BR112020012216A2 - composição imunogênica - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a proteínas ClfA modificadas de Staphylococcus aureus que contêm sequências consenso no sítio de glicosilação. A invenção também se refere a um conjugado compreendendo uma proteína ClfA modificada e um antígeno (por exemplo, um antígeno do sacarídeo de Staphylococcus aureus), em que o antígeno está ligado (diretamente ou através de um ligante) a um resíduo de aminoácido da proteína ClfA modificada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÃO IMUNOGÊNICA”".

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de composições imunogênicas e vacinas, sua fabricação e o uso de tais composições em medicina. Mais particularmente, ela refere-se a um polipeptídeo de Staphylococcus aureus e seu uso como antígeno de vacina, em parti- cular como uma proteína carreadora conjugada com antígenos de sa- carídeos.

ANTECEDENTES

[0002] Staphylococcus aureus é uma das principais causas de in- fecções humanas invasivas, incluindo bacteremia, endocardite, pneu- monia e infecções de feridas. S. aureus desenvolve resistência a anti- bióticos muito rapidamente, e surgiram cepas resistentes a antibióticos comumente usados, tal como a meticilina e até ao antibiótico de último recurso, a vancomiíicina. S. aureus resistente à meticilihna (MRSA) é endêmico em hospitais, e as cepas de MRSA associadas à comunida- de estão se espalhando por todo o mundo, representando um grande desafio global.

[0003] Existe, portanto, uma necessidade urgente de uma vacina para prevenir a doença estafilocócica. Várias vacinas foram testadas em ensaios clínicos, incluindo conjugados de polissacarídeo capsular (CPS), antígenos proteicos individuais, e anticorpos monocionais (mAbs) ao ácido lipoteicoico. No entanto, todas falharam em vários estágios de desenvolvimento e, até o momento, não existe vacina con- tra S. aureus no mercado.

[0004] Atualmente, as vacinas contra S. aureus que provocam respostas imunes humorais e mediadas por células estão em avalia- ção, e ambos os antígenos proteicos, incluindo adesinas tal como o fator de aglomeração A (CIfA) e CPS, são antígenos chave a serem considerados para inclusão em uma vacina multicomponente.

[0005] A aderência das bactérias aos componentes da matriz ex- tracelular do hospedeiro é uma fase inicial crítica da infecção bacteria- na. O CIfA é uma adesina importante de S. aureus, necessária para a virulência e ajuda as bactérias a escapar dos mecanismos de defesa do hospedeiro. Ele se liga ao fibrinogênio no ECM, auxiliando na ade- rência e colonização dos tecidos hospedeiros, além de causar aglome- ração e revestimento celular das células bacterianas no fibrinogênio, o que promove a evasão imune, prejudicando a deposição de opsoninas nas bactérias. Portanto, o CIfA é um antígeno promissor para inclusão em uma vacina multicomponente para S. aureus.

[0006] 90% das cepas de S. aureus expressam polissacarídeo capsular Tipo 5 ou Tipo 8; portanto, uma vacina compreendendo CP5 e CP8 poderia potencialmente proteger contra a maioria das cepas circulantes de S. aureus. Vacinas compreendendo polissacarídeos capsulares de S. aureus foram usadas para gerar uma resposta imune protetora contra estafilococos, mas vacinas compreendendo CPS iso- ladamente não se mostraram totalmente eficazes. Uma vacina conten- do conjugados de polissacarídeos capsulares de S. aureus Tipo 5 e Tipo 8 conjugados à exoproteína A de Pseudomonas (StaphVAX - Na- bi Biopharmaceuticals) foi testada em ensaios clínicos, onde demons- trou segurança e eficácia em Phl e Il, mas não conseguiu atingir o des- fecho final em PhiIll, como descrito em WO 03/61558.

[0007] Uma vacina multicomponente compreendendo CPS e CIfA de S. aureus (Anderson e outros, 2012, Hum Vaccine Immunother 8: 1585 a 1594) foi testada em ensaios com Phl em humanos. A vacina induziu anticorpos opsônicos anti-CP e anticorpos inibitórios anti-CIfA em Phl, e atualmente está sendo testada em ensaios de eficácia Philb para uso profilático em pacientes eletivos de cirurgia de fusão espi- nhal.

[0008] Bioconjugados de S. aureus CP8 com EPA de P. aerugino- Sa ou CIfA de S. aureus como proteína carreadora foram descritos em WO 2015/082571. Os bioconjugados CP8-EPA foram capazes de in- duzir anticorpos opsônicos em coelhos, e a vacinação de camundon- gos com bioconjugados CP8-EPA protegidos contra bacteremia indu- zida por cepas de sorotipo 8 de S. aureus. Os bioconjugados CP8-CIfA têm, portanto, potencial para uso em uma vacina contra S. aureus.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção fornece uma proteína CIfA estafilocó- cica modificada de modo a introduzir um sítio de glicosilação para PglB e seus bioconjugados.

[0010] Consequentemente, é fornecido em um aspecto da presen- te invenção, um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3, por exemplo, SEQ ID NO: 4, modifi- cada em que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais sequências consenso selecionadas a partir de D/E-X-N-Z-S /T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido, exceto a prolina. Em uma modalidade preferencial, a dita sequência consenso foi adicionada ou substituída por um ou mais aminoácidos entre os resíduos de aminoá- cidos 313 a 340 de SEQ ID NO: 3 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3.

[0011] Em uma modalidade, a dita sequência consenso é substitu- ída pelo resíduo de aminoácido Q327, D329, P331 e / ou 1337 na SEQ ID NO: 3, ou substituída em uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posição de aminoácido equivalente ao resíduo de aminoácido Q327, D329, P331 e / ou 1337 na SEQ ID NO: 3.

[0012] Em uma modalidade, a dita sequência consenso é substitu- ída pelo resíduo de aminoácido Q327, D329 ou 1337 na SEQ ID NO: 3, ou substituída em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posição de aminoácido equivalente ao resíduo de aminoáci- do Q327, D329 ou 1337 na SEQ ID NO: 3.

[0013] Em uma modalidade preferencial, a dita sequência consen- so é substituída pelo resíduo de aminoácido 1337 na SEQ ID NO: 3, ou substituída em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à SEQ ID NO: 3.

[0014] Em uma modalidade, a dita sequência consenso tem uma sequência K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) em que X é Q (gluta- mina) e Z é A (alanina) (por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)).

[0015] O polipeptídeo pode ainda compreender pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada a partir de P116 a S e Y118 a A com referência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (correspondente às posições P336 e Y338 na sequência da SEQ ID NO: 1) ou uma posição equivalente em uma sequência de aminoáci- dos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3), por exemplo, SEQ ID NOs: 4-5 ou 10-12.

[0016] O polipeptídeo pode compreender um resíduo de serina adicional no N-terminal, por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 12 e / ou resíduos adicionais, tal como Gly ou Gly-Ser no C-terminal, por exemplo SEQ ID NO: 32.

[0017] O polipeptídeo pode compreender uma sequência sinal que é capaz de direcionar a proteína para o periplasma de uma célula hos- pedeira (por exemplo, bactéria), opcionalmente a dita sequência sinal sendo selecionada a partir de SEQ ID NO: 13-20, preferencialmente

SEQ ID NO: 13, opcionalmente a dita proteína tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 11.

[0018] O polipeptídeo pode compreender uma etiqueta de peptí- deo que é útil para a purificação da proteína CIfA, opcionalmente a dita etiqueta de peptídeo compreendendo seis resíduos de histidina e, op- cionalmente, a dita etiqueta de peptídeo localizada no C-terminal da sequência de aminoácidos, opcionalmente a dita etiqueta de peptídeo sendo precedida por um ligante tal como Gly ou Gly-Ser, opcionalmen- te a dita proteína tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO : 27.

[0019] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um conjugado (por exemplo, bioconjugado) compreendendo um antígeno, preferencialmente um antígeno de polissacarídeo, ligado a um polipeptídeo da invenção.

[0020] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção.

[0021] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando um poli- peptídeo da invenção.

[0022] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cida uma célula hospedeira compreendendo: i) um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosil trans- ferase(s); ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfe- rase; iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da in- venção; e opcionalmente iv) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exemplo, wzy).

[0023] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um processo para a produção de um bioconjugado que compre- ende (ou consiste em) um polipeptídeo ligado a um sacarídeo, o dito método compreendendo: (i) cultivar a célula hospedeira da invenção em condições adequadas para a produção de proteínas, e (ii) isolar o bioconjugado produzido pela dita célula hospedeira.

[0024] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um bioconjugado produzido por um processo da invenção, em que o dito bioconjugado compreende um sacarídeo ligado a um poli- peptídeo.

[0025] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cida uma composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da in- venção e um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[0026] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um método para produzir uma composição imunogênica da in- venção compreendendo a etapa de misturar o polipeptídeo ou o con- jugado ou o bioconjugado com um excipiente ou carreador farmaceuti- camente aceitável.

[0027] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um método para o tratamento ou prevenção da infecção por Sta- bhylococcus aureus em um sujeito em necessidade de tratamento, compreendendo administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um polipeptídeo da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção.

[0028] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um método para imunizar um hospedeiro humano contra a infec- ção por Staphylococcus aureus, compreendendo administrar ao hos- pedeiro uma dose imunoprotetora de um polipeptídeo da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção.

[0029] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um método para induzir uma resposta imune a Staphylococcus aureus em um sujeito, o método compreendendo administrar uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um polipeptídeo da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção.

[0030] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um polipeptídeo da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença causada pela infecção por Staphylococcus aureus.

[0031] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um polipeptídeo da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença causada pela infecção por Staphylococcus aureus.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032] Figura 1: Visão geral dos domínios proteicos no fator de aglomeração de Staphylococcus aureus

[0033] A Figura 1 é uma representação esquemática da organiza- ção do domínio do fator de aglomeração de S. aureus CITA. Ele desta- ca os subdomínios de ligação ao fibrinogênio N1I-N2-N3 e mostra a posição e a natureza das mutações de desintoxicação localizadas no subdomínio N2. Os números referem-se às posições de aminoácidos (início de cada domínio). SS = sequência sinal; N1 - N3: subdomínios de ligação ao fibrinogênio; R = região de repetição de dipeptídeo seri- na-aspartato; W = região abrangendo a parede celular; M = região abrangendo a membrana.

[0034] Figura 2: Estruturas cristalinas dos domínios do fator de aglomeração de S. aureus N2 e N3 (CIfAN2N3, identificador PDB

1N67) mostrando os lóci dos sítios de glicosilação introduzidos na ex- tremidade N-terminal (mutante 1) ou na extremidade C-terminal (mu- tante 30).

[0035] A Figura 2 representa a estrutura cristalina dos domínios de fator de aglomeração de S. aureus N2N3 (CIfAN2N3, Deivanayagam e outros, EMBO J., 2002, identificador PDB 1N67), mostrando os sítios de glicosilação N-terminal e C-terminal testados A: um na extremidade N-terminal (D244K-D-Q-N-A-T-K = mutante 1) e B: uma na extremida- de C-terminal (I557K-D-Q-N-A-T-K = mutante 30).

[0036] Figuras 3, 4: Western blot Anti-His de diferentes bioconju- gados mutantes de sítio de glicosilação CIfA

[0037] A análise de Western blot anti-His da produção de biocon- jugado CP8-CIfAN2N3 para os mutantes 1-30, como descrito no Exemplo 1, com D328KDQNRTK (plasmídeo 633) como controle posi- tivo e EPA-CP8. Pista 1: marcadores de proteína (M). .Blot: coelho a- His 1:2000, cabra a-camundongo 1:20.000.

3a:

FE E BR E E 1141 1142 [1148 [114 633 SOC EPA-cp8 EF5 003 068

FE EE 3b:

PF E E E 1145 1146 1147 1148 1149 [1150 1151 1152 | EPA-cp8 EF5 003 068 PF dr E re re e 4a: Ss [esta aa RB Ra 1153 1154 1155 [1156 1158 1159 1160 1161 EPA-cp8 EF5 003 068 4b:

PE E E 1162 1163 1164 1166 1167 [1168 1169 1170 | EPA-cp8 EF5 003 068

[0038] Figuras 5, 6: Western blot anti-CP8 de diferentes bioconjugados mutantes de sítio de glicosilação CIfA 0039 Análise de Western blot anti-CP8 da produção de bioconjugado CP8-CIfAN2N3 para os mutantes 1-30 des- ç JUug critos no Exemplo 1, com D328KDQNRTK (plasmídeo 633) como controle positivo e EPA-CP8. Blot: coelho a-CP8- EPA-His 1:1000, cabra a-coelho 1:10.000.

Sa: esta RR E eee a ros 5b: este RR RR ae a re ds e e O 6a: esta a RR RR ame q ds e e de a ao 6b: esta RR e ja a ds os o esmas |

[0040] Figura 7: Expressão e purificação do bioconjugado CP8- CIfAN2N3 mutante 1 (D244K-D-Q-N-A-T-K)

[0041] A Figura 7 mostra uma análise SDS-PAGE SimplyBlue Sa- feStain, uma análise Western Blot anti-CIfA e anti-CP8 do produto final de CP8-CIfAN2N3 mutante 1, expressa a partir de um sistema de três plasmídeos em um biorreator de 20 L e purificada até a homogeneida- de. A) SimplyBlue Safe Stain B) Análise Western Blot anti-CIfAN2N3 C) Western Blot anti-CP8 de CP8- CIFAN2N3 mut1 (mut1) e CIFAN2N3 não glicosilado wt (U-wt) purificado até a homogeneidade.

[0042] Figura 8: Expressão e purificação do bioconjugado CP8- CIfAN2N3 mutante 30 (I557K-D-Q-N-A-T-K)

[0043] A Figura 8 mostra uma análise SDS-PAGE SimplyBlue Sa- feStain, uma análise Western Blot anti-CIfA e anti-CP8 do produto final de CP8-CIfAN2N3 mutante 30, expressa a partir de um sistema de um plasmídeo em um biorreator de 20 L e purificada até a homogeneidade. A) SimplyBlue SafeStain e B) Análise de Western Blot anti-CIfAN2N3 e C) Western Blot anti-CP8 de CP8-CIfFAN2N3 mut30 (mut30) e CIFAN2N3 não glicosilado mut 30 (U-mut 30) purificados até a homogeneidade.

[0044] Figura 9: Estabilidade proteica aprimorada da produção de bioconjugado de S. aureus no contexto de proteína carreadora CIfAN2N3 mutante 30 de sítio de glicosilação em comparação com o mutante 1 de sítio de glicosilação.

[0045] A análise Western blot da produção de bioconjugado CP8- CIfAN2N3 utilizando o sistema de três plasmídeos demonstrando de- gradação proteica reduzida para o mutante de sítio de glicosilação 30 (pista 3) em relação ao mutante de sítio de glicosilação 1 (pista 2). Pis- ta 1 = marcador de proteína.

[0046] Figura 10: Impacto no rendimento da produção com diferen- tes sequências sinal no CIFAN2N3 mutante 30

[0047] O Western blot Ant-His de CIfA-CP8-CIfAN2N3 mutante 30 com etiqueta HRHR produzido utilizando diferentes sequências sinal: sequência sinal DsbA de dissulfeto oxidorredutase de E. coli (DsbA), uma sequência sinal de proteína do anel P flagelar de S. flexneri (Flgl), enterotoxina lábil ao calor IIB de E. coli, sequência sinal da cadeia B (LTIIb), sequência sinal da proteína de ligação à E maltose MalE de coli, (MalE), sequência sinal do precursor de pectase liase 2 de P. ca- rotovorum (PelB), sequência sinal de proteína imunogênica de superfí- cie de S. agalactiae (SipA), sequência sinal de proteína de transloca- ção de E. coli (TolB), sequência sinal de proteína de membrana exter- na de E. coli (OmpA).

[0048] Pista 1: Marcador de proteína pré-corado PageRuler

[0049] Pista A: sequência sinal DsbA

[0050] Pista B: sequência sinal Flgl

[0051] Pista C: sequência sinal LTIlIb

[0052] Pista D: sequência sinal MalE

[0053] Pista E: sequência sinal PelB

[0054] Pista F: sequência sinal SipA

[0055] Pista G: sequência sinal TolB

[0056] Pista H: sequência sinal OMpA

DESCRIÇÃO DETALHADA Terminologia

[0057] Proteína carreadora: uma proteína covalentemente ligada a um antígeno (por exemplo, antígeno de sacarídeo) para criar um con- jugado (por exemplo, bioconjugado). Uma proteína carreadora ativa a imunidade mediada por células T em relação ao antígeno ao qual ela está conjugada.

[0058] Qualquer aminoácido, exceto a prolina (pro, P): refere-se a um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina (ala, A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gin, Q), ácido glutâmico (glu, E), glici-

na (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, 1), leucina (leu, L), lisina (lis, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), serina (ser, S), treoni- na (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tir, Y) e valina (val, V).

[0059] CIfA: Fator de aglomeração A a partir de Staphylococcus aureus

[0060] CP: Polissacarídeo capsular

[0061] LPS: lipopolissacarídeo.

[0062] Wwzy: o gene da polimerase de polissacarídeo que codifica uma enzima que catalisa a polimerização de polissacarídeos. A enzi- ma codificada transfere as unidades de oligossacarídeos para a ex- tremidade não redutora, formando uma ligação glicosídica.

[0063] waaL: o gene de antígeno O ligase que codifica uma enzi- ma ligada à membrana. A enzima codificada transfere o antígeno O ligado a undecaprenil-difosfato (UPP) para o oligossacarídeo de nú- cleo de lipídio A, formando um lipopolissacarídeo.

[0064] Und-PP: undecaprenil pirofosfato.

[0065] Und-P: undecaprenil fosfato.

[0066] Extremidade redutora: a extremidade redutora de um oli- gossacarídeo ou polissacarídeo é o monossacarídeo com um carbono anomérico livre que não está envolvido em uma ligação glicosídica e é, portanto, capaz de converter para a forma de cadeia aberta.

[0067] Como usado aqui, o termo "bioconjugado” refere-se ao con- jugado entre uma proteína (por exemplo, uma proteína carreadora) e um antígeno (por exemplo, um sacarídeo) preparado em um fundo ge- nético da célula hospedeira, em que o mecanismo da célula hospedei- ra liga o antígeno à proteína (por exemplo, N-ligações). Geralmente, em um bioconjugado, o polissacarídeo está ligado à asparagina via N- acetilglucosamina.

[0068] Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz”, no contexto da administração de uma terapia (por exemplo, uma composição imu-

nogênica ou vacina da invenção) a um sujeito, refere-se à quantidade de uma terapia que tem efeito(s) profilático e / ou terapêutico). Em cer- tas modalidades, uma "quantidade eficaz” refere-se à quantidade de uma terapia que é suficiente para atingir um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade de uma in- fecção ou sintoma bacteriano associado a ela; (ii) reduzir a duração de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (iii) impedir a progressão de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (iv) causar regressão de uma infecção bacteriana ou sintoma associa- do a ela; (v) impedir o desenvolvimento ou início de uma infecção bac- teriana ou sintoma associado a ela; (vi) impedir a recorrência de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (vii) reduzir a falência de órgãos associada a uma infecção bacteriana; (viii) reduzir a hospi- talização de um sujeito com uma infecção bacteriana; (ix) reduzir o tempo de hospitalização de um indivíduo com uma infecção bacteria- na; (x) aumentar a sobrevida de um sujeito com uma infecção bacteri- ana; (xi) eliminar uma infecção bacteriana em um sujeito; (xii) inibir ou reduzir uma replicação bacteriana em um sujeito; e / ou (xiii) melhorar ou aprimorar o efeito(s) profilático ou terapêutico de outra terapia.

[0069] Como usado aqui, o termo "sujeito" refere-se a um animal, em particular um mamífero tal como um primata (por exemplo, huma- no).

[0070] Como usado aqui, o termo "oligossacarídeo ou polissacarí- deo doador” refere-se a um oligossacarídeo ou polissacarídeo do qual um oligossacarídeo ou polissacarídeo é derivado. Os oligossacarídeos e polissacarídeos doadores, como aqui utilizados, compreendem um monossacarídeo hexose (por exemplo, glicose) na extremidade redu- tora da primeira unidade de repetição. O uso do termo oligossacarídeo ou polissacarídeo doador não pretende sugerir que um oligossacarí- deo ou polissacarídeo seja modificado in situ. Em vez disso, o uso do termo oligossacarídeo ou polissacarídeo doador se refere a um oligos- sacarídeo ou polissacarídeo que, em seu estado de ocorrência natural, é um substrato fraco para a atividade da oligossacaril transferase (por exemplo, PglB) ou não é um substrato para a atividade da oligossaca- ril transferase (por exemplo, PglB). Exemplos de oligossacarídeos ou polissacarídeos doadores incluem aqueles a partir de bactérias, inclu- indo CP5 e CP8 de Staphylococcus aureus. Os versados na técnica poderão determinar rapidamente se um oligossacarídeo ou polissaca- rídeo compreende um monossacarídeo hexose (por exemplo, glicose) na extremidade redutora da primeira unidade de repetição, e assim, se esse oligossacarídeo ou polissacarídeo é um oligossacarídeo ou polis- sacarídeo doador, como aqui incluído.

[0071] Como usado aqui, o termo "derivado de monossacarídeo hexose” refere-se a um derivado de um monossacarídeo hexose que pode ser um substrato para a atividade da oligossacaril transferase. Em geral, os derivados de monossacarídeo hexose compreendem um monossacarídeo compreendendo um grupo acetamido na posição 2. Os derivados de monossacarídeo hexose exemplificativos incluem GIcNAc, HexNAc, desoxi HexNAc ou 2 4-diacetamido-2,4,6-trideoxihexose.

[0072] Como usado aqui, o termo "oligossacarídeo ou polissacarí- deo híbrido” refere-se a um oligossacarídeo ou polissacarídeo manipu- lado que não compreende uma hexose na extremidade redutora da primeira unidade de repetição, mas compreende um derivado de mo- nossacarídeo hexose na extremidade redutora da primeira unidade de repetição.

[0073] Como aqui utilizado, a referência a uma identidade de se- quência percentual entre duas sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos significa que, quando alinhadas, essa porcentagem de ami- noácidos ou bases é a mesma comparando-se as duas sequências. Esse alinhamento e a porcentagem de homologia ou identidade de se-

quência podem ser determinados usando programas de software co- nhecidos na técnica, por exemplo, os descritos na seção 7.7.18 de Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel e outros, Eds., 1987, Suplemento 30). Um alinhamento preferencial é determinado pelo algoritmo de busca de homologia de Smith-Waterman usando uma busca de espaço de afinidade com uma penalidade de abertura de espaço de 12 e uma penalidade de extensão de espaço de 2, ma- triz BLOSUM de 62. O algoritmo de busca de homologia de Smith- Waterman é descrito por Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 a 489. A identidade percentual para qualquer sequência particular (por exemplo, para uma SEQ ID particular) é idealmente calculada ao longo de todo o comprimento dessa sequência. A identidade da se- quência percentual entre duas sequências de comprimentos diferentes é preferencialmente calculada ao longo do comprimento da sequência mais longa.

[0074] Como aqui utilizado, o termo "fragmento imunogênico” é uma porção de um antígeno menor do que o todo, capaz de provocar uma resposta imune humoral e / ou celular em um animal hospedeiro, por exemplo, um ser humano, específica para esse fragmento. Os fra- gmentos de uma proteína podem ser produzidos utilizando técnicas conhecidas, por exemplo, recombinantemente, por digestão proteolíti- ca ou por síntese química. Os fragmentos internos ou terminais de um polipeptídeo podem ser gerados removendo-se um ou mais nucleotí- deos de uma extremidade (para um fragmento terminal) ou ambas as extremidades (para um fragmento interno) de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Tipicamente, os fragmentos compreendem pe- lo menos 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos contíguos da sequência de comprimento total. No entanto, os fragmentos também podem ter 100 ou mais, 200 ou mais, 300 ou mais ou 400 ou mais aminoácidos de comprimento. Os fragmentos podem ser facilmente modificados adici-

onando-se ou removendo-se 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos de um ou de ambos o N-terminal e o C-terminal.

[0075] Como usado aqui, o termo "substituição conservativa de aminoácidos” envolve a substituição de um resíduo de aminoácido na- tivo por um resíduo não nativo, de modo que haja pouco ou nenhum efeito no tamanho, polaridade, carga, hidrofobicidade ou hidrofilicidade do resíduo de aminoácido nessa posição, e sem resultar em diminui- ção da imunogenicidade. Por exemplo, estas podem ser substituições dentro dos seguintes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glu- tamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. As mo- dificações conservativas de aminoácidos na sequência de um polipep- tídeo (e as modificações correspondentes nos nucleotídeos codifican- tes) podem produzir polipeptídeos com características funcionais e químicas semelhantes às de um polipeptídeo parental.

[0076] Como usado aqui, o termo "deleção” é a remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de proteína. Tipicamente, não mais do que cerca de 1 a 6 resíduos (por exemplo, 1 a 4 resíduos) são deletados em qualquer sítio dentro da molécula de proteína.

[0077] Como usado aqui, o termo "inserção" é a adição de um ou mais resíduos de aminoácidos não nativos na sequência de proteína. Normalmente, não mais do que cerca de 1 a 7 resíduos (por exemplo, 1 a 4 resíduos) são inseridos em qualquer sítio dentro da molécula de proteína. Proteínas

[0078] O fator de aglomeração A (CIfA) é uma proteína de adesão de S. aureus de ligação à cadeia y do fibrinogênio, presente em quase todas as cepas de S. aureus. Ele é um importante fator de virulência, contribuindo para a patogênese da artrite séptica e endocardite. O CIfA se liga ao C-terminal da cadeia y do fibrinogênio e, portanto, é capaz de induzir aglomeração de bactérias na solução de fibrinogênio. A ex- pressão de CIfA em S. aureus dificulta a fagocitose por macrófagos e neutrófilos. Nos neutrófilos, isso ocorre devido a um mecanismo de- pendente de fibrinogênio e a um mecanismo independente de fibrino- gênio. Por outro lado, as plaquetas são ativadas por bactérias que ex- pressam CIfA através de sua interação com GPIIb / lIlla, levando à agregação. Isso é executado com mais eficiência quando o fibrinogê- nio está presente, mas também existe uma via independente do fibri- nogênio para a ativação de plaquetas.

[0079] CIfA contém um domínio N-terminal A de 520 aminoácidos (a região de ligação ao fibrinogênio), que compreende três subdomí- nios dobrados separadamente N1, N2 e N3. O domínio A é seguido por uma região de repetição de dipeptídeo serina-aspartato e uma re- gião abrangendo a parede celular e uma região abrangendo a mem- brana, que contém o motivo LPDTG para ancoragem promovida por sortase à parede celular.

[0080] Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção pode ser derivado de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 que é um fragmento imunogênico e / ou uma variante da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, SEQ ID NO: 3).

[0081] Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção pode ser derivado de um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 compreen- dendo pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 300 ou pelo menos cerca de 400 resíduos de aminoá- cidos contíguos da sequência de comprimento total, em que o dito po- lipeptídeo é capaz de provocar uma resposta imune específica para a dita sequência de aminoácidos. Sabe-se que o domínio de ligação ao fibrinogênio de CIfA nativo consiste em três subdomínios dobrados se-

paradamente N1, N2 e N3, como mostrado na Figura 1. Esses domí- nios podem ser modificados removendo-se e / ou modificando-se um ou mais desses domínios. Em uma modalidade, o fragmento de SEQ ID NO: 1 contém exatamente ou pelo menos 1, 2 ou 3 domínios. Em outra modalidade, o fragmento de SEQ ID NO: 1 contém exatamente ou pelo menos 2 ou 3 domínios. Em outra modalidade, o fragmento de SEQ ID NO: 1 contém pelo menos 2 domínios, preferencialmente do- mínios N2 e N3. Em uma modalidade, o fragmento de SEQ ID NO: 1 pode compreender (ou consistir de) os resíduos de aminoácidos de N1 (resíduos 39 a 220) da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o frag- mento de SEQ ID NO: 1 pode compreender (ou consistir de) os resí- duos de aminoácidos de N2 (resíduos 221 a 368) da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o fragmento de SEQ ID NO: 1 pode compreen- der (ou consistir de) os resíduos de aminoácidos de N3 (resíduos 369 a 560) 2 da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o fragmento de SEQ ID NO: 1 pode compreender (ou consistir de) os resíduos de aminoá- cidos de N1IN2N3 (resíduos 39 a 560) da SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade preferencial, o fragmento de SEQ ID NO: 1 pode compreender (ou consistir de) os resíduos de aminoácidos de N2N3 (resíduos 221 a 560) da SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3).

[0082] Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção pode compreender (ou consistir de) subdomínios N1, N2 e N3 de CIfA (SEQ ID NO: 2) ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o polipeptídeo da invenção pode compreender (ou consistir de) subdomínios N2 e N3 (SEQ ID NO: 3) ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3.

[0083] A presente invenção fornece assim um polipeptídeo com-

preendendo (ou consistindo em) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica à SEQ ID NO: 3 (por exemplo, SEQ ID NO: 4), modificada pelo fato de que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais sequências consenso selecionadas a partir de: D/E-X-N-2Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID 22), em que X e Z são inde- pendentemente qualquer aminoácido, exceto a prolina. Estas sequên- cias podem ser modificadas pela adição de uma serina N-terminal para fins de clonagem. As sequências podem ainda ser modificadas para conter mutações desintoxicantes, como qualquer uma ou todas as mu- tações desintoxicantes descritas aqui.

[0084] Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção pode ser derivado de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1, que é uma variante da SEQ ID NO: 1 que foi modificada pela deleção e / ou adição e / ou substituição de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos). A substi- tuição de aminoácidos pode ser conservativa ou não conservativa. Em um aspecto, a substituição de aminoácidos é conservativa. Substitui- ções, deleções, adições ou qualquer combinação das mesmas podem ser combinadas em uma única variante, desde que a variante seja um polipeptídeo imunogênico. Em uma modalidade, a proteína CIfA modi- ficada da presente invenção pode ser derivada de uma variante na qual 1 a 10, 5a 10, 1a 5, 1a 3,1a2ou1 aminoácidos são substituí- dos, deletados ou adicionados em qualquer combinação. Por exemplo, o polipeptídeo da invenção pode ser derivado de uma sequência de aminoácidos que é uma variante da SEQ ID NO: 3, pelo fato de que compreende uma serina N-terminal adicional (por exemplo, SEQ ID NO: 12).

[0085] Em uma modalidade, a presente invenção inclui fragmentos e / ou variantes que compreendem um epítopo de célula B ou célula T. Esses epítopos podem ser previstos usando uma combinação de pre- visão da estrutura 2D, por exemplo, usando o programa PSIPRED (de David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade de Brunei, Uxbridge UB8 3PH, Reino Unido) e o índice antigênico calculado com base no método descrito por Ja- meson e Wolf (CABIOS 4: 181 a 186 [1988]).

[0086] O termo "polipeptídeo” refere-se a uma sequência de ami- noácidos CIfA (por exemplo, tendo uma sequência de aminoácidos CIfA da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3), sequência de aminoácidos de CIfA que pode ser uma sequência de aminoácidos de CIfA de ocorrência natural que foi modificada pela adição, substituição ou deleção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, pela adição de uma sequência consenso selecionada a partir de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N- Z-SIT-K (SEQ ID NO: 22) ou por substituição de um ou mais aminoáci- dos por uma sequência consenso selecionada a partir de D/E-X-N-Z- S/T (SEQ ID NO: 22) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 23). O poli- peptídeo também pode compreender modificações adicionais (adi- ções, substituições, deleções), bem como a adição ou substituição de uma ou mais sequências consenso. Por exemplo, a proteína CIfA pode conter mutações desintoxicantes para reduzir ou eliminar a ligação ao fibrinogênio, conforme descrito abaixo, a sequência sinal de uma pro- teína CIfA de ocorrência natural pode ser deletada ou substituída por uma sequência sinal alternativa, e / ou uma etiqueta de peptídeo pode ser adicionada. Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção pode ser uma proteína CIfA de ocorrência não natural. Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO:

10.

[0087] Em uma modalidade da invenção, um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1 a 7 aminoácidos, por exemplo, um aminoácido) da se- quência de aminoácidos de CIfA (por exemplo, tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácido de CIfA pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3) foram substituídos por uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) ou K-D/E-X- N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) (por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)). Por exemplo, um único aminoácido na sequência de amino- ácidos de CIfA (por exemplo, SEQ ID NO: 3) pode ser substituído por uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) ou K-D/E-X- N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) (por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)). Alternativamente, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos na sequên- cia de aminoácidos de CIfA (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma se- quência de aminoácidos de CIfA pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3) podem ser substituídos por uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) (por exemplo, K-D-Q-N-A- T-K (SEQ ID NO: 23)).

[0088] A introdução de uma sequência consenso selecionada a partir de: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) permite que o polipeptídeo seja glicosilado. Assim, a pre- sente invenção também fornece um polipeptídeo da invenção em que o polipeptídeo é glicosilado. Em modalidades específicas, as sequên- cias consenso são introduzidas em regiões específicas da sequência de aminoácidos de CIfA, por exemplo, estruturas de superfície da pro- teína, nos N-terminais ou C-terminais da proteína e / ou em alças que são estabilizadas por pontes dissulfeto na base da proteína. Em um aspecto da invenção, a posição da(s) sequência(s) consenso fornece glicosilação melhorada, por exemplo, aumento do rendimento. Em uma modalidade, a(s) sequência(s) consenso selecionada(s) a partir de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) (por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)) está localizada na extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos de CIfA modifi- cada no C-terminal, por exemplo, na posição a 25 aminoácidos ou menos do C-terminal. Em uma modalidade, a sequência consenso é substituída pelo aminoácido correspondente à posição 557 da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7-12).

[0089] Em uma modalidade, uma sequência consenso selecionada a partir de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-2Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) (por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)) foi adicio- nada ou substituída para um ou mais resíduos de aminoácidos 533- 560 (por exemplo, no lugar de um ou mais resíduos de aminoácidos 550-560, ou no lugar do resíduo de aminoácido Q547, P549, P551 ou 1557, preferencialmente 1557) da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição equivalente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 (por exemplo, em uma posição equivalente na sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 3, isto é, Q327, D329, P331 ou 1337; por exem- plo, SEQ ID NOS. 7-12).

[0090] Será entendido por um versado na técnica que a referência a "entre os aminoácidos...” (por exemplo, "entre os aminoácidos 533- 560”) refere-se ao número de aminoácidos contados consecutivamen- te a partir do N-terminal da sequência de aminoácidos, por exemplo "entre os aminoácidos 533-560... da SEQ ID NO: 1” refere-se à posi- ção na sequência de aminoácidos entre o 533º e o 560º aminoácido da SEQ ID NO: 1 incluindo o 533º e o 560º aminoácido. Assim, em uma modalidade em que "uma sequência consenso selecionada a partir de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO:

22) (por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)) foi adicionada ou substituída por um ou mais aminoácidos entre os resíduos de aminoá- cidos 533-560”, a sequência consenso pode ter sido adicionada ou substituída para qualquer um (ou mais) dos números de aminoácidos 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559 ou 560 na SEQ ID NO: 1. Um versado na técnica entenderá que quando a sequência de aminoácidos de CIfA é uma variante e / ou fragmento de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, tal como uma se- quência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mes- ma, tal como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, a referência a "entre aminoácidos...” refere-se a uma posição que seria equivalente à posi- ção definida, se essa sequência estivesse alinhada com uma sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de modo a maximizar a identida- de da sequências entre as duas sequências (as ferramentas de ali- nhamento de sequências não estão limitadas a Clustal Omega (www(.)ebi(.)Ac(.)Ac(.JUKk) MUSCLE (www(.)ebi(.)ac(.)Uk) ou T-coffee (www(.)tcoffee(.)org). Em um aspecto, a ferramenta de alinhamento de sequências usada é o Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uUk). Por exemplo, os ditos números de aminoácidos na SEQ ID NO: 1 corres- pondem aos números de aminoácidos 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 ou 340 das SEQ ID NOs: 3 e 4.

[0091] A adição ou deleção de aminoácidos da variante e / ou fra- gmento da SEQ ID NO:1 pode levar a uma diferença na posição de aminoácidos real da sequência consenso na sequência mutada, no entanto, ao alinhar a sequência mutada com a sequência de referên- cia, o aminoácido em uma posição equivalente ao aminoácido corres- pondente na sequência de referência pode ser identificado e, portanto,

a posição apropriada para adição ou substituição da sequência con- senso pode ser estabelecida.

[0092] Em uma modalidade, a proteína modificada da invenção compreende pelo menos 1, 2, 3 ou 4 sequências consenso D/E-X-N-X- S/T ou exatamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências consenso D/E-X-N-X- S/T. Em uma modalidade, a proteína modificada da invenção compre- ende pelo menos 1, 2, 3 ou 4 sequências consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) ou exatamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências consen- so de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, a proteí- na modificada da invenção compreende pelo menos 1, 2, 3 ou 4 se- quências consenso K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) ou exatamen- te 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências consenso K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, a proteína modificada da invenção compreende uma única sequência consenso selecionada a partir de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, a sequência consenso é D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21), em que X é Q (glutamina) e Z é A (alanina), por exemplo, D-Q-N-A-T. Em uma modalidade, a sequência consenso é K- D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22), em que X é Q (glutamina) e Zé R (arginina), por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO: 24). Em uma modalidade preferencial, a sequência consenso é K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22), em que X é Q (glutamina) e Z é A (alanina), por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23).

[0093] Como a atividade de ligação ao fibrinogênio de CIfA é ne- cessária para que ela atue como um fator de virulência, a proteína CIfA pode ser modificada para reduzir ou eliminar a atividade de ligação ao fibrinogênio para que possa ser administrada in vivo. Um polipeptídeo pode ter uma das mutações descritas em WO 2011/007004, por exem- plo, mutações em um ou preferencialmente ambos os aminoácidos cor- respondentes aos resíduos P336 e Y338 da SEQ ID NO: 1 (resíduos

P116 e Y118 da SEQ ID NO: 3), por exemplo, P336S e / ou Y338A. Se- quências exemplificativas são as das SEQ ID NOs: 4-6 e, 10-12 e 25-27.

[0094] Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção compre- ende ainda uma "etiqueta de peptídeo” ou "etiqueta”, isto é, uma se- quência de aminoácidos que permite o isolamento e / ou identificação do polipeptídeo. Por exemplo, adicionar uma etiqueta a um polipeptí- deo da invenção pode ser útil na purificação dessa proteína e, portan- to, na purificação de vacinas conjugadas compreendendo a proteína CIfA modificada marcada. Etiquetas exemplificativas que podem ser utilizadas aqui incluem, sem limitação, etiquetas de histidina (HIS) (por exemplo, etiquetas de hexa-histidina ou etiqueta 6XHis), etiquetas FLAG-TAG e HA. Em uma modalidade, a etiqueta é uma etiqueta de hexa-histidina. Em certas modalidades, as etiquetas usadas neste do- cumento são removíveis, por exemplo, remoção por agentes químicos ou por meios enzimáticos, uma vez que não são mais necessários, por exemplo, após a proteína ter sido purificada. Opcionalmente, a etique- ta de peptídeo está localizada no C-terminal da sequência de aminoá- cidos. Opcionalmente, a etiqueta de peptídeo compreende seis resí- duos de histidina no C-terminal da sequência de aminoácidos. Em um aspecto, a proteína CIfA modificada da invenção compreende (ou con- siste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6, a dita sequência de aminoácidos compreen- dendo uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido, exceto proli- na (por exemplo, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO 22) ou K-D-Q-N-A- T-K (SEQ ID NO: 23)) e uma etiqueta de peptídeo (por exemplo, seis resíduos de histidina no C-terminal da sequência de aminoácidos). Opcionalmente, o polipeptídeo da invenção tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID

NO: 25, 25 ou 27.

[0095] Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção compre- ende uma sequência sinal que é capaz de direcionar a proteína CIfA para o periplasma de uma célula hospedeira (por exemplo, bactéria). Em uma modalidade específica, a sequência sinal é de flagelina (Flgl) de E. coli [IMIKFLSALILLLVTTAAQA (SEQ ID NO: 13)]. Em outras mo- dalidades, a sequência sinal é da membrana externa de E. coli porina A (OmpA) [MKKTAIAIlAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 14)], proteína de ligação à maltose de E. coli (MalE) [M KI KT GARI LALSALTTM M FSASALA (Seg ID 15)], pectate liase de Enwinia carotovorans (PelB) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 16)]J, enterotoxina lábil ao calor LTIlb de E. coli [MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA (SEQ ID NO: 17)], DSbA de E. coli [MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 18)), TolB [MKQALRVAFGFLILWASVLHA (SEQ ID NO: 19)) ou SipA [IMKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS (SEQ ID NO: 20)]. Em uma modalidade, a sequência sinal tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma SEQ ID NO: 13-20. Em um aspecto, a sequência sinal tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência sinal de fla- gelina (Flgl) de E. coli [MIKFLSALILLLVTTAAQA (SEQ ID NO: 13)]. Sequências de CIfA modificadas exemplificativas compreendendo uma sequência sinal são SEQ ID NOs: 5, 11 e 26.

[0096] Em uma modalidade, um resíduo de aminoácido adicional (por exemplo, serina ou alanina) é adicionado entre a sequência sinal e o início da sequência da proteína madura, como, por exemplo, SEQ ID NOs: 5 e 11. Esse resíduo tem a vantagem de levar a uma clivagem mais eficiente da sequência líder.

[0097] Em um aspecto, o polipeptídeo da invenção compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à se- quência da SEQ ID NO: 3, a dita sequência de aminoácidos compre- endendo: as substituições de aminoácidos P116 a Se Y118 a A, uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) em que XK e Z são independentemente qualquer aminoácido exceto prolina (por exemplo, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)) e em que a dita sequência consenso é preferencial- mente substituída pelo resíduo de aminoácido 1337, uma etiqueta de 6- His no C-terminal da sequência de aminoácidos e opcionalmente uma sequência sinal, preferencialmente uma sequência sinal FlglL (SEQ ID NO: 13)) no N-terminal da sequência sinal, opcionalmente seguido por um resíduo de serina adicional. Em uma modalidade, uma proteína CIfA modificada da invenção tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de amino- ácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs 10-12 ou SEQ ID NOs. 25-

27. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptí- deo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs 10-12 ou SEQ ID NOs. 25-27.

[0098] Um outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs. 10-12 ou 25-26. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de qual- quer uma das SEQ ID NOs. 10-12 ou 25-27. Um vetor compreendendo esse polinucleotídeo é um outro aspecto da invenção. Conjugados

[0099] A presente invenção também fornece um conjugado (por exemplo, bioconjugado) compreendendo (ou consistindo em) um poli- peptídeo da invenção, em que o polipeptídeo está ligado, por exemplo, covalentemente ligado, a um antígeno, de preferência um antígeno de polissacarídeo ou oligossacarídeo.

[00100] Em uma modalidade, o conjugado compreende um conju- gado (por exemplo, bioconjugado) compreendendo (ou consistindo em) um polipeptídeo da invenção tendo uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NOs. 4-12 ou 25-27 ligados covalentemente a um antígeno, em que o antígeno está ligado (ou diretamente ou através de um ligan- te) a um resíduo de aminoácido do polipeptídeo.

[00101] Em uma modalidade, o polipeptídeo é covalentemente liga- do ao antígeno através de uma ligação química obtida utilizando um método de conjugação química (isto é, o conjugado é produzido por conjugação química).

[00102] Em uma modalidade, o método de conjugação química é selecionado a partir do grupo que consiste em química de carbodi- imida, animação redutora, química de cianilação (por exemplo, quími- ca de CDAP), química de maleimida, química de hidrazida, química de éster, e química de N-hidroxisuccinimida. Os conjugados podem ser preparados por métodos de aminação redutora direta, conforme des- crito em US 200710184072 (Hausdorff) US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos em EP-0-161-188, EP-208375 e EP-0-477508. O método de conjugação pode alternati- vamente depender da ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP) para formar um cianato éster. Tais conjugados são descritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed Services University e WO 95/08348 e WO 96/29094. Ver também Chu C. e outros Infect. Immunity, 1983 245 256.

[00103] Em geral, os seguintes tipos de grupos químicos em um polipeptídeo podem ser usados para acoplamento / conjugação:

[00104] A) Carboxil (por exemplo, via ácido aspártico ou ácido glu- tâmico). Em uma modalidade, este grupo está ligado a grupos amino diretamente em sacarídeos ou a um grupo amino em um ligante com o produto químico carbodi-imida, por exemplo, com EDAC.

[00105] BB) Grupo amino (por exemplo, via lisina). Em uma modali- dade, este grupo está ligado a grupos carboxila nos sacarídeos dire- tamente ou a um grupo carboxila em um ligante com o produto quími- co carbodi-imida, por exemplo, com EDAC. Em outra modalidade, este grupo está ligado a grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr em sacarídeos diretamente ou a esses grupos em um ligante; a sacarí- deos ou ligantes tendo um grupo aldeído; a sacarídeos ou ligantes tendo um grupo succinimida éster.

[00106] C) Sulfidrila (por exemplo, via cisteína). Em uma modalida- de, este grupo está ligado a um sacarídeo bromo ou cloro acetilado ou ligante com o produto químico maleimida. Em uma modalidade, este grupo é ativado / modificado com bis diazobenzidina.

[00107] D) Grupo hidroxila (por exemplo, via tirosina). Em uma mo- dalidade, este grupo é ativado / modificado com bis diazobenzidina.

[00108] E) Grupo imidazolila (por exemplo, via histidina). Em uma modalidade, este grupo é ativado / modificado com bis diazobenzidina.

[00109] —F) Grupo guanidila (por exemplo, via arginina).

[00110] G) Grupo indolila (por exemplo, via triptofano).

[00111] Emum sacarídeo, em geral os seguintes grupos podem ser usados para um acoplamento: OH, COOH ou NH>2. Grupos aldeídos podem ser gerados após diferentes tratamentos, tal como: periodato, hidrólise ácida, peróxido de hidrogênio, etc.

[00112] — Abordagens de acoplamento direto:

[00113] Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> cianato éster + NH2- Proteína ----> conjugado

[00114] Sacarídeo-aldeído + NH>-proteína ----> base Schiff + NaC- NBH;3 ----> conjugado

[00115] Sacarídeo-COOH + NH>-proteína + EDAC ----> conjugado

[00116] Sacarídeo-NH?; + COOH-proteína + EDAC ----> conjugado

[00117] — Acoplamento indireto via abordagens espaçadoras (ligante):

[00118] Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> cianato éster + NH? -- -- NH? --—-> sacarídeo ---- NH2 + COOH-proteína + EDAC ----> conju- gado

[00119] Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> cianato éster + NH? -- -- SH ----> sacarídeo ---- SH + SH-Proteína (proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após modificação dos grupos amino da pro- teína por SPDP, por exemplo) ----> sacarídeo-S-S-Proteína

[00120] Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> cianato éster + NH? -- -- SH ----> sacarídeo ---- SH + maleimida-Proteína (modificação de grupos amino) ----> conjugado

[00121] Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> cianato éster + NH? -- -- SH ----> Sacarídeo-SH + proteína haloacetilada ----> Conjugado

[00122] —Sacarídeo-COOH + EDAC + NH, ---- NH2 ----> sacarídeo --- -- NH2 + EDAC + COOH- Proteína ----> conjugado

[00123] “Sacarídeo-COOH + EDAC + NH> ---- SH ----> sacarídeo ---- SH + SH-Proteína (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obti- da após modificação de grupos amino da proteína por SPDP, por exemplo) ----> sacarídeo-S-S-Proteína

[00124] Sacarídeo-COOH + EDAC + NH> ---- SH ----> sacarídeo ---- SH + proteína maleimida (modificação dos grupos amino) ----> conju- gado

[00125] Sacarídeo-COOH + EDAC + NH> ---- SH ----> Sacarídeo- SH + proteína haloacetilada ----> Conjugado

[00126] Sacarídeo-aldeído + NH2 ----- NH2 ----> sacarídeo --- NH? + EDAC + COOH-proteína ----> conjugado

[00127] Nota: em vez de EDAC acima, qualquer carbodi-imida ade- quada pode ser usada.

[00128] Em uma modalidade, o antígeno está diretamente ligado ao polipeptídeo.

[00129] Em uma modalidade, o antígeno é acoplado ao polipeptí- deo através de um ligante. Opcionalmente, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em ligantes com 4 a 12 átomos de carbo- no, ligantes bifuncionais, ligantes contendo 1 ou 2 grupos amino reati- vos na extremidade, B-proprionamido, nitrofenil-etilamina, haletos de haloacila, ácido 6-aminocaproico e ADH. O sacarídeo ativado pode assim ser acoplado diretamente ou via um grupo espaçador (ligante) a um grupo amino no polipeptídeo. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para fornecer um polissacarídeo tiolado que pode ser acoplado a CIfA modificado por meio de uma ligação tioéter obtida após a reação com um polipeptídeo ativado por maleimida (por exemplo, usando GMBS (N-hidroxisuccinimida éster de ácido 4- maleimidobutírico)) ou um polipeptídeo haloacetilado (por exemplo, usando SIAB (sucinimidil (4-iodoacetil) aminobenzoato), ou SIA (succi- nimidil iodoacetato) ou SBAP (succinimidil-3-(bromoacetamida) propi- onato)). Em uma modalidade, o cianato éster (opcionalmente produzi- do pelo produto químico CDAP) é acoplado a hexano diamina ou ADH (dihidrazida de ácido adípico) e o sacarídeo amino-derivado é conju- gado ao polipeptídeo usando o produto químico carbodi-imida (por exemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDAC ou EDC)) através de um grupo carboxila na proteína CIfA modificada. Tais con- jugados são descritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Unifor- med Services University e WO 95/08348 e WO 96/29094.

[00130] Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido no polipeptí- deo ao qual o antígeno está ligado não é um resíduo de asparagina e, nesse caso, o conjugado é tipicamente produzido por conjugação quíi-

mica. Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido no polipeptídeo ao qual o antígeno está ligado é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ala, Arg, Asp, Cys, Gly, Glu, Gin, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val. Opcionalmente, o aminoácido é: um aminoácido contendo um grupo amino terminal, uma lisina, uma argi- nina, um ácido glutamínico, um ácido aspártico, uma cisteína, uma ti- rosina, uma histidina ou um triptofano. Opcionalmente, o antígeno é covalentemente ligado ao aminoácido no polipeptídeo selecionado a partir de: ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, his- tidina, arginina ou triptofano. De preferência, o antígeno está ligado a um resíduo de asparagina.

[00131] Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido no polipeptí- deo ao qual o antígeno está ligado não é parte da sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido no polipeptídeo ao qual o antígeno está ligado não é o resíduo de asparagina na sequên- cia consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-2Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22).

[00132] —Alternativamente, em outra modalidade, o antígeno está ligado a um aminoácido no polipeptídeo selecionado a partir de aspa- ragina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, histi- dina, arginina ou triptofano (por exemplo, asparagina). Em outra moda- lidade, o resíduo de aminoácido no polipeptídeo ao qual o antígeno está ligado é um resíduo de asparagina. Em outra modalidade, o resí- duo de aminoácido no polipeptídeo ao qual o antígeno está ligado é parte da sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22) (por exemplo, a asparagina na se- quência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-z- S/T-K (SEQ ID NO: 22)).

Antígenos de Polissacarídeos

[00133] Em uma modalidade, um dos antígenos em um conjugado (por exemplo, bioconjugado) da invenção é um sacarídeo, tal como um sacarídeo capsular bacteriano, um lipopolissacarídeo bacteriano ou um oligossacarídeo bacteriano. Em uma modalidade, o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano.

[00134] Os sacarídeos podem ser selecionados a partir de um gru- po que consiste em: sacarídeo capsular de Staphylococcus aureus tipo 5, sacarídeo capsular de Staphylococcus aureus tipo 8, sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo A (MenA), sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C (MenC), sacarídeo capsular de N. me- ningitidis sorogrupo Y (MenY), sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo W (MenW), sacarídeo capsular de H. influenzae tipo b (Hib), sacarídeo capsular grupo | de Estreptococcus grupo B, sacarídeo cap- sular grupo Il Estreptococcus grupo B, sacarídeo capsular grupo Ill de Estreptococcus grupo B, sacarídeo capsular grupo IV de Estreptococ- cus grupo B, sacarídeo capsular grupo V de Estreptococcus grupo B, sacarídeo Vi a partir de Salmonella typhi, LPS de N. meningitidis (tal como L3 e / ou L2), LPS de M. catarrhalis, LPS de H. influenzae, antí- genos O de Shigella, antígenos O de P.aeruginosa, antígenos O de E. coli ou de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae.

[00135] Em uma modalidade, o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano de Staphylococcus aureus. O sacarídeo capsular bacteria- no de Staphylococcus aureus pode ser selecionado a partir de um sa- carídeo capsular sorotipo 5 ou 8 de Staphylococcus aureus. Por exemplo, o antígeno pode ser um sacarídeo capsular de Staphylococ- cus aureus sorotipo 8.

[00136] Em uma modalidade da invenção, o antígeno é uma unida- de de repetição de um sacarídeo capsular bacteriano de Staphylococ- cus aureus. Em uma modalidade da invenção, o antígeno compreende uma unidade de repetição de um sacarídeo capsular bacteriano a par- tir de Staphylococcus aureus sorotipo 5 ou 8.

[00137] Em uma modalidade da invenção, o antígeno compreende uma unidade de repetição de um sacarídeo capsular bacteriano a par- tir de Staphylococcus aureus sorotipo 8. Em uma modalidade da in- venção, o antígeno compreende: Ns a B o spo T3* L-FucNAc 3 D- FucNAc e n

[00138] onde 'n' é qualquer número inteiro, mas de preferência con- forme definido abaixo (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).

[00139] Em uma modalidade da invenção, o antígeno compreende uma unidade de repetição de um sacarídeo capsular bacteriano a par- tir de Staphylococcus aureus sorotipo 5. Em uma modalidade da in- venção, o antígeno compreende: eras FucNAc—»D- ranel n

[00140] onde n' é qualquer número inteiro, mas de preferência con- forme definido abaixo (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).

[00141] Em uma modalidade, o antígeno é um polissacarídeo ou oligossacarídeo. Em uma modalidade, o antígeno compreende dois ou mais monossacarídeos, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais monossacarídeos. Em uma modalidade, o antígeno é um oligossacarí- deo contendo não mais de 20, 15, 12, 10, 9 ou 8 monossacarídeos. Em uma modalidade, o antígeno é um oligossacarídeo contendo não mais que 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou monossacarídeos.

Célula Hospedeira

[00142] A presente invenção também fornece uma célula hospedei- ra compreendendo:

[00143] i)um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosil trans- ferase(s);

[00144] ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfe- rase;

[00145] iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da in- venção; e opcionalmente

[00146] iv) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exemplo, wzy).

[00147] As células hospedeiras que podem ser utilizadas para pro- duzir os bioconjugados da invenção incluem archea, células hospedei- ras procarióticas, e células hospedeiras eucarióticas. Células hospe- deiras procarióticas exemplificativas para uso na produção dos biocon- jugados da invenção incluem, sem limitação, espécie Escherichia, es- pécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Lactococcecus, espécie Lactobaci- Ilus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Strep- tomyces, Espécie Streptococcus, espécie Staphylococcus, espécie Bacillus e espécie Clostridium. Em uma modalidade específica, a célu- la hospedeira é E. coli.

[00148] Em uma modalidade, as células hospedeiras usadas para produzir os bioconjugados da invenção são manipuladas para com- preender ácidos nucleicos heterólogos, por exemplo, ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais proteínas carreadoras e / ou ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais proteínas, por exemplo, genes que codificam uma ou mais proteínas. Em uma modalidade específica, os ácidos nucleicos heterólogos que codificam proteínas envolvidas nas vias de glicosilação (por exemplo, vias de glicosilação procariótica e / ou eucariótica) podem ser introduzidos nas células hospedeiras da invenção. Tais ácidos nucleicos podem codifi- car proteínas incluindo, sem limitação, oligossacaril transferases, epi- merases, flipases, polimerases e / ou glicosil transferases. Ácidos nu- cleicos heterólogos (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam pro- teínas carreadoras e / ou ácidos nucleicos que codificam outras prote- íÍnas, por exemplo, proteínas envolvidas na glicosilação) podem ser introduzidos nas células hospedeiras da invenção usando métodos tal como eletroporação, transformação química por choque térmico, trans- formação natural, transdução de fagos, e conjugação. Em modalida- des específicas, os ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras da invenção utilizando um plasmídeo, por exemplo, os ácidos nucleicos heterólogos são expressos nas células hospedeiras por um plasmídeo (por exemplo, um vetor de expressão). Em outra mo- dalidade específica, os ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras da invenção usando o método de inserção descrito no pedido de patente internacional No. POCT/EP2013/068737 (publicado como WO 14/037585).

[00149] Assim, a presente invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende:

[00150] i) um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosil trans- ferase (s);

[00151] ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfe- rase;

[00152] iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da in- venção;

[00153] iv) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exemplo, wzy); e

[00154] vi) um ácido nucleico que codifica uma flipase (por exem- plo, wxy).

[00155] Em uma modalidade, modificações adicionais podem ser introduzidas (por exemplo, usando técnicas recombinantes) nas célu- las hospedeiras da invenção. Por exemplo, os ácidos nucleicos da cé- lula hospedeira (por exemplo, genes) que codificam proteínas que formam parte de uma via de glicosilação possivelmente competitiva ou interferente (por exemplo, competem ou interferem com um ou mais genes heterólogos envolvidos na glicosilação que são introduzidos de forma recombinante na célula hospedeira) podem ser deletados ou modificados no fundo genético da célula hospedeira (genoma) de uma maneira que os torna inativos / disfuncionais (isto é, os ácidos nuclei- cos da célula hospedeira que são deletados / modificados não codifi- cam uma proteína funcional ou não codificam uma proteína). Em uma modalidade, quando os ácidos nucleicos são deletados do genoma das células hospedeiras da invenção, eles são substituídos por uma sequência desejável, por exemplo, uma sequência que é útil para a produção de glicoproteínas.

[00156] Genes exemplificativos que podem ser deletados nas célu- las hospedeiras (e, em alguns casos, substituídos por outras sequên- cias de ácidos nucleicos desejados) incluem genes de células hospe- deiras envolvidas na biossíntese de glicolipídios, tal como waaL (ver, por exemplo, Feldman e outros 2005, PNAS USA 102: 3016 a 3021), o agrupamento de biossíntese de lipídios do núcleo A (waa), agrupa- mento de galactose (gal), agrupamento de arabinose (ara), agrupa- mento de ácido colônico (wc), agrupamento de polissacarídeos capsu- lares, genes de biossíntese de undecaprenol-pirofosfato (por exemplo, uppS (undecaprenil pirofosfato sintase), uppP (undecaprenil difosfa- tase)), genes de reciclagem de Und-P, enzimas metabólicas envolvi- das na biossíntese de açúcar ativada por nucleotídeos, agrupamento de antígeno comum enterobacteriano, e agrupamentos de modificação de antígeno O de pró-fago, como o agrupamento gtrABS.

[00157] Tal célula hospedeira procariótica modificada compreende ácidos nucleicos codificando enzimas capazes de produzir um biocon- jugado compreendendo um antígeno, por exemplo, um antígeno de sacarídeo ligado a um polipeptídeo da invenção. Tais células hospe- deiras podem expressar naturalmente ácidos nucleicos específicos para a produção de um antígeno de sacarídeo, ou as células hospe- deiras podem ser feitas para expressar esses ácidos nucleicos, isto é, em certas modalidades, os ditos ácidos nucleicos são heterólogos às células hospedeiras. Em certas modalidades, um ou mais dos ditos ácidos nucleicos específicos para a produção de um antígeno de saca- rídeo são heterólogos à célula hospedeira e integrados ao genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, as células hospedeiras da invenção compreendem ácidos nucleicos que codificam enzimas adi- cionais ativas na N-glicosilação de proteínas, por exemplo, as células hospedeiras da invenção compreendem adicionalmente um ácido nu- cleico codificando uma oligossacaril transferase e / ou um ou mais áci- dos nucleicos codificando outras glicosil transferases.

[00158] As sequências de ácido nucleico compreendendo grupos de genes de polissacarídeos capsulares podem ser inseridas nas célu- las hospedeiras da invenção. Em uma modalidade específica, o agru- pamento de genes do polissacarídeo capsular inserido em uma célula hospedeira da invenção é um agrupamento de gene do polissacarídeo capsular de uma cepa de E. coli, uma cepa de Staphylococcus (por exemplo, S. aureus), uma cepa de Streptococcus (por exemplo, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae) ou uma cepa de Burkhol- deria (por exemplo, B mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis). As descrições de métodos para fabricar essas células hospedeiras capa- zes de produzir bioconjugados são encontradas nos documentos WO 06/119987, WO 09/104074, WO 11/62615, WO 11/138361, WO 14/57109, WO 14/72405 e WO 16/20499.

[00159] Em uma modalidade, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína CIfA modificada em um plas- mídeo na célula hospedeira. Mecanismo de Glicosilação

[00160] As células hospedeiras da invenção compreendem e / ou podem ser modificadas para compreender ácidos nucleicos que codifi- cam mecanismos genéticos (por exemplo, glicosil transferases, flipa- ses, polimerases e / ou oligossacaril transferases) capazes de produzir oligossacarídeos e / ou polissacarídeos híbridos, além de mecanismos genéticos capazes de ligar antígenos ao polipeptídeo da invenção.

[00161] Os polissacarídeos capsulares de S. aureus são montados no lipídio carreador de membrana bacteriana undecaprenil pirofosfato por uma via conservada que compartilha homologia com a via depen- dente de polimerase da síntese de polissacarídeo O em bactérias Gram-negativas. A montagem de antígeno O é iniciada pela transfe- rência de um fosfato de açúcar de um doador DP para undecaprenil fosfato. O antígeno O ligado a lipídios é montado no lado citoplasmáti- co da membrana interna por ação sequencial de diferentes glicosil transferases. O glicolípido é então invertido para o espaço periplásmi- co e polimerizado. Ao substituir a ligase de antígeno O WaaL pela oli- gossacaril transferase PglB, o antígeno O polimerizado pode ser trans- ferido para uma proteína carreadora ao invés de para o núcleo de lipí- dio A. Glicosil transferases

[00162] As células hospedeiras da invenção compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosil transferases que produzem uma uni- dade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo. Em uma mo- dalidade, a dita unidade de repetição não compreende uma hexose na extremidade redutora, e a dita unidade de repetição de oligossacarí- deo ou polissacarídeo é derivada de uma unidade de repetição de oli-

gossacarídeo ou polissacarídeo doador que compreende uma hexose na extremidade redutora.

[00163] Em uma modalidade, as células hospedeiras da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica uma glicosil trans- ferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em unde- caprenil pirofosfato (Und-PP). Em um aspecto, a glicosil transferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é he- teróloga à célula hospedeira e / ou heteróloga a um ou mais dos genes que codificam glicosil transferase. A dita glicosil transferase pode ser derivada de, por exemplo, espécie Escherichia, espécie Shigella, es- pécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Aeromonas, espécie Francisella, espécie Helicobac- ter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, es- pécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Strep- tomyces, espécie Streptococcus, espécie Enterococcus, espécie Sta- Pphylococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium, espécie Listeria, ou espécie Campylobacter. Em uma modalidade específica, a glicosil transferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é wecA, opcionalmente a partir de E. coli (vecA pode montar GIcNAc em UndP de UDP-GICNAc). Em uma modalidade, o monossa- carídeo hexose é selecionado a partir do grupo que consiste em glico- se, galactose, ramnose, arabinotol, fucose e manose (por exemplo, galactose).

[00164] Em uma modalidade, as células hospedeiras da invenção podem compreender ácidos nucleicos que codificam uma ou mais gli- cosil transferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao deri- vado de monossacarídeo hexose montado em Und-PP. Em uma mo- dalidade específica, as ditas uma ou mais glicosil transferases capa- zes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose é a galactosil transferase (wfeD) de Shigella boyedii. Em outra modalidade específica, as ditas uma ou mais glicosil transferases ca- pazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarí- deo hexose é a galactofuranosil transferase (wbeY) de E. coli 028. Em outra modalidade específica, as ditas uma ou mais glicosil transferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossaca- rídeo hexose é a galactofuranosil transferase (wfdK) de E. coli 0167. As galf-transferases, tal como wfdK e wbeY, podem transferir Galf (Ga- lactofuranose) de UDP-Galf para -GIcNAc-P-P-Undecaprenil. Em outra modalidade específica, as ditas uma ou mais glicosil transferases ca- pazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarí- deo hexose são a galactofuranosil transferase (wbeY) de E. coli 028 e a galactofuranosil transferase (wfdK) de E. coli 0167.

[00165] Em uma modalidade, as células hospedeiras da invenção compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosil transferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monossacarídeo hexose.

[00166] Em uma modalidade, as glicosil transferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monossacarídeo hexose compreendem uma glicosil trans- ferase capaz de adicionar o monossacarídeo hexose presente na ex- tremidade redutora da primeira unidade de repetição de oligossacarí- deo ou polissacarídeo doador ao derivado de monossacarídeo hexose. As glicosil transferases exemplificativas incluem galactosil transferases (wciP), por exemplo, wciP de E. coli 021.

[00167] Em uma modalidade, as glicosil transferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monossacarídeo hexose compreendem uma glicosil trans- ferase que é capaz de adicionar o monossacarídeo que é adjacente ao monossacarídeo hexose presente na extremidade redutora da primeira unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no monossacarídeo hexose presente na extremidade redutora da primeira unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador. As glicosil transferases exemplificativas incluem glicosil transferase (wciQ), por exemplo, wciQ de E. coli 021.

[00168] Em uma modalidade, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosil transferases para síntese das unidades de repeti- ção de um oligossacarídeo ou polissacarídeo selecionado a partir do agrupamento de genes de Staphylococcus aureus CP5 ou CP8. Em uma modalidade específica, as glicosil transferases para síntese das unidades de repetição de um oligossacarídeo ou polissacarídeo são do agrupamento de genes de Staphylococcus aureus CP5. CP5 e CP8 de S. aureus têm uma estrutura semelhante aos genes sintéticos de antí- genos 011 de P. aeruginosa, de modo que esses genes possam ser combinados com genes de síntese de monossacarídeos de E. coli pa- ra sintetizar um polímero CP5 ou CP8 ligado a undecaprenil pirofosfa- to, consistindo em unidades de trissacarídeos de repetição.

[00169] Em uma modalidade, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosil transferases suficientes para síntese das unida- des de repetição do sacarídeo CP5 ou CP8 compreendendo capH, capl, capJ e / ou capK de CP5 ou S. aureus CP8. Opcionalmente, a célula hospedeira da invenção também compreende capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO, capP de CP5 ou S. aureus CP8. Alternativamente, a célula hospedeira da invenção também com- preende wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjl, wopM, wzz e / ou wzx de P. aeruginosa O11 e wecB, wecC de E. coli 016.

[00170] Em uma modalidade, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosil transferases suficientes para síntese das unida- des de repetição do sacarídeo CP5 compreendendo capH, capl, capJ e / ou capK de S. aureus CP5. Opcionalmente, a célula hospedeira da invenção também compreende capD, capE, capF, capG, capL, capM,

capN, capO, capP de S. aureus CP5. Alternativamente, a célula hos- pedeira da invenção também compreende wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjl, wbpM, wzz e / ou wzx de P. aeruginosa O11 e wecB, wecC de E. coli 016.

[00171] Em uma modalidade, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosil transferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monos- sacarídeo hexose compreendem uma glicosil transferase que é capaz de adicionar o monossacarídeo hexose presente na extremidade redu- tora da primeira unidade de repetição do oligossacarídeo ou polissaca- rídeo doador ao derivado de monossacarídeo hexose. Oligossacaril Transferases

[00172] A glicosilação da proteína N-ligada — a adição de moléculas de carboidrato a um resíduo de asparagina na cadeia de polipeptídeo da proteína alvo — é o tipo mais comum de modificação pós- traducional que ocorre no retículo endoplasmático dos organismos eu- carióticos. O processo é realizado pelo complexo enzimático de oli- gossacaril transferase (OST) responsável pela transferência de um oligossacarídeo pré-montado de um lipídio carreador (fosfato de doli- chol) para um resíduo de asparagina de uma proteína nascente na se- quência conservada Asn-X-Ser/Thr (onde X é qualquer aminoácido exceto prolina) no retículo endoplasmático.

[00173] Foi demonstrado que uma bactéria, o patógeno de origem alimentar Campylobacter jejuni, também pode N-glicosilar suas proteí- nas (Wacker e outros Science. 2002; 298 (5599): 1790-3) devido ao fato de possuir o seu próprio mecanismo de glicosilação. O mecanis- mo responsável por essa reação é codificado por um agrupamento chamado "pgl” (para glicosilação de proteínas).

[00174] O mecanismo de glicosilação de C. jejuni pode ser transfe- rido para E. coli para permitir a glicosilação de proteínas recombinan-

tes expressas pelas células de E. coli. Estudos anteriores demonstra- ram como gerar cepas de E. coli que podem realizar a N-glicosilação (ver, por exemplo, Wacker e outros, Science. 2002; 298 (5599): 1790- 3; Nita-Lazar e outros Glycobiology. 2005; 15 (4): 361-7; Feldman e outros, Proc Natl Acad Sci US A. 2005; 102 (8): 3016-21; Kowarik e outros EMBO J. 2006; 25 (9): 1957-66; Wacker e outros Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103 (18): 7088-93; Publicações de Pedidos de Patentes Internacionais Nos. WO 2003/074687, WO 2006/119987, WO 2009/104074 e WO 2011/06261 e WO 2011/138361) Os mutantes de PglB tendo propriedades otimizadas são descritos em WO 2016/107818. Um mutante preferencial é o PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669v, como descrito nos Exemplos.

[00175] As oligossacaril transferases transferem oligossacarídeos ligados a lipídio para resíduos de asparagina de cadeias de polipeptí- deos nascentes que compreendem um motivo consenso de N- glicosilação, por exemplo, Asn-X-Ser (Thr), em que X pode ser qual- quer aminoácido exceto Pro; ou Asp (Glu) -X-Asn-Z-Ser (Thr), em que X e Z são selecionados independentemente de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (consultar WO 2006/119987). Ver, por exemplo, WO 2003/074687 e WO 2006/119987, cujas descrições são aqui in- corporadas por referência em sua totalidade.

[00176] Em uma modalidade, as células hospedeiras da invenção compreendem um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril trans- ferase. O ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase po- de ser nativo à célula hospedeira ou pode ser introduzido na célula hospedeira usando abordagens genéticas, como descrito acima. Em uma modalidade específica, a oligossacaril transferase é uma oligos- sacaril transferase de Campylobacter. Em outra modalidade especifi- ca, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase de Campylobacter jejuni (isto é, pglB; ver, por exemplo, Wacker e outros

2002, Science 298: 1790 a 1793; ver também, por exemplo, NCBI Ge- ne ID: 3231775, número de acesso UniProt 086154). Em outra modali- dade específica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril trans- ferase de Campylobacter lari (ver, por exemplo, NCBI Gene |D: 7410986).

[00177] Em uma modalidade específica, as células hospedeiras da invenção compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase, em que a dita sequência de ácido nu- cleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, palB de Campylobacter jejuni) é integrada ao genoma da célula hospedeira.

[00178] Em uma modalidade específica, as células hospedeiras da invenção compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase, em que a dita sequência de ácido nu- cleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni) é transmitida por plasmídeo.

[00179] Em outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célu- la hospedeira procariótica modificada que compreende (i) uma glicosil transferase derivada de um agrupamento de polissacarídeo capsular de S. aureus, em que a dita glicosil transferase é integrada no genoma da dita célula hospedeira; (ii) um ácido nucleico que codifica uma oli- gossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni), em que o dito ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase é transmitido por plasmídeo e / ou integrado ao genoma da célula hos- pedeira; e (iii) um polipeptídeo da invenção, em que o dito polipeptídeo é transmitido por plasmídeo ou integrado ao genoma da célula hospe- deira. Também é fornecido um método para produzir uma célula hos- pedeira procariótica modificada, compreendendo (i) integrar uma glico- sil transferase derivada de um agrupamento de polissacarídeo capsu- lar de S. aureus no genoma da dita célula hospedeira; (ii) integrar na célula hospedeira um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma oli-

gossacaril transferase (por exemplo, palB de Campylobacter jejuni) que é transmitida por plasmídeo e / ou integrada no genoma da célula hospedeira; e (iii) integrar em uma célula hospedeira um polipeptídeo da invenção ou transmitido por plasmídeo ou integrado ao genoma da célula hospedeira.

[00180] Em uma modalidade específica, é uma célula hospedeira da invenção em que pelo menos um gene da célula hospedeira foi ina- tivado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi inativado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL do célula hospedeira foi substituí- do por um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituí- do por palB de C. jejuni. Polimerases

[00181] Em uma modalidade, uma polimerase (por exemplo, wzy) é introduzida em uma célula hospedeira da invenção (isto é, a polimera- se é heteróloga à célula hospedeira). Em uma modalidade, a polime- rase é uma polimerase bacteriana. Em uma modalidade, a polimerase é uma polimerase de polissacarídeo capsular (por exemplo, wzy) ou uma polimerase de antígeno O (por exemplo, wzy). Em uma modali- dade, a polimerase é uma polimerase de polissacarídeo capsular (por exemplo, wzy).

[00182] Em uma modalidade, uma polimerase de uma via biossinté- tica de polissacarídeo capsular é introduzida em uma célula hospedei- ra da invenção.

[00183] Em outra modalidade específica, uma polimerase de uma via biossintética de polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus é introduzida em uma célula hospedeira da invenção.

[00184] Em uma modalidade, a polimerase introduzida nas células hospedeiras da invenção é o gene wzy de um agrupamento de genes de polissacarídeo capsular de S. aureus CP5 ou CP8 (cap5J / cap8l). Em uma modalidade específica, a polimerase introduzida nas células hospedeiras da invenção é o gene wzy a partir de um agrupamento de genes de polissacarídeo capsular de CP8 (cap8l).

[00185] Em outra modalidade específica, a dita polimerase é incor- porada (por exemplo, inserida no genoma ou plasmídeo expresso por) na dita célula hospedeira como parte de um agrupamento de polissa- carídeo capsular de S. aureus, em que o dito agrupamento de polissa- carídeo capsular de S. aureus foi modificado para compreender a po- limerase wzy.

[001868] Em uma modalidade específica, uma sequência de ácido nucleico que codifica a polimerase wzy de S. aureus é inserida ou ex- pressa pelas células hospedeiras da invenção. Assim, uma célula hos- pedeira da invenção pode ainda compreender uma polimerase de S. aureus wzy. Flipases

[00187] Em uma modalidade, uma flipase (wzx ou homólogo) é in- troduzida em uma célula hospedeira da invenção (isto é, a flipase é heteróloga à célula hospedeira). Assim, uma célula hospedeira da in- venção pode ainda compreender uma flipase. Em uma modalidade, a flipase é uma flipase bacteriana. As flipases translocam unidades de repetição de ocorrência natural e / ou suas unidades de repetição ma- nipuladas (híbridas) correspondentes a partir do citoplasma para o pe- riplasma das células hospedeiras (por exemplo, E. coli). Assim, uma célula hospedeira da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma flipase (wzx).

[00188] Em uma modalidade específica, uma flipase de uma via bi- ossintética de polissacarídeo capsular é introduzida em uma célula hospedeira da invenção.

[00189] Em outra modalidade específica, uma flipase de uma via biossintética de polissacarídeo capsular de S. aureus é introduzida em uma célula hospedeira da invenção. Em certas modalidades, a flipase introduzida nas células hospedeiras da invenção é o gene capK a par- tir de um agrupamento de genes de polissacarídeo capsular de S. au- reus CP5 ou CP8. Em uma modalidade específica, a flipase introduzi- da nas células hospedeiras da invenção é o gene capK a partir de um agrupamento de genes de polissacarídeo capsular de CP8.

[00190] Outras flipases que podem ser introduzidas nas células hospedeiras da invenção são, por exemplo, a partir de Campylobacter jejuni (por exemplo, palK). Enzimas que Modificam Monossacarídeos Enzimas Acessórias

[00191] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas acessórias são introduzidos nas células hospe- deiras da invenção. Assim, uma célula hospedeira da invenção pode ainda compreender uma ou mais dessas enzimas acessórias. Tais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas acessórias po- dem ser transmitidos por plasmídeo ou integrados no genoma das cé- lulas hospedeiras da invenção. As enzimas acessórias exemplificativas incluem, sem limitação, epimerases, enzimas de ramificação, modifi- cação (por exemplo, para adicionar colinas, glicerolfosfatos, piruvatos), amidação, regulação de comprimento da cadeia, acetilação, formila- ção, e polimerização.

[00192] Em certas modalidades, as enzimas que são capazes de modificar monossacarídeos são introduzidas em uma célula hospedei- ra da invenção (isto é, as enzimas que são capazes de modificar mo- nossacarídeos são heterólogas à célula hospedeira). Tais enzimas in- cluem, por exemplo, epimerases e racemases. Assim, uma célula hos- pedeira da invenção pode ainda compreender uma epimerase e / ou racemase.

[00193] Em uma modalidade, as epimerases e racemases são a partir de bactérias. Em certas modalidades, as epimerases e / ou ra- cemases introduzidas nas células hospedeiras da invenção são da es- pécie Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhan- tomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Aeromonas, espécie Francisella, espécie Helicobacter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Streptococcus, es- pécie Enterococcus, espécie Staphylococcus, espécie Bacillus, espé- cie Clostridium, espécie Listeria, ou espécie Campylobacter.

[00194] Em certas modalidades, a epimerase inserida em uma célu- la hospedeira da invenção é uma epimerase descrita na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2011/062615, cuja descrição é incorporada por referência aqui em sua totalidade. Em uma modali- dade, a epimerase é a epimerase codificada pelo gene 23206 da cepa 0157 de E. coli. Ver, por exemplo, WO 2011/062615 e Rush e outros 2009, The Journal of Biological Chemistry 285: 1671 a 1680, que é in- corporado por referência aqui em sua totalidade. Em outra modalida- de, a epimerase é galE (UPD-galactose epimerase) 23206 e galE con- verte GIcNAc-P-P-undecaprenil em GalNAc-P-P-undecaprenil. Em uma modalidade específica, as células hospedeiras da invenção com- preendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma epime- rase, em que a dita sequência de ácido nucleico que codifica uma epimerase é integrada no genoma da célula hospedeira.

[00195] Em uma modalidade, uma célula hospedeira da invenção compreende ainda uma mutase, por exemplo, glf (UDP-galactopira- nose mutase).

[00196] Em uma modalidade, uma célula hospedeira da invenção compreende ainda RcsA (um ativador da síntese de CP). O RcsA é um regulador positivo instável necessário para a síntese do polissacarídeo capsular de ácido colânico em Escherichia coli. Fundo Genético

[00197] As células hospedeiras exemplificativas que podem ser usadas para gerar as células hospedeiras da invenção incluem, sem limitação, espécies Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Streptococcus, es- pécie Staphylococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira aqui utilizada é E. coli.

[00198] Em uma modalidade, o fundo genético da célula hospedeira é modificado, por exemplo, por deleção de um ou mais genes. Os ge- nes exemplificativos que podem ser deletados nas células hospedeiras (e, em alguns casos, substituídos por outras sequências de ácidos nu- cleicos desejadas) incluem genes de células hospedeiras envolvidas na biossíntese de glicolipídeos, tal como waaL (ver, por exemplo, Feldman e outros 2005, PNAS USA 102: 3016 a 3021), o agrupamento de antígenos O (rfb ou wb), o agrupamento de antígenos comuns ente- robacterianos (wec), o agrupamento de biossíntese do núcleo de lipí- dio A (waa), e os agrupamentos de modificação de antígeno O de pró- fago como o agrupamento gtrABS. Em uma modalidade específica, um ou mais do gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS, ou um gene ou genes do agrupamento wec ou um gene ou genes do agrupamento de gene rfb são deletados ou inativados funcionalmente a partir do ge- noma de uma célula hospedeira procariótica da invenção. Em uma modalidade, uma célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o ge- ne waaL, o gene gtrA, o gene gtrB, o gene gtrS são deletados ou inati- vados funcionalmente a partir do genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade, uma célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL e o gene gtrS são deletados ou inativados funcionalmen-

te a partir do genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade, uma célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL e os ge- nes do agrupamento wec são deletados ou inativados funcionalmente a partir do genoma da célula hospedeira. Bioconjugados

[00199] As células hospedeiras da invenção podem ser usadas pa- ra produzir bioconjugados compreendendo um antígeno, tal como um antígeno de polissacarídeo ou oligossacarídeo, por exemplo, um antí- geno de sacarídeo de Staphylococcus aureus ligado a um polipeptídeo da invenção. Os métodos de produção de bioconjugados utilizando células hospedeiras são descritos, por exemplo, nos documentos WO 2003/074687, WO 2006/119987 e WO 2011/138361. Os bioconjuga- dos, como aqui descritos, têm propriedades vantajosas sobre os con- jugados químicos da proteína carreadora — antígeno, na medida em que requerem menos produtos químicos na fabricação e são mais consistentes em termos do produto final gerado.

[00200] Em uma modalidade, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo um polipeptídeo ligado a um antígeno de Staphylo- coccus aureus. Em uma modalidade específica, o dito antígeno de Staphylococcus aureus é um sacarídeo capsular (por exemplo, polis- sacarídeo capsular). Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjugado compreendendo um polipeptídeo da invenção e um antígeno selecionado a partir de um sacarídeo capsular (por exemplo, polissacarídeo capsular) do Staphylococcus aureus sorotipo CP5 ou CP8. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um bioconjuga- do compreendendo um polipeptídeo da invenção e um antígeno de um sacarídeo capsular (por exemplo, polissacarídeo capsular) do Sta- Pphylococcus aureus sorotipo CP8.

[00201] Os bioconjugados da invenção podem ser purificados por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia em coluna de troca iônica, troca catiônica, troca aniônica, afinidade, e dimensiona- mento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Ver, por exemplo, Sa- raswat e outros 2013, Biomed. Res. Int. ID % 312709 (p. 1-18); ver também os métodos descritos no documento WO 2009/104074. Além disso, os bioconjugados podem ser fusionados com sequências de po- lipeptídeos heterólogas aqui descritas ou de outro modo conhecidas na técnica para facilitar a purificação. Por exemplo, a proteína CIfA po- de incorporar uma etiqueta de peptídeo, tal como uma etiqueta de he- xahistidina, para purificação por troca catiônica. As condições reais usadas para purificar um bioconjugado específico dependerão, em parte, da estratégia de síntese e de fatores tal como carga líquida, hi- drofobicidade e / ou hidrofilicidade do bioconjugado, e serão evidentes para os versados na técnica.

[00202] “Um outro aspecto da invenção é um processo para a pro- dução de um bioconjugado que compreende (ou consiste em) um poli- peptídeo ligado a um sacarídeo, o dito método compreendendo (i) cul- tivar a célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a produção de proteínas (e opcionalmente sob condições adequadas para a produção de sacarídeos) e (ii) isolar o bioconjugado produzido pela dita célula hospedeira.

[00203] “Um outro aspecto da invenção é um bioconjugado produzi- do pelo processo da invenção, em que o dito bioconjugado compreen- de um sacarídeo ligado a um polipeptídeo. Métodos Analíticos

[00204] Vários métodos podem ser utilizados para analisar as com- posições estruturais e os comprimentos das cadeias de açúcar dos bioconjugados da invenção.

[00205] Em uma modalidade, a hidrazinólise pode ser usada para analisar glicanos. Primeiro, os polissacarídeos são liberados a partir de suas proteínas carreadoras por incubação com hidrazina, de acordo com as instruções do fabricante (Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, Reino Unido). O nucleófilo hidrazina ataca a ligação glicosídica entre o polissacarídeo e a proteína carrea- dora e permite a liberação dos glicanos ligados. Os grupos N-acetil são perdidos durante este tratamento e precisam ser reconstituídos por re-N-acetilação. Os glicanos livres são purificados em colunas de carbono e subsequentemente marcados na extremidade redutora com o fluóforo 2-amino benzamida. Ver Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB: Non-selective and eficiente flu- orescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 1995, 230 (2): 229 a 238. Os polissacarídeos mar- cados são separados em uma coluna GlycoSep-N (GL Sciences) de acordo com o protocolo de HPLC de Royle e outros. Ver Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge JIl, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM: An analytical and structural database provides a srategy for sequencing O-glycans from micrograma quantities of glycoproteins. Anal Biochem 2002, 304 (1): 70 a 90. O cromatograma de fluorescên- cia resultante indica o comprimento do polissacarídeo e o número de unidades de repetição. As informações estruturais podem ser reunidas através da coleta de picos individuais e subsequentemente executan- do análises de MS/MS. Desse modo, a composição de monossacarí- deos e a sequência da unidade de repetição podem ser confirmadas e, adicionalmente, a homogeneidade da composição de polissacarídeos pode ser identificada.

[00206] Em outra modalidade, SDS-PAGE ou eletroforese capilar em gel pode ser usada para avaliar glicanos e bioconjugados. O com- primento do polímero para os antígenos O glicanos é definido pelo número de unidades de repetição que são montadas linearmente. Isso significa que o padrão típico de escada é uma consequência de dife-

rentes números de unidades de repetição que compõem o glicano. As- sim, duas bandas próximas uma da outra no SDS PAGE ou outras técnicas que se separam por tamanho diferem apenas em uma única unidade de repetição. Essas diferenças discretas são exploradas quando analisando glicoproteínas quanto ao tamanho do glicano: À proteína carreadora não glicosilada e o bioconjugado com diferentes comprimentos de cadeia polimérica são separados de acordo com su- as mobilidades eletroforéticas. O primeiro número de unidade de repe- tição detectável (n1) e o número médio de unidade de repetição (Navera- ge) presente em um bioconjugado são medidos. Esses parâmetros po- dem ser usados para demonstrar a consistência lote a lote ou estabili- dade de polissacarídeos.

[00207] Em outra modalidade, MS de alta massa e HPLC de exclu- são de tamanho podem ser aplicadas para medir o tamanho dos bio- conjugados completos.

[00208] Em outra modalidade, um ensaio de antrona — ácido sulfúri- co pode ser usado para medir os rendimentos de polissacarídeos. Ver Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC: Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate for- mat to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals: journal of the International As- sociation of Biological Standardization 2008, 36 (2): 134 a 141. Em ou- tra modalidade, um ensaio de metilpentose pode ser usado para medir os rendimentos de polissacarídeos. Ver, por exemplo, Dische e outros J. Biol Chem. Setembro de 1948; 175 (2): 595 a 603. Alteração no uso do sítio de glicosilação

[00209] Para mostrar que o uso do sítio em uma proteína específica é alterado em um sistema de múltiplos plasmídeos em oposição a um sistema inserido, o uso do sítio de glicosilação deve ser quantificado. Os métodos para fazer isso estão listados abaixo.

[00210] LC-MS/MS de Glicopeptídeos: os bioconjugados são dige- ridos com protease(s), e os peptídeos são separados por um método cromatográfico adequado (C18, interação hidrofílica HPLC HILIC, co- lunas GlycoSepN, SE HPLC, AE HPLC) e os diferentes peptídeos são identificados usando MS/MS. Este método pode ser usado com os presentes métodos sem redução prévia da cadeia de açúcar por mé- todos químicos (degradação de Smith) ou enzimáticos. A quantificação de picos de glicopeptídeos usando detecção UV em 215 a 280 nm permite a determinação relativa do uso do sítio de glicosilação.

[00211] HPLC por exclusão por tamanho: O uso do sítio de glicosi- lação mais alto é refletido por um tempo de eluição anterior de uma coluna SE HPLC. Homogeneidade

[00212] A homogeneidade do bioconjugado (isto é, a homogenei- dade dos resíduos de açúcar ligados) pode ser avaliada usando méto- dos que medem o comprimento do glicano e o raio hidrodinâmico. Métodos Analíticos

[00213] Rendimento. O rendimento é medido como a quantidade de carboidrato derivada de um litro de cultura de produção bacteriana cultivada em um biorreator sob condições controladas e otimizadas. Após a purificação do bioconjugado, os rendimentos de carboidratos podem ser medidos diretamente pelo teste de antrona ou ELISA usan- do anti-soros específicos para carboidratos. Medições indiretas são possíveis usando a quantidade de proteína (medida pelos ensaios BCA, de Lowry ou Bradford) e o comprimento e a estrutura do glicano para calcular uma quantidade teórica de carboidratos por grama de proteína. Além disso, o rendimento também pode ser medido secando a preparação de glicoproteína a partir de um tampão volátil e usando uma balança para medir o peso.

[00214] Estabilidade. A estabilidade da proteína ou do glicoconju-

gado pode ser avaliada por SDS-PAGE e / ou Western blot, para de- tectar a produção de produtos de degradação, ou por CD, espectrome- tria de massas ou outros métodos conhecidos na técnica. A estabilida- de pode ser testada diretamente após a produção, ou após armaze- namento por 1, 2,3,4 semanas ou mais, 1, 2, 3, 4, 5, 6 meses ou mais, por exemplo, 4, 10, 20 ou 30 graus Celsius ou mais.

[00215] — Homogeneidade. A homogeneidade significa a variabilida- de do comprimento do glicano e possivelmente o número de sítios de glicosilação. Os métodos listados acima podem ser usados para essa finalidade. O SE-HPLC permite a medição do raio hidrodinâmico. Um número maior de sítios de glicosilação no carreador leva a uma maior variação no raio hidrodinâmico em comparação com um carreador com menos sítios de glicosilação. No entanto, quando cadeias simples de glicano são analisadas, elas podem ser mais homogêneas devido ao comprimento mais controlado. O comprimento do glicano é medido por hidrazinólise, SDS PAGE e CGE. Além disso, a homogeneidade também pode significar que certos padrões de uso de sítios de glicosi- lação mudam para uma faixa mais ampla / mais estreita. Esses fatores podem ser medidos pelo LC-MS/MS de glicopeptídeos.

[00216] Estabilidade e reprodutibilidade da cepa. A estabilidade da cepa durante a fermentação bacteriana na ausência de pressão seletiva é medida por métodos diretos e indiretos que confirmam a presença ou ausência do DNA recombinante nas células da cultura de produção. A influência do volume da cultura pode ser simulada por tempos de cultura prolongados, o que significa tempos de geração aumentados. Quanto mais gerações na fermentação, maior a probabi- lidade de perda de um elemento recombinante. A perda de um ele- mento recombinante é considerada instabilidade. Métodos indiretos dependem da associação de cassetes de seleção com DNA recombi- nante, por exemplo, os cassetes de resistência a antibióticos em um plasmídeo. As células de cultura de produção são colocadas em meio seletivo, por exemplo, Placas LB suplementadas com antibióticos ou outros produtos químicos relacionados a um sistema de seleção, e co- lônias resistentes são consideradas positivas para o DNA recombinan- te associado ao respectivo produto químico de seleção. No caso de um sistema com múltiplos plasmídeos, são contadas colônias resisten- tes a múltiplos antibióticos e a proporção de células contendo todas as três resistências é considerada a população estável. Alternativamente, a PCR quantitativa pode ser usada para medir a quantidade de DNA recombinante dos três elementos recombinantes na presença, ausên- cia de seleção, e em diferentes momentos da fermentação. Assim, a quantidade relativa e absoluta de DNA recombinante é medida e com- parada. A reprodutibilidade do processo de produção é medida pela análise completa dos lotes de consistência pelos métodos descritos neste pedido. Composições Imunogênicas

[00217] Os polipeptídeos e conjugados (por exemplo, bioconjugado) da invenção são particularmente adequados para inclusão em compo- sições imunogênicas e vacinas. A presente invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo da invenção, ou o conjugado da invenção, ou o bioconjugado da invenção.

[00218] “Também é fornecido um método para produzir a composi- ção imunogênica da invenção compreendendo a etapa de misturar o polipeptídeo ou o conjugado (por exemplo, bioconjugado) da invenção com um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[00219] As composições imunogênicas compreendem uma quanti- dade imunologicamente eficaz do polipeptídeo ou conjugado (por exemplo, bioconjugado) da invenção, bem como quaisquer outros componentes. Por "quantidade imunologicamente eficaz”, entende-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, ou como uma dose única ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou prevenção. Essa quantidade varia de acordo com a saúde e a condi- ção física do indivíduo a ser tratado, idade, grau de proteção desejado, formulação da vacina e outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade esteja em uma faixa relativamente ampla que possa ser determinada por meio de ensaios de rotina.

[00220] As composições imunogênicas da invenção também podem conter diluentes tal como água, solução salina, glicerol etc. Além disso, podem estar presentes substâncias auxiliares, tal como agentes umec- tantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH, polióis e simila- res.

[00221] As composições imunogênicas compreendendo o polipeptí- deo da invenção ou conjugados (ou bioconjugados) podem compreen- der quaisquer componentes adicionais adequados para uso na admi- nistração farmacêutica. Em modalidades específicas, as composições imunogênicas da invenção são formulações monovalentes. Em outras modalidades, as composições imunogénicas da invenção são formula- ções multivalentes, por exemplo, formulações bivalentes, trivalentes e tetravalentes. Por exemplo, uma formulação multivalente compreende mais de um antígeno, por exemplo, mais de um conjugado.

[00222] A composição imunogênica da invenção opcionalmente compreende ainda antígenos adicionais. Exemplos de tais antígenos adicionais são proteínas ou polissacarídeos capsulares de S. aureus. Vacinas

[00223] A presente invenção também fornece uma vacina compre- endendo uma composição imunogênica da invenção e um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[00224] Excipientes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser selecionados pelos versados na técnica. Por exemplo, o excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável pode incluir um tampão, tal como Tris (trimetamina), fosfato (por exemplo, fosfato de sódio), acetato, borato (por exemplo, borato de sódio), citrato, glicina, histidina e sucinato (por exemplo, sucinato de sódio), adequadamente cloreto de sódio, histidina, fosfato de sódio ou sucinato de sódio. O ex- cipiente farmaceuticamente aceitável pode incluir um sal, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio ou cloreto de magnésio. Opcio- nalmente, o excipiente farmaceuticamente aceitável contém pelo me- nos um componente que estabiliza a solubilidade e / ou a estabilidade. Exemplos de agentes solubilizantes / estabilizadores incluem deter- gentes, por exemplo, laurel sarcosina e / ou polissorbato (por exemplo, TWEENTY 80). Exemplos de agentes estabilizadores também incluem poloxâmero (por exemplo, poloxâmero 124, poloxâmero 188, poloxà- mero 237, poloxâmero 338 e poloxâmero 407). O excipiente farmaceu- ticamente aceitável pode incluir um tensoativo não iônico, por exem- plo, polioxietileno sorbitano ésteres de ácidos graxos, Polissorbato-80 (TWEEN'TY 80), Polissorbato-60 (TWEEN'Y 60), Polissorbato-40 (TWEEN'Y 40) e Polissorbato-20 (TWEEN'TY 20), ou polioxietileno al- quil éteres (adequadamente polissorbato-80). Agentes de solubilização / estabilização alternativos incluem arginina, e polióis formadores de vidro (tal como sacarose, trealose e similares). O excipiente farmaceu- ticamente aceitável pode ser um conservante, por exemplo, fenol, 2- fenoxietanol ou tiomersal. Outros excipientes farmaceuticamente acei- táveis incluem açúcares (por exemplo, lactose, sacarose) e proteínas (por exemplo, gelatina e albumina). Os carreadores farmaceuticamen- te aceitáveis incluem água, soluções salinas, soluções aquosas de dextrose e glicerol. Inúmeros excipientes e carreadores farmaceutica- mente aceitáveis são descritos, por exemplo, em Remington's Phar- maceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co. Easton, PA, 5º edição (975).

[00225] Em uma modalidade, a composição imunogênica ou vacina da invenção compreende adicionalmente um ou mais tampões, por exemplo, tampão fosfato e / ou tampão sacarose fosfato glutamato. Em outras modalidades, a composição imunogênica ou vacina da in- venção não compreende um tampão.

[00226] Em uma modalidade, a composição imunogênica ou vacina da invenção compreende adicionalmente um ou mais sais, por exem- plo, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, glutamato mo- nossódico, e sais de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio, fos- fato de alumínio, alúmen (sulfato de potássio e alumínio) ou uma mis- tura desses sais de alumínio). Em outras modalidades, a composição imunogênica ou vacina da invenção não compreende um sal.

[00227] A composição imunogênica ou vacina da invenção pode adicionalmente compreender um conservante, por exemplo, um deri- vado de mercúrio timerosal. Em uma modalidade específica, a compo- sição imunogênica ou vacina da invenção compreende 0,001% a 0,01% de timerosal. Em outras modalidades, a composição imunogê- nica ou vacina da invenção não compreende um conservante.

[00228] A vacina ou composição imunogênica da invenção também pode compreender um antimicrobiano, tipicamente quando empacota- do em formato de dose múltipla. Por exemplo, a composição imunogê- nica ou vacina da invenção pode compreender 2-fenoxietanol.

[00229] A vacina ou composição imunogênica da invenção também pode compreender um detergente, por exemplo, polissorbato, tal como TWEENTY 80. Os detergentes estão geralmente presentes em níveis baixos, por exemplo, < 0,01%, mas foram sugeridos níveis mais eleva- dos para estabilizar formulações de antígeno, por exemplo, até 10%.

[00230] As composições imunogênicas da invenção podem ser in- cluídas em um recipiente, embalagem ou dispensador juntamente com instruções para administração.

[00231] As composições imunogênicas ou vacinas da invenção po-

dem ser armazenadas antes do uso, por exemplo, as composições podem ser armazenadas congeladas (por exemplo, a cerca de -20º C Ou a cerca de -70º C); armazenadas em condições refrigeradas (por exemplo, a cerca de 4º C); ou armazenadas em temperatura ambiente.

[00232] As composições imunogênicas ou vacinas da invenção po- dem ser armazenadas em solução ou liofiizadas. Em uma modalida- de, a solução é liofilizada na presença de um açúcar, tal como sacaro- se, trealose ou lactose. Em outra modalidade, as vacinas da invenção são liofilizadas e reconstituídas extemporaneamente antes do uso.

[00233] A preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvante approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). O encapsulamento dentro dos lipossomas é descrito por Fullerton, Patente US 4.235.877. Adjuvantes

[00234] Em uma modalidade, as composições imunogênicas ou va- cinas da invenção compreendem ou são administradas em combina- ção com um adjuvante. O adjuvante para administração em combina- ção com uma composição imunogênica ou vacina da invenção pode ser administrado antes, concomitantemente ou após a administração da dita composição imunogênica ou vacina. Em algumas modalidades, o termo "adjuvante" refere-se a um composto que, quando administra- do em conjunto com ou como parte de uma composição imunogênica da vacina da invenção, aumenta, melhora e / ou reforça a resposta imune a um bioconjugado, mas quando o composto é administrado isoladamente não gera uma resposta imune ao polipeptídeo / conjuga- do / bioconjugado. Em algumas modalidades, o adjuvante gera uma resposta imune ao polipeptídeo, conjugado ou bioconjugado e não produz uma alergia ou outra reação adversa.

[00235] Em uma modalidade, a composição imunogênica ou vacina da invenção é adjuvantada. Os adjuvantes podem melhorar uma res-

posta imune por vários mecanismos, incluindo, por exemplo, recruta- mento de linfócitos, estimulação de células B e / ou T, e estimulação de macrófagos. Exemplos específicos de adjuvantes incluem, entre outros, sais de alumínio (alúmen) (tal como hidróxido de alumínio, fos- fato de alumínio, e sulfato de alumínio), monofosforil lipídio A (MPL) 3- des-O-acilado (ver Patente do Reino Unido GB2220211), MF59 (No- vartis), ASO01 (GlaxoSmithKline), ASO3 (GlaxoSmithKline), ASO4 (Gla- xoSmithKline), polissorbato 80 (TWEENTY 80; ICL Americas, Inc.), compostos de imidazopiridina (consultar o Pedido Internacional No. PCT/US2007/064857, publicado como Publicação Internacional No. WO2007/109812), compostos de imidazoquinoxalina (consultar o Pe- dido Internacional No. POCT/US2007/064858, publicado como Publica- ção Internacional No. WO02007/109813) e saponinas, tal como QS21 (consultar Kensil e outros, em Vaccine Design: The Subunit and Adju- vant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Pa- tente US No. 5.057.540). Em algumas modalidades, o adjuvante é o adjuvante de Freund (completo ou incompleto). Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (tal como esqualeno ou óleo de amen- doim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, tal como monofosforil lipídio A (ver Stoute e outros, N. Engl. J. Med. 336, 86 a 91 (1997)). Outro adjuvante é o CpG (Bioworld Today, 15 de no- vembro de 1998).

[00236] Em um aspecto da invenção, o adjuvante é um sal de alu- mínio, tal como gel de hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio.

[00237] Em outro aspecto da invenção, o adjuvante é selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo de resposta TH1 ou TH2. Altos níveis de citocinas do tipo Th1 tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por células a um determinado antígeno, enquanto altos níveis de citocinas do tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.

É importante lembrar que a distinção da resposta imune do tipo Th1 e Th2 não é absoluta.

Na realidade, um indivíduo suportará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Th1 ou predominan- temente Th2. No entanto, muitas vezes é conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquelas descritas em clones de célu- las T CD4 +ve murinas por Mosmann e Coffman (Mosmann, TR e Co- fíman, RL (1989)) TH1 and TH2 cells: different patterns of Iymphokine secretion lead to different functional properties.

Annual Review of Immunology, 7, pág. 145 a 173). Tradicionalmente, as respostas do tipo Th1 estão associadas à produção das citocinas INF-y e IL-2 por linfócitos T.

Outras citocinas frequentemente diretamente associadas à indução de respostas imunes do tipo Th1 não são produzidas por célu- las T, tal como a IL-12. Em contraste, as respostas do tipo Th2 estão associadas à secreção de 1l-4, IL-5, IL-6, I1L-10. Sistemas adjuvantes adequados que promovem uma resposta predominantemente Th1 in- cluem: Monofosforil lipídio A ou um derivado do mesmo, particularmen- te monofosforil lipídio A 3-des-O-acilado (39D-MPL) (para sua prepara- ção, ver GB 2220211 A); MPL, por exemplo, 3D-MPL e a saponina QS21 em um lipossoma, por exemplo, um lipossoma compreendendo colesterol e DPOC; e uma combinação de monofosforil lipídio A, por exemplo, monofosforil lipídio A 3-des-O-acilado, juntamente com um sal de alumínio (por exemplo, fosfato de alumínio ou hidróxido de alu- mínio) ou uma emulsão de óleo em água.

Em tais combinações, o an- tígeno e o 3D-MPL estão contidos nas mesmas estruturas particula- das, permitindo a entrega mais eficiente de sinais antigênicos e imu- noestimuladores.

Estudos demonstraram que o 3D-MPL é capaz de aumentar ainda mais a imunogenicidade de um antígeno adsorvido em alúmen [Thoelen e outros, Vaccine (1998) 16: 708-14; EP 689454-B1]. Os oligonucleotídeos contendo CpG não metilados (WO 96/02555)

também são indutores preferenciais de uma resposta TH1 e são ade- quados para utilização na presente invenção.

[00238] A vacina ou a composição imunogênica da invenção pode conter uma emulsão de óleo em água, uma vez que foi sugerido que elas são úteis como composições adjuvantes (EP 399843; WO 95/17210). Emulsões de óleo em água, tal como as descritas em WO 95/17210 (que descreve emulsões de óleo em água compreendendo de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol e de 0,3 a 3% de tween 80 e seu uso isolado ou em combinação com QS21 e / ou 3D-MPL), WO 99/12565 (que descreve composições de emulsão de óleo em água compreendendo um óleo metabolizável, uma saponina e um esterol e MPL) ou WO 99/11241. Também são adequadas emul- sões de óleo em água, como as descritas nos documentos WO 09/127676 e WO 09/127677. Em uma modalidade específica, a com- posição imunogênica ou vacina compreende adicionalmente uma sa- ponina, por exemplo, QS21. A composição imunogênica ou vacina também pode compreender uma emulsão de óleo em água e tocoferol (WO 95/17210). Método de Administração

[00239] As composições imunogênicas ou vacinas da invenção po- dem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível à in- fecção, por meio da administração da dita composição imunogênica ou vacina por via sistêmica ou mucosa. Essas administrações podem in- cluir injeção pelas vias intramuscular (IM), intraperitoneal, intradérmica (ID) ou subcutânea; ou via administração mucosa ao trato oral / ali- mentar, respiratório, geniturinário. Por exemplo, a administração intra- nasal (IN) pode ser usada para o tratamento de pneumonia ou otite média (como o transporte nasofaríngeo de pneumococos pode ser mais eficazmente prevenido, atenuando a infecção em seu estágio ini- cial). Embora a composição imunogênica ou vacina da invenção possa ser administrada em dose única, seus componentes também podem ser coadministrados juntos ao mesmo tempo ou em momentos diferen- tes (por exemplo, polissacarídeos pneumocócicos podem ser adminis- trados separadamente, ao mesmo tempo ou 1 a 2 semanas após a administração de qualquer componente de proteína bacteriana da va- cina para uma coordenação ideal das respostas imunes entre si). Para coadministração, o adjuvante Th1i opcional pode estar presente em qualquer uma ou em todas as diferentes administrações, no entanto, em um aspecto particular da invenção, ele está presente em combina- ção com o componente polipeptídico da composição imunogênica ou vacina. Além de uma única via de administração, podem ser usadas 2 vias de administração diferentes. Por exemplo, os polissacarídeos po- dem ser administrados IM (ou ID) e proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses iniciais e IN para doses de reforço.

[00240] Em um aspecto, a composição imunogênica ou vacina da invenção é administrada pela via de entrega intramuscular. A adminis- tração intramuscular pode ser na coxa ou no braço. A injeção é tipica- mente através de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas a injeção sem agulha pode ser usada alternativamente. Uma dose intramuscular típica é de 0,5 ml.

[00241] Em outro aspecto, a composição imunogênica ou vacina da invenção é administrada pela administração intradérmica. A pele hu- mana compreende uma cutícula externa "córnea", chamada estrato córneo, que se sobrepõe à epiderme. Debaixo desta epiderme está uma camada chamada derme, que, por sua vez, se sobrepõe ao teci- do subcutâneo. A técnica convencional de injeção intradérmica, o "procedimento mantoux”, compreende as etapas de limpeza da pele, alongamento com uma mão, e com o chanfro de uma agulha de bitola estreita (bitola 26 a 31) voltada para cima, a agulha é inserida em um ângulo entre 10 e 15º. Uma vez que o chanfro da agulha é inserido, o cano da agulha é abaixado e avançado, fornecendo uma leve pressão para elevá-la sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamente, formando uma bolha ou inchaço na superfície da pele, seguida pela retirada lenta da agulha.

[00242] Mais recentemente, foram descritos dispositivos especifi- camente projetados para administrar agentes líquidos na pele ou atra- vés da pele, por exemplo, os dispositivos descritos nos documentos WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção de jato descritos, por exemplo, no documento WO 01/13977; US

5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US

5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520.639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US

4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Métodos alternativos de administração intradérmica das preparações de vacina podem incluir seringas e agulhas convencionais, ou dispositivos projetados para en- trega balística de vacinas sólidas (WO 99/27961) ou emplastros trans- dérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); ou aplicados à superfície da pele (entrega transdérmica ou transcutânea WO 98/20734; WO 98/28037).

[00243] Em outro aspecto, a composição imunogênica ou vacina da invenção é administrada pela administração intranasal. Tipicamente, a composição imunogênica ou vacina é administrada localmente à área nasofaríngea, por exemplo, sem ser inalado nos pulmões. É desejável usar um dispositivo de entrega intranasal que entregue a composição imunogênica ou a formulação de vacina à área nasofaríngea, sem ou substancialmente sem que ela entre nos pulmões. Dispositivos ade- quados para administração intranasal das vacinas de acordo com a invenção são dispositivos de aspersão. Os dispositivos de aspersão nasal adequados comercialmente disponíveis incluem ACCUSPRAY TY (Becton Dickinson).

[00244] Em uma modalidade, os dispositivos de aspersão para uso intranasal são dispositivos para os quais o desempenho do dispositivo não depende da pressão aplicada pelo usuário. Esses dispositivos são conhecidos como dispositivos de limite de pressão. O líquido é libera- do a partir do bico somente quando uma pressão limite é aplicada. Es- ses dispositivos facilitam a obtenção de uma aspersão um tamanho de gotícula regular. Os dispositivos de limite de pressão adequados para uso com a presente invenção são conhecidos na técnica e são descri- tos, por exemplo, em WO 91/13281 e EP311 863 e EP516636, aqui incorporados por referência. Tais dispositivos estão disponíveis co- mercialmente a partir de Pfeiffer GmbH e também são descritos por Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, setembro de 1999.

[00245] Em outra modalidade, dispositivos intranasais produzem gotículas (medidas usando água como líquido) na faixa de 1 a 200 um, por exemplo 10 a 120 um. Abaixo de 10 um existe o risco de inalação; portanto, é desejável que não haja mais do que cerca de 5% de gotí- culas abaixo de 10 um. Gotículas acima de 120 um não se espalham tão bem quanto gotículas menores; portanto, é desejável que não haja mais que 5% das gotículas que excedam 120 um.

[00246] Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço espaçadas adequadamente.

[00247] A composição imunogênica ou vacina da presente invenção pode ser usada para proteger ou tratar um mamífero, por exemplo, ser humano, susceptível à infecção, por meio de administração da dita composição imunogênica ou vacina por uma via sistêmica ou mucosa. Essas administrações podem incluir injeção pelas vias intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), intradérmica (ID) ou subcutânea (SC); ou por administração mucosa ao trato oral / alimentar, respiratório, genituriná-

rio. Embora a vacina da invenção possa ser administrada em dose única, seus componentes também podem ser coadministrados juntos ao mesmo tempo ou em momentos diferentes (por exemplo, conjuga- dos de sacarídeo pneumocócico podem ser administrados separada- mente, ao mesmo tempo ou 1 a 2 semanas após a administração de qualquer polipeptídeo, conjugado ou bioconjugado da invenção, para coordenação ideal das respostas imunes entre si). Para a coadminis- tração, o adjuvante opcional pode estar presente em qualquer uma ou em todas as diferentes administrações. Além de uma única via de ad- ministração, podem ser usadas 2 vias de administração diferentes. Por exemplo, os conjugados de polissacarídeos podem ser administrados IM (ou ID) e o polipeptídeo, conjugado ou bioconjugado da invenção podem ser administrados IN (ou ID). Além disso, as composições imu- nogênicas ou vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses iniciais e IN para doses de reforço. Dosagem

[00248] A quantidade de antígeno conjugado em cada composição imunogênica ou dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos colaterais adver- sos significativos em vacinas típicas. Essa quantidade variará depen- dendo de qual imunogene específico é empregado e como ele é apre- sentado. O teor de polipeptídeo estará tipicamente na faixa de 1 a 100ug, adequadamente de 5 a 50ug. O teor de sacarídeo estará tipi- camente na faixa de 0,1 a 10 ug, adequadamente de 1 a 5 ug.

[00249] Uma dose que está em um volume adequado para uso hu- mano está geralmente entre 0,25 e 1,5 ml, embora, para administração à pele, ela possa ser utilizada um volume mais baixo entre 0,05 ml e 0,2 ml. Em uma modalidade, uma dose humana é de 0,5 ml. Em uma modalidade adicional, uma dose humana é superior a 0,5 ml, por exemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Em uma outra modalidade, uma do-

se humana está entre 1 ml e 1,5 ml. Em outra modalidade, em particu- lar quando a composição imunogênica é para a população pediátrica, uma dose humana pode ser menor do que 0,5 ml, tal como entre 0,25 eo5ml. Usos Profiláticos e Terapêuticos

[00250] A presente invenção também fornece métodos de tratamen- to e / ou prevenção de infecções bacterianas de um sujeito compreen- dendo administrar ao sujeito um polipeptídeo, conjugado ou bioconju- gado da invenção. O polipeptídeo, conjugado ou bioconjugado pode estar na forma de uma composição imunogênica ou vacina. Em uma modalidade específica, a composição imunogênica ou vacina da in- venção é usada na prevenção da infecção de um indivíduo (por exem- plo, seres humanos) por uma bactéria. As infecções bacterianas que podem ser tratadas e / ou prevenidas usando o polipeptídeo, conjuga- do ou bioconjugado da invenção incluem aquelas causadas por espé- cie Staphylococcus, espécie Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersi- nia, espécie Aeromonas, espécie Francisella, espécie Helicobacter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, es- pécie Streptococcus, espécie Enterococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium, espécie Listeria, ou espécie Campylobacter. Em uma mo- dalidade específica, a composição imunogênica ou vacina da invenção é usada para tratar ou prevenir uma infecção por espécie Staphylo- coccus (por exemplo, Staphylococcus aureus).

[00251] Também são aqui fornecidos métodos para induzir uma resposta imune em um sujeito contra uma bactéria, compreendendo administrar ao sujeito um polipeptídeo ou conjugado ou bioconjugado da invenção (ou composição imunogênica ou vacina). Em uma moda- lidade, o dito sujeito tem infecção bacteriana no momento da adminis-

tração. Em outra modalidade, o dito sujeito não tem uma infecção bac- teriana no momento da administração. O polipeptídeo, conjugado ou bioconjugado da invenção pode ser usado para induzir uma resposta imune contra espécie Staphylococcus, espécie Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonel- la, espécie Yersinia, espécie Aeromonas, espécie Francisella, espécie Helicobacter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espécie Lactoba- cillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Streptococcus, espécie Enterococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium, espécie Listeria, ou espécie Campylo- bacter. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo, ou conjugado ou bioconjugado da invenção é usado para induzir uma resposta imu- ne contra a espécie Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus au- reus).

[00252] — Também são aqui fornecidos métodos para induzir a produ- ção de anticorpos opsonofagocíticos em um sujeito contra uma bacté- ria, compreendendo administrar ao sujeito um polipeptídeo ou conju- gado ou bioconjugado da invenção (ou composição imunogênica ou vacina). Em uma modalidade, o dito sujeito tem infecção bacteriana no momento da administração. Em outra modalidade, o dito sujeito não tem uma infecção bacteriana no momento da administração. O poli- peptídeo, ou conjugado ou bioconjugado da invenção (ou composição imunogênica ou vacina) aqui fornecido pode ser usado para induzir a produção de anticorpos opsonofagocitários contra espécie Staphylo- coccus, espécie Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, es- pécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Aeromonas, espécie Francisella, espécie Helicobacter, espécie Pro- teus, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, espécie Pseudomo- nas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Strep- tococcus, espécie Enterococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium,

espécie Listeria, ou espécie Campylobacter. Em uma modalidade es- pecífica, um polipeptídeo, ou conjugado ou bioconjugado da invenção (ou composição imunogênica ou vacina) é usado para induzir a produ- ção de anticorpos opsonofagocitários contra a espécie Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus aureus).

[00253] Por exemplo, a composição imunogênica ou vacina da in- venção pode ser usada para prevenir a infecção por S. aureus, inclu- indo uma infecção hospitalar. Mais particularmente, o sujeito pode ser protegido contra uma infecção na pele, pneumonia, meningite, oste- omielite, endocardite, síndrome do choque tóxico, e / ou septicemia. À invenção também é útil para proteger contra a infecção por S. aureus dos ossos e articulações de um indivíduo (e, portanto, para prevenir distúrbios, incluindo, entre outros, osteomielite, artrite séptica, e infec- ção articular protética). Em muitos casos, esses distúrbios podem es- tar associados à formação de um biofilme de S. aureus.

[00254] SS. aureus infecta vários mamíferos (incluindo vacas, cães, cavalos e porcos), mas o mamífero preferencial para uso com a inven- ção é um ser humano. O ser humano pode ser uma criança (por exemplo, um bebê ou criança), um adolescente ou um adulto. Em al- gumas modalidades, o humano pode ter um osso ou articulação proté- tica, ou pode ser um paciente aguardando cirurgia eletiva, em particu- lar um destinatário pretendido de um osso ou articulação protética (por exemplo, um paciente de cirurgia ortopédica pré-operatória). As vaci- nas não são adequadas apenas para esses grupos, no entanto, e po- dem ser usadas mais geralmente em uma população humana.

[00255] As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano susceptível à infecção por S. aureus, por meio da administração da dita vacina por via sistê- mica ou mucosa. Essas administrações podem incluir injeção pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por administração da mucosa ao trato oral / alimentar, respiratório, genitu- rinário.

[00256] Em uma modalidade, a presente invenção é um método aprimorado para obter uma resposta imune em bebês (definidos como de O a 2 anos de idade no contexto da presente invenção), adminis- trando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica ou vacina da invenção (uma vacina pediátrica). Em uma modalidade, a vacina é uma vacina pediátrica.

[00257] Em uma modalidade, a presente invenção é um método aprimorado para obter uma resposta imune na população idosa (no contexto da presente invenção, um paciente é considerado idoso se tiver 50 anos de idade ou mais, tipicamente mais de 55 anos e mais geralmente mais de 60 anos) administrando uma quantidade terapeu- ticamente eficaz da composição imunogênica ou vacina da invenção. Em uma modalidade, a vacina é uma vacina para os idosos.

[00258] A presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção da infecção por Staphylococcus aureus em um indivíduo em necessidade de tratamento, compreendendo administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo da invenção, ou do conjugado da invenção, ou do bioconjugado da inven- ção, ou a composição imunogênica ou vacina da invenção.

[00259] A presente invenção fornece um método para imunizar um hospedeiro humano contra a infecção por Staphylococcus aureus, compreendendo administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora do polipeptídeo da invenção, ou do conjugado da invenção, ou do bio- conjugado da invenção, ou da composição imunogênica ou vacina da invenção.

[00260] A presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imune ao Staphylococcus aureus em um sujeito, o método compreendendo administrar uma quantidade terapêutica ou profilati-

camente eficaz do polipeptídeo da invenção, ou do conjugado da in- venção, ou do bioconjugado da invenção, ou da composição imunogê- nica ou vacina da invenção.

[00261] A presente invenção fornece um polipeptídeo da invenção, ou o conjugado da invenção, ou o bioconjugado da invenção, ou a composição imunogênica ou vacina da invenção para uso no trata- mento ou prevenção de uma doença causada pela infecção por Sta- bhylococcus aureus.

[00262] A presente invenção fornece o uso do polipeptídeo da in- venção, ou do conjugado da invenção, ou do bioconjugado da inven- ção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou preven- ção de uma doença causada pela infecção por Staphylococcus au- reus.

[00263] A doença causada pela infecção por S. aureus pode ser, por exemplo, infecção cutânea, pneumonia, meningite, infecção por S. aureus nos ossos e articulações de um indivíduo (por exemplo, artrite séptica, infecção protética das articulações ou osteomielite), endocar- dite, síndrome do choque tóxico, e / ou septicemia. A doença pode ser uma infecção hospitalar.

[00264] Todas as referências ou pedidos de patente citados nesta especificação de patente são incorporados por referência aqui.

[00265] Os aspectos da invenção estão resumidos nos subsequen- tes parágrafos numerados:

[00266] 1. Polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3, modificada pelo fato de que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais sequências consenso selecionadas a partir de: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido exceto a prolina; em que a dita sequência consenso foi adicionada ou substituída por um ou mais aminoácidos entre os resíduos de aminoá- cidos 313-340 da SEQ ID NO: 3 ou em uma posição equivalente den- tro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90 %, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3.

[00267] 2. Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 1, em que a dita sequência consenso foi substituída pelo resíduo de aminoácido Q327, D329, P331 ou 1337 na SEQ ID NO: 3 ou substituído em uma sequên- cia de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posição de ami- noácido equivalente ao resíduo de aminoácido Q327, D329 ou 1337 na SEQ ID NO: 3.

[00268] 3. Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 2, contendo uma única sequência consenso que foi substituída pelo resíduo de aminoácido 1337 na SEQ ID NO: 3, ou substituída em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posição de aminoácido equivalente ao resíduo de aminoácido 1337 na SEQ ID NO: 3.

[00269] 4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a3, em que X é Q (glutamina) e Z é A (alanina) (por exemplo, K-D- Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)).

[00270] 5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 4, em que a sequência de aminoácidos é adicionalmente modifica- da por pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada a partir de P116 a Se Y118 a A com referência à sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 3 (ou uma posição equivalente em uma sequên- cia de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3), compreendendo opcio- nalmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs 4-5 ou 10-

12.

[00271] 6. Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 5, que compre- ende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 3, a dita sequência de aminoáci- dos compreendendo uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido exceto a prolina, substituído pelo aminoácido na posição 1337 na SEQ ID NO: 3, ou substituído em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posi- ção de aminoácido equivalente ao resíduo de aminoácido Q327, D329 ou 1337 na SEQ ID NO: 3.

[00272] 7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6, que tem um resíduo de serina adicional no N-terminal, opcio- nalmente, o dito polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 12; e / ou um resíduo de glicina ou glicina-serina adicional no C-terminal, opcionalmente o dito polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 32.

[00273] 8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a7, em que a sequência de aminoácidos compreende adicionalmen- te uma sequência sinal que é capaz de direcionar o polipeptídeo para o periplasma de uma célula hospedeira (por exemplo, bactéria), opcio- nalmente a dita sequência sinal sendo selecionada a partir de SEQ ID NO: 13-20, opcionalmente o dito polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 11.

[00274] 9. Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a 8, em que a sequência de aminoácidos compreende adicionalmen-

te uma etiqueta de peptídeo que é útil para a purificação da proteína CIfA, opcionalmente a dita etiqueta de peptídeo compreendendo seis resíduos de histidina e opcionalmente a dita etiqueta de peptídeo loca- lizada na C-terminal da sequência de aminoácidos, opcionalmente o dito polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27.

[00275] 10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágra- fos 1 a 9, em que o polipeptídeo é glicosilado.

[00276] 11. Conjugado (por exemplo, bioconjugado) compreenden- do um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, em que o polipeptídeo está ligado a um antígeno, por exemplo, um an- tígeno de polissacarídeo ou oligossacarídeo.

[00277] 12. Conjugado, de acordo com o parágrafo 11, em que o conjugado é covalentemente ligado ao antígeno através de uma liga- ção química obtida através de um método de conjugação química, op- cionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em química de carbodi-imida, animação redutiva, química de cianilação (por exemplo, química de CDAP), química de maleimida, química de hidrazida, quíi- mica de éster, e química da N-hidroxisuccinimida, diretamente ou por meio de um ligante.

[00278] 13. Conjugado (por exemplo, bioconjugado) de acordo com o parágrafo 11 ou parágrafo 12, em que o antígeno está ligado a um aminoácido no polipeptídeo selecionado a partir de asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, histidina, arginina ou triptofano (por exemplo, asparagina).

[00279] 14. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 13, em que o antígeno é um sacarí- deo, opcionalmente um sacarídeo capsular bacteriano (por exemplo, de Staphylococcus aureus) opcionalmente selecionado a partir de um sacarídeo capsular sorotipo 5 ou 8 de S. aureus.

[00280] 15. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com o parágrafo 14, em que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano de S. aureus sorotipo 8.

[00281] 16. Polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10.

[00282] 17. Vetor compreendendo o polinucleotídeo de acordo com o parágrafo 16.

[00283] 18. Célula hospedeira, compreendendo: um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosil transfe- rase(s); um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfera- se; um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10; e opcionalmente um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exem- plo, wzy).

[00284] 19. Célula hospedeira, de acordo com o parágrafo 18, em que a dita célula hospedeira compreende (a) uma glicosil transferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em undecaprenil pirofosfato (Und-PP) e (b) uma ou mais glicosil transferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo he- xose montado em Und-PP.

[00285] 20. Célula hospedeira, de acordo com o parágrafo 19, em que a dita glicosil transferase que monta um derivado de monossaca- rídeo hexose em Und-PP é heteróloga à célula hospedeira e / ou hete- róloga a um ou mais dos genes que codificam glicosil transferase op- cionalmente em que a dita glicosil transferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é da espécie Escherichia, es- pécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie

Salmonella, espécie Yersinia, espécie Aeromonas, espécie Francisel- la, espécie Helicobacter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espé- cie Lactobacillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Streptococcus, espécie Enterococcus, espécie Staphylococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium, espé- cie Listeria, ou espécie Campylobacter, opcionalmente wecA (por exemplo, wecA de E. coli).

[00286] 21.Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 20, em que o dito derivado de monossacarídeo hexose é qualquer monossacarídeo em que a posição C-2 é modificada com um grupo acetamido, tal como N-acetilglucosamina (GICNAc), N-acetilga- lactoseamina (GalNAc), 2,4-Diacetamido-2,4,6-trideoxi-hexose (DA- TDH). N-acetilfucoseamina (FucNAc) ou N-acetilquinovosamina (Qui- NAc).

[00287] 22. Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 21, em que as ditas uma ou mais glicosil transferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossaca- rídeo hexose montado em Und-PP são a galactofuranosil transferase (wbeY) de E. coli 028 ou a galactofuranosil transferase (wfdK) de E. coli 0167 ou são a galactofuranosil transferase (wbeY) de E. coli 028 e a galactofuranosil transferase (wfdK) de E. coli 0167.

[00288] 23.Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 22, em que a célula hospedeira compreende glicosil transferases suficientes para a síntese de unidades de repetição do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e / ou capK de S. aureus CP5 e opcionalmente capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO e / ou capP de S. aureus CP5.

[00289] 24. Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 23, em que a célula hospedeira compreende glicosil transferases suficientes para a síntese de unidades de repetição do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e / ou capK de S. aureus CP5 e, opcionalmente, wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wWbpM, wzz e / ou wzx de P. aeruginosa O11 e wecB e / ou wecC de E. coli 016.

[00290] 25. Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 24, em que a oligossacaril transferase é derivada de Campylobacter jejuni, opcionalmente em que a dita oligossacaril trans- ferase é pglB de C. jejuni, opcionalmente em que o gene pglB de C. jejuni é integrado ao genoma da célula hospedeira e opcionalmente em que pelo menos um gene da célula hospedeira foi inativado ou de- letado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi inativado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituído por um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituído por pglB de C. jejuni.

[00291] 26. Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 25, em que a dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma polimerase de polissacarídeo capsular (por exemplo, wzy) ou uma polimerase de antígeno O (por exemplo Wwzy), opcionalmente a dita polimerase de polissacarídeo capsular é de Staphylococcus aureus, opcionalmente a partir de S. aureus CP5 ou CP8.

[00292] 27. Célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 18 a 26, em que a dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma flipase (wzx), opcionalmente em que a dita flipase é de Staphylococcus aureus, opcionalmente de S. aureus CP5 ou CP8.

[00293] 28.Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 27, em que a dita célula hospedeira compreende adicio- nalmente uma enzima capaz de modificar um monossacarídeo, opcio-

nalmente uma epimerase, opcionalmente em que a dita epimerase é da espécie Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Aero- monas, espécie Francisella, espécie Helicobacter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Streptococ- cus, espécie Enterococcus, espécie Staphylococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium, espécie Listeria, ou espécie Campylobacter, opci- onalmente em que a dita epimerase é de E. coli, opcionalmente 23206 de E. coli 0157 ou galE.

[00294] 29. Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 28, em que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo está em um plasmídeo na célula hospedeira.

[00295] 30. Célula hospedeira, de acordo com qualquer um dos pa- rágrafos 18 a 29, em que a célula hospedeira é E. coli.

[00296] 31. Método para produzir um bioconjugado que compreen- de um polipeptídeo ligado a um sacarídeo, o dito método compreen- dendo (i) cultivar a célula hospedeira de acordo com qualquer um dos parágrafos 18 a 30 sob condições adequadas para a produção de pro- teínas e (ii) isolar o bioconjugado.

[00297] 32. Bioconjugado produzido pelo método de acordo com o parágrafo 31, em que o dito bioconjugado compreende um sacarídeo ligado a um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10.

[00298] 33. Composição imunogênica compreendendo o polipeptí- deo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, ou o conjuga- do de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou o bioconju- gado de acordo com o parágrafo 32.

[00299] 34. Método para fabricar a composição imunogênica de acordo com o parágrafo 33, compreendendo a etapa de misturar o po-

lipeptídeo ou o conjugado ou o bioconjugado com um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[00300] 35. Vacina compreendendo a composição imunogênica de acordo com o parágrafo 34 e um excipiente ou carreador farmaceuti- camente aceitável.

[00301] 36. Método para o tratamento ou prevenção da infecção por Staphylococcus aureus em um indivíduo em necessidade de tratamen- to, compreendendo administrar ao dito sujeito uma quantidade tera- peuticamente eficaz do polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, ou do conjugado de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou do bioconjugado de acordo com o parágrafo

32.

[00302] 37. Método para imunizar um hospedeiro humano contra a infecção por Staphylococcus aureus, compreendendo administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora do polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, ou do conjugado de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou do bioconjugado de acordo com o parágrafo 32.

[00303] 38. Método para induzir uma resposta imune a Staphylo- coccus aureus em um sujeito, compreendendo administrar uma quan- tidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, ou do conjugado de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou do bioconjugado de acordo com o parágrafo 32.

[00304] 39. Polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágra- fos 1 a 10, ou conjugado de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou bioconjugado de acordo com o parágrafo 32, para uso no tratamento ou prevenção de uma doença causada pela infecção por Staphylococcus aureus.

Descrição da Listagem de Sequências

[00305] “Todas as sequências são sequências de aminoácidos

[00306] SEQID NO: 1- Domínio de ligação ao fibrinogênio de CIfA de ocorrência natural (N123) com sequência sinal

MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTOSDSASNESKSNDSSSVSAAP KTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQOQETTOSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTO SSNTNAEELVNQTSNETTFNDTNTVSSVNSPONSTNAENVSTTODTSTEATPSNNESAPOSTDASN KDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFS VPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVK ATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQOIDKTNNTYRO TIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSV NITFPNPNOYKVEFNTPDDOITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVA FNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPED

[00307] —SEQIDNO:2-CIfANIN2N3 de tipo selvagem

ASENSVTOSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTOSSST NATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTOSSNTNAEELVNQTSNETTFNDTNTVSSVNSPQONSTNAE NVSTTQDTSTEATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPAAGTDITNQL TNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDO VLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAY IDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVD YEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQOTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIK VYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSK GDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPED

[00308] SEQIDNO:3-CIfAN2N3 de tipo selvagem

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTEFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYROTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE PGEIEPIPED

[00309] —SEQID NO: 4-CIfAN2N3P116S /Y118A

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDOIDKTNNTYROTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDOQONTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQOYKVEFNTPDDOIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE PGEIEPIPED

[00310] SEQ ID NO: 5 - CIFAN2N3P116S / Y118A com sequência sinal N-terminal S e Flgl

MIKFLSALILLLVTTAAQASVAADAPAAGTDITNOLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVP NSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKAT LTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYROTI YVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESY FVNPENFEDVTNSVNI TFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFN NGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPED

[00311] SEQIDNO:6-CIfAN2N3P116S / Y118A com S N-terminal

SVAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNL NGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVT LATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLK PNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQI TTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPD EPGEIEPIPED

[00312] SEQID NO: 7 - CIFANIN2N3 de tipo selvagem com sítio de glicosilação na posição correspondente ao mutante 30 (I557 de CIfA de comprimento total, sublinhado)

ASENSVTOSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTOSSST NATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTOSSNTNAEE LVNQTSNETTFNDTNTVSSVNSPQNSTNAE NVSTTQDTSTEATPSNNESAPQOSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPAAGTDITNQL TNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDO VLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAY IDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVD YEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQOTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQOQNTSIK VYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSK GDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPKDQNATKPED

[00313] SEQID NO: 38-CIfANIN2N3 P298S / Y300A com sítio de glicosilação na posição correspondente ao mutante 30 (I557 de CIfA de comprimento total, sublinhado)

ASENSVTOSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQOETTOSSST NATTEETPVTGEATTTTTNQOANTPATTOSSNTNAEELVNQOTSNETTENDTNTVSSVNSPONSTNAE NVSTTQODTSTEATPSNNESAPOSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPAAGTDITNQL TNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDO VLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVD YEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYROTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDOQONTSIK VYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQOYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSK GDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPKDQNATKPED

[00314] SEQ ID NO: 9- CIfAN2N3 de tipo selvagem com sítio de glicosilação no mutante 30 (sublinhado)

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNOQYKVEFNTPDDOIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE PGEIEPKDONATKPED

[00315] SEQ ID NO: 10 - CMAN2N3P116S / Y118A com sítio de glicosilação no mutante 30 (sublinhado)

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYROTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDOONTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDOIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE PGEIEPKDQNATKPED

[00316] SEQID NO: 11- CIFAN2N3P1168S / Y118A com sequência sinal N-terminal S e Flgl e sítio de glicosilação no mutante 30 (subli- nhado)

MIKFLSALILLLVTTAAQASVAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVP NSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDOVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKAT LTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYROTI YVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNI TFPNPNQYKVEENTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFN NGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPKDQNATKPED

[00317] SEQID NO: 12 - CIFAN2N3P1168S / Y118A com S no N- terminal e sítio de glicosilação no mutante 30 (sublinhado)

SVAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNL NGVTSTAKVPPIMAGDOVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVT LATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLK PNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQI TTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPD EPGEIEPKDQNATKPED

[00318] SEQIDNO:13-sequência sinal Flgl

MIKFLSALILLLVTTAAQA

[00319] “SEQID NO: 14 - Sequência sinal OMpA

MKKTAIAIAVALAGFATVAÇA

[00320] SEQID NO: 15- sequência sinal MalE

MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA

[00321] “SEQID NO: 16- Sequência sinal PelB

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA

[00322] “SEQID NO: 17- sequência sinal LTIIb

MSFKKIIKAFVIMAALVSVOAHA

[00323] SEQIDNO:18-sequência sinal DsbA

MKKIWLALAGLVLAFSASA

[00324] SEQID NO: 19- sequência sinal TolB

MKQALRVAFGFLILWASVLHA

[00325] SEQID NO: 20 - sequência sinal SipA

MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS

[00326] SEQIDNO:21- sítio de glicosilação D/E-X-N-2-S/T

[00327] SEQID NO: 22 - sítio de glicosilação K-D/E-X-N-2Z2-S/T-K

[00328] SEQIDNO:23- sítio de glicosilação K-D-Q-N-A-T-K

[00329] “SEQID NO: 24 - sítio de glicosilação K-D-Q-N-R-T-K

[00330] SEQID NO: 25 - CIfAN2N3P116S / Y118A com sítio de gli- cosilação no mutante 30 (sublinhado), etiqueta adicional C-terminal GSand 6-His

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDQOVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQONTSIKVYKVDNAADLSESY FVNPENFEDVTNSVNITFPNPNOQYKVEFNTPDDOIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE PGETEPKDQNATKPEDGSHHHHHH

[00331] SEQID NO: 26 - CIfAN2N3P116S / Y118A com sequência sinal N-terminal S e Flgl e sítio de glicosilação no mutante 30 (subli- nhado), etiqueta C-terminal adicional de GSand 6-His

MIKFLSALILLLVTTAAQASVAADAPAAGTDITNQLTNVTIVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVP NSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKAT LTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYROTI YVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDOQQONTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNI TFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFN NGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPKDQNATKPEDGSHHHHHH

[00332] SEQ ID NO: 27- CIFAN2N3P116S / Y118A com S no N- terminal, sítio de glicosilação (sublinhado), etiqueta C-terminal adicio- nal de GS e 6-His

SVAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNL NGVTSTAKVPPIMAGDQOVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVT LATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQOTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLK PNTDSNALIDOONTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNOYKVEEFNTPDDOI TTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPD EPGEIEPKDQNATKPEDGSHHHHHH

[00333] SEQ ID NO: 28 - CIfFAN2N3P1168S / Y118A mutante 1 (D24KDQNATK)

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIKDQNATKSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVP KELNLNGVTSTAKVPPIMAGDOVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKK TGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVL TGNLKPNTDSNALIDOONTSIKVYKVDNAADLSESY FVNPENFEDVTNSVNITFPNPNOYKVEFNT PDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVV PEQPDEPGEIEPIPED

[00334] SEQ ID NO: 29 - CIfAN2N3P1168S / Y118A mutante 27 (Q327KDQNATK)

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYROTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQOQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNOYKVEFNTPDDOIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEKDQN ATKPDEPGEIEPIPED

[00335] SEQ ID NO: 30 - CIFAN2N3P1168S / Y118A mutante 28 (D329KDQNATK)

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDOIDKTNNTYROTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDOQONTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQOIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGI DKPVVPEQPKD QNATKEPGEIEPIPED

[00336] SEQ ID NO: 31 - CIfAN2N3SP116S / Y118A mutante 29 (P331 KDQNATK)

VAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLN GVTSTAKVPPIMAGDOVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTL ATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQOIT TPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE KDQNATKGEIEPIPED

[00337] SEQID NO: 32- CIPAN2N3P116S / Y118A com sítio de gli- cosilação no mutante 30 (sublinhado), S no N-terminal, GS no C- terminal

SVAADAPAAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHOAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNL NGVTSTAKVPPIMAGDOVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVT LATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLK PNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQI TTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPD EPGEIEPKDQNATKPEDGS

[00338] Para que esta invenção possa ser compreendida melhor, são apresentados os seguintes exemplos. Estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de forma alguma.

[00339] Exemplos

[00340] Exemplo 1: Triagem de mutantes de sítio de glicosila- ção de CIfA

[00341] Células químicas competentes da cepa StGVXN1690 de E. coli, clone 6D (W3110 AwaaL; AECA (rffG-rffM)::cat) portando o plas- mídeo que codifica o polissacarídeo capsular de Staphylococcus au-

reus CP8 (CPS 8; pGVXN564) e o plasmídeo que codifica a versão códon-otimizada do mutante de oligossacaril transferase de Campylo- bacter jejuni PalB N534Q (pGVXN971) foram transformadas com plasmídeos codificando os mutantes no sítio de glicosilação N2N3 de fatores de agrupamento indicados (ver tabela) de Staphylococcus au- reus com uma sequência sinal de E. coli OMpA e portando uma eti- queta de afinidade C-terminal:

Plasmídeo Mutação — numeração de Mutação -— numeração de | Estrutura de plasmídeo, resistência

CO eo compamenatoal&e CIA MNSABGIR o RamBÓlR e

Ss

2

Plasmídeo Mutação — numeração de Mutação -— numeração de | Estrutura de plasmídeo, resistência a ersmemotoa de A NANSABE o JamBálie

< ê Tabela 1: Utilizando pPGVXN974, a mutagênese sítio-direcionada foi empregada para substituir o resíduo de aminoáci-

do indicado em CIfA contra um sítio de glicosilação (sequência de glicosilação "KDQNATI) resultando nos plasmí-

deos de expressão baseados em pEC415 exibindo resistência à ampicilina.

Para facilitar a referência, também é for-

necida a numeração correspondente em CIfN2N3.

[00342] “Como um controle positivo, células químicas competentes de E. coli, cepa StGVXN1690, clone 6D (W3110 AwaaL; AECA (rffG- rffM)::cat) portando o plasmídeo que codifica o polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus CP8 (CPS 8; pGVXN564) e o plasmídeo que codifica a versão códon-otimizada para uso do mutante de oligos- sacaril transferase de Campylobacter jejuni PglB N534Q (pbGVXN971) foram transformadas com um plasmídeo (pGVXN150) codificando a exoproteina A de Pseudomonas aeruginosa (pEC415-DsbA-ss- EPA?*gcosites 55) com uma sequência sinal de E. coli DSbA e portando uma etiqueta de afinidade de hexahistidina C-terminal.

[00343] “Como segundo controle positivo, as células competentes químicas de E. coli, cepa StIGVXN1690, clone 6D (W3110 AwaaL; AECA (rffG-rffM)::cat) portando o plasmídeo que codifica o polissaca- rídeo capsular de Staphylococcus aureus CP8 (CPF 8; pGVXN564) e o plasmídeo que codifica a versão códon-otimizada para uso do mu- tante de oligossacaril transferase de Campylobacter jejuni PglB N534Q (PGVXN971) foram transformadas com um plasmídeo (pGVXN633) que codifica o fator de aglomeração de Staphylococcus aureus (D328KDQNRTK) com sítio de glicosilação no mutante com a sequên- cia sinal de E. coli e portando a etiqueta de afinidade de hexahistidina C-terminal.

[00344] “Como um controle negativo, células competentes químicas de E. coli, cepa StGVXN1690, clone 6D (W3110 AwaaL; AECA (rffG- rffM)::cat) portando o plasmídeo que codifica o polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus CP8 (CPS 8; pGVXN564) e o plasmídeo que codifica a versão códon-otimizada para uso o mutante de oligos- sacaril transferase de Campylobacter jejuni PglB N534Q (pbGVXN971) foram transformadas com um plasmídeo (pbGVXN974) que codifica o fator de aglomeração de Staphylococcus aureus sem um sítio de gli- cosilação contendo uma sequência sinal de E. coli OMpA e portando uma etiqueta de afinidade de hexahistidina C-terminal.

[00345] As células foram cultivadas durante a noite em placas de ágar seletivo Luria Broth (LB) suplementadas com os três antibióticos ampicilina [100 ug / ml], tetraciclina [100 ug / ml] e espectinomicina [40 ug / ml]. Os transformantes recém-cultivados foram inoculados em 1 ml de pré-cultura de LB suplementada com antibióticos ampicilina [100 ug / ml], tetraciclina [100 ug / ml] e espectinomicina [40 ug / ml] e agi- tados em uma placa de 96 poços durante a noite a 37º C. Após o culti- vo durante a noite, 100 ul das pré-culturas foram usados para inocular 900 uL de Terrific Broth (TB) suplementado com 10 mM de MgCl2 e com os antibióticos ampicilina [100 ug / ml], tetraciclina [100 ug / ml] e espectinomicina [40 ug / ml]. Após 150 min de cultivo a 37º C, as cultu- ras foram induzidas com 1 mM de IPTG e arabinose a 0,1% e cultiva- das o/h a 37º C. As células foram colhidas dentro das placas de 96 poços por centrifugação durante 10 min a 3700 rpm. O conteúdo peri- plásmico foi extraído com 200 ul de tampão de lise (30 mM de Tris- HCl, pH 8,5, 1 mM de EDTA, pH 8,0, sacarose a 20%, contendo liso- zima [1 mg / ml final]l), durante 30 minutos a 4º C. Os extratos peri- plásmicos (PPE) foram limpos por centrifugação (15 min a 3700 rpm) e 150 ul de cada sobrenadante foram misturados com 37,5 ul de tampão de ligação 5x (150 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 M de NaCl, 50 mM de imidazol, pH 8,0, 4 mM de MgCl2) em uma nova placa de 96 poços (= carga). As "cargas" foram transferidas para uma nova placa de 96 po- ços contendo 50 ul / poço de agarose NI-NTA que foi equilibrada antes com 1 x tampão de ligação (30 mM de Tris-HCl, pH 80, 500 mM de NaCl, 500 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. As pastas fluidas foram transferidas para uma nova placa de 96 poços (contendo um dispositivo de filtro / poço). A agarose Ni-NTA com proteína ligada foi centrifugada no filtro durante 2 min a 300 ref e o fluxo foi descartado. Os filtros foram lava-

dos duas vezes com 1 x tampão de ligação e a proteína ligada foi eluí- da com 50 ul de tampão de eluição por filtro (1 x PBS pH 7,0; 500 mM de imidazol).

[00346] 20 yulde tampão de amostra Lammli 4x foram adicionados a cada uma das amostras eluídas, misturados e fervidos por 10 min a 95º C. Para análise por Western Blot, 30 ul dessas amostras foram carregadas por pista em um NuPAGE Gel a 4 a 12%, as proteínas fo- ram eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose e detectadas com um anticorpo anti-His (Qiagen No. 34660; Figuras 3 e 4) e um an- ticorpo secundário conjugado de peroxidase anti-camundongo (Sigma, A0412) ou um anticorpo anti-CP8 e um anticorpo secundário conjuga- do de peroxidase anti-coelho (BioRad, 170-6515; Figuras 5 e 6). O Western Blot anti-CP8 revelou formação de conjugado para o fator de aglomeração de Staphylococcus aureus de sítio de glicosilação nos mutantes mut1, mut27, mut28 e mut30.

[00347] “Exemplo 2: Melhor estabilidade de proteína da produção de bioconjugado de S. aureus no contexto de proteína CIFAN2N3 de sítio de glicosilação no mutante 30 em comparação com o sítio de glicosila- ção no mutante 1.

[00348] A eficiência e a estabilidade da glicosilação dos mutantes 1 e 30 descritos no Exemplo 1 foram comparadas diretamente.

[00349] A cepa StIGVXN8966 (W3110 waalL::pglBcuo N311V-K482R-D483H- assov; 016:011 wbjB-wbpM; ArmlB-wecG; wecA-wzzE::CP8 p2636 (CCW) Cat) foi transformada individualmente com os plasmídeos codifi- cando o fator de aglomeração de Staphylococcus aureus domínios N2N3 de sítio de glicosilação no mutante mut 1 (CIFAN2N3, pGVXN1188) ou o plasmídeo codificando o fator de aglomeração domínios N2N3 de sítio de glicosilação no mutante 30 (pbGVXN2592) por eletroporação.

[00350] As células foram cultivadas em meio TB, o polissacarídeo capsular de S. aureus CP8 (CPS 8) foi expresso constitutivamente a partir de grupos de genes integrados no genoma de E. coli. A oligos- sacaril transferase integrada PglB foi induzida com 1mMM de isopropil- B-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), CIFAN2N3 a base de plasmídeo foi induzida com 0,6% de arabinose, a uma densidade óptica de ODgoonm de 0,95 e 1,05.

[00351] — Após indução durante a noite a 37º C, as células foram co- lhidas e os bioconjugados CP8-CIfAN2N3 foram extraídos por uma preparação periplásmica usando um tampão de lise (380mM de Tris- HCl, pH 8,5, ImMM de EDTA, sacarose a 20% (peso / volume)) suple- mentado com 1 mg / ml de lisozima. As proteínas periplásmicas foram coletadas a partir do sobrenadante após centrifugação, carregadas em SDS-PAGE a 4-12% e transferidas para uma membrana de nitrocelu- lose e detectadas com um anticorpo anti-histidina. As proteínas carre- gadas foram normalizadas para a densidade óptica das células. Os resultados são mostrados na Figura 9.

[00352] Exemplo 3: Expressão e purificação do bioconjugado CP8- CIfAN2N3 mutante 1 a partir de um sistema de três plasmídeos

[00353] A Figura7 mostra uma análise SDS-PAGE SimplyBlue Sa- feStain, uma análise Western Blot anti-CIfA e anti-CP8 do produto final de CP8-CIfAN2N3 mut1, expressa a partir de um sistema de três plasmídeos em um biorreator de 20 L e purificada até a homogeneida- de.

[00354] A cepa StGVXN1690, clone 6D (W3110 AwaaLl, AECA (rffG-rffM)::cat) portando os plasmídeos que codificam o fator de aglo- meração de Staphylococcus aureus domínios N2N3 de síto de glicosi- lação no mutante mut1 com uma sequência sinal OmpA de E. coli e portando uma etiqueta de afinidade de hexahistidina C-terminal PGVXN1188 e o plasmídeo que codifica o polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus CP8 (CPS 8) pGVXN564 foi transformada com o plasmídeo portando a oligossacaril transferase PglB de Campylobacter jejuni de ocorrência natural para uso de códon-otimizado pGVXN970, por eletroporação e plaqueado em uma placa de ágar seletiva.

[00355] As células foram inoculadas em uma pré-cultura de 400 ml de LB, agitadas durante a noite a 37º C e inoculadas em um biorreator de 20 L (novo MBR FE 03/20 L) contendo 7 Litros (L) de meio Terrific Broth (TB). O polissacarídeo recombinante foi expresso constitutiva- mente, enquanto PglB e CIFAN2N3 mut1 foram induzidos com 1 mM de isopropil-B-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e com arabinose a 0,6%, respectivamente, a uma densidade óptica de ODçsoonm de 40, e o vaso foi alimentado com meio TB durante a noite a 37º C até atingir uma ODeoonm de 108 e um volume total de 10 L, e a indução foi continuada por um total de 40 horas (h).

[00356] Após a indução, um total de 803.600 ODs foram colhidos e lavados com cloreto de sódio a 0,9%. Os bioconjugados CP1- CIFAN2N3 mut1 de 100.000 ODs foram extraídos por um tratamento de choque osmótico. As células foram ressuspensas em 250 ml de 1/3 x TBS (solução salina tamponada com Tris, Fisher Scientific), suplemen- tadas com 125 ml de tampão de ressuspensão (sacarose a 75%, 30 mM de EDTA, 600 mM de Tris HCl, pH 8,5), incubadas por 20 minutos a 4º C por rotação. As células foram peletizadas e ressuspensas em 375 ml de tampão de choque osmótico (10 mM de Tris HCl, pH 8,0) e novamente incubadas por 30 minutos a 4º C. As células foram peleti- zadas e o sobrenadante (420 ml) foi suplementado com 21 ml de clo- reto de magnésio a 1 M e 110 ml de tampão de ligação 5 x Tris-HCIl a 150 mM, pH 8,0, NaCl a 2500 mM, imidazol a 25 mM e filtrado com um filtro de 0,2 micrometros. 40 ml de microesferas IMAC (cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados) foram equilibradas com Tris-HCI a 30 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, imidazol a 5 mM e incuba- das com a amostra por agitação durante 30 minutos em temperatura ambiente. A resina foi empacotada em uma coluna XK26 / 20 (GE

Healthcare) e lavada com Tris-HCI a 30 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, Imidazol a 5 mM para 2 volumes de coluna. A proteína foi eluída com um gradiente para atingir Tris-HCI a 30 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, imidazol a 500 mM em 15 volumes de coluna. As frações foram anali- sadas por SDS-PAGE a 4-12%, desenvolvidas com Western Blot anti- His e todas as frações contendo bioconjugado foram reunidas (110 ml) e carregadas diretamente em uma coluna PallQ (Pall) equilibrada com Bis-Tris a 30 mM pH 6,5, NaCl a 50 mM. A proteína foi eluída por um gradiente de 20 volumes de coluna para Bis-Tris a 30 mM, pH 6,5, NaCl a 500 mM e as frações foram analisadas por 4 a 12% de SDS- PAGE, coradas com SimplyBlue Safe Stain e visualizadas por Western Blot anti-His. As frações contendo a maior parte do bioconjugado e menos das espécies não glicosiladas foram reunidas (42 ml) e dialisa- das contra 4 L de Na-fosfato a 5 mM pH 7,2, NaCl a 150 mM durante a noite a 4º C. A amostra foi carregada em uma coluna de hidroxiapatita (Biorad) equilibrada com Na-Fosfato a 5 mM, pH 7,2, NaCl a 150mM e eluída por um gradiente diferencial até Na-Fosfato a 500 mM, pH 7,2, NaCl a 150mM. As frações foram analisadas por SDS -PAGE 4 a 12%, coradas com SimplyBlue Safe Stain e as frações contendo glicanos mais longos foram reunidas. A amostra combinada (55 ml) foi concen- trada em um filtro de corte de peso molecular de 10 kDa (MWCO) (Mil- lipore) e injetada em uma coluna de exclusão de tamanho (Superdex 200 10/300, GE Healthcare) equilibrada e funcionando em 1x TBS (so- lução salina tamponada com Tris, Fisher Scientific). As frações foram analisadas por SDS-PAGE 4 a 12%, coradas com SimplyBlue Safe Stain e as frações mais limpas contendo a menor proteína não glicosi- lada e impurezas foram reunidas e filtradas estéril.

[00357] “Exemplo 4: Expressão e purificação do bioconjugado CP8- CIFAN2N3 mut 30 a partir de um sistema de um plasmídeo

[00358] A Figura8 mostra uma análise SDS-PAGE SimplyBlue Sa-

feStain, uma análise Western Blot anti-CIfA e anti-CP8 do produto final de CP8-CIfFAN2N3 mut30, expressa a partir de um sistema de um plasmídeo em um biorreator de 2L e purificada até a homogeneidade.

[00359] A cepa StGVXN8966 (W3110 waaL::pglBcuo n311V-K482R-D483H- assov; 016::011 wbjB-wbpM; ArmIlB-wecG; wecA-wzzE::CP8 p2636 (CCW) Cat) foi transformada com o plasmídeo codificando o fator de aglomeração de Staphylococcus aureus domínio N2N3 de sítio de gli- cosilação no mutante 30 com uma sequência sinal de proteína do anel P flagelar S. flexneri (Flgl) e portando uma etiqueta de afinidade de hexahistidina C-terminal (pDGVXN2685), por eletroporação e plaquea- das em uma placa de ágar seletiva.

[00360] As células foram inoculadas em uma pré-cultura de 400 ml de LB suplementada com MgCl2 a 10 mM, agitadas durante a noite a 37º C e inoculadas em biorreatores de 2 L (Infors Multitron) contendo 1,4 L de meio TB. O polissacarídeo recombinante foi expresso consti- tutivamente, enquanto PglB e CIfA foram induzidos com 1 mM de iso- propil-B-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e com arabinose a 0,6%, res- pectivamente, a uma densidade óptica de ODgoonm de 33, e o vaso foi alimentado com meio de TB durante a noite para atingir volume total de 1,8 litros.

[00361] — Após indução durante a noite, um total de 138.600 ODs fo- ram colhidos e lavados com cloreto de sódio a 0,9%. Os bioconjuga- dos foram extraídos por um tratamento de choque osmótico. As célu- las (30.000 equivalentes ODgoo) foram ressuspensas em 100 ml de 1/3 x TBS (solução salina tamponada com Tris, Fisher Scientific), suple- mentadas com 50 ml de tampão de ressuspensão (sacarose a 75%, EDTA a 30 mM, Tris HCI a 600 mM, pH 8,5) incubadas por 30 minutos a 4º C por rotação. As células foram peletizadas e ressuspensas em 150 ml de tampão de choque osmótico (Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e no- vamente incubadas por 30 minutos a 4º C. As células foram peletiza-

das e o sobrenadante foi suplementado com MgCl2 a 50 mM e tampão de ligação 5 x para atingir Tris-HCI a 30 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, Imidazol a 5 mM. 50 ml de microesferas de IMAC (cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados) foram equilibrados com Tris- HCI a 30 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, imidazol a 5 mM e incubadas com a amostra por agitação durante 1 h em temperatura ambiente.

À resina foi empacotada em uma coluna XK26 (GE Healthcare) e lavada com Tris-HCIl a 30 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, Imidazol a 5 mM para volumes de coluna.

A proteína foi eluída com um gradiente para atingir Tris-HCI a 30 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, imidazol a 500 mM em 15 volumes de coluna.

As frações foram analisadas por SDS- PAGE 4 a 12%, desenvolvidas com Western Blot anti-His e todas as frações contendo bioconjugado foram reunidas (128 ml) e carregadas diretamente em uma coluna PallQ (Pall) equilibrada com Bis-Tris a 30 MM, pH 6,5, NaCl a 50 mM.

A proteína foi eluída por um gradiente de volumes de coluna até Bis-Tris a 30 mM, pH 6,5, NaCl a 500 mM, e as frações foram analisadas por SDS-PAGE 4 a 12%, coradas com SimplyBlue Safe Stain e visualizadas por Western Blot anti-His.

As fra- ções contendo a maior parte do bioconjugado e menos das espécies não glicosiladas foram reunidas (55 ml) e dialisadas contra 4 L de Na- fosfato a 5 mM pH 7,2, NaCl a 150 mM durante a noite a 4º C.

À amostra foi carregada em uma coluna de hidroxiapatita (Biorad) equili- brada com Na-fosfato a SMM pH 7,2, NaCl a 150mM e eluída por um gradiente diferencial até Na-fosfato a 500 mM, pH 7,2, NaCl a 150mM.

As frações foram analisadas por SDS-PAGE 4 a 12%, coradas com SimplyBlue Safe Stain e as frações contendo glicanos mais longos fo- ram reunidas separadamente das frações contendo glicanos mais cur- tos.

As amostras reunidas foram concentradas separadamente em um filtro MWCO de 10kDa (Millipore) e injetadas em uma coluna de exclu- são de tamanho (Superdex 200 10/300, GE Healthcare), operando em

1x TBS (solução salina tamponada com Tris, Fisher Scientific). As fra- ções foram analisadas por SDS-PAGE a 4-12%, coradas com Sim- plyBlue Safe Stain e as frações mais limpas contendo a menor proteí- na não glicosilada foram reunidas e filtradas estéril.

[00362] Exemplo 5: Produtividade aprimorada do bioconjugado de S. aureus CP8-CIPAN2N3 mut30 com expressão de portador a partir de uma sequência sinal de flagelina versus uma sequência sinal OMpA

[00363] A Figura 10 mostra o impacto no rendimento da produção com diferentes sequências sinal em CIFAN2N3 mut30 e destaca o au- mento da produtividade de bioconjugados CP8-CIFAN2N3 mut 30 com a sequência sinal da proteína do anel P flagelar de S. flexneri Figl.

[00364] A cepa StGVXN8966 (W3110 waaL::pglBcuo n311V-K482R-D483H- assov; O16::011 wbjB-wbpM; ArmlB-wecG; wecA-wzzE::CP8 p2636 (CCW) Cat) foi transformada individualmente com os plasmídeos co- dificando o fator de aglomeração de Staphylococcus aureus domínios N2N3 de sítio de glicosilação no mutante mut 30 com uma sequência sinal de dissulfeto oxidoredutase DsbA de E. coli (DsbA, pGVXN2684), uma sequência sinal de proteína de anel P flagelar de S. flexneri (Flgl, PGVXN2685), enterotoxina lábil ao calor de E. coli IIB, sequência sinal da cadeia B (LTIlb, PpGVXN2686), sequência sinal MalE da proteína de ligação à maltose de E. coli (MalE, pGVXN2687), sequência sinal pre- cursora de pectase liase 2 de P. carotovorum (PelB, pGVXN2688), se- quência sinal de proteína imunogênica de superfície de S. agalactiae (SipA, pGVXN2689), sequência sinal de proteína de translocação de E. coli (TolB, pGVXN2691), sequência sinal de proteína de membrana externa de E. coli (OmpA, pGVXN2692) por eletroporação.

[00365] As células foram cultivadas em meio TB, o polissacarídeo capsular de S. aureus CP8 (CPS 8) foi expresso constitutivamente a partir de agrupamentos de genes integrados no genoma de E£E. coli. À oligossacaril transferase integrada PglB foi induzida com 1 mM de iso-

propil-p-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), CIFAN2N3 a base de plasmí- deo foram induzidos com arabinose a 0,6%, entre uma densidade ópti- ca ODgoonm de 0,86 e 0,96.

[00366] Após a indução durante a noite a 37º C, as células foram colhidas e os bioconjugados CP8-CIfAN2N3 foram extraídos por uma preparação periplásmica usando um tampão de lise (Tris-HCI a 30mM, pH 8,5, EDTA a ImM, sacarose a 20% (peso / volume)) suplementada com 1 mg / ml de lisozima. As proteínas periplásmicas foram coletadas a partir do sobrenadante após a centrifugação, carregadas em SDS- PAGE 4 a 12% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose e detectadas com um anticorpo de etiqueta de anti-histidina. As proteí- nas carregadas foram normalizadas para a densidade óptica das célu- las. Os resultados são mostrados na Figura 10.

[00367] A presente descrição não deve ser limitada em escopo pe- las modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modifica- ções do assunto aqui fornecido, além das descritas, tornar-se-ão evi- dentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras em anexo. Tais modificações devem se enquadrar no escopo das reivindicações em anexo.

[00368] Várias publicações, patentes e pedidos de patente são cita- dos aqui, cujas descrições são aqui incorporadas em sua totalidade.

Claims (40)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais sequências consenso selecionadas a partir de: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido exceto a prolina; em que a dita sequência consenso foi adicionada ou substituída por um ou mais aminoácidos entre os resíduos de aminoá- cidos 313-340 da SEQ ID NO: 3 ou em uma posição equivalente den- tro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90 %, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a dita sequência consenso foi substituída pelo resíduo de aminoácido Q327, D329, P331 ou 1337 na SEQ ID NO: 3 ou substituída em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posição de aminoácido equivalente ao resíduo de aminoáci- do Q327, D329 ou 1337 na SEQ ID NO: 3.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que contém uma única sequência consenso que foi substituída pelo resíduo de aminoácido 1337 na SEQ ID NO: 3, ou substituída em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posição de aminoácido equivalente ao resíduo de aminoácido 1337 na SEQ ID NO: 3.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que X é Q (glutamina) e ZÉ À (alanina) (por exemplo, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO: 23)).

5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoá- cidos compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada a partir de P116 a Se Y118 a A com referência à sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (ou uma posição equivalente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3), compreen- dendo opcionalmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs 4-5 ou 10-12.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zado pelo fato de que compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 3, a dita sequência de aminoácidos compreendendo uma sequência con- senso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 21) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO: 22), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido exceto a prolina, substituído pelo aminoácido na posição 1337 na SEQ ID NO: 3, ou substituído em uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3 em uma posição de aminoácido equivalente ao resíduo de aminoácido Q327, D329 ou 1337 na SEQ ID NO: 3.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que tem um resíduo de serina adicional no N-terminal, opcionalmente, o dito polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idên- tica à SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 12; e / ou um resíduo de glicina ou glicina-serina adicional no C-terminal, opcionalmente o dito polipep- tídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 32.

8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoá- cidos compreende adicionalmente uma sequência sinal que é capaz de direcionar o polipeptídeo para o periplasma de uma célula hospe- deira (por exemplo, bactéria), opcionalmente a dita sequência sinal sendo selecionada a partir de SEQ ID NO: 13-20, opcionalmente o dito polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 11.

9. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoá- cidos compreende adicionalmente uma etiqueta de peptídeo que é útil para a purificação da proteína CIfA, opcionalmente a dita etiqueta de peptídeo compreendendo seis resíduos de histidina e opcionalmente a dita etiqueta de peptídeo localizada na C-terminal da sequência de aminoácidos, opcionalmente o dito polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27.

10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é glicosi- lado.

11. Conjugado (por exemplo, bioconjugado) compreenden- do um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo está ligado a um antígeno, por exemplo, um antígeno de polissacarídeo ou oligos- sacarídeo.

12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11, caracte- rizado pelo fato de que o conjugado é covalentemente ligado ao antí- geno através de uma ligação química obtida através de um método de conjugação química, opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em química de carbodi-imida, animação redutiva, química de cianilação (por exemplo, química de CDAP), química de maleimida,

química de hidrazida, química de éster, e química da N-hidroxisucci- nimida, diretamente ou por meio de um ligante.

13. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o antígeno está ligado a um aminoácido no polipeptídeo selecionado a partir de asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, histidina, arginina ou triptofano (por exemplo, asparagina).

14. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sacarídeo, opcionalmente um sacarídeo capsular bacteriano (por exemplo, de Staphylococcus aureus) opcionalmente selecionado a partir de um sacarídeo capsular de S. aureus sorotipo 5 ou 8.

15. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano de S. aureus sorotipo 8.

16. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

10.

17. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o po- linucleotídeo, como definido na reivindicação 16.

18. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende: um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosil transfe- rase(s); um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfera- se; um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10; e opcionalmente um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exem-

plo, wzy).

19. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma glicosil transfera- se que monta um derivado de monossacarídeo hexose em undeca- prenil pirofosfato (Und-PP) e (b) uma ou mais glicosil transferases ca- pazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarí- deo hexose montado em Und-PP.

20. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a dita glicosil transferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é heteróloga à célula hospedeira e / ou heteróloga a um ou mais dos genes que codi- ficam glicosil transferase opcionalmente em que a dita glicosil transfe- rase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é da espécie Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Aero- monas, espécie Francisella, espécie Helicobacter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Streptococ- cus, espécie Enterococcus, espécie Staphylococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium, espécie Listeria, ou espécie Campylobacter, opci- onalmente wecA (por exemplo, wecA de E. coli).

21. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que o dito derivado de monossacarídeo hexose é qualquer monossacarídeo em que a po- sição C-2 é modificada com um grupo acetamido, tal como N-acetilglu- cosamina (GIcNAc), N-acetilgalactoseamina (GalNAc), 2,4-Diaceta- mido-2,4,6-trideoxi-hexose (DATDH), N-acetilfucoseamina (FucNAc) ou N-acetilquinovosamina (QuiNAc).

22. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada pelo fato de que as ditas uma ou mais glicosil transferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose montado em Und-PP são a galactofuranosil transferase (wbeY) de E. coli 028 ou a galactofurano- sil transferase (wfdK) de E. coli 0167 ou são a galactofuranosil transfe- rase (wbeY) de E. coli 028 e a galactofuranosil transferase (wfdK) de E. coli 0167.

23. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizada pelo fato de que a célula hospe- deira compreende glicosil transferases suficientes para a síntese de unidades de repetição do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e / ou capK de S. aureus CP5 e opcionalmente capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO e / ou capP de S. aureus CP5.

24. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizada pelo fato de que a célula hospe- deira compreende glicosil transferases suficientes para a síntese de unidades de repetição do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e / ou capK de S. aureus CP5 e, opcionalmente, wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wWbpM, wzz e / ou wzx de P. aeru- ginosa O11 e wecB e / ou wecC de E. coli 016.

25. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizada pelo fato de que a oligossacaril transferase é derivada de Campylobacter jejuni, opcionalmente em que a dita oligossacaril transferase é pglB de C. jejuni, opcionalmente em que o gene pglB de C. jejuni é integrado ao genoma da célula hos- pedeira e opcionalmente em que pelo menos um gene da célula hos- pedeira foi inativado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi inativado ou deletado funci- onalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituído por um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituído por pglB de C. jejuni.

26. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma polimera- se de polissacarídeo capsular (por exemplo, wzy) ou uma polimerase de antígeno O (por exemplo wzy), opcionalmente a dita polimerase de polissacarídeo capsular é de Staphylococcus aureus, opcionalmente a partir de S. aureus CP5 ou CP8.

27. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma flipase (wzx), opcionalmente em que a dita flipase é de Staphylococcus au- reus, opcionalmente de S. aureus CP5 ou CP8.

28. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira compreende adicionalmente uma enzima capaz de modifi- car um monossacarídeo, opcionalmente uma epimerase, opcionalmen- te em que a dita epimerase é da espécie Escherichia, espécie Shigel- la, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, es- pécie Yersinia, espécie Aeromonas, espécie Francisella, espécie Heli- cobacter, espécie Proteus, espécie Lactococcus, espécie Lactobaci- Ilus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Strep- tomyces, espécie Streptococcus, espécie Enterococcus, espécie Sta- Pphylococcus, espécie Bacillus, espécie Clostridium, espécie Listeria, ou espécie Campylobacter, opcionalmente em que a dita epimerase é de E. coli, opcionalmente 23206 de E. coli 0157 ou galE.

29. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 28, caracterizada pelo fato de que o ácido nuclei- co que codifica o polipeptídeo está em um plasmídeo na célula hospe-

deira.

30. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 29, caracterizada pelo fato de que a célula hospe- deira é E. coli.

31. Método para produzir um bioconjugado que compreen- de um polipeptídeo ligado a um sacarídeo, caracterizado pelo fato de que compreende (i) cultivar a célula hospedeira, como definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 30 sob condições adequadas para a produção de proteínas e (ii) isolar o bioconjugado.

32. Bioconjugado produzido pelo método, como definido na reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que que compreende um sacarídeo ligado a um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

33. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou o conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, ou o bioconjugado, como definido na reivindicação 32.

34. Método para fabricar a composição imunogênica, como definida na reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compre- ende a etapa de misturar o polipeptídeo ou o conjugado ou o bioconju- gado com um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

35. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a composição imunogênica, como definida na reivindicação 34 e um ex- cipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

36. Método para o tratamento ou prevenção da infecção por Staphylococcus aureus em um sujeito em necessidade de tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo, como defini- do em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou do conjugado, co-

mo definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, ou do bio- conjugado, como definido na reivindicação 32, ou da vacina, como de- finida na reivindicação 35.

37. Método para imunizar um hospedeiro humano contra a infecção por Staphylococcus aureus, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 11 a 15, ou do bioconjugado, como definido na reivindicação 32, ou da vacina, como definida na reivindicação 35.

38. Método para induzir uma resposta imune a Staphylo- coccus aureus em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compre- ende administrar uma quantidade terapêutica ou profilaticamente efi- caz do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, ou do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, ou do bioconjugado, como definido na reivindi- cação 32, ou da vacina, como definida na reivindicação 35.

39. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 11 a 15, ou bioconjugado de acordo com a reivindicação 32, Ou a vacina de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de uma doença causa- da pela infecção por Staphylococcus aureus.

40. Uso do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou do conjugado, como definido em qual- quer uma das reivindicações 11 a 15, ou do bioconjugado, como defi- nido na reivindicação 32, ou da vacina, como definida na reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que é usado na fabricação de um medi- camento para o tratamento ou prevenção de uma doença causada por infecção por Staphylococcus aureus.