CN113388596B - 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其编码DNA及其在NGS中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体，其特征为，在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行1个、3个或6个氨基酸位点的突变，其中突变位点在以下位点中选择：Y403A、P411H、V438K、A741S、R757Q、S768K。并公开了其编码DNA，以及其在NGS中的应用。本发明的高保真Pfu DNA聚合酶突变体，具有超高保真性和高扩增效率，可稳定高效的应用于二代测序中文库富集过程，有效提高文库测序质量，减少碱基错配率，可用于遗传信息的精准分析和判读。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体及其编码DNA，以及其在NGS中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
高通量测序（High-Throughput Sequencing）又称为下一代测序（NextGeneration Sequencing，NGS），测序通量大，一次即可测定几十到几百万条DNA分子序列，是对传统测序技术革命性的改变。目前NGS技术已应用到生命科学领域的方方面面，解决了越来越多的生物学问题。随着测序技术的广泛普及和应用，市场对建库试剂盒的需求也日益增加，与此同时，人们对建库试剂盒的质量标准也提出了更高的要求，不再把文库产量放在第一位，更多的开始关注质量，而众多质量指标中，保真性首当其冲。尤其对于临床检测领域，保真性至关重要，只有保证测序信息的真实性，才能做出更精准的判断。
文库制备过程中，聚合酶链式反应（PCR）是重要的一步，可大量富集目标文库，保证足够的文库产出，对于PCR free建库，则省略了该步骤，即不会通过扩增过程引入突变，但由于样本质量的限制，大部分样本种类依然需要PCR扩增过程。因此，需要得到一个保真性好，扩增效率高的高保真酶。
Pfu DNA聚合酶( Pfu DNA polymerase )，又称Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一类能在活体内进行DNA复制的酶，该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50)，为多聚体，分子量约为90kDa，该酶同时具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性。在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基，保真性是极高的，碱基错误率约为2×10-6。体外PCR实验中，使用Pfu聚合酶可以高保真的扩增DNA片段。然而Pfu酶扩增效率低，影响了Pfu酶的应用推广。现阶段NGS技术的不断发展和多领域应用，人们也不再止步于Pfu酶的保真性，对DNA聚合酶的保真性提出了更高的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体，扩增效率高，保真性强。
该发明对野生型Pfu DNA聚合酶进行突变改造，同时对相应位点进行突变，成功筛选得到了13个突变体，其中有6个单位点突变体，6个三位点突变体，1个六位点突变体，该13个突变体在保真性以及扩增效率方面均有不同程度的改善，具体突变信息见下表，其中六位点突变体性能改善最佳，突变位点为Y403A，P411H，V438K，A741S，R757Q，S768K。
单位点突变
三位点突变
六位点突变
本发明还公开了上述的高保真Pfu DNA聚合酶六位点突变体的氨基酸序列，如SEQID NO：1所示，该高保真DNA聚合酶六位点突变体的编码DNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。
上述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体在NGS中的应用。
本发明的高保真Pfu DNA聚合酶突变体，具有超高保真性和高扩增效率，可稳定高效的应用于二代测序中文库富集过程，有效提高文库测序质量，减少碱基错配率，用于遗传信息的精准分析和判读。
本发明的有益效果为：
1、本发明的高保真酶突变体具有很强的保真性，能够大幅降低PCR过程中出现碱基突变的概率，使扩增获得的DNA产物进一步分析鉴定所得结果更加真实可靠。
2、本发明的高保真酶突变体扩增效率高，文库扩增产量显著高于野生型Pfu DNA聚合酶。
3、本发明的高保真酶突变体扩增均一性好，可兼容不同GC样本的扩增。
4、本发明的高保真酶突变体可稳定的配置成PCR Mix，即包含除模板之外的所有组分，操作简便，保证了稳定的扩增效果。
总体而言，本发明的高保真Pfu DNA聚合酶突变体，具有超高保真性和高扩增效率，可稳定高效的应用于二代测序中文库富集过程，有效提高文库测序质量，减少碱基错配率，可用于遗传信息的精准分析和判读。
附图说明
图1是实施例4中蜡状芽孢杆菌GC bias图。
图2是实施例4中大肠杆菌GC bias图。
图3是实施例4中嗜盐杆菌GC bias图。
具体实施方式
实施例1 高保真酶六位点突变体活性测试
选取小牛胸腺gDNA(Yeasen,Cat#60612ES03)超声片段，250-500bp作为模板，使用常规DNA建库试剂盒（Yeasen,Cat#12200）进行建库，制备PCR free文库，使用1×dsDNA HSAssay Kit for Qubit®(Cat#12642)对PCR free文库进行浓度检测。使用不同体积（0.3/0.5/1/1.5/2μL）高保真Pfu DNA聚合酶六位点突变体（简称高保真酶六位点突变体）对10ngPCR free文库进行扩增测试，对比纯化产物扩增产量，选取最适酶量。
表1 PCR体系
| 名称 | 用量 |
| 小牛胸腺gDNA PCR free文库 | 10 ng |
| 10×PCR buffer | 5 μL |
| NGS Primer | 5 μL |
| 高保真酶突变体 | 0.3/0.5/1/1.5/2 μL |
| ddH2O to 50 μL | X μL |
表2 PCR程序
表3 文库产量
| 组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 高保真酶突变体 | 0.3 μL | 0.5 μL | 1 μL | 1.5 μL | 2 μL |
| 文库产量 (ng) | 1300 | 1430 | 1500 | 1487 | 1506 |
结果分析：此高保真酶六位点突变体扩增效率高，文库产量理想，0.5-2μL均可得到1400 ng以上的文库产出，选取中间用量即1μL作为最适酶量。
实施例2 高保真酶突变体1-13，PCR free文库扩增效率测试
使用50ng小牛胸腺DNA PCR free文库进行扩增测试，高保真酶突变体1-13，以及野生型Pfu酶的最适用量分别是1.5μL、2μL、1μL、1.2μL、1μL、1.5μL、1μL、1μL、2μL、1.5μL、1.5μL、1μL、1μL、1μL，10×PCR buffer 5μL，补水至50 μL，PCR扩增 7cycles，对比不同突变体的扩增效率。
表4 文库产量
结果分析：13个高保真酶突变体中，单突变体2、3，三突变体10的扩增效率稍有提升，单突变体1、4、5、6，三突变体7、8、9、11、12扩增效率提升明显，扩增产量是野生型pfu酶的1.5倍左右；六突变体13扩增效率提升最明显，产量是野生型pfu酶的2.5倍左右。
实施例3 高保真酶六位点突变体不同DNA投入量PCR free文库扩增效率测试
使用500pg-500ng小牛胸腺DNA PCR free文库进行扩增测试，高保真酶突变体用量1μL，10×PCR buffer 5μL，补水至50 μL，PCR扩增，对比不同DNA投入量的扩增效果。
表5文库产量
| 组别 | 1 | 2 | 3 |
| 小牛胸腺gDNA PCR free文库 | 500 pg | 50 ng | 500 ng |
| 扩增循环数 (Cycles) | 14 | 7 | 4 |
| 文库产量 (ng) | 1530 | 1690 | 1550 |
结果分析：该高保真酶六位点突变体可兼容不同投入量DNA PCR free文库的扩增，500pg-500ng扩增相应循环数，均可得到可观的文库产量。
实施例4 三种不同GC含量微生物样本扩增文库高通量建库测序
选取50ng不同GC含量的微生物PCR free文库使用该高保真酶六位点突变体进行扩增，酶用量1μL，10×PCR buffer 5μL，补水至50 μL，PCR纯化产物进行高通量建库测序分析，测序模式PE150，通过分析覆盖率，GC偏好性，Q30等数据来综合评估该高保真酶突变体。原始样本来源，蜡状芽孢杆菌（35%GC）(购自广州省微生物菌种保藏中心)、大肠杆菌（50%GC）(Yeasen,Cat#11802)、嗜盐杆菌 gDNA（65%GC）（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）。
1）文库产量如表6所示
表6 三种不同GC含量微生物样本扩增的文库产量
| 组别 | 1 | 2 | 3 |
| 50 ng PCR free文库 | 蜡状芽孢杆菌 | 大肠杆菌 | 嗜盐杆菌 |
| 扩增循环数 (Cycles) | 7 | 7 | 7 |
| 文库产量 (ng) | 1528 | 1491 | 1489 |
2）测序数据
表7 测序质量
| 组别 | Raw Base (G) | Raw q30 (%) | Raw GC (%) | Clean Base (G) | Clean q30 (%) | Clean GC (% | Map Ratio (%) | Dup (%) | Mean Depth | Coverage (%) |
| 蜡状芽孢杆菌 | 0.94 | 94.34 | 35.71 | 0.89 | 94.31 | 35.59 | 99.39 | 15.72 | 136.20 | 100.00 |
| 大肠杆菌 | 1.12 | 95.06 | 50.90 | 1.06 | 95.04 | 50.89 | 99.45 | 16.15 | 180.48 | 100.00 |
| 嗜盐杆菌 | 1.37 | 95.09 | 65.92 | 1.30 | 95.05 | 66.01 | 99.02 | 18.89 | 430.36 | 100.00 |
GC偏好性(GC bias)：
蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜盐杆菌的GC偏好性分别如图1、图2、图3所示。
3）结果分析
1）该高保真酶六位点突变体可兼容三种不同GC微生物样本的扩增，扩增效率高，产量均一可观；
2）该高保真酶六位点突变体扩增三种不同GC微生物样本，建库测序质量优异，Mapping可达到99%，Coverage均可达到100%；
3）该高保真酶六位点突变体扩增三种不同GC微生物样本，建库测序质量优异，GC偏好性低。
实施例5 高保真酶突变体1-13，保真性测试
选取50ng Lambda DNA PCR free文库使用高保真酶突变体进行扩增，突变体1-13Pfu酶的最适用量分别是1.5μL、2μL、1μL、1.2μL、1μL、1.5μL、1μL、1μL、2μL、1.5μL、1.5μL、1μL、1μL、1μL，10×PCR buffer 5μL，补水至50 μL，对照组使用野生型pfu酶，扩增7个循环，PCR纯化产物进行高通量建库测序分析，测序模式PE150，通过分析覆盖率，GC偏好性，Q30，保真性等数据来综合评估高保真酶突变体1-13。
1）测序质量如表8所示
表8 测序质量
| 组别 | Raw Base(G) | Raw q30(%) | Raw GC(%) | Clean Base(G) | Clean q30(%) | Clean GC(% | Map Ratio(%) | Dup(%) | MeanDepth | Coverage(%) |
| 突变体1 | 0.51 | 95.59 | 50.43 | 0.45 | 95.55 | 50.19 | 99.37 | 24.03 | 8253.90 | 100.00 |
| 突变体2 | 0.41 | 94.91 | 50.06 | 0.36 | 94.89 | 49.75 | 99.83 | 23.89 | 6508.24 | 100.00 |
| 突变体3 | 0.39 | 94.95 | 49.96 | 0.35 | 94.94 | 49.71 | 99.84 | 23.52 | 6401.08 | 100.00 |
| 突变体4 | 0.51 | 94.97 | 50.54 | 0.46 | 94.94 | 50.23 | 99.50 | 23.29 | 8369.31 | 100.00 |
| 突变体5 | 0.40 | 94.08 | 49.98 | 0.36 | 94.02 | 49.71 | 99.81 | 23.99 | 6558.61 | 100.00 |
| 突变体6 | 0.40 | 94.98 | 49.95 | 0.36 | 94.96 | 49.69 | 99.83 | 23.05 | 6565.02 | 100.00 |
| 突变体7 | 0.52 | 95.53 | 50.39 | 0.46 | 95.49 | 50.01 | 99.45 | 24.44 | 8407.77 | 100.00 |
| 突变体8 | 0.54 | 95.19 | 50.47 | 0.48 | 95.15 | 50.41 | 99.48 | 23.81 | 8794.27 | 100.00 |
| 突变体9 | 0.51 | 95.55 | 50.55 | 0.46 | 95.51 | 50.08 | 99.45 | 23.58 | 8357.40 | 100.00 |
| 突变体10 | 0.48 | 95.43 | 50.55 | 0.43 | 95.40 | 50.12 | 99.47 | 23.75 | 7964.49 | 100.00 |
| 突变体11 | 0.51 | 95.40 | 50.55 | 0.45 | 95.35 | 50.05 | 99.40 | 23.83 | 8171.48 | 100.00 |
| 突变体12 | 0.43 | 94.18 | 49.93 | 0.39 | 94.13 | 49.67 | 99.83 | 23.75 | 7079.75 | 100.00 |
| 突变体13 | 0.50 | 95.32 | 50.14 | 0.46 | 95.30 | 50.12 | 99.36 | 23.12 | 8426.09 | 100.00 |
| 野生型Pfu酶 | 0.44 | 95.31 | 50.18 | 0.41 | 95.29 | 50.16 | 99.38 | 23.55 | 8426.14 | 100.0 |
2）保真性结果如表9所示
表9 保真性
| 组别 | SNP Count (>1/1000) | (%%) | Insert Count (>1/1000) | (%%) | Delete Count (>1/1000) | (%%) |
| 突变体1 | 300 | 0.6216 | 10 | 0.0207 | 29 | 0.0601 |
| 突变体2 | 250 | 0.5180 | 7 | 0.0145 | 15 | 0.0311 |
| 突变体3 | 278 | 0.5760 | 8 | 0.0166 | 17 | 0.0352 |
| 突变体4 | 370 | 0.7667 | 6 | 0.0124 | 32 | 0.0663 |
| 突变体5 | 358 | 0.7418 | 9 | 0.0186 | 43 | 0.0891 |
| 突变体6 | 360 | 0.7460 | 7 | 0.0145 | 32 | 0.0663 |
| 突变体7 | 369 | 0.7646 | 10 | 0.0207 | 33 | 0.0684 |
| 突变体8 | 263 | 0.5450 | 9 | 0.0186 | 16 | 0.0332 |
| 突变体9 | 240 | 0.4973 | 6 | 0.0124 | 14 | 0.0290 |
| 突变体10 | 257 | 0.5325 | 8 | 0.0166 | 16 | 0.0332 |
| 突变体11 | 338 | 0.7004 | 7 | 0.0145 | 31 | 0.0642 |
| 突变体12 | 260 | 0.5387 | 9 | 0.0186 | 16 | 0.0332 |
| 突变体13 | 111 | 0.2300 | 6 | 0.0124 | 7 | 0.0145 |
| 野生型Pfu酶 | 367 | 0.7600 | 10 | 0.0207 | 40 | 0.0829 |
3）结果分析
相对于野生型Pfu酶，该高保真酶六位点突变体测序质量优异，保真性提升显著，SNP，Insert，Delete等指标均有极大程度的改善，单位点突变体以及三位点突变体在扩增效率以及保真性方面均有不同程度的提升。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
<120> 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其编码DNA及其在NGS中的应用
<141> 2021-06-24
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 775
<212> PRT
<213> Artifical Sequence
<400> 1
Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile
35 40 45
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg
50 55 60
Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Thr Ile
85 90 95
Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser
370 375 380
Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn
385 390 395 400
Ile Val Ala Leu Asp Phe Arg Ala Leu Tyr His Ser Ile Ile Ile Thr
405 410 415
His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr
420 425 430
Asp Ile Ala Pro Gln Lys Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly
435 440 445
Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile
450 455 460
Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu
465 470 475 480
Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly
485 490 495
Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu
500 505 510
Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu
515 520 525
Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly
530 535 540
Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys
545 550 555 560
Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu
565 570 575
Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys
580 585 590
Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly
595 600 605
Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln
610 615 620
Ala Arg Val Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala
625 630 635 640
Val Arg Ile Val Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile
645 650 655
Pro Pro Glu Lys Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His
660 665 670
Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala
675 680 685
Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val
690 695 700
Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu
705 710 715 720
Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn
725 730 735
Gln Val Leu Pro Ser Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg
740 745 750
Lys Glu Asp Leu Gln Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Lys
755 760 765
Trp Leu Asn Ile Lys Lys Ser
770 775
<210> 2
<211> 2328
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 2
atgattttag atgtggatta cataactgaa gaaggaaaac ctgttattag gctattcaaa 60
aaagagaacg gaaaatttaa gatagagcat gatagaactt ttagaccata catttacgct 120
cttctcaggg atgattcaaa gattgaagaa gttaagaaaa taacggggga aaggcatgga 180
aagattgtga gaattgttga tgtagagaag gttgagaaaa agtttctcgg caagcctatt 240
accgtgtgga aactttattt ggaacatccc caagatgttc ccactattag agaaaaagtt 300
agagaacatc cagcagttgt ggacatcttc gaatacgata ttccatttgc aaagagatac 360
ctcatcgaca aaggcctaat accaatggag ggggaagaag agctaaagat tcttgccttc 420
gatatagaaa ccctctatca cgaaggagaa gagtttggaa aaggcccaat tataatgatt 480
agttatgcag atgaaaatga agcaaaggtg attacttgga aaaacataga tcttccatac 540
gttgaggttg tatcaagcga gagagagatg ataaagagat ttctcaggat tatcagggag 600
aaggatcctg acattatagt tacttataat ggagactcat tcgacttccc atatttagcg 660
aaaagggcag aaaaacttgg gattaaatta accattggaa gagatggaag cgagcccaag 720
atgcagagaa taggcgatat gacggctgta gaagtcaagg gaagaataca tttcgacttg 780
tatcatgtaa taacaaggac aataaatctc ccaacataca cactagaggc tgtatatgaa 840
gcaatttttg gaaagccaaa ggagaaggta tacgccgacg agatagcaaa agcctgggaa 900
agtggagaga accttgagag agttgccaaa tactcgatgg aagatgcaaa ggcaacttat 960
gaactcggga aagaattcct tccaatggaa attcagcttt caagattagt tggacaacct 1020
ttatgggatg tttcaaggtc aagcacaggg aaccttgtag agtggttctt acttaggaaa 1080
gcctacgaaa gaaacgaagt agctccaaac aagccaagtg aagaggagta tcaaagaagg 1140
ctcagggaga gctacacagg tggattcgtt aaagagccag aaaaggggtt gtgggaaaac 1200
atagtagccc tagattttag agccctatat cactcgatta taattaccca caatgtttct 1260
cccgatactc taaatcttga gggatgcaag aactatgata tcgctcctca aaaaggccac 1320
aagttctgca aggacatccc tggttttata ccaagtctct tgggacattt gttagaggaa 1380
agacaaaaga ttaagacaaa aatgaaggaa actcaagatc ctatagaaaa aatactcctt 1440
gactatagac aaaaagcgat aaaactctta gcaaattctt tctacggata ttatggctat 1500
gcaaaagcaa gatggtactg taaggagtgt gctgagagcg ttactgcctg gggaagaaag 1560
tacatcgagt tagtatggaa ggagctcgaa gaaaagtttg gatttaaagt cctctacatt 1620
gacactgatg gtctctatgc aactatccca ggaggagaaa gtgaggaaat aaagaaaaag 1680
gctctagaat ttgtaaaata cataaattca aagctccctg gactgctaga gcttgaatat 1740
gaagggtttt ataagagggg attcttcgtt acgaagaaga ggtatgcagt aatagatgaa 1800
gaaggaaaag tcattactcg tggtttagag atagttagga gagattggag tgaaattgca 1860
aaagaaactc aagctagagt tttggagaca atactaaaac acggagatgt tgaagaagct 1920
gtgagaatag taaaagaagt aatacaaaag cttgccaatt atgaaattcc accagagaag 1980
ctcgcaatat atgagcagat aacaagacca ttacatgagt ataaggcgat aggtcctcac 2040
gtagctgttg caaagaaact agctgctaaa ggagttaaaa taaagccagg aatggtaatt 2100
ggatacatag tacttagagg cgatggtcca attagcaata gggcaattct agctgaggaa 2160
tacgatccca aaaagcacaa gtatgacgca gaatattaca ttgagaacca ggttcttcca 2220
agcgtactta ggatattgga gggatttgga tacagaaagg aagacctcca ataccaaaag 2280
acaagacaag tcggcctaac taagtggctt aacattaaaa aatcctag 2328
Claims (3)
1.一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体，其特征为，在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行6个氨基酸位点的突变，其中突变位点为：Y403A、P411H、V438K、A741S、R757Q、S768K，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的编码DNA，其特征为：其序列如SEQID NO：2所示。
3.权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体在NGS中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110933939.3A CN113388596B (zh) | 2021-08-16 | 2021-08-16 | 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其编码DNA及其在NGS中的应用 |
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