CN111801343A

CN111801343A - 免疫原性组合物

Info

Publication number: CN111801343A
Application number: CN201880089908.0A
Authority: CN
Inventors: A·法里莫亚耶; S·M·格贝尔; S·J·克姆勒
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-10-20
Also published as: MX2020006328A; CA3086264A1; GB201721582D0; US11819544B2; EP3728293A1; BR112020012216A2; US20210077607A1; JP2021506318A; WO2019121926A1

Abstract

本发明公开了修饰的金黄色葡萄球菌ClfA蛋白，其含有糖基化位点共有序列。本发明还公开了包含修饰的ClfA蛋白和抗原(例如金黄色葡萄球菌糖抗原)的缀合物，其中所述抗原(直接或通过接头)连接至修饰的ClfA蛋白的氨基酸残基。

Description

免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及以下领域：免疫原性组合物和疫苗、此类组合物的制备和在医学中的用途。更具体地，其涉及来自金黄色葡萄球菌的多肽及其作为疫苗抗原、尤其是作为与糖抗原缀合的载体蛋白的用途。

背景

金黄色葡萄球菌是侵入性人感染(包括菌血症、心内膜炎、肺炎和伤口感染)的主要原因。金黄色葡萄球菌非常迅速地发展抗生素抗性，并且已经出现对常用的抗生素、诸如甲氧西林和甚至最后手段的抗生素万古霉素抗性的菌株。甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)在医院中流行，并且社区相关的MRSA菌株正在全世界传播，造成重大的全球挑战。

因此，迫切需要一种预防葡萄球菌疾病的疫苗。几种疫苗已经在临床试验中进行测试，包括荚膜多糖(CPS)缀合物、单个蛋白抗原和针对脂磷壁酸的单克隆抗体(mAb)，然而，都已经在各个发展阶段失败，并且迄今为止，市场上没有针对金黄色葡萄球菌的疫苗。

引发体液和细胞介导的免疫应答两者的金黄色葡萄球菌疫苗目前正在评估中，并且蛋白抗原(包括粘附素、诸如凝集因子A (ClfA))和CPS两者都是正在考虑包含于多组分疫苗中的关键抗原。

细菌对宿主细胞外基质组分的粘附是细菌感染的关键初始阶段。ClfA是一种重要的金黄色葡萄球菌粘附素，其对于毒力而言是必需的，并且有助于细菌逃避宿主防御机制。其结合ECM中的纤维蛋白原，有助于宿主组织的粘附和定植，并且另外引起细胞凝集和细菌细胞在纤维蛋白原中的包被，其通过损害调理素在细菌上的沉积来促进免疫逃逸。因此，ClfA是包含在金黄色葡萄球菌多组分疫苗中的有希望的抗原。

90%的金黄色葡萄球菌菌株表达5型或8型荚膜多糖，因此包含CP5和CP8的疫苗可能会针对大多数循环金黄色葡萄球菌菌株进行保护。包含金黄色葡萄球菌荚膜多糖的疫苗已经用于生成针对葡萄球菌的保护性免疫应答，但仅包含CPS的疫苗尚未被证明是完全有效的。含有与假单胞菌外蛋白A缀合的金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的缀合物的疫苗(StaphVAX – Nabi Biopharmaceuticals)已经在临床试验中进行测试，其中其在PhI和II中表明安全性和有效性，但未能在PhIII中达到所需的终点，如WO 03/61558中所述。

已经在PhI人试验中测试了包含金黄色葡萄球菌CPS和ClfA的多组分疫苗(Anderson等人 2012, Hum Vaccine Immunother 8: 1585-1594)。该疫苗在PhI中诱导调理性抗CP抗体和抑制性抗ClfA抗体，并且目前正在PhIIb效力试验中针对在选择性脊柱融合手术患者中的预防性用途进行测试。

金黄色葡萄球菌CP8与作为载体蛋白的铜绿假单胞菌EPA或金黄色葡萄球菌ClfA的生物缀合物已经描述于WO2015/082571中。CP8-EPA生物缀合物能够在兔中诱导调理性抗体，并且用CP8-EPA生物缀合物对小鼠接种疫苗针对由血清型8金黄色葡萄球菌菌株诱导的菌血症进行保护。因此，CP8-ClfA生物缀合物具有用于针对金黄色葡萄球菌的疫苗中的潜能。

发明概述

本发明提供了经修饰以引入PgIB的糖基化位点的葡萄球菌ClfA蛋白及其生物缀合物。

因此，在本发明的一个方面提供了多肽，其包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:4，或由其组成，所述多肽被修饰，其中所述氨基酸序列包含一个或多个选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)(其中X和Z独立地是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)的共有序列。在一个优选实施方案中，所述共有序列添加在SEQ ID NO:3的氨基酸残基313-340之间或在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列内的等同位置，或取代在SEQ ID NO:3的氨基酸残基313-340之间或在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列内的等同位置处的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，所述共有序列取代SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329、P331和/或I337，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329、P331和/或I337等同的氨基酸位置处取代。

在一个实施方案中，所述共有序列取代SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329或I337，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329或I337等同的氨基酸位置处取代。

在一个优选实施方案中，所述共有序列取代SEQ ID NO:3中的氨基酸序列I337，或在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中取代。

在一个实施方案中，所述共有序列具有序列K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ IDNO.22)，其中X是Q(谷氨酰胺)且Z是A(丙氨酸)(例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))。

相对于SEQ ID NO.3的氨基酸序列，所述多肽可以进一步包含选自P116至S和Y118至A的至少一个氨基酸取代(对应于SEQ ID NO:1的序列中的位置P336和Y338或与SEQ IDNO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中的等同位置)，例如SEQ ID NO 4-5或10-12。

所述多肽可以在N-末端包含额外的丝氨酸残基，例如SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.12，和/或在C-末端包含额外的残基，诸如Gly或Gly-Ser，例如SEQ ID NO:32。

所述多肽可以包含能够将蛋白引导至宿主细胞(例如细菌)的周质的信号序列，任选地，所述信号序列选自SEQ ID NO.13-20，优选SEQ ID NO:13，任选地，所述蛋白具有与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

所述多肽可以包含可用于纯化ClfA蛋白的肽标签，任选地所述肽标签包含六个组氨酸残基，且任选地，所述肽标签位于所述氨基酸序列的C-末端，任选地所述肽标签前面为接头诸如Gly或Gly-Ser，任选地所述蛋白具有与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

根据本发明的一个进一步方面，提供了缀合物(例如生物缀合物)，其包含连接至本发明的多肽的抗原、优选多糖抗原。

根据本发明的一个进一步方面，提供了编码本发明的多肽的多核苷酸。

根据本发明的一个进一步方面，提供了载体，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸。

根据本发明的一个进一步方面，提供了宿主细胞，其包含：

i)一种或多种编码糖基转移酶的核酸；

ii)编码寡糖基转移酶的核酸；

iii)编码本发明的多肽的核酸；和任选地

iv)编码聚合酶的核酸(例如wzy)。

根据本发明的一个进一步方面，提供了用于产生生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含与糖连接的多肽(或由其组成)，所述方法包括：(i)在适合于产生蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和(ii)分离由所述宿主细胞产生的生物缀合物。

根据本发明的一个进一步方面，提供了通过本发明的方法产生的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与多肽连接的糖。

根据本发明的一个进一步方面，提供了免疫原性组合物，其包含本发明的多肽、本发明的缀合物或本发明的生物缀合物以及药学上可接受的赋形剂或载体。

根据本发明的一个进一步方面，提供了制备本发明的免疫原性组合物的方法，其包括将多肽或缀合物或生物缀合物与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。

根据本发明的一个进一步方面，提供了用于治疗或预防有此需要的受试者中的金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物。

根据本发明的一个进一步方面，提供了针对金黄色葡萄球菌感染免疫人宿主的方法，其包括向所述宿主施用免疫保护剂量的本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物。

根据本发明的一个进一步方面，提供了诱导受试者中对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物。

根据本发明的一个进一步方面，提供了本发明的多肽、本发明的缀合物或本发明的生物缀合物，其用于治疗或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。

根据本发明的一个进一步方面，提供了本发明的多肽、本发明的缀合物或本发明的生物缀合物，其用于制备用于治疗或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病的药物。

附图描述

图1：来自金黄色葡萄球菌的凝集因子中的蛋白结构域的概览。

图1是金黄色葡萄球菌凝集因子ClfA的结构域组织的示意图。其突出显示纤维蛋白原结合亚结构域N1-N2-N3，并且显示位于亚结构域N2中的脱毒突变的位置和性质。数字是指氨基酸位置(每个结构域的起点)。SS= 信号序列；N1-N3：纤维蛋白原结合亚结构域；R= 丝氨酸-天冬氨酸二肽重复区；W = 跨细胞壁区域；M = 跨膜区域。

图2：金黄色葡萄球菌凝集因子结构域N2和N3的晶体结构(ClfAN2N3，PDB标识符1N67)，其显示在N-最末端(突变体1)或C-最末端(突变体30)引入的糖基化位点的基因座。

图2代表金黄色葡萄球菌凝集因子结构域N2N3的晶体结构(ClfAN2N3,Deivanayagam等人, EMBO J., 2002, PDB标识符1N67)，其显示测试的N-极末端和C-极末端糖基化位点A：一个在N-最末端(D244KDQNATK = 突变体1)和B：一个在C最-末端(I557KDQNATK = 突变体30)。

图3、4：不同的ClfA糖位点突变体生物缀合物的抗His Western印迹。

如实施例1中所述，用作为阳性对照的D328KDQNRTK(质粒633)和EPA-CP8，突变体1-30的CP8-ClfAN2N3生物缀合物生产的抗His Western印迹分析。泳道1：蛋白标记(M)。印迹：兔α-His 1:2000，山羊α-小鼠1:20 000。

图5、6：不同的ClfA糖位点突变体生物缀合物的抗CP8 Western印迹

如实施例1中所述，用作为阳性对照的D328KDQNRTK(质粒633)和EPA-CP8，突变体1-30的CP8-ClfAN2N3生物缀合物生产的抗CP8 Western印迹分析。印迹：兔α-CP8-EPA-His 1:1000，山羊α-兔1:10 000。

图7：CP8-ClfAN2N3突变体1 (D244KDQNATK)生物缀合物的表达和纯化

图7显示在20L生物反应器中从三质粒系统表达且纯化至均质的CP8-ClfAN2N3突变体1的最终产物的SDS-PAGE SimplyBlue SafeStain、抗ClfA和抗CP8 Western印迹分析。纯化至均质的CP8-ClfAN2N3 mut1 (mut1)和未糖基化的ClfAN2N3 wt (U-wt)的A) SimplyBlueSafeStain、B) 抗ClfAN2N3 Western印迹分析、C) 抗CP8 Western印迹。

图8：CP8-ClfAN2N3突变体30 (I557KDQNATK)生物缀合物的表达和纯化

图8显示在20L生物反应器中从单质粒系统表达且纯化至均质的CP8-ClfAN2N3突变体30的最终产物的SDS-PAGE SimplyBlue SafeStain、抗ClfA和抗CP8 Western印迹分析。纯化至均质的CP8-ClfAN2N3 mut30 (mut30)和未糖基化的ClfAN2N3 mut 30 (U-mut 30)的A) SimplyBlue SafeStain和B) 抗ClfAN2N3 Western印迹分析和C) 抗CP8 Western印迹。

图9：与糖位点突变体1相比，在载体蛋白ClfAN2N3糖位点突变体30的背景下金黄色葡萄球菌生物缀合物生产的蛋白稳定性提高

使用三质粒系统的CP8-ClfAN2N3生物缀合物生产的Western印迹分析，证实糖位点突变体30(泳道3)相对于糖位点突变体1(泳道2)的蛋白降解降低。泳道1 =蛋白标记。

图10：不同信号序列对ClfAN2N3突变体30的生产产率的影响

使用不同信号序列产生的具有HRHR标签的ClfA-CP8-ClfAN2N3突变体30的抗HisWestern印迹：大肠杆菌二硫化物氧化还原酶DsbA信号序列(DsbA)，福氏志贺氏菌鞭毛P-环蛋白信号序列(Flgl)，大肠杆菌不耐热肠毒素IIB，B链信号序列(LTIIb)，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MalE信号序列(MalE)，胡萝卜软腐病果胶杆菌果胶酶裂解酶2前体信号序列(PelB)，无乳链球菌表面免疫原性蛋白信号序列(SipA)，大肠杆菌易位蛋白信号序列(TolB)，大肠杆菌外膜蛋白信号序列(OmpA)。

泳道1：PageRuler预染的蛋白标记

泳道A：DsbA信号序列

泳道B：Flgl信号序列

泳道C：LTIIb信号序列

泳道D：MalE信号序列

泳道E：PelB信号序列

泳道F：SipA信号序列

泳道G：TolB信号序列

泳道H：OmpA信号序列。

详述

术语

载体蛋白：共价附接至抗原(例如糖抗原)以产生缀合物(例如生物缀合物)的蛋白。载体蛋白活化T-细胞介导的免疫力，所述免疫力与缀合于载体蛋白的抗原相关。

除脯氨酸(pro，P)外的任何氨基酸：是指选自以下的氨基酸：丙氨酸(ala，A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)，和缬氨酸(val，V)。

ClfA：来自金黄色葡萄球菌的凝集因子A

CP：荚膜多糖

LPS：脂多糖。

wzy：多糖聚合酶基因，其编码催化多糖聚合的酶。所编码的酶将寡糖单元转移至非还原末端，形成糖苷键。

waaL：编码膜结合酶的O抗原连接酶基因。所编码的酶将十一异戊烯基-二磷酸酯(UPP)结合的O抗原转移至脂质A核心寡糖，形成脂多糖。

Und-PP：焦磷酸十一异戊烯基酯。

Und-P：磷酸十一异戊烯基酯

还原末端：寡糖或多糖的还原末端是具有游离异头碳的单糖，所述游离异头碳不参与糖苷键，且因此能够转化为开链形式。

如本文所用，术语“生物缀合物”是指在宿主细胞背景中制备的蛋白(例如载体蛋白)和抗原(例如多糖)之间的缀合物，其中宿主细胞机构将抗原连接至蛋白(例如N-连接)。通常，在生物缀合物中，多糖经由N-乙酰基葡糖胺与天冬酰胺连接。

如本文所用，在向受试者施用治疗(例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗)的背景中，术语"有效量"是指具有预防和/或治疗效应的治疗的量。在某些实施方案中，"有效量"是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效应的治疗的量：(i)降低或改善细菌感染或与其相关的症状的严重度；(ii)缩短细菌感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防细菌感染或与其相关的症状的进展；(iv)引起细菌感染或与其相关的症状的消退；(v)预防细菌感染或与其相关的症状的发生或发作；(vi)预防细菌感染或与其相关的症状的复发；(vii)减少与细菌感染相关的器官衰竭；(viii)减少具有细菌感染的受试者的住院；(ix)缩短具有细菌感染的受试者的住院长度；(x)提高具有细菌感染的受试者的存活；(xi)消除受试者的细菌感染；(xii)抑制或减少受试者中的细菌复制；和/或(xiii)增强或改善另一治疗的预防或治疗效应。

如本文所用，术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)。

如本文所用，术语“供体寡糖或多糖”是指由其衍生出寡糖或多糖的寡糖或多糖。如本文所用的供体寡糖和多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖(例如葡萄糖)。术语供体寡糖或多糖的使用并不意味着暗示原位修饰寡糖或多糖。相反，术语供体寡糖或多糖的使用意指在其野生型状态下为寡糖基转移酶(例如，PglB)活性的弱底物或不是寡糖基转移酶(例如，PglB)活性的底物的寡糖或多糖。示例性供体寡糖或多糖包括来自细菌的那些，所述细菌包括金黄色葡萄球菌CP5和CP8。本领域技术人员将能够容易地确定寡糖或多糖是否在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖(例如，葡萄糖)，以及因此此类寡糖或多糖是否是如本文涵盖的供体寡糖或多糖。

如本文所用，术语“己糖单糖衍生物”是指可以是寡糖基转移酶活性的底物的己糖单糖的衍生物。通常，己糖单糖衍生物包含在位置2包含乙酰氨基的单糖。示例性己糖单糖衍生物包括GlcNAc、HexNAc、脱氧HexNAc或2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖。

如本文所用，术语“杂合寡糖或多糖”是指在第一重复单元的还原末端不包含己糖，而是在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物的工程改造的寡糖或多糖。

如本文所用，提及两个氨基酸或核酸序列之间的百分比序列同一性意味着，当比对时，该百分比的氨基酸或碱基在比较两个序列中是相同的。可以使用本领域中已知的软件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人, 编,1987, Supplement 30)的第7.7.18节中描述的那些，来确定这种比对和百分比同源性或序列同一性。优选的比对通过Smith-Waterman同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚分为12，且缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。Smith-Waterman同源性搜索算法公开于Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489。理想地，与任何特定序列(例如与特定SEQ ID)的百分比同一性在该序列的整个长度上计算。不同长度的两个序列之间的序列同一性百分比优选地在较长序列的长度上计算。

如本文所用，术语“免疫原性片段”是小于整个抗原的抗原的一部分，其能够在宿主动物(例如人)中引发对该片段特异性的体液和/或细胞免疫应答。使用本领域中已知的技术，例如重组、通过蛋白水解消化或通过化学合成，可以产生蛋白的片段。通过从编码多肽的核酸的一个末端(对于末端片段)或两个末端(对于内部片段)除去一个或多个核苷酸，可以生成多肽的内部或末端片段。通常，片段包含全长序列的至少10、20、30、40或50个邻接氨基酸。然而，片段长度也可以是100或更多，200或更多，300或更多或400或更多的氨基酸。通过从N和C-末端中任一或两者添加或除去1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个氨基酸，可以容易地修饰片段。

如本文所用，术语“保守氨基酸取代”涉及天然氨基酸残基由非天然残基的取代，使得对在该位置处的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性具有很少作用或无作用，并且不导致免疫原性减少。例如，这些可以是在以下组内的取代：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。对多肽序列的保守氨基酸修饰(和对编码核苷酸的相应修饰)可以产生具有与亲本多肽的那些相似的功能和化学特征的多肽。

如本文所用，术语“缺失”是从蛋白序列中除去一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任何一个位点处缺失不多于约1 - 6个残基(例如1 - 4个残基)。

如本文所用，术语“插入”是在蛋白序列中添加一个或多个非天然氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任何一个位点处插入不多于约1 - 7个残基(例如1 - 4个残基)。

蛋白

凝集因子A (ClfA)是一种与纤维蛋白原γ-链结合的金黄色葡萄球菌粘附蛋白，其存在于几乎所有金黄色葡萄球菌菌株中。其为重要的毒力因子，有助于败血性关节炎和心内膜炎的发病机理。ClfA结合纤维蛋白原的γ-链的C-末端，且因此能够诱导细菌在纤维蛋白原溶液中凝集。ClfA在金黄色葡萄球菌上的表达阻碍巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用。在嗜中性粒细胞中，这是由于纤维蛋白原依赖性和纤维蛋白原非依赖性机制二者。相反，表达ClfA的细菌通过其与GPIIb/IIIa的相互作用(其导致聚集)而活化血小板。当存在纤维蛋白原时，这是最有效执行的，但是也存在血小板活化的纤维蛋白原非依赖性的途径。

ClfA含有520个氨基酸的N-末端A结构域(纤维蛋白原结合区)，其包含三个分开折叠的亚结构域N1、N2和N3。A结构域随后为丝氨酸-天冬氨酸二肽重复区以及跨细胞壁区域和跨膜区域，其含有用于分选酶促进的至细胞壁的锚定的LPDTG-基序。

在一个实施方案中，本发明的多肽可以衍源自与SEQ ID NO.1具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%相同一性的氨基酸序列，其为SEQ ID NO.1的免疫原性片段和/或变体(例如 SEQ ID NO.3)。

在一个实施方案中，本发明的多肽可以源自SEQ ID NO.1的免疫原性片段，其包含全长序列的至少约15个、至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约100个、至少约300个或至少约400个连续氨基酸残基，其中所述多肽能够引发对所述氨基酸序列特异性的免疫应答。已知天然ClfA的纤维蛋白原结合结构域由三个分开折叠的亚结构域N1、N2和N3组成，如图1中所示。可以通过除去和/或修饰这些结构域中的一个或多个来修饰这些构域。在一个实施方案中，SEQ ID NO.1的片段含有确切或至少1、2或3个结构域。在另一个实施方案中，SEQ ID NO.1的片段含有确切或至少2或3个结构域。在另一个实施方案中，SEQ ID NO.1的片段含有至少2个结构域，优选结构域N2和N3。在一个实施方案中，SEQ ID NO.1的片段可以包含SEQ ID NO.1的N1的氨基酸残基(残基39-220)(或由其组成)。在一个实施方案中，SEQ ID NO.1的片段可以包含SEQ ID NO.1的N2的氨基酸残基(残基221-368)(或由其组成)。在一个实施方案中，SEQ ID NO.1的片段可以包含SEQ ID NO.1的N3的氨基酸残基(残基369-560)2(或由其组成)。在一个实施方案中，SEQ ID NO.1的片段可以包含SEQ ID NO.1的N1N2N3的氨基酸残基(残基39-560)(SEQ ID NO:2)(或由其组成)。在一个优选实施方案中，SEQ ID NO.1的片段可以包含SEQ ID NO.1的N2N3的氨基酸残基(残基221-560)(SEQ IDNO:3)(或由其组成)。

在一些实施方案中，本发明的多肽可以包含ClfA的亚结构域N1、N2和N3(SEQ IDNO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列(或由其组成)。在其他实施方案中，本发明的多肽可以包含亚结构域N2和N3(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列(或由其组成)。

因此，本发明提供了多肽，其包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列(例如SEQ ID NO.4)(或由其组成)，所述多肽被修饰，其中所述氨基酸序列包含一个或多个选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)(其中X和Z独立地是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)的共有序列。为了克隆的目的，可以通过添加N-末端丝氨酸来修饰这些序列。所述序列可以被进一步修饰以包含脱毒突变，诸如本文所述的脱毒突变中的任何一种或全部。

在一个实施方案中，本发明的多肽可以源自与SEQ ID NO.1具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其为SEQ ID NO.1的变体，其已通过缺失和/或添加和/或取代一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸)进行修饰。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一个方面，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、添加或其任何组合可以组合在单一变体中，只要所述变体是免疫原性多肽即可。在一个实施方案中，本发明的修饰的ClfA蛋白可以源自其中1至10、5至10、1至5、1至3、1至2或1个氨基酸被以任何组合取代、缺失或添加的变体。例如，本发明的多肽可以源自作为SEQID NO.3的变体的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含额外的N-末端丝氨酸(例如SEQ IDNO:12)。

在一个实施方案中，本发明包括片段和/或变体，其包含B细胞或T细胞表位。此类表位可以使用2D结构预测的组合进行预测，例如使用PSIPRED程序(来自David Jones，Brunel Bioinformatics Group，Dept. Biological Sciences，Brunel University，Uxbridge UB8 3PH，UK)和基于由Jameson和Wolf(CABIOS 4:181-186 [1988])描述的方法计算的抗原指数。

术语“多肽”是指ClfA氨基酸序列(例如，具有SEQ ID NO.3的ClfA氨基酸序列或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列)，所述ClfA氨基酸序列可以是野生型ClfA氨基酸序列，其已通过如下进行修饰：添加、取代或缺失一个或多个氨基酸(例如，通过添加选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)的共有序列；或通过用选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQID NO.22)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.23)的共有序列取代一个或多个氨基酸。所述多肽还可以包含另外的修饰(添加、取代、缺失)以及一个或多个共有序列的添加或取代。例如，所述ClfA蛋白可以含有脱毒突变以减少或消除纤维蛋白原结合，如下所述，野生型ClfA蛋白的信号序列可以被缺失或用替代的信号序列取代，和/或可以添加肽标签。在一个实施方案中，本发明的多肽可以是非天然存在的ClfA蛋白。在一个实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:10的序列。

在本发明的一个实施方案中，所述ClfA氨基酸序列(例如，具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的ClfA氨基酸序列)的一个或多个氨基酸(例如1-7个氨基酸，例如一个氨基酸)已经被D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)或K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22) (例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))共有序列取代。例如，ClfA氨基酸序列(例如SEQ ID NO.3)中的单个氨基酸可以用D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)或K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ IDNO.22) (例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))共有序列替代。或者，ClfA氨基酸序列(例如SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的ClfA氨基酸序列)中的2、3、4、5、6或7个氨基酸可以用D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)或K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22) (例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))共有序列替代。

选自：D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)的共有序列的引入使得所述多肽能够被糖基化。因此，本发明还提供了本发明的多肽，其中所述多肽是糖基化的。在具体实施方案中，将共有序列引入ClfA氨基酸序列的特定区域，例如所述蛋白的表面结构，在所述蛋白的N或C末端，和/或通过在所述蛋白的基部的二硫键稳定的环中。在本发明的一个方面，共有序列的位置提供改进的糖基化，例如增加的产率。在一个实施方案中，选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ IDNO.22) (例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))的共有序列在C末端位于修饰的ClfA氨基酸序列的C-末端，例如在距C末端25个或更少氨基酸的位置。在一个实施方案中，所述共有序列取代对应于SEQ ID NO.1(例如 SEQ ID NO 7-12)的位置557的氨基酸。

在一个实施方案中，选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K(SEQ ID NO.22) (例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))的共有序列已经被添加或取代SEQ ID NO.1的一个或多个氨基酸残基533-560(例如代替一个或多个氨基酸残基550-560，或代替氨基酸残基Q547、P549、P551或I557，优选I557)或者被添加或取代在与SEQ ID NO.1具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中的等同位置中(例如SEQ ID NO.3的氨基酸序列中的等同位置中，即Q327、D329、P331或I337；例如，SEQ IDNO.7-12)。

本领域技术人员将理解，提及“在氨基酸...之间”(例如“在氨基酸533-560之间”)是指从氨基酸序列的N-末端连续计数的氨基酸编号，例如“在SEQ ID NO.1的氨基酸533-560 ...之间”是指在SEQ ID NO.1的第533个和第560个氨基酸之间(包括第533个和第560个氨基酸)的氨基酸序列中的位置。因此，在其中“选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22) (例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))的共有序列已经在氨基酸残基533-560之间添加或取代一个或多个氨基酸”的实施方案中，所述共有序列可能已经在SEQ ID NO.1中的氨基酸编号533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559或560中的任何一个(或多个)处添加或取代。本领域技术人员将理解，当ClfA氨基酸序列是SEQ IDNO.1的氨基酸序列的变体和/或片段、诸如与SEQ ID NO.1或其片段具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，诸如SEQ ID NO 3或SEQ ID NO:4时，提及“在氨基酸...之间”是指这样的位置，如果该序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列对齐以使两个序列之间的序列同一性最大化，则该位置与定义的位置等同(序列比对工具不限于Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk) MUSCLE (www(.)ebi(.)ac(.)uk)或T-coffee (www(.)tcoffee(.)org)。在一个方面，使用的序列比对工具是Clustal Omega(www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)。例如，SEQ ID NO:1中的所述氨基酸编号对应于SEQ ID NO:3和4的氨基酸编号313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339或340。

从SEQ ID NO.1的变体和/或片段添加或缺失氨基酸可以导致突变序列中共有序列的实际氨基酸位置中的差异，然而，通过将突变序列与参考序列对齐，可以鉴定与参考序列中相应氨基酸等同的位置的氨基酸，且因此可以确定用于添加或取代共有序列的适当位置。

在一个实施方案中，本发明的修饰的蛋白包含至少1、2、3或4个D/E-X-N-X-S/T共有序列或确切1、2、3、4、5或6个D/E-X-N-X-S/T共有序列。在一个实施方案中，本发明的修饰的蛋白包含至少1、2、3或4个D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)共有序列或确切1、2、3、4、5或6个D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.22)共有序列。在一个实施方案中，本发明的修饰的蛋白包含至少1、2、3或4个K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列或确切1、2、3、4、5或6个K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列。在一个实施方案中，本发明的修饰的蛋白包含选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)的单个共有序列。在一个实施方案中，所述共有序列是D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)，其中X是Q(谷氨酰胺)且Z是A(丙氨酸)，例如D-Q-N-A-T。在一个实施方案中，所述共有序列是K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)，其中X是Q(谷氨酰胺)且Z是R(精氨酸)，例如K-D-Q-N-R-T-K(SEQ ID NO.24)。在一个优选实施方案中，所述共有序列是K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ IDNO.22)，其中X是Q(谷氨酰胺)且Z是A(丙氨酸)，例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))。

因为ClfA的纤维蛋白原结合活性是其充当毒力因子所需的，所以可以修饰ClfA蛋白以降低或消除纤维蛋白原结合活性，以便其可以在体内施用。多肽可以具有WO2011/007004中描述的突变之一，例如在对应于SEQ ID NO:1的残基P336和Y338 (SEQ ID NO:3的残基P116和Y118)的氨基酸中的一个或优选两个处的突变，例如P336S和/或Y338A。示例性序列是SEQ ID NO:4-6和10-12和25-27的那些。

在一个实施方案中，本发明的多肽进一步包含"蛋白标签"或"标签"，即允许分离和/或鉴定所述多肽的氨基酸序列。例如，向本发明的多肽添加标签可用于纯化该蛋白且因此纯化包含标记的修饰的ClfA蛋白的缀合物疫苗。可用于本文中的示例性标签包括但不限于组氨酸(HIS)标签(例如，六组氨酸-标签或6XHis-标签)、FLAG-标签和HA标签。在一个实施方案中，所述标签是六组氨酸标签。在某些实施方案中，本文使用的标签是可除去的，例如一旦不再需要它们(例如在纯化蛋白之后)，就通过化学试剂或通过酶促方式除去。任选地，所述肽标签位于氨基酸序列的C-末端。任选地，所述肽标签包含在氨基酸序列的C-末端的六个组氨酸残基。在一个方面，本发明的修饰的ClfA蛋白包含与SEQ ID NO.4、5或6的序列具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99% 或100%同一性的氨基酸序列(或由其组成)，所述氨基酸序列包含D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)共有序列(其中X和Z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸)(例如K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)或K-D-Q-N-A-T-K(SEQ ID NO.23))和肽标签(例如，在该氨基酸序列的C-末端的六个组氨酸残基)。任选地，本发明的多肽具有与SEQ ID NO.25、25或27具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的多肽包含能够将ClfA蛋白引导至宿主细胞(例如细菌)的周质的信号序列。在一个具体实施方案中，所述信号序列来自大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI) [MIKFLSALILLLVTTAAQA (SEQ ID NO.13)]。在其他实施方案中，所述信号序列来自大肠杆菌外膜孔蛋白A (OmpA) [MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO.14)]、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE) [MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (SEQ ID NO.15)]、胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶裂解酶(PelB) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO.16)]、不耐热的大肠杆菌肠毒素LTIIb [MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA (SEQ ID NO.17)]、大肠杆菌DsbA[MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO.18)]、TolB [MKQALRVAFGFLILWASVLHA (SEQ IDNO.19)]或SipA [MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS (SEQ ID NO.20)]。在一个实施方案中，所述信号序列具有与SEQ ID NO.13-20具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个方面，所述信号序列具有与大肠杆菌鞭毛蛋白信号序列(FlgI) [MIKFLSALILLLVTTAAQA (SEQ ID NO.13)]具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。包含信号序列的示例性的修饰的ClfA序列是SEQ IDNO:5、11和26。

在一个实施方案中，在所述信号序列和所述成熟蛋白的序列的开始之间添加额外的氨基酸残基(例如，丝氨酸或丙氨酸)，如例如SEQ ID NO:5和11中。这样的残基具有导致前导序列的更有效切割的优点。

在一个方面，本发明的多肽包含与SEQ ID NO.3的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列(或由其组成)，所述氨基酸序列包含：氨基酸取代P116至S和Y118至A，D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)共有序列(其中X和Z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸(例如K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)或K-D-Q-N-A-T-K(SEQ ID NO.23))，且其中所述共有序列优选地取代氨基酸残基I337，在氨基酸序列的C-末端的6-His标签和任选地信号序列，优选地FlgL信号序列(SEQ ID NO:13))，在所述信号序列的N-末端，任选地随后是额外的丝氨酸残基。在一个实施方案中，本发明的修饰的ClfA蛋白具有与选自SEQ ID NO.10-12或SEQ ID NO.25-27的氨基酸序列具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了具有选自SEQ ID NO.10-12或SEQ ID NO.25-27的氨基酸序列的多肽。

本发明的一个进一步方面是编码本发明的多肽的多核苷酸。例如，编码多肽的多核苷酸，其具有的核苷酸序列编码具有与SEQ ID NO.10-12或25-26中的任一个具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。例如，编码多肽的多核苷酸，其具有编码具有SEQ ID NO.10-12或25-27中的任一种的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。包含这样的多核苷酸的载体是本发明的一个进一步方面。

缀合物

本发明还提供了包含本发明的多肽(或由其组成)的缀合物(例如生物缀合物)，其中所述多肽被连接、例如共价连接至抗原，优选多糖或寡糖抗原。

在一个实施方案中，所述缀合物包含这样的缀合物(例如生物缀合物)，其包含共价连接至抗原的本发明的多肽(或由其组成)，所述多肽具有与SEQ ID NO.4-12或25-27的序列具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述抗原(直接或通过接头)连接至所述多肽的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述多肽通过使用化学缀合方法可获得的化学键共价连接至所述抗原(即，所述缀合物通过化学缀合产生)。

在一个实施方案中，所述化学缀合方法选自碳二亚胺化学法、还原性胺化、氰化化学法(例如CDAP化学法)、马来酰亚胺化学法、酰肼化学法、酯化学法和N-羟基琥珀酰亚胺化学法。缀合物可以通过直接还原胺化方法进行制备，如US200710184072 (Hausdorff)、US4365170 (Jennings)和US 4673574 (Anderson)中描述的。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。或者，缀合方法可以依赖使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)的糖活化，以形成氰酸酯。此类缀合物在PCT公开申请WO 93/15760Uniformed Services University以及WO 95/08348和WO 96/29094中描述。还参见Chu C.等人 Infect. Immunity, 1983 245 256。

通常，在多肽上的以下类型的化学基团可以用于偶联/缀合：

A)羧基(例如经由天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接连接至糖上的氨基或用碳二亚胺化学法例如EDAC连接至接头上的氨基。

B)氨基(例如经由赖氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接连接至糖上的羧基或用碳二亚胺化学法例如EDAC连接至接头上的羧基。在另一个实施方案中，该基团直接连接至糖上由CDAP或CNBr活化的羟基或者连接至接头上的此类基团；连接至具有醛基的糖或接头；连接至具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头。

C)巯基(例如经由半胱氨酸)。在一个实施方案中，该基团由马来酰亚胺化学法连接至溴或氯乙酰化的糖或者接头。在一个实施方案中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。

D)羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方案中，该基团由用双重氮联苯胺活化/修饰。

E)咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方案中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。

F)胍基(例如经由精氨酸)。

G)吲哚基(例如经由色氨酸)。

在糖上，通常，以下基团能够用于偶联：OH、COOH或NH2。醛基能够在不同处理后生成，所述处理例如：高碘酸盐、酸水解、过氧化氢等。

直接偶联方法：

糖-OH + CNBr或CDAP -----> 氰酸酯 + NH2-蛋白 ----> 缀合物

糖-醛 + NH2-蛋白 ----> 希夫碱+ NaCNBH3 ----> 缀合物

糖-COOH + NH2-蛋白 + EDAC ----> 缀合物

糖-NH2 + COOH-蛋白 + EDAC ----> 缀合物。

经由间隔物(接头)的间接偶联方法：

糖-OH + CNBr或CDAP --->氰酸酯 + NH2----NH2 ---->糖----NH2 + COOH-蛋白 +EDAC -----> 缀合物

糖-OH + CNBr或CDAP ---->氰酸酯 + NH2-----SH ----->糖----SH + SH-蛋白(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得)----->糖-S-S-蛋白

糖-OH + CNBr或CDAP --->氰酸酯 + NH2----SH ------->糖----SH + 马来酰亚胺-蛋白(氨基的修饰)----> 缀合物

糖-OH + CNBr或CDAP --->氰酸酯 + NH2-----SH --->糖-SH + 卤代乙酰化-蛋白----> 缀合物

糖-COOH + EDAC + NH2-----NH2 --->糖------NH2 + EDAC + COOH-蛋白 ----> 缀合物

糖-COOH + EDAC+ NH2----SH ----->糖----SH + SH-蛋白(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得)----->糖-S-S-蛋白

糖-COOH + EDAC+ NH2----SH ----->糖----SH +马来酰亚胺-蛋白(氨基的修饰)----> 缀合物

糖-COOH + EDAC + NH2----SH --->糖-SH +卤代乙酰化-蛋白 ----> 缀合物

糖-醛 + NH2-----NH2 ---->糖---NH2 + EDAC + COOH-蛋白 ----> 缀合物

注：可以使用任何合适的碳二亚胺代替上述EDAC。

在一个实施方案中，抗原直接连接至所述多肽。

在一个实施方案中，抗原经由接头附接至所述多肽。任选地，接头选自具有4-12个碳原子的接头、双官能接头、在末端含有1或2个反应性氨基的接头、B-丙酰胺基、硝基苯基-乙胺、卤代酰基卤化物、6-氨基己酸和ADH。活化的糖因此可以与所述多肽上的氨基直接偶联或经由间隔物(接头)基团偶联。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺，以获得硫醇化多糖，其可以经由硫醚键偶联至修饰的ClfA，所述硫醚键在与马来酰亚胺活化的多肽(例如使用GMBS (4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯))或卤代乙酰化的多肽(例如使用SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯)或SIA (碘乙酸琥珀酰亚胺基酯)或SBAP (琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰胺)丙酸酯))反应后获得。在一个实施方案中，氰酸酯(任选通过CDAP化学法制备)与己二胺或ADH (己二酸二酰肼)偶联，并且经由在修饰的ClfA蛋白上的羧基，使用碳二亚胺(例如1-乙基-3-( 3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC或EDC))化学法，使氨基衍生的糖缀合至所述多肽。此类缀合物描述于PCT公开申请WO 93/15760 UniformedServices University以及WO 95/08348和WO 96/29094。

在一个实施方案中，与所述抗原连接的所述多肽上的氨基酸残基不是天冬酰胺残基，并且在这种情况下，缀合物通常通过化学缀合产生。在一个实施方案中，与所述抗原连接的多肽上的氨基酸残基选自：Ala、Arg、Asp、Cys、Gly、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。任选地，所述氨基酸是：含有末端胺基团的氨基酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸或色氨酸。任选地，所述抗原共价连接至所述多肽上的氨基酸，所述氨基酸选自：天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸。优选地，所述抗原连接至天冬酰胺残基。

在一个实施方案中，与所述抗原连接的所述多肽上的氨基酸残基不是D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列的一部分。在一个实施方案中，与所述抗原连接的所述多肽上的氨基酸残基不是D/E-X-N-Z-S/T (SEQ IDNO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列中的天冬酰胺残基。

或者，在另一个实施方案中，所述抗原与所述多肽上的氨基酸连接，所述氨基酸选自天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸(例如天冬酰胺)。在另一个实施方案中，与所述抗原连接的所述多肽上的氨基酸残基是天冬酰胺残基。在另一个实施方案中，与所述抗原连接的所述多肽上的氨基酸残基是D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列的一部分(例如D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列中的天冬酰胺)。

多糖抗原

在一个实施方案中，本发明的缀合物(例如生物缀合物)中的抗原之一是糖，诸如细菌荚膜糖、细菌脂多糖或细菌寡糖。在一个实施方案中，所述抗原是细菌荚膜糖。

所述糖可以选自：金黄色葡萄球菌5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、脑膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏菌血清群W荚膜糖(MenW)、流感嗜血杆菌(H. influenzae) b型荚膜糖(Hib)、B群链球菌I群荚膜糖、B群链球菌II群荚膜糖、B群链球菌III群荚膜糖、B群链球菌IV群荚膜糖、B群链球菌V群荚膜糖、来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的Vi糖、脑膜炎奈瑟氏菌 LPS (诸如L3和/或L2)、卡他莫拉菌(M. catarrhalis) LPS、流感嗜血杆菌LPS、志贺氏菌O-抗原、铜绿假单胞菌O-抗原、大肠杆菌O-抗原或肺炎链球菌荚膜多糖。

在一个实施方案中，所述抗原是来自金黄色葡萄球菌的细菌荚膜糖。来自金黄色葡萄球菌的细菌荚膜糖可以选自金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜糖。例如，所述抗原可以是来自血清型8的金黄色葡萄球菌荚膜糖。

在本发明的一个实施方案中，所述抗原是来自金黄色葡萄球菌的细菌荚膜糖的重复单元。在本发明的一个实施方案中，所述抗原包含来自金黄色葡萄球菌血清型5或8的细菌荚膜糖的重复单元。

在本发明的一个实施方案中，所述抗原包含来自金黄色葡萄球菌血清型8的细菌荚膜糖的重复单元。在本发明的一个实施方案中，所述抗原包含：

其中‘n’是任何整数，但优选如下所定义(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10)。

在本发明的一个实施方案中，所述抗原包含来自金黄色葡萄球菌血清型5的细菌荚膜糖的重复单元。在本发明的一个实施方案中，所述抗原包含：

在一个实施方案中，所述抗原是多糖或寡糖。在一个实施方案中，所述抗原包含两个或更多个单糖，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个单糖。在一个实施方案中，所述抗原是含有不超过20、15、12、10、9或8个单糖的寡糖。在一个实施方案中，所述抗原是含有不超过500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个单糖的寡糖。

宿主细胞

本发明还提供了宿主细胞，其包含：

i)一种或多种编码糖基转移酶的核酸；

ii)编码寡糖基转移酶的核酸；

iii)编码本发明的多肽的核酸；和任选地

iv)编码聚合酶的核酸(例如wzy)。

可用于产生本发明的生物缀合物的宿主细胞包括古生菌(archea)、原核宿主细胞和真核宿主细胞。用于产生本发明的生物缀合物的示例性原核宿主细胞不限于埃希氏杆菌物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

在一个实施方案中，用于产生本发明的生物缀合物的宿主细胞进行工程改造以包含异源性核酸，例如编码一种或多种载体蛋白的异源性核酸和/或编码一种或多种蛋白的异源性核酸(例如编码一种或多种蛋白的基因)。在一个具体实施方案中，可将编码参与糖基化途径(例如，原核和/或真核糖基化途径)的蛋白的异源性核酸引入本发明的宿主细胞中。此类核酸可编码蛋白，包括但不限于寡糖基转移酶、差向异构酶、翻转酶、聚合酶和/或糖基转移酶。可使用方法(诸如电穿孔、通过热休克的化学转化、天然转化、噬菌体转导和接合)将异源性核酸(例如，编码载体蛋白的核酸和/或编码其他蛋白(例如参与糖基化的蛋白)的核酸)引入本发明的宿主细胞中。在具体实施方案中，使用质粒将异源性核酸引入本发明的宿主细胞中，例如，通过质粒(例如表达载体)使异源性核酸表达于宿主细胞中。在另一个具体实施方案中，使用国际专利申请号PCT/EP2013/068737 (公开为WO 14/037585)中描述的插入方法将异源性核酸引入本发明的宿主细胞中。

因此，本发明还提供了宿主细胞，其包含：

i)一种或多种编码糖基转移酶的核酸；

ii)编码寡糖基转移酶的核酸；

iii)编码本发明的多肽的核酸；

iv)编码聚合酶的核酸(例如wzy)；和

vi)编码翻转酶的核酸(例如wxy)。

在一个实施方案中，可将额外修饰引入(例如，使用重组技术)本发明的宿主细胞中。例如，编码形成可能竞争或干扰糖基化途径(例如，竞争或干扰一种或多种重组引入宿主细胞中的参与糖基化的异源性基因)的部分的蛋白的宿主细胞核酸(例如基因)可在宿主细胞背景(基因组)中以使其失活/功能失调的方式缺失或修饰(即，缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能蛋白或无论如何不编码任何蛋白)。在一个实施方案中，当核酸从本发明的宿主细胞的基因组缺失时，其由所需序列(例如可用于糖蛋白产生的序列)代替。

可在宿主细胞中缺失(和在一些情况下被其他所需核酸序列代替)的示例性基因包括参与糖脂生物合成的宿主细胞的基因，诸如waaL(参见例如Feldman等人，2005, PNASUSA 102：3016-3021)、脂质A核心生物合成簇(waa)、半乳糖簇(gal)、阿拉伯糖簇(ara)、可拉酸(colonic acid)簇(wc)、荚膜多糖簇、十一异戊烯醇-焦磷酸酯生物合成基因(例如，uppS (焦磷酸十一异戊烯基酯合酶)、uppP (十一异戊烯基二磷酸酶))、Und-P再循环基因、参与核苷酸活化的糖生物合成的代谢酶、肠杆菌普通抗原簇和原噬菌体O抗原修饰簇(如gtrABS簇)。

这种修饰的原核宿主细胞包含编码能够产生包含与本发明的多肽附接的抗原(例如糖抗原)的生物缀合物的酶的核酸。此类宿主细胞可以天然地表达对糖抗原的产生特异性的核酸，或者可以制备宿主细胞以表达此类核酸，即在某些实施方案中，所述核酸对于宿主细胞是异源的。在某些实施方案中，对于糖抗原产生特异性的所述核酸中的一种或多种对于宿主细胞是异源的并且整合至宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码在蛋白的N-糖基化中有活性的额外酶的核酸，例如，本发明的宿主细胞进一步包含编码寡糖基转移酶的核酸和/或编码其他糖基转移酶的一种或多种核酸。

包含荚膜多糖基因簇的核酸序列可插入本发明的宿主细胞中。在一个具体实施方案中，插入本发明的宿主细胞中的荚膜多糖基因簇是来自以下的荚膜多糖基因簇：大肠杆菌菌株、葡萄球菌菌株(例如金黄色葡萄球菌)、链球菌菌株(例如肺炎链球菌、酿脓链球菌(S. pyrogenes)、无乳链球菌(S. agalacticae))或伯克霍尔德氏菌菌株(例如鼻疽伯克霍尔德氏菌(B mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B. pseudomallei)、泰国伯克霍尔德氏菌(B. thailandensis))。制备能够产生生物缀合物的此类宿主细胞的方法的公开内容可见于WO 06/119987、WO 09/104074、WO 11/62615、WO 11/138361、WO 14/57109、WO14/72405和WO16/20499。

在一个实施方案中，所述宿主细胞包含在宿主细胞中的质粒中编码修饰的ClfA蛋白的核酸。

糖基化机制

本发明的宿主细胞包含和/或可被修饰为包含这样的核酸，其编码能够产生杂合寡糖和/或多糖的遗传机制(例如，糖基转移酶、翻转酶、聚合酶和/或寡糖基转移酶)，以及能够将抗原与本发明的多肽连接的遗传机制。

金黄色葡萄球菌荚膜多糖通过保守途径组装在细菌膜载体脂质焦磷酸十一异戊烯基酯上，所述保守途径与革兰氏阴性细菌中的O多糖合成的聚合酶依赖性途径共享同源性。O抗原组装是通过将糖磷酸酯从DP-供体转移至磷酸十一异戊烯基酯而引发的。通过不同糖基转移酶的依次作用，脂质连接的O抗原在内膜的细胞质侧组装。然后将糖脂翻转至周质空间并聚合。通过用寡糖基转移酶PglB替代O抗原连接酶WaaL，可以将聚合的O抗原转移至蛋白载体而不是脂质A核心。

糖基转移酶

本发明的宿主细胞包含编码产生寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶的核酸。在一个实施方案中，所述重复单元在还原末端不包含己糖，且所述寡糖或多糖重复单元源自在还原末端包含己糖的供体寡糖或多糖重复单元。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞可以包含编码将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(UNnd-PP)上的糖基转移酶的核酸。在一个方面，所述将己糖单糖衍生物组装至Und-PP上的糖基转移酶与所述宿主细胞异源和/或与编码糖基转移酶的基因中的一种或多种异源。所述糖基转移酶可以源自例如埃希氏杆菌属物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种。在一个具体实施方案中，所述将己糖单糖衍生物组装至Und-PP上的糖基转移酶是wecA，任选地来自大肠杆菌(wecA可以将GlcNAc从UDP-GlcNAc组装至UndP上)。在一个实施方案中，所述己糖单糖选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖和甘露糖(例如半乳糖)。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞可以包含编码能够将单糖添加至组装在Und-PP上的己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶的核酸。在一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自鲍氏志贺氏菌(Shigella boyedii)的半乳糖基转移酶(wfeD)。在另一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)。在另一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)。Galf-转移酶，诸如wfdK和wbeY，可以将Galf (呋喃半乳糖)从UDP-Galf转移至-GlcNAc-P-P-十一异戊烯基。在另一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)和来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶的核酸。

在一个实施方案中，所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖添加至己糖单糖衍生物的糖基转移酶。示例性糖基转移酶包括半乳糖基转移酶(wciP)，例如来自大肠杆菌O21的wciP。

在一个实施方案中，所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将邻近于存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的单糖添加至存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的糖基转移酶。示例性糖基转移酶包括葡糖基转移酶(wciQ)，例如来自大肠杆菌O21的wciQ。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含糖基转移酶，其用于合成选自金黄色葡萄球菌CP5或CP8基因簇的寡糖或多糖的重复单元。在一个具体实施方案中，用于合成寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶来自金黄色葡萄球菌CP5基因簇。金黄色葡萄球菌CP5和CP8具有与铜绿假单胞菌O11抗原合成基因相似的结构，因此这些基因可以与大肠杆菌单糖合成基因组合以合成焦磷酸十一异戊烯基酯连接的由重复三糖单元组成的CP5或CP8聚合物。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含足以合成CP5或CP8糖的重复单元的糖基转移酶，其包含来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8的capH、capI、capJ和/或capK。任选地，本发明的宿主细胞还包含来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8的capD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capP。或者，本发明的宿主细胞还包含来自铜绿假单胞菌O11的wbjB、 wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz和/或wzx以及来自大肠杆菌O16的wecB、wecC。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含足以合成CP5糖的重复单元的糖基转移酶，其包含来自金黄色葡萄球菌CP5的capH、capI、capJ和/或capK。任选地，本发明的宿主细胞还包含来自金黄色葡萄球菌CP5的capD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capP。或者，本发明的宿主细胞还包含来自铜绿假单胞菌O11的wbjB、wbjC、wbjD、wbjE、 wbjF、wbjL、wbpM、wzz和/或wzx以及来自大肠杆菌O16的wecB、wecC。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶，其包含能够将存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖添加至己糖单糖衍生物的糖基转移酶。

寡糖基转移酶

N-连接的蛋白糖基化 -将碳水化合物分子添加至靶蛋白的多肽链中的天冬酰胺残基-是发生在真核生物的内质网中的最常见的翻译后修饰类型。该过程通过酶促的寡糖基转移酶复合体(OST)完成，所述寡糖基转移酶复合体(OST)负责将来自脂质载体(磷酸多萜醇)的预装配寡糖转移至在内质网中的新生蛋白保守序列Asn-X-Ser/Thr (其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)内的天冬酰胺残基。

已经显示，一种细菌，食物传染病原体空肠弯曲杆菌，也可以将其蛋白N-糖基化(Wacker等人. Science. 2002; 298(5599):1790-3)，这是由于其拥有其自身的糖基化机制的事实。负责该反应的机制由被称为“pgl”的簇编码(用于蛋白糖基化)。

可以将空肠弯曲杆菌糖基化机制转移至大肠杆菌，以允许由大肠杆菌细胞表达的重组蛋白的糖基化。先前的研究已表明如何生成可进行N-糖基化的大肠杆菌菌株(参见，例如，Wacker等人 Science. 2002; 298 (5599):1790-3; Nita-Lazar等人 Glycobiology.2005; 15(4):361-7; Feldman等人 Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(8):3016-21; Kowarik等人 EMBO J. 2006; 25(9):1957-66; Wacker等人.Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(18):7088-93; 国际专利申请公开号WO2003/074687、WO2006/119987、WO2009/104074和WO/2011/06261和WO2011/138361)。具有优化的特性的PglB突变体描述于WO2016/107818中。优选的突变体是PglB_{cuo N311V-K482R-D483H-A669V}，如实施例中所述。

寡糖基转移酶将脂质-连接的寡糖转移至包含N-糖基化共有基序(例如Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸)的新生多肽链的天冬酰胺残基(参见WO 2006/119987)。参见例如WO 2003/074687和WO 2006/119987，其公开内容以其整体通过引用并入本文。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸。编码寡糖基转移酶的核酸可对宿主细胞是天然的，或可使用遗传方法引入宿主细胞中，如上文所描述。在一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自弯曲杆菌(Campylobacter)的寡糖基转移酶。在另一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的寡糖基转移酶(即pglB；参见例如Wacker等人，2002, Science 298：1790-1793；还参见例如NCBI基因ID：3231775, UniProt登录号O86154)。在另一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)的寡糖基转移酶(参见例如NCBI基因ID：7410986)。

在一个具体实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列，其中编码寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲杆菌的pglB)的所述核酸序列整合至宿主细胞的基因组中。

在一个具体实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列，其中编码寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲杆菌的pglB)的所述核酸序列是质粒携带的。

在另一个具体实施方案中，本文提供了修饰的原核宿主细胞，其包含：(i)源自来自金黄色葡萄球菌的荚膜多糖簇的糖基转移酶，其中所述糖基转移酶被整合至所述宿主细胞的基因组中；(ii)编码寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲杆菌的pglB)的核酸，其中所述编码寡糖基转移酶的核酸是质粒携带的和/或被整合至宿主细胞的基因组中；和(iii)本发明的多肽，其中所述多肽是质粒携带的或被整合至宿主细胞的基因组中。还提供了制备修饰的原核宿主细胞的方法，其包括：(i)将源自来自金黄色葡萄球菌的荚膜多糖簇的糖基转移酶整合至所述宿主细胞的基因组中；(ii)将一种或多种编码寡糖基转移酶(例如空肠弯曲杆菌的pglB)的核酸整合至宿主细胞中，所述核酸是质粒携带的和/或整合至宿主细胞的基因组中；和(iii)将本发明的多肽整合至宿主细胞中，所述本发明的多肽是质粒携带的或整合至宿主细胞的基因组中。

在具体实施方案中是本发明的宿主细胞，其中宿主细胞的至少一个基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被编码寡糖基转移酶的核酸替代，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被空肠弯曲杆菌pglB替代。

聚合酶

在一个实施方案中，将聚合酶(例如wzy)引入本发明的宿主细胞(即，聚合酶与宿主细胞异源)。在一个实施方案中，所述聚合酶是细菌聚合酶。在一个实施方案中，所述聚合酶是荚膜多糖聚合酶(例如wzy)或O抗原聚合酶(例如wzy)。在一个实施方案中，所述聚合酶是荚膜多糖聚合酶(例如wzy)。

在一个实施方案中，将荚膜多糖生物合成途径的聚合酶引入本发明的宿主细胞。

在另一个具体实施方案中，将金黄色葡萄球菌的荚膜多糖生物合成途径的聚合酶引入本发明的宿主细胞。

在一个实施方案中，引入本发明的宿主细胞的聚合酶是来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8 (cap5J/cap8I)的荚膜多糖基因簇的wzy基因。在一个具体实施方案中，引入本发明的宿主细胞的聚合酶是来自CP8 (cap8I)的荚膜多糖基因簇的wzy基因。

在另一个具体实施方案中，所述聚合酶作为金黄色葡萄球菌荚膜多糖簇的一部分并入(例如插入其基因组中或表达该酶的质粒中)，其中所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖簇已被修饰以包含wzy聚合酶。

在一个具体实施方案中，将编码金黄色葡萄球菌wzy聚合酶的核酸序列插入本发明的宿主细胞中或由本发明的宿主细胞表达。因此，本发明的宿主细胞可以进一步包含金黄色葡萄球菌wzy聚合酶。

翻转酶

在一个实施方案中，将翻转酶(wzx或同源物)引入本发明的宿主细胞(即，翻转酶与宿主细胞异源)。因此，本发明的宿主细胞可以进一步包含翻转酶。在一个实施方案中，所述翻转酶是细菌翻转酶。翻转酶将野生型重复单元和/或其相应的工程改造(杂合)重复单元从胞浆转运至宿主细胞(例如大肠杆菌)的周质中。因此，本发明的宿主细胞可以包含编码翻转酶(wzx)的核酸。

在一个具体实施方案中，将荚膜多糖生物合成途径的翻转酶引入本发明的宿主细胞。

在另一个具体实施方案中，将金黄色葡萄球菌的荚膜多糖生物合成途径的翻转酶引入本发明的宿主细胞。在某些实施方案中，引入本发明的宿主细胞的翻转酶是来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8的荚膜多糖基因簇的capK基因。在一个具体实施方案中，引入本发明的宿主细胞的翻转酶是来自CP8的荚膜多糖基因簇的capK基因。

可以引入本发明的宿主细胞的其他翻转酶例如来自空肠弯曲杆菌(例如，pglK)。

修饰单糖的酶

辅助酶

在一个实施方案中，将编码一种或多种辅助酶的核酸引入本发明的宿主细胞中。因此，本发明的宿主细胞可以进一步包含这些辅助酶中的一种或多种。编码一种或多种辅助酶的此类核酸可以是质粒携带的或被整合至本发明的宿主细胞的基因组中。示例性辅助酶包括但不限于差向异构酶、支化酶、修饰酶(例如以添加胆碱、甘油磷酸酯、丙酮酸酯)、酰胺化酶、链长度调节酶、乙酰化酶、甲酰化酶、聚合酶。

在某些实施方案中，将能够修饰单糖的酶引入本发明的宿主细胞(即，能够修饰单糖的酶与宿主细胞异源)。此类酶包括例如差向异构酶和消旋酶。因此，本发明的宿主细胞可以进一步包含差向异构酶和/或消旋酶。

在一个实施方案中，所述差向异构酶和消旋酶来自细菌。在某些实施方案中，引入本发明的宿主细胞的差向异构酶和/或消旋酶来自埃希氏杆菌属(Escherichia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种。

在某些实施方案中，插入本发明的宿主细胞中的差向异构酶是国际专利申请公开号WO 2011/062615中描述的差向异构酶，其公开内容以其整体通过引用并入本文。在一个实施方案中，所述差向异构酶是由大肠杆菌菌株O157的Z3206基因编码的差向异构酶。参见例如WO 2011/062615和Rush等人，2009，The Journal of Biological Chemistry 285：1671-1680，其以其整体通过引用并入本文。在另一个实施方案中，所述差向异构酶是galE(UPD-半乳糖差向异构酶) Z3206，且galE将GlcNAc-P-P-十一异戊烯基转化为GalNAc-P-P-十一异戊烯基。在一个具体实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码差向异构酶的核酸序列，其中将所述编码差向异构酶的核酸序列整合至宿主细胞的基因组中。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞进一步包含突变酶，例如glf (UDP-吡喃半乳糖突变酶)。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞进一步包含RcsA(CP合成的活化剂)。RcsA是在大肠杆菌中合成可拉酸荚膜多糖所需的不稳定的正调节剂。

遗传背景

可用于生成本发明的宿主细胞的示例性宿主细胞包括但不限于埃希氏杆菌属(Escherichia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种。在一个具体实施方案中，本文使用的宿主细胞是大肠杆菌。

在一个实施方案中，通过例如缺失一个或多个基因来修饰宿主细胞遗传背景。可在宿主细胞中缺失(和在一些情况下被其他所需核酸序列代替)的示例性基因包括参与糖脂生物合成的宿主细胞的基因，诸如waaL(参见例如Feldman等人，2005, PNAS USA 102：3016-3021)、O抗原簇(rfb或wb)、肠杆菌共同抗原簇(wec)、脂质A核心生物合成簇(waa)和原噬菌体O抗原修饰簇(如gtrABS簇)。在一个具体实施方案中，将waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因中的一个或多个或来自wec簇的一个或多个基因或来自rfb基因簇的一个或多个基因从本发明的原核宿主细胞的基因组缺失或功能失活。在一个实施方案中，本文使用的宿主细胞是大肠杆菌，其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因从宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。在另一个实施方案中，本文使用的宿主细胞是大肠杆菌，其中waaL基因和gtrS基因从宿主细胞的基因组缺失或功能失活。在另一个实施方案中，本文使用的宿主细胞是大肠杆菌，其中waaL基因和来自wec簇的基因从宿主细胞的基因组缺失或功能失活。

生物缀合物

本发明的宿主细胞可用于产生生物缀合物，其包含与本发明的多肽连接的抗原、诸如多糖或寡糖抗原，例如金黄色葡萄球菌糖抗原。使用宿主细胞产生生物缀合物的方法例如描述于WO 2003/074687、WO 2006/119987和WO2011/138361中。如本文描述的生物缀合物具有优于抗原-载体蛋白的化学缀合物的有利特性，因为它们在制造中需要更少化学品且在生成的最终产物方面更一致。

在一个实施方案中，本文提供了生物缀合物，其包含与金黄色葡萄球菌抗原连接的多肽。在一个具体实施方案中，所述金黄色葡萄球菌抗原是荚膜糖(例如荚膜多糖)。在一个具体实施方案中，本文提供了生物缀合物，其包含本发明的多肽和选自金黄色葡萄球菌血清型CP5或CP8的荚膜糖(例如荚膜多糖)的抗原。在一个具体实施方案中，本文提供了生物缀合物，其包含本发明的多肽和来自金黄色葡萄球菌血清型CP8的荚膜糖(例如荚膜多糖)的抗原。

本发明的生物缀合物例如通过色谱法(例如离子交换、阳离子交换、阴离子交换、亲和力和大小分级柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白的标准技术来纯化。参见例如，Saraswat 等人, 2013, Biomed.Res.Int. ID#312709 (p. 1-18)；还参见WO 2009/104074中描述的方法。此外，生物缀合物可以与本文所述的或本领域以其他方式已知的异源多肽序列融合以促进纯化。例如，ClfA蛋白可并入肽标签，诸如六组氨酸标签，用于通过阳离子交换进行纯化。用于纯化特定生物缀合物的实际条件将部分取决于合成策略和因素诸如生物缀合物的净电荷、疏水性和/或亲水性，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

本发明的一个进一步方面是用于产生生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含与糖连接的多肽(或由其组成)，所述方法包括(i)在适合于产生蛋白的条件下(和任选地在适合于产生糖的条件下)培养本发明的宿主细胞，和(ii)分离由所述宿主细胞产生的生物缀合物。

本发明的一个进一步方面是通过本发明的方法产生的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与多肽连接的糖。

分析方法

可以使用各种方法来分析本发明的生物缀合物的结构组成和糖链长度。

在一个实施方案中，肼解可用于分析聚糖。首先，根据制造商的说明书(LudgerLiberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK)，通过与肼一起孵育，使多糖从其蛋白载体释放。亲核试剂肼攻击多糖和载体蛋白之间的糖苷键，并且允许释放所附接的聚糖。在该处理期间N-乙酰基团丢失并且必须通过重新N-乙酰化来重构。游离聚糖在碳柱上纯化并随后用荧光团2-氨基苯甲酰胺在还原末端进行标记。参见Bigge JC,Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB:Nonselective andefficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide andanthranilic acid.Anal Biochem 1995, 230(2):229-238。根据Royle等人的HPLC方案在GlycoSep-N 柱(GL Sciences)上分离标记的多糖。参见Royle L, Mattu TS, Hart E,Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM:An analyticaland structural database provides a strategy for sequencing O-glycans frommicrogram quantities of glycoproteins.Anal Biochem 2002, 304(1):70-90。所得的荧光色谱图表明多糖的长度和重复单元的数目。可以通过收集单独的峰并随后进行MS /MS分析来收集结构信息。因此可以确定重复单元的单糖组成和序列，并且另外可以鉴定多糖组合物的同质性。

在另一个实施方案中，可以使用SDS-PAGE或毛细管凝胶电泳来评价聚糖和生物缀合物。O抗原聚糖的聚合物长度由线性组装的重复单元的数目限定。这意味着典型的类似梯形的模式是构成聚糖的不同重复单元数目的结果。因此，SDS PAGE或按大小分开的其他技术中的彼此相邻的两个条带仅通过单个重复单元而不同。在分析糖蛋白的聚糖大小时发现了这些离散差异：非糖基化载体蛋白和具有不同聚合物链长度的生物缀合物根据其电泳迁移率分离。测量生物缀合物上存在的第一可检测重复单元数(n₁)和平均重复单元数(n_平均)。这些参数可用于证明批次间一致性或多糖稳定性。

在另一个实施方案中，可以应用高质量MS和大小排阻HPLC来测量完整生物缀合物的大小。

在另一个实施方案中，可以使用蒽酮 - 硫酸测定法来测量多糖产率。参见LeyvaA, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC:Rapid andsensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantifycarbohydrate in biopharmaceutical products: method development andvalidation.Biologicals : journal of the International Association ofBiological Standardization 2008, 36(2):134-141。在另一个实施方案中，可以使用甲基戊糖测定法来测量多糖产率。参见例如，Dische等人, J Biol Chem.1948 Sep；175(2):595-603。

糖基化位点使用的变化

为了显示特定蛋白中的位点使用相对于插入系统，在多重质粒系统中被改变，必须定量糖基化位点的使用。在下文列出了如此做的方法。

糖肽LC-MS / MS：用蛋白酶消化生物缀合物，并通过合适的色谱方法(C18，亲水性相互作用HPLC HILIC，GlycoSepN柱，SE HPLC，AE HPLC)分离肽，并使用MS / MS鉴定不同的肽。这种方法可以与或不与通过化学(史密斯降解)或酶促方法预先缩短糖链一起使用。使用在215-280nm处的UV检测对糖肽峰进行定量允许相对测定糖基化位点的使用。

大小排阻HPLC：较高的糖基化位点使用由从SE HPLC柱的较早的洗脱时间所反映。

同质性

可以使用测量聚糖长度和流体动力学半径的方法评估生物缀合物同质性(即，所附接的糖残基的同质性)。

分析方法

产率. 将产率测量为在控制和优化的条件下从在生物反应器中生长的1升细菌生产培养物衍生的碳水化合物量。纯化生物缀合物后，碳水化合物产率可以通过蒽酮测定或使用碳水化合物特异性抗血清的ELISA直接测量。间接测量是可以的，这通过使用蛋白量(通过BCA、Lowry或Bardford测定测量)和聚糖长度和结构来计算每克蛋白的理论碳水化合物量。另外，还可以通过从挥发性缓冲液中干燥糖蛋白制剂并使用天平来测量重量来测量产率。

稳定性 蛋白或糖缀合物稳定性可以通过检测降解产物的产生的SDS-PAGE和/或Western印迹来测定或通过CD、质谱法或本领域中已知的其他方法来测定。稳定性可以在生产后直接测定，或者在例如4、10、20或高于30摄氏度储存1、2、3、4或更多周，1、2、3、4、5、6或更多个月后测定。

同质性. 同质性意指聚糖长度的可变性和可能的糖基化位点的数目。上面列出的方法可用于此目的。SE-HPLC允许测量流体动力学半径。与具有较少糖基化位点的载体相比，载体中更高数目的糖基化位点导致流体动力学半径变化更大。然而，当分析单个聚糖链时，由于更受控的长度，它们可能更同质。聚糖长度通过肼解、SDS PAGE和CGE测量。此外，同质性也可能意味着某些糖基化位点的使用模式变为更宽/更窄的范围。这些因素可以通过糖肽LC-MS/MS来测量。

菌株稳定性和再现性. 在没有选择压力的情况下细菌发酵期间的菌株稳定性通过直接和间接方法测量，所述方法证实生产培养细胞中存在或不存在重组DNA。培养体积的影响可以通过延长的培养时间(其意味着增加世代时间)来模拟。发酵的世代越多，重组元件丢失的可能性就越大。重组元件的丢失被认为是不稳定。间接方法依赖于选择盒与重组DNA的缔合，例如质粒中的抗生素抗性盒。将生产培养细胞铺板在选择性培养基上，例如，补充有与选择系统相关的抗生素或其他化学品的LB板，并且抗性菌落被认为对于与相应选择化学品相关的重组DNA是阳性的。在多质粒系统的情况下，将多种抗生素的抗性菌落计数，并且含有所有三种抗性的细胞部分被认为是稳定群体。或者，可以使用定量PCR在存在、不存在选择的情况下和在发酵的不同时间点测量三种重组元件的重组DNA的量。因此，测量并比较重组DNA的相对量和绝对量。生产过程的再现性通过本申请中所述方法对一致性批次的完整分析来测量。

免疫原性组合物

本发明的多肽和缀合物(例如生物缀合物)特别适合于包含在免疫原性组合物和疫苗中。本发明提供了包含本发明的多肽、本发明的缀合物或本发明的生物缀合物的免疫原性组合物。

还提供了制备本发明的免疫原性组合物的方法，其包括将本发明的多肽或缀合物(例如生物缀合物)与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。

免疫原性组合物包含免疫有效量的本发明的多肽或缀合物(例如生物缀合物)以及任何其他组分。“免疫有效量”是指将该量作为单一剂量或作为系列的一部分施用给个体对治疗或预防有效。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、所需保护程度、疫苗配制和其他相关因素而不同。预计该量将落入可以通过常规试验确定的相对宽的范围。

本发明的免疫原性组合物还可以含有稀释剂、诸如水、盐水、甘油等。另外，可以存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、多元醇等。

包含本发明的多肽或缀合物(或生物缀合物)的免疫原性组合物可包含适用于药物施用的任何额外组分。在具体实施方案中，本发明的免疫原性组合物是单价制剂。在其他实施方案中，本发明的免疫原性组合物是多价制剂，例如二价、三价和四价制剂。例如，多价制剂包含多于一种抗原，例如多于一种生物缀合物。

本发明的免疫原性组合物任选地进一步包含额外抗原。此类额外抗原的实例是金黄色葡萄球菌蛋白或荚膜多糖。

疫苗

本发明还提供了包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体的疫苗。

药学上可接受的赋形剂和载体可以由本领域技术人员选择。例如，所述药学上可接受的赋形剂或载体可以包括缓冲剂，诸如Tris(三甲胺)，磷酸盐(例如磷酸钠)，乙酸盐，硼酸盐(例如硼酸钠)，柠檬酸盐，甘氨酸，组氨酸和琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)，合适地，氯化钠，组氨酸，磷酸钠或琥珀酸钠。所述药学上可接受的赋形剂可以包括盐，例如氯化钠、氯化钾或氯化镁。任选地，所述药学上可接受的赋形剂包含至少一种稳定溶解度和/或稳定性的组分。增溶剂/稳定剂的实例包括去污剂，例如月桂肌氨酸和/或聚山梨醇酯(例如TWEEN^TM80)。稳定剂的实例还包括泊洛沙姆(例如泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407)。所述药学上可接受的赋形剂可以包括非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80 (TWEEN^TM 80)、聚山梨醇酯-60 (TWEEN^TM60)、聚山梨醇酯-40 (TWEEN^TM 40)和聚山梨醇酯-20 (TWEEN^TM 20)或聚氧乙烯烷基醚(适合地，聚山梨醇酯-80)。替代的增溶剂/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成的多元醇(诸如蔗糖、海藻糖等)。药物赋形剂可以是防腐剂，例如苯酚、2-苯氧基乙醇或硫柳汞。其他药学上可接受的赋形剂包括糖(例如乳糖、蔗糖)和蛋白(例如明胶和白蛋白)。药学上可接受的载体包括水、盐水溶液、水性右旋糖和甘油溶液。许多药学上可接受的赋形剂和载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co.Easton, PA, 第5版 (975)。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗额外包含一种或多种缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂和/或蔗糖磷酸盐谷氨酸盐缓冲剂。在其他实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗不包含缓冲剂。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗额外包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸钾铝)或此类铝盐的混合物)。在其他实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗不包含盐。

本发明的免疫原性组合物或疫苗可以额外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一个具体实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗包含0.001%至0.01%硫柳汞。在其他实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗不包含防腐剂。

本发明的疫苗或免疫原性组合物还可以包含抗微生物剂，通常当以多剂量形式包装时。例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗可以包含2-苯氧基乙醇。

本发明的疫苗或免疫原性组合物还可以包含去污剂，例如聚山梨醇酯，诸如TWEEN^TM 80。去污剂通常以低水平(例如<0.01%)存在，但已经提出更高水平用于稳定抗原制剂，例如最高达10%。

本发明的免疫原性组合物可与施用说明一起包括于容器、包装或分配器中。

可在使用之前储存本发明的免疫原性组合物或疫苗，例如，组合物可冷冻(例如在约-20℃下或在约-70℃下)储存；储存于冷藏条件下(例如在约4℃)；或储存在室温。

本发明的免疫原性组合物或疫苗可以储存于溶液中或者是冷冻干燥的。在一个实施方案中，将溶液在糖、诸如蔗糖、海藻糖或乳糖存在的情况下冻干。在另一个实施方案中，将本发明的疫苗冻干并在使用前临时重构。

疫苗制剂通常描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvant approach”(编辑Powell M.F. & Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)。Fullerton, 美国专利4,235,877描述了脂质体内的包封。

佐剂

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗包含佐剂，或与佐剂组合施用。与本发明的免疫原性组合物或疫苗组合施用的佐剂可在施用所述免疫原性组合物或疫苗之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，术语"佐剂"是指如下化合物：其当与本发明的免疫原性组合物或疫苗结合或作为其一部分施用时，增加、增强和/或加强对生物缀合物的免疫应答，但当单独施用化合物时，不生成对多肽/缀合物/生物缀合物的免疫应答。在一些实施方案中，佐剂生成对多肽、缀合物或生物缀合物的免疫应答且不产生过敏或其他不良反应。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗是佐剂化的。佐剂可通过几种机制增强免疫应答，包括，例如，淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞和刺激巨噬细胞。佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)(参见英国专利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS01 (GlaxoSmithKline)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(TWEEN^TM 80；ICLAmericas, Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857，公开为国际公开号WO2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858，公开为国际公开号WO2007/109813)和皂苷诸如QS21(参见Kensil等人，Vaccine Design：TheSubunit and Adjuvant Approach (Powell和Newman编辑，Plenum Press, NY, 1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其他佐剂是任选地与免疫刺激剂(诸如单磷酰基脂质A)组合的水包油型乳液(诸如角鲨烯或花生油)(参见Stoute等人，N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997))。另一佐剂是CpG(BioworldToday, Nov. 15, 1998)。

在本发明的一个方面，所述佐剂是铝盐、诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝。

在本发明的另一个方面，将佐剂选择为TH1或TH2型应答的优先诱导物。高水平的Th1类型细胞因子趋于促进诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2类型细胞因子趋于促进诱导针对抗原的体液免疫应答。重要的是要记住，Th1和Th2型免疫反应的区别并不是绝对的。事实上，个体将支持被描述为主要是Th1或主要是Th2的免疫应答。然而，通常方便的是考虑根据由Mosmann和Coffman在鼠 CD4 +ve T细胞克隆中所述的细胞因子家族(Mosmann, T.R.和Coffman, R.L.(1989) TH1 and TH2 cells: differentpatterns of lymphokine secretion lead to different functionalproperties.Annual Review of Immunology, 7, p145-173)。常规上，Th1型应答与由T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子相关。其他通常与Th1型免疫应答的诱导直接相关的细胞因子不是由T细胞产生的，诸如IL-12。相反，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。促进主要是Th1应答的合适的佐剂系统包括：单磷酰脂质A或其衍生物，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(对于其制备参见GB 2220211 A)；MPL，例如脂质体中的3D-MPL和皂苷QS21，例如包含胆固醇和DPOC的脂质体；和单磷酰脂质A，例如3-脱-O-酰化单磷酰脂质A、连同铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳剂的组合。在此类组合中，抗原和3D-MPL包含在相同的微粒结构中，允许更有效递送抗原和免疫刺激性信号。研究已显示3D-MPL能够进一步增强明矾吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等人Vaccine (1998) 16:708-14；EP 689454-B1]。含未甲基化的CpG寡核苷酸(WO 96/02555)也是TH1应答的优先诱导物，并且适用于本发明。

本发明的疫苗或免疫原性组合物可含有水包油乳剂，因为这些已被认为可用作佐剂组合物(EP 399843；WO 95/17210)。可以使用水包油乳剂诸如WO95/17210 (其公开了包含2-10%角鲨烯、2-10%α生育酚和0.3-3% tween 80，且其单独使用或与QS21和/或3D-MPL组合使用)、 WO99/12565 (其公开了包含可代谢油、角鲨烯和甾醇和MPL的水包油乳剂组合物)或WO99/11241中描述的那些。另外的水包油乳剂、诸如WO 09/127676和WO 09/127677中公开的那些也是合适的。在一个具体实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗额外包含皂苷，例如QS21。所述免疫原性组合物或疫苗还可以包含水包油乳剂和生育酚(WO 95/17210)。

施用方法

本发明的免疫原性组合物或疫苗可以用于通过经由全身性或粘膜途径施用所述免疫原性组合物或疫苗来保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些施用可以包括经由肌肉内(IM)、腹膜内、皮内(ID)或皮下途径注射；或经由向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的粘膜施用。例如，鼻内(IN)施用可用于治疗肺炎或中耳炎(由于肺炎球菌的鼻咽运送可以被更有效地预防，因此在它最早阶段减弱感染)。尽管本发明的免疫原性组合物或疫苗可以作为单次剂量施用，但其组分也可以同时或在不同时间一起共施用(例如肺炎球菌多糖可分开施用，同时施用，或在施用疫苗的任何细菌蛋白组分之后1 - 2周施用，用于彼此之间免疫应答的最佳协调)。对于共同施用，任选的Th1佐剂可以存在于任何或所有不同的施用中，然而，在本发明的一个具体方面，其与所述免疫原性组合物或疫苗的多肽组分组合存在。除了施用的单一途径以外，可以使用2种不同的施用途径。例如，多糖可以IM(或ID)施用，并且细菌蛋白可以IN(或ID)施用。此外，本发明的疫苗可以IM施用为致敏剂量并且IN施用为加强剂量。

在一个方面，本发明的免疫原性组合物或疫苗通过肌肉内递送途径进行施用。肌肉内施用可以是对于大腿或上臂。注射通常经由针(例如皮下注射针)，但可替代地可以使用无针注射。典型肌肉内剂量为0.5 ml。

在另一个方面，本发明的免疫原性组合物或疫苗通过皮内施用进行施用。人皮肤包含外部“角质”表皮，称为角质层，其覆盖表皮。在该表皮下的是称为真皮的层，其进而覆盖皮下组织。常规皮内注射技术，“芒图(mantoux)操作”包括以下步骤：清洁皮肤，且随后伸出一只手，且使小号针(narrow gauge needle)(26-31号)的斜面朝上，以10-15°的角度将针插入。一旦针斜面被插入后，针筒下降，并且在提供轻微压力时进一步推进，以使其在皮肤下抬起。然后将液体非常缓慢地注入，从而在皮肤表面上形成包或隆起，随后缓慢抽出针。

更近来，专门设计为将液体试剂施用到皮肤内或跨越皮肤的装置已得到描述，例如WO 99/34850和EP 1092444中所述的装置，以及例如WO 01/13977；US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US5,064,413、US 5,520、639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO97/37705和WO 97/13537中所述的射流注射装置。疫苗制剂的可替代皮内施用方法可以包括常规注射器和针，或设计用于固体疫苗的弹道递送的装置(WO 99/27961)，或经皮贴剂(WO 97/48440；WO98/28037)；或应用于皮肤的表面(经皮或经皮肤递送WO98/20734；WO98/28037)。

在另一个方面，本发明的免疫原性组合物或疫苗通过鼻内施用进行施用。通常，所述免疫原性组合物或疫苗局部施用于鼻咽区域，例如而不吸入肺内。期望使用鼻内递送装置，其将所述免疫原性组合物或疫苗制剂递送至鼻咽区域，而不使其进入肺或基本上不使其进入肺。用于根据本发明的疫苗的鼻内施用的合适的装置是喷雾装置。合适的商购可得的鼻喷雾装置包括ACCUSPRAY™ (Becton Dickinson)。

在一个实施方案中，用于鼻内使用的喷雾装置是装置的表现不依赖于由用户施加的压力的装置。这些装置被称为压力阈值装置。仅在施加阈值压时，液体从喷嘴中释放。这些装置使得更容易实现具有常规小滴大小的喷雾。适合与本发明一起使用的压力阈值装置是本领域中已知的，并且例如描述于通过引用并入本文的WO91/13281以及EP311 863和EP516636。此类装置从Pfeiffer GmbH商购可得，并且也描述于Bommer，R. PharmaceuticalTechnology Europe，Sept 1999。

在另一个实施方案中，鼻内装置产生在1 - 200 µm例如10 - 120 µm范围内的小滴(使用水作为液体测量的)。低于10 µm，存在吸入的危险，因此，期望具有不多于约5%的低于10 µm的小滴。高于120 µm的小滴不如更小的小滴那样良好扩散，因此期望具有不多于约5%的超过120 µm的小滴。

在初始接种疫苗后，受试者可以接受足够间隔开的一次或几次加强免疫。

本发明的免疫原性组合物或疫苗可以用于通过经由全身性或粘膜途径施用所述免疫原性组合物或疫苗的方式，来保护或治疗易于感染的哺乳动物(例如人)。这些施用可以包括经由肌肉内(IM)、腹膜内(IP)、皮内(ID)或皮下(SC)途径注射；或经由向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的粘膜施用。尽管本发明的疫苗可以作为单次剂量施用，但其组分也可以同时或在不同时间一起共施用(例如肺炎链球菌糖缀合物可分开施用，同时施用，或在施用本发明的任何多肽、缀合物或生物缀合物之后1 - 2周施用，用于彼此之间免疫应答的最佳协调)。对于共同施用，任选的佐剂可以存在于任何或所有不同的施用中。除了施用的单一途径以外，可以使用2种不同的施用途径。例如，多糖缀合物可以IM(或ID)施用，并且本发明的多肽、缀合物或生物缀合物可以IN(或ID)施用。此外，本发明的免疫原性组合物或疫苗可以IM施用为致敏剂量并且IN施用为加强剂量。

剂量

选择每种免疫原性组合物或疫苗剂量中缀合物抗原的量为在典型疫苗中诱导免疫保护应答而不具有明显的不良副作用的量。此类量将根据使用的具体免疫原以及它如何呈现而不同。多肽的含量将通常在1-100μg、合适地5-50μg的范围内。糖的含量将通常在0.1-10μg、合适地1-5μg的范围内。

适合于人使用的按体积计的剂量通常为0.25至1.5ml，尽管对于向皮肤施用，可以使用0.05 ml至0.2 ml的较低体积。在一个实施方案中，人剂量是0.5 ml。在一个进一步实施方案中，人剂量高于0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在一个进一步实施方案中，人剂量是1 ml - 1.5 ml。在另一个实施方案中，特别当免疫原性组合物用于儿科群体时，人剂量可以小于0.5 ml，诸如0.25 - 0.5 ml。

预防和治疗用途

本发明还提供了治疗和/或预防受试者的细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用本发明的多肽、缀合物或生物缀合物。所述多肽、缀合物或生物缀合物可以呈免疫原性组合物或疫苗的形式。在一个具体实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗用于预防细菌感染受试者(例如人受试者)。可以使用本发明的多肽、缀合物或生物缀合物治疗和/或预防的细菌感染包括由以下引起的那些：葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、埃希氏杆菌属(Escherichia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种。在一个具体实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗用于治疗或预防葡萄球菌属物种(例如金黄色葡萄球菌)的感染。

本文还提供了诱导受试者中针对细菌的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本发明的多肽、缀合物或生物缀合物(或免疫原性组合物或疫苗)。在一个实施方案中，所述受试者在施用时具有细菌感染。在另一个实施方案中，所述受试者在施用时不具有细菌感染。本发明的多肽、缀合物或生物缀合物可用于诱导针对以下的免疫应答：葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、埃希氏杆菌属(Escherichia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种。在一个具体实施方案中，本发明的多肽或缀合物或生物缀合物用于诱导针对葡萄球菌属物种(例如金黄色葡萄球菌)的免疫应答。

本文还提供了诱导受试者中针对细菌的调理吞噬性抗体的产生的方法，其包括向所述受试者施用本发明的多肽、缀合物或生物缀合物(或免疫原性组合物或疫苗)。在一个实施方案中，所述受试者在施用时具有细菌感染。在另一个实施方案中，所述受试者在施用时不具有细菌感染。本文提供的本发明的多肽或缀合物或生物缀合物(或免疫原性组合物或疫苗)可用于诱导针对以下的调理吞噬性抗体的产生：葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、埃希氏杆菌属(Escherichia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种。在一个具体实施方案中，本发明的多肽或缀合物或生物缀合物(或免疫原性组合物或疫苗)用于诱导针对葡萄球菌属物种(例如金黄色葡萄球菌)的调理吞噬性抗体的产生。

例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗可用于针对金黄色葡萄球菌感染(包括医院感染)进行预防。更具体地，可以针对皮肤感染、肺炎、脑膜炎、骨髓炎心内膜炎、中毒性休克综合征和/或败血症，保护所述受试者。本发明还可用于针对受试者的骨骼和关节的金黄色葡萄球菌感染进行预防(且因此用于预防病症，包括但不限于骨髓炎、败血性关节炎和假体关节感染)。在许多情况下，这些病症可能与金黄色葡萄球菌生物膜的形成相关。

金黄色葡萄球菌感染各种哺乳动物(包括牛、狗、马和猪)，但用于本发明使用的优选的哺乳动物是人。该人可以是儿童(例如，幼儿或婴儿)、青少年或成人。在一些实施方案中，该人可以具有假体骨骼或关节，或者可以是等待选择性手术的患者，特别是假体骨骼或关节的预期接受者(例如，术前整形手术的患者)。然而，所述疫苗不仅仅适用于这些组，并且可以更广泛地用于人群中。

本发明的疫苗制剂可以用于通过经由全身性或粘膜途径施用所述疫苗来保护或治疗易于金黄色葡萄球菌感染的人。这些施用可以包括经由肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经由向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的粘膜施用。

在一个实施方案中，本发明是通过施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗(儿科疫苗)，来引发婴儿(在本发明的上下文中定义为0-2岁)中的免疫应答的改进方法。在一个实施方案中，所述疫苗是儿科疫苗。

在一个实施方案中，本发明是通过施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗来引发老年人群(在本发明的上下文中，如果患者是50岁或超过50岁，通常超过55岁，且更通常超过60岁，则他们被认为是老年人)中的免疫应答的改进方法。在一个实施方案中，所述疫苗是老年人的疫苗。

本发明提供了用于治疗或预防有此需要的受试者中的金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物或本发明的免疫原性组合物或疫苗。

本发明提供了针对金黄色葡萄球菌感染免疫人宿主的方法，其包括向所述宿主施用免疫保护剂量的本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物或本发明的免疫原性组合物或疫苗。

本发明提供了诱导受试者中对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物或本发明的免疫原性组合物或疫苗。

本发明提供了本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物或本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。

本发明提供了本发明的多肽或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。

由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病可以是例如皮肤感染，肺炎，脑膜炎，受试者的骨骼和关节的金黄色葡萄球菌感染(例如败血性关节炎、假肢关节感染或骨髓炎)，心内膜炎，中毒性休克综合征和/或败血病。所述疾病可以是医院感染。

在本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请都通过引用并入本文。

本发明的各方面概述于子序列编号的段落中：

1. 多肽，其包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，所述多肽被修饰，其中所述氨基酸序列包含一个或多个选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ IDNO.22)的共有序列，其中X和Z独立地是除了脯氨酸以外的任何氨基酸；其中所述共有序列添加在SEQ ID NO:3的氨基酸残基313-340之间或在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列内的等同位置，或取代在SEQ ID NO:3的氨基酸残基313-340之间或在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列内的等同位置处的一个或多个氨基酸。

2. 段落1的多肽，其中所述共有序列已经取代SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329、P331或I337，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329或I337等同的氨基酸位置处取代。

3. 段落2的多肽，其含有单个共有序列，所述单个共有序列已经取代SEQ ID NO.3中的氨基酸残基I337，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基I337等同的氨基酸位置处取代。

4. 段落1-3中任一项的多肽，其中X是Q(谷氨酰胺)且Z是A(丙氨酸)(例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))。

5. 段落1-4中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列进一步通过相对于SEQ IDNO.3的氨基酸序列(或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中的等同位置)，选自P116至S和Y118至A的至少一个氨基酸取代来修饰，其任选地包含SEQ ID NO 4-5或10-12中的任一者的序列。

6. 根据段落5所述的多肽，其包含与SEQ ID NO.3的序列具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列(或由其组成)，所述氨基酸序列包含D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)或K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列，其中X和Z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸，所述共有序列取代SEQ ID NO. 3中的位置I337处的氨基酸，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329或I337等同的氨基酸位置处取代。

7. 段落1-6中任一项的多肽，其具有N-末端的额外的丝氨酸残基，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.12具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列；和/或C-末端的额外的甘氨酸或甘氨酸-丝氨酸残基，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO:32具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

8. 段落1-7中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列进一步包含能够将所述多肽引导至宿主细胞(例如细菌)的周质的信号序列，任选地所述信号序列选自SEQ ID NO.13-20，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

9. 段落1-8中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列进一步包含可用于纯化所述ClfA蛋白的肽标签，任选地所述肽标签包含六个组氨酸残基，且任选地，所述肽标签位于所述氨基酸序列的C-末端，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

10. 段落1-9中任一项的多肽，其中所述多肽是糖基化的。

11.缀合物(例如生物缀合物)，其包含段落1-10中任一项的多肽，其中所述多肽被连接至抗原，例如多糖或寡糖抗原。

12.根据段落11所述的缀合物，其中所述缀合物通过使用化学缀合方法可获得的化学键直接或经由接头与所述抗原共价连接，所述化学缀合方法任选地选自碳二亚胺化学法、还原性胺化、氰化化学法(例如CDAP化学法)、马来酰亚胺化学法、酰肼化学法、酯化学法和N-羟基琥珀酰亚胺化学法。

13.段落11或段落12的缀合物(例如生物缀合物)，其中所述抗原与所述多肽上的氨基酸连接，所述氨基酸选自天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸(例如天冬酰胺)。

14.段落11-13中任一项的缀合物(例如生物缀合物)，其中所述抗原是糖，任选地细菌荚膜糖(例如来自金黄色葡萄球菌)，其任选地选自金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜糖。

15.段落14的缀合物(例如生物缀合物)，其中所述抗原是来自金黄色葡萄球菌血清型8的细菌荚膜糖。

16.多核苷酸，其编码段落1-10中任一项的多肽。

17.载体，其包含段落16的多核苷酸。

18.宿主细胞，其包含：

一种或多种编码糖基转移酶的核酸；

编码寡糖基转移酶的核酸；

编码根据段落1-10中任一项所述的多肽的核酸；和任选地

编码聚合酶的核酸(例如wzy)。

19.段落18的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(a)将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(Und-PP)上的糖基转移酶和(b)能够将单糖添加至组装在Und-PP上的己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶。

20.段落19的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至Und-PP上的糖基转移酶与所述宿主细胞异源和/或与编码糖基转移酶的基因中的一种或多种异源，任选地其中所述将己糖单糖衍生物组装至Und-PP上的糖基转移酶来自埃希氏杆菌属物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种，任选地是wecA(例如，来自大肠杆菌的wecA)。

21.段落18-20中任一项的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物是其中C-2位置被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)或N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。

22.段落18-21中任一项的宿主细胞，其中所述能够将单糖添加至组装在Und-PP上的所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)或来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)，或者是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)和来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)。

23. 段落18-22中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含足以合成金黄色葡萄球菌CP5糖的重复单元的糖基转移酶，其包含来自金黄色葡萄球菌CP5的capH、capI、capJ和/或capK和任选地来自金黄色葡萄球菌CP5的capD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO和/或capP。

24.段落18-23中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含足以合成金黄色葡萄球菌CP5糖的重复单元的糖基转移酶，其包含来自金黄色葡萄球菌CP5的capH、capI、capJ和/或capK和任选地来自铜绿假单胞菌O11的wbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz和/或wzx以及来自大肠杆菌O16的wecB和/或wecC。

25.段落18-24中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶源自空肠弯曲杆菌，任选地其中所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的pglB，任选地其中所述空肠弯曲杆菌的pglB基因被整合至所述宿主细胞基因组中，且任选地其中所述宿主细胞的至少一个基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被编码寡糖基转移酶的核酸替代，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被空肠弯曲杆菌pglB替代。

26. 段落18-25中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码荚膜多糖聚合酶(例如wzy)或O抗原聚合酶(例如wzy)的核酸，任选地所述荚膜多糖聚合酶来自金黄色葡萄球菌，任选地来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8。

27. 段落18-26中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码翻转酶(wzx)的核酸，任选地所述翻转酶来自金黄色葡萄球菌，任选地来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8。

28.段落18-27中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含能够修饰单糖的酶，任选地差向异构酶，任选地其中所述差向异构酶来自埃希氏杆菌属物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种，任选地其中所述差向异构酶来自大肠杆菌，任选地来自大肠杆菌O157的Z3206或galE。

29.段落18-28中任一项的宿主细胞，其中编码所述多肽的核酸在所述宿主细胞中的质粒中。

30.段落18-29中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

31.用于产生生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含与糖连接的多肽，所述方法包括(i)在适合于产生蛋白的条件下培养段落18-30中任一项的宿主细胞，和(ii)分离所述生物缀合物。

32.通过段落31的方法产生的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与多肽、例如段落1-10中任一项的多肽连接的糖。

33.免疫原性组合物，其包含段落1-10中任一项的多肽或段落11-15中任一项的缀合物或段落32的生物缀合物。

34.制备段落33的免疫原性组合物的方法，其包括将所述多肽或缀合物或生物缀合物与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。

35.疫苗，其包含段落34的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体。

36.用于治疗或预防有此需要的受试者中的金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的段落1-10中任一项的多肽或段落11-15中任一项的缀合物或段落32的生物缀合物。

37.针对金黄色葡萄球菌感染免疫人宿主的方法，其包括向所述宿主施用免疫保护剂量的段落1-10中任一项的多肽或段落11-15中任一项的缀合物或段落32的生物缀合物。

38.诱导受试者中对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的段落1-10中任一项的多肽或段落11-15中任一项的缀合物或段落32的生物缀合物。

39.段落1-10中任一项的多肽或段落11-15中任一项的缀合物或段落32的生物缀合物，其用于治疗或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。

序列表的描述

所有序列都是氨基酸序列

SEQ ID NO:1 - 具有信号序列的野生型ClfA纤维蛋白原结合结构域(N123)

SEQ ID NO:2 – 野生型ClfAN1N2N3

SEQ ID NO:3 - 野生型ClfAN2N3

SEQ ID NO:4 - ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:5 – 具有N-末端S和Flgl信号序列的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:6 – 具有N-末端S的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:7 – 在对应于突变体30的位置(全长ClfA的I557，加下划线)处具有糖位点的野生型ClfAN1N2N3

SEQ ID NO:8 – 在对应于突变体30的位置(全长ClfA的I557，加下划线)处具有糖位点的ClfAN1N2N3 P298S/Y300A

SEQ ID NO:9- 具有突变体30糖位点(加下划线)的野生型ClfAN2N3

SEQ ID NO:10 – 具有突变体30糖位点(加下划线)的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:11- 具有N-末端S和Flgl信号序列以及突变体30糖位点(加下划线)的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:12 – 具有N-末端S和突变体30糖位点(加下划线)的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:13 - FlgI信号序列

SEQ ID NO:14 – OmpA信号序列

SEQ ID NO:15 - MalE信号序列

SEQ ID NO:16 - PelB信号序列

SEQ ID NO:17 - LTIIb信号序列

SEQ ID NO:18 - DsbA信号序列

SEQ ID NO:19 - TolB信号序列

SEQ ID NO:20 - SipA信号序列

SEQ ID NO:21 - 糖位点

D/E-X-N-Z-S/T

SEQ ID NO:22 - 糖位点

K-D/E-X-N-Z-S/T-K

SEQ ID NO:23 – 糖位点

K-D-Q-N-A-T-K

SEQ ID NO:24 - 糖位点

K-D-Q-N-R-T-K

SEQ ID NO:25 – 具有突变体30糖位点(加下划线)、额外的GS和6-His C-末端标签的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:26 – 具有N-末端S和Flgl信号序列以及突变体30糖位点(加下划线)、额外的GS和6-His C-末端标签的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:27- 具有N-末端S、糖位点(加下划线)、额外的GS和6-His C-末端标签的ClfAN2N3P116S/Y118A

SEQ ID NO:28 - ClfAN2N3P116S/Y118A突变体1 (D24KDQNATK)

SEQ ID NO:29 - ClfAN2N3P116S/Y118A突变体27 (Q327KDQNATK)

SEQ ID NO:30 - ClfAN2N3P116S/Y118A突变体28 (D329KDQNATK)

SEQ ID NO:31 - ClfAN2N3P116S/Y118A突变体29 (P331KDQNATK)

SEQ ID NO:32- 具有突变体30糖位点(加下划线)、N-末端S、C-末端GS的ClfAN2N3P116S/Y118A

为了可以更好地理解本发明，阐述以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：ClfA糖位点突变体的筛选

大肠杆菌菌株StGVXN1690 (携带编码金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP8的质粒(CPS 8；pGVXN564)和编码空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶PglB N534Q突变体的密码子使用优化的版本的质粒(pGVXN971)的克隆6D (W3110 ΔwaaL; ΔECA(rffG-rffM)::cat))的化学感受态细胞用编码具有大肠杆菌OmpA信号序列且携带C-末端六组氨酸亲和标签的所示(参见表格)金黄色葡萄球菌凝集因子N2N3糖位点突变体的质粒进行转化：

质粒	突变 – ClfA全长编号	突变 – ClfA N2N3编号	质粒骨架，抗生素抗性
				pGVXN1141	mut 1: D244KDQNATK	D24KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1142	mut 2: T248KDQNATK	T28KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1143	mut 3: G262KDQNATK	G42KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1144	mut 4: T278KDQNATK	T58KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1145	mut 5: G300KDQNATK	G80KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1146	mut6: V308KDQNATK	V88KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1147	mut7: D312KDQNATK	D92KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1148	mut8: I316KDQNATK	I96KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1149	mut9: T318KDQNATK	T98KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1150	mut10: K330KDQNATK	K110KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1151	mut11: N349KDQNATK	N129KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1152	mut12: L366KDQNATK	L146KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1153	mut13: Y376KDQNATK	Y156KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1154	mut14: T390KDQNATK	T170KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1155	mut15: N406KDQNATK	N186KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1156	mut16: P418KDQNATK	P198KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1158	mut18: S432KDQNATK	S212KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1159	mut19: F466KDQNATK	F246KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1160	mut20: D480KDQNATK	D260KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1161	mut21: Q482KDQNATK	Q262KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1162	mut22: H494KDQNATK	H274KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1163	mut23: G501KDQNATK	G281KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1164	mut24: N515KDQNATK	N295KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1166	mut26: R519KDQNATK	R299KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1167	mut27: Q547KDQNATK	Q327KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1168	mut28: D549KDQNATK	D329KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
				pGVXN1169	mut29: P551KDQNATK	P331KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性
pGVXN1170	mut30: I557KDQNATK	I337KDQNATK	pEC414，氨苄青霉素抗性

表1：使用pGVXN974，采用定点诱变来针对糖基化位点(糖基化序列“KDQNATK”)替换ClfA中指示的氨基酸残基，产生展现氨苄青霉素抗性的基于pEC415的表达质粒。为了便于参考，还给出ClfN2N3中的相应编号。

作为一种阳性对照，大肠杆菌菌株StGVXN1690 (携带编码金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP8的质粒(CPS 8；pGVXN564)和编码空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶PglB N534Q突变体的密码子使用优化的版本的质粒(pGVXN971)的克隆6D (W3110 ΔwaaL; ΔECA(rffG-rffM)::cat))的化学感受态细胞用编码具有大肠杆菌DsbA信号序列和携带C-末端六组氨酸亲和标签的铜绿假单胞菌外蛋白A (pEC415-DsbA-ss-EPA ^2x糖位点 _His6)的质粒(pGVXN150)进行转化。

作为第二种阳性对照，大肠杆菌菌株StGVXN1690 (携带编码金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP8的质粒(CPS 8；pGVXN564)和编码空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶PglB N534Q突变体的密码子使用优化的版本的质粒(pGVXN971)的克隆6D (W3110 ΔwaaL; ΔECA(rffG- rffM)::cat))的化学感受态细胞用编码具有大肠杆菌DsbA信号序列和携带C-末端六组氨酸亲和标签的金黄色葡萄球菌凝集因子糖位点突变体(D328KDQNRTK)的质粒(pGVXN633)进行转化。

作为阴性对照，大肠杆菌菌株StGVXN1690 (携带编码金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP8的质粒(CPS 8；pGVXN564)和编码空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶PglB N534Q突变体的密码子使用优化的版本的质粒(pGVXN971)的克隆6D (W3110 ΔwaaL; ΔECA(rffG-rffM)::cat))的化学感受态细胞用编码含有大肠杆菌OmpA信号序列和携带C-末端六组氨酸亲和标签的没有糖位点的金黄色葡萄球菌凝集因子的质粒(pGVXN974)进行转化。

细胞在补充有三种抗生素氨苄青霉素[100 ug/ml]、四环素[100ug/ml]和壮观霉素[40ug/ml]的选择性Luria Broth(LB)琼脂板上生长过夜。将新鲜生长的转化体接种至补充有抗生素氨苄青霉素[100ug/ml]、四环素[100ug/ml]和壮观霉素[40ug/ml]的1ml LB预培养物中，并在96-深孔板中在37℃下振荡过夜。过夜培养后，将100ul的预培养物用于接种补充有10 mM MgCl₂和抗生素氨苄青霉素[100 ug/ml]、四环素[100ug/ml]和壮观霉素[40ug/ml]的900 ul Terrific Broth (TB)。在37℃下培养150 min后，用1mM IPTG和0.1%阿拉伯糖诱导培养物，并在37℃下培养过夜。通过以3700 rpm离心10 min在96-深孔板内收获细胞。在4℃下30分钟期间，用200ul裂解缓冲液(30mM Tris-HCl pH 8.5、1mM EDTA pH8.0、20%蔗糖，含有溶菌酶[最终1 mg/ml])提取周质内容物。通过离心(15 min，以3700rpm)使周质提取物(PPE)澄清，并将150 ul每种上清液与37.5ul 5x结合缓冲液(150 mMTris-HCl pH 8.0、2.5 M NaCl、50mM咪唑pH 8.0、4 mM MgCl2)在新的96孔板中混合(=上样物)。将“上样物”转移至含有之前用1 x结合缓冲液(30 mM Tris-HCl pH 80、500 mM NaCl、10 mM咪唑pH 8.0)平衡的50ul/孔Ni-NTA琼脂糖的新的96-孔板中，并在环境温度下孵育1小时。将浆料转移至新的96孔板(每孔包含一个过滤装置)。将具有结合的蛋白的Ni-NTA琼脂糖在2 min期间以300 rcf离心至滤膜上，并丢弃流通液。滤膜用1 x 结合缓冲液洗涤两次，并且结合的蛋白用每个滤膜50ul洗脱缓冲液(1 x PBS pH 7.0；500mM咪唑)洗脱。

向每个洗脱的样品中添加20 ul 4x Lämmli样品缓冲液，混合并在95℃下煮沸10min。为了通过Western印迹进行分析，对每个泳道，将30ul这些样品上样至4-12% NuPAGE凝胶上，将蛋白电印迹在硝酸纤维素膜上，并用抗His抗体(Qiagen N°34660；图3和图4)和第二抗小鼠过氧化物酶缀合抗体(Sigma, A0412)或抗CP8抗体和第二抗兔过氧化物酶缀合抗体(BioRad, 170-6515；图5和6)检测。抗CP8 Western印迹揭示金黄色葡萄球菌凝集因子糖位点突变体mut1、mut27、mut28和mut30的缀合物形成。

实施例2：与糖位点突变体1相比，在载体蛋白ClfAN2N3糖位点突变体30的背景下金黄色葡萄球菌生物缀合物生产的蛋白稳定性提高

直接比较实施例1中所述的突变体1和30的糖基化效率和稳定性。

通过电穿孔，菌株StGVXN8966 (W3110 waaL::pglB_{cuo N311V-K482R-D483H-A669V}; O16::O11_ wbjB-wbpM; ΔrmlB-wecG; wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat)单独地用编码金黄色葡萄球菌凝集因子结构域N2N3糖位点突变体mut 1的质粒(ClfAN2N3, pGVXN1188)或编码凝集因子结构域N2N3糖位点突变体mut 30的质粒(pGVXN2592)转化。

细胞在TB培养基中生长，金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP8 (CPS 8)从整合至大肠杆菌基因组中的基因簇组成型表达。在0.95和1.05的光密度OD_600nm，用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导整合的寡糖基转移酶PglB，用0.6%阿拉伯糖诱导质粒携带的ClfAN2N3。

在37℃下过夜诱导后，收获细胞，并使用补充有1 mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(30mM Tris-HCl pH 8.5, 1mM EDTA, 20% (w/v)蔗糖)通过周质制备提取CP8-ClfAN2N3生物缀合物。在离心后从上清液收集周质蛋白，上样至4-12% SDS-PAGE上，并印迹至硝酸纤维素膜上，并用抗组氨酸标签抗体检测。将上样的蛋白针对细胞的光密度归一化。结果显示于图9中。

实施例3：来自三质粒系统的CP8-ClfAN2N3突变体1生物缀合物的表达和纯化

图7显示在20L生物反应器中从三质粒系统表达且纯化至均质的CP8-ClfAN2N3 mut1的最终产物的SDS-PAGE SimplyBlue SafeStain、抗ClfA和抗CP8 Western印迹分析。

通过电穿孔，菌株StGVXN1690 (携带编码具有大肠杆菌OmpA信号序列且携带C-末端六组氨酸亲和标签的金黄色葡萄球菌凝集因子结构域N2N3糖位点突变体mut1的质粒pGVXN1188和编码金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP8 (CPS 8)的质粒pGVXN564的克隆6D (W3110ΔwaaL; ΔECA(rffG-rffM)::cat))用携带空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶PglB野生型密码子使用优化的质粒pGVXN970转化，并铺板在选择性琼脂板上。

将细胞接种至400 ml LB预培养物中，在37℃下摇动过夜，并接种至含有7升(L)Terrific Broth (TB)培养基的20 L生物反应器(newMBR FE_03 / 20 L)中。重组多糖组成型表达，而在40的光密度OD_600nm，分别用1 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和0.6%阿拉伯糖诱导PglB和ClfAN2N3 mut1，并在37℃下向容器中提供TB培养基过夜，直至108的OD_600nm，并且达到10 L总体积，并且继续诱导总共40小时(h)。

诱导后，收获总共803,600 OD，并用0.9%氯化钠洗涤。通过渗透性休克处理从100,000 OD提取CP8-ClfAN2N3 mut1生物缀合物。将细胞重悬浮于250 ml 1/3 x TBS (Tris缓冲盐水, Fisher Scientific)(其补充有125 ml重悬浮缓冲液(75%蔗糖、30 mM EDTA、600mM Tris HCl pH 8.5))中并在4℃下通过旋转孵育20分钟。将细胞沉淀并重悬浮于375 ml渗透休克缓冲液(10 mM Tris-HCl pH 8.0)中，并在4℃下再次孵育30分钟。将细胞沉淀，并向上清液(420ml)补充21 ml 1M氯化镁和110ml 5 x 结合缓冲液150mM Tris-HCl (pH8.0)、2500mM NaCl、25mM咪唑，并用0.2微米过滤器过滤。40 ml IMAC (固定化金属亲和色谱)珠粒用30mM Tris-HCl (pH 8.0)、500mM NaCl、5mM咪唑平衡，并通过在室温下搅拌30分钟与样品一起孵育。将树脂填充至XK26/20柱(GE Healthcare)中，并用30mM Tris-HCl (pH8.0)、500mM NaCl、5mM咪唑洗涤2个柱体积。以在15个柱体积中达到30mM Tris-HCl (pH8.0)、500mM NaCl、500mM咪唑的梯度洗脱蛋白。级分通过4-12% SDS-PAGE分析，用抗HisWestern印迹显色，并且合并含有生物缀合物的所有级分(110 ml)，并直接上样在用30 mMBis-Tris (pH 6.5)、50mM NaCl平衡的PallQ柱(Pall)上。通过20个柱体积至30 mM Bis-Tris (pH 6.5), 500mM NaCl的梯度洗脱蛋白，并通过4-12% SDS-PAGE分析级分，用SimplyBlue Safe Stain染色并通过抗His Western印迹显现。合并含有大部分生物缀合物和最少未糖基化物质的级分(42ml)，并在4℃下针对4 L 5mM磷酸钠(pH 7.2)、150mM NaCl透析过夜。将样品上样在用5mM磷酸钠(pH 7.2)、150mM NaCl平衡的羟基磷灰石柱(Biorad)上，并用最高达500mM磷酸钠(pH 7.2)、150mM NaCl的差异梯度洗脱。通过4-12% SDS-PAGE分析级分，用SimplyBlue Safe Stain染色，并且合并含有更长聚糖的级分。合并的样品(55ml)在10kDa分子量截止(MWCO)过滤器(Millipore)中浓缩，并注入在1x TBS (Tris缓冲盐水, Fisher Scientific)中平衡并运行的大小排阻柱(Superdex 200 10/300, GEHealthcare)中。通过4-12% SDS-PAGE分析级分，用SimplyBlue Safe Stain染色，并且合并含有最少未糖基化蛋白和杂质的最干净级分，并进行无菌过滤。

实施例4：来自单质粒系统的CP8-ClfAN2N3 mut 30生物缀合物的表达和纯化

图8显示在2L生物反应器中从单质粒系统表达且纯化至均质的CP8-ClfAN2N3 mut30的最终产物的SDS-PAGE SimplyBlue SafeStain、抗ClfA和抗CP8 Western印迹分析。

通过电穿孔，菌株StGVXN8966 (W3110 waaL::pglB_{cuo N311V-K482R-D483H-A669V}; O16::O11_ wbjB-wbpM; ΔrmlB-wecG; wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat)用编码具有福氏志贺氏菌鞭毛P-环蛋白信号序列(Flgl)且携带C-末端六组氨酸亲和标签的金黄色葡萄球菌凝集因子N2N3糖位点突变体mut 30的质粒(pGVXN2685)转化，并铺板在选择性琼脂板上。

将细胞接种至400 ml LB预培养物(其补充有10mM MgCl2)中，在37℃下摇动过夜，并接种至含有1.4 L TB培养基的2 L生物反应器(Infors Multitron)中。重组多糖组成型表达，而在33的光密度OD_600nm，分别用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和0.6%阿拉伯糖诱导PglB和ClfA，并向容器中提供TB培养基过夜，以达到1.8升总体积。

过夜诱导后，收获总共138,600 OD，并用0.9%氯化钠洗涤。通过渗透休克处理提取生物缀合物。将细胞(30,000 OD₆₀₀当量)重悬浮于100 ml 1/3 x TBS (Tris缓冲盐水,Fisher Scientific)(其补充有50 ml重悬浮缓冲液(75%蔗糖、30 mM EDTA、600 mM TrisHCl pH 8.5))中，并在4℃下通过旋转孵育30分钟。将细胞沉淀并重悬浮于150 ml渗透休克缓冲液(10 mM Tris-HCl pH 8.0)中，并在4℃下再次孵育30分钟。将细胞沉淀，并向上清液中补充50mM MgCl2和5 x结合缓冲液，以达到30mM Tris-HCl (pH 8.0)、500mM NaCl、5mM咪唑。50 ml IMAC (固定化金属亲和色谱)珠粒用30mM Tris-HCl (pH 8.0)、500mM NaCl、5mM咪唑平衡，并通过在室温下搅拌1h与样品一起孵育。将树脂填充至XK26柱(GE Healthcare)中，并用30mM Tris-HCl (pH 8.0)、500mM NaCl、5mM咪唑洗涤5个柱体积。以在15个柱体积中达到30mM Tris-HCl (pH 8.0)、500mM NaCl、500mM咪唑的梯度洗脱蛋白。级分通过4-12%SDS-PAGE分析，用抗His Western印迹显色，并且合并含有生物缀合物的所有级分(128ml)，并直接上样在用30 mM Bis-Tris (pH 6.5)、50mM NaCl平衡的PallQ柱(Pall)上。通过20个柱体积至30 mM Bis-Tris (pH 6.5), 500mM NaCl的梯度洗脱蛋白，并通过4-12%SDS-PAGE分析级分，用SimplyBlue Safe Stain染色并通过抗His Western印迹显现。合并含有大部分生物缀合物和最少未糖基化物质的级分(55ml)，并在4℃下针对4 L 5mM磷酸钠(pH 7.2)、150mM NaCl透析过夜。将样品上样在用5mM磷酸钠(pH 7.2)、150mM NaCl平衡的羟基磷灰石柱(Biorad)上，并用最高达500mM磷酸钠(pH 7.2)、150mM NaCl的差异梯度洗脱。通过4-12% SDS-PAGE分析级分，用SimplyBlue Safe Stain染色，并且与含有较短聚糖分开合并含有更长聚糖的级分。合并的样品在10kDa MWCO过滤器(Millipore)中分开浓缩，并注入在1x TBS (Tris缓冲盐水, Fisher Scientific)中运行的大小排阻柱(Superdex200 10/300, GE Healthcare)中。通过4-12% SDS-PAGE分析级分，用SimplyBlue SafeStain染色，并且合并含有最少未糖基化蛋白的最干净级分，并进行无菌过滤。

实施例5：与OmpA信号序列相比，具有来自鞭毛蛋白信号序列的载体表达的金黄色葡萄球菌CP8-ClfAN2N3 mut30生物缀合物的生产率提高

图10显示在ClfAN2N3 mut30上具有不同信号序列对产量的影响，并突出显示来自福氏志贺氏菌鞭毛P-环蛋白Flgl的信号序列对CP8-ClfAN2N3 mut 30生物缀合物生产率的增强。

通过电穿孔，菌株StGVXN8966 (W3110 waaL::pglB_{cuo N311V-K482R-D483H-A669V}; O16::O11_ wbjB-wbpM; ΔrmlB-wecG; wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat)单独地用编码金黄色葡萄球菌凝集因子结构域N2N3糖位点突变体mut 30的质粒转化，所述金黄色葡萄球菌凝集因子结构域N2N3糖位点突变体mut 30具有大肠杆菌二硫化物氧化还原酶DsbA信号序列(DsbA, pGVXN2684)、福氏志贺氏菌鞭毛P-环蛋白信号序列(Flgl, pGVXN2685)、大肠杆菌不耐热肠毒素IIB，B链信号序列(LTIIb, pGVXN2686)，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MalE信号序列(MalE, pGVXN2687)，胡萝卜软腐病果胶杆菌果胶酶裂解酶2前体信号序列(PelB,pGVXN2688)，无乳链球菌表面免疫原性蛋白信号序列(SipA, pGVXN2689)，大肠杆菌易位蛋白信号序列(TolB, pGVXN2691)，大肠杆菌外膜蛋白信号序列(OmpA, pGVXN2692)。

细胞在TB培养基中生长，金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP8(CPS 8)从整合至大肠杆菌基因组中的基因簇组成型表达。在0.86和0.96之间的光密度OD_600nm，用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导整合的寡糖基转移酶PglB，用0.6%阿拉伯糖诱导质粒携带的ClfAN2N3。

在37℃下过夜诱导后，收获细胞，并使用补充有1 mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(30mM Tris-HCl pH 8.5, 1mM EDTA, 20% (w/v)蔗糖)通过周质制备提取CP8-ClfAN2N3生物缀合物。在离心后从上清液收集周质蛋白，上样至4-12% SDS-PAGE上，并印迹至硝酸纤维素膜上，并用抗组氨酸标签抗体检测。将上样的蛋白针对细胞的光密度归一化。结果显示于图10中。

本公开的范围不应由本文所述的具体实施方案限制。事实上，根据前文的描述和附图，除了所述的那些主题以外，对本文提供的主题的各种改变，将变得对于本领域技术人员而言显而易见。此类改变意图落入所附权利要求的范围之内。

本文引用各种出版物、专利和专利申请，其公开内容以其整体并入本文。

Claims

1.多肽，其包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，所述多肽被修饰，其中所述氨基酸序列包含一个或多个选自D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ IDNO.22)的共有序列，其中X和Z独立地是除了脯氨酸以外的任何氨基酸；其中所述共有序列添加在SEQ ID NO:3的氨基酸残基313-340之间或在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列内的等同位置，或取代在SEQ ID NO:3的氨基酸残基313-340之间或在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列内的等同位置处的一个或多个氨基酸。

2.权利要求1的多肽，其中所述共有序列已经取代SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329、P331或I337，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329或I337等同的氨基酸位置处取代。

3.权利要求2的多肽，其含有单个共有序列，所述单个共有序列已经取代SEQ ID NO.3中的氨基酸残基I337，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基I337等同的氨基酸位置处取代。

4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中X是Q(谷氨酰胺)且Z是A(丙氨酸)(例如K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO.23))。

5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列进一步包含相对于SEQ ID NO.3的氨基酸序列(或与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中的等同位置)，选自P116至S和Y118至A的至少一个氨基酸取代，其任选地包含SEQ ID NO 4-5或10-12中的任一者的序列。

6.根据权利要求5所述的多肽，其包含与SEQ ID NO.3的序列具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列(或由其组成)，所述氨基酸序列包含D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO.21)或K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO.22)共有序列，其中X和Z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸，所述共有序列取代SEQ ID NO. 3中的位置I337处的氨基酸，或者在与SEQ ID NO.3具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列中，与SEQ ID NO.3中的氨基酸残基Q327、D329或I337等同的氨基酸位置处取代。

7.权利要求1-6中任一项的多肽，其具有N-末端的额外的丝氨酸残基，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.12具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列；和/或C-末端的额外的甘氨酸或甘氨酸-丝氨酸残基，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO:32具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

8.权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列进一步包含能够将所述多肽引导至宿主细胞(例如细菌)的周质的信号序列，任选地所述信号序列选自SEQ ID NO.13-20，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

9.权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列进一步包含可用于纯化所述ClfA蛋白的肽标签，任选地所述肽标签包含六个组氨酸残基，且任选地，所述肽标签位于所述氨基酸序列的C-末端，任选地所述多肽具有与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27具有至少97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

10.权利要求1-9中任一项的多肽，其中所述多肽是糖基化的。

11.缀合物(例如生物缀合物)，其包含权利要求1-10中任一项的多肽，其中所述多肽被连接至抗原，例如多糖或寡糖抗原。

12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述缀合物通过使用化学缀合方法可获得的化学键直接或经由接头与抗原共价连接，所述化学缀合方法任选地选自碳二亚胺化学法、还原性胺化、氰化化学法(例如CDAP化学法)、马来酰亚胺化学法、酰肼化学法、酯化学法和N-羟基琥珀酰亚胺化学法。

13.权利要求11或权利要求12的缀合物(例如生物缀合物)，其中所述抗原与所述多肽上的氨基酸连接，所述氨基酸选自天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸(例如天冬酰胺)。

14.权利要求11-13中任一项的缀合物(例如生物缀合物)，其中所述抗原是糖，任选地细菌荚膜糖(例如来自金黄色葡萄球菌)，其任选地选自金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜糖。

15.权利要求14的缀合物(例如生物缀合物)，其中所述抗原是来自金黄色葡萄球菌血清型8的细菌荚膜糖。

16.多核苷酸，其编码权利要求1-10中任一项的多肽。

17.载体，其包含权利要求16的多核苷酸。

18.宿主细胞，其包含：

一种或多种编码糖基转移酶的核酸；

编码寡糖基转移酶的核酸；

编码根据权利要求1-10中任一项所述的多肽的核酸；和任选地

编码聚合酶的核酸(例如wzy)。

19.权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(a)将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(Und-PP)上的糖基转移酶和(b)能够将单糖添加至组装在Und-PP上的己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶。

20.权利要求19的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至Und-PP上的糖基转移酶与所述宿主细胞异源和/或与编码糖基转移酶的基因中的一种或多种异源，任选地其中所述将己糖单糖衍生物组装至Und-PP上的糖基转移酶来自埃希氏杆菌属物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种，任选地是wecA(例如，来自大肠杆菌的wecA)。

21.权利要求18-20中任一项的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物是其中C-2位置被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)或N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。

22.权利要求18-21中任一项的宿主细胞，其中所述能够将单糖添加至组装在Und-PP上的所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)或来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)，或者是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)和来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)。

23.权利要求18-22中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含足以合成金黄色葡萄球菌CP5糖的重复单元的糖基转移酶，其包含来自金黄色葡萄球菌CP5的capH、capI、capJ和/或capK和任选地来自金黄色葡萄球菌CP5的capD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO和/或capP。

24.权利要求18-23中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含足以合成金黄色葡萄球菌CP5糖的重复单元的糖基转移酶，其包含来自金黄色葡萄球菌CP5的capH、capI、capJ和/或capK和任选地来自铜绿假单胞菌O11的wbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz和/或wzx以及来自大肠杆菌O16的wecB和/或wecC。

25.权利要求18-24中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶源自空肠弯曲杆菌，任选地其中所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的pglB，任选地其中所述空肠弯曲杆菌的pglB基因被整合至所述宿主细胞基因组中，且任选地其中所述宿主细胞的至少一个基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被编码寡糖基转移酶的核酸替代，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被空肠弯曲杆菌pglB替代。

26.权利要求18-25中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码荚膜多糖聚合酶(例如wzy)或O抗原聚合酶(例如wzy)的核酸，任选地所述荚膜多糖聚合酶来自金黄色葡萄球菌，任选地来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8。

27.权利要求18-26中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码翻转酶(wzx)的核酸，任选地所述翻转酶来自金黄色葡萄球菌，任选地来自金黄色葡萄球菌CP5或CP8。

28.权利要求18-27中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含能够修饰单糖的酶，任选地差向异构酶，任选地其中所述差向异构酶来自埃希氏杆菌属物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、气单胞菌属(Aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)物种、李斯特菌属(Listeria)物种或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种，任选地其中所述差向异构酶来自大肠杆菌，任选地来自大肠杆菌O157的Z3206或galE。

29.权利要求18-28中任一项的宿主细胞，其中编码所述多肽的核酸在所述宿主细胞中的质粒中。

30.权利要求18-29中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

31.用于产生生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含与糖连接的多肽，所述方法包括(i)在适合于产生蛋白的条件下培养权利要求18-30中任一项的宿主细胞，和(ii)分离所述生物缀合物。

32.通过权利要求31的方法产生的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与多肽、例如权利要求1-10中任一项的多肽连接的糖。

33.免疫原性组合物，其包含权利要求1-10中任一项的多肽或权利要求11-15中任一项的缀合物或权利要求32的生物缀合物。

34.制备权利要求33的免疫原性组合物的方法，其包括将所述多肽或缀合物或生物缀合物与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。

35.疫苗，其包含权利要求34的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体。

36.用于治疗或预防有此需要的受试者中的金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项的多肽或权利要求11-15中任一项的缀合物或权利要求32的生物缀合物或权利要求35的疫苗。

37.针对金黄色葡萄球菌感染免疫人宿主的方法，其包括向所述宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-10中任一项的多肽或权利要求11-15中任一项的缀合物或权利要求32的生物缀合物或权利要求35的疫苗。

38.诱导受试者中对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的权利要求1-10中任一项的多肽或权利要求11-15中任一项的缀合物或权利要求32的生物缀合物或权利要求35的疫苗。

39.权利要求1-10中任一项的多肽或权利要求11-15中任一项的缀合物或权利要求32的生物缀合物或权利要求35的疫苗，其用于治疗或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。

40.权利要求1-10中任一项的多肽或权利要求11-15中任一项的缀合物或权利要求32的生物缀合物或权利要求35的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。