEQ ID NO:7. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido polimerase de antígeno O, codificado por SEQ ID NO:8. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido O- acetil transferase, codificado por SEQ ID NO:9. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- glicosiltransferase, codificado por SEQ ID NO:10. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase, codificado por SEQ ID NO:11.
[00116] Em um aspecto, são aqui fornecidos antígenos isolados de E. coli dos sorotipos O25, O1, O2 e O6.
[00117] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isolado de E. coli cepa upec138. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isolado de E. coli cepa upec163. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isolado de E. coli cepa upec177.
[00118] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isoladO25B de E. coli da fórmula O25B:
[00119] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um antígeno O isoladO25B de E. coli da fórmula O25B’:
[00120] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma população de macromoléculas isoladas da fórmula O25B, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, n de pelo menos 80 % das macromoléculas na população está entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20.
[00121] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma população de macromoléculas isoladas da fórmula O25B’, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, n de pelo menos 80 % das macromoléculas na população está entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20.
[00122] Outros antígenos de E. coli usados nas composições aqui descritas (por exemplo, composições terapêuticas, por exemplo, vacinas; ver Seção 5.6) incluem O25A, bem como antígenos O1, O2 e O6, e subsorotipos dos mesmos.
[00123] Em uma modalidade, um antígeno O25A (por exemplo, na forma isolada ou como parte de um bioconjugado) é usado em uma composição aqui fornecida (por exemplo, em combinação com um antígeno O25B (ou bioconjugado compreendendo um antígeno O25B)). Em uma modalidade específica, o antígeno O25A apresenta a fórmula O25A:
[00124] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O25A apresenta a fórmula O25A’:
[00125] Em uma modalidade, um antígeno O1A (por exemplo, na forma isolada ou como parte de um bioconjugado) é usado em uma composição aqui fornecida (por exemplo, em combinação com um antígeno O25B (ou bioconjugado compreendendo um antígeno O25B)). Em uma modalidade específica, o antígeno O1A apresenta a fórmula O1A:
[00126] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O1A apresenta a fórmula O1A’:
[00127] Em uma modalidade, um antígeno O1B (por exemplo, na forma isolada ou como parte de um bioconjugado) é usado em uma composição aqui fornecida (por exemplo, em combinação com um antígeno O25B (ou bioconjugado compreendendo um antígeno O25B)). Em uma modalidade específica, o antígeno O1B apresenta a fórmula O1B:
[00128] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O1B apresenta a fórmula O1B’:
[00129] Em uma modalidade, um antígeno O1C (por exemplo, na forma isolada ou como parte de um bioconjugado) é usado em uma composição aqui fornecida (por exemplo, em combinação com um antígeno O25B (ou bioconjugado compreendendo um antígeno O25B)). Em uma modalidade específica, o antígeno O1C apresenta a fórmula O1C:
[00130] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O1C apresenta a fórmula O1C’:
[00131] Em uma modalidade, um antígeno O2 (por exemplo, na forma isolada ou como parte de um bioconjugado) é usado em uma composição aqui fornecida (por exemplo, em combinação com um antígeno O25B (ou bioconjugado compreendendo um antígeno O25B)). Em uma modalidade específica, o antígeno O2 apresenta a fórmula O2:
[00132] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O2 apresenta a fórmula O2’:
[00133] Em uma modalidade, um antígeno O6 (por exemplo, na forma isolada ou como parte de um bioconjugado) é usado em uma composição aqui fornecida (por exemplo, em combinação com um antígeno O25B (ou bioconjugado compreendendo um antígeno O25B)). Em uma modalidade específica, o antígeno O6 apresenta a fórmula O6K2 (aqui também referida como O6Glc):
[00134] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O6 apresenta a fórmula O6K2’ (aqui também referida como O6Glc’):
[00135] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O6 apresenta a fórmula O6K54 (aqui também referida como O6GlcNAc):
[00136] Em uma outra modalidade específica, o antígeno O6 apresenta a fórmula O6K54’ (aqui também referida como O6GlcNAc’):
[00137] São aqui fornecidas células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras procarióticas, capazes de produzir antígenos O de E. coli e bioconjugados compreendendo tais antígenos O de E. coli. Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem (por exemplo, modificadas naturalmente ou por meio de engenharia genética) um ou mais dos ácidos nucleicos aqui descritos. Ver Seção 5.1. Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui fornecidas produzem um ou mais dos antígenos O de E. coli aqui descritos, e/ou produzem bioconjugados compreendendo um ou mais dos antígenos O de E. coli aqui descritos. Ver Seção 5.2.
[00138] Em um aspecto, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo ácidos nucleicos que codificam enzimas (por exemplo, glicosiltransferases) capazes de produzir o novo polissacarídeo aqui descrito, E. coli O25B. São também aqui fornecidas células hospedeiras compreendendo ácidos nucleicos que codificam enzimas (por exemplo, glicosiltransferases) capazes de produzir outros antígenos de E. coli, por exemplo, O25A, O1, O2, e O6, e subsorotipos dos mesmos (ver Seção 5.2). As células hospedeiras aqui fornecidas podem expressar naturalmente ácidos nucleicos capazes de produzir um antígeno O de interesse, ou as células hospedeiras podem ser preparadas para expressar tais ácidos nucleicos, isto é, em certas modalidades os ditos ácidos nucleicos são heterólogos às células hospedeiras e são introduzidos nas células hospedeiras usando abordagens genéticas conhecidas na técnica. Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam enzimas adicionais ativas na N-glicosilação de proteínas, por exemplo, a célula hospedeira aqui fornecida pode compreender adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase ou ácidos nucleicos que codificam outras glicosiltransferases. Ver, por exemplo, Seção 5.3.3. Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem um ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora, por exemplo, uma proteína na qual oligo- e polissacarídeos podem ser anexados para formar um bioconjugado. Ver, por exemplo, Seção 5.3.2 para uma descrição de proteínas carreadoras e Seção 5.4 para uma descrição de bioconjugados. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00139] Upec138 é uma cepa de E. coli aqui identificada como pertencendo ao sorotipo O25B, e o aglomerado de genes rfb da cepa (e cepas do sorotipo O25B em geral) foi aqui identificado, em um primeiro momento, compreendendo genes que produzem um novo polissacarídeo de E. coli, O25B. Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO:12), ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:12. Em uma modalidade específica, o aglomerado de genes de E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO:12) é introduzido na célula hospedeira por manipulação genética (por exemplo, o aglomerado de genes é expresso em um plasmídeo ou plasmídeos ou integrado no genoma da célula hospedeira (ver, por exemplo, pedido de patente internacional PCT/EP2013/068737)). Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14) ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma outra modalidade específica, alguns ou todos os genes do aglomerado rfb são heterólogos à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita oligossacaril transferase é heteróloga à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita proteína carreadora é heteróloga à célula hospedeira. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00140] Upec163 é uma cepa de E. coli aqui identificada como pertencendo ao sorotipo O25B, e o aglomerado de genes rfb da cepa (e cepas do sorotipo O25B em geral) foi aqui identificado, em um primeiro momento, compreendendo genes que produzem um novo polissacarídeo de E. coli, O25B. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec163), ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec163). Em uma modalidade específica, o aglomerado de genes de E. coli rfb(upec163) é introduzido na célula hospedeira por manipulação genética (por exemplo, o aglomerado de genes é expresso em um plasmídeo ou plasmídeos ou integrado no genoma da célula hospedeira (ver, por exemplo, pedido de patente internacional PCT/EP2013/068737)). Em uma outra modalidade, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14) ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso ou Asp(Glu)-X-Asn- Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma outra modalidade específica, alguns ou todos os genes do aglomerado rfb são heterólogos à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita oligossacaril transferase é heteróloga à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita proteína carreadora é heteróloga à célula hospedeira. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00141] Upec177 é uma cepa de E. coli aqui identificada como pertencendo ao sorotipo O25B, e o aglomerado de genes rfb da cepa (e cepas do sorotipo O25B em geral) foi aqui identificado, em um primeiro momento, compreendendo genes que produzem um novo polissacarídeo de E. coli, O25B. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica compreendendo um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec177), ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um aglomerado de genes de E. coli rfb(upec177). Em uma modalidade específica, o aglomerado de genes de E. coli rfb(upec177) é introduzido na célula hospedeira por manipulação genética (por exemplo, o aglomerado de genes é expresso em um plasmídeo ou plasmídeos ou integrado no genoma da célula hospedeira (ver, por exemplo, pedido de patente internacional PCT/EP2013/068737)). Em uma outra modalidade, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14) ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso ou Asp(Glu)-X-Asn- Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma outra modalidade específica, alguns ou todos os genes do aglomerado rfb são heterólogos à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita oligossacaril transferase é heteróloga à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita proteína carreadora é heteróloga à célula hospedeira. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00142] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz O25B, em que a dita célula hospedeira compreende rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, e/ou wbbL. Tais células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas usando abordagens recombinantes para compreender um ou mais plasmídeos compreendendo os genes rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, e/ou wbbL. Em certas modalidades, o dito um ou mais plasmídeos é integrado no genoma da célula hospedeira. Em uma modalidade específica, o dito rmlB compreende ou consiste em SEQ ID NO:1, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:1. Em uma modalidade específica, o dito rmlD compreende ou consiste em SEQ ID NO:2, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:2. Em uma modalidade específica, o dito rmlA compreende ou consiste em SEQ ID NO:3, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:3. Em uma modalidade específica, o dito rmlC compreende ou consiste em SEQ ID NO:4, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:4. Em uma modalidade específica, o dito wzx compreende ou consiste em SEQ ID NO:5, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:5. Em uma modalidade específica, o dito wekA compreende ou consiste em SEQ ID NO:6, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:6. Em uma modalidade específica, o dito wekB compreende ou consiste em SEQ ID NO:7, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:7. Em uma modalidade específica, o dito wzy compreende ou consiste em SEQ ID NO:8, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:8. Em uma modalidade específica, o dito wbbJ compreende ou consiste em SEQ ID NO:9, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:9. Em uma modalidade específica, o dito wbbK compreende ou consiste em SEQ ID NO:10, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:10. Em uma modalidade específica, o dito wbbL compreende ou consiste em SEQ ID NO:11, ou é 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:11. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X- Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14) ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma outra modalidade específica, alguns ou todos os genes, rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, e wbbL, são heterólogos à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita oligossacaril transferase é heteróloga à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita proteína carreadora é heteróloga à célula hospedeira. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00143] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz O25B, em que a dita célula hospedeira compreende um, dois, três, quatro, ou mais, por exemplo, todos, dos seguintes genes (ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo a um dos seguintes genes, e preferivelmente que codifica proteína com a mesma função): rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2), rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), wekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10), e/ou wbbL (SEQ ID NO:11). Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00144] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de rmlB (SEQ ID NO:1). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma dTDP- Glicose 4,6-desidratase, por exemplo, uma dTDP-Glicose 4,6-desidratase codificada por rmlB. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntico à SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00145] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de rmlD (SEQ ID NO:2). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma dTDP- 6-Desoxi-D-glicose 3,5-epimerase, por exemplo, uma dTDP-6-Desoxi-D- glicose 3,5-epimerase codificada por rmlD. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender um ácido nucleico that é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntico à SEQ ID NO:2. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X- Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00146] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de rmlA (SEQ ID NO:3). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma Glicose- 1-fosfato timidililtransferase, por exemplo, uma Glicose-1-fosfato timidililtransferase codificada por rmlA. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender um ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntico à SEQ ID NO:3. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z- Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00147] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de rmlC (SEQ ID NO:4). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma dTDP- 4-desidroramnose 3,5-epimerase, por exemplo, uma dTDP-4-desidroramnose 3,5-epimerase codificada por rmlC. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender um ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntico à SEQ ID NO:4. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z- Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00148] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de wzx (SEQ ID NO:5). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma flipase de antígeno O, por exemplo, uma flipase de antígeno O codificada por wzx. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender um ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntico à SEQ ID NO:5. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X- Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00149] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de wekA (SEQ ID NO:6). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ramnosiltransferase, por exemplo, uma dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc- UPP α-1,3- ramnosiltransferase codificada por wekA. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender ácidos nucleicos que são pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idênticos à SEQ ID NO:6. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X- Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00150] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de wekB (SEQ ID NO:7). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma wekB glicosiltransferase, por exemplo, uma UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6- glicosiltransferase codificada por wekB. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender ácidos nucleicos que são pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idênticos à SEQ ID NO:7. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X- Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00151] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de wzy (SEQ ID NO:8). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um polimerase de antígeno O, por exemplo, um polimerase de antígeno O codificada por wzy. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender ácidos nucleicos que são pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idênticos à SEQ ID NO:8. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00152] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de wbbJ (SEQ ID NO:9). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma O-acetil transferase, por exemplo, uma O-acetil transferase codificada por wbbJ. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender ácidos nucleicos que são pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idênticos à SEQ ID NO:9. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X- Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00153] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de wbbK (SEQ ID NO:10). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase, por exemplo, uma UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- glicosiltransferase codificada por wbbK. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender ácidos nucleicos que são pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idênticos à SEQ ID NO:10. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X- Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00154] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender a sequência de ácido nucleico de wbbL (SEQ ID NO:11). Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ramnosil transferase, por exemplo, uma dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase codificada por wbbL. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender ácidos nucleicos que são pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idênticos à SEQ ID NO:11. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X- Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00155] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir O25B, e/ou um bioconjugado O25B (isto é, uma proteína carreadora ligada ao antígeno O25B de E. coli), em que a dita célula hospedeira compreende naturalmente ou é geneticamente modificada para compreender pelo menos um, dois, três, quatro ou mais, por exemplo, todos os seguinte: (i) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:1; (ii) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:2; (iii) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:3; (iv) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:4; (v) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:5; (vi) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:6; (vii) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:7; (viii) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:8; (ix) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:9; (x) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:10; e/ou (xi) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO:11. Em uma modalidade específica, a dita célula hospedeira foi geneticamente modificada para compreender cada uma das ditas sequências, isto é, as ditas sequências são heterólogas à dita célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z- Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00156] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz O25B, em que a dita célula hospedeira compreende pelo menos dois de (i) wbbJ (SEQ ID NO:9) ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:9; (ii) wbbK (SEQ ID NO:10) ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:10; e/ou (iii) wbbL (SEQ ID NO:11) ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:11. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00157] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz O25B, em que a dita célula hospedeira compreende cada qual de (i) wbbJ (SEQ ID NO:9) ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:9; (ii) wbbK (SEQ ID NO:10) ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:10; e (iii) wbbL (SEQ ID NO:11) ou um ácido nucleico que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:11. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00158] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz O25B, em que a dita célula hospedeira compreende (i) dTDP-Glicose 4,6-desidratase; (ii) dTDP-6-Desoxi-D-glicose 3,5-epimerase; (iii) Glicose-1- fosfato timidililtransferase; (iv) dTDP-4-desidroramnose 3,5-epimerase; (v) flipase de antígeno O; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6- glicosiltransferase (viii) polimerase de antígeno O; (ix) O-acetil transferase; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- glicosiltransferase e/ou (xi) dTDP- Rha: GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14) ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso ou Asp(Glu)- X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma outra modalidade específica, some ou all de (i) dTDP-Glicose 4,6-desidratase; (ii) dTDP-6-Desoxi-D-glicose 3,5-epimerase; (iii) Glicose-1-fosfato timidililtransferase; (iv) dTDP-4-desidroramnose 3,5- epimerase; (v) flipase de antígeno O; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc- UPP α-1,3- ramnosiltransferase; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β- 1,6- glicosiltransferase (viii) polimerase de antígeno O; (ix) O-acetil transferase; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- glicosiltransferase e/ou (xi) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase são heterólogos à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita oligossacaril transferase é heteróloga à célula hospedeira. Em uma outra modalidade específica, a dita proteína carreadora é heteróloga à célula hospedeira. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00159] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz E. coli O25A, isto é, a dita célula hospedeira compreende enzimas capazes de sintetizar E. coli O25A (ver, por exemplo, Figura 3). Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X- Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00160] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz E. coli O1, isto é, a dita célula hospedeira compreende enzimas capazes de sintetizar E. coli O1 (ver, por exemplo, Figura 12). Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira que produz E. coli O1A. Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira que produz E. coli O1B. Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira que produz E. coli O1C. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z- Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00161] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz E. coli O2, isto é, a dita célula hospedeira compreende enzimas capazes de sintetizar E. coli O2 (ver, por exemplo, Figura 19). Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X- Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00162] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) que produz E. coli O6, isto é, a dita célula hospedeira compreende enzimas capazes de sintetizar E. coli O6 (ver, por exemplo, Figura 17). Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira que produz E. coli O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação ou um antígeno O6 compreendendo um monossacarídeo GlcNAc de ramificação. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X- Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00163] Adicionalmente, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética) capaz de produzir mais de um tipo de antígeno O de E. coli. Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira capaz de produzir pelo menos dois dos seguintes: O25B, O25A, O1 (por exemplo, O1A, O1B, O1C), O2, e O6. Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira capaz de produzir O25B e um ou mais de O25A, O1 (por exemplo, O1A, O1B, O1C), O2, e O6. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. Em uma outra modalidade específica, a célula hospedeira procariótica compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00164] Qualquer das células hospedeiras conhecidas pelos versados na técnica pode ser usada para produzir os antígenos O de E. coli aqui descritos (por exemplo, O25B) e bioconjugados compreendendo os antígenos O de E. coli aqui descritos (por exemplo, O25B), incluindo arqueas, células hospedeiras procarióticas, e células hospedeiras eucarióticas. Células hospedeiras procarióticas exemplares para uso na produção dos antígenos O de E. coli aqui descritas, e bioconjugados compreendendo os antígenos O de E. coli aqui descritos incluem, sem limitação, espécies de Escherichia, espécies de Shigella, espécies de Klebsiella, espécies de Xhantomonas, espécies de Salmonella, espécies de Yersinia, espécies de Lactococcus, espécies de Lactobacillus, espécies de Pseudomonas, espécies de Corynebacterium, espécies de Streptomyces, espécies de Streptococcus, espécies de Staphylococcus, espécies de Bacillus e espécies de Clostridium. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira usada para produzir os antígenos O de E. coli aqui descritos e bioconjugados compreendendo os antígenos O de E. coli aqui descritos é E. coli.
[00165] Em certas modalidades, as células hospedeiras usadas para produzir os antígenos O de E. coli e bioconjugados aqui descritos são geneticamwnte modificados para compreender ácidos nucleicos heterólogos, por exemplo, ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais proteínas carreadoras e/ou ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais proteínas, por exemplo, genes que codifica uma ou mais proteínas. Em uma modalidade específica, ácidos nucleicos heterólogos que codificam proteínas envolvidas nas vias de glicosilação (por exemplo, vias de glicosilação procarióticas e/ou eucarióticas) podem ser introduzidos nas células hospedeiras aqui descritas. Tais ácidos nucleicos podem codificar proteínas incluindo, sem limitação, oligossacaril transferases e/ou glicosiltransferases. Ácidos nucleicos heterólogos (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam proteínas carreadoras e/ou ácidos nucleicos que codificam outras proteínas, por exemplo, proteínas envolvidas em glicosilação) pode ser introduzidos nas células hospedeiras aqui descritas usando qualquer dos métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, eletroporação, transformação química por choque térmico, transformação natural, transdução por fago e conjugação. Em modalidades específicas, ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras aqui descritas usando um plasmídeo, por exemplo, os ácidos nucleicos heterólogos são expressos nas células hospedeiras por um plasmídeo (por exemplo, um vetor de expressão). Em uma outra modalidade específica, ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras aqui descritas usando o método de inserção descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2013/068737.
[00166] Em certas modalidades, modificações adicionais podem ser introduzidas (por exemplo, usando técnicas recombinantes) nas células hospedeiras aqui descritas. Por exemplo, ácidos nucleicos da célula hospedeira (por exemplo, genes) que codificam proteínas que fazem parte de uma possível via de competição ou interferência da glicosilação (por exemplo, compete ou interfere com um ou mais genes heterólogos envolvidos na glicosilação, os quais são recombinantemente introduzidos na célula hospedeira) podem ser eliminados ou modificados na base da célula hospedeira (genoma), de uma maneira que a torna inativa/disfuncional (isto é, os ácidos nucleicos da célula hospedeira que são eliminados/modificados não codificam uma proteína funcional ou não codificam uma proteína, qualquer que seja). Em certas modalidades, quando ácidos nucleicos são eliminados do genoma das células hospedeiras aqui fornecidas, são substituídos por uma sequência desejável, por exemplo, uma sequência que é usada para a produção de glicoproteína.
[00167] Genes exemplares que podem ser eliminados em células hospedeiras (e, em alguns casos, substituídos por outras sequências desejadas de ácido nucleico) incluem genes de células hospedeiras envolvidos na biossíntese de glicolipídeos, tal como waaL (ver, por exemplo, Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), a biossíntese do aglomerado da parte principal de lipídeo A (waa), aglomerado de galactose (gal), aglomerado de arabinose (ara), aglomerado de ácido colônico (wc), aglomerado de polissacarídeo capsular, genes de biossíntese de undecaprenol-p (por exemplo uppS, uppP), genes de reciclagem de und-P, enzimas metabólicas envolvidas na biossíntese de nucleotídeo ativado por açúcar, aglomerado de antígeno comum à enterobactéria, e aglomerados de modificação do antígeno O do profago, do tipo aglomerado gtrABS. Em uma modalidade específica, as células hospedeiras aqui descritas são modificadas de maneira tal que não produzam nenhum dos antígenos O, sem ser um antígeno O desejado de um ExPEC, por exemplo, O25B. Em uma modalidade específica, um ou mais dos gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS, ou o aglomerado de genes rfb é eliminado ou funcionalmente inativado do genoma de uma célula hospedeira procariótica aqui fornecida. Em uma modalidade, uma célula hospedeira aqui usada é E. coli que produz antígeno O25B, em que o gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, e gene gtrS são eliminados ou funcionalmente inativados do genoma da célula hospedeira. Em uma outra modalidade, uma célula hospedeira aqui usada é E. coli que produz antígeno O25B, em que o gene waaL e gene gtrS são eliminados ou funcionalmente inativados do genoma da célula hospedeira.
[00168] Em certas modalidades, as células hospedeiras modificadas aqui fornecidas podem ser usadas para glicosilação de proteína. A glicosilação de proteína pode ser determinada para produzir bioconjugados para uso em formulações de vacina, por exemplo, vacinas que contêm antígeno(s) do polissacarídeo de E. coli, por exemplo, O25 (por exemplo, O25B), O1, O2, e O6.
[00169] Qualquer proteína carreadora adequada para uso na produção de vacinas conjugadas (por exemplo, bioconjugados para uso em vacinas) pode ser aqui usada, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam a proteína carreadora podem ser introduzidos em um hospedeiro aqui fornecidos para a produção de um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno de ExPEC (por exemplo, O25B). As proteínas carreadoras exemplares incluem, sem limitação, exotoxina A desintoxicada de P. aeruginosa (EPA; ver, por exemplo, Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, proteína de ligação de maltose (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetânico, hemolisina A desintoxicada de S. aureus, fator de aglutinação A, fator de aglutinação B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina lábil ao calor de E. coli, variantes desintoxicados de enterotoxina lábil ao calor de E. coli, subunidade B de toxina da cólera (CTB), toxina da cólera, variantes desintoxicados de toxina da cólera, proteína Sat de E. coli, o domínio passageiro de proteína Sat de E. coli, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae e variantes desintoxicados dos mesmos, AcrA de C. jejuni, e glicoproteínas naturais de C. jejuni. For EPA, vários variantes de proteína desintoxicada foram descritos na literatura e podem ser usados como proteínas carreadoras.
[00170] Em certas modalidades, as proteínas carreadoras usadas na geração dos bioconjugados aqui descrita são modificadas, por exemplo, modificadas de uma maneira tal que a proteína é menos tóxica e/ou mais susceptível à glicosilação. Em uma modalidade específica, as proteínas carreadoras usadas na geração dos bioconjugados aqui descritos são modificadas de uma maneira tal que o número de sítios de glicosilação nas proteínas carreadoras é maximizado de uma maneira tal que permite menores concentrações da proteína a ser administrada, por exemplo, em uma composição imunogênica, na sua forma de bioconjugado.
[00171] Em certas modalidades, as proteínas carreadoras aqui descritas são modificadas para incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sítios de glicosilação do que poderia normalmente estar associado com a proteína carreadora (por exemplo, em relação ao número de sítios de glicosilação associados com a proteína carreadora em seu estado nativo/natural, por exemplo, “tipo selvagem”). Em modalidades específicas, a introdução de sítios de glicosilação é acompanhada pela inserção de sequências de consenso de glicosilação (por exemplo, Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987)), onde quer que esteja a estrutura primária da proteína. A introdução de tais sítios de glicosilação pode ser realizada, por exemplo, adicionando novos aminoácidos à estrutura primária da proteína (isto é, os sítios de glicosilação são adicionados, completamente ou em parte), ou mutando aminoácidos existentes na proteína, a fim de gerar os sítios de glicosilação (isto é, aminoácidos não são adicionados à proteína, mas aminoácidos selecionados da proteína são mutados de maneira a formar sítios de glicosilação). Os versados na técnica reconhecerão que a sequência de aminoácido de uma proteína pode ser facilmente modificada usando abordagens conhecidas na técnica, por exemplo, abordagens recombinantes que incluem modificação da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína. Em modalidades específicas, as sequências de consenso de glicosilação são introduzidas em regiões específicas da proteína carreadora, por exemplo, estruturas de superfície da proteína, nas terminações N ou C da proteína, e/ou nas alças que são estabilizadas por pontes de dissulfeto na base da proteína. Em certas modalidades, a sequência de consenso de glicosilação clássica de 5 aminoácidos pode ser estendida em resíduos de lisina para glicosilação mais eficiente e, assim, a sequência de consenso inserida pode codificar 5, 6, ou 7 aminoácidos que podem ser inseridos ou que substituem aminoácidos da proteína receptora. Em uma modalidade particular, uma proteína carreadora é EPA desintoxicada compreendendo 4 sequências de consenso de glicosilação Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO:15), e apresenta uma sequência de aminoácido da maneira fornecida SEQ ID NO: 13.
[00172] Em certas modalidades, as proteínas carreadoras usadas na geração dos bioconjugados aqui descritos compreendem um “marcação” isto é, uma sequência de aminoácidos que permite o isolamento e/ou identificação da proteína carreadora. Por exemplo, adicionar uma marcação à uma proteína carreadora aqui descrita pode ser usada na purificação desta proteína e, consequentemente, a purificação de vacinas conjugadas compreendendo a proteína carreadora marcada. Marcações exemplares que podem ser usadas aqui incluem, sem limitação, marcações de histidina (HIS) (por exemplo, marcação de hexa histidina, ou marcação 6XHis), marcação FLAG, e marcações HA. Em certas modalidades, as marcações aqui usadas são removíveis, por exemplo, removíveis por agentes químicos ou por meios enzimáticos, uma vez que não são maiores que o necessário, por exemplo, após a proteína ser purificada.
[00173] Em certas modalidades, as proteínas carreadoras aqui descritas compreendem uma sequência sinal que alveja a proteína carreadora no espaço periplasmático da célula hospedeira, que expressa a proteína carreadora. Em uma modalidade específica, a sequência sinal é de DsbA de E. coli, porina A de membrana externa de E. coli (OmpA), proteína de ligação de maltose de E. coli (MalE), pectato liase de Erwinia carotovorans (PelB), FlgI, NikA, ou endoxilanase de Bacillus sp. (XynA), enterotoxina LTIIb lábil ao calor de E. coli, endoxilanase XynA de Bacillus, ou flagelina de E. coli (FlgI).
[00174] As células hospedeiras aqui fornecidas compreendem, e/ou podem ser modificadas para compreender, ácidos nucleicos que codificam a maquinaria genética (por exemplo, glicosiltransferases) capazes de produzir antígenos O de ExPEC, por exemplo, o O25 (por exemplo, O25B), O1, O2, e/ou antígeno O6s. Ver Seção 5.1.
[00175] As células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir antígenos O de ExPEC, por exemplo, um antígeno O de E. coli de sorotipo O25 (por exemplo, O25A ou O25B, ver Figura 3B), O1 (ver Figura 12), O2 (ver Figura 19), e O6 (por exemplo, um sorotipo O6 que produz um antígeno O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação ou um antígeno O6 compreendendo um monossacarídeo GlcNAc de ramificação, ver Figura 17). Ácidos nucleicos exemplares são descritos na seção 5.1. Em certas modalidades, alguns ou todos os ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O de ExPEC são naturalmente expressos pelas células hospedeiras aqui fornecidas (por exemplo, os ácidos nucleicos estão presentes na base “tipo selvagem” da célula hospedeira). Em certas modalidades, alguns ou todos os ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O de ExPEC são not naturalmente expressos pelas células hospedeiras aqui fornecidas, isto é, alguns ou todos os ácidos nucleicos são heterólogos à célula hospedeira. Células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas para compreender ácidos nucleicos específicos, por exemplo, os ácidos nucleicos descritos na seção 5.1, usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, o métodos descrito na seção 5.3.
[00176] Em uma modalidade específica, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O de E. coli do sorotipo O25B, isto é, um antígeno O25B aqui descrito. Em uma modalidade específica, os ditos ácidos nucleicos codificam o aglomerado rfb de upec138 (SEQ ID NO:12), ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico ou homólogo à SEQ ID NO:12.
[00177] Em uma outra modalidade específica, os ditos ácidos nucleicos codificam o aglomerado rfb de upec163, ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico ou homólogo ao aglomerado rfb de upec163. Em uma outra modalidade específica, os ditos ácidos nucleicos codificam o aglomerado rfb de upec177, ou um aglomerado de genes que é cerca de ou pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico ou homólogo ao aglomerado rfb de upec177.
[00178] Em uma outra modalidade específica, os ditos ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O de E. coli do sorotipo O25B são genes de um sorotipo O25B, em que os ditos genes são rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2) rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), wekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10), e wbbL (SEQ ID NO:11). Ver tabelas 3 e 9.
[00179] Em uma modalidade específica, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam proteínas (por exemplo, glicosiltransferases) capazes de produzir um antígeno O de E. coli do O25A sorotipo, isto é, um antígeno O25A aqui descrito. Em uma outra modalidade específica, os ditos ácidos nucleicos que codificam proteínas (por exemplo, glicosiltransferases) capazes de produzir um antígeno O de E. coli do O25A sorotipo são genes de um O25 sorotipo, em que os ditos genes são rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wekC, wzy, fnlA, fnlB, fnlC, wbuB, e/ou wbuC. Ver Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; GenBank GU014554; e Tabela 2.
[00180] Em uma outra modalidade específica, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O E. coli do sorotipo O2. Em uma outra modalidade específica, os ditos ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O de E. coli do sorotipo O2 são genes de um sorotipo O2, em que os ditos genes são rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekP, wekQ, wekR, wzy, fdtA, fdtB, e/ou fdtC. Ver Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77; Fratamico, et al., 2010, Canadian Journal of Microbiology 56, 308-316; e Tabela 5.
[00181] Em uma outra modalidade específica, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O E. coli do sorotipo O6. Ver Welch et al., 2002, PNAS USA 99(26):17020-17024; Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225, e Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283. Em uma modalidade específica, o dito sorotipo O6 compreende um monossacarídeo ramificado Glc.
[00182] Em uma outra modalidade específica, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O E. coli do O1 sorotipo. Em uma modalidade específica, o dito sorotipo O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, os ditos ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases capazes de produzir um antígeno O de E. coli do sorotipo O1 são genes de um sorotipo O1, em que os ditos genes são rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, mnaA, wekM, wzy, wekN, e/ou wekO.
[00183] Oligossacaril transferases transferem oligossacarídeos ligados ao lipídeo para resídeos de asparagina de cadeias de polipeptídeo nascente que compreendem um motivo de consenso de N-glicoxilação, por exemplo, Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15) (ver WO 2006/119987). Ver, por exemplo, WO 2003/074687 e WO 2006/119987, cujas descrições são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.
[00184] Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui fornecidas compreendem um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. O ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase pode ser natural para a célula hospedeira, ou pode ser introduzido na célula hospedeira usando abordagens genéticas, da maneira descrita anteriormente. A oligossacaril transferase pode ser de qualquer fonte conhecida na técnica. Em uma modalidade específica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase de Campylobacter. Em uma outra modalidade específica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase de Campylobacter jejuni (isto é, pglB; ver, por exemplo, Wacker et al., 2002, Science 298:17901793; ver também, por exemplo, NCBI Gene ID: 3231775, número de acesso UniProt O86154). Em uma outra modalidade específica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase de Campylobacter lari (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 7410986).
[00185] Em certas modalidades, as células hospedeiras aqui descritas podem ser usadas para produzir bioconjugados compreendendo um antígeno O de E. coli aqui descrito (por exemplo, O25B; ver Seção 5.2), ligado a uma proteína carreadora. Métodos de produzir tais bioconjugados usando as células hospedeiras são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, WO 2003/074687 e WO 2006/119987.
[00186] Alternativamente, glicoconjugados podem ser preparados por síntese química, isto é, preparado fora das células hospedeiras (in vitro). Por exemplo, os antígenos O de E. coli aqui descritos, por exemplo, O25B, podem ser conjugados com as proteínas carreadoras usando métodos conhecidos pelos versados na técnica, incluindo meios de usar grupos reativos de ativação no polissacarídeo/oligossacarídeo, bem como o carreador de proteína. Ver, por exemplo, Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885; e Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978), cujas descrições são aqui incorporadas pela referência. Tais abordagens compreendem extração de polissacarídeos antigênicos/ oligossacarídeos de células hospedeiras, purificação dos polissacarídeos/oligossacarídeos, ativação química de polissacarídeos/oligossacarídeos, e conjugação de polissacarídeos/ oligossacarídeos a uma proteína carreadora.
[00187] Bioconjugados, da maneira aqui descrita, apresentam propriedades vantajosas em relação aos glicoconjugados, por exemplo, bioconjugados exigem menos elementos qupimicos na fabricação e são mais consistentes em termos do produto final gerado. Assim, bioconjugados são preferidos em relação aos glicoconjugados quimicamente produzidos.
[00188] Em uma modalidade específica, são aqui fornecidos bioconjugados compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de ExPEC aqui descrito. Ver Seção 5.2.
[00189] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) N-ligada a E. coli O25B.
[00190] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um composto da fórmula O25B apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, a proteína carreadora é N-ligada ao antígeno O da fórmula O25B, isto é, O25B é ligado ao resíduo Asn de uma proteína carreadora compreendendo a sequência Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14); ou uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15).
[00191] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um composto da fórmula O25B’, apresentada a seguir: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. Em uma modalidade específica, a proteína carreadora é N-ligada ao antígeno O da fórmula O25B’.
[00192] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um antígeno O25A. Em uma modalidade específica, o dito antígeno O25A compreende a fórmula O25A:
[00193] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um O1 antígeno. Em uma modalidade específica, o dito O1 antígeno é O1A, por exemplo, o dito antígeno compreende a fórmula O1A:
[00194] Em uma outra modalidade específica, o dito O1 antígeno é O1B, por exemplo, o dito antígeno compreende a fórmula O1B:
[00195] Em uma outra modalidade específica, o dito O1 antígeno é O1C, por exemplo, o dito antígeno compreende a fórmula O1C:
[00196] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um antígeno O2. Em uma modalidade específica, o dito antígeno O2 compreende a fórmula O2:
[00197] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, EPA) ligada a um antígeno O6. Em uma modalidade específica, o dito antígeno O6 compreende a fórmula O6Glc:
[00198] Os bioconjugados aqui descritos podem ser purificados por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma proteína, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de troca aniônica, por afinidade, e coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Ver, por exemplo, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18); ver também os métodos descritos em WO 2009/104074. Adicionalmente, os bioconjugados podem ser fundidos às sequências heterólogas de polipeptídeo aqui descritas, ou de outra maneira conhecidas na técnica, para facilitar a purificação. As condições atuais usadas para purificar um bioconjugado particular dependerão, em parte, da estratégia de síntese (por exemplo, produção sintética vs. Produção recombinante) e de fatores tais como carga líquida, hidrofobicidade, e/ou hidrofilicidade do bioconjugado, e serão evidentes aos versados na técnica.
[00199] O antígeno O25B aqui descrito (ver Seção 5.2) e/ou bioconjugados compreendendo antígeno O O25B aqui descritos (ver Seção 5.4) podem ser usados para elicitar anticorpos neutralizantes contra ExPEC. Em uma modalidade específica, antígeno O O25B aqui descrito e/ou bioconjugados compreendendo antígeno O O25B aqui descritos podem ser administrados a um sujeito (por exemplo, um humano, camundongo, coelho, rato, porquinho de Índia, etc.) para induzir uma resposta imune que inclui a produção de anticorpos. Tais anticorpos podem ser isolados usando técnicas conhecidas pelos versados na tecnologia (por exemplo, cromatografia por imunoafinidade, centrifugação, precipitação, etc.).
[00200] Além disso, antígeno O O25B aqui descrito pode ser usado para selecionar anticorpos de bibliotecas de anticorpo. Por exemplo, O25B isolado pode ser imobilizado em um suporte sólido (por exemplo, um sílica gel, uma resina, um filme derivado de plástico, uma microesfera de vidro, algodão, uma microesfera de plástico, uma microesfera de polistireno, um gel de alumina, ou um polissacarídeo, uma microesfera magnética), e selecionado para se ligar aos anticorpos. Como uma alternativa, os anticorpos a serem selecionados podem ser imobilizados em um suporte sólido e selecionados para se ligar ao O25B. Qualquer ensaio de seleção, tal como um ensaio panning, ELISA, ressonância de plasma de superfície, ou outro ensaio de seleção de anticorpo conhecido na técnica pode ser usado para selecionar anticorpos que se ligam ao O25B. A biblioteca de anticorpo selecionada pode ser uma biblioteca de anticorpo disponível comercialmente, uma biblioteca gerada in vitro, ou uma biblioteca obtida identificando e clonando ou isolando anticorpos de um indivíduo infectado com EXPEC. Bibliotecas de anticorpo podem ser geradas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade particular, a biblioteca de anticorpo é gerada clonando os anticorpos e usando-os em bibliotecas de exibição de fago ou uma biblioteca de exibição de fagemídio.
[00201] Anticorpos identificados ou elicitados usando O25B e/ou um bioconjugado de O25B podem incluir moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao O25B. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Anticorpos incluem, mas sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs ligados ao dissulfeto (sdFv), e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti- Id para anticorpos elicitados ou identificados usando um método aqui descrito), e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer dos anteriores. Em uma modalidade específica, um anticorpo elicitado ou identificado usando O25B e/ou um bioconjugado de O25B é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado.
[00202] Anticorpos elicitados ou identificados usando O25B e/ou um bioconjugado de O25B podem ser usados para monitorar a eficiência de um terapia e/ou progressão de doença. Qualquer sistema de imunoensaio conhecido na técnica pode ser usado com este propósito incluindo, mas sem limitação, sistemas de ensaio competitivo e não competitivo usando técnicas tais como radioimunoensaios, ELISA (ensaios imunoabsorventes ligados à enzima), imunoensaios “sanduiche”, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A e ensaios de imunoeletroforese.
[00203] Anticorpos elicitados ou identificados usando O25B e/ou um bioconjugado de O25B podem ser usados pata eliminar cepas de E. coli O25B, por exemplo, de uma pluralidade de cepas de E. coli e/ou para diagnosticar uma infecção por uma cepa de E. coli O25B.
[00204] Em um aspecto, são aqui fornecidas composições compreendendo as células hospedeiras aqui descrita. Tais composições podem ser usadas em métodos para gerar os bioconjugados aqui descritos (ver Seção 5.4), por exemplo, as composições podem ser cultivadas em condições adequadas para a produção de proteínas. Subsequentemente, os bioconjugados podem ser isolados das ditas composições usando métodos conhecidos na técnica.
[00205] As composições compreendendo as células hospedeiras aqui fornecidas podem compreender componentes adicionais adequados para manutenção e sobrevivência das células hospedeiras aqui descritas, e podem compreendem adicionalmente componentes exigidos ou benéficos para a produção de proteínas pelas células hospedeiras, por exemplo, indutores para promotores indutíveis, tal como arabinose, IPTG.
[00206] Em um outro aspecto, são aqui fornecidas composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo um ou mais dos antígenos O de E. coli aqui descritos (ver Seção 5.2) e composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo um ou mais dos bioconjugados aqui descritos (ver Seção 5.4). Em uma modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende um ou mais dos antígenos O de E. coli aqui descritos (ver Seção 5.2). Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende um ou mais dos bioconjugados aqui descritos (ver Seção 5.4). Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende um ou mais dos antígenos O de E. coli aqui descritos (ver Seção 5.2) e um ou mais dos bioconjugados aqui descritos (ver Seção 5.4). As composições aqui descritas são usadas no tratamento e prevenção de infecção de sujeitos (por exemplo, sujeitos humanos) com E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC). Ver Seção 5.7.
[00207] Em certas modalidades, além de compreender um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2) e/ou um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), as composições (por exemplo, composições farmacêuticas) aqui descritas compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável. Da maneira aqui usada, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência regulatória do governo federal, ou um governo do estado, ou listado na farmacopeia dos Estados Unidos, ou outra farmacopeia em geral reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos. O termo “carreador”, da maneira aqui usada no contexto de um carreador farmaceuticamente aceitável, se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual a composição farmacêutica é administrada. Soluções de salina e dextrose aquosa e soluções de glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. Exemplos de carreadores farmaceuticamente adequados são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin.
[00208] Em uma modalidade específica, é aqui fornecida uma composição compreendendo uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2) ligada a um antígeno aqui descrito, por exemplo, um antígeno O de ExPEC descrito na seção 5.2.
[00209] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada à E. coli O25B (ver Seção 5.2).
[00210] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada à E. coli O25A (ver Seção 5.2).
[00211] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada à E. coli O1 (ver Seção 5.2). Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1C.
[00212] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada à E. coli O2 (ver Seção 5.2).
[00213] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada à E. coli O6 (ver Seção 5.2). Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O6 é uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação.
[00214] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B), ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B) e (ii) uma macromolécula O1 ou um bioconjugado compreendendo O1. Ver Seção 5.2. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1C.
[00215] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B), ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B) e (ii) uma macromolécula O2 ou um bioconjugado compreendendo O2. Ver Seções 5.2 e 5.4. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B.
[00216] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B), ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B) e (ii) uma macromolécula O6 (por exemplo, uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação ou um monossacarídeo GlcNAc de ramificação) ou um bioconjugado compreendendo O6. Ver Seções 5.2 e 5.4. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O6 é uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação.
[00217] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo E. coli O25B (ver Seção 5.2) ou um ou um bioconjugado compreendendo O25 (ver Seção 5.4) e pelo menos um dos seguintes: (i) E. coli O1 ou um bioconjugado compreendendo O1 (ver Seções 5.2 e 5.4); (ii) E. coli O2 ou um bioconjugado compreendendo O2 (ver Seções 5.2 e 5.4); e/ou (iii) E. coli O6 ou um bioconjugado compreendendo O6 (ver Seções 5.2 e 5.4). Em uma outra modalidade específica, o dito O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, o dito O1 é O1B. Em uma outra modalidade específica, o dito O1 é O1C. Em uma outra modalidade específica, o dito O6 é O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação.
[00218] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo pelo menos dois dos seguintes: (i) uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B) ou um bioconjugado compreendendo O25 (por exemplo, O25A ou O25B); (ii) uma macromolécula O1 ou um bioconjugado compreendendo O1; (iii) uma macromolécula O2 ou um bioconjugado compreendendo O2; e/ou (iv) uma macromolécula O6 (por exemplo, uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação ou um monossacarídeo GlcNAc de ramificação) ou um bioconjugado compreendendo O6. Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1C. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O6 é uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação.
[00219] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado compreendendo E. coli O25B e um bioconjugado compreendendo E. coli O1A. Tais bioconjugados são descritos na seção 5.4.
[00220] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado compreendendo E. coli O25B e um bioconjugado compreendendo E. coli O1B. Tais bioconjugados são descritos na seção 5.4.
[00221] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado compreendendo E. coli O25B e um bioconjugado compreendendo E. coli O1C. Tais bioconjugados são descritos na seção 5.4.
[00222] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado compreendendo E. coli O25B e um bioconjugado compreendendo E. coli O2. Tais bioconjugados são descritos na seção 5.4.
[00223] Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado compreendendo E. coli O25B e um bioconjugado compreendendo E. coli O6. Tais bioconjugados são descritos na seção 5.4.
[00224] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada à E. coli O25B (ver Seção 5.2), (ii) uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada a um antígeno O de E. coli do sorotipo O1, por exemplo, O1A (ver Seção 5.2), (iii) uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.1.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada a um antígeno O de E. coli do sorotipo O2 (ver Seção 5.2), e (iv) uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada a um antígeno O de E. coli do sorotipo O6 (ver Seção 5.2).
[00225] Em certas modalidades, as composições precedentes compreendem uma proteína carreadora (por exemplo, uma proteína carreadora descrita na seção 5.3.2, por exemplo, EPA ou MBP) ligada à um antígeno O de E. coli de um sorotipo de E. coli sem ser O1, O2, O6, ou O25. Outros sorotipos usados de E. coli são descritos, por exemplo, no exemplo 1 e tabela 1, a seguir.
[00226] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B).
[00227] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma macromolécula O1 (por exemplo, O1A, O1B, ou O1C).
[00228] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma macromolécula O2.
[00229] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma macromolécula O6 (por exemplo, uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação ou um monossacarídeo GlcNAc de ramificação).
[00230] Em uma outra modalidade específica, uma composição aqui fornecida compreende uma macromolécula O25 (por exemplo, O25A ou O25B), uma macromolécula O1, uma macromolécula O2, e uma macromolécula O6 (por exemplo, uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação ou um monossacarídeo GlcNAc de ramificação). Em uma modalidade específica, a dita macromolécula O25 é uma macromolécula O25B. Em uma outra modalidade específica, a dita macromolécula O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, o dito 06 macromolécula é uma macromolécula O6 compreendendo um monossacarídeo Glc de ramificação.
[00231] As composições aqui fornecidas podem ser usadas para elicitar uma resposta imune em um hospedeiro no qual a composição é administrada, isto é, são imunogênicas. Assim, as composições aqui descritas podem ser usadas como vacinas contra infecção por ExPEC, ou podem ser usadas no tratamento de infecção por ExPEC e, dessa maneira, podem ser formuladas como composições farmacêuticas. Ver Seção 5.7.
[00232] As composições compreendendo os bioconjugados e/ou macromoléculas aqui descritas podem compreender qualquer dos componentes adicionais adequados para uso em administração farmacêutica. Em modalidades específicas, as composições aqui descritas são formulações monovalentes. Em outras modalidades, as composições aqui descritas são formulações multivalentes, por exemplo, formulações bivalentes, trivalentes e tetravalentes. Por exemplo, uma formulação multivalente compreende mais de um bioconjugado ou antígeno O de E. coli aqui descritos. Ver Seções 5.2 e 5.4 para descrição de antígenos O de E. coli e bioconjugados, respectivamente. Em uma modalidade específica, uma composição aqui descrita é uma formulação tetravalente compreendendo uma macromolécula ou bioconjugado, em que as ditas valências são de antígenos O de E. coli dos sorotipos/subsorotipos O25B, O1A, O6, e O2.
[00233] Em certas modalidades, as composições aqui descritas compreendem adicionalmente um conservante, por exemplo, o timerosal derivado de mercúrio. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas aqui descritas compreendem 0,001 % a 0,01 % de timerosal. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas não compreendem um conservante.
[00234] Em certas modalidades, as composições aqui descritas (por exemplo, as composições imunogênicas) compreendem, ou são administradas em combinação com, um adjuvante. O adjuvante para administração em combinação com uma composição aqui descrita pode ser administrado antes, concomitantemente com, ou após a administração da dita composição. Em algumas modalidades, o termo “adjuvante” se refere a um composto que quando administrado junto com ou como parte de uma composição aqui descrita aumenta, melhora e/ou reforça a resposta imune em um bioconjugado, mas quando o composto é administrado sozinho não gera uma resposta imune no bioconjugado. Em algumas modalidades, o adjuvante gera uma resposta imune no bioconjugado polipeptídeo e não produz uma alergia ou outra reação adversa. Adjuvantes podem melhorar uma resposta imune em vários mecanismos incluindo, por exemplo, recrutamento de linfócito, estimulação de células B e/ou T, e estimulação de macrófagos.
[00235] Exemplos específicos de adjuvantes incluem, mas sem limitação, sais de alumínio (alúmen) (tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e sulfato de alumínio), 3 De-O-acilado monofosforil lipídeo A (MPL) (ver patente do Reino Unido GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polissorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compostos de imidazopiridina (ver pedido internacional PCT/US2007/064857, publicado como publicação internacional WO2007/109812), compostos de imidazoquinoxalina (ver pedido internacional PCT/US2007/064858, publicado como publicação internacional WO2007/109813) e saponinas, tais como QS21 (ver Kensil et al., em Vaccine Design: The Subunidade and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente U.S. 5.057.540). Em algumas modalidades, o adjuvante é adjuvante de Freund (completo ou incompleto). Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (tal como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, tal como monofosforil lipídeo A (ver Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Um outro adjuvante é CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998).
[00236] Em certas modalidades, as composições aqui descritas são formuladas para serem adequadas para a via de administração pretendida a um sujeito. Por exemplo, as composições aqui descritas podem ser formuladas para serem adequadas para administração subcutânea, parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorretal, intraperitoneal e retal. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica pode ser formulada para administração intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutânea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica ou pulmonar.
[00237] Em certas modalidades, as composições aqui descritas compreendem adicionalmente um ou mais tampões, por exemplo, tampão fosfato e tampão de sacarose fosfato glutamato. Em outras modalidades, as composições aqui descritas não compreendem tampões.
[00238] Em certas modalidades, as composições aqui descritas compreendem adicionalmente um ou mais sais, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, glutamato de monossódio, e sais de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, alúmen (sulfato de potássio e alumínio), ou uma mistura de tais sais de alumínio). Em outras modalidades, as composições aqui descritas não compreendem sais.
[00239] As composições aqui descritas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem, ou dispensador junto com instruções para administração.
[00240] As composições aqui descritas podem ser armazenadas antes do uso, por exemplo, as composições podem ser armazenadas congeladas (por exemplo, em cerca de -20°C ou em cerca de -70°C); armazenadas em condições refrigeradas (por exemplo, em cerca de 4°C); ou armazenadas em temperatura ambiente.
[00241] São aqui fornecidos métodos de tratar e prevenir infeção extraintestinal por E. coli (ExPEC) de um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2). Em uma modalidade específica, as composições aqui descritas (ver Seção 5.6.2) são usadas na prevenção de infecção de um sujeito (por exemplo, sujeitos humanos) por ExPEC, isto é, as composições aqui descritas são usadas para vacinar um sujeito contra infecção por ExPEC. Em uma outra modalidade específica, as composições aqui descritas (ver Seção 5.6.2) são usadas no tratamento de um sujeito que foi infectado por ExPEC.
[00242] São também aqui fornecidos métodos de induzir uma resposta imune em um sujeito contra ExPEC, compreendendo administrar ao sujeito um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2). Em uma modalidade, o dito sujeito apresenta uma infecção por ExPEC durante o período de administração. Em uma outra modalidade, o dito sujeito não apresenta uma infecção por ExPEC durante o período de administração.
[00243] São também aqui fornecidos métodos de induzir a produção de anticorpos opsonofagocíticos contra ExPEC em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2). Em uma modalidade, o dito sujeito apresenta uma infecção por ExPEC durante o período de administração. Em uma outra modalidade, o dito sujeito não apresenta uma infecção por ExPEC durante o período de administração.
[00244] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para prevenir uma infecção de E. coli (por exemplo, ExPEC) em um sujeito, em que o dito método compreende administrar a um sujeito que precisa deste uma quantidade eficiente de uma composição descrita na seção 5.6.2. Os métodos de prevenir infecção por ExPEC em um sujeito aqui fornecidos resultam na indução de uma resposta imune em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma composição descrita na seção 5.6.2. Os versados na técnica entenderão que os métodos de induzir uma resposta imune em um sujeito aqui descritos resultam em vacinação do sujeito contra infecção pelas cepas ExPEC, cujos antígenos O estão presente na(s) composição(s).
[00245] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para tratar uma infecção por E. coli (por exemplo, ExPEC) em um sujeito, em que o dito método compreende administrar a um sujeito que necessita deste uma quantidade eficiente de uma composição descrita na seção 5.6.2.
[00246] Em certas modalidades, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção por ExPEC causada por qualquer sorotipo, subsorotipo, ou cepa de ExPEC. Em certas modalidades, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção por ExPEC, e mais de um sorotipo de ExPEC.
[00247] Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrita (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por E. coli do sorotipo O25. Em uma modalidade específica, o dito sorotipo O25 é O25B. Em uma modalidade específica, o dito sorotipo O25 é O25A.
[00248] Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por E. coli do sorotipo O1. Em uma modalidade específica, o dito sorotipo O1 é O1A. Em uma outra modalidade específica, o dito sorotipo O1 é O1B. Em uma outra modalidade específica, o dito sorotipo O1 é O1C.
[00249] Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por E. coli do sorotipo O2.
[00250] Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por E. coli do sorotipo O6.
[00251] Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por dois ou mais dos seguintes sorotipos d e E. coli: O25 (por exemplo, O25B e O25A), O1 (por exemplo, O1A, O1B, e O1C), O2, e/ou O6.
[00252] Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por cada um dos seguites sorotipos de E. coli: O25 (por exemplo, O25B e O25A), O1 (por exemplo, O1A, O1B, e O1C), O2, e O6.
[00253] A fim de tratar um sujeito com uma infecção por ExPEC ou imunizr um sujeito contra uma infecção por ExPEC, o sujeito pode ser administrado com uma composição simples aqui descrita, em que a dita composição compreende um, dois, três, quatro, ou mais antígenos de E. coli aqui descritos. Ver Seção 5.2. Alternativamente, a fim de tratar um sujeito com uma infecção por ExPEC ou imunizar um sujeito contra uma infecção por ExPEC, o sujeito pode ser administrado com bioconjugados múltiplos aqui descritos, por exemplo, um sujeito pode ser administrado com dois, três, quatro, ou mais bioconjugados descritos na seção 5.4. Alternativamente, a fim de tratar um sujeito com uma infecção por ExPEC ou imunizar um sujeito contra uma infecção por ExPEC, o sujeito pode ser administrado com composições múltiplas aqui descritas, por exemplo, um sujeito pode ser administrado dois, três, quatro, ou mais composições descritos na seção 5.6.2.
[00254] Em certas modalidades, a resposta imune induzida em um sujeito após administração de um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para reduzir sintomas que resultam de uma infecção por ExPEC. Sintomas de infecção por ExPEC podem variar dependendo da natureza da infecção e podem incluir, mas sem limitação: disúria, aumento da frequência ou urgência urinária, piúria, hematúria, dor nas costas, dor ao urinar, febre, calafrios e/ou náuseas (por exemplo, em sujeitos com uma infeção do trato urinário causada por ExPEC); febre alta, dor de cabeça, torcicolo, náusea, vomito, convulsões, sono, e/ou sensibilidade à luz (por exemplo, em sujeitos com meningite causada por ExPEC); febre, aumento do batimento cardíaco, aumento da taxa respiratória, menor eliminação de urina, menor contagem de plaquetas, dor abdominal, dificuldade de respiração, e/ou função cardíaca anormal (por exemplo, em sujeitos com sepse causada por ExPEC).
[00255] Em certas modalidades, a resposta imune induzida em um sujeito após administração de um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para reduzir a probabilidade de hospitalização de um sujeito que sofre de uma infecção por ExPEC. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida em um sujeito após a administração de um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é eficiente para reduzir a duração de hospitalização de um sujeito que sofre de uma infecção por ExPEC.
[00256] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos métodos de prevenir e/ou tratar uma infecção por ExPEC em um sujeito causada por E. coli do sorotipo O25B, administrando um anticorpo aqui descrito, isto é, um anticorpo anti-O25B aqui descrito. Em modalidades particulares, o anticorpo neutralizante é um anticorpo monoclonal.
[00257] Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antibacterianas ou imunomodulatórias). A uma ou mais outras terapias podem ser benéficas no tratamento ou prevenção de uma infecção por ExPEC ou podem melhorar um sintoma ou condição associada a uma infecção por ExPEC. Em algumas modalidades, a uma ou mais outras terapias são analgésicos ou medicações anti-piréticas. Em certas modalidades, as terapias são administradas menos de 5 minutos independentemente, menos de 30 minutos independentemente, 1 hora independentemente, em cerca de 1 hora independentemente, em cerca de 1 a cerca de 2 horas independentemente, em cerca de 2 horas a cerca de 3 horas independentemente, em cerca de 3 horas a cerca de 4 horas independentemente, em cerca de 4 horas a cerca de 5 horas independentemente, em cerca de 5 horas a cerca de 6 horas independentemente, em cerca de 6 horas a cerca de 7 horas independentemente, em cerca de 7 horas a cerca de 8 horas independentemente, em cerca de 8 horas a cerca de 9 horas independentemente, em cerca de 9 horas a cerca de 10 horas independentemente, em cerca de 10 horas a cerca de 11 horas independentemente, em cerca de 11 horas a cerca de 12 horas independentemente, em cerca de 12 horas a 18 horas independentemente, 18 horas a 24 horas independentemente, 24 horas a 36 horas independentemente, 36 horas a 48 horas independentemente, 48 horas a 52 horas independentemente, 52 horas a 60 horas independentemente, 60 horas a 72 horas independentemente, 72 horas a 84 horas independentemente, 84 horas a 96 horas independentemente, ou 96 horas a 120 horas independentemente.
[00258] Qualquer dos agentes anti-bacterianos conhecidos pelos versados na técnica pode ser usado em combinação com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2). Exemplos não limitantes de agentes anti-bacterianos incluem Amicacina, Amoxicilina, Amoxicilina-ácido clavulânico, Amfotericina-B, Ampicilina, Ampicilina- sulbactam, Apramicina, Azitromicina, Aztreonam, Bacitracina, Benzilpenicilina, Caspofungina, Cefaclor, Cefadroxila, Cefalexina, Cefalotina, Cefazolina, Cefdinir, Cefepime, Cefixime, Cefmenoxime, Cefoperazona, Cefoperazona-sulbactam, Cefotaxime, Cefoxitina, Cefpirome, Cefpodoxime, Cefpodoxime-ácido clavulânico, Cefpodoxime-sulbactam, Cefprozil, Cefquinoma, Ceftazidime, Ceftibutina, Ceftiofur, Ceftobiprol, Ceftriaxon, Cefuroxime, Cloranfenicol, Florfenicol, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clinafloxacina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Cotrimoxazol (Trimetoprim/sulfametoxazol), Dalbavancina, Dalfopristina/Quinopristina, Daptomicina, Dibecacina, Dicloxacilina, Doripenem, Doxiciclina, Enrofloxacina, Ertapenem, Eritromicina, Flucloxacilina, Fluconazol, Flucitosina, Fosfomicina, ácido fusídico, Garenoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Gentamicina, Imipenem, Itraconazol, canamicina, cetoconazol, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Loracarbef, Mecilnam (amdinocilina), Meropenem, Metronidazol, Meziocilina, Mezlocilina-sulbactam, Minociclina, Moxifloxacina, Mupirocina, Ácido nalidíxico, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Pefloxacina, Penicilina V, Piperacilina, Piperacilina-sulbactam, Piperacilina-tazobactam, Rifampicina, Roxitromicina, esparfloxacina, Espectinomicina, espiramicina, estreptomicina, Sulbactam, Sulfametoxazol, Teicoplanina, Telavancina, Telitromicina, Temocilina, Tetraciclina, Ticarcilina, Ticarcilina-ácido clavulânico, Tigeciclina, Tobramicina, Trimetoprim, Trovafloxacina, Tilosin, Vancomicina, Virginiamicina, e Voriconazol.
[00259] Em certas modalidades, uma terapia de combinação compreende administração de dois ou mais antígenos O de E. coli aqui descritos (ver Seção 5.2), bioconjugados aqui descritos (ver Seção 5.4), e/ou composições aqui descritas (ver Seção 5.6.2).
[00260] Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito naive, isto é, um sujeito que não apresenta uma infecção por ExPEC ou não apresentou previamente uma infecção por ExPEC. Em uma modalidade, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito naive que está em risco de adquirir uma infecção por ExPEC.
[00261] Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito que foi diagnosticado com uma infecção por ExPEC. Em algumas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito infectado com ExPEC antes dos sintomas se manifestarem ou dos sintomas se tornarem graves (por exemplo, antes do paciente precisar de hospitalização).
[00262] Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito que foi diagnosticado com uma infecção por UPEC. Em algumas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito que sofre de infecções recorrentes do trato urinário. Em algumas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito que sofre de infecções recorrentes do trato urinário, mas é saudável no momento do tratamento. Em algumas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito com ou em risco de adquirir bacteremia ou sepse.
[00263] Em algumas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um animal. Em certas modalidades, o animal é um pássaro. Em certas modalidades, o animal é um cão. Em certas modalidades, o animal é um felino. Em certas modalidades, o animal é um cavalo. Em certas modalidades, o animal é uma vaca. Em certas modalidades, o animal é um mamífero, por exemplo, um cavalo, porco, camundongo, ou primata. Em uma modalidade específica, o sujeito é um humano.
[00264] Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um humano adulto. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um humano adulto com anos de 50 anos. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um sujeito humano idoso.
[00265] Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é uma criança. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um bebê. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um bebê prematuro. Em algumas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é uma criança pequena. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada não um bebê com menos de 6 meses.
[00266] Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é uma mulher grávida. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é uma mulher que deu à luz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 semanas anteriormente.
[00267] Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um indivíduo com maior risco de ExPEC (por exemplo, um indivíduo imunocomprometido ou imunodeficiente). Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um indivíduo em contato próximo com um indivíduo com infecção por ExPEC, ou com maior risco desta.
[00268] Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é um profissional da saúde (por exemplo, um médico ou enfermeiro). Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é imunocomprometido (por exemplo, sofre de infecção por HIV) ou é imunossuprimido.
[00269] Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) apresenta diabetes. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) apresenta esclerose múltipla.
[00270] Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) apresenta uma condição que exige o uso de um cateter. Em certas modalidades, um sujeito a ser administrado com um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) apresenta uma lesão na medula espinhal.
[00271] A quantidade de um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) que será eficiente no tratamento e/ou prevenção de uma infecção por ExPEC dependerá da natureza da doença, e pode ser determinada por técnicas clínicas padrões. A administração do antígeno O, bioconjugado e/ou composição pode ser realizada por meio de várias vias conhecidas pelo clínico, por exemplo, subcutânea, parenteral, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, intradérmica, transdérmica, intranasal, etc. Em uma modalidade, administração é por meio de injeção intramuscular.
[00272] A dosagem exata a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração, e da gravidade da infecção, e pode ser decidida de acordo com o julgamento do clínico e cada circunstância do sujeito. Por exemplo, dosagens eficientes também podem variar dependendo dos meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente (incluindo idade, peso corporal, saúde), quer o paciente seja humano ou um animal, outras medicações administradas, e quer o tratamento seja profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são tituladas de maneira ideal para otimizar a segurança e eficiência.
[00273] Em certas modalidades, um ensaio in vitro é empregado para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. Ver Seção 5.8. As doses eficientes podem ser extrapoladas das curvas de resposta de dosagem derivadas in vitro ou sistemas de teste em modelo animal.
[00274] Em certas modalidades, dosagens exemplares para vacinas à base de glicoconjugados (por exemplo, composições compreendendo os bioconjugados) variam de cerca de 0,1 μg a 400 μg de carboidrato por dose. Em outras modalidades, dosagens exemplares para vacinas à base de glicoconjugados (por exemplo, composições compreendendo os bioconjugados) variam de cerca de 0,1 μg a 4000 μg de proteína(s) por dose. Em certas modalidades, uma dosagem exemplar para uma vacina à base de glicoconjugado (por exemplo, uma composição compreendendo os bioconjugados) compreende 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 μg de carboidrato(s) por dose. Em certas modalidades, uma dosagem exemplar para uma vacina à base de glicoconjugado (por exemplo, uma composição compreendendo os bioconjugados) compreende 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 μg de proteína(s) por dose. Em certas modalidades exemplares, uma dosagem para a administração a um humano corresponde à 0,5 mL contendo cerca de 1-10, por exemplo, cerca de 2-6, por exemplo, cerca de 4 μg de polissacarídeo para cada um dos glicoconjugados incluídos.
[00275] Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito uma vez como uma única dose. Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito como única dose seguida por uma segunda dose 3 a 6 semanas posteriormente. De acordo com estas modalidades, inoculações de reforço podem ser administradas ao sujeito em intervalos de 6 a 12 após a segunda inoculação. Em certas modalidades, as inoculações de reforço podem utilizar um antígeno O diferente de E. coli, bioconjugado, ou composição. Em algumas modalidades, a administração do mesmo antígeno O de E. coli, bioconjugado, ou composição pode ser repetida e as administrações podem ser separadas em pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito como uma dose única uma vez ao ano.
[00276] Em certas modalidades, um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) é administrada a um sujeito as 2, 3, 4, 5 ou mais doses 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas ou 6 semanas independentemente. Em algumas modalidades, 2, 3, 4, 5 ou mais doses de um antígeno O de E. coli aqui descrito (ver Seção 5.2), um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.4), ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.6.2) são administradas a um sujeito 2, 3, 4, 5 ou 6 semanas independentemente, em uma dosagem de 0,1 μg a 0,5 mg, 0,1 μg a 0,4 mg, 0,1 μg a 0,3 mg, 0,1 μg a 0,2 mg, ou 0,1 μg a 0,1 mg de teor de carboidrato. Em certas modalidades, o antígeno O de E. coli, bioconjugado, ou composição administrada é o mesmol em cada período. Em certas modalidades, o antígeno O de E. coli, bioconjugado, ou composição administrada é diferente em cada período.
[00277] Para imunização passiva com um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-O25B), a dosagem pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg de anticorpo por kg de peso corporal, ou de 0,01 a 5 anticorpo por kg de peso corporal. Por exemplo, dosagens podem ser 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal, ou na faixa de 1-10 mg/kg ou, em outras palavras, 70 mg ou 700 mg ou na faixa de 70-700 mg, respectivamente, para um paciente de 70 kg. Um regime de tratamento exemplar inclui a administração uma vez a cada duas semanas, ou uma vez por mês, ou uma vez a cada 3 a 6 meses, por um período de um ano ou por vários anos, ou por vários intervalos anuais. Os intervalos podem ser irregulares e alterados com base nos níveis de anticorpo no sangue do paciente.
[00278] A capacidade dos bioconjugados/composições aqui descritas em gerar uma resposta imune em um sujeito pode ser avaliada usando qualquer abordagem conhecida pelos versados na técnica ou aqui descrita. Em algumas modalidades, a capacidade de um bioconjugado em gerar uma resposta imune em um sujeito pode ser avaliada imunizando um sujeito (por exemplo, um camundongo) ou conjunto de sujeitos com um bioconjugado aqui descrito, e immunizando um sujeito adicional (por exemplo, um camundongo) ou conjunto de sujeitos com um controle (PBS). O sujeito ou grupos de sujeitos podem ser subsequentemente desafiados com ExPEC, e a capacidade de ExPEC em causar doença (por exemplo, UTI) no sujeito ou grupo de sujeitos pode ser determinada. Os versados na técnica reconhecerão que, se o sujeito ou grupo de sujeitos imunizados com o controle sofrem(s) de doença subsequente ao desafio com o ExPEC, mas o sujeito ou grupo de sujeitos imunizados com um(s) bioconjugado(s) ou composição deste aqui descrita sofre menos ou não sofre da doença, então o bioconjugado é capaz de gerar uma resposta imune em um sujeito. A capacidade de um bioconjugado(s) ou composição deste aqui descrita de induzir antissoro que possa reagir de maneira cruzada com um antígeno O de ExPEC pode ser testada, por exemplo, por um imunoensaio, tal como um ELISA.
[00279] A capacidade dos bioconjugados aqui descritos em gerar uma resposta imune em um sujeito pode ser avaliada usando um ensaio de soro bactericida (SBA) ou ensaio de morte opsonofagocítica (OPK), que representa um método estabelecido e aceito que foi usado para obter a aprovação de vacinas à base de glicoconjugado. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica e, resumidamente, compreendem as etapas de gerar e isolar anticorpos contra um alvo de interesse (por exemplo, um antígeno O, por exemplo, O25B, de E. coli), administrando a um sujeito (por exemplo, um camundongo) um composto que elicita tais anticorpos. Subsequentemente, a capacidade bactericida dos anticorpos pode ser avaliada, por exemplo, cultivando as bactérias em questão (por exemplo, E. coli do sorotipo relevante) na presença dos ditos anticorpos e células complementares e, dependendo do ensaio, neutrófilos, e ensaiando a capacidade dos anticorpos em matar e/ou neutralizar as bactérias, por exemplo, usando abordagens microbiológicas padrões.
[00280] É aqui fornecido uma embalagem farmacêutica ou kit compreendendo um ou mais recipiente preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições aqui descritas (ver Seção 5.6.2), tal como um ou mais antígenos de E. coli (ver Seção 5.2) e/ou bioconjugados (ver Seção 5.4) aqui fornecidos. Podem estar opcionalmente associados com tal(s) recipiente(s) um informativo na forma prescrita por uma agência do governo que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo informativo reflete a aprovação pela agência para fabricação, uso ou venda para administração humana. Os kits aqui incluídos podem ser usados nos métodos de tratamento anteriores e imunização de sujeitos.
[00281] Um processo no qual células ou massa de célula lisada são misturadas com antissoro contendo anticorpos específicos para uma estrutura polimérica, por exemplo, antígeno O. Agregados insolúveis e visíveis se formam quando o antissoro reconhece as estruturas celulares. Este método é classicamente usado para identificar os sorotipos O, K, e H. Ver DebRoy, et al., (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185.
[00282] LPS de células Gram-negativas é composto de uma base de lipídeo A, modificado por uma parte central de oligossacarídeo que fornece a anexação ao antígeno O. Para analisar o LPS de isolados clínicos, as células foram crescidas em meio LB padrão a 37 °C por 24 h, e a biomassa correspondente a 1 mL de cultura com um OD600 de 2 foi coletada e lisada em tampão de amostra 1x Lãmmli e incubada a 95 °C por 10 minutos. Os extratos foram tratados adicionalmente por 1 hora a 65 °C para remover qualquer proteína sinal usando 1 g/L de proteinase K. Os extratos tratados foram separados por SDS PAGE e o LPS foi visualizado por manchamento pela prata ou Western blotting usando antissoro apropriado.
[00283] LPS foi preparado usando um método descrito por Apicella, (2008) Methods Mol Biol 431, 3-13, e purificado adicionalmente da maneira descrita por Perdomo e Montero, (2006) Biotecnology Applied 23:124-129.
[00284] Este método é usado para analisar a estrutura de OPS ligado à UPP.
[00285] Para extrair glicanos ligados à UPP, células de E. coli foram lavadas com 0,9 % de NaCl e liofilizadas. As células secas foram extraídas com solvente orgânico (Metanol:água (M:W=17:3 a 19:1, v/v), e/ou misturas de clorofórmio:Metanol:água de razões otimizadas (por exemplo, C:M:W = 10:10:3; v/v/v)). Os extratos foram secos em um fluxo de N2, e ressuspensos em C:M:W=3:48:47. Para purificar os glicolipídeos extraídos, a ressuspensão 3:48:47 passou por um cartucho tC18 Sep-PAK. O cartucho foi condicionado com 10 mL de metanol, seguido pelo equilíbrio com 10 mL de 3:48:47 (C:M:W). Após preenchimento da amostra, o cartucho foi lavado com 10 mL de 3:48:47 (C:M:W) e eluído com 5 mL de metanol e 5 mL de 10:10:3 (C:M:W). As eluições combinadas foram secas em N2. As amostras de glicolipídeo foram hidrolisadas dissolvendo as amostras secas em 2 mL de ácido n-propanol:2 M trifluoroacético (1:1), aquecendo a 50 °C por 15 min, e a seguir evaporando até a secura em N2 (Glover, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9). As amostras secas foram ressuspensas mais uma vez em 3:48:47 e passaram por um cartucho tC18, e o fluxo obtido foi seco em N2. A marcação com 2-AB e limpeza com glicano foram realizadas usando o método de disco de papel descrito (Bigge, et al., Anal Biochem 230(2): 22938; Merry, et al., Anal Biochem 304(1): 91-9).
[00286] Os glicanos marcados com 2-AB foram separados por HPLC usando uma coluna de fase normal GlicoSep-N, de acordo com Royle et al., mas modificada em um sistema de três solventes (Royle, et al., Anal Biochem 304(1): 70-90). O solvente A era formato de amônio 10 mM pH 4,4 em 80 % de acetonitrila. O solvente B era formato de amônio 30 mM pH 4,4 em 40 % de acetonitrila. O solvente C era ácido fórmico 0,5 %. A temperatura da coluna foi 30 °C e os glicanos marcados com 2-AB foram detectados por fluorescência (excitação Xex = 330 nm, emissão Xem = 420 nm). As condições de gradiente foram um gradiente linear de 100 % de A a 100 % de B por 160 min em uma vazão de 0,4 mL/min, seguido por 2 min 100 % de B ao 100 % de C, aumentando a vazão para 1 mL/min. a coluna foi lavada por 5 min com 100 % de C, retornando para 100 % de A por 2 min, e correndo por 15 min a 100 % de A em uma vazão de 1 mL/min, e a seguir retornando a vazão para 0,4 mL/min por 5 min. As amostras foram injetadas em água.
[00287] Um equivalente de glicano marcado com 2-AB é seco a 30 °C, resuspenso em 50 μL de água com (amostra) ou sem (simulado) NaOH 200 mM (pH ~ 14), e incubado por 25 horas a 37 °C. A solução é então aquecida em temperatura ambiente e neutralizada pela adição de solução de HCl 200 mM (pH ~ 1). Após secar em velocidade a vácuo a 30 °C, a amostra é remarcada com 2AB e analisada por HPLC.
[00288] A mesma técnica HPLC de fase normal descrita anteriormente foi usada para separar OPS liberado dos bioconjugados após a hidrazinólise. Antes da hidrazinólise, os bioconjugados correspondentes à 1 mg de proteína foram completamente secos em um fluxo de N2. A liberação do polissacarídeo foi realizada usando o kit de liberação de glicano por hidrazinólize Ludger Liberate (Ludger #LL-HYDRAZ-A2), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 450 μL de hidrazina foram adicionados às amostras secas em uma cobertura de N2 e incubados por 16 horas a 85 °C. A hidrazina foi removida por evaporação em N2 a 45 °C. A re-N-acetilação dos polissacarídeos foi realizada por incubação em 471 μL 4,5 % de anidrido acético em bicarbonato de sódio 1M por duas horas no gelo. Posteriormente, 600 μL de uma solução de TFA 5 % foram adicionados e as amostras foram hidrolisadas por mais uma hora no gelo. A purificação foi realizada em uma coluna EB20 usando os tampões correspondentes EB20 A e B.
[00289] Os polissacarídeos liberados e purificados foram marcados com 2-AB e analisados por NP-HPLC, da maneira descrita para as amostras de LLO. Os picos de interesse foram coletados e identificados por MS/MS.
[00290] Para analisar a sequência de monossacarídeo de uma molécula OPS de interesse, a análise por espectroscopia de massa foi realizada. As frações coletadas e secas que correspondem aos picos específicos de HPLC foram ressuspensas em 5 uL de acetonitrila 10 % (ACN), 0,1 % de ácido trifluor acético (TFA), e misturadas 1:1 com solução matriz (40mg/mL de DHB em ACN 50 %, TFA 0,1 %) na placa alvo. Os dados de MS e MS/MS foram adquiridos manualmente no modo íon positivo em um espectrômetro de massa Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha). MS/MS foram obtidos usando o método LIFT. Uma mistura padrão de peptídeo (Bruker Daltonik GmbH) foi usada para calibração externa. Os espectros foram exportados usando o software de análise Flex (Bruker Daltonik GmbH) e analisados manualmente.
[00291] Bioconjugados foram produzidos por células recombinantes de E. coli que expressam, por meio de plasmídeo(s), proteína(s) carreadora(s) e a oligossacaril transferase de C. jejuni (PglB), e OPS de cosmídeos ou mutantes de inserção cromossomal.
[00292] EPA desintoxicada geneticamente (Exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa contendo as mutações L552V, ΔE553) foi usada como uma proteína carreadora, e foi modificada para compreender 2 ou 4 sítios de glicosilação (aqui referidos como 2S-EPA e 4S-EPA, respectivamente) e uma marcação HIS C-terminal, e foi expressa de um derivado de pBR322, plasmídeo indutível por arabinose (ver Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61).
[00293] MBP (Proteína de ligação de maltose), um periplasmático natural, proteína solúvel de E. coli, foi expressa a partir de um pGVXN579. pGVXN579 é um plasmídeo pMAL-p2X modificado (New England Biolabs) que codifica três sequências de consenso bacterianas de N glicosilação em uma linha, seguido por uma marcação Myc C-terminal fundida à proteína de ligação de maltose ORF codificada no plasmídeo. Esta configuração permite a purificação por afinidade do bioconjugado MBP independente de uma marcação HIS. A indução da expressão é controlada pelo promotor tac e é indutível usando IPTG.
[00294] A proteína PglB foi expressa a partir do plasmídeo pEXT21 (um fragmento EcoRI/BamHI de pMAF10 (Feldman et al., 2005, PNAS USA 102(8):3016-3021) foi clonada em pEXT21 com uma marcação HA fundida C-terminalmente. Variantes do plasmídeo de expressão são otimizados pelo códon (pGVXN939), otimizados pelo códon com uma eliminação do sítio de glicosilação (pGVXN948), e removidos pela marcação HA-T (pGVXN970) e otimizados pelo códon e eliminados pela marcação HA (pGVXN971).
[00295] Isolados clínicos foram analisados por sua capacidade de sintetizar um certo OPS usando aglutinação, Western blot, manchamento pela prata, impressão digital por LLO, sorotipagem por PCR, ou tecnologias similares que permitem a identificação das características estruturais de OPS, e também por seu fenótipo de resistência aos antibióticos. Certos isolados clínicos foram eliminados cromossomicamente de maneira adicional pela enzima ligase, WaaL, para melhorar a disponibilidade de OPS para a glicosilação de proteína ou análise de OPS.
[00296] Para analisar adicionalmente os isolados clínicos, o aglomerado rfb da cepa de laboratório W3110 foi substituído pelo aglomerado rfb clonado de isolados clínicos, e a biossíntese de OPS foi analisada. O gene waaL foi eliminado para melhorar a eficiência da produção de bioconjugados.
[00297] As trocas de aglomerado e eliminações de waaL foram atingidas por recombinação homóloga usando um método otimizado (ver pedido de patente internacional PCT/EP2013/068737) ou procedimentos publicados (Datsenko e Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 66406645). Em relação à troca do aglomerado OPS, o aglomerado rfb de interesse de um isolado clínico foi clonado no plasmídeo de seleção contador pDOC-C, junto com um cassete de resistência aos antibióticos, para integração subsequente no locus rfb da cepa E. coli W3110 (Kuhlman e Cox, 2010, Nucleic acids research 38, e92; Lee et al, 2009, BMC Microbiol 9, 252). A recombinação homóloga de aglomerados grandes rfb de interesse foi atingida usando flanqueamento de DNA no aglomerado rfb que codifica a sequência de W3110 de 0,5 a 1,5 quilobases em tamanho, e linearização in vivo da inserção de DNA de plasmídeo de suporte rfb. A cepa resultante continha um aglomerado rfb substituído (com e sem cassete de resistência aos antibióticos), isto é, o aglomerado rfb de W3110 foi substituído por uma molécula de DNA entre os genes gale e gnd pelo intervalo análogo isolado de uma amostra clínica de E. coli.
[00298] Em certos experimentos, as cepas W3110 contendo um cosmídeo que codifica o aglomerado rfb de um dado sorotipo de E. coli foram usadas como cepas hospedeiras.
[00299] Para a produção de bioconjugados recombinantemente expressos em cepas à base de W3110, os genes suportados em W3110 que interferem com a produção recombinante de OPS foram eliminados. Por exemplo, em relação à célula hospedeira que produz bioconjugados O25Bs, o aglomerado gtrABS de W3110 foi eliminado. Para atingir isto, a recombinação homóloga de acordo com um método publicado (Bloor AE, Cranenburgh RM. Appl Environ Microbiol. 2006 Apr;72(4):2520-5.) usam sequências de homologia que flanqueiam à montante o gene gtrA e à jusante o gene gtrS.
[00300] Para montar as cepas de produção, a cepa hospedeira foi transformada com um pglB e um plasmídeo de expressão carreador por transformação. Ver Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793.
[00301] A produção de bioconjugado foi realizada crescendo células hospedeiras e purificando bioconjugados produzidos no espaço periplasmático. O crescimento foi realizado tanto em frascos de agitação quanto em um processo de fermentação em lote alimentado de escala industrial.
[00302] Os cultivos em frasco de agitação foram realizados a 37 °C, usando um meio composto dos antibióticos apropriados em caldo Terrific, algumas vezes suplementado com MgCl2 5 mM. O meio foi inoculado em uma OD de 0,05 com um cultivo por toda a noite de células de produção recentemente transformadas, crescidas até a fase mid-log, induzidas com arabinose 0,2 % e IPTG 1mM, crescidas adicionalmente e coletadas após 20 horas de crescimento.
[00303] Uma alíquota de um banco da linhagem celular de produção foi usada para inocular um frasco de agitação contendo meio de soja LB com os antibióticos apropriados. O frasco de agitação foi incubada a 180 rpm, 37 °C por aproximadamente 12 horas. Os meios em lote sem complementos foram esterilizados diretamente dentro do biorreator (33 min a > 121 °C), resfriados, e os complementos foram adicionados. KOH 4 M ou ácido fosfórico 25 % foram anexados ao fermentador para regulação com pH e o pH foi ajustado em pH 7. Inoculação do biorreator e cultura em lotes da pré- cultura foi realizada para render uma OD600 inicial de 0,005. O pH foi mantido estável pela adição de KOH 4 M ou ácido fosfórico 25 %. A tensão de oxigênio dissolvido (DO) é mantida. A pressão elevada foi mantida em 600 mbar. A formação de produto foi induzida com L-Arabinose (0.1 %) e/ou IPTG (1 mM). Imediatamente após a indução, a alimentação foi iniciada pela adição de meio de suplementação contendo Arabinose 2,5 % e IPTG. 24±2 horas após a indução, o biorreator foi resfriado a 25 °C, a suplementação parou e a coleta foi realizada por filtração de fluxo tangencial ou centrifugação.
[00304] A biomassa foi lisada em Triton X-100 0,5 % pela interrupção durante 4 ciclos de homogeneização de alta pressão a 800 bar.
[00305] Bioconjugados foram purificados por cromatografia em coluna. Várias técnica cromatográficas foram usadas para preparar bioconjugados, principalmente IMAC, cromatografia de troca aniônica à base de resina Q (AEC), e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Ver, por exemplo, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18) e WO 2009/104074 para descrição de tais métodos.
[00306] À partir da pré-cultura, uma quantidade definida foi transferida para um biorreator contendo um meio rico a 35 ± 0,2 °C. O pH e tensão de oxigênio dissolvido foram mantidos. A taxa de agitação atingiu 700 rpm.
[00307] Quando a densidade emperat atingiu OD600 = 40 ± 5, a formação do produto foi induzida com L-Arabinose (0.1 %) e IPTG (1 mM). A suplementação iniciou 24±2 horas após a indução e o biorreator foi resfriado. Assim que a emperature atingiu 25 °C, a suplementação parou e as células foram coletadas.
[00308] Uma biomassa que corresponde a 50 L na coleta foi descongelada por 1 dia a 2 a 8 °C. A seguir, 2,5 L de tampão de lise e clarificação foram adicionados ao recipiente. Triton X-100 foi adicionado em uma concentração final de 0,5 % e as células completamente descongeladas foram rompidas por 4 ciclos de homogeneização de alta pressão a 800 bar. As células foram coletadas e lavadas usando técnicas padrões.
[00309] Bioconjugados contendo aproximadamente 8 ug de polissacarídeo foram hidrolisados por seis horas em 104 μL de TFA 3 M a 99 °C. TFA foi removido por evaporação e as amostras foram lavadas uma vez com 500 μl de 2-propanol. Os monossacarídeos resultantes foram suspensos em 100 μL de mistura de marcação contendo 87,1 mg/mL de 1-fenil-3-metil- 5-pirazolona (PMP), 50 % de MeOH e NaOH 150 mM. A marcação foi realizada durante 60 minutos a 70 °C. As amostras foram neutralizadas pela adição de 50 μL de HCl 300 mM e 20 μL de Tris/HCl 100 mM pH 7,0. Os monossacarídeos marcados com PMP foram purificados por extração, uma vez com 1 mL de di-butil éter e três vezes com 1 mL de CHCl3.
[00310] Os monossacarídeos derivados de PMP foram separados por RP-HPLC (Merck-Hitachi) em uma coluna C18 Inertsil ODS-3 (GL Sciences) equipada com uma pré-coluna. Um gradiente de duas etapas de tampão A 100 % (13 % de acetonitrila, 87 % de H2O (0,045 % de KH2PO4, 0,05 % de trietilamina, pH 7,0) em 50 % de tampão A / 50 % de tampão B (21 % de acetonitrila, 79 % de H2O (0,045 % de KH2PO4, 0,05 % de trietilamina, pH 7,0), por 4 minutos em 100 % de tampão B por 47 minutos foi aplicado a 35 °C e uma vazão de 1 mL/min. O volume de injeção era 50 μL e a eluição foi monitorada por detecção por UV online a 250 nm. Os picos individuais foram identificados por sobreposição com cromatogramas dos padrões de monossacarídeos disponíveis comercialmente D-glicose (Sigma-Aldrich #G7528), L-ramnose (Sigma-Aldrich #R3875), N-acetil-D-glucosamina (Sigma-Aldrich #A8625) e N-acetil-L-fucosamina (Omicron Biochemicals #FUC-006).
[00311] Para determinar a distribuição de sorotipo de E. coli que causa infecção do trato urinário (UTI), um estudo de epidemiologia foi realizado. Mais de 1800 isolados de E. coli de amostras de urina humana foram coletados de sujeitos na Suíça e os sorotipos de antígeno O (OPS) de cada amostra foram analisados usando técnicas de aglutinação clássica. Ver Figura 4.
[00312] As amostras de urina isoladas de humano foram analisadas para determinar a identidade de patógenos nas mesmas, e seus padrões de resistência aos antibióticos. Isolados de E. coli foram obtidos das amostras após a análise. Os isolados de E. coli foram identificados por estratégias de exclusão e inclusão microbiológicas clássicas, envolvendo o crescimento no ágar cromo (CPS3) e MacConkey. Os isolados de E. coli foram analisados adicionalmente usando um ensaio de aglutinação para determinar seu sorotipo de antígeno O. Ver DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185. Os isolados dos mesmos sorogrupos de antígeno O forma analisados adicionalmente para determinar a estrutura química da cadeia O de cada isolado. Ver Tabela 1A. Certas cepas isoladas de E. coli foram determinadas para serem resistentes aos antibióticos, incluindo identificação de cepas resistentes à fluoroquinolona e cepas produtoras de de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL). Tabela 1A: Distribuição dos sorotipos mais comuns de E. coli associadas à UTI, a partir de uma coleção de 1841 amostras de urina coletadas na Suíça em 2012. É mostradas a distribuição de sorotipo de amostras de uma subpopulação relevante de 671 sujeitos, e a distribuição de todas** amostras.
[00313] Os sorotipos O1, O2, O4, O6, O7, O8, O16, O18, O25, O73, e O75 foram isolados de sujeitos independente do local, tempo de isolamento, sintomas e população alvo, sugerindo que estes sejam os sorotipos predominantes de E. coli uropatogênica (UPEC). Dessa maneira, a identificação dos sorotipos de antígeno O mais prevalentes indica que as vacinas específicas de antígeno O podem ser limitadas a um subgrupo de sorotipos, ou seja aqueles mais associados com doença, da maneira identificada no estudo descrito neste exemplo.
[00314] Uma análise retrospectiva de sorotipos de UTI em 1323 isolados das últimas três décadas nos Estados Unidos, obtida do centro de referência de E. coli (ECRC), permitiu uma comparação completa com a literatura e os dados atuais da Suíça. A prevalência dos 20 principais sorotipos foi observada independentemente no local, tempo de isolamento, sintomas, ou população alvo e sugere sorotipos predominantes associados à UPEC (ver Tabela 1B). Tabela 1B: Prevalência de sorotipos mais comuns associados à UTI de literatura selecionada, variando de 1987- 2011, e de dados dos Estados Unidos retrospectivamente analisados de 2000-2011 (ECRC).
[00315] Os isolados de sorotipos descritos foram calculados como percentual no número total de isolados (Andreu et al., 1997, J Infect Dis 176:464-469; Blanco et al., 1996, Eur J Epidemiol 12:191-198; Fathollahi et al., 2009, Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81; Johnson et al., 2005, J Clin Microbiol 43:6064-6072; Molina-Lopez et al., 2011, Journal of infection in developing countries 5:840-849; Sandberg et al., 1988, J Clin Microbiol 26:1471-1476; K. L. 2007, The Journal of infection 55:8-18; Terai et al., 1997, Int J Urol 4:289-294.) Em certos casos específicos, os dados não estão disponíveis; Portanto, os números percentuais podem fornecer apenas uma indicação na distribuição completa de sorotipo de diferentes isolados de UTI em estudos descritos, e devem ser considerados com precaução. Os outros sorotipos descritos identificados, entretanto menos prevalente (O15, O20, O21, O22, O77 e O82), também são incluídos.
[00316] Em toda informação de análise de epidemiologia obtida, os 10 sorotipos predominantes podem cobrir uma estimativa de 60-80 % de infecções de E. coli, o que presume a abrangência de subporções das cepas não tipáveis. Além disso, os dados mostram a importância não esperada do sorotipo O25 no estudo de epidemiologia da Suíça quando comparados aos dados de literatura e dados recentes dos Estados Unidos. Ver Tabelas 1A e B.
[00317] Os sorotipos de antígeno O de E. coli são frequentemente compostos de subtipos, os quais são distintos, e ainda estruturalmente e antigenicamente similares. Para identificar subtipos desconhecidos/não relatados entre os isolados clínicos coletados, e para identificar os subtipos mais prevalentes de antígeno O, as estruturas químicas dos antígenos O e dos sorotipos mais prevalentes foram analisadas em mais detalhes.
[00318] Em anos recentes, a maior ocorrência de cepas O25-positivas foram observadas (ver George e Manges (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690) e é evidenciada pelo estudo descrito no exemplo 1, onde o sorotipo O25 foi observado como um dos quatro principais sorotipos de E. coli em termos de prevalência.
[00319] Uma estrutura de unidade repetida de antígeno O do sorotipo O25 de E. coli foi previamente publicada (ver Kenne et al., 1983, Carbohydrate Research 122, 249-256; e Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4) e é apresentada na figura 2B. Um aglomerado rfb relacionado ao antígeno O O25 da cepa E. coli E47a está publicamente disponível (GenBank GU014554), e é apresentada na figura 2A. E. coli E47a é usada como uma cepa de referência para o sorotipo O25. A informação de sequência adicional do aglomerado rfb está disponível da sequência do genoma de uma cepa que causa bacteriúria assintomática, E. coli 83972. (ver Zdziarskiet al., 2010, PLoS Pathog 6, e1001078). Embora a expressão fenotípica O25 não tenha sido confirmada, as sequências de aglomerado rfb de E. coli E47a e 83972 são 99,49 % idênticas, sugerindo fortemente que codificam o mesmo antígeno O.
[00320] O antígeno O de E. coli cepas 83972 e E47a é aqui determinado como “O25A”, em decorrência da maneira a seguir, um antígeno O inédito de E. coli, determinado “O25B”, foi identificado com base na análise dos isolados clínicos obtidos no estudo de epidemiologia descrito no exemplo 1, anterior.
[00321] As funcionalidades para os produtos de gene previstos de E. coli cepas 83972 e E47a foram propostas. Ver tabela 2; GenBank GU014554; e Szijarto, et al. (2012) FEMS Microbiol Lett 332, 131-136. Tabela 2. Previsões do gene do antígeno O O25A a partir do aglomerado rfb publicado por Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; ver também GenBank GU014554.
[00322] Comparações de estrutura e aglomerado de genes implicam que todas as funções necessárias pra a montagem do OPS O25A são codificadas no aglomerado rfb, localizado entre galE e gnd.
[00323] As funções das várias enzimas do aglomerado de genes rfb (ver Fig. 2A) são da maneira a seguir:
[00324] RmlBDAC codifica as enzimas exigidas para a biossíntese de dTDP-L-Ramnose, que é o substrato para a adição de L-Rha ramificada na unidade repetida de OPS.
[00325] FnlABC codifica as enzimas exigidas para a biossíntese de UDP-L-FucNAc, que é o substrato doador para a adição de L-FucNAc à repetição de O25 OPS.
[00326] WekABC e wbuBC são glicosiltransferases de acordo com análise por homologia. Entretanto, wbuC aparece curto e truncado e é provavelmente não funcional. Assim, as anotações provavelmente mais funcionais indicam que existem quantro glicosiltransferases que geram as quatro ligações para montagem da unidade repetida.
[00327] Wzx e Wzy são exigidos for acionamento do BRU no espaço periplasmático e sua polimerização em Und-PP.
[00328] Todas as funções exigidas para sintetizar a estrutura de unidade repetida O25A publicada são codificadas pelos aglomerados rfb de E. coli E47a e 83972. Assim, conclui-se que o aglomerado rfb é responsável por codificar o OPS O25A.
[00329] Em 2009, isolados clínicos de E. coli de um ambiente hospitalar na Espanha foram caracterizados para determinar grupos clonais. Ver Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141. Caracterização de a) o tipo de ESBL, b) o sorotipo O, c) genes de virulência, d) tipagem de sequência multi locus (MLST), e e) tipagem por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) foram realizadas. Os resultados indicam que cerca de 20 % de todos os isolados podem ser atribuídos ao mesmo clone: O sorotipo e MLST O25:H4 ST131, tipo de ESBL CTX-M15, filogrupo B2, que codifica um grupo específico de genes de virulência. A análise dos componentes do aglomerado rfb de isolados clínicos representativos mostrou uma sequência 3’ desconhecida quando comparada à sequência da cepa de tipagem da cepa E47a, e também de isolados clínicos identificados por um métodos de tipagem por PCR de alelo específico (Ver Clermont et al., 2008, J Antimicrob Chemother. 61(5):1024-8.; Clermont et al., Diagn. Microbiol Infect Dis. 2007, 57(2):129-36.; e Li, et al., 2010, J Microbiol Methods 82, 71-77. Em 2013, Phan et al. publicaram a sequência do genoma de clone O25b:H4 ST131, confirmando que o clone é um derivado de K-12, de acordo com a estrutura de seu aglomerado de genes waa, da maneira relatada anteriormente. Ver Phan et al., 2013, PLOS Genetics 9(10):1-18 (e1003834). Juntos, os dados sugerem que um clone de aglutinação O25 inédito surgiu em isolados de E. coli de ambiente hospitalar, e que o clone apresentou fenótipos específicos ESBL, MLST, e PFGE e continha um aglomerado de genes alterado do antígeno O.
[00330] Para determinar se o sorotipo O25B estava presente entre as cepas isoladas de E. coli identificadas no estudo de epidemiologia descrito no exemplo 1, as cepas O25 positivas para aglutinação foram analisadas por tipagem por PCR para O25 e O25B. PCR foi realizada usando colônias recuperadas de uma placa de Petri como fonte de DNA molde e diferentes oligonucleotídeos iniciadores. Oligonucleotídeos iniciadores específicos para O25, baseados na amplificação de E47a O25 wzy, e descritos em Li, et al. (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77 foram usados. Também foram usados os oligonucleotídeos iniciadores específicos para O25B descritos em Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141, que são específicos para uma porção 3’ não definida do aglomerado rfb de O25b (LNB220). De acordo com Phan et al., 2013, este par de oligonucleotídeo específico para O25B anela em uma porção 3’ do aglomerado rfb de O25B.
[00331] Dos 24 isolados clínicos testados com um fenótipo positivo para aglutinação de O25, 20 foram determinados com o sorotipo O25B por tipagem por PCR, enquanto os 4 restantes foram identificados positivamente como pertencentes ao sorotipo O25A por tipagem por PCR. Assim, de maneira surpreendente, as cepas do sorotipo O25B foram determinadas para serem mais frequentes entre as cepas analisadas do que as cepas do sorotipo O25A.
[00332] Para analisar o aglomerado rfb de O25B geneticamente, o aglomerado de uma cepa positiva para PCR O25B, determinado “upec138” foi sequenciado. Os genes identificados e seus homólogos protéicos relevantes mais próximos, junto com a nomenclatura sugerida são listadas na tabela 3, a seguir. Os genes específicos para O25B e ausentes em O25A são indicados com um asterisco. Tabela 3. Previsões do gene de antígeno O O25B do aglomerado rfb.
[00333] A composição de aglomerado rfb mostra diferenças evidentes na composição do aglomerado O25A. Os genes na porção 5’ do aglomerado são homólogos próximos um do outro (rmlD to wzy; E. coli E47a e 83972). Isto não é surpreendente para os genes rml, que são homólogos em muitas cepas de E. coli que sintetizam L-ramnose. A homologia do produto de genes de O25A e B abrange o gene wekC (O25A), antes de cair em níveis abaixo de 25 % de identidade, indicando não relação com sequências de proteína. Ver Fig. 3B. Adicionalmente, observa-se que os genes de biossíntese de UDP-N- acetilfucosamina de O25A estão ausentes em cepa upec138 (O25B), uma vez que apresentam duas glicosiltransferases à jusante de fnlABC. Ver Fig. 3B. Obtidos juntos, estes dados sugerem que as cepas O25B são incapazes de sintetizar UDP-L-FucNAc, exceto que a biossíntese dos genes L-FucNAc pode ser codificada fora do aglomerado rfb. Entretanto, não existe nenhum caso relatado para um locus fnlABC dentro do aglomerado rfb quando L- FucNAc está presente em BRU do antígeno O. Isto é, é improvável que a cepa 138 seja capaz de sintetizar a unidade repetida básica (BRU) O25A publicada.
[00334] Os genes identificados no aglomerado rfb de O25B que não estão presentes no aglomerado rfb de sorotipo O25A codificam duas glicosiltransferases e uma O-acetiltransferase. Estes três genes compartilham a mesma organização e as proteínas codificadas apresentam muita homologia com os genes wbbJKL encontrados, e foram caracterizadas em cepas de E. coli K-12 do genótipo do aglomerado rfb O16. Ver Fig. 3B. De acordo com a relação genética entre os sorotipos O25B e O16, a nomenclatura dos genes O16 rfb, wbbJKL foi aplicada aos genes homólogos, identificados no aglomerado rfb O25B.
[00335] A estrutura de BRU O16 é conhecida e as funções do gene de wbbJKL foram determinadas. Ver Steveneson et al., (1994) J Bacteriol. 176(13):4144-56. WbbJKL são responsáveis por acetilação de L-Ramnose, transferem de um resíduo D-Glc para L-Rha-D-Glc-UndPP, e o transferem do L-Rha para D-GlcNAc-UPP, que é formado por wecA do aglomerado ECA. Com base na homologia com O16 WbbJKL, e as funções conhecidas O16 WbbJKL, pode-se deduzir que o aglomerado rfb O25B sintetiza uma estrutura contendo elementos parcialmente O16 e parcialmente O25A juntos. Fundamenta-se muito provavelmente que WbbJKLO25B sintetiza a mesma estrutura que WbbJKLO16, isto é α-D-Glc-1,3-α-L-Rha(2Ac)-1,3-α-D- GlcNAc. Esta estrutura de trissacarídeo é idêntica à parte principal “central” não ramificada de O25A, apenas com a exceção de que o L-Rha(2Ac) substitui o L-FucNAc. A substituição pode ser, dessa maneira, uma conservativa, uma vez que D-FucNAc e L-RhaOAc são ambos monossacarídeos com uma função 6-desoxi e 2-acetil. A única diferença é a conformação, uma vez que a fucose é relacionada à galactose, e ramnose à manose, resultando em uma orientação diferente do grupo OH na posição 3 e o grupo metil na posição 5. As ligações entre os monossacarídeos podem ser idênticas (todas α-1,3), indicando que as estruturas podem ser similares na forma e características químicas. Em analogia, as proteínas codificadas na parte à montante dos aglomerados rfb O25A e B (rmlDCAB e wekAB) ramidicam a BRU de O25A ou B pela anexação da ramificação D-Glc e L- Rha em ambas as partes principais “centrais” do trissacarídeo. Isto pode significar que são aceitas ambas as partes principais (com L-FucNAc OU L- Rha(2Ac)) como um substrato.
[00336] A presença de L-Rha como o segundo monossacarídeo da extremidade redutora da BRU O25B explica por que a biossíntese de L- FucNAc pode estar ausente em O25B. UDP-L-FucNAc não é necessário, em decorrência de ser substituído pelos genes da biossíntese de dTDP-L-Rha, que estão presentes na extremidade 5’ do aglomerado (rmlDBAC).
[00337] Phan et al., 2013 apresentaram uma análise genética similar em um isolado clínico O25B, mas concluíram de maneira diferente. Também sequenciaram o genoma inteiro para encontrar o aglomerado de genes responsável pela biossíntese de UDP-FucNAc; entretanto, determinam que a maquinária para UDP-L-FucNAc em cepa O25B:H4 ST131 EC958 está ausente não apenas no aglomerado rfb O25B, mas na cepa inteira. Entretanto, Phan concluiu que UDP-L-FucNAc tem que ser sintetizado de uma maneira diferente, presumindo que O25B:H4 ST131 EC958 produz a mesma estrutura de antígeno O como E47a, isto é, O25A. Ao contrário, é aqui descrito que o cenário mais provável é que cepas O25B não produzem L-FucNAc, mas ao contrário, substituem o segundo resíduo de BRU por um resíduo de L- ramnose O-acetilado, e os genes exigidos para esta mudança são exclusivamente codificados no aglomerado rfb.
[00338] Além disso, a presença de um homólogo de O-acetil transferase no aglomerado O25B sugere a O-acetilação na BRU O25B, uma modificação ausente em O25A. Dessa maneira, determina-se que as estruturas de antígeno O25 dos sorotipos O25A e O25B tem que ser diferentes.
[00339] Para confirmar a hipótese de uma estrutura diferente de antígeno O25, a composição química e arranjo dos antígenos O dos isolados clínicos O25 descritos no exemplo 1 foram analisados. Para caracterizar as estruturas OPS O25 em mais detalhes, vários métodos foram usados.
[00340] Primeiro, a estrutura do antígeno O foi analisada por SDS PAGE. O lipopolissacarídeo (LPS) de isolados clínicos foi analisado em relação às diferenças em mobilidade electroforética usando métodos de coloração diferentes após SDS PAGE. Para visualizar as quantidades de LPS, manchamento pela prata e Western blots anti-O25 específicos foram realizados. Ver figura 5, que representa resultados da análise de 10 isolados. Os dados mostram que as intensidades de sinal similar são obtidas por manchamento pela prata das diferentes preparações de LPS. Ao contrário, a sondagem com o antissoro específico mostrou intensidades de sinal mais fortes em 3 das 10 amostras (isolados upec436, upec767, upec827). Especula- se que as intensidades de sinal possam surgir em virtude das diferenças na estrutura do OPS.
[00341] Para elucidar a estrutura O25B em detalhes, métodos analíticos diferentes foram aplicados. O isolado clínico upec138 foi positivo para O25B por PCR, e exibe um reconhecimento mais fraco pelo antissoro de aglutinação O25 do que pelas cepas O25A. Ver figura 5. Além disso, a cepa é ESBL, mas sensível para FOS, IPM, e TZP, e resistente para AM, CXM, NOR, e CIP. Um outro isolado clínico, cepa upec436, foi negativo para O25B por PCR, mas positivo para o O25 geral (O25A) por PCR. Observou-se também que upec436 é muito reativa com o antissoro de aglutinação O25 quando seu LPS foi analisado por Western blotting. Ver figura 5. LLO de ambas as cepas foi extraído, marcado com um 2AB e analisado por HPLC de fase normal. Ver figura 6; LLO de upec138 e upec436, 9.079 e 9.081). Os padrões de eluição mostraram diferenças claras entre os dois extratos. A análise MS/MS de picos de cepa específica detectou sinais compatíveis com as estruturas esperadas de BRU.
[00342] Os sinais em cepa upec436 (9.081): O pico no tempo de eluição 62’ foi analisado por MS e observou-se que continha como a massa principal uma molécula com m/z=1021 Da, isto é, uma molécula que corresponde à massa esperada de OPS BRU O25A completo. MS/MS produziu um padrão de fragmentação compatível com a sequência de monossacarídeo de O25A (Fig. 7A; MS/MS de m/z=1021).
[00343] Os sinais na cepa upec138: A massa principal no pico no tempo de eluição de 50’ foi m/z 1022 Da, isto é, um Da maior que a unidade repetida completa de O25A. A análise MS/MS (Fig. 7B; O25B MS/MS) mostrou comportamento de fragmentação quase idêntico à unidade repetida O25A, e localizou uma diferença de 1 Da no 2o monossacarídeo da extremidade redutora (identificada por um íon de fragmentação Y de m/z=551 em O25A MS/MS, e m/z=552 na cepa upec138). Um pico adicional que eluiu em 60’ mostrou fragmentação similar, mas uma diferença de 42 Da na massa do íon mãe (m/z=980) localizado no mesmo monossacarídeo (m/z=510), isto é, o segundo da extremidade redutora. A interpretação destes resultados é fornecida a seguir.
[00344] Os procedimentos de extração de OPS, hidrólise e marcação com 2AB envolvem tratamento ácido para remover o Und-PP do OPS. Observa-se que as condições de tratamento removem parcialmente a O- acetilação, mas não a N-acetilação. Assim, é provável que o pico em 60’ represente uma massa desacetilada de BRU que surgiu da hidrólise química do material no pico 50’. Obtidos juntos, estes dados indicam que existe uma O-acetilação em O25B na mesma posição do monossacarídeo, em que existe N-acetilação em L-FucNAc de O25A.
[00345] Para confirmar quimicamente que a acetilação no segundo resíduo da extremidade redutora é O-ligada, um ensaio de desacetilação foi realizado. O pico específico de O25B de HPLC de 2AB LLO no tempo de eluição 50’ foi coletado de uma cepa positiva por PCR O25B e tratado com álcali descrito em ‘Métodos’. A re-análise por HPLC resultou em um pico no tempo de eluição 60’, da maneira identificada em um pico de O25B da figura 6, contendo uma massa principal de m/z=979, com um padrão de íon de fragmentação MS/MS consistente com uma BRU de O25B, que apresentou perda em seu grupo O-acetil. Os grupos N-acetil são estáveis no tratamento com álcali, da maneira mostrada pelo grupo N-acetil restante na extremidade redutora D-GlcNAc, na mesma molécula.
[00346] Em conclusão, determinou-se que a cepa O25B representativa upec138 é estruturalmente e geneticamente relacionada com o OPS O25A e O16 (Fig. 3A e B) de E. coli. O25B difere de O25A em uma estrutura de unidade repetida contendo um grupo O-acetil em vez de um grupo N-acetil no segundo monossacarídeo da unidade repetida, que é um resíduo L-Rha e não um D-FucNAc. Estas alterações foram mais provavelmente causadas por uma substituição da maquinaria de biossíntese de UDP-FucNAc e a D-FucNAc transferase por um intervalo de DNA, que codifica duas glicosiltransferases e uma O-acetiltransferase. Estes genes são relacionados aos aglomerados de gene O16, com base na homologia e análise da funcionalidade. As estruturas finais são diferentes, mas similares, o que explica a reatividade cruzada observada com o antissoro de aglutinação O25.
[00347] Da maneira discutida anteriormente, foi concluído e proposto, com base na análise de seus aglomerados rfb, que OPS O25A contém L- FucNAc, ao passo que a estrutura está ausente em O25B. Para investigar se FucNAc está ausente em O25B, a análise da composição de monossacarídeo dos bioconjugados EPA produzidos nas cepas O25A e O25B foi realizada (Fig. 9) usando o método de marcação PMP e método de análise HPLC descrito anteriormente. Para produzir bioconjugados, os isolados clínicos de E. coli com os fenótipos O25A e O25B foram preparados e modificados para a produção ideal de bioconjugado. Como parte da modificação, os genes waaL das cepas upec_436 (O25A) e uepc_138 (O25B) foram eliminados da maneira previamente descrita (ver Datsenko e Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645), informado pelo método para determinação de tipo principal (ver Amor, et al., (2000) Infect Immun 68, 1116-1124). As cepas resultantes foram transformadas com plasmídeos de expressão para 4S-EPA (pGVXN659) e uma oligossacaril transferase, PglB (pGVXN939), para produção de O25A; e com pGVXN114 e pGVXN539 (que produz 2S-EPA) para produção de bioconjugado O25B. Os bioconjugados O25B foram produzidos em um frasco de agitação de 2L com subsequente purificação por afinidade de extratos periplasmáticos por IMAC. Os conjugados O25A foram produzidos por fermentação por lote alimentado, e purificados por um procedimento de purificação de duas etapas, que se inicial com a clarificação total de homogenado celular, gerado por homogeneização de alta pressão, da maneira descrita nos métodos da seção anterior. A análise da composição de monossacarídeo foi realizada da maneira descrita anteriormente.
[00348] Os resultados confirmaram a ausência de um sinal para FucNAc nos bioconjugados derivados por O25B, ao passo que os bioconjugados contendo O25A mostraram um pico no tempo de eluição esperado, da maneira determinada submetendo uma mistura de monossacarídeos ao mesmo procedimento de processamento de amostra como um controle. Assim, confirmou-se que a estrutura provável de O25B é, da maneira esperada com base na análise do aglomerado rfb, L-FucNAc-less.
[00349] A estrutura completa da unidade repetida (RU) do antígeno polissacarídeo O (O-PS), do antígeno O O25B de Escherichia coli, foi determinada por ressonância magnética nuclear do bioconjugado após digestão enzimática parcial da fração carreadora da proteína EPA. A análise confirmou que o O-PS O25B é composto de uma RU de pentassacarídeo. Os sinais 1H e 13C foram determinados por técnicas de correlação RMN 2D, que confirmaram que a estrutura da RU O25B O-PS difere da estrutura de RU O25A O-PS publicada (Kenne, L., et al. 1983. Carbohydr. Res. 122:249-256; Fundin, J., et al. 2003. Magn. Reson. Chem. 41:202-205) pela substituição de um resídio α-3-FucpNAc por um resíduo α-3-Rhap, com mais de 90 % deste resíduo sendo O-acetilado na posição C2. A RU O25B O-PS completa é mostrada a seguir (O25B’):
[00350] Para analisar adicionalmente os antígenos do polissacarídeo O25A e O25B, mais material bioconjugado foi produzido. Para O25A, o lote purificado de O25A-EPA anterior foi usado para experimentos de caracterização adicional. Para produção de O25B-EPA, uma cepa com um aglomerado O25B genomicamente integrado foi construída: W3110 ΔwaaL ΔgtrABS ΔrfbO16::rfb(upec138), com plasmídeos pGVXN1076 e pGVXN970. Esta cepa foi construída a patir de W3110 pelos métodos de Datsenko e Wanner e por uma técnica de recombinação homóloga para integração sítio direcionada de inserções grandes nos cromossomos bacterianos (ver pedido de patente iInternacional PCT/EP2013/071328).
[00351] Os bioconjugados O25B resultantes foram caracterizados usando ensaios padrões de liberação e caracterização. Bioconjugados foram purificados usando duas etapas consecutivas de cromatografia de troca aniônica e por exclusão de tamanho, rendendo 97,2 e 98,1 % de preparações de O25A puro e bioconjugado O25B, respectivamente. A quantificação por SDS PAGE foi usada para análise de pureza. Ver figura 10 (O25A) e Fig. 11 (O25B). As razões açúcar para proteína foram calculadas com base na quantificação de açúcar pelo ensaio de antrona (ver Laurentin e Edwards, (2003) Anal Biochem 315, 143-145) e o ensaio de BCA para concentração de proteína, resultando em 40,2 e 26,6 % para O25A e bioconjugados O25B. A cromatografia por exclusão de tamanho mostrou um estado monomérico das partículas, em concordância com o raio hidrodinâmico esperado de EPA com cadeias de glicano anexadas.
[00352] Para direcionar o potencial imunogênico da estrutura O25B, vários experimentos pré-clínicos usando bioconjugados O25B e O25A foram realizados. Como observado na figura 5, todos os isolados clínicos identificados como positivos para O25 no exemplo 1 (isto é, ambos os isolados O25A e O25B) foram positivos com antissoros O25A, comumente usados para detectar sorotipos O25 (soros por tipagem da cepa E47a O25A) em Western blots. Assim, antissoro anti O25A parece apresentar reatividade cruzada com LPS das cepas O25B. Para analisar a resposta ao anticorpo e a reatividade cruzada em detalhes, os bioconjugados O25 foram produzidos. A proteína de ligação de maltose (MBP) foi usada como uma proteína carreadora, e a proteína carreadora foi ligada a O25A ou O25B. A tabela 4 representa as cepas usadas para a produção de proteína. As cepas usadas foram identificadas por PCR em relação ao seu genótipo O25A ou B. A expressão foi realizada em meio TB e o produto protéico foi purificado a partir dos extratos periplasmáticos. Tabela 4:Q: Purificação de recurso Q; A: resina amilose; S: cromatografia por exclusão de tamanho
[00353] Imunizações usando os bioconjugados obtidos foram realizadas usando protocolos padrões de imunização de coelho (o protocolo de velocidade de 28 dias Eurogentech). 50 μg de polissacarídeo ligado a MBP foram injetados nos dias 0, 7, 8, e 18 com um composto imunestimulatório sem Freund patenteado. Os antissoros séricos finais resultantes, obtidos no dia 28 após a primeira imunização, foram testados em relação à sua especificidade em relação ao LPS O25A ou O25B. A figura 22 mostra uma comparação das reatividades do antissoro em relação ao respectivo LPS (O25A ou O25B). O LPS foi preparado a partir de upec436 e upec138 por digestão da proteinase K de amostras de células completas, em tampão SDS- PAGE Lammli. A mesma quantidade de LPS foi preenchida em dois géis SDS-PAGE, seguido por eletrotransferência para membranas de nitrocelulose e detecção usando antissoros O25A e O25B. Os resultados mostraram que o antissoro O25A reconhece o LPS de O25A melhor que LPS de O25B, enquanto o antissoro O25B reconhece o LPS O25B melhor que LPS O25A. Este resultado indica que o antígeno autólogo produz um antígeno melhor. Assim, a inclusção de antígeno O25B em uma vacina fornecerá melhor proteção contra as cepas clínicas predominantes de O25B, do grupo O25, do que o antígeno O25A.
[00354] Os dados de bases estruturais listam diferentes estruturas de subsorotipo para E. coli O1. Em particular, O1A, O1A1, O1B, O1C. O1A e O1A1 são estruturalmente idênticos e acredita-se que estejam associados com doença, embora O1B e C não tenham sido relatados como patogênicos (ver Gupta, et al., (1992) J Bacteriol 174, 7963-7970), e representam uma minoria entre os isolados O1. As estruturas de O1A/O1A1, O1B, e O1C são mostradas na figura 12B. Para analisar a subdistribuição O1 de sorotipo no estudo de epidemiologia em UPEC do exemplo 1, as estruturas do antígeno O de vários isolados clínicos do estudo foram analisadas em detalhe. Primeiro, a estrutura do LPS de 12 cepas determinadas para serem positivas para O1 pelo ensaio de aglutinação foram analisadas por SDS PAGE. Ver figura 13: manchamento pela prata e Western blot de O1.
[00355] A manchamento pela prata mostrou sinais típicos de LPS em todas as canaletas contendo extratos dos isolados clínicos O1. A coloração forte em uma mobilidade eletroforética de cerca de 10-15 kDa representa a parte principal do lipídeo A, e sinais do tipo escada com mobilidades mais lentas representam a parte principal do lipídeo A modificada com polímeros de carboidrato compostos de diferentes números das unidades repetidas de antígeno. Quando o LPS de diferentes isolados são comparados, as diferenças aparecem na distribuição de comprimento modal, a mobilidade eletroforética de bandas individuais, e o padrão de escada. Com base nestas observações, três grupos podem ser identificados: (i) mais isolados (upec002, upec010, upec032, upec140, upec108, upec143, upec276, upec399, e upec425) exibiram mobilidade eletroforética indistinguível de bandas individuais, diferindo apenas na intensidade do sinal e tamanho médio da cadeia (distribuição de comprimento modal); (ii) dois isolados (upec119 e upec256) pareceram apresentar mobilidade um pouco mais rápida em cada banda de LPS de unidade repetida, sugerindo uma estrutura diferente, por exemplo, uma modificação diferente da parte central do lipídeo A; e (iii) sinais obtidos do isolado upec1096 aparecem como uma mancha sem ser uma escada, indicando uma estrutura de OPS diferente. Ver figura 13A.
[00356] A análise por Western blotting e detecção usando o antissoro anti O1 mostrou que LPS de quase toda upec1096 é detectado por anticorpos específicos O1, o que é indicativo de moléculas de LPS com reatividade cruzada. Isto significa que 11 dos isolados são O1, e que upec1096 muito provavelmente não é um isolado O1 (isto é, foi um falso positivo por ensaio de aglutinação).
[00357] Para analisar a similaridade estrutural dos antígenos O1 em detalhes, a marcação com 2AB de LLO e uma técnica HPLC de fase normal e alta resolução foram usadas da maneira descrita anteriormente. A figura 14A mostra uma sobreposição dos cromatogramas obtidos de 5 dos 11 isolados clínicos. A área da digital do OPS aparece em tempos de retenção de 110 a 150 minutos. Os perfis indicam que todas as amostras apresentam sinais que aparecem nos mesmos períodos de retenção, indicando estruturas de molécula idêntica. As diferenças observadas foram a distribuição de intensidade, isto é, o tempo de eluição do sinal máximo médio, e as intensidades de sinal geral. Os 6 extratos restantes resultaram em picos nos mesmos períodos de eluição, com diferenças nas intensidades. Apenas a amostra upec1096 foi diferente com relação ao padrão do pico, confirmando a diferença estrutural observada anteriormente.
[00358] A análise MS/MS de teores de pico individual pela análise de MALDI-TOF/TOF foi usada para identificar a sequência de monossacarídeos nas amostras O1 (ver figura 14B). A análise MS foi realizada a partir de amostras extraídas não de isolados clínicos, mas de uma cepa W3110 ΔwaaL contendo um cosmídeo com o aglomerado rfb de upec032. Os picos que eluiram em 50, 80, 96, e 108 minutos de tempo de eluição continham massas principais de m/z=1021,4, 1849,6, 2693,9, 3540,4. As séries de fragmentação iônica obtidas após MS/MS foram consistentes com 1, 2, 3, e 4 unidades repetidas de um HexNAc, três desoxiexoses, e um HexNAc ramificado. Estes dados podem ser explicados apenas pela estrutura do subsorotipo O1A. As séries de pico descrito representam o OPS O1 anexado ao UPP em isolados clínicos, e cada pico consecutivo difere do prévio por uma unidade repetida.
[00359] Estes dados confirmam as declarações da literatura de que a estrutura representativa para o sorotipo O O1 de E. coli nos isolados clínicos de UTI do estudo descrito no exemplo 1 é o subtipo O1A.
[00360] Para produzir um bioconjugado que carrega o polissacarídeo O1A, as cepas W3110 de E. coli foram geneticamente modificadas para expressar o OPS O1A. As cepas resultantes foram W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL, contendo o aglomerado rfb de um isolado clínico O1 positivo (GU299791*, aglomerado que varia de rmlB-wekO). As cepas hospedeiras que expressam OPS O1A foram construídas por recombinação homóloga. O aglomerado rfb de um isolado clínico O1A foi amplificado usando anelamento de oligonucleotídeos por PCR no DNA qie flanqueia o aglomerado rfb. O DNA amplificado foi então usado para substituir o aglomerado do antígeno O endógeno da cepa de laboratório W3110 bem caracterizada, pela recombinação homóloga descrita no pedido de patente internacional PCT/EP2013/071328. Os plasmídeos de expressão para as proteínas carreadoras pGVXN659 e for PglB (pGVXN114, 939, 970, 971) foram inseridos por transformação e a expressão de O1 foi confirmada (ver figura 15 e Fig. 16).
[00361] Em um experimento separado, o isolado clínico O1 upec032 foi geneticamente modificado para produzir bioconjugados. A modificação genética exigiu que o fenótipo de sensibilidade ao antibiótico do isolado clínico fosse considerada. upec032 ΔwaaL foi construída e transformada com pGVXN939 e pGVXN579 para produção de bioconjugado, usando MBP como proteína carreadora. A vantagem de usar MBP e EPA como proteínas carreadoras é a possibilidade de aumentar antissoros, com ambos resultando em antissoros que apresentam reatividade cruzada com o componente do polissacarídeo, mas não com o carreador. Tais antissoros são ferramentas isadas para avaliação de experimentos pré-clínicos, por exemplo, como agentes de revestimento para desenvolver ensaios de ELISA específicos para polissacarídeo.
[00362] O sorotipo O6 de E. coli é a ExPEC mais frequentemente relatada nos dias atuais (George, D. B., e Manges, A. R. (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690). Não apenas o estudo descrito no exemplo 1, mas também dados obtidos da literatura confirmam que o sorotipo O6 está entre os quatro principais sorotipos em muitas manifestações causadas por ExPEC (ver figura 4).
[00363] Duas estruturas do OPS O6 foram relatadas na literatura (ver Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225, e Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283). As estruturas relatadas dos antígenos O6 são mostradas na figura 17B. São idênticas, exceto pela ramificação do monossacarídeo de cada um, que é tanto Glc quanto GlcNAc. Entretanto, a literatura não identificou a estrutura predominante O6 em isolados clínicos envolvidos em UTI.
[00364] Para escolher a estrutura mais representativa do antígeno O6 com propósitos de vacina, as estruturas OPS de isolados clínicos de E. coli O6 positivo para aglutinação, do estudo do exemplo 1, foram investigadas usando a mesma abordagem da maneira descrita anteriormente para os sorotipos O1. A manchamento pela prata e Western blotting usando antissoro anti O6 identificou um de 12 isolados clínicos como não reativo ao antissoro O6, embora o LPS tenha se corado pela prata em todas as amostras (não mostrado), sugerindo um resultado de aglutinação falso positivo. Entretanto, é provável que diferenças em Glc ou GlcNAc não possam ser detectadas por deslocamento de mobilidade eletroforética em géis.
[00365] Para análise detalhada da estrutura, a impressão digital de LLO foi usada. Como uma referência para cada uma das duas estruturas relatadas, os extratos das cepas com ramificações de Glc (CCUG11309) e GlcNAc (CCUG11311) relatadas foram incluídos na análise. A comparação dos dois traços de HPLC mostrou séries de picos que eluem em 70,8, 103,3, e 122,2’ para amostras derivadas de CCUG11309, e séries de 68,8, 100,3, e 118,3 para amostras CCUG11311. Ver figura 18A. Os picos foram analisados por MS em relação às massas principais presentes nos picos, e MS/MS em relação à sequência de monossacarídeo destas massas principais. Os dados confirmados para o extrato CCUG11311 derivaram séries de pico m/z=1094,4, 2027,6, e 2962 (MSO154), que corresponde ao GlcNAc ramificado em 1, 2, e 3 polímeros de BRU, da maneira esperada. m/z=1053,4, 1945,7, e 2836,9 com ramificação de Glc foram identificados previamente nos extratos de uma cepa W3110 que expressa o aglomerado rfb clonado do isolado clínico CFT O6, com tempos de eluição de pico de impressão digital de 2AB idênticos à CCUG11309 (MSO138). Quando os cromatogramas obtidos dos 12 isolados clínicos foram comparados às cepas de referência, 11 sinais continham as séries de pico, indicativo do OPS O6 com um resíduo ramificado de Glc. Cinco destes 11 cromatogramas são mostrados na figura 18B. Uma amostra O que não gerou sinais em tempos de eluição específicos para O6 não foi considerada O6, isto é, muito provavelmente um falso positivo do teste de aglutinação. Assim, o OPS O6 com uma ramificação de Glc (Fig. 17B, superior) é a estrutura mais representativa entre os sorotipos O6s isolados da epidemiologia descrita no exemplo 1.
[00366] Para produzir um bioconjugado que carrega o polissacarídeo O6Glc, as cepas W3110 de E. coli foram geneticamente modificadas para expressar o OPS O6, substituindo o aglomerado rfb de W3110 pelo aglomerado rfb da cepa CCUG11309. Ver tabelas 7 e 13. As cepas resultantes foram W3110 ΔrfbO16::rfbCCUG11309 ΔwaaL, contendo o aglomerado rfb de uma cepa de E. coli positiva para O6, com ramificação de Glc relatada na BRU (ver anteriormente). As cepas hospedeiras que expressam OPS O6Glc foram construídas por recombinação homóloga. O aglomerado rfb foi amplificado usando anelamento de oligonucleotídeos por PCR no DNA que flanqueia o aglomerado rfb. O DNA amplificado foi então usado para substituir o aglomerado de antígeno O endógeno, a partir da cepa de laboratório W3110 bem caracterizada, pela recombinação homóloga descrita no pedido de patente internacional PCT/EP2013/071328. Os plasmídeos de expressão para as proteínas carreadoras e para PglB inseridos por transformação e expressão do OPS esperado em EPA foram confirmados por Western blotting.
[00367] A estrutura de unidade repetida do polissacarídeo O2 é conhecida desde 1987 (Jansson, et al., (1987) Carbohydrate research 161, 273-279). Esta é mostrada na figura 19B. Duas sequências do aglomerado de genes de antígeno O O2 são disponíveis a partir de base de dados pública (GenBank EU549863 e GU299792). A análise comparativa foi realizada e as atividades de glicosiltransferase foram sugeridas (Tabela 5; Fratamico et al., 2010, Canadian Journal of microbiology 56, 308-316; e Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77). Tabela 5. Previsões de gene do aglomerado do antígeno O O2, a partir do aglomerado rfb, da maneira publicada por Li, et al. e Fratamico, et al. são indicadas em colchetes.
[00368] A comparação de homologias de estrutura e gene indicou que todas as funções para a biossíntese do polímero estão presentes: rmlBDAC codificam as enzimas exigidas para a biossíntese de dTDP-L-Ramnose, que é o substrato para a adição de L-Rha na parte principal por glicosiltransferases wekPOR; fdtABC fornece dTDP-D-Fuc3NAc para a ramificação de glicosiltransferases; wzy e wzx são homólogos responsáveis por flipping do unidade repetida ligada a Und-PP do citoplasma ao periplasma; e wekPOR, são glicosiltransferases previstas, e são previstas para formar ligações glicosídicas da BRU O2 (três L-Rha e um L-FucNAc).
[00369] O gene wekS encontrado nas sequências publicadas do aglomerado rfb de O2 é uma sulfatase ligada à membrana prevista e, assim, muito provavelmente não está envolvido na formação de BRU. Isto pode significar que, se assume-se uma enzima como uma regra de ligação,- uma enzima entre o grupo de wekPOR tem que ser bifuncional para fornecer as quatro ligações glicosídicas.
[00370] Esta uma enzima - uma regra de ligação não é absoluta, como mostrado em múltiplos exemplos nos quais menos glicosiltransferases do que ligações são conhecidas, por exemplo, em Shigella flexneri Y, S. flexneri 6, C. jejuni, e E. coli O1A. Nestes exemplos, as glicosiltransferases multifuncionais são responsáveis pela formação de mais de uma ligação glicosídica, são ‘bi-‘ ou ‘multi-funcionais’. Constantemente, é o mesmo monossacarídeo que é adicionado múltiplas vezes. Resíduos repetidos de ramnose- da maneira encontrada no sorotipo O2 - são frequentemente associados a tais enzimas multi-funcionais.
[00371] Em virtude da presença de elementos truncados de transposon elements que flanqueiam a sequência wekS, especula-se que o locus wekS foi inserido no aglomerado rfb por um evento de recombinação de DNA (ver Fratamico et al., 2010, Canadian Journal of Microbiology 56, 308-316). Uma inserção mediada por transposon do locus wekS pode sugerir que a biossíntese de OPS O2 não ocorre sem a presença prévia de e, dessa maneira, wekS pode não ser exigido para a síntese do polímero OPS O2. Para confirmar esta hipótese, a formação de OPS O2 foi reconstituída em um sistema de expressão recombinante, um ambiente genômico “limpo”, contendo um aglomerado O2 rfb sem o gene wekS. Para atingir isto, o aglomerado de antígeno O da cepa W3110 foi substituído pelo aglomerado rfb da cepa upec116 O2 positiva que não apresenta o DNA wekS. A substituição cromossômica foi realizada por recombinação homóloga, da maneira descrita no pedido de patente internacional PCT/EP2013/071328. A cepa resultante foi W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. OPS foi preparado e analisado por marcação com 2AB e HPLC de fase normal, e a detecção por fluorescência foi realizada da mesma maneira para O1A e OPS O6 (ver anterior) e analisada por HPLC de fase normal (Fig. 21), e comparada aos sinais da cepa tipo selvagem CCUG25. A análise resultou em uma série de picos sobrepostos entre 40 e 140 minutos de tempo de eluição.
[00372] A análise MS da série de pico dependente do aglomerado rfbO2 mostrou as principais massas com as mesmas diferenças entre os picos consecutivos (isto é, de uma única RU O2).
[00373] A análise de MS das moléculas coletadas nos respectivos picos foi realizada para analisar a estrutura de OPS. Os picos obtidos em 43,5, 73,1, 81,4 e 90’, obtidos da cepa CCUG25 tipo selvagem, foram coletados e analisados por MS e MS/MS. As massas e série de íon do fragmento Y compatíveis com 1, 2 e 3 moléculas OPS O2 de unidade repetida esperada foram encontradas (m/z=989,4 (Fig. 23), 1817,8, 2646,1, todos adutos de Na+).
[00374] Para confirmar OPS O2 de isolados clínicos, 12 clones foram analisados em relação à sua estrutura de OPS, da maneira descrita anteriormente para o sorotipo O1. Primeiro, o LPS foi preparado para ser analisado por manchamento pela prata e Western blotting. Os resultados são descritos na figura 20. Todas as amostras mostraram um padrão de bandas do tipo escada com dois tamanhos médios aparentemente diferentes de escada. O antissoro anti-O2 foi detectado em todas as amostras de LPS, indicando que a aglutinação identificou corretamente todos os isolados como sorotipos O2.
[00375] Para produzir um bioconjugado que carrega o polissacarídeo O2, W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS foi usado. Os plasmídeos de expressão para as proteínas carreadoras e para PglB foram inseridos por transformação e a expressão do OPS esperado em EPA foi confirmada por Western blotting. Ver tabelas 7 e 13 anteriores.
[00376] Para avaliar o potencial imunológico de bioconjugados contendo os polissacarídeos antigênicos selecionados, um estudo pré-clínico foi realizado. Os bioconjugados O1A-EPA, O2-EPA, O6Glc-EPA e O25B- EPA foram produzidos, purificados e caracterizados da maneira descrita anteriormente, e na seção de métodos. Tabela 6. Revisão do estudo pré-clínico em rato, incluindo números do grupo de vacina, tamanhos do grupo, vacinas usadas, e indicação da qualidade da preparação de vacina.
[00377] Os bioconjugados purificados foram usados para imunizar ratos Sprague Dawley fêmeas de 9 semanas. 100 μL de soluções da mesma dose foram injetados intramuscularmente (i.m.) nos dias 1, 22, e 43 nos ratos que foram sangrados terminalmente e sacrificados no dia 56.
[00378] Diferentes grupos de ratos receberam diferentes vacinas: sempre não formuladas, compreendendo os bioconjugados sozinhos ou em combinação, da maneira indicada na tabela 6. As placas de ELISA revestidas com o LPS cognato produzido em uma cepa positiva para waaL foram usadas para avaliar a imunogenicidade na forma de titulação por ELISA dos soros de rato no período de sangria terminal de 56 dias após a primeira injeção (Figs. 25-28). Obtida junta, a imunogenicidade estatística significativa foi observada para todos os grupos de vacinação medidos contra controles (EPA não glicosilado ou tampão TBS). Assim, os bioconjugados selecionados e produzidos representam compostos candidatos à vacina usados.
[00379] Para todos os consjugados antígeno O-EPA testados, a imunogenicidade estatisticamente significativa foi observada para todos os grupos de vacinação medidos contra controles (EPA não glicosilado ou tampão TBS). Assim, os bioconjugados selecionados e produzidos representam compostos candidatos à vacina usados para a indução de anticorpos específicos para antígeno O.
[00380] Os quatro bioconjugados descritos nos exemplos anteriores (antígeno O de O25B, O1A, O2 e O6, conjugados respectivamente em EPA como uma proteína carreadora) foram preparados como lotes monovalentes (ingredientes farmacêuticos ativos, APIs) ou combinados em uma preparação única como uma vacina multivalente contra ExPEC. Vários lotes foram produzidos: lotes pré-clínicos, lotes de estudo de toxicidade, e lotes clínicos. A tabela 7 indica cepas hospedeiras usadas para a produção de conjugados. Tabela 7: Cepas hospedeiras para a produção de estudo pré-clínico, toxicologia e lotes clínicos
[00381] Os quatro lotes monovalentes de pre-GMP e um padrão de referência EPA não glicosilado foram assim analisados por cromatografia por exclusão de tamanho com espalhamento de luz multi-ângulo (SEC-MALS), a fim de quantificar o grau de mono e di-glicosilação dos bioconjugados individuais, e para determinar a massa molecular (MW) da proteína carreadora e do O-PS anexado à esta. As amostras foram separadas em uma coluna TSKgel-G3000 SWxl em tampão fosfato (pH 7,0; NaCl 50 mM, fosfato de sódio 150 mM) e monitoradas por UV (214 e 280 nm), índice refratário (RI) e espalhamento de luz multi ângulo (MALS).
[00382] Em relação à proteína carreadora EPA não glicosilada, uma MW de 63-67 kDa foi determinada (MW teórica de 70,5 kDa, com base na sequência de aminoácidos). Nos bioconjugados, apenas EPA foi detectada em 280 nm, permitindo que sua MW seja extraída da MW total medida por RI e MALS: nos bioconjugados, a MW medida da fração EPA foi 65-71 kDa.
[00383] A análise dos padrões do produto API pré-GMP é exibida na tabela 8, indicando a presença de conjugados mono e di-glicosilados, com uma MW na faixa de 75-79 kDa e 87-91 kDa, respectivamente. As partes OPS destacaram uma MW de 16-24 kDa para as espécies di-glicosiladas, e 8-14 kDa para as espécies mono-glicosiladas, respectivamente. Considerando a MW de RU de cada sorotipo, um número de 10-16 RU por cadeia de polissacarídeo foi determinado, em boa concordância com dados de hidrazinólise e MS. Tabela 8: Análise SEC-MALS dos padrões de produto API pré-GMP monovalente
[00384] A análise de dicroísmo circular (CD) de um lote de bioconjugado O25B, formulado em salina tamponada com Tris (TBS), mostrou que formulações em pH 6,8 a 7,4 apresentaram espectros similares àqueles da proteína carreadora EPA não glicosilada, com uma mistura de estruturas em alfa hélice e folha beta, da maneira experada com base na estrutura cristalina publicada de EPA. Portanto, com base nestas análises de CD, a glicosilação com cadeias de O25B O-PS parecem não afetar a estrutura secundária da proteína carreadora EPA.
[00385] A análise de calorimetria por espalhamento diferencial (DSC) de uma formulação de lote de bioconjugado O25B em TBS, em pH 6,8 a 7,4, e em salina tamponada com fosfato (PBS) em pH 7,1 a 7,8, mostrou curvas de fusão comparáveis àquela de EPA não glicosilada, com um ponto de fusão de aproximadamente 52 °C. Este resultado indicou que a característica biofísica da proteína carreadora EPA não foi alterada mediante modificação com cadeias de O25B O-PS.
[00386] Antes da produção em larga escala, a consistência do processo de fabricação foi avaliada em uma escala menor. Os lotes de consistência foram avaliados em estudos extensivos de estabilidade que incluiram condições de armazenamento de estresse e aceleradas para identificar as vias de degradação. A estabilidade dos quatro componentes de vacina monovalente (APIs) foi testada em um período de 3 meses.
[00387] Análise de dados de estabilidade de APIs pré-clínicos indicou a estabilidade em pelo menos 3 meses quando armazenados a -75 ±15 °C (condições de armazenamento normal). Nenhum carcaterística estatisticamente significativa foi observada na condição de armazenamento pretendida por análise de regressão linear estatística. Igualmente na condição de armazenamento acelerada (+5 ±3 °C) e de estresse (+25 ±5 °C), o produto foi estável por pelo menos 3 meses, da maneira evidenciada pela pouca variabilidade dos parâmetros que indicam estabilidade. Os dados para o API pré-clínico de O1A são mostrados na tabela 9. Os outros três sorotipos (O2, O6, O25B) demonstraram dados de estabilidade similares. Tabela 9: Dados de estabilidade de lote API pré-clínico de O1A
[00388] A estabilidade da composição de vacina tetravalente (bioconjugados O25B, O1A, O2 e O6) foi testada durante um período de 3 meses. Os estudos incluíram condições de armazenamento aceleradas e de estresse para identificar vias de degradação. Os dados resultantes são considerados relevantes para a justificativa inicial da vida de prateleira de GMP IMP (produto médico investigado, a composição de vacina tetravalente ExPEC).
[00389] A análise dos dados de estabilidade do lote pré-clínico de vacina tetravalente ExPEC indicou estabilidade em pelo menos 3 meses, quando armazenada a +5 ±3 °C (condições de armazenamento normal), da maneira mostrada na tabela 10. Nenhuma característica estatisticamente significativa foi observada na condição de armazenamento pretendido por análise de regressão linear estatística. Igualmente na condição de armazenamento acelerado (+25 ±5 °C) o produto ficou estável, da maneira evidenciada pela pouca variabilidade dos parâmetros que indicam estabilidade. Tabela 10: Dados de estabilidade de lote pré-clínico de vacina tetravalente
[00390] Juntos, estes estudos demonstram que APIs e a composição de vacina tetravalente ExPEC eram estáveis por pelo menos três meses e, assim, são composições adequadas de vacina com relação à estabilidade.
[00391] A tolerância à toxicidade e local de uma preparação de vacina tetravalente (bioconjugados O25B, O1A, O2 e O6) após duas administrações intramusculares (quadríceps femoral foi usado para tratamento) em ratos Sprague Dawley nos dias 1 e 14 foi avaliada. A ocorrência de reversibilidade, persistência, ou demora de qualquer alteração foi avaliada após um período de recuperação de 14 dias no dia 28. A necropsia dos animais nos grupos principais (10 machos e 10 fêmeas para ambos os grupos vacinado e controle) ocorreu no dia 17, e para os grupos de recuperação (5 machos e 5 fêmeas para ambos os grupos vacinado e controle) no dia 28 (após um período de recuperação de 14 dias). Isto não estava associado com nenhum efeito relacionado como adverso, que pode ser atribuído ao tratamento. A dose administrada, isto é, uma dose completa humana equivalente de 4 μg por antígeno O (16 μg de antígeno O total para a vacina tetravalente), da maneira administrada nos dias 1 e 14, foi considerada como nível de efeito adverso não observado (NOAEL) para a vacina tetravalente ExPEC nas condições deste estudo. Além disso, a imunogenicidade da vacina tetravalente ExPEC foi confirmada tanto no dia 17 quanto no dia 28, após a avaliação das amostras de soro. As titulações mais elevadas de anticorpos anti-O1A, anti- O2, anti-O6 e anti-O25B IgG foram induzidas no grupo vacinado, comparado aos controles que receberam apenas tampão de formulação (25 mM Tris, 130 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7,4).
[00392] Estes dados confirmam que a vacina tetravalente ExPEC apresenta um perfil de toxicidade adequado para a administração como uma vacina, e induz anticorpos em pelo menos todos os quatro sorotipos dos antígenos O de E. coli presentes na vacina (isto é, O25B, O1A, O2 e O6).
[00393] Para determinar a distribuição de sorotipo O entre E. coli extraintestinal que causa bacteremia nos idosos, um estudo epidemiológico foi conduzido em um painel de isolados sanguíneos de E. coli, coletados de pacientes com idade superior a 60 anos. No total, 860 isolados do sangue do período de 2011-2013 foram coletados de sujeitos nos Estadus Unicos, Reino Unido, Alemanha, Espanha e Holanda, e analisados por O-aglutinação clássica. Da maneira mostrada na tabela 11, a O-distribuição de sorotipo de isolados de bacteremia se assemelhou à O-distribuição de sorotipo encontrada em pacientes que sofrem de infecção do trato urinário (UTI, ver tabela 1A). Sorotipo O25 foi mais prevalente na população de bacteremia estudada; a subtipagem de cinquenta e sete isolados por PCR mostrou que cinquenta e seis (98 %) dos sorotipos O25 eram tipáveis como O25B. Em ambas as populações alvo (UTI e bacteremia), sorotipos O1, O2, O6, e O25 foram identificados como os quatro sorotipos mais prevalentes. No geral, estes dados confirmam que a distribuição de sorotipo tanto entre isolados de infecção do trato urinário quanto de bacteremia é muito similar e independente de local geográfico, tempo de isolamento e indicação. Tabela 11: Distribuição dos sorotipos O de E. coli associados à bacteremia mais comuns, de uma coleção de 860 isolados do sangue coletados nos Estados Unidos e Reino Unido, no período de 2011-2013. É indicada a distribuição O relativa de sorotipo das amostras.
[00394] A funcionalidade dos anticorpos que surgem após a vacinação com formulações de vacina monovalente e tetravalente descritas anteriormente foi investigada com um ensaio de morte opsonofagocítico in vitro (OPK). Este tipo de ensaio foi aceito como um correlato de proteção para a vacina de conjugado contra Streptococcus pneumoniae (Prevenar®). O ensaio OPK avalia a capacidade do soro em facilitar a opsonofagocitose e morte de diferentes sorotipos de E. coli. Em placas de 96 poços, as diluições definidas dos soros de amostra foram incubadas, em cada poço, com: bactérias de um dos quatro sorotipos de E. coli específicos da vacina, uma quantidade definida de células HL60, e complemento de coelho bem novo. Após incubação, uma proporção da mistura foi semeada em ágar tríptico de soja (TSA), e o número de colônias de bactérias foi contado. A capacidade dos anticorpos se ligarem às células bacterianas e deposição ativa do complemente, e mediarem absorção e morte das bactérias por células HL60 foi expressa como titulação opsônica. A titulação opsônica ou índice de opsonização (OI) corresponde à diluição dos soros que matam 50 % das células bacterianas. Os índices opsônicos para soros pré e pós-imune são fornecidos. Um > que aumento de 4 vezes de OI de pré - a pós-imune é considerado significativo. Ensaios OPK para os três sorotipos O2, O6Glc e O25B foram estabelecidos.
[00395] Para avaliar a atividade funcional de respostas de anticorpo induzidas por vacina de bioconjugados O25B, O1A, O2 e O6Glc, os soros de ratos vacinados foram analisados usando ensaios de morte opsonofagocítica (OPK), que avaliam in vitro a fagocitose dependente do complemento e anticorpo e morte de bactérias, por exemplo, E. coli. E. coli foi pré- opsonizada com diluições de soro de ratos vacinados, incubadas com complemente e fagócitos (células HL60 diferenciadas), e as unidades formadoras de colônia (CFUs) foram determinadas. Subsequentemente, os índices de opsonização de % de morte máximo (OI: morte com diluição de doro de 50 % de E. coli) foram calculados. As E. coli selecionadas para teste OPK foram OC 24453 (sorotipo O2), OC 24781 (sorotipo O6Glc) e OC 24176 (sorotipo O25B). Da maneira mostrada na figura 29, uma resposta imune funcional intensa à O2-EPA (FIG. 29A), O6Glc-EPA (FIG. 29B) e O25B-EPA (FIG. 29C) foi observada.
[00396] Os dados demonstram que os componentes da vacina aqui descritos induzem responses de anticorpo contra sorotipos de E. coli, nos quais antígenos O são incluídos na vacina, e que tais respostas ao anticorpo são funcionais na morte de E. coli destes sorotipos.
[00397] A tabela 12 mostra as titulações totais total OI para os antígenos O O2, O6Glc e O25B de animais imunizados com a vacina tetravalente, tanto com 0,4 quanto 4 μg por antígeno O. As titulações foram determinadas em dois experimentos separados. A dose de 0,4 μg induziu OIs significativos em todos os animais para os sorotipos O2 e O6Glc. Para O25B, 3/8 do animais mostraram um aumento significativo em OI após a imunização com a dose de 0,4 μg. Comparada à dose de 0,4 μg, a dose de 4 μg induziu menos aumentos de OI para O2 em todos os animais. 3/8 animais mostraram aumentos de OI quando os soros do grupo de dose de 4 μg foram testados em E. coli O25B. Os dados confirmam que uma vacina tetravalente é capaz de elicitar anticorpos opsônicos específicos de antígeno O contra O2, O6Glc e O25B.
[00398] Os dados demonstram que os componentes da vacina aqui descritos induzem respostas ao anticorpo contra sorotipos de E. coli, nas quais antígenos O são incluídos na vacina, e que tais respostas ao anticorpo são funcionais em matar E. coli destes sorotipos. Tabela 12: OIs contra E. coli O2, O6 e O25. OIs para pré-vacinação individual e soros após 3 vacinações de dois experimentos separados são mostrados para todos os animais.
[00399] O % de morte e índices de opsonização máximos (OI: morte por diluição de soro de 50 % de E. coli) foram calculados. E. coli selecionadas para teste OPK foram OC 24453 (sorotipo O2), OC 24781 (sorotipo O6Glc) e OC 24176 (sorotipo O25B). Resposta imune funcional significativa para O2-EPA, O6Glc-EPA e O25B-EPA foi observada.
[00400] Uma vacina de bioconjugado de E. coli é usada em um estudo clínico de fase I. A vacina compreende quatro bioconjugados em uma solução de tampão em salina. Os quatro bioconjugados são: (i) E. coli O1A conjugada à proteína carreadora EPA, (ii) E. coli O2 conjugada à proteína carreadora EPA, (iii) E. coli O6Glc conjugada à proteína carreadora EPA, e (iv) E. coli O25B conjugada à proteína carreadora EPA.
[00401] A população de estudo inclui 194 mulheres saudáveis, idade > 18 a 70 anos, com uma história de infecção recorrente do trato urinário (RUTI), definida como > 3 episódios independentes nos 12 meses prévios ou > 2 episódios nos últimos 6 meses. Pelo menos um dos episódios de infecção do trato urinário (UTI) foi causado por E. coli (como patógeno simples ou parte de infecção polimicrobiana) e a causa foi confirmada por cultura e documentada. Com propósitos do estudo, UTI é definida pela presença de pelo menos um sintoma específico de UTI (disúria, urgência, frequência, dor no flanco, desconforto na bexiga, dor suprapúbica, febre, náusea, vômito) junto com uma contagem bacteriana (CFU) de >103 CFU/mL de uropatógeno em urina de jato médio.
[00402] O estudo inclui duas ramificações: (i) vacina candidata e (ii) placebo. O estudo é um estudo escalonado, randomizado, simples cego, multicentro controlado por placebo, em mulheres saudáveis com história de RUTI.
[00403] O período estimado para o estudo é 4 meses, com um período de duração para continuação de nove meses para cada sujeito.
[00404] O objetivo do estudo é avaliar a segurança, imunogenicidade e eficiência da vacina bioconjugada de E. coli.
[00405] Os sujeitos são acompanhados por 9 meses após a injeção, e apenas os sujeitos injetados são acompanhados em todo o período de estudo. Os sujeitos participam de um total de 5 visitas programadas: triagem (primeira visita), dia 1 (segunda visita), dia 7, dia 30, e dia 270. Os sujeitos receberam 4 contatos por telefone, no dia 2, dia 90, dia 150, e dia 210.
[00406] Qualquer das visitas sem marcação em virtude da ocorrência de UTI incluem padrão de cuidado com opções de tratamento harmonizado. Urina e sangue (se possível) são coletados para propósitos de diagnóstico e sorotipagem. Os eventos adversos não solicitados (AE) e eventos adversos graves (SAEs) são registrados junto com a duração do estudo, ao passo que AE solicitados são registrados por 7 dias após a injeção.
[00407] Em cada visita um novo cartão diário é fornecido ao sujeito e um anterior é discutido.
[00408] Na primeira visita, os sujeitos elegíveis que forneceram consentimento informado são selecionados e o cumprimento dos critérios inclusão/exclusão são confirmados. O sangue é retirado e a urina é coletada.
[00409] Na visita 2 (dia 1), cada sujeito receberá uma injeção intramuscular de 0,5 mL de solução (vacina candidata ou placebo) no músculo deltoide. A dose reduzida da vacina candidata conterá 1 μg de cada polissacarídeo (total de 4 μg de polissacarídeo). A dose alvo da vacina candidata conterá 4 μg de cada polissacarídeo (total de 16 μg de polissacarídeo).
[00410] O objetivo primário é avaliar a ocorrência, intensidade, relação, e duração de eventos adversos solicitados e não solicitados (AE) e eventos adversos graves (SAE) pós-injeção de vacina candidata, comparado ao grupo placebo em todo o período de estudo.
[00411] Os objetivos secundários são (i) comparar a mudança nos objetivos hematológico e bioquímico antes da injeção (na triagem inicial e dia 1) e pós-injeção (no dia 7 e dia 30) da vacina candidata, comparado ao grupo placebo; (ii) avaliar a resposta imune de vacina candidata entre linha de base (dia 1) e pós-injeção (dia 30 e dia 270); (iii) comparar o número de episódios de infecção sintomática de trato urinário (UTI) causados por sorotipos de vacina de E. coli entre as duas ramificações, injetada com vacina candidata ou placebo durante todo o período de estudo como objetivo de eficiência mais relevante; (iv) avaliar a taxa de ocorrência de sorotipo de vacina específica de UTI por E. coli no grupo de vacina, comparado ao grupo placebo junto com a duração do estudo; e (v) avaliar a intensidade e duração de sintomas clínicos de sorotipo de vacina específico de UTI por E. coli no grupo de vacina, comparado ao grupo placebo junto com a duração do estudo.
[00412] Os objetivos exploratórios são (i) comparar a taxa de ocorrência de UTI causada por qualquer sorotipo de E.coli no grupo de vacina, comparado ao grupo placebo em todo o período de estudo; e (ii) comparar a taxa de ocorrência de UTI causada por qualquer dos patógenos no grupo de vacina, comparado ao grupo placebo em todo o período de estudo.
[00413] Os critérios de inclusão para o estudo são da maneira a seguir: (i) mulheres com uma história de UTI recorrente, que é definida como: > 3 episódios independentes de UTI nos 12 meses anteriores ou > 2 episódios de UTI nos últimos 6 meses; pelo menos uma UTI durante os últimos 5 anos foi causada por E. coli (como único patógeno ou parte de infecção polimicrobiana) e foi confirmada por cultura e documentada; (ii) idade > 18 e < 70 anos; (iii) sujeitos em um estado saudável sem UTI contínua ou sintomática suspeita na visita de triagem e no dia de injeção (visita 2); (iv) boa saúde em geral, sem história médica clinicamente significativa, achados de exame físico ou anormalidades de laboratório clínico por julgamento clínico do investigador; e (v) disposição para participar do estudo após todos os aspectos do protocolo serem explicados e completamente entendidos, e um consentimento informado por escrito ser obtido.
[00414] Os critérios de exclusão para o estudo são da maneira a seguir: (i) história de mais de 10 UTIs recorrentes no ano anterior da visita de triagem; (ii) uso de qualquer cateter urinário de curto tempo 7 dias antes da triagem; (iii) uso de qualquer cateter permanente 30 dias antes da triagem; (iv) história de qualquer doença/anormalidade do trato urinário não resolvida; (v) evidência de função imune comprometida; (vi) doenças e/ou insuficiência cardiovascular, hepática, renal significativa; (vii) diabetes mellitus não controlada; (viii) anormalidades significativas nos resultados de triagem para hematologia, química sérica ou urinálise; (ix) teste positivo para HIV, e/ou evidência de HBV ou HCV; (x) BMI >34; (xi) terapia estimulatória imune prévia para prevenção de UTI (tal como Urovaxom®, Strovac® ou Urovac®) nos últimos 3 meses, ou uso planejado durante o período de estudo; (xii) uso atual de qualquer medicação conhecida por afetar a função imune (por exemplo, corticosteroides >0,5 mg/kg de BW/dia); (xiii) uso de tratamento com estrogênio vaginal relacionado à UTI recentemente iniciado em menos de 6 meses antes da infeção e que continua durante o estudo, ou início planejado durante o período ativo do estudo; (xiv) uso de qualquer terapia de antibiótico em injeção precendente 1 semana; (xv) uso planejado de antibióticos pós-coito para prevenção de UTI durante o período de estudo; (xvi) qualquer vacinação planejada 30 dias antes e 30 dias após a injeção; (xvii) participação em outros testes clínicos nos 60 dias anteriores de inscrição e duração do estudo; (xviii) tratamento prévio com imunoglobulinas ou produtos sanguíneos nos 3 meses precedentes à injeção; (xix) hipersensibilidade conhecida a qualquer componente da vacina; (xx) presença de uma condição médica ou psiquiátrica significativa que, na opinião do investigador, impossibilita a participação no estudo; (xxi) doença aguda no período de injeção; (xxii) mulheres que podem potencialmente engravidar, tanto com um teste positivo de gravidez quanto se recusam a usar um contraceptivo eficiente; (xxiii) mulheres que são lactantes em qualquer período durante o tempo de estudo; (xxiv) sujeitos com uma intervenção cirúrgica eletiva, planejada durante o período de estudo; e (xxv) qualquer outro achado significativo que, na opinião do investigador, pode aumentar o risco de um resultado adverso por participar do estudo.
[00415] As estatísticas descritivas (n, média, desvio padrão, mediana e faixas para variáveis contínuas, frequências e percentuais para variáveis categóricas) são fornecidas por grupo de tratamento e/ou visita, onde aplicável. Todos os dados são listados por sujeito, grupo de tratamento e, onde aplicável, visita. Todos os sujeitos do grupo B que receberam placebo são combinados para formar o grupo de tratamento com placebo.
[00416] Este exemplo apresenta certos resultados da análise de Interim do estudo clínico de fase I descrito no exemplo 12.
[00417] A ocorrência de eventos adversos e eventos adversos graves foi comparável entre os grupos placebo e vacinados. Dez eventos adversos graves foram relatados, e nenhum foi relatado ao medicamento do estudo.
[00418] Para avaliar a imunogenicidade dos componentes de vacina, os soros de mulheres que participam do estudo clínico foram obtidos e analisados por ELISA para quantificar IgG contra os quatro diferentes antígenos O incluídos na vacina tetravalente (E. coli O1, E. coli O2, E. coli O6, e. coli O25B).
[00419] Os soros de mulheres vacinadas foram incubados em placas revestidas com O1A, O2, O6Glc e O25B-LPS e EPA. Subsequentemente, as placas foram incubadas com anticorpo secundário marcado com HRP (IgG anti-humano). Os anticorpos ligados foram detectados com substrato TMB e a absorbância foi medida. Os valores EC50 foram calculados por ajuste 4PL.
[00420] Da maneira mostrada na figura 30, uma resposta imune significativa à O1A-EPA, O2-EPA, O6Glc-EPA e O25B-EPA ocorreu na maioria das mulheres vacinadas.
[00421] Estes dados demonstram imunogenicidade de cada componente da vacina tetravalente.
[00422] Os ensaios OPK, que medem a fagocitose dependente de complemento e anticorpo in vitro e morte de bactérias E. coli, foram usados para avaliar a resposta ao anticorpo funcional de mulheres que participam do estudo clínico.
[00423] Os soros foram coletados dos participantes do estudo. E. coli foram pré-opsonizadas com diluições de soro das mulheres vacinadas, incubadas com complemente e fagócitos (células HL60 diferenciadas), e as unidades formadoras de colônias restantes (CFUs) foram determinadas. Subsequentemente, a morte percentual máxima e os índices de opsonização (OI: morte por diluição sérica de 50 % de E. coli) foram calculados. E. coli selecionadas para teste OPK foram OC 24452 (sorotipo O1A), OC 24453 (sorotipo O2), OC 24454 (sorotipo O6Glc), e OC 24176 (sorotipo O25B).
[00424] Da maneira mostrada na figura 31, uma resposta imune funcional significativa para O1A-EPA (Fig. 31A), O2-EPA (Fig. 31B), O6Glc-EPA (Fig. 31C), e O25B-EPA (Fig. 31D) foi observada.
[00425] Estes dados demonstram que cada componente da vacina tetravalente induz uma resposta de anticorpo específica para sorotipo, e que tais resposta ao anticorpo são funcionais em matar E. coli destes sorotipos. Assim, as composições de vacina aqui descritas são funcionais em humanos.
[00426] Para determinar o nível de reatividade cruzada de anticorpos IgG séricos induzidos por vacina para os dois sorotipos conhecidos de E. coli O25, O25A e O25B, diluições de soro derivado de sujeitos vacinados foram incubados com LPS O25A, LPS O25B purificado, ou células bacterianas intactas e testados por ELISA.
[00427] Da maneira mostrada na figura 32, valores similares de EC50 foram observados quando a reatividade para LPS O25A (barras pretas) e LPS O25B (barras cinza) trinta dias após a vacinação foi testada. No geral, os dados sugerem aque o bioconjugado O25B funcionam melhor para O25B e para O25A, mas em muitos casos/ sujeitos testados O25B funciona significativamente melhor em termos de resposta ao anticorpo para O25B, comparado a O25A. Este resultado demonstra que, com a ocorrência de alguma variação natural, a vacina tetravalente induz anticorpos que reconhecem tanto LPS O25A quanto O25B. Para testar se o mesmo foi verdadeiro para as células bacterianas completas e múltiplas cepas O25A/O25B, a reatividade em um conjunto de isolados clínicos O25A ou O25B derivados tanto do sangue quanto da urina também foram testados. Neste caso, uma cepa sorotipo O75, um sorotipo não representado na vacina tetravalente, foi usada como um controle negativo (linha pontilhada cinza na figura 33). Da maneira demonstrada na figura 33, os anticorpos IgG séricos induzidos por vacina mostraram uma resposta forte para cada uma das cepas O25 individuais. Embora a variação cepa-a-cepa ser aparente, a reatividade para as cepas O25A (linhas pretas) e cepas O25B (linhas cinza) foi observada. Estes dados demonstram que o componente de vacina O25B da vacina tetravalente elicita anticorpos que reconhecem tanto LPS O25A quanto O25B purificado e cepas de E. coli O25A e O25B.
[00428] As tabelas 13 e 14, a seguir, fornecem detalhes de certas cepas e plasmídeos, respectivamente, usados nos exemplos precedentes.
[00429] As modalidades aqui descritas são pretendidas meramente para serem exemplares, e os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais que experimentação de rotina, vários equivalentes aos procedimentos específicos aqui descritos. Todos os tais equivalentes são considerados no escopo da presente invenção e são contempladas pelas reivindicações a seguir.
[00430] Todas as referências (incluindo pedidos de patente, patentes e publicações) aqui citadas são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra e com todos os propósitos na mesma extensão, como se cada publicação, ou patente, ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado pela referência na sua íntegra e com todos os propósitos. 7. MODALIDADES Modalidades 1: 1. Uma célula hospedeira procariótica compreendendo: a. rfb(upec138) aglomerado de genes (SEQ ID NO:12), rfb(upec163) aglomerado de genes, ou rfb(upec177) aglomerado de genes; b. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma oligossacaril transferase; e c. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14). 2. Uma célula hospedeira procariótica compreendendo: a. rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, e wbbL; b. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma oligossacaril transferase; c. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14). 3. Uma célula hospedeira procariótica compreendendo: a. uma sequência de nucleotídeos que codifica: i. dTDP-Glicose 4,6-desidratase; ii. dTDP-6-Desoxi-D-glicose 3,5-epimerase; iii. Glicose-1-fosfato timidililtransferase; iv. dTDP-4-desidroramnose 3,5-epimerase; v. antígeno O flipase; vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase; vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6- glicosiltransferase; viii. antígeno O polimerase; ix. O-acetil transferase; x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- glicosiltransferase e xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase; b. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma oligossacaril transferase; c. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína carreadora compreendendo uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14). 4. A célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 3, em que: a. a dTDP-Glicose 4,6-desidratase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a um dTDP-Glicose 4,6-desidratase codificado por SEQ ID NO:1; b. a dTDP-6-Desoxi-D-glicose 3,5-epimerase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma dTDP-6-Desoxi-D-glicose 3,5- epimerase codificada por SEQ ID NO:2; c. a Glicose-1-fosfato timidililtransferase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma Glicose-1-fosfato timidililtransferase codificado por SEQ ID NO:3; d. a dTDP-4-desidroramnose 3,5-epimerase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma dTDP-4-desidroramnose 3,5- epimerase codificada por SEQ ID NO:4; e. a flipase de antígeno O compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma flipase de antígeno O codificada por SEQ ID NO:5; f. a ramnosil transferase de (xi) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a um ramnosil transferase codificada por SEQ ID NO: 6; g. a glicosiltransferase de (xii) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma glicosiltransferase codificada por SEQ ID NO:7; h. a polimerase de antígeno O compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a um polimerase de antígeno O codificada por SEQ ID NO:8; i. a O-acetil transferase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma O-acetil transferase codificada por SEQ ID NO: 9; j. a glicosiltransferase de (x) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma glicosiltransferase codificada por SEQ ID NO:10: e k. a ramnosiltransferase de (xi) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica a uma ramnosiltransferase codificada por SEQ ID NO:11. 5. A célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a célula hospedeira é Escherichia coli. 6. A célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 5, em que pelo menos um dos gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS, e aglomerado rfb é eliminado ou funcionalmente inativado do genoma da célula hospedeira. 7. A célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em exotoxina A desintoxicada de P. aeruginosa (EPA), CRM197, proteína de ligação de maltose (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetânico, hemolisina A desintoxicada de S. aureus, fator de aglutinação A, fator de aglutinação B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina lábil ao calor de E. coli, variantes desintoxicados de enterotoxina lábil ao calor de E. coli, subunidade B de toxina da cólera (CTB), toxina da cólera, variantes desintoxicados de toxina da cólera, proteína Sat de E. coli, o domínio passageiro de proteína Sat de E. coli, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae e variantes desintoxicados dos mesmos, AcrA de C. jejuni, e glicoproteínas naturais de C. jejuni. 8. A célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a proteína carreadora compreende uma sequência de consenso de N-glicosilação otimizada, Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15). 9. A célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a proteína carreadora compreende uma ou mais sequências de consenso recombinantemente introduzidas. 10. A célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a proteína carreadora compreende uma sequência sinal para alvejar a proteína carreadora no espaço periplasmático da célula hospedeira. 11. A célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência sinal é selecionada do grupo que consiste na sequência sinal de DsbA de E. coli, porina A de membrana externa de E. coli (OmpA), proteína de ligação de maltose de E. coli (MalE), pectato liase de Erwinia carotovorans (PelB), FlgI, NikA, ou endoxilanase de Bacillus sp. (XynA), enterotoxina LTIIb lábil ao calor de E. coli, endoxilanase XynA de Bacillus, ou flagelina de E. coli (FlgI). 12. Um método de preparar uma proteína carreadora N- glicosilada, o dito método compreendendo: a. cultivar a célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11; e b. purificar a proteína carreadora N-glicosilada. 13. Uma proteína carreadora N-glicosilada produzida pelo método de acordo com a reivindicação 12. 14. A proteína carreadora N-glicosilada, de acordo com a reivindicação 13, compreendendo um composto da fórmula O25B: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. 16. Um antígeno O isolado de uma cepa O25B, tal como upec138, upec163, ou upec177. 17. Uma proteína carreadora N-ligada ao antígeno O, de acordo com a reivindicação 15. 18. Uma população de macromolécula isolada compreendendo uma estrutura da fórmula O25B: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. 19. Uma população de macromolécula isolada compreendendo uma estrutura da fórmula O25B’: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. 21. Uma composição farmacêutica compreendendo uma macromolécula que compreende uma estrutura da fórmula O25B’: em que n é um número inteiro entre 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20. 22. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, em que a estrutura da fórmula O25B é covalentemente ligada a um resíduo Asn em uma proteína carreadora. 23. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, em que a estrutura da fórmula O25B’ é covalentemente ligada a um resíduo Asn em uma proteína carreadora. 24. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que o resíduo Asn é posicionado em uma sequência de consenso Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro (SEQ ID NO:14). 25. A célula hospedeira procariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que a dita oligossacaril transferase é heteróloga à célula hospedeira. 26. A célula hospedeira procariótica de 1-11, em que a dita oligossacaril transferase é o C. Jejuni oligossacaril transferase, pglB. 27. A célula hospedeira procariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que a dita proteína carreadora é heteróloga à célula hospedeira. 28. A célula hospedeira procariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, 25, 26, ou 27, em que a dita proteína carreadora não é uma proteína de E. coli. 29. Um método para gerar um oligossacarídeo compreendendo um L-Rha(2Ac), compreendendo incubar um sacarídeo ou oligossacarídeo com uma ramnosil transferase compreendendo SEQ ID NO:11, em que o sacarídeo ou oligossacarídeo compreende um D-GlcNAc terminal. 30. O método, de acordo com a reivindicação 29, em que o L- Rha(2Ac) e D-GlcNAc são ligados por meio de uma ligação alfa 1, 3. 31. O método, de acordo com a reivindicação 29, em que a dita incubação ocorre in vitro. 32. O método, de acordo com a reivindicação 29, em que o dito oligossacarídeo é gerado em uma célula hospedeira que expressa de maneira recombinante uma ramnosil transferase compreendendo SEQ ID NO:11. Modalidades 2: 1. Uma composição compreendendo (i) um bioconjugado O25B, compreendendo um antígeno O25B de E. coli covalentemente ligado a um resíduo Asn de uma proteína carreadora, (ii) um bioconjugado O1A, compreendendo um antígeno O1A de E. coli covalentemente ligado a um resíduo Asn de uma proteína carreadora, (iii) um O2 bioconjugado, compreendendo um antígeno O2 de E. coli covalentemente ligado a um resíduo Asn de uma proteína carreadora, e (iv) um O6 bioconjugado, compreendendo um antígeno O6 de E. coli covalentemente ligado a um resíduo Asn de uma proteína carreadora. 2. A composição, de acordo com a reivindicação 1, em que antígeno O O25B, antígeno O1A, antígeno O6, e antígeno O2 compreendem as seguintes formulas, respectivamente:
3. A composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em exotoxina A desintoxicada de P. aeruginosa (EPA), CRM197, proteína de ligação de maltose (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetânico, hemolisina A desintoxicada de S. aureus, fator de aglutinação A, fator de aglutinação B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina lábil ao calor de E. coli, variantes desintoxicados de enterotoxina lábil ao calor de E. coli, subunidade B de toxina da cólera (CTB), toxina da cólera, variantes desintoxicados de toxina da cólera, proteína Sat de E. coli, o domínio passageiro de proteína Sat de E. coli, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae e variantes desintoxicados dos mesmos, AcrA de C. jejuni, e glicoproteínas naturais de C. jejuni. 4. A composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína carreadora é EPA desintoxicada, CRM197, ou MBP. 5. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o resíduo Asn da proteína carreadora é posicionado na sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (SEQ ID NO:15). 6. Um método para tratar uma infecção de um sujeito com Escherichia coli patogênica extra-intestinal, em que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficiente da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5. 7. Um método para prevenir uma infecção de um sujeito com Escherichia coli patogênica extra-intestinal, em que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficiente da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5. 8. Um método para induzir uma resposta imune em um sujeito contra Escherichia coli patogênica extra-intestinal, em que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficiente da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5. 9. Um método para induzir a produção de anticorpos opsonofagocíticos em um sujeito, os quais são específicos para a Escherichia coli patogênica extra-intestinal, em que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficiente da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5. 10. O método, de acordo com a reivindicação 6, 8, ou 9, em que o sujeito foi diagnosticado com uma infecção do trato urinário. 11. O método, de acordo com a reivindicação 7, 8, ou 9, em que o sujeito está em risco de desenvolver uma infecção do trato urinário. 12. O método de acordo com a reivindicação, 6, 8, ou 9, em que o sujeito foi diagnosticado com bacteremia. 13. O método de acordo com a reivindicação, 7, 8, ou 9, em que o sujeito está em risco de desenvolver bacteremia. 14. O método de acordo com a reivindicação, 6, 8, ou 9, em que o sujeito foi diagnosticado com sepse. 15. O método de acordo com a reivindicação, 7, 8, ou 9, em que o sujeito está em risco de desenvolver sepse. 16. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-16, em que o sujeito é um humano.
Claims (9)
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um bioconjugado de um antígeno de E.coli O25B covalentemente acoplado a uma proteína carreadora, em que o antígeno de E.coli O25B compreende a estrutura de Fórmula O25B’: em que n é um número inteiro entre 1 e 30, em que o antígeno O25B é N-ligado a um Asn na proteína carreadora posicionada na sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z- Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados a partir de qualquer aminoácido natural exceto Pro (SEQ ID NO: 15); e a proteína carreadora é selecionada a partir do grupo que consiste em Exotoxina A desintoxicada de P. aeruginosa (EPA), CRM197, proteína de ligação de maltose (MBP), toxoide de Difteria, toxoide de Tétano, Hemolisina A desintoxicada de S. aureus, fator de aglutinação A, fator de aglutinação B, E.coli FimH, E.coli FimHC, enterotoxina lábil ao calor de E.coli, variantes desintoxicados de enterotoxina lábil ao calor de E.coli, subunidade da toxina B da cólera (CTB), toxina da cólera, variantes desintoxicados de toxina da cólera, proteína Sat de E.coli, o domínio passageiro da proteína Sat de E.coli, Pneumolisina de Streptococcus pneumoniae e variantes desintoxicados das mesmos, AcrA de C. jejuni, e glicoproteínas naturais de C. jejuni, preferivelmente EPA desintoxicada..
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente (i) um bioconjugado O1A, compreendendo um antígeno de E.coli O1A ligado covalentemente a um resíduo Asn de uma proteína carreadora, (ii) um bioconjugado de O2, compreendendo um E.coli O2 antígeno ligado covalentemente a um resíduo Asn de uma proteína carreadora, e (iii) um bioconjugado de O6, compreendendo um antígeno de E.coli O6 ligado covalentemente a um resíduo Asn de uma proteína carreadora.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno O1A, o antígeno O6, e o antígeno O2 compreendem as seguintes fórmulas, respectivamente:
4. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para indução de uma resposta imune em um indivíduo, preferivelmente um humano, contra Escherichia coli patogênica extraintestinal.
5. Uso da composição como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para indução da produção de anticorpos opsonofagocíticos em um indivíduo, preferivelmente um humano, que são específicos para Escherichia coli patogênica extraintestinal.
6. Célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, caracterizada pelo fato de que compreende: a. uma sequência nucleotídica que codifica: i. dTDP-glicose 4,6-desidratase; ii. dTDP-6-desóxi-D-glucose 3,5-epimerase; iii. Glicose-1-fosfato timidililtransferase; iv. dTDP-4-dehidrorhamnose 3,5-epimerase; v. Flipase de Antígeno O; vi. dTDP-Rha:GLC-Rha(Ac)GlcNAc-UPP α-1,3- ramnosiltransferase; vii. UDP-Glc:GLC-Rha (Ac) GlcNAc-UPP β-1,6- glucosyltransferase viii. polimerase de antígeno O; ix. transferase de O-acetil; x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glicosiltransferase e xi. dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-ramnosiltransferase; b. uma sequência de nucleótideos que codifica uma transferase de oligossacaril; e c. uma sequência de nucleótideos que codifica uma proteína carreadora que compreende uma sequência de consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z- Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados a partir de qualquer aminoácido natural exceto Pro (SEQ ID NO: 15), preferivelmente a célula hospedeira é uma célula hospedeira de E. coli.
7. Célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que pelo menos um gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS ou aglomerado de rfb é excluído do ou funcionalmente inativado no genoma da célula hospedeira.
8. Célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora é selecionada a partir do grupo que consiste em Exotoxina A desintoxicada de P. aeruginosa (EPA), CRM197, proteína de ligação de maltose (MBP), toxoide de Difteria, toxoide de Tétano, Hemolisina A desintoxicada de S. aureus, fator de aglutinação A, fator de aglutinação B, E.coli FimH, E.coli FimHC, enterotoxina lábil ao calor de E.coli, variantes desintoxicados de enterotoxina lábil ao calor de E.coli, subunidade da toxina B da cólera (CTB), toxina da cólera, variantes desintoxicados de toxina da cólera, proteína Sat de E.coli, o domínio passageiro da proteína Sat de E.coli, Pneumolisina de Streptococcus pneumoniae e variantes desintoxicados das mesmos, AcrA de C. jejuni, e glicoproteínas naturais de C. jejuni, preferivelmente a proteína carreadora é EPA desintoxicada.
9. Método para produção de uma proteína carreadora N- glicosilada que compreende um antígeno de E.coli O25B, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende: a. fazer cultura da célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8; e b. purificar uma proteína carreadora N-glicosilada, que compreende o antígeno de E.coli O25B.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461943710P | 2014-02-24 | 2014-02-24 | |
US61/943,710 | 2014-02-24 | ||
PCT/EP2015/053739 WO2015124769A1 (en) | 2014-02-24 | 2015-02-23 | Novel polysaccharide and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BR112016019341A2 BR112016019341A2 (pt) | 2018-01-16 |
BR112016019341B1 true BR112016019341B1 (pt) | 2024-04-09 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11738076B2 (en) | Polysaccharide and uses thereof | |
US11931405B2 (en) | Bioconjugates of E. coli O-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof | |
US11491220B2 (en) | Methods of producing bioconjugates of E. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof | |
BR112016023688B1 (pt) | Bioconjugado e uso de um bioconjugado | |
BR112016019341B1 (pt) | Composição, uso da composição, célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, e, método para produção de uma proteína carreadora n-glicosilada | |
EA046206B1 (ru) | Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения |