MX2010011393A

MX2010011393A - Vacuna.

Info

Publication number: MX2010011393A
Application number: MX2010011393A
Authority: MX
Inventors: Emmanuel Jules Hanon; William Ripley Ballou Jr
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2010-11-09
Also published as: IL208652A0; AU2009237648A1; CA2720877A1; EA201001478A1; EP2268307A1; WO2009127677A1; US20110189223A1; JP2011516597A; CN102065889A; KR20110009158A; ZA201007402B; BRPI0910884A2

Abstract

La presente invención proporciona una composición inmunogénica, la cual comprende un antígeno o una composición de antígeno, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

Description

VACUNA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a composiciones de vacuna e inmunogénicas mejoradas, y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a formulaciones de vacuna o inmunogénicas, las cuales comprenden un adyuvante en emulsión de aceite en agua, y un sacárido y/o proteína de S. aureus, y a su uso en medicina, en particular a su uso para aumentar las respuestas inmunitarias, y a métodos de preparación, en donde la emulsión de aceite en agua comprende un tocol, un aceite metabolizable, y un agente emulsionante.

ANTECEDENTES TÉCNICOS Siempre se necesitan nuevas composiciones o vacunas con una inmunogenicidad mejorada. Como una estrategia, se han utilizado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria producida para cualquier antígeno dado, y/o para reducir la reactogenicidad/toxicidad en el huésped.

Las emulsiones de aceite en agua por sí mismas son bien conocidas en la materia, y se ha sugerido que son útiles como composiciones adyuvantes (Patente Europea Número EP 399843; Publicación Internacional Número WO 95/17210).

La Publicación Internacional Número WO95/17210 da a conocer emulsiones de aceite en agua, las cuales comprenden del 2 al 10 por ciento de escualeno, del 2 al 10 por ciento de alfa-tocoferol, y del 0.3 al 3 por ciento de Tween 80, y su uso solas o en combinación con QS21 y/o 3D-MPL.

La Publicación Internacional Número W099/12565 da a conocer composiciones en emulsión de aceite en agua que comprenden un aceite metabolizable, una saponina, y un esterol. La emulsiones de aceite en agua comprenden además 3D-MPL.

La Publicación Internacional Número W099/11241 da a conocer emulsiones de aceite en agua, las cuales comprenden un aceite metabolizable y una saponina, en donde el aceite y la saponina están presentes en una proporción de entre 1:1 y 200:1.

Existe todavía una necesidad de composiciones de vacuna e inmunogénicas mejoradas que proporcionen una respuesta inmunitaria adecuada y que sean menos reactogénicas en el huésped.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto que se pueden utilizar composiciones de vacuna o inmunogénicas que comprenden cantidades más bajas de cada componente de la emulsión de aceite en agua, mientras que todavía se mantiene una respuesta inmunitaria comparable contra un antígeno o composición antigénica dentro de esta composición. Esto tiene la ventaja de mantener el nivel de inmunogenicidad contra un antígeno mientras que se reduce la reactogenicidad dentro del huésped receptor y es aplicable para las composiciones que comprenden un sacárido o una proteína de estafilococo (por ejemplo, de Staphylococcus aureus).

De conformidad con lo anterior, en el primer aspecto de la presente invención se proporciona una composición inmunogénica, la cual comprende un sacárido y/o proteína de estafilococo, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizabie, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de vacuna, la cual comprende un sacárido o una proteína de estafilococo, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizabie, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una composición de vacuna o inmunogénica, la cual comprende un sacárido o una proteína de estafilococo, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizabie, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante, en la elaboración de una composición inmunogénica para la prevención de una infección y/o enfermedad.

En un aspecto adicional, se proporciona un método o uso como se define anteriormente en la presente, para la protección contra una infección o enfermedad causada por un patógeno, el cual es una variante del patógeno a partir del cual se deriva el antígeno de la composición inmunogénica. En otra modalidad, se proporciona un método o uso como se define anteriormente en la presente, para la protección contra infecciones o enfermedades causadas por un patógeno, el cual comprende un antigeno que una variante del antígeno de la composición inmunogénica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Estudio clínico: titulaciones medias geométricas (G Ts) para el anticuerpo anti-hemaglutinina (HA) en diferentes puntos del tiempo (cohorte de ATP para la inmunogenicidad).

Figura 2: Estudio clínico: índice de seroprotección (SPR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) con un intervalo de confianza del 95 por ciento en el día 0 y en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad).

Figura 3: Estudio clínico: índice de seroconversión (SCR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) con un intervalo de confianza del 95 por ciento en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad).

Figura 4: Estudio clínico: factor de seroconversión (SCF) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) con un intervalo de confianza del 95 por ciento en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad).

Figuras 5A-5C: Estudio en ratones: Prueba de inhibición de hemaglutinina (GMT +/- IC95) en ratones BALB/c primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas (intervalo de dosis AS03). Figura 5A: Titulaciones de Anti-A/Nueva Caledonia/20/99 Hl; Figura 5B: Titulaciones de Anti-A/Panamá/2007/99 Hl. Figura 5C: Titulaciones de Anti-B / Shandong / 7/97 Hl.

Figura 6: Estudio en ratones: Prueba de inhibición de hemaglutinina (GMT +/- IC95) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas (intervalo de dosis AS03).

Figura 7: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (células-T CD4+) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de ratones C57BI/6 primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas (intervalo de dosis AS03).

Figura 8: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (células-T CD4+) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de ratones C57BI/6 primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas e inmunizados con una dosis baja de antígeno (0.5 microgramos) y adyuvante con el intervalo de dosis AS03.

Figura 9: Estudio en ratones: Titulaciones ELISA de Ig en suero específica de H5N1 (A y B), y respuestas isotípicas de lgG1 anti-H5N1 (C y D) e lgG2b (E y F) en el día 14 después de la inmunización (GMT +/- IC95) para dos dosis de antígeno diferentes: 1.5 microgramos (A, C y E) o 0.38 microgramos (B, D y F) Figura 10: Estudio en ratones: Prueba de inhibición de hemaglutinación (GMT +/- IC95) en el día 21 después de la inmunización (GMT +/- IC95) para dos dosis de antígeno diferentes: 1 .5 m icrog ram os (A) o 0.38 m icrog ramos (B) .

Figuras 1 1 A-1 1 B: Estudio en ratones: Respuesta inmu ni-taria celular (células-T CD4+) en ratones C57BI/6 puros inmunizados con diferentes dosis de la vacuna H5N 1 (1 .5 ó 0.38 microg ramos) y adyuvante con el intervalo de dosis de AS03: (A) 1 .5 microgramos de HA Ag (antígeno) o (B) 0.38 microg ramos de HA Ag (antígeno).

Figura 1 2: Estudio en cerdos. Prueba de inhibición de hemaglutinina (G MT +/- IC95) en cerdos primeramente inoculados con cepas homólogas (intervalo de dosis AS03) .

DESC RI PCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores pretenden que íos términos "comprendiendo", "comprenden" y "comprende" en la presente, sean opcionalmente sustituibles con los términos "consistiendo en", "consisten en" y "consiste en", respectivamente, en cada caso.

Las modalidades de la presente en relación con "composiciones de vacuna" de la invención , también son aplicables a las modalidades en relación con "composiciones inmunogénicas" de la invención , y viceversa.

En una modalidad de la invención , se proporciona una composición de vacuna o inmunogénica que comprende u n antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 1 0 milig ramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 1 1 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

En una modalidad adicional de la invención, se proporciona una composición de vacuna o inmunogénica que comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable (tal como escualeno), de 0.5 a 11 miligramos de tocol (tal como alfa-tocoferol y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante (tal como mono-oleato de sorbitán de polioxietileno), por dosis humana.

Componente de emulsión de aceite en agua La composición adyuvante de la invención comprende un adyuvante en emulsión de aceite en agua, de preferencia esta emulsión comprende un aceite metabolizable en una cantidad de 0.5 a 10 miligramos, un tocol en una cantidad de 0.5 a 11 miligramos, y un agente emulsionante en una cantidad de 0.4 a 4 miligramos, y que tiene gotas de aceite, de las cuales cuando menos el 70 por ciento por intensidad tienen diámetros de menos de 1 miera.

Con el objeto de que cualquier composición de aceite en agua sea adecuada para su administración a seres humanos, la fase de aceite del sistema en emulsión tiene que comprender un aceite metabolizable. El significado del término "aceite metabolizable" es bien conocido en la materia. Metabolizable se puede definir como 'ser capaz de transformarse mediante el metabolismo' (Dorland's lllustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25a Edición (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite de animal, o aceite sintético, el cual no sea tóxico para el receptor, y el cual sea capaz de transformarse mediante el metabolismo. Las nueces, semillas, y granos son las fuentes comunes de los aceites vegetales. Los aceites sintéticos también son parte de esta invención, y pueden incluir los aceites comercialmente disponibles, tales como NEOBEE® y otros. Un aceite metabolizable particularmente adecuado es el escualeno. El escualeno (2,6,10,15, 19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa- exaeno) es un aceite insaturado, el cual se encuentra en grandes cantidades en el aceite de hígado de tiburón, y en cantidades más bajas en el aceite de oliva, en el aceite de germen de trigo, en el aceite de arroz integral, y en la levadura, y es un aceite particularmente preferido para utilizarse en esta invención. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho de que es un intermediario en la biosíntesis del colesterol (Merck Index, 10a Edición, Anotación Número 8619).

De una manera adecuada, el aceite metabolizable está presente en la composición adyuvante en una cantidad de 0.5 a 10 miligramos, de preferencia de 1 a 10, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, ó de 5 a 6 miligramos (por ejemplo, de 2 a 3, de 5 a 6, o de 9 a 10 miligramos), específicamente 5.35 miligramos o 2.14 miligramos. En una modalidad adicional de la invención, el aceite metabolizable está presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad de 0.5 a 10 miligramos, de preferencia de 1 a 10, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, o de 5 a 6 miligramos (por ejemplo, de 2 a 3, de 5 a 6, o de 9 a 10 miligramos), específicamente 5.35 miligramos o 2.14 miligramos.

La cantidad de aceite metabolizable en la composición de vacuna o ¡nmunogénica se puede expresar como un porcentaje de la composición total. De una manera adecuada, el aceite metabolizable está presente en la composición de vacuna en una cantidad del 0.5 por ciento al 2 por ciento, de preferencia del 0.25 al 2, o del 0.25 al 1.75, o del 0.5 al 1.65, o del 0.6 al 1.5, o del 0.8 al 1.4, o del 1 al 1.25 por ciento (volumen/volumen) de aceite del volumen total de la composición.

En otra modalidad específica, el aceite metabolizable está presente en una cantidad final de aproximadamente el 1.25 por ciento del volumen total de la composición de vacuna (o ¡nmunogénica). En otra modalidad específica, el aceite metabolizable está presente en una cantidad final del 0.25 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición.

A manera de aclaración, las concentraciones dadas en volumen/volumen se pueden convertir en concentración en peso/volumen mediante la aplicación del siguiente factor de conversión: una concentración de escualeno del 5 por ciento (volumen/volumen) es equivalente a una concentración de escualeno del 4.28 por ciento (peso/volumen).

La emulsión de aceite en agua comprende un tocol. Los tocóles son bien conocidos en la materia y se describen en la Patente Europea Número EP0382271. De una manera adecuada, el tocol es alfa-tocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa-tocoferol (también conocido como succinato de vitamina E). Este tocol está adecuadamente presente en la composición adyuvante en una cantidad de 0.5 a 11 miligramos, de preferencia de 1 a 11, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, de 5 a 6 (por ejemplo, de 10 a 11, de 5 a 6, de 2.5 a 3.5, o de 1 a 3 miligramos). En una modalidad específica, el tocol está presente en una cantidad de 5.94 miligramos o de 2.38 miligramos. En una modalidad adicional, este tocol está adecuadamente presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad de 0.5 a 11 miligramos, de preferencia de 1 a 11 , de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, de 5 a 6 (por ejemplo, de 10 a 11, de 5 a 6, de 2.5 a 3.5, o de 1 a 3 miligramos). En una modalidad específica, el tocol está presente en una cantidad de 5.94 miligramos o de 2.38 miligramos.

La cantidad de tocol se puede expresar como un porcentaje del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica. De una manera adecuada, el tocol está presente en la composición de vacuna en una cantidad del 0.25 por ciento al 2 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición inmunogénica, de preferencia al 0.25-2 por ciento, comprende del 0.25 al 2, o del 0.25 al 1.75, o del 0.5 al 1.65, o del 0.6 al 1.5, o del 0.8 al 1.4, o del 1 al 1.25 por ciento (volumen/volumen) de tocol del volumen total.

De preferencia, el tocol está presente en una cantidad de entre el 0.2 por ciento y el 2 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición de vacuna (o inmunogénica), más preferiblemente en una cantidad del 1.25 por ciento (volumen/ volumen) en un volumen de dosis de 0.5 mililitros.

En una modalidad específica, el tocol está presente en una cantidad final de aproximadamente el 1.25 por ciento del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica. En otra modalidad específica, el tocol está presente en una cantidad final del 0.25 por ciento (volumen/volumen) del volumen total, o del 1.25 por ciento (volumen/volumen) en un volumen de dosis de 0.5 mililitros, o del 0.9 por ciento (volumen/volumen), en un volumen de dosis de 0.7 mililitros, o del 0.5 por ciento (volumen/volumen) en una dosis de 0.5 mililitros, o del 0.35 al 0.37 por ciento, de preferencia del 0.36 por ciento en una dosis de vacuna o inmunogénica de 0.7 mililitros.

A manera de aclaración, las concentraciones dadas en volumen/volumen se pueden convertir en concentración en peso/volumen mediante la aplicación del siguiente factor de conversión: una concentración de alfa-tocoferol del 5 por ciento (volumen/volumen) es equivalente a una concentración de alfa-tocoferol del 4.8 por ciento (peso/volumen).

La emulsión de aceite en agua comprende además un agente emulsionante. El agente emulsionante puede ser adecuadamente mono-oleato de sorbitán de polioxietileno. En una modalidad particular, el agente emulsionante se puede seleccionar a partir del grupo que comprende: Polisorbato® 80 ó Tween® 80.

Este agente emulsionante está adecuadamente presente en la composición adyuvante en una cantidad de 0.1 a 5, de 0.2 a 5, de 0.3 a 4, de 0.4 a 3, o de 2 a 3 miligramos (por ejemplo, de 0.4 a 1.2, de 2 a 3, o de 4 a 5 miligramos) de agente emulsionante. En una modalidad específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad de 0.97 miligramos o de 2.425 miligramos.

Además, este agente emulsionante está adecuadamente presente en la composición de vacuna o inmunogénica en una cantidad de 0.1 a 5, de 0.2 a 5, de 0.3 a 4, de 0.4 a 3, o de 2 a 3 miligramos (por ejemplo, de 0.4 a 1.2, de 2 a 3, o de 4 a 5 miligramos) de agente emulsionante. En una modalidad específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad de 0.97 miligramos o de 2.425 miligramos.

La cantidad de agente emulsionante se puede expresar como un porcentaje del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica. De una manera adecuada, el agente emulsionante está presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad del 0.125 al 0.8 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición, de preferencia en del 0.08 al 0.5, o del 0.1 al 0.7, o del 0.2 al 0.6, o del 0.25 al 0.55, o del 0.3 al 0.52, o del 0.4 al 0.5 por ciento (volumen/volumen) del volumen total. En una modalidad específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad del 1 por ciento, del 0.5 por ciento, o del 0.2 por ciento (volumen/volumen) del volumen total de la composición de vacuna o inmunogénica.

A manera de aclaración, las concentraciones dadas en volumen/volumen se pueden convertir en concentración en peso/volumen mediante la aplicación del siguiente factor de conversión: una concentración de polisorbato 80 del 1.8 por ciento (volumen/volumen) es equivalente a una concentración de polisorbato 80 del 1.91 por ciento (peso/volumen).

En una modalidad específica, un volumen de dosis de vacuna o inmunogénica de 0.5 mililitros contiene el 0.45 por ciento (volumen/volumen) de Tween 80, y un volumen de dosis de 0.7 mililitros contiene el 0.315 por ciento (volumen/volumen) de Tween 80. En otra modalidad específica, una dosis de 0.5 mililitros contiene el 0.18 por ciento (volumen/volumen) de agente emulsionante, y una dosis de composición de vacuna o inmunogénica de 0.7 mililitros contiene el 0.126 por ciento (volumen/volumen) de agente emulsionante.

El término "dosis humana" significa una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano. En términos generales, ésta es de entre 0.25 y 1.5 mililitros. En una modalidad, una dosis humana es de 0.5 mililitros. En una modalidad adicional, una dosis humana es más alta que 0.5 mililitros, por ejemplo de 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 ó 1 mililitro. En una modalidad adicional, una dosis humana es de entre 1 mililitro y 1.5 mililitros. En otra modalidad, en particular cuando la composición inmunogénica es para la población pediátrica, una dosis humana puede ser menor de 0.5 mililitros, tal como de entre 0.25 y 0.5 mililitros. La invención se caracteriza porque cada uno o todos los componentes individuales del adyuvante dentro de la composición inmunogénica están en un nivel más bajo de lo que anteriormente se pensaba que era útil, y son típicamente como se menciona anteriormente. Las composiciones particularmente adecuadas comprenden los siguientes componentes adyuvantes en las siguientes cantidades están en un volumen final de dosis humana de 0.5 mililitros: Tabla 1 La invención proporciona además una composición adyuvante, la cual comprende los componentes individuales como se definen anteriormente en la presente, y en la cantidad definida en lo anterior, por ejemplo, pero no exclusivamente, como se ilustra en la Tabla 1. Típicamente esta composición adyuvante estará en un volumen adecuado de la dosis humana. Cuando el adyuvante está en una forma líquida para combinarse con una forma líquida de una composición antigénica, la composición adyuvante estará en un volumen adecuado de la dosis humana que es una fracción del volumen final pretendido de la dosis humana, tal como, por ejemplo aproximadamente la mitad del volumen final pretendido de la dosis humana, por ejemplo un volumen de 350 microlitros para una dosis humana pretendida de 0.7 mililitros, o un volumen de 250 microlitros para una dosis humana pretendida de 0.5 mililitros. La composición adyuvante se diluye cuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis humana final de vacuna. El volumen final de esta dosis, desde luego, variará dependiendo del volumen inicial de la composición adyuvante y del volumen de la composición de antígeno agregada a la composición adyuvante. En una modalidad alternativa, se utiliza un adyuvante liquido para reconstituir una composición de antígeno liofilizada. En esta modalidad, El volumen adecuado de la dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se agrega al frasco que contiene la composición de antígeno liofilizada. La dosis humana final puede variar entre 0.5 y 1.5 mililitros.

El método para producir las emulsiones de aceite en agua es bien conocido por la persona experta en este campo. Comúnmente, el método comprende mezclar la fase de aceite que contiene tocol con un tensoactivo, tal como una solución de PBS/TWEEN 80MR, seguido por homogeneización utilizando un homogeneizador, y estaría claro para un experto en la materia que u n método que comprenda pasar la mezcla dos veces a través de una aguja de jeringa, sería adecuado para homogeneizar pequeños volúmenes de líq uido. Igualmente, el proceso de emulsión en un microfl uidizador (máquina Microfl uidics M 1 1 0S, un máxi mo de 50 pasadas , du rante u n período de 2 minutos a una entrada de presión máxima de 6 bar (presión de sal ida de aproxi madamente 850 bar)) podría ser adaptado por el experto en la técn ica para producir vol úmenes menores o mayores de em ulsión . La adaptación se podría lograr mediante experimentación de rutina, la cual comprende la medición de la em ulsión resultante hasta que se obtiene una preparación con gotas de aceite del diámetro req uerido .

En una emulsión de aceite en agua, el aceite y el emulsionante debe n estar en un vehículo acuoso. El veh ículo acuoso puede ser, por ejemplo , suero regu lado con fosfato.

De preferencia, los sistemas en em ulsión de aceite en agua de la presente i nvención tienen un tamaño pequeño de la gota de aceite en el rango de sub-micras. De una manera adecuada, los tamaños de las gotas estarán en el intervalo 1 20 a 750 nanóm etros , más preferiblemente serán tamaños de 1 20 a 600 nanómetros de diámetro. Más preferiblemente, la emulsión de aceite en agua contiene gotas de aceite , de las cuales cuando menos el 70 por ciento por intensidad son menores de 500 nanómetros de diámetro, más preferiblemente cuando menos el 80 por ciento por intensidad son menores de 300 nanometros de diámetro, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento por intensidad están en el intervalo de 120 a 200 nanometros de diámetro.

El tamaño de la gota de aceite, es decir, el diámetro, de acuerdo con la presente invención, se da por intensidad. Existen varias maneras de determinar el diámetro del tamaño de la gota de aceite por intensidad. La intensidad se mide mediante el uso de un instrumento dimensionador, de una manera adecuada mediante dispersión de luz dinámica, tal como el Malvern Zetasizer 4000 o de preferencia el Malvern Zetasizer 3000HS. Se da un procedimiento detallado en el Ejemplo 11.2. Una primera posibilidad es determinar el diámetro promedio z (ZAD) mediante dispersión de luz dinámica (PCS - espectroscopia de correlación de fotones); este método adicionalmente da el índice de polidispersidad (PDI), y tanto el ZAD como el PDI se calculan con el algoritmo de acumulantes. Estos valores no requieren del conocimiento del índice de refracción de partículas. Un segundo medio es calcular el diámetro de la gota de aceite mediante la determinación de la distribución total de tamaños de partículas mediante otro algoritmo, ya sea el Contin, o NNLS, o el "Malvern" automático (el algoritmo por omisión proporcionado por el instrumento dimensionador). La mayor parte del tiempo, debido a que se desconoce el índice de refracción de las partículas de una composición compleja, solamente se toma en consideración la distribución de intensidad, y si es necesario, la media de intensidad que se origina a partir de esta distribución.

Inmunoestimulantes Opcionales En una modalidad adicional de la invención, se proporciona una composición de vacuna o inmunogénica que comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante, la cual comprende una emulsión de aceite en agua y opcionalmente uno o más inmunoestimulantes adicionales, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.4 a 4 miligramos de un agente emulsionante.

En una modalidad, la composición adyuvante comprende una emulsión de aceite y agua como se describe en la presente. En una modalidad adicional, la composición adyuvante puede comprender además uno o más adyuvantes o inmunoestimulantes adicionales. En una modalidad adicional, la composición adyuvante opcionalmente comprende uno o más adyuvantes o inmunoestimulantes adicionales diferentes de QS21 y/o MPL.

El adyuvante adicional opcional se selecciona a partir del grupo de: una saponina, lípido A o un derivado del mismo, un oligonucleótido inmunoestimulante, un fosfato de alquil-glucosaminida, una sal de metal, un agonista de los receptores tipo-Toll, o combinaciones de los mismos. Se prefiere que el adyuvante sea un agonista de los receptores tipo-Toll, en particular un agonista de un receptor tipo-Toll 2, 3, 4, 7, 8 ó 9, o una saponina. Además se prefiere que el sistema adyuvante comprenda dos o más adyuvantes a partir de la lista anterior. Las combinaciones de preferencia contienen un adyuvante de saponina (en particular QS21) y/o un agonista del receptor tipo-Toll 4, tal como 3D-MPL o un agonista del receptor tipo-Toll 9, tal como un CpG que contenga un oligonucleótido inmunoestimulante. Otras combinaciones preferidas comprenden una saponina (en particular QS21), y un agonista del receptor tipo-Toll 4, tal como una saponina (en particular QS21), y un ligando del receptor tipo-Toll 4, tal como 3D-MPL o un fosfato de alquil-glucosaminida.

En una modalidad, el adyuvante adicional es un ligando del receptor tipo-Toll (TLR) 4, de preferencia un agonista, tal como un derivado de lípido A, en particular monofosforilo-lípido A, o más particularmente, monofosforilo-lípido A 3-desacilado (3 D - MPL).

El 3D-MPL está disponible bajo la marca comercial registrada MPL® por GlaxoSmithKIine Biologicals North America y promueve primordialmente las respuestas de células-T CD4+ con un fenotipo de IFN-g (Th1). Se puede producir de acuerdo con los métodos que se dan a conocer en la Patente Británica Número 2 220 211 A. Químicamente, es una mezcla de monofosforilo-lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. De preferencia, en las composiciones de la presente invención, se utiliza un 3D-MPL de partículas pequeñas. El 3D-MPL de partículas pequeñas tiene un tamaño de partículas tal que se pueda filtrar para esterilizarse a través de un filtro de 0.22 mieras. Estas preparaciones se describen en la Solicitud Internacional de Patente Número WO 94/21292. Los derivados sintéticos de lípido A son conocidos, y se piensa que son agonistas de TLR 4, incluyendo, pero no limitándose a: OM174 (di-fosfato ácido de 2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetra-decanoil-amino]-4-o-fosfono-B-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-a-D-glucopiranosilo), (Publicación Internacional Número WO 95/ 14026), OM 294 DP (3S, 9R)-3--[(R)-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-decano-1 , 10-d¡ol , 1 ,10-bis-(di-fosfato ácido) (Publicaciones Internacionales Números W099 /64301 y WO 00/0462), OM 197 MP-Ac DP 10-(6-amino-hexanoato) de (3S-, 9R) -3- [(R)-dodecanoiloxi-tetradecano¡l-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- idrox¡-tetradecanoil-amino]-decano-1 ,10-diol, 1 -di-fosfato ácido (Publicación Internacional Número WO 01/46127).

Otros ligandos de TLR4 que se pueden utilizar son fosfatos de alquil-glucosaminida (AGPs), tales como aquéllos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO9850399 o en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6303347 (también se dan a conocer procesos para la preparación de AGPs), o sales farmacéuticamente aceptables de AGPs, como se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6764840. Algunos AGPs son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Se piensa que ambos son útiles como adyuvantes.

Otros ligandos de TLR-4 adecuados, capaces de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-4 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5) son, por ejemplo, lipopolisacárido a partir de bacterias gram-negativas y sus derivados, o fragmentos de los mismos, en particular un derivado no tóxico de LPS (tal como 3D-MPL). Otros agonistas de TLR adecuados son: proteína de choque por calor (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ó 90; Proteína A de tensoactivo, oligosacáridos de hialuronano, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinógeno y B-defensina-2, dipéptido de muramilo ( DP) o proteína F del virus sincicial respiratorio. En una modalidad, el agonista de TLR es HSP 60, 70 ó 90.

Los receptores tipo-Toll (TLRs) son receptores transmembrana tipo I, conservados en la evolución entre los insectos y los seres humanos. Hasta ahora se han establecido diez TLRs (TLRs 1-10) (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). Los miembros de la familia de TLR tienen dominios extracelulares e intracelulares similares; se ha demostrado que sus dominios extracelulares tienen secuencias de repetición ricas en leucina, y sus dominios intracelulares son similares a la región intracelular del receptor de interleucina-1 (IL-1R). Las células de TLR se expresan diferencialmente entre las células inmunes y otras células (incluyendo las células epiteliales vasculares, adipocitos, miocitos cardíacos, y células epiteliales intestinales). El dominio intracelular de los TLRs pueden interactuar con la proteína adaptadora Myd88, la cual también posee el dominio IL-1R en su región citoplásmica, conduciendo a la activación de las citoquinas por NF-KB; esta senda de Myd88 es una manera en la cual se efectúa la liberación de citoquina mediante la activación del TLR. La principal expresión de los TLRs está en los tipos de células, tales como las células presentadoras de antígeno (por ejemplo, las células dendríticas, los macrófagos, etc.).

La activación de las células dendríticas mediante la estimulación a través de los TLRs conduce a la maduración de las células dendríticas, y a la producción de las citoquinas inflamatorias, tales como IL-12. La investigación llevada a cabo hasta ahora has encontrado que los TLRs reconocen diferentes tipos de agonistas, aunque algunos agonistas son comunes a varios TLRs. Los agonistas de TLR se derivan predominantemente a partir de bacterias o virus, e incluyen moléculas tales como flagelina o el lipopolisacárido (LPS) bacteriano.

"Agonista de TLR" significa el componente que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de una senda de señalización de TLR, ya sea como un ligando directo o bien indirectamente a través de la generación de ligandos endógenos o exógenos (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5).

En otra modalidad, otros agonistas naturales o sintéticos de las moléculas de TLR se utilizan como inmunoestimulantes adicionales opcionales. Éstos podrían incluir, pero no se limitan a, agonistas para TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9.

En una modalidad de la presente invención, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-1 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-1 se selecciona a partir de: Lipopéptidos (LPs) tri-acilados; modulina soluble en fenol; lipopéptido de Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3-bis-(palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, lipopéptido de triclorhidrato (Pam3Cys), el cual imita el término amino acetilado de una lipoproteína bacteriana, y lipopéptido de OspA a partir de Borrelia burgdorfei.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-2 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-2 es uno o más de una lipoproteína, a peptidoglicano, un lipopéptido bacteriano a partir de M tuberculosis, B burgdorferi. T pallidum; peptidoglicanos a partir de las especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manurónicos, porinas de Neisseria, fimbrias bacterianas, factores de virulencia de Yersina, viriones de CMV, hemaglutinina de sarampión, y zimosano a partir de levadura.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-3 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-3 es ARN de doble cadena (dsARN), o ácido poli-inosínico/poli-citidílico (Poli-IC), un patrón de ácido nucleico molecular asociado con la infección viral.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-5 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-5 es la flagelina bacteriana.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-6 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-6 es lipoproteína micobacteriana, lipopéptido di-acilado, y modulina soluble en fenol. Otros agonistas de TLR6 se describen en la Publicación Internacional Número WO2003043572.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-7 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-7 es un ARN de una sola cadena (ssARN), loxoribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquinolina, o un derivado de los mismos. En una modalidad, el agonista de TLR es imiquimod. Otros agonistas de TLR7 se describen en la Publicación Internacional Número WO02085905.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-8 (Sabroe y colaboradores, Jl 2003 p1630-5). De una manera adecuada, el agonista de TLR capaz de provocar una respuesta de señalización a través de TLR-8 es un ARN de una sola cadena (ssARN), una molécula de imidazoquinolina con actividad anti-viral, por ejemplo resiquimod (R848); el resiquimod también es capaz de ser reconocido por TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que se pueden utilizar incluyen aquéllos descritos en la Publicación Internacional Número WO2004071459.

También se pueden utilizar inmunoestimulantes de oligonucleótidos o cualquier otro agonista del receptor tipo-Toll (TLR) 9. Los oligonucleótidos preferidos para utilizarse en los adyuvantes o vacunas o composiciones inmunogénicas de la presente invención son los oligonucleótidos que contienen CpG, que contienen de preferencia dos o más motivos de dinucleótido CpG separados por cuando menos tres, más preferiblemente por cuando menos seis o más nucleótidos. Un motivo CpG es un nucleótido de Citosina seguido por un nucleótido de Guanina. Los oligonucleótidos CpG de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad preferida, el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente un enlace de fosforotioato, aunque los enlaces de fosfodiéster y otros enlaces internucleótidos están dentro del alcance de la invención. También se incluyen dentro del alcance de la invención los oligonucleótidos con enlaces internucleótidos mixtos. Los métodos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en las Patentes Números US5,666,153, US5,278,302 y WO95/26204.

Los ejemplos de los oligonucleótidos preferidos tienen las siguientes secuencias. Las secuencias de preferencia contienen enlaces internucleótidos modificados por fosforotioato.

OLIGO 1 (SEQ ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Los oligonucleótidos de CpG alternativos pueden comprender las secuencias preferidas anteriores, en las que haya supresiones o adiciones sin consecuencias. Los oligonucleótidos de CpG utilizados en la presente invención se pueden sintetizar mediante cualquier método conocido en la materia (por ejemplo, véase la Patente Europea Número EP 468520). De una manera conveniente, estos oligonucleótidos se pueden sintetizar utilizando un sintetizador automatizado.

De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la composición adyuvante comprende además un inmunoestimulante adicional, el cual se selecciona a partir del grupo que consiste en: un agonista de TLR-1, un agonista de TLR-2 , un agonista de TLR-3, un agonista de TLR-4, un agonista de TLR-5, un agonista de TLR-6, un agonista de TLR-7, un agonista de TLR-8, un agonista de TLR-9, o una combinación de los mismos.

Otros inmunoestimulantes preferidos para utilizarse en la presente invención son Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada a partir del árbol sudamericano Quilaja Saponaria Molina, y fue primeramente descrita por tener una actividad adyuvante por Dalsgaard y colaboradores, en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Volumen 44, Springer Verlag, Berlín, páginas 243-254). Se han aislado fragmentos purificados .de Quil A mediante HPLC, los cuales retienen su actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (Patente Europea Número EP 0 362 278), por ejemplo QS7 y QS21 (también conocidos como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina natural derivada a partir de la corteza del Quillaja saponaria Molina, que induce las células-T citotóxicas CD8+ (CTLs), las células Th1, y una respuesta de anticuerpo lgG2a predominante, y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.

Se han descrito formulaciones particulares de QS21 que se prefieren particularmente; estas formulaciones comprenden además un esterol (Publicación Internacional Número W096/33739). Cuando se incluyen escualeno y una saponina (opcionalmente QS21), es benéfico incluir también un esterol (opcionalmente colesterol) a la formulación, debido a que éste permite tener una reducción en el nivel total de aceite en la emulsión. Esto conduce a un costo reducido de elaboración, mejora de la comodidad global de la vacunación, y también mejoras cualitativas y cuantitativas de las respuestas inmunitarias resultantes, tales como una mejor producción de IFN-?. De conformidad con lo anterior, el sistema adyuvante de la presente invención típicamente comprende una proporción de aceite metabolizable : saponina (peso/peso) en el intervalo de 200:1 a 300:1; también la presente invención se puede utilizar en una forma "baja en aceite", cuyo intervalo opcional es de 1:1 a 200:1, opcionalmente de 20:1 a 100:1, o sustancialmente de 48:1; esta vacuna retiene las propiedades adyuvantes benéficas de todos los componentes, con un perfil de reactogenicidad muy reducido. De conformidad con lo anterior, algunas modalidades tienen una proporción de escualeno : QS21 (peso/peso) en el intervalo de 1:1 a 250:1 ó de 20:1 a 200:1 ó de 20:1 a 100:1, o sustancialmente de 48:1. Opcionalmente, también se incluye un esterol (por ejemplo, colesterol), presente en una proporción de saponina : esterol como se describe en la presente.

Antíqenos y composición de antíqeno Las formulaciones de vacuna o inmunogénicas contendrán un sacárido y/o proteína de estafilococo capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno de humano o animal.

Polisacáridos Las composiciones ¡nmunogénicas de la invención opcionalmente comprenden PNAG, antígeno 336 y/o polisacáridos tipos 5 y/u 8 a partir de S. aureus.

PNAG Ahora está claro que las diferentes formas de polisacáridos superficiales de estafilococos identificados como PS/A, PIA y SAA son de la misma entidad química - PNAG (Maira-Litran y colaboradores, Vaccine 22; 872-879 (2004)). Por consiguiente, el término PIA o PNAG abarca todos estos polisacáridos u oligosacáridos derivados a partir de los mismos.

PIA es una adhesina intercelular de polisacárido, y se compone de un polímero de glucosamina ß-(1?6)-enlazada sustituida con los constituyentes de N-acetilo y O-succinilo. Este polisacárido está presente tanto en S. aureus como en S. epidermidis, y se puede aislar a partir de cualquier fuente (Joyce y colaboradores 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litran y colaboradores, 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por ejemplo, PNAG se puede aislar a partir de S. aureus, cepa MN8m (Publicación Internacional Número WO 04/43407).

PIA, aislado a partir de S. epidermidis, es un constituyente integral de la biopelícula. Es responsable de mediar la adhesión de célula-célula, y probablemente también funciona para proteger a la colonia en crecimiento de la respuesta inmunitaria del huésped.

Recientemente se demostró que el polisacárido, previamente conocido como poli-N-succinil-B-(1?6)-glucosamina (PNSG), no tiene la estructura esperada, debido a que la identificación de la N-succinilación era incorrecta (Maira-Litran y colaboradores 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por consiguiente, el polisacárido formalmente conocido como PNSG, y ahora encontrado que es PNAG, también está abarcado por el término PIA.

PIA (o PNAG) puede ser de diferentes tamaños, variando desde más de 400 kDa hasta entre 75 y 400 kDa y hasta entre 10 y 75 kDa, hasta los oligosacáridos compuestos de hasta 30 unidades de repetición (de glucosamina B-(1?6)-enlazada sustituida con los constituyentes de N-acetilo y O-succinilo). Se puede utilizar cualquier tamaño de polisacárido u oligosacárido de PIA en una composición inmunogénica de la invención; sin embargo, se prefiere un tamaño de más de 40 kDa. El dimensionamiento se puede lograr mediante cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, mediante microf luidización, irradiación ultrasónica, o mediante disociación química (Patentes Números WO 03/53462, EP497524, EP497525).

En una modalidad, los intervalos de tamaños de PIA (PNAG) son de 40 a 400 kDa, de 50 a 350 kDa, de 40 a 300 kDa, de 60 a 300 kDa, de 50 a 250 kDa, y de 60 a 200 kDa.

PIA (PNAG) puede tener diferentes grados de acetilación, debido a la sustitución sobre los grupos amino por el acetato. El PIA producido ¡n vitro es casi completamente sustituido sobre los grupos amino (del 95 al 100' por ciento). De una manera alternativa, se puede utilizar un PIA (PNAG) desacetilado que tenga menos del 60 por ciento, de preferencia menos del 50 por ciento, del 40 por ciento, del 30 por ciento, del 20 por ciento, o del 10 por ciento de acetilación. Se prefiere el uso de un PIA (PNAG) desacetilado, debido a que los epítopos no acetilados de PNAG son eficientes para mediar la aniquilación opsónica de las bacterias Gram-positivas, de preferencia S. aureus y/o S. epidermidis. De una manera muy preferible, el PIA (PNAG) tiene un tamaño de entre 40 kDa y 300 kDa, y se desacetila de tal manera que menos del 60 por ciento, del 50 por ciento, del 40 por ciento, del 30 por ciento, o del 20 por ciento de grupos amino queden acetilados.

El término PNAG desacetilado (dPNAG) se refiere a un polisacárido u oligosacárido de PNAG en donde menos del 60 por ciento, del 50 por ciento, del 40 por ciento, del 30 por ciento, del 20 por ciento, ó del 10 por ciento de los grupos amino queden acetilados.

En una modalidad, el PNAG se desacetila para formar el dPNAG mediante el tratamiento químico del polisacárido nativo. Por ejemplo, el PNAG nativo se trata con una solución básica, de tal manera que el pH se eleve hasta arriba de 10. Por ejemplo, el PNAG se trata con 0.1-5M, 0.2-4 , 0.3-3M, 0.5-2M, 0.75-1.5M o 1M de NaOH, KOH o NH4OH. El tratamiento es durante cuando menos 10 ó 30 minutos, o durante 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ó 20 horas a una temperatura de 20°C a 100°C, de 25°C a 80°C, de 30°C a 60°C ó de 30°C a 50°C ó de 35°C a 45°C. El dPNAG se puede preparar como se describe en la Publicación Internacional Número WO 04/43405.

Los polisacáridos incluidos en la composición inmunogénica de la invención se conjugan opcionalmente con una proteína portadora, como se describe más adelante, o de una manera alternativa no se conjugan.

Polisacáridos Tipo 5 y Tipo 8 a partir de S.aureus La mayoría de las cepas de S.aureus que provocan infección en el hombre, contienen polisacáridos ya sea Tipo 5 o bien Tipo 8. Aproximadamente el 60 por ciento de las cepas humanas son Tipo 8, y aproximadamente el 30 por ciento son Tipo 5. La estructuras de los antígenos de polisacáridos capsulares Tipo 5 y Tipo 8 se describen en Moreau y colaboradores, Carbohydrate Res. 201; 285 (1990), y Fournier y colaboradores, Infect. Immun. 45; 87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición, así como ManNAcA, que se puede utilizar para introducir un grupo sulfhidrilo. La estructuras se reportaron como : Tipo 5 ?4)-B-D-ManNAcA(30Ac)-(1 ?4)-a-L-FucNAc(1 ?3)-ß-?-FucNAc-(1 ? Tipo 8 ?3)- -D-ManNAcA(40Ac)-(1 ?3)-a-L-FucNAc(1 ?3)-B-D-FucNAc-(1 ? Recientemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005)) la espectroscopia de RMN revisó las estructuras para quedar en: Tipo 5 -?4)-B-D-ManNAcA-(1 ?4)-a-L-FucNAc(30Ac)-(1 ->3)-B-D-FucNAc-(1 ? Tipo 8 ?3)- -D-ManNAcA(40Ac)-(1 ?3)-a-L-FucNAc(1 ?3)-a-D-FucNAc(1 — > Los polisacáridos se pueden extraer a partir de la cepa apropiada de S. aureus empleando un método bien conocido por el experto, por ejemplo como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6294177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de S. aureus Tipo 5, y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus Tipo 8.

Los polisacáridos son del tamaño nativo, o de una manera alternativa, se pueden dimensionar, por ejemplo, mediante microfluidización, irradiación ultrasónica, o mediante tratamiento químico. La invención también cubre los oligosacáridos derivados a partir de los polisacáridos Tipos 5 y 8 a partir de S. aureus.

Los polisacáridos Tipos 5 y 8 incluidos en la composición inmunogénica de la invención de preferencia se conjugan con una proteína portadora, como se describe más adelante o, de una manera alternativa, no se conjugan.

Las composiciones inmunogénicas de la invención de una manera alternativa contienen un polisacárido ya sea Tipo 5 o bien Tipo 8.

Antíqeno 336 de S. aureus En una modalidad, la composición inmunogénica de la invención comprende el antígeno 336 de S. aureus descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6294177.

El antígeno 336 comprende hexosamina ß-enlazada, no contiene grupos O-acetilo, y enlaza específicamente los anticuerpos a S. aureus Tipo 336 depositado bajo ATCC 55804.

En una modalidad, el antígeno 336 es un polisacárido que es del tamaño nativo, o de una manera alternativa, se puede dimensionar, por ejemplo mediante microfluidización, irradiación ultrasónica, o mediante tratamiento químico. La invención también cubre los oligosacáridos derivados a partir del antígeno 336.

El antígeno 336, cuando se incluye en la composición inmunogénica de la invención, de preferencia se conjuga con una proteína portadora, como se describe más adelante, o de una manera alternativa, no se conjuga.

Polisacáridos Tipos I, II y III a partir de S. epidermidis Las cepas ATCC-31432, SE-360 y SE-10 de S. epidermidis son características de tres tipos capsulares diferentes, I, II y III, respectivamente (Ichiman y Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Los polisacáridos capsulares extraídos a partir de cada serotipo de S. epidermidis constituyen los polisacáridos Tipos I, II y III. Los polisacáridos se pueden extraer mediante varios métodos, incluyendo el método descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US4197290, o como se describe en Ichiman y colaboradores 1991, J. Appl. Bacteriol.71; 176.

En una modalidad de la invención, la composición inmunogénica comprende los polisacáridos u oligosacáridos Tipos I y/o II y/o Ill a partir de S. epidermidis.

Los polisacáridos son del tamaño nativo, o de una manera alternativa, se pueden dimensionar, por ejemplo, mediante microfluidización, irradiación ultrasónica, o disociación química. La invención también cubre los oligosacáridos extraídos a partir de las cepas de S. epidermidis.

Estos polisacáridos no están conjugados, o de preferencia se conjugan como se describe en seguida.

Conjugación de sacáridos Entre los problemas asociados con el uso de polisacáridos en la vacunación, está el hecho de que los polisacáridos, por sí mismos, son inmunógenos pobres. Las estrategias que se han diseñado para superar esta falta de inmunogenicidad incluyen el enlace del polisacárido a vehículos de proteína grandes, los cuales proporcionan una ayuda de las células-T en espera. Se prefiere que los polisacáridos utilizados en la invención se enlacen a un vehículo de proteína que proporcione una ayuda de células-T en espera. Los ejemplos de estos vehículos que se utilizan actualmente para acoplarse a los inmunógenos de polisacárido u oligosacárido incluyen los toxoides de Difteria y Tétanos (DT, DT Crm197 y TT), la hemocianina de lapa californiana (KLH), la exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) y el derivado de proteína purificado de Tuberculina (PPD), la proteína D a partir de Haemophilus influenzae, la neumolisina, o fragmentos de cualquiera de los anteriores. Los fragmentos adecuados para utilizarse incluyen los fragmentos que abarcan los epítopos auxiliares-T. En particular, el fragmento de proteína D de preferencia contendrá el 1/3 N-terminal de la proteína. La Proteína D es una proteína de enlace de IgD a partir de Haemophilus influenzae (Patente Europea Número EP 0594 610 B1).

A pesar del uso común de estos vehículos, y de su éxito en la inducción de las respuestas de anticuerpos anti-polisacárido, están asociados con varios inconvenientes. Por ejemplo, se sabe que se pueden suprimir las respuestas inmunitarias específicas del antígeno mediante la presencia de anticuerpos previamente existentes dirigidos contra el vehículo, en este caso, la toxina de Tétanos (Di John y colaboradores, Lancet, Diciembre 16, 1989). En la población en general, un porcentaje muy alto de personas tendrán inmunidad previamente existente tanto al DT como al TT, debido a que las personas se vacunan de manera rutinaria con estos antígenos. En el Reino Unido, por ejemplo, el 95 por ciento de los niños reciben la vacuna DTP, la cual comprende tanto DT como TT. Otros autores han descrito el problema de la supresión del epítopo en las vacunas peptídicas en modelos animales (Sad y colaboradores, Immunology, 1991; 74: 223-227; Schutze y colaboradores, J. Immunol. 135: 4, 1985; 2319-2322).

La hemocianina de lapa californiana (KLH) se conoce como un potente inmunógeno, y ya se ha utilizado como un vehículo para los péptidos de IgE en estudios clínicos humanos. Sin embargo, se han observado algunas reacciones adversas (reacciones tipo DTH o sensibilización a la IgE), así como respuestas de anticuerpos contra el anticuerpo.

Una proteína portadora alternativa para utilizarse en la composición inmunogénica de la invención es una sola proteína estafilocócica o fragmento de la misma, o una proteína de fusión que comprenda cuando menos o exactamente 1, 2, 3 ó 4, o más de las proteínas estafilocócicas enlistadas en la siguiente sección, o fragmentos de las mismas.

Una nueva proteína portadora que sería particularmente conveniente para utilizarse en el contexto de una vacuna estafilocócica es el toxoide estafilocócico alfa. La forma nativa se puede conjugar con un polisacárido, debido a que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. De preferencia, se utiliza como vehículo una toxina alfa genéticamente destoxificada, tal como las variantes His35Leu o His35Arg, debido a que la toxicidad residual es más baja. De una manera alternativa, la toxina alfa se destoxifica químicamente mediante el tratamiento con un reactivo reticulante, formaldehído o glutaraldehído. Una toxina alfa genéticamente destoxificada se destoxifica químicamente de manera opcional, de preferencia mediante el tratamiento con un reactivo reticulante, formaldehído o glutaraldehído, para reducir adicionalmente la toxicidad. Otras proteínas estafilocócicas o fragmentos de las mismas, en particular aquéllas enlistadas anteriormente, se pueden utilizar como una proteína portadora para los polisacáridos enlistados en lo anterior. La proteína portadora puede ser una proteína de fusión que comprenda cuando menos o exactamente 1, 2, 3, 4 ó 5 de las proteínas estafilocócicas enlistadas anteriormente.

Los polisacáridos se pueden enlazar a las proteínas portadoras mediante cualquier método conocido (por ejemplo, por Lik ite, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,372,945 por Armor y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,474,757, y Jennings y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,356,170). De preferencia, se lleva a cabo la química de conjugación de CDAP (véase la Publicación Internacional Número WO95/08348).

En la CDAP, de preferencia se utiliza el reactivo cianilante de tetrafluoroborato de 1 -ciano-dimetil-amino-piridinio (CDAP) para la síntesis de los conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación se puede llevar a cabo bajo condiciones relativamente suaves, lo cual evita la hidrólisis de los polisacáridos sensibles al álcali. Esta síntesis permite hacer el acoplamiento directo con una proteína portadora.

El polisacárido se puede solubilizar en agua o en una solución salina. La CDAP se puede disolver en acetonitrilo y se agrega inmediatamente a la solución del polisacárido. La CDAP reacciona con los grupos hidroxilo del polisacárido para formar un cianato-éster. Después del paso de activación, se agrega la proteína portadora. Los grupos amino de la Usina reaccionan con el polisacárido activado para formar un enlace covalente de isourea. Después de la reacción de acoplamiento, se agrega entonces u n g ran exceso de glicina para apagar los grupos fu ncionales activados residuales. El producto se pasa entonces a través de una colum na de permeación de gel para remover la proteína portadora y los reactivos residuales si n reaccionar.

Proteínas La composición inmunogénica de la i nvención opcional mente comprende una proteína estafilocócica, opcionalmente una proteína a parti r de S. aureus o S. epidermidis. Algunas modalidades de la invención contienen proteínas a parti r de tanto S. aureus como S. epidermidis.

Los aspectos adicionales de la i nvención que invol ucran la combinación de HarA o M RPI I y una prote ína estafilocócica adicional , se pueden combinar con el P NAG y/o los polisacáridos capsu lares descritos anteriormente . Estos aspectos de la invención pueden comprender las proteínas o las combinaciones de proteínas descritas en seguida.

La siguientes descripciones de las proteínas se aplican a HarA y M RP I I , as í como a otras proteínas presentes dentro de las composiciones inmunogénicas de la invención.

En una modal idad , las composiciones inm unogénicas de la invención comprenden u na proteína aislada que comprende una secuencia de ami noácidos que tiene cuando menos el 85 por ciento de identidad, cuando menos el 90 por ciento de identidad, cuando menos el 95 por ciento de identidad, cuando menos del 97 al 99 por ciento, o la identidad exacta, con la de cualquier secuencia presente en la Publicación Internacional Número WO 06/32475 ó en la Publicación Internacional Número WO 07/113222.

Cuando se menciona específicamente una proteína en la presente, es de preferencia una referencia a una proteína de longitud completa nativa o recombinante, u opcionalmente una proteína madura de la que se haya removido cualquier secuencia de señal. La proteína se puede aislar directamente a partir de la cepa estafilocócica, o se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante. Se pueden incorporar fragmentos inmunogénicos de la proteína en la composición inmunogénica de la invención. Éstos son fragmentos que comprenden cuando menos 10 aminoácidos, de preferencia 20 aminoácidos, más preferiblemente 30 aminoácidos, más preferiblemente 40 aminoácidos ó 50 aminoácidos, más preferiblemente 100 aminoácidos, tomados contiguamente a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína. En adición, estos fragmentos inmunogénicos son inmunologicamente reactivos con los anticuerpos generados contra las proteínas estafilocócicas, o con los anticuerpos generados mediante la infección de un huésped mamífero con Staphylococci. Los fragmentos inmunogénicos también incluyen fragmentos que, cuando se administran en una dosis efectiva (ya sea solos o bien como un hapteno enlazado a un vehículo), provocan una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por el estafilococo, más preferiblemente es protectora contra la infección por S. aureus y/o S. epidermidis. Este fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio transmembrana, y/o un dominio de ancla C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene cuando menos el 85 por ciento de identidad, cuando menos el 90 por ciento de identidad, cuando menos el 95 por ciento de identidad, cuando menos del 97 al 99 por ciento de identidad, con aquélla de una secuencia presente en la Publicación Internacional Número WO 06/32475 ó en la Publicación Internacional Número WO 07/113222 sobre toda la longitud de la secuencia del fragmento.

En las composiciones inmunogénicas de la invención también se incluyen las proteínas de fusión recombinante de las proteínas estafilocócicas, o fragmentos de las mismas. Éstas pueden combinar diferentes proteínas estafilocócicas o fragmentos de las mismas en la misma proteína. De una manera alternativa, la invención también incluye las proteínas de fusión individuales de las proteínas estafilocócicas o fragmentos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas, tal como un proveedor de epítopos de células-T o marcas de purificación, por ejemplo: ß-galactosidasa, glutationa-S-transferasa, proteínas fluorescentes verdes (GFP), marcas de epítopos, tales como FLAG, marca myc, poli-histidina, o proteínas superficiales virales, tales como hemaglutinina del virus de influenza, o proteínas bacterianas, tales como toxoide de tétanos, toxoide de difteria, CRM197.

Las composiciones inmunogénicas de la invención opcionalmente comprenden una o más de las proteínas mencionadas más adelante. Muchas de las proteínas caen en las categorías de: proteínas de enlace de componente extracelular, proteínas transportadoras, toxinas y reguladores de virulencia, o proteínas estructurales. La composición inmunogénica de la invención opcionalmente comprende además una proteína de enlace de componente extracelular estafilocócica, o una proteína transportadora estafilocócica, o una toxina estafilocócica o regulador de virulencia, o una proteína estructural. La composición inmunogénica de la invención opcionalmente comprende 2, 3, 4, 5 ó 6 proteínas estafilocócicas.

Tabla 1 La siguiente tabla estipula los números SEQ ID NO de las secuencias de proteínas y secuencias de ADN preferidas que se encuentran en la Publicación Internacional Número WO 06/32475. SA indica una secuencia a partir de S. aureus, y SE indica una secuencia a partir de S. epidermidis.

Secuencia de Secuencia de Nombre Proteína ADN Transportador ABC inmunodominante Secuencia de Secuencia de Nombre Proteína ADN SA SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 34 SE SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 35 Receptor de laminina SA SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 36 SE SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 37 Antígeno Secretor A SsaA SA 1 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 38 SA 2 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 39 SE SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 40 SitC SA SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 41 SE SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 42 IsaA / PisA (IssA) SA SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 43 SE SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 44 Secuencia de Secuencia de Nombre Proteína ADN EbhA / B SA EbhA SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 45 SA EbhB SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 46 SE EbhA SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 47 SE EbhB SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 48 Acumulación-asociación pro Aap SA SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 49 SE SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 50 Proteína activadora de ARN III, RAP SA SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 51 SE SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 52 Secuencia de Secuencia de Nombre Proteína ADN FIG / SdrG SA SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 53 SE SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 54 Proteína de enlace de elastina EbpS SA SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 55 SE SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 56 Proteína Extracelular EFB SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 57 SA Toxina alfa SA SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 58 SBI SA SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 59 ISdA SA SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 60 IsdB SA SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 61 SdrC SA SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 62 CIfA SA SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 63 Secuencia de Secuencia de Nombre Proteína ADN FnbA SA SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 64 ClfB SA SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 65 Coagulasa SA SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 66 FnbB SA SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 77 MAP SA SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 78 HarA SA SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 79 Autolisina- SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 80 glucosaminidasa SA Autolisina-amidasa SA SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 81 Fragmento de Ebh SA SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 82 Autolisina Ant SA SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 83 SdrC SA SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 84 MRPII SA SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 85 SdrG SA SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 86 Vacunación Las preparaciones de vacuna que contienen las composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden utilizar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a la infección, mediante la administración de esta vacuna por medio de la vía sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección por medio de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, o subcutánea; o por medio de administración mucosal a los tractos oral/alimentario, respiratorio, o genitourinario. Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una sola dosis, los componentes de la misma también se pueden co-administrar juntos al mismo tiempo o en diferentes tiempos (por ejemplo, los conjugados de sacáridos neumococicos se podrían administrar por separado, al mismo tiempo, ó 1 a 2 semanas después de la administración de cualquier componente de proteína bacteriana de la vacuna, para una coordinación óptima de las respuestas inmunitarias unas con respecto a otras). En adición, las vacunas de la invención se pueden administrar intramuscularmente para la primera inoculación, e intranasalmente para las dosis de refuerzo.

El contenido de antígenos de proteína en la vacuna típicamente estará en el intervalo de 1 a 100 microgramos, de preferencia de 5 a 50 microgramos, más típicamente en el intervalo de 5 a 25 microgramos. En seguida de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.

La preparación de vacuna se describe en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Editores Powell M.F. & Newman .J.) (1995) Plenum Press, Nueva York). La encapsulación dentro de liposomas es descrita por Fullerton, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,235,877.

Las vacunas de la presente invención se pueden almacenar en solución o liofilizadas. De preferencia, la solución se liofiliza en la presencia de un azúcar, tal como sacarosa o lactosa. Todavía es además preferible que se liofilicen y se reconstituyan de una manera extemporánea antes de usarse.

En un aspecto de la invención, se proporciona un kit de vacuna, el cual comprende un frasco que contiene una composición inmunogénica de la invención, opcionalmente en una forma liofilizada, y que comprende además un frasco que contiene un adyuvante, como se describe en la presente. Se prevé que en este aspecto de la invención, el adyuvante se utilizará para reconstituir la composición inmunogénica liofilizada.

Aunque las vacunas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía, la administración de las vacunas descritas en la piel (ID) forma una modalidad de la presente invención. La piel humana comprende una cutícula "córnea" externa, denominada como el estrato córneo, el cual se sobrepone a la epidermis. Debajo de esta epidermis está una capa denominada como la dermis, la cual a su vez se sobrepone al tejido subcutáneo. Los investigadores han demostrado que la inyección de una vacuna en la piel, y en particular en la dermis, estimula una respuesta inmunitaria, la cual también se puede asociar con un número de ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas en la presente forma una característica preferida de la presente invención.

La técnica convencional de la inyección intradérmica, el procedimiento de "Mantoux", comprende los pasos de limpiar la piel, y entonces estirar con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre angosto (calibre 26-31) hacia arriba, se inserta la aguja en un ángulo de entre 10° y 15°. Una vez que se inserta el bisel de la aguja, se baja el barril de la aguja, y se avanza adicionalmente mientras se aplica una ligera presión para elevarla debajo de la piel. Entonces se inyecta el líquido muy lentamente, formando de esta manera una burbuja o protuberancia sobre la superficie de la piel, seguido por un retiro lento de la aguja.

Más recientemente, se han descrito dispositivos que se diseñan específicamente para administrar agentes líquidos dentro o a través de la piel, por ejemplo, los dispositivos descritos en la Publicación Internacional Número WO 99/34850 y en la Patente Europea Número EP 1092444, también los dispositivos de inyección de chorro descritos, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 01/13977; en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, y en las Publicaciones Internacionales Números WO 97/37705 y WO 97/13537. Los métodos alternativos de administración intradérmica de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringas y agujas convencionales, o dispositivos diseñados para el suministro balístico de vacunas sólidas (Publicación Internacional Número WO 99/27961), o parches transdérmicos (Publicaciones Internacionales Números WO 97/48440 y WO 98/28037); o se aplican a la superficie de la piel (suministro transdérmico o transcutáneo, Publicaciones Internacionales Números WO 98/20734 y WO 98/28037).

Cuando las vacunas de la presente invención son para administrarse a la piel, o más específicamente en la dermis, la vacuna está en un volumen bajo de líquido, en particular un volumen de entre aproximadamente 0.05 mililitros, y 0.2 mililitros.

El contenido de antígenos en las vacunas para la piel o intradérmicas de la presente invención puede ser similar a la dosis convencional, como se encuentra en las vacunas intramusculares (véase lo anterior). Sin embargo, es una característica de las vacunas para la piel o intradérmicas que las formulaciones pueden ser de "dosis baja". De conformidad con lo anterior, los antígenos de proteína en las vacunas de "dosis baja" de preferencia están presentes en tan poco como de 0.1 a 10 microgramos, de preferencia de 0.1 a 5 microgramos por dosis; y los antígenos de sacárido (de preferencia conjugados) pueden estar presentes en el intervalo de 0.01 a 1 microgramo, y de preferencia de entre 0.01 y 0.5 microgramos de sacárido por dosis.

Como se utiliza en la presente, el término "suministro intradérmico" significa el suministro de la vacuna a la región de la dermis en la piel. Sin embargo, la vacuna no necesariamente se localizará exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa en la piel localizada entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 2.0 milímetros desde la superficie de la piel humana, pero hay cierta cantidad de variación entre los individuos y en las diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar llegar a la dermis si se va 1.5 milímetros más adelante de la superficie de la piel. La dermis se localiza entre el estrato córneo y la epidermis en la superficie y en la capa subcutánea más adelante. Dependiendo del modo de suministro, la vacuna por último se puede localizar exclusivamente o primordialmente dentro de la dermis, o finalmente se puede distribuir dentro de la epidermis y la dermis.

La cantidad de cada antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induzca una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en los vacunados típicos. Esta cantidad variará dependiendo de cuál inmunógeno específico se emplee, y de cómo se presente.

En una modalidad adicional, se proporciona un método para el tratamiento de un individuo susceptible a, o que sufra de, una enfermedad, mediante la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente.

También se proporciona un método para evitar que un individuo contraiga una enfermedad seleccionada a partir del grupo que comprende enfermedades infecciosas bacterianas y virales, enfermedades parasitarias, en particular enfermedad patogénica intracelular, enfermedades proliferativas, tales como cánceres de próstata, de mama, colo-rectal, de pulmón, pancreático, renal, de ovarios, o melanoma; trastornos crónicos que no sean cáncer, alergia; el cual comprende la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente a este individuo.

En una modalidad adicional, se proporciona una composición de vacuna para utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una condición o enfermedad, en donde la composición de vacuna comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, la cual comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

En una modalidad adicional, se proporciona el uso de una composición de vacuna en la elaboración de un medicamento para utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una condición o enfermedad, en donde la composición de vacuna comprende un antígeno o composición de antígeno, y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, la cual comprende de 0.5 a 10 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 11 miligramos de tocol, y de 0.1 a 4 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana.

La invención se describirá adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes: El Ejemplo I describe métodos de lectura inmunológicos empleados en estudios en ratones, hurones, cerdos, y seres humanos.

El Ejemplo II describe la preparación de las formulaciones en emulsión de aceite en agua y adyuvante utilizadas en los estudios ejemplificados.

El Ejemplo III muestra un estudio clínico en una población de adultos de 18 a 59 años de edad, con una vacuna que contiene una preparación disociada de antígeno de influenza y diferentes dosis de adyuvante AS03.

El Ejemplo IV muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones BALB/c primeramente inoculados.

El Ejemplo V muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados.

El Ejemplo VI muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03 y una dosis baja de antígeno) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados.

El Ejemplo VII muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de H5N1 disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03 y antígeno) en ratones C57BI/6 puros.

El Ejemplo VIII muestra una evaluación pre-clínica de vacunas de influenza con adyuvante y sin adyuvante en cerdos Large White (Grandes Blancos) primeramente inoculados.

Ejemplo I - Métodos de lectura inmunológicos 1.1. Métodos con ratones 1.1.1. Prueba de inhibición de hemaalutinación Principio de la prueba (procedimiento clásico).

Las titulaciones de anticuerpo anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de influenza (de temporada), utilizando la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl). El principio de la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) se basa en la capacidad de los anticuerpos anti-influenza específicos para inhibir la hemaglutinación de los glóbulos rojos sanguíneos (RBC) mediante la hemaglutinina del virus de influenza (HA). Los sueros inactivados por calor se tratan con Caolín y glóbulos rojos sanguíneos (RBC) para remover los inhibidores no específicos. Después del tratamiento previo, se incuban diluciones dobles de los sueros con 4 unidades de hemaglutinina de cada cepa de influenza. Entonces se agregan los glóbulos rojos sanguíneos, y se califica la inhibición de la aglutinación. Las titulaciones se expresan como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibe completamente la hemaglutinación. Debido a que la primera dilución de suero es de 1:20, un nivel indetectable se califica como una titulación igual a 10. Adaptación para H5N1 (descripción específica de inhibición de hemaglutinación (Hl) utilizando eritrocitos de caballo): Debido a que se documentó que el ensayo clásico de la inhibición de hemaglutinación (Hl) para determinar los anticuerpos anti-hemaglutinina (HA) no funciona bien para la cepa H5N1, se empleó el protocolo adaptado utilizando glóbulos rojos sanguíneos (RBC) de caballo.

Los eritrocitos de caballo se utilizan para las cepas pandémicas de H5N1. Suspensión de glóbulos rojos sanguíneos de caballo al 0.5 por ciento (concentración final) en regulador de fosfato que contiene BSA al 0.5 por ciento (albúmina de suero bovino, concentración final). Esta suspensión se prepara cada día mediante lavado de los glóbulos rojos sanguíneos con el mismo regulador de fosfato y un paso de centrifugación subsiguiente (10 minutos, 2,000 revoluciones por minuto). Este paso de lavado se tiene que repetir una vez. Después de la adición de los glóbulos rojos sanguíneos de caballo a la mezcla de reacción de suero y suspensión de virus; las placas se tienen que incubar a temperatura ambiente (RT, 20°C +/-2°C) durante dos horas, debido a la baja velocidad de sedimentación de los glóbulos rojos sanguíneos de caballo.

Análisis estadístico El análisis estadístico se llevó a cabo sobre las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) después de la vacunación utilizando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de variación se puede describir brevemente como sigue: • Transformación de datos Log.

• Prueba de Shapiro-Wilk sobre cada población (grupo) con el objeto de verificar la normalidad de la distribución de los grupos.

• Prueba de Cochran con el objeto de verificar la homogenicidad de variación entre las diferentes poblaciones (grupos).

• Análisis de variación sobre los datos seleccionados.

· Prueba para la interacción de ANOVA de dos vías.

• Prueba de Tukey-HSD para comparaciones múltiples 1.1.2. Teñido de citoquina intracelular Esta técnica permite hacer una cuantificación de los linfocitos-T específicos del antígeno con base en la producción de citoquina: las células-T efectoras y/o las células-T efectoras-de memoria producen IFN-?, y/o las células-T de memoria central producen IL-2. las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se cosechan en el día 7 después de la inmunización.

Las células linfoides se vuelven a estimular in vitro en la presencia del inhibidor de secreción (Brefeldine).

Estas células se procesan entonces mediante el procedimiento inmunofluorescente convencional utilizando anticuerpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-?, e IL-2). Los resultados se expresan como una frecuencia de células positivas para citoquina dentro de las células-T CD4/CD8. El teñido intracelular de citoquinas de las células-T se llevó a cabo sobre las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) 7 días después de la segunda inmunización. La sangre se recolectó de los ratones, y se reservó en el medio RPMI heparinizado + Add. Para la sangre, se pusieron en capas suspensiones de PBL diluidos en RPMI + Add sobre un gradiente de Lympholyte-Mammal de acuerdo con el protocolo recomendado (centrifugar durante 20 minutos a 2,500 revoluciones por minuto y a temperatura ambiente). Las células mononucleares en la interfase se removieron, se lavaron 2 veces en RPMI + Add, y las suspensiones de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se ajustaron a 2 x 106 células/mililitro en RPMI con suero fetal de becerro al 5 por ciento.

La estimulación con el antígeno in vitro de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se llevó a cabo en una concentración final de 1 x 107 células/mililitro (tubo FACS) con Fl Integral (1 microgramo de HA/cepa), y entonces se incubaron durante 2 horas a 37°C con la adición de anti-CD28 y anti-CD49d (1 microgramo/mililitro para ambos).

En seguida del paso- de re-estimulación del antígeno, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se incuban durante la noche a 37°C en la presencia de Brefeldina (1 microgramo/mililitro) a 37°C, para inhibir la secreción de citoquina. El teñido de IFN-y7 IL-2 / CD4 / CD8 se llevó a cabo como sigue: Las suspensiones de células se lavaron, se volvieron a suspender en 50 microlitros de suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de becerro al 1 por ciento (FCS) conteniendo reactivo de bloqueo Fe al 2 por ciento (1/50; 2.4G2). Después de 10 minutos de incubación a 4°C, se agregaron 50 microlitros de una mezcla de anti-CD4-PE (2/50), y anti-CD8 perCp (3/50), y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Después de un lavado en suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de becerro al 1 por ciento (FCS), las células se permeabilizaron volviendo a suspender en 200 microlitros de Cytofix-Cytoperm (Kit BD), y se incubaron durante 20 minutos a 4°C. Las células luego se lavaron con Perm Wash (Kit BD), y se volvieron a suspender con 50 microlitros de una mezcla de APC anti-IFN-y (1/50) + FITC anti-IL-2 (1/50) diluida en Perm Wash. Después de una incubación mínima de 2 horas y máxima durante la noche a 4°C, las células se lavaron con Perm Wash y se volvieron a suspender en suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de becerro al 1 por ciento (FCS) + paraformaldehído al 1 por ciento. El análisis de la muestra se llevó a cabo mediante FACS. Las células vivas se pasaron por compuerta (FSC/SSC), y se llevó a cabo la adquisición en aproximadamente 20,000 eventos (linfocitos) ó 35,000 eventos sobre las células-T CD4+. Los porcentajes de IFN-v+ o IL2+ se calcularon sobre las poblaciones pasadas por compuerta CD4+ y CD8+. 1.1.3. ELISA Anti-H5N1.

La cuantificación de las titulaciones de anticuerpos de Ig, IgG 1 e lgG2b anti-H5N1 se llevó a cabo mediante un ELISA utilizando H5N1 disociado como recubrimiento. Las soluciones de virus y anticuerpos se utilizaron a 100 microlitros por pozo. El virus H5N1 disociado se diluyó en una concentración final de 1 microgramo/ mililitro en suero regulado con fosfato (PBS), y se adsorbió durante la noche a 4°C en los pozos de las placas de microtitulación de 96 pozos (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454). Las placas entonces se incubaron durante 1 hora a 37°C con 200 microlitros por pozo de suero regulado con fosfato (PBS), que contiene albúmina de suero bovino al 1 por ciento y Tween 20 al 0.1 por ciento (regulador de saturación). Se agregaron doce diluciones dobles de los sueros en regulador de saturación a las placas recubiertas con H5N1, y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37°C. Las placas se lavaron cuatro veces con suero regulado con fosfato (PBS), Tween 20 al 0.1 por ciento. Se agregó la Ig anti-ratón conjugada-biotinilada (Prozan-E0413) diluida a 1/500, o la lgG1 anti-ratón conjugada-biotinilada (Imtech 1070-08), o una lgG2b anti-ratón biotinilada (Imtech 1090-08) diluida a 1/4,000 en suero regulado con fosfato (PBS), albúmina de suero bovino al 1 por ciento, y Tween 20 al 0.1 por ciento, a cada pozo, y se incubó durante 1hora 30 minutos a 37°C; después de un paso de lavado, las placas se incubaron durante 30 minutos con un conjugado de Estreptavidina-Biotina-Peroxidasa (Prozan P0397) diluido a 1/10,000 en suero regulado con fosfato (PBS), albúmina de suero bovino al 1 por ciento, y Tween 20.

Para la revelación colorimétrica, las placas se incubaron durante 20 minutos a 22°C con una solución de o-fenil-diamina al 0.04 por ciento (Sigma P4664) H202 al 0.03 por ciento en regulador de citrato 0.1 M, pH de 4.2. La reacción se detuvo con H2S0 2N, y las microplacas se leyeron a 490-630 nanómetros.

I.2. Métodos en Hurones 1.2.1. Prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) Procedimiento de prueba.

Las titulaciones de anticuerpo anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de influenza se determinaron utilizando la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl). El principio de la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) se basa en la capacidad de los anticuerpos anti-influenza específicos para inhibir la hemaglutinación de glóbulos rojos sanguíneos de pollo (RBC) mediante la hemaglutinina del virus de influenza (HA). Primero se trataron los sueros con una solución de neuraminidasa al 25 por ciento (RDE), y se inactivaron por calor para remover los inhibidores no específicos. Después del tratamiento previo, se incubaron diluciones dobles de los sueros con 4 unidades de hemaglutinina de cada cepa de influenza. Entonces se agregaron los glóbulos rojos sanguíneos de pollo, y se calificó la inhibición de aglutinación. Las titulaciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió completamente lá hemaglutinación. Debido a que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se calificó como una titulación igual a 5.

Análisis estadístico.

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo sobre las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) (Día 41, antes del estímulo) utilizando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de variación se puede describir brevemente como sigue: • Transformación de datos Log.

• Prueba para la interacción del ANOVA de una vía.

· Prueba de Tuckey-HSD para comparaciones múltiples. 1.2.2. Monitoreo de la temperatura corporal Las temperaturas individuales se monitorearon durante el período de estímulo con los transmisores y mediante el registro de telemetría. Todos los implantes se verificaron y se restauraron, y DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, Holanda) llevó a cabo una nueva calibración antes de colocarse en la cavidad intraperitoneal. Todos los animales se alojaron individualmente en jaulas individuales durante estas mediciones.

Las temperaturas se registraron cada 15 minutos, 4 días antes del estímulo hasta 7 días después del estímulo. 1.2.3. Lavados nasales Los lavados nasales se llevaron a cabo mediante la administración de 5 mililitros de suero regulado con fosfato (PBS), en ambas fosas nasales de los animales despiertos. El inóculo se recolectó en una caja de Petri, y se colocó en recipientes de muestras sobre hielo seco.

Titulación viral en los lavados nasales Todas las muestras nasales se filtraron primero para esterilizarse a través de filtros Spin X (Costar) para remover cualquier contaminación bacteriana. Se transfirieron 50 microlitros de diluciones diez veces en serie de los lavados nasales a las placas de microtitulación que contenían 50 microlitros del medio (10 pozos/ dilución). Entonces se agregaron a cada pozo 100 microlitros de células MDCK (2.4 x 105 células/mililitro), y se incubaron a 35°C durante 5 a 7días.

Después de 5 a 7 días de incubación, el medio de cultivo se removió suavemente, y se agregaron 100 microlitros de un medio que contenía 1/20 WST-1, y se incubaron durante otras 18 horas.

La intensidad del tinte de formazán amarillo producida después de la reducción de WST-1 mediante las células viables, es proporcional al número de células viables presentes en el pozo al final del ensayo de titulación viral, y se cuantificó mediante la medición de la absorbencia de cada pozo a la longitud de onda apropiada (450 nanómetros). El corte se define como la OD promedio de las células de control no infectadas - 0.3 OD (0.3 OD corresponde a +/- 3 Desviación Estándar de la OD de las células de control no infectadas). Una calificación positiva se define cuando la OD es < el corte, y en contraste, una calificación negativa se define cuando la OD es > el corte. Las titulaciones de envoltura viral fueron determinadas por "Reed y Muench", y se expresaron como Log TCID50/mililitro. 1.3. Métodos en Cerdos 1.3.1. Prueba de inhibición de hemaqlutinación (Hl) Procedimiento de prueba.

Las titulaciones de anticuerpo anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de influenza se determinaron utilizando la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl). El principio de la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) se basa en la capacidad de los anticuerpos anti-influenza específicos para inhibir la hemaglutinación de glóbulos rojos sanguíneos de pollo (RBC) mediante la hemaglutinina del virus de influenza (HA). Primero se trataron los sueros con una solución de neuraminidasa al 25 por ciento (RDE), y se inactivaron por calor para remover los inhibidores no específicos. Después del tratamiento previo, se incubaron diluciones dobles de los sueros con 4 unidades de hemaglutinina de cada cepa de influenza. Entonces se agregaron los glóbulos rojos sanguíneos de pollo, y se calificó la inhibición de aglutinación. Las titulaciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió completamente la hemaglutinación. Debido a que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se calificó como una titulación igual a 5.

Análisis estadístico.

· Prueba de Cochran con el objeto de verificar la homogenicidad de variación entre las diferentes poblaciones (grupos).

• Prueba para la interacción del ANOVA de una vía.

• Prueba de Tuckey-HSD para comparaciones múltiples. 1.4. Ensayos para evaluar la respuesta inmunitaria en los seres humanos 1.4.1. Ensayo de inhibición de hemaglutinación La respuesta inmunitaria se determinó mediante la medición de los anticuerpos de Hl, empleando el método descrito por el WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, EUA (1991) (Organización Mundial de la Salud, Centro de Colaboración para Influenza, Centros para el Control de Enfermedades, Atlanta, EUA (1991)).

Se condujeron mediciones de las titulaciones de anticuerpos sobre las muestras de suero descongeladas-congeladas, con un micrométodo estandarizado y comprensivamente validado, utilizando 4 unidades de inhibición de hemaglutinación (4 HIU) de los antígenos apropiados, y una suspensión de eritrocitos de ave de corral al 0.5 por ciento. Los inhibidores del suero no específicos se removieron mediante tratamiento por calor y mediante la enzima destructora de los receptores.

Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar los niveles de anticuerpo de Hl. Empezando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de dilución (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1 :20,480.

El punto final de la titulación se tomó como el paso de dilución más alta que mostró una inhibición completa (100 por ciento) de la hemaglutinación. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado.

I.4.2. Ensayo de Inhibición de Neuraminidasa El ensayo se llevó a cabo en placas de microtitulación recubiertas con fetuina. Se preparó una serie de dilución doble del anti-suero, y se mezcló con una cantidad estandarizada de virus de influenza A H3N2, H1N1 o de influenza B. La prueba se basó en la actividad biológica de la neuraminidasa que libera enzimáticamente el ácido neuramínico a partir de la fetuina. Después de la disociación el ácido neuramínico terminal, se desenmascaró la ß-D-galactosa-N-acetil-galactosamina. Se agregó a los pozos la aglutinina de cacahuate marcada con peroxidasa de radícula roja (HRP) a partir de Arachis hipogaea, la cual se enlaza específicamente a las estructuras de galactosa. La cantidad de aglutinina enlazada se puede detectar y cuantificar en una reacción del sustrato con tetra-metil-bencidina (TMB). La dilución de anticuerpo más alta que todavía inhibe la actividad de neuraminidasa viral por cuando menos el 50 por ciento se indicó como la titulación de NI. 1.4.3. Ensayo de Anticuerpo Neutralizante Se condujeron mediciones de los anticuerpos neutralizantes sobre las muestras de suero descongeladas-congeladas. La neutralización del virus mediante los anticuerpos contenidos en el suero se determinó en un ensayo de microneutralización. Los sueros se utilizaron sin mayor tratamiento en el ensayo.

Cada suero se probó por triplicado. Se mezcló una cantidad estandarizada del virus con diluciones en serie de suero, y se incubó para permitir el enlace de los anticuerpos al virus. Entonces se agregó una suspensión celular que contenía una cantidad definida de células MDCK a la mezcla de virus y anti-suero, y se incubó a 33°C. Después del período de incubación, se visualizó la réplica del virus mediante la hemaglutinación de glóbulos rojos sanguíneos de pollo. Se calculó la titulación de neutralización del 50 por ciento de un suero mediante el método de Reed y Muench. 1.4.4. La Inmunidad Mediada por Células se evaluó mediante Citometría de Flujo de Citoquina (CFC) Las células-T CD4 y CD8 específicas del antígeno de sangre periférica se pueden volver a estimular in vitro para producir IL-2, CD40L, TNF-alfa, e IFN, si se incuban con su antígeno correspondiente.

En consecuencia, las células-T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar mediante citometría de flujo en seguida del marcado con inmunofluorescencia convencional del fenotipo celular, así como mediante la producción de citoquinas intracelulares. En el presente estudio, el antígeno de vacuna de influenza, así como los péptidos derivados a partir de la proteína de influenza específica, se utilizaron como el antígeno para volver a estimular las células-T específicas de influenza. Los resultados se expresaron como una frecuencia de células-T CD4 o CD8 positivas para las citoquinas dentro de la sub-población de células-T CD4 o CD8. 1.4.5. Métodos Estadísticos 1.4.5.1. Puntos finales primarios • Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales inducidos durante un período de seguimiento de 7 días (es decir, día de la vacunación y los 6 días siguientes) después de la vacunación y globalmente.

• Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no solicitados durante un período de seguimiento de 21 días (es decir, día de la vacunación y los 20 días siguientes) después de la vacunación y globalmente.

• Presentación de eventos adversos graves durante todo el estudio. 1.4.5.2. Puntos finales secundarios Para la respuesta inmunitaria humoral: Variables observadas: • En los días 0 y 21: inhibición de hemaglutinación en suero (Hl), y titulaciones de anticuerpos de NI, probadas por separado contra cada una de las tres cepas del virus de influenza representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).

• En los días 0 y 21: titulaciones de anticuerpo neutralizante, probadas por separado contra cada una de las tres cepas del virus de influenza representadas en la vacuna.

Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95 por ciento): • Titulaciones medias geométricas (GMTs) de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) antes y después de la vacunación. • índices de seroconversión* con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) en el día 21.

• Factores de conversión** con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) en el día 21. • índices de seroprotección*** con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) en el día 21.

• Titulaciones medias geométricas (GMTs) de anticuerpos de inhibición de neuraminidasa (NI) en suero (con intervalos de confianza del 95 por ciento) en todos los puntos del tiempo. índice de seroconversión definido como el porcentaje de vacunados que tienen un aumento de cuando menos 4 veces en las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero en el día 21 comparándose con el día 0, para cada cepa de vacuna.

Factor de conversión definido como las veces de aumento en titulaciones medias geométricas (GMTs) de inhibición de hemaglutinacion (Hl) en suero en el día 21 comparándose con el día 0, para cada cepa de vacuna. *** índice de protección definido como el porcentaje de vacunados con una titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero = 40 después de la vacunación (para cada cepa de vacuna), que usualmente se acepta como indicador de la protección.

Se debe entender que para algunos de los estudios clínicos, la reactogenicidad/seguridad pueden ser puntos finales secundarios, y la inmunogenicidad puede ser el punto final primario.

Para la respuesta inmunitaria mediada por células (CMI) Variable observada En los días 0 y 21: frecuencia de células CD4/CD8 positivas para citoquina por 106 en diferentes pruebas. Cada prueba cuantifica la respuesta de las células-T CD4/CD8 a: • Antígeno de influenza peptídico (gf) (se necesita dar/explicar la naturaleza precisa y el origen de estos antígenos).

• Antígeno de influenza disociado (sf).

· Antígeno de influenza integral (wf).

Variables derivadas: • Células que producen cuando menos dos citoquinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa).

• Células que producen cuando menos CD40L y otra citoquina (IL-2, TNFa, IFNy).

• Células que producen cuando menos IL-2 y otra citoquina (CD40L, TNFa, IFNy).

• Células que producen cuando menos IFNy y otra citoquina (IL-2, TNFa, CD40L).

• Células que producen cuando menos TNFa y otra citoquina (IL-2, CD40L, IFNy). 1.3.5.3. Análisis de inmunogenicidad El análisis de inmunogenicidad se basó en la cohorte vacunada total. Para cada grupo de tratamiento, se calcularon los siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95 por ciento): • Titulaciones medias geométricas (G Ts) de inhibición de hemaglutinación (Hl) y titulaciones de anticuerpos de inhibición de neuraminidasa (NI) en los días 0 y 21 • Titulaciones medias geométricas (GMTs) de titulaciones de anticuerpo neutralizante en los días 0 y 21.

• Factores de conversión en el día 21.

• Indices de seroconversión (SC) en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados que tienen cuando menos un aumento de 4 veces en las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero en el día 21 comparándose con el día 0. • índices de protección en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados con una titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero = 1:40.

• Se resumió la frecuencia de linfocitos-T CD4/CD8 que se secretan en respuesta (estadística descriptiva) para cada grupo de vacunación en cada punto del tiempo (Día 0, Día 21), y para cada antígeno (Influenza peptídica (pf), influenza disociada (sf), e influenza integral (wf)).

· Estadística descriptiva en la diferencia individual entre las respuestas al punto del tiempo (Después-Antes) para cada grupo de vacunación y cada antígeno (pf, sf, y wf) en cada una de 5 pruebas diferentes.

• Se utilizó una prueba no paramétrica (prueba de Kruskall-Wallis) para comparar las diferencias de localización entre los 3 grupos, y se calculó el valor-p estadístico para cada antígeno en cada una de 5 pruebas diferentes. Todas las pruebas de significado fueron de dos colas. Los valores-p menores o iguales a 0.05 se consideraron como estadísticamente significativos.

Ejemplo II - Preparación de las formulaciones en emulsión de aceite en agua y adyuvante A menos que se informe de otra manera, la emulsión de aceite en agua utilizada en los siguientes ejemplos está compuesta de una fase orgánica hecha de 2 aceites (alfa-tocoferol y escualeno), y una fase acuosa de suero regulado con fosfato (PBS), que contiene Tween 80 como el agente emulsionante. A menos que se informe de otra manera, las formulaciones adyuvantes de la emulsión de aceite en agua utilizadas en los siguientes ejemplos se hicieron comprendiendo el siguiente componente de la emulsión de aceite en agua (se dan las concentraciones finales): 2.5 por ciento de escualeno (volumen/volumen), 2.5 por ciento de alfa-tocoferol (volumen/volumen), 0.9 por ciento de mono-oleato de sorbitán de polioxietileno (volumen/volumen) (Tween 80), véase la Publicación Internacional Número WO 95/17210. Esta emulsión, denominada como AS03 en los siguientes ejemplos, se preparó como sigue, como un concentrado dos veces. 11.1. Preparación de emulsión SB62 Este método se utilizó en los estudios reportados en las secciones de ejemplos clínicos y pre-clínicos. La preparación de la emulsión SB62 se hace mediante la mezcla, bajo una fuerte agitación, de una fase de aceite compuesta de componentes hidrofóbicos (DL-a-tocoferol y escualeno), y una fase acuosa que contiene los componentes solubles en agua (el detergente aniónico Tween 80 y suero regulado con fosfato (PBS) mod (modificado), pH de 6.8). Con agitación, la fase de aceite (volumen total de 1/10) se transfiere a la fase acuosa (volumen total de 9/10), y la mezcla se agita durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla resultante entonces se somete a fuerzas cortantes, de impacto y cavitación en la cámara de interacción de un microfluidizador (15,000 PSI (1,050 kg/cm2) - 8 ciclos, ó 3 ciclos en el adyuvante utilizado en el estudio clínico reportado en el Ejemplo III), para producir gotas en sub-micras (distribución de entre 100 y 200 nanómetros). El pH resultante es de entre 6.8 ± 0.1. La emulsión SB62 se esteriliza entonces mediante filtración a través de una membrana de 0.22 mieras y la emulsión estéril en volumen se almacena refrigerada en recipientes Cupac de 2°C a 8°C. Se inunda con gas inerte estéril (nitrógeno o argón) en el volumen muerto del recipiente con El volumen final de la emulsión SB62 durante cuando menos 15 segundos.

La composición final de la emulsión SB62 es como sigue : Tween 80: 1.8 por ciento (volumen/volumen) 19.4 miligramos/ mililitro; Escualeno: 5 por ciento (volumen/volumen) 42.8 miligramos/ mililitro; a-tocoferol: 5 por ciento (volumen/volumen) 47.5 miligramos/ mililitro; PBS-mod: NaCI 121 mM, KCI 2.38 mM, Na2HP04 7.14 mM, KH2P04 1.3 mM; pH de 6.8 ± 0.1.

Ejemplo III - Estudio clínico en una población de adultos de 18 a 59 años de edad con una vacuna que contiene una preparación disociada de antígeno de influenza y diferentes dosis de adyuvante AS03 (Flu-LD-004) III.1. Introducción Se condujo un estudio ciego individual controlado, de selección aleatoria, en fase II en una población de adultos de 18 a 59 años de edad en el año 2006, con el objeto de evaluar la inmunogenicidad, la seguridad, y la reactogenicidad de la vacuna candidata de dosis baja de GlaxoSmithKIine Biologicals (es decir, que contiene 5 microgramos de HA por cepa) con dos dosis de adyuvante AS03.

La respuesta inmunitaria humoral (es decir, anti-hemaglutinina) se midió 21 días después de la administración intramuscular de una dosis de una vacuna con adyuvante AS03. Se utilizó FluarixMR como referencia. 111.2. Diseño del estudio Tres grupos de sujetos en paralelo recibieron la siguiente vacuna intramuscularmente: un grupo de 100 sujetos recibieron una inyección de la vacuna de virus de influencia disociada de dosis baja que contenía 5 microgramos de HA con adyuvante AS03 (FluLD1/1); un grupo de 100 sujetos recibieron una inyección de la vacuna de virus de influencia disociada de dosis baja que contenía 5 microgramos de HA con adyuvante de media dosis de AS03 (AD03 ½) (FluLDI/2); un grupo de 100 sujetos recibieron una dosis de FluarixMR (Fluarix).

Programa: una inyección intramuscular de la vacuna de influenza en el día 0, citas en el sitio del estudio en el día 0 y en el día 21 con una recolección de muestras de sangre (determinación del anticuerpo inhibidor de hemaglutinación (Hl)), y un contacto telefónico adicional en el día 30 (conclusión del estudio).

La vacuna de influenza disociada trivalente estándar -FluarixMR utilizada en este estudio, es una vacuna comercial del año 2006 desarrollada y elaborada por GlaxoSmithKIine Biologicals. 111.3. Objetivos del estudio III.3.1. Objetivo primario Evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por las vacunas del estudio en términos de titulaciones de anticuerpos anti-hemaglutinina: Variables observadas en los días O y 21: titulaciones de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación en suero.

Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95 por ciento): Titulaciones medias geométricas (GMTs) de anticuerpos en suero en los días 0 y 21. índices de seroconversión* en el día 21 Factores de conversión** en el día 21 índices de protección*** en los días 0 y 21 El índice de seroconversión para la respuesta de anticuerpos de hemaglutinina se define como el porcentaje de vacunados que tienen ya sea una titulación antes de la vacunación < 1:10 y una titulación después de la vacunación > 1:40, o bien una titulación antes de la vacunación > 1:10 y cuando menos un aumento del cuádruple en la titulación después de la vacunación.

** Factor de conversión definido como las veces de aumento en las titulaciones medias geométricas (GMTs) de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero después de la vacunación comparándose con el día 0; *** índice de protección definido como el porcentaje de vacunados con una titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) en suero > 40 después de la vacunación que usualmente se acepta que indica protección.

III.3.2. Objetivo secundario Evaluar la seguridad y reactogenicidad de las vacunas del estudio en términos de eventos adversos locales y generales inducidos, eventos adversos no inducidos, y eventos adversos graves: Presentación, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales inducidos durante un período de seguimiento de 7 días (es decir, el día de la vacunación y los 6 días siguientes) después de cada vacunación en cada grupo.

Presentación, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no inducidos durante un período de seguimiento de 30 días (es decir, el día de la vacunación y los 29 días siguientes) después de la vacunación en cada grupo.

Presentación y relación de eventos adversos graves durante todo el período del estudio en cada grupo.

III.4. Composición de vacuna y administración III.4.1. Preparación de la vacuna La vacuna de influenza sin adyuvante es una vacuna de influenza inactivada de virión disociado trivalente que consiste en tres volúmenes de antígeno viral monovalente (preparados a partir de, respectivamente, las cepas de influenza A/H1N1, A/H3N2 y B). Los antígenos presentes en esta vacuna son los mismos que aquéllos de la vacuna con licencia FluarixMR, la cual está disponible en el mercado como FluarixMR (a-Rix®) desde el año 1992, y contiene 15 microgramos de HA/cepa por dosis. Las cepas de influenza incluidas en los lotes clínicos FluLD son las cepas que se seleccionaron para el Hemisferio Norte en 2006/2007: Cepa tipo A / Nueva Caledonia / 20/99 (H1N1): A / Nueva Celedonia / 20/99 (H1N1) IVR-116.

Cepa tipo A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2): A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) NYMCX-161.

B / Malasia / 2506/2004.

Los antígenos se derivan a partir de virus cultivados en huevo.

La disociación se lleva a cabo con desoxicolato de sodio antes del paso de inactivación, el cual se lleva a cabo a través de la siguiente acción del desoxicolato de sodio y el formaldehído.

La vacuna de influenza de dosis baja (FluLD) con adyuvante AS03 (lotes clínicos) se basa en la vacuna FluarixMR comercialmente disponible (preparada a partir de, respectivamente, las cepas de influenza A/H1N1, A/H3N2 y B), pero con un contenido de antígeno más bajo, y con adyuvante del sistema adyuvante de GSK, AS03. El AS03 consiste en una emulsión de aceite en agua (SB62) que contiene dos aceites biodegradables, escualeno y a-tocoferol (Vitamina E), y un tensoactivo, polisorbato 80 (Tween 80). Los antígenos de influenza se incorporan en la fase acuosa del sistema adyuvante mediante una mezcla simple con la emulsión. Se han probado dos formulaciones, que difieren por la cantidad de adyuvante introducido con los antígenos Flu en el lote de la vacuna. Las vacunas con adyuvante contienen 5 microgramos de hemaglutinina (HA) de cada cepa de virus de influenza por dosis, combinados con una dosis completa (AS03) o media dosis (AS03 ½) del sistema adyuvante AS03. Los excipientes son los siguientes: polisorbato 80 (Tween 80), octoxinol 10 (Tritón X-100), succinato ácido de alfa-tocoferilo, cloruro de sodio, di-fosfato ácido de sodio, di-fosfato ácido de potasio, cloruro de potasio, agua para inyecciones.

Las vacunas de influenza de dosis baja con adyuvante AS03 (FluLD, dosis completa o media dosis de AS03) son vacunas sin conservadores. Sin embargo, contienen cantidades traza de tiomersal (< 1.25 microgramos de Hg por dosis) desde las primeras etapas del proceso de elaboración. Ambas se presentan como vacunas de una sola dosis en jeringas de vidrio (Tipo I) previamente llenadas con un volumen de 0.5 mililitros/dosis.

III.4.1.1. Composición de vacuna de influenza con adyuvante AS03 Una dosis de FluLD (dosis completa o media dosis de AS03) corresponde a 0.5 mililitros. La composición se proporciona en la Tabla 3. El contenido de HA por dosis es de 5 microgramos para ambas formulaciones, siendo la única diferencia la cantidad de AS03 presente en los recipientes finales.

Tabla 3 Composición de vacuna de influenza de dosis baja con adyuvante AS03 (dosis completa y media dosis de AS03) Cantidad por dosis Componente (0.5 mL) Viriones disociados inactivados - A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 5 \ig HA - A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) NYMCX-161 5 µg HA Cantidad por dosis Componente (0.5 ml_) - B/Malasia/2506/2004 5 µg HA Adyuvante (Dosis completa / Media dosis) - emulsión SB62 (Volumen total) 0.250 ml_ • escualeno 10.70 mg / 5.35 mg • DL-a-tocoferol 11.88 mg / 5.94 mg • Polisorbato 80 (Tween 80) 4.85 mg / 2.425 mg Polisorbato 80 (Tween 80) 0.122 mg Octoxinol 10 (Tritón X-100) 0.0283 mg Succinato ácido de a-tocoferilo 0.01665 mg Cloruro de sodio 4 mg Di-fosfato de sodio 0.575 mg Di-fosfato ácido de potasio 0.100 mg Cloruro de potasio 0.101 mg Agua para inyecciones hasta 0.50 mi Abreviaturas: HA = Hemaglutinina.

El contenido total en Polisorbato 80 corresponde a 4.972 miligramos por dosis cuando se utiliza la dosis completa de AS03, y a 2.547 miligramos por dosis cuando se utiliza media dosis de AS03.

III.4.1.2. Producción de preparación de antigeno de influenza inactivado disociado Los antígenos de influenza son idénticos a aquéllos incluidos en el FluarixMR (Vacuna de Virus de Influenza). Los volúmenes monovalentes consisten en virus disociados inactivados purificados que se preparan a partir de las semillas de procesamiento de las tres cepas de virus de influenza, tipo A (H1N1 y H3N2), y tipo B, las cuales se cultivan individualmente en huevos de gallina embrionados. Estas semillas de procesamiento se derivan a partir de cepas que se reciben a partir de un centro colaborador de la Organización Mundial de la Salud, siguiendo las recomendaciones anuales de la Organización Mundial de la Salud. Para el proceso para la preparación de los antígenos, se da una referencia, a manera de ilustración, en la Publicación Internacional Número WO 02/097072. Los volúmenes de los tres lotes monovalentes se basan en el contenido de hemaglutinina (HA) medido en cada volumen monovalente antes* de la formulación, y sobre El volumen de elaboración objetivo.

Un suero regulado con fosfato concentrado 10 veces (pH de 7.4 cuando se concentra 1 vez), y una pre-mezcla de Tween 80 y succinato ácido de a-tocoferilo, se diluyen en agua para inyecciones, seguido por agitación durante 5 a 30 minutos a temperatura ambiente.

Los tres volúmenes monovalentes concentrados se diluyen entonces sucesivamente en la solución resultante de suero regulado con fosfato / Tween 80 - succinato ácido de a-tocoferilo, hasta una concentración de: 20 microgramos de HA de cada volumen monovalente de A (H1 N1 , H3N2) 23.32 microgramos de HA del volumen monovalente de B por mililitro del volumen trivalente intermedio (5 microgramos de HA de cada volumen monovalente de A y 5.83 microgramos de HA de B / 500 microlitros de volumen final trivalente).

Entre las adiciones de cada volumen monovalente, la mezcla se agita durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente, y durante 15 a 30 minutos después de la adición del último volumen monovalente. Este volumen trivalente intermedio, también referido como "pre-reserva", se puede mantener a +2°C - +8°C, o se puede procesar adicionalmente hasta el paso de formulación final en el mismo día. El volumen final de la pre-reserva es de 250 microlitros por dosis.

II 1.4.1.3. Preparación de composiciones de vacuna con adyuvante AS03 Vacuna con adyuvante: LD AS03 1/1 (Tabla 4) Se agrega PBS modificado concentrado 10 veces (pH de 7.4 cuando se concentra una vez; NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, Na2HP04 8.1 mM, KH2P04 1.47 mM, pH de 7.4), así como una mezcla que contiene Tween 80, Tritón X-100 y VES (las cantidades son tomando en cuenta el detergente presente en las cepas), a agua para inyecciones. Después de 5 a 30 minutos de agitación, se agregan 20 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de cada cepa H1N1 y H3N2, y 23.32 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de la cepa B con 10 a 30 minutos de agitación entre cada adición. Después de 15 a 30 minutos de agitación, se desecha un pequeño volumen del denominado como "volumen intermedio" para el análisis, y se almacena entre +2°C y +8°C. El volumen intermedio está en suero regulado con fosfato (PBS) moderado concentrado 1 vez. La concentración de los detergentes objetivo es de 488 microgramos de Tween 80 por mililitro, de 73.6 microgramos de Tritón X-100 por mililitro, y de 66.6 microgramos de VES por mililitro.

Entonces se prepara la formulación final: Se agrega un volumen igual de SB62 (véase la preparación en el Ejemplo II) a cada 250 microlitros del volumen intermedio de pre-reserva, y se mezcla durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. Se verifica el pH para quedar en el intervalo de entre 6.8 y 7.5. La formulación se inunda con nitrógeno, y entonces se almacena entre +2°C y 8°C antes de llenarse.

Tabla 4 Vacuna de dosis baja con adyuvante AS03 Componente Concentración Volumen (mi) Paso 1: Pre-reserva A/Nueva Caledonia, volumen 104 µ?/???? 302.88 monovalente A/ Wisconsin, volumen 85 µ?/??? 370.59 monovalente B/ Malasia, volumen 110 g ml 333.90 monovalente Véase la PBS mod(1) 56.76 leyenda Tween 80 48,000 pg/ml 5.24 Residuo de la Tritón X-100 cepa H3N2 Succinato ácido de a- 26,480 pg/ml 1.2 tocoferilo Agua filtrada 504.43 Componente Concentración Volumen (mi) Volumen total = 1,575 (mi) Se recuperan 75 mililitros de muestras de la pre-reserva para probarse Volumen de pre-reserva restante - 1,500 (mi) (1): La composición del volumen final de regulador es: NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, Na2HP048.1 mM, KH2P041.47 mM, pH de 7.4 Vacuna con adyuvante: LD AS03 1/2 (Tabla 5) Se agrega PBS modificado concentrado 10 veces (pH de 7.4 cuando se concentra una vez - véase la composición anterior), así como una mezcla que contiene Tween 80, Tritón X-100 y VES (las cantidades son tomando en cuenta el detergente presente en las cepas) a agua para inyecciones. Después de 5 a 30 minutos de agitación, se agregan 20 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de cada cepa de H1N1 y H3N2, y 23.32 microgramos de hemaglutinina (HA) por mililitro de la cepa B, con 10 a 30 minutos de agitación entre cada adición. Después de 15 a 30 minutos de agitación, se desecha un pequeño volumen del denominado como "volumen intermedio" para el análisis, y se almacena entre +2°C y +8°C. El suero regulado con fosfato (PBS) modificado se concentra una vez en el volumen intermedio. La concentración de los detergentes objetivo es de 488 microgramos de Tween 80 por mililitro, de 73.6 microgramos de Tritón X-100 por mililitro, y de 66.6 microgramos VES por mililitro.

Entonces se prepara la formulación final: Primero se diluye el SB62 con el regulador de suero regulado con fosfato (PBS) modificado, y se agita durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se agrega un volumen igual de este SB62 diluido a cada 250 microlitros de pre-reserva del volumen intermedio. Después de 30 a 60 minutos de agitación a temperatura ambiente, se verifica el pH para quedar en el intervalo de entre 6.8 y 7.5. La formulación se inunda con nitrógeno, y entonces se almacena entre +2°C y 8°C antes de llenarse.

El volumen final de ambas formulaciones es de 500 microlitros por dosis, y la concentración final de hemaglutinina (HA) es de 10 microgramos de cada volumen monovalente de A, y de 11.66 microgramos del volumen monovalente de B por mililitro del volumen final trivalente. Las concentraciones objetivo finales de Tween 80, Tritón X-100 (residuo de la elaboración del volumen monovalente de H3N2) y succinato ácido de a-tocoferilo (el succinato ácido de a- tocoferilo es una forma de éster del RRR (isómero D)-a-tocoferol) son de 244 microgramos/mililitro, 58.6 microgramos/mililitro, y 33.3 microgramos/ mililitro, respectivamente.

Tabla 5 Vacuna de dosis baja con adyuvante AS03 (media dosis de adyuvante) Componente Concentración Volumen (mi) Paso 1: Pre-reserva Paso 1: Pre-reserva A/Nueva Caledonia, volumen 104 µ?/?t?? 300.96 monovalente A/ Wisconsin, volumen 85 µg/ml 368.24 monovalente B/ Malasia, volumen 110 g/ml 331.78 monovalente Véase la PBS mod(1) 56.4 leyenda Tween 80 48,000 Mg/ml 5.2 Residuo de la Tritón X-100 cepa H3N2 Componente Concentración Volumen (mi) Succinato ácido de o 26,480 Mg/ml 1.2 tocoferilo Agua filtrada 501.22 Volumen total = 1,565 (mi) Se recuperan 75 mililitros de muestras de la pre-reserva para probarse Volumen de ore-reserva restante = 1.500 (mi) Paso 2: Añadido a la pre-reserva Emulsión SB62 750 Véase la PBS mod(1) 75 leyenda Agua filtrada 675 Volumen final total = 3,000 (mi) (1): La composición del volumen final de regulador es: NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, Na2HP048.1 mM, KH2P04 1.47 mM, pH de 7.4.

III.4.2. Administración de vacuna La vacuna se rellena en jeringas de vidrio estériles de 1.25 mililitros Tipo I (Farmacopea Europea). Cada jeringa se rellena hasta un objetivo de 0.57 mililitros (intervalo: de 0.54 a 0.60 mililitros). Las vacunas se administraron intramuscularmente en la región deltoide del brazo no dominante. Todas las vacunas se presentaron como jeringas previamente llenadas (0.5 mililitros). Con el objeto de asegurar una inyección intramuscular apropiada de la vacuna, se utilizó una aguja de cuando menos 25G y de cuando menos 2.5 centímetros de longitud. 111.5 Resultados de la población del estudio En este estudio se inscribió un total de 300 sujetos: 100 sujetos en cada uno de los 3 grupos. La edad promedio de la cohorte vacunada total en el momento de la vacunación fue de 36.7 años con una desviación estándar de 13.67 años. La edad promedio y la distribución de géneros de los sujetos a través de los 3 grupos de vacuna fueron similares. 111.6 Resultados de inmunogenicidad El análisis de inmunogenicidad se llevó a cabo sobre la cohorte de ATP para la inmunogenicidad (297 sujetos).

Respuesta inmunitaria humoral Con el objeto de evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por la vacuna candidata de influenza de dosis baja con adyuvante AS03, se calcularon los siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95 por ciento) para cada grupo de tratamiento: • Titulaciones medias geométricas (GMTs) de titulaciones de anticuerpos de inhibición de hemaglutinacion (Hl) en los días 0 y 21; · índices de seroconversión (SC) en el día 21; • Factores de conversión en el día 21; • índices de protección en el día 0 y 21.

III.6.1 Titulaciones medias geométricas (GMT) de inhibición de hemaglutinacion (Hl) Las titulaciones medias geométricas (GMT) para los anticuerpos de inhibición de hemaglutinacion (Hl) con intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%) se muestran en la Tabla 10 y en la Figura 1. Las proporciones de las titulaciones medias geométricas (GMT) ajustadas entre los grupos se muestran en la Tabla 1 .

Antes de la vacunación las titulaciones medias geométricas (GMT) de los anticuerpos de inhibición de hemaglutinacion (Hl) para las 3 cepas de vacuna estuvieron dentro del mismo intervalo en los 3 grupos de tratamiento. Las titulaciones medias geométricas (GMT) observadas en el día 21 para los grupos con adyuvante tienden a ser más altas que para el grupo de Fluarix para las 3 cepas con una diferencia estadística (no hubo traslape de los intervalos de confianza del 95 por ciento (Cl 95%), y la proporción de la titulación media geométrica (GMT) ajustada no contuvo el valor de 1) entre FluLD1/1 y Fluarix para la cepa de vacuna A/Wisconsin. También se observó una diferencia estadística (la proporción de la titulación media geométrica (GMT) ajustada no contuvo el valor de 1) entre FluLD1/2 y Fluarix para la cepa de vacuna B/Malasia.

Tabla 10 índices de seropositividad y titulaciones medias geométricas (GMTs) para el anticuerpo anti-hemaglutinina (HA) en los días 0 y 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) Anticuerpo Grupo Tiempo N =1( 1/DIL GMT Min Max n % Clí 6% 1/DL Cl 9 5% LL UL LL UL FluLDI/1 PRE 99 80 80.8 71.7 88.0 31.9 23.5 43.4 <10.0 2560.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 475.4 352.2 641.6 20.0 7240.0 A/Nueva FluLDI/2 PRE 99 80 80.8 71.7 88.0 36.1 26.9 48.5 <10.0 3620.0 Caledonia PI(D21) 99 98 99.0 94.5 100 399.0 294.7 540.2 <10.0 7240.0 Fluarix PRE 98 85 86.7 78.4 92.7 26.1 20.5 33.2 <10.0 1280.0 PI(D21) 98 98 100 96.3 100 380.6 274.2 528.4 10.0 7240.0 FluLD1/1 PRE 99 61 61.6 51.3 71.2 16.8 13.1 21.5 <10.0 453.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 276.2 223.5 341.3 28.0 5120.0 A/Wisconsin FluLDI/2 PRE 99 66 66.7 56.5 75.8 19.9 15.2 25.9 <10.0 640.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 241.9 192.9 303.4 20.0 5120.0 Fluarix PRE 98 58 59.2 48.8 69.0 14.7 11.6 18.6 <10.0 320.0 PI(D21) 98 97 99.0 94.4 100 172.3 136.4 217.6 <10.0 5120.0 Anticuerpo Grupo Tiempo =101/DIL GMT Min Max Cl 95% 1/DL Cl 95% LL UL LL UL FluLDI/1 PRE 99 72 72.7 62.9 81.2 20.4 15.9 26.1 <10.0 453.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 268.6 221.3 326.0 28.0 2560.0 B/Malas¡a FluLD1/2 PRE 99 76 76.8 67.2 84.7 22.2 17.6 27.9 <10.0 320.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 301.5 246.1 369.4 28.0 3620.0 Fluarix PRE 98 76 77.6 68.0 85.4 26.5 20.9 33.6 <10.0 320.0 PI(D21) 98 97 99.0 94.4 100 219.2 171.4 280.2 <10.0 5120.0 FluLDI/1 Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

FluLD1/2 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con media dosis de adyuvante AS03.

Fluarix Vacuna Fluarix.

GMT Titulación media geométrica de anticuerpos.

N Número de sujetos con resultados disponibles. n% Número/porcentaje de sujetos seropositivos (titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) >= 1:10).

Cl 95% = Intervalo de confianza del 95 por ciento, LL = Límite inferior, UL = Límite superior.

MIN/MAX = Mínimo/Máximo.

PRE = Antes de la vacunación en el día 0.

Pl (D21) = Después de la vacunación en el día 21.

Tabla 11 Proporciones de las titulaciones medias geométricas (GMT) ajustadas entre grupos para cada cepa de vacuna en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) GMT GMT Descr. Descr.

Anticuerpo N ajusN ajusProporción de GMT ajustada Grupo Grupo tada tada Orden de Valor Cl 95% Proporción LL UL FluLDI/1 A/Nueva FluLDI/1 99 472.4 FluLDI/2 99 385.0 1.23 0.80 1.88 /FluLDI/2 FluLDI/1 Celedonia FluLDI/1 99 472.3 Fluarix 98 396.9 1.19 0.78 1.82 Fluarix FluLDI/2 (1/DIL) FIULD1/2 99 385.0 Fluarix 98 397.0 0.97 0.63 1.49 I Fluarix FluLDI/1 A/Wisconsin FluLDI/1 99 277.3 FluLDI/2 99 230.0 1.21 0.90 1.62 /FluLD1/2 GMT GMT Descr. Descr.

Anticuerpo N ajusN ajusProporción de GMT ajustada Grupo Grupo tada tada Orden de Valor Cl 95% Proporción LL UL FluLDI/1 (1/DIL) FluLDI/1 99 277.5 Fluarix 98 180.8 1.54 1.14 2.06 /Fluarix FluLDI/2 FluLDI/2 99 230.0 Fluarix 98 180.6 1.27 0.95 1.71 Fluarix FluLD1/1 B/Malasia FluLDI/1 99 275.1 FluLD1/2 99 303.4 0.91 0.68 1.22 /FluLDI/2 FluLDI/1 (1/DIL) FluLDI/1 99 275.2 Fluarix 98 212.7 1.29 0.96 1.74 /Fluarix FluLDI/2 FluLDI/2 99 303.4 Fluarix 98 212.6 1.43 1.06 1.92 /Fluarix FluLD 1 /1 Vacuna de influenza de dosis baja (5 m icrogramos de hemaglutini na ( HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

Fl uLD I /2 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutini na ( HA) / cepa) con m edia dosis de adyuvante AS03.

Fl uarix = Vacuna Fluarix.

G MT ajustada = titu lación media geométrica de anticuerpos ajustada para la titulación de la l ínea base .

N = N úmero de sujetos con resultados disponibles tanto antes como después de la vacunación .

C l 95% = I ntervalo de confianza del 95 por ciento para la proporción de la titulación media geométrica (G MT) aj ustada ( modelo Ancova: ajuste para la titulación de la l ínea base - variación reservada con más de 2 grupos) ; LL = l ím ite i nferior, UL = límite superior.

III.6.2 Factores de conversión de titulaciones de anticuerpos anti-inhibición de hemaglutinación (Hl), índices de seroprotección e índices de seroconversion (se correlaciona para la protección como se establece para la vacuna de influenza en los seres humanos) Los resultados se presentan en la Tabla 6 - Figura 2 para los índices de seroprotección , Tabla 7 - Figura 3 para los índices de seroconversion , y Tabla 8 - Figura 4 para los factores de conversión .

En todos los grupos se alcanzó el umbral requerido por las Autoridades Eu ropeas para los índices de seroprotección (70 por ciento) (cuando menos el 94.9 por ciento) . Para cada cepa de vacuna, los índices de seroprotección en el día 21 para los 3 grupos estuvieron dentro del mismo intervalo.

En todos los grupos se alcanzó el umbral requerido po r las Autoridades Europeas para los índices de seroconversion (40 por ciento) (cuando menos el 65 por ciento).

Para la cepa de vacuna A/Nueva Celedonia, el índice de seroconversion (SCR) en el día 21 para los 3 grupos estuvo dentro del mismo intervalo.

Para la cepa de vacuna A/Wisconsin, el índice de seroconversion (SCR) en el día 21 para el grupo de FluLD1/1 tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix. El índice de seroconversion (SCR) en el día 21 para el grupo de FluLD1/2 estuvo dentro del mismo intervalo comparándose con el grupo de Fluarix.

Para la cepa de vacuna B/Malasia, el índice de seroconversión (SCR) en el día 21 para el grupo de FluLD1/2 tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix. El índice de seroconversión (SCR) en el día 21 para el grupo de FluLD1/1 estuvo dentro del mismo intervalo comparándose con el grupo de Fluarix.

En todos los grupos se alcanzó el umbral requerido por las Autoridades Europeas para los factores de seroconversión (2.5) (cuando menos 6.2).

Para la cepa de vacuna A/Nueva Caledonia, el factor de seroconversión (SCF) en el día 21 para los 3 grupos pareció estar dentro del mismo intervalo. El valor observado para el grupo de FluLD1/2 fue más bajo que el valor observado para el grupo de Fluarix pero se pudo explicar by el índice de seroprotección antes de la vacunación más alto en el grupo de FluLD1/2.

Para la cepa de vacuna A/Wisconsin, el factor de seroconversion (SCF) en el día 21 para el grupo de FluLD1/1 tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix. El factor de seroconversion (SCF) en el día 21 para el grupo de FluLD1/2 estuvo dentro del mismo intervalo comparándose con el grupo de Fluarix.

Para la cepa de vacuna B/Malasia, el factor de seroconversion (SCF) en el día 21 para los dos grupos con adyuvante tendió a ser más alto comparándose con el grupo de Fluarix.

Tabla 6 índices de seroprotección (SPR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) en el día 0 y en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) Cepa de Vacuna Grupo Tiempo N SPR Cl 95% n % LL UL A/Nueva FluLDI/1 PRE 99 41 41.4 31.6 51.8 Caledonia PI(D21) 99 95 96.0 90.0 98.9 FluLDI/2 PRE 99 55 55.6 45.2 65.5 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 Fluarix PRE 98 35 35.7 26.3 46.0 PI(D21) 98 93 94.9 88.5 98.3 Cepa de Vacuna Grupo Tiempo N SPR Cl 95% n % LL UL A/Wisconsin FluLDI/1 PRE 99 32 32.3 23.3 42.5 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 FluLDI/2 PRE 99 37 37.4 27.9 47.7 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 Fluarix PRE 98 25 25.5 17.2 35.3 PI(D21) 98 93 94.9 88.5 98.3 B/Malasia FluLDI/1 PRE 99 31 31.3 22.4 41.4 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 FluLDI/2 PRE 99 39 39.4 29.7 49.7 PI(D21) 99 98 99.0 94.5 100 Fluarix PRE 98 44 44.9 34.8 55.3 PI(D21) 98 94 95.9 89.9 98.9 FluLDI/1 Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

Fluarix = Vacuna Fluarix.

N = Número de sujetos con resultados disponibles. n/% = Número/porcentaje de sujetos seroprotegidos (titulación de inhibición de hemaglutinación (Hl) > = 40 1/DIL).

PRE = Antes de la vacunación en el día 0.

Pl (D1) = Después de la vacunación en el día 21.

Fuente de datos = Apéndice, Tabla MIA.

Tabla 7 índice de seroconversion (SCR) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) Cepa de Vacuna Grupo N SC ;R n % CI < )5% LL UL A/Nueva FluLD1/1 99 69 69.7 59.6 78.5 Caledonia Cepa de Vacuna Grupo N SC n % CI . )5% LL UL FluLDI/2 99 64 64.6 54.4 74.0 Fluarix 98 66 67.3 57.1 76.5 A/Wisconsin FluLD1/1 99 88 88.9 81.0 94.3 FluLD1/2 99 79 79.8 70.5 87.2 Fluarix 98 73 74.5 64.7 82.8 B/Malasia FluLDI/1 99 76 76.8 67.2 84.7 FluLDI/2 99 82 82.8 73.9 89.7 Fluarix 98 65 66.3 56.1 75.6 FluLD1/1 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

Fluarix = Vacuna Fluarix.

La seroconversión se define como: Para los sujetos inicialmente seronegativos, titulación de anticuerpos >= 40 1/DIL después de la vacunación Para los sujetos inicialmente seropositivos, titulación de anticuerpos después de la vacunación >= 4 veces la titulación de anticuerpos antes de la vacunación.

Número de sujetos con resultados antes y después de la vacunación disponibles-.

Número/porcentaje de sujetos seroconvertidos.

Intervalo de confianza del 95 por ciento, LL = Límite inferior, UL = Límite superior.

Tabla 8 Factor de seroconversión (SCF) para la titulación del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) en el día 21 (cohorte de ATP para la inmunogenicidad) Cepa de Vacuna Grupo N SCF Valor Cl 95% LL UL A/Nueva FluLDI/1 99 14.9 10.4 21.3 Caledonia Cepa de Vacuna Grupo N SCF Valor Cl 95% LL UL FluLD1/2 99 11.0 7.7 15.9 Fluarix 98 14.6 9.9 21.6 A/Wisconsin FluLDI/1 99 16.5 13.0 20.9 FluLD1/2 99 12.2 9.2 16.1 Fluarix 98 11.7 8.8 15.6 B/Malasia FluLD1/1 99 13.2 10.0 17.4 Flul_D1/2 99 13.6 10.2 18.0 Fluarix 98 8.3 6.2 11.0 FluLD1/1 = Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con dosis completa de adyuvante AS03.

Vacuna de influenza de dosis baja (5 microgramos de hemaglutinina (HA) / cepa) con media dosis de adyuvante AS03.

Vacuna Fluarix.

Número de sujetos con resultados antes y después de la vacunación disponibles.

Factor de seroconversión o proporción media geométrica (media[log10(PI(D21 )/PRE)]).

III.7 Conclusiones de seguridad Una reactogenicidad más alta en términos de síntomas (locales/generales) inducidos, y síntomas no inducidos en los grupos de vacuna con adyuvante comparándose con el grupo de Fluarix fue la tendencia global observada en este estudio.

Una reducción del contenido de AS03 en la vacuna con adyuvante tiene un impacto significativo sobre todos los síntomas generales y locales de grado 3.

La presentación de síntomas no inducidos tendió a ser más alta en los grupos de vacuna con adyuvante (el 55 por ciento y el 47 por ciento de los sujetos), comparándose con el grupo de Fluarix (35 por ciento).

A partir de estos resultados, se puede concluir que el perfil de reactogenicidad y seguridad de las vacunas candidatas, es satisfactorio y clínicamente aceptable.

III.8. Conclusiones globales III.8.1. Resultados de inmunogenicidad El objetivo primario de este estudio fue evaluar la respuesta inmunitaria humoral (titulaciones de anticuerpos anti-inhibición de hemaglutinación (Hl)) provocada por la vacuna de influenza de dosis baja con dos diferentes concentraciones del adyuvante AS03, y con Fluarix.

En el día 21, las tres vacunas excedieron los requerimientos de las Autoridades Europeas para el registro anual de las vacunas de influenza de virión disociado ("Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines" para la evaluación inmunológica de los cambios anuales de la cepa CPMP/BWP/214/96). Las titulaciones medias geométricas (GMT) tendieron a ser más altas en los grupos con adyuvante comparándose con el grupo de Fluarix, con una diferencia estadísticamente significativa observada para las cepas de vacuna A/Wisconsin (FluLD1/1 contra Fluarix), y B/Malasia (FluLD1/2 contra Fluarix). Se observaron índices de seroprotección similares en los tres grupos de vacunas, en el intervalo desde el 94.9 por ciento hasta el 99 por ciento. Se observó que los índices de seroconversion y los factores de seroconversion fueron más altos en los grupos con adyuvante que en el grupo de Fluarix. Los datos a partir de este estudio también revelaron que la inmunogenicidad inducida por la vacuna con la mitad de la dosificación de adyuvante AS03 fue comparable con aquélla inducida con la dosis completa de adyuvante.

III.8.2. Resultados de reactogenicidad y seguridad La administración de la vacuna de influenza de dosis baja candidata con adyuvante AS03 fue segura y clínicamente bien tolerada en la población del estudio, es decir, en las personas adultas de entre 18 y 59 años de edad. La vacuna de media dosis con adyuvante mostró una disminución notoria en la incidencia de los síntomas locales y generales inducidos, comparándose con la vacuna de dosis completa con adyuvante.

Ejemplo IV Evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones BALB/c primeramente inoculados IV.1. Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones primeramente inoculados con influenza con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas humorales mediante AS03 inducidas por las vacunas de influenza formuladas con este adyuvante de aceite en agua. Para simular la situación en seres humanos, se condujo un experimento utilizando ratones primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas.

IV.1.1. Grupo de Tratamiento (Tabla 9) Los grupos de 27 ratones adultos hembras BALB/c se inocularon primeramente intranasalmente (volumen de 20 microlitros) en el día 0 con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (5 microgramos de hemaglutinina (HA) para cada cepa). Las cepas de primera inoculación consistieron en variantes desfasadas más tempranas (5 microgramos de H1N1 inactivado integral de hemaglutinina (HA) A/Johannesburg/82/96, H3N2 A/Sidney/5/97, B/Harbin/7/94) que aquéllas incluidas en la vacuna. Veintiocho días más tarde, los ratones se vacunaron con una sola dosis de la vacuna candidata intramuscularmente en un volumen total de 50 microlitros. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de dos dosis de AS03 (completas o medias). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron los antígenos virales de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shangdong/7/97 (1.5 microgramos/cepa, 1/10a parte de la dosis humana).

Tabla 9 IV.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X100, y Succinato de vitamina E (VES), se prepara con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microgramos/mililitro de Tween 80, 110 microgramos/mililitro de Tritón X100, y 100 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla se calculan tomando en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.

Preparación de un litro de regulador de suero concentrado 10 veces (PBS, pH de 7.4): A 0.800 litros de agua para inyecciones, se les agregan 80 gramos de NaCI, 2 gramos de KCI, 11.44 gramos de Na2HP04, 2 gramos de KH2P04. Después de la solubilización, se ajusta hasta 1.0 litro con agua para inyecciones. El pH estará en 7.4 cuando se diluya 10 veces.

Disociado trivalente / llano La formulación de una dosis de 50 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

Disociado trivalente /AS03 Una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X100, y Succinato de vitamina E (VES), se prepara con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microgramos/mililitro de Tween 80, 110 microgramos/mililitro de Tritón X100, y 100 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla se calculan tomando en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.

La formulación de una dosis de 50 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 25 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de dosis completa, ó 5 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de media dosis, 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

IV.1.3. Lecturas (Tabla 10) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió antes de la inmunización (día 28), y 14 días después de inmunización (27 ratones/grupo), las muestras de suero se proba mediante la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl).

Tabla 10 IV.2. Resultados IV.2.1. Inmunidad humoral Los resultados se presentan en las Figuras 5A-5C. En este modelo de ratón de primera inoculación hetero-subtípica seguida por una sola vacunación, se mostró que el AS03 y las diluciones del mismo inducían titulaciones más altas de inhibición de hemaglutinación (Hl), comparándose con la vacuna llana. Para todas las cepas de influenza A, se observó un aumento estadísticamente significativo de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) (p < 0.05). Para la cepa H1N1, también se observó una diferencia significativa en las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) entre el AS03 y el AS03 1/5 (p < 0.05). Una dosis reducida de AS03 fracasó para aumentar las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) para las tres cepas comparándose con la vacuna llana. Se observaron respuestas muy bajas contra la cepa B (B/Shangdong); esto probablemente se debe al desfasamiento antigénico significativo entre las cepas B utilizadas para la primera inoculación y la vacuna.

IV.3. Sumario de resultados y conclusiones En conclusión, se observó un aumento en las titulaciones de inhibición de hemaglutinacion (Hl) en los animales primeramente inoculados con las cepas hetero-subtípicas cuando se utilizaron las vacunas con adyuvante AS03 comparándose con la vacuna llana. Una dosis completa de AS03 fue óptima para obtener titulaciones de inhibición de hemaglutinacion (Hl) robustas contra las tres vacunas de cepas de influenza.

Ejemplo V Evaluación pre-clínica de vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados V.1. Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones primeramente inoculados con influenza con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas humorales y celulares mediante las vacunas de influenza inducidas por AS03 formuladas con este adyuvante de aceite en agua.

Para simular la situación humana, se condujo un experimento utilizando ratones primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas.

V.1.1. Grupo de tratamiento (Tabla 11) Los grupos de 25 ratones adultos hembras C57BI/6 se inocularon primeramente intranasalmente (volumen de 20 microlitros) en el día 0 con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (5 microgramos de hemaglutinina (HA) para cada cepa). Las cepas de primera inoculación consistieron en variantes de desfasamiento más temprano (5 microgramos de H1N1 inactivado integral de hemaglutinina (HA) A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panamá/2007/99, B/ Shangdong/7/97) que aquéllas incluidas en la vacuna. Veintiocho días más tarde, los ratones se vacunaron con una sola dosis de la vacuna candidata ¡ntramuscularmente en un volumen total de 100 microlitros. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de tres dosis de AS03 (completa, 1/2 ó 1/5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos virales de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Nueva York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (1.5 microgramos/cepa, 1/10a parte de la dosis humana).

Tabla 11 Gr Antígeno / Formulación Otro Tratamiento Disociado trivalente / Llano (sin Primera inoculación 1 adyuvante) heteróloga DO Gr Antígeno / Formulación Otro Tratamiento Primera inoculación 2 Disociado trivalente / AS03 heteróloga DO Primera inoculación 3 Disociado trivalente / AS03 1/2 heteróloga DO Primera inoculación 4 Disociado trivalente / AS03 1/5 heteróloga DO Primera inoculación 5 PBS heteróloga DO V.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Disociado trivalente / Llano Las formulaciones para una dosis de 100 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (1.5 microgramos por cepa en la dosis final).

Disociado trivalente /AS03 Las formulaciones para una dosis de 100 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (1.5 microgramos por cepa en la dosis final) + 25 microlitros de emulsión SB62 para la dosis completa o 12.5 microlitros de emulsión SB 62 para la media dosis ó 5 microlitros de emulsión SB62 para la 1/5 de la dosis. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de la preparación.

V.1.3. Lecturas (Tabla 12) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió 21 días después de la inmunización (10 ratones/grupo), y las muestras de suero se probaron mediante la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl). La respuesta inmunitaria celular se probó 7 días después de la inmunización mediante teñido de citoquina intracelular (ICS).

Tabla 12 Punto del Tipo de Método de Lectura tiempo muestra análisis Respuesta D49 Suero IHA humoral Respuesta D35 PB Cs ICS celular V.2. Resultados V.2.1. Inmunidad humoral (10 ratones/grupo).

Los resultados se presentan en la Figura 6. En este modelo de ratón de primera inoculación hetero-subtípica seguida por una sola vacunación, se mostró que el AS03 y las diluciones (1/2 y 1/5) del mismo inducían titulaciones más altas de inhibición de hemaglutinación (Hl) comparándose con la vacuna llana. Para las tres cepas, no se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) entre los ratones que recibieron la vacuna con adyuvante de una dosis completa AS03 o la dosis reducida de AS03.

V.2.2. Inmunidad celular (15 ratones/grupo).

Los resultados se presentan en la Figura 7. Cualquiera que sea la dilución de AS03, se observaron respuestas de células-T CD4+ más altas en los ratones inmunizados con la vacuna trivalente disociada con adyuvante AS03 comparándose con los ratones inmunizados con llanos disociados trivalentes. Comparándose con la respuesta inducida en los ratones inmunizados con disociado trivalente con adyuvante de una dosis completa de AS03, se observó una tendencia a tener respuestas celulares más bajas cuando los ratones se inmunizaron con disociado trivalente con adyuvante de dosis más bajas de AS03.

V.3. Sumario de resultados y conclusiones En conclusión, se observó un aumento en las respuestas humorales y celulares en los animales primeramente inoculados con cepas hetero-subtípicas cuando se utilizaron las vacunas con adyuvante AS03 comparándose con la vacuna llana. Se observó una magnitud similar de la respuesta humoral entre los ratones inmunizados con la dosis completa o la dosis fraccionaria de adyuvante AS03. Sin embargo, una reducción en la dosis de adyuvante estuvo asociada con una tendencia a una magnitud reducida de la respuesta de células-T CD4+.

Ejemplo VI - Evaluación pre-clínica de la respuesta inmunitaria celular inducida por vacunas de influenza disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS 03 y una dosis baja de antígeno) en ratones C57BI/6 primeramente inoculados VI.1. Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones primeramente inoculados con influenza con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas inmunitarias celulares mediante AS03 inducido por vacunas de influenza que contenían una dosis baja de antígeno (0.5 microgramos/cepa, 1/30a parte de la dosis humana), y formuladas con este adyuvante de aceite en agua.

VI.1.1. Grupo de tratamiento (Tabla 13) Los grupos de 15 ratones adultos hembras C57BI/6 se inocularon primeramente intranasalmente (volumen de 20 microlitros) en el día O con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (5 microgramos de hemaglutinina (HA) para cada cepa). Las cepas de primera inoculación consistieron en variantes de desfasamiento más temprano (5 microgramos de H1N1 inactivado integral de hemaglutinina (HA) A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panamá/2007/99, B/ Shangdong/7/97) que aquéllas incluidas en la vacuna. Veintiocho días más tarde, los ratones se vacunaron con una sola dosis de la vacuna candidata intramuscularmente en un volumen total de 50 microlitros. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de tres dosis de AS03 (completa, 1/2 ó 1/5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos virales de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Nueva York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (0.5 microgramos/cepa, 1/30a parte de la dosis humana).

Tabla 13 Gr Antígeno / Formulación Otro Tratamiento Disociado trivalente / Llano (sin Primera inoculación 1 adyuvante) heteróloga DO Primera inoculación 2 Disociado trivalente / AS03 heteróloga DO 3 Disociado trivalente / AS03 1/2 Primera inoculación heteróloga DO Primera inoculación 4 Disociado trivalente / AS031/5 heteróloga DO Primera inoculación 5 PBS heteróloga DO VI.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Disociado trivalente / llano Las formulaciones para una dosis de 50 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4, preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (0.5 microgramos por cepa en la dosis final).

Disociado trivalente /AS03 Las formulaciones para una dosis de 50 microlitros se preparan extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Fluarix, Lote Clínico DFLUA014 (0.5 microgramos por cepa en la dosis final) + 25 microlitros de emulsión SB62 para la dosis completa, o 12.5 microlitros de emulsión SB 62 para la ½ dosis ó 5 microlitros de emulsión SB62 para la 1/5 dosis.

Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de la preparación.

VI.1.3. Lecturas (Tabla 14) La respuesta inmunitaria celular se probó 7 días después de la inmunización mediante teñido de citoquina intracelular.

Tabla 14 VI.2. Resultados Vl.2.1. Inmunidad celular Los resultados se presentan en la Figura 8. Marginalmente se observaron respuestas de células-T CD4+ más altas en los ratones inmunizados con la vacuna disociada trivalente con adyuvante AS03 (completo o media dosis), comparándose con los ratones inmunizados con llanos disociados trivalentes. Comparándose con la respuesta inducida en los ratones inmunizados con disociado trivalente llano o con adyuvante de una dosis completa, o media dosis de AS03, se observaron respuestas celulares más altas cuando los ratones se inmunizaron con disociado trivalente con adyuvante de 1/5 de la dosis de AS03.

VI.3. Sumario de resultados y conclusiones En conclusión, se observó un aumento mínimo en la respuesta de células-T CD4+s en los animales primeramente inoculados hetero-subtípicos cuando se utilizaron las vacunas con adyuvante AS03 comparándose con la vacuna llana. No se observó respuesta alguna a la dosis de adyuvante en este experimento, y en realidad, 1/5 de la dosis de AS03 indujo frecuencias más alas de células-T CD4+ específicas del antígeno que lo que se vio con las dosis más altas de adyuvante. Sobre todo, estos datos no son consistentes con otros experimentos pre-clínicos, y pueden ser sugestivos de un problema técnico con este experimento en particular.

Ejemplo VII - Evaluación pre-clínica de vacunas de H5N1 disociadas con adyuvante y sin adyuvante (las cuales comprenden diferentes dosis de adyuvante AS03 y antígeno) en ratones C57BI/6 puros VII.1. Diseño experimental y objetivo Se llevaron a cabo experimentos en ratones H5N1 puros con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas inmunitarias humorales y celulares mediante AS03 inducido por vacunas de H5N1 disociadas formuladas con este adyuvante de aceite en agua. En el caso de una pandemia, se espera que toda la población mundial sea inmunológicamente pura para la cepa de influenza pandémica de reciente circulación. Debido a este estado inmunitario puro, una vacuna para la pandemia probablemente requerirá de dos dosis de vacuna para proteger a los individuos de la infección y de la enfermedad grave causada por una nueva cepa de influenza. Para representar esta falta de exposición previa, se desarrolló un modelo de ratón puro para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna.

VII.1.1. Grupo de tratamiento (Tabla 15) Los grupos de 15 ratones adultos hembras C57BI/6 puros se inmunizaron en los días 0 y 28 con la vacuna de H5N1 pandémica candidata intramuscularmente en un volumen total de 50 microlitros. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenían los antígenos de H5N1 disociados solos (H5N1 llano disociado), o con formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de diferentes dosis de AS03 (doble, completa, 1/2, ó 1/5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígeno viral H5N1 A / Vietnam / 1194/04 (1.5 ó 0.38 microgramos/cepa correspondientes a 1/10a parte de la dosis humana).

No se hizo formulación alguna con una dosis doble de AS03, sino más bien fue una inyección concomitante de 50 microlitros de H5N1 disociado/AS03 en dosis completa + una dosis de 50 microlitros de AS03.

Tabla 15 Gr Antígeno / Formulación Dosis de Antígeno 1 H5N1 disociado / llano (sin adyuvante) 1.5 µg 2 H5N1 disociado / dosis doble AS03 1.5 pg 3 H5N1 disociado / AS03 1.5 pg Gr Antígeno / Formulación Dosis de Antígeno 4 H5N1 disociado / AS03 1/2 1.5 pg 5 H5N1 disociado / AS03 1/5 1.5 ig 6 H5N1 disociado / llano (sin adyuvante) 0.38 g 7 H5N1 disociado / dosis doble AS03 0.38 ig 8 H5N1 disociado / AS03 0.38 Mg 9 H5N1 disociado / AS03 1/2 0.38 ig 10 H5N1 disociado / AS03 1/5 0.38 µg 11 PBS VII.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Preparación de un litro de regulador de volumen final (suero regulado con fosfato (PBS), pH de 7.2 ± 0.2): A 0.800 litros de agua para inyecciones, se les agregan 7.699 gramos de NaCI, 0.200 gramos de KCI, 0.100 gramos de MgCI2 x 6H20, 2.600 gramos de Na2HP04 x 12 H20, 0.373 gramos de KH2P04. Después de la solubilización, se ajusta hasta 1.0 litro con agua para inyecciones H5N1 disociado / llano Preparación de una dosis de 50 microlitros: Se agregan Tiomersal (las cantidades son tomando en cuenta su concentración en la cepa), y Tritón X100 al regulador de volumen final. No se agrega Tween 80 a medida que se alcanza el contenido objetivo en la formulación mediante la concentración de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 368 microgramos/mililitro para el Tween 80, y de 35 microgramos/mililitro para el Tritón X100 en la dosis de formulación de 1.5 microgramos. Son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 93 microgramos/mililitro para el Tween 80, y de 8.9 microgramos/mililitro para el Tritón X100 in la dosis de formulación de 0.38 microgramos. Después de 5 a 30 minutos de agitación magnética, se agregan 1.5 ó 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA) (cepa H5N1). Las formulaciones se agitan durante 30 a 60 minutos. Se verifica el pH. Las inyecciones ocurren dentro de la hora en seguida del final de la formulación.

H5N1 disociado/ AS03 Preparación de una dosis de 50 microlitros: Se agregan Tiomersal (las cantidades son tomando en cuenta su concentración en la cepa) y Tritón X100 al regulador de volumen final. No se agrega Tween 80 a medida que se alcanza el contenido objetivo en la formulación mediante la concentración de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 368 microgramos/mililitro para el Tween 80, y de 35 microgramos/mililitro para el Tritón X100 en la dosis de formulación de 1.5 microgramos. Son de 10 microgramos/mililitro para el Tiomersal, de 93 microgramos/mililitro para el Tween 80, y de 8.9 microgramos/mililitro para el Tritón X100 en la dosis de formulación de 0.38 microgramos. Después de 5 a 30 minutos de agitación magnética, se agregan 1.5 ó 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA) (cepa H5N1). Después de 30 a 60 minutos de agitación magnética, se agregan 25 ó 12.5 ó 5 microlitros de emulsión SB62. Las formulaciones se agitan durante 30 a 60 minutos. Se verifica el pH. Las inyecciones ocurren dentro de la hora en seguida del final de la formulación VII.1.3. Lecturas (Tabla 16) La respuesta inmunitaria humoral se midió 14 días después de la inmunización (10 ratones/grupo) mediante las titulaciones de los anticuerpos anti-lg, IgG 1 e lgG2b (Figura 9, A-F). La respuesta inmunitaria humoral también se midió 21 días después de la inmunización (10 ratones/grupo) mediante el ensayo de inhibición de hemaglutinación anti-H5N1 (Figúralo, A-B).

La respuesta inmunitaria celular se probó 6 días después de la inmunización (5 reservas de 3 ratones por grupo) mediante teñido de citoquina intracelular (ICS) de células-T CD4+ específicas del antígeno numeradas mediante citometría de flujo (Figura 11, A-B).

Tabla 16 Punto del Tipo de Método de Lectura tiempo muestra análisis Respuesta ELISA, isotipos D39 Suero humoral y titulaciones Punto del Tipo de Método de Lectura tiempo muestra análisis de Hl Respuesta D34 PBMCs ICS celular VII.2. Resultados VII.2.1. Respuesta inmunitaria humoral: ELISA e isotipos.

Los resultados se presentan en las Figuras 9A-9F.

En cada dosis de vacuna de H5N1 disociada, todos los grupos con adyuvante indujeron titulaciones de anticuerpos Ig, lgG1 e lgG2b anti-H5N1 más altas, comparándose con la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante (Figuras 9 - A a F).

En cada dosis de vacuna de H5N1 disociada; la respuesta del anticuerpo de IgG 1 anti-H5N1 fue 4 a 5 veces más alta que la respuesta del anticuerpo de lgG2b anti-H5N1 (Figuras 9 - C a F). Con una dosis de 1.5 microgramos de hemaglutinina (HA) de la vacuna de H5N1 disociada, y combinada con cada dosis de adyuvante, no se observó diferencia alguna de las respuestas de los anticuerpos de Ig, IgG 1 e lgG2b anti-H5N1 (Figuras 9 - A, C y E).

Con una dosis de 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA) de la vacuna de H5N1 disociada, se obtuvo una tendencia a titulaciones de Ig anti-H5N1 más altas después de la inmunización con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante de 2 veces la dosis completa, comparándose con la respuesta inducida por la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03/2 (p = 0.7315), y AS03 1/5 (p = 0.9744) (Figura 9-B). También se observó esta tendencia para la respuesta del anticuerpo de lgG1 anti-H5N1 (Figura 9-D). Sin embargo, la potencia no fue suficiente para observar una diferencia estadísticamente significativa (potencia del 25 por ciento para una diferencia de 1.7 veces, o del 47 por ciento para una diferencia de 2 veces).

VII.2.2. Respuesta inmunitaria humoral: Titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl).

Con una dosis de 1.5 microgramos de hemaglutinina (HA)/ ratones: En cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03 indujeron titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) más altas, comparándose con la respuesta obtenida en los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante (Figura 10-A). No se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) cuando la vacuna de H5N1 disociada tuvo el adyuvante con un intervalo de dosis de AS03 (Figura 10-A).

Con una dosis de 0.38 microgramos de hemaglutinina (HA)/dosis En cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03 indujeron titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) más altas, comparándose con la respuesta obtenida en los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante (Figura 10B).

Se observaron titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) significativamente más altas con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03, comparándose con la respuesta obtenida con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03/2 (p = 0.032 para una diferencia de 4 veces) (Figura 10B).

No se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) en los ratones inmunizados con vacuna de H5N1 disociada con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03, o una dosis completa de AS03, o entre los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03/2 o AS03/5 (Figura 10B).

Comparación entre la dosis de antígeno (1.5 microgramos o 0.38 microgramos): No se observó diferencia alguna de las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) entre los ratones inmunizados con cada dosis de hemaglutinina (HA) de la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03, AS03/2 o AS03/5, excepto entre los ratones inmunizados con 1.5 microgramos de H5N1 disociada de hemaglutinina (HA) con adyuvante AS03/5, y los ratones inmunizados con 0.38 microgramos de H5N1 disociada de hemaglutinina (HA) con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03 (Figuras 10A-10B). Las titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl) fueron significativamente más altas en seguida de la inmunización con 0.38 microgramos de H5N1 disociada de hemaglutinina (HA) con adyuvante de 2 veces la dosis completa de AS03, comparándose con la dosis de antigeno más alta combinado con la dosis de adyuvante más baja (1.5 microgramos de hemaglutinina (HA) con AS03/5, p = 0.0193 para el una diferencia de 4 veces) (Figuras 10A-10B).

VI 1.2.3. Respuesta inmunitaria celular Los resultados se presentan en las Figuras 11A-11B.

En cada dosis de vacuna de H5N1 disociada (1.5 ó 0.38 microgramos) se observaron respuestas de células-T CD4+ más altas en los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante de diferentes dosis de AS03, comparándose con los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante (Figuras 11A-11B). ; En una dosis de 1.5 microgramos de vacuna de H5N1 disociada, una reducción de la dosis de AS03 correspondió a una disminución en las frecuencias de células-T CD4+ (Figura 11A). Sin embargo, en una dosis de 0.38 microgramos de vacuna de H5N1 disociada, no se observó diferencia alguna en la respuesta de células-T CD4 + S entre diferentes dosis de adyuvante en los ratones inmunizados con las vacunas de H5N1 disociadas con adyuvante AS03 (Figura 11B)..

VII.3. Sumario de resultados y conclusiones Los estudios de inmunogenicidad en los ratones mostraron que la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante indujo respuestas humorales (ELISA de anti-H5N1 y titulaciones de inhibición de hemaglutinación (Hl)) y celulares (CD4 + células-T) significativamente más altas que aquéllas inducidas por la vacuna de H5N1 disociada sin adyuvante.

No se observó ningún efecto de respuesta a la dosis de antígeno para la respuesta inmunitaria humoral entre los ratones inmunizados con 1.5 microgramos y 0.38 microgramos de vacuna de H5N1 disociada con adyuvante, sugiriendo que, en la presencia de adyuvante, se pueden requerir dosis todavía más bajas de hemaglutinina (HA) para observar un efecto de respuesta a la dosis en este modelo.

Se observó un fuerte incremento en la respuesta de células-T CD4+s en los ratones puros cuando se utilizaron las vacunas pandémicas de H5N1 con adyuvante AS03, comparándose con la vacuna de H5N1 llana. No se observó impacto alguno de la dilución de AS03 cuando se utilizó una dosis de 0.38 microgramos de vacuna de H5N1 disociada como la vacuna candidata, mientras que se observó una disminución de las respuestas de células-T CD4 cuando se usaron 1.5 microgramos de la vacuna de H5N1 disociada con adyuvante AS03 en la dosis reducida.

Como se observó anteriormente, no se observó diferencia alguna en las respuestas inmunitarias humorales y celulares entre los ratones inmunizados con la vacuna de H5N1 disociada (en cualquiera de las dosis de antígeno) con adyuvante de una dosis completa AS03 o con AS03/2. Se detectó alguna mejora en la respuesta inmunitaria cuando se utilizó 2 veces la dosis completa de AS03 en la formulación de vacuna y, de conformidad con lo anterior, se detectó una disminución en la respuesta inmunitaria cuando se utilizó AS03/5 en la formulación de vacuna.

Sobre todo, los datos reportados aquí apoyan la potencia de este novedoso sistema adyuvante en esta formulación de vacuna. Ejemplo VIII - Evaluación pre-clínica de vacunas de influenza con adyuvante y sin adyuvante en cerdos Large White (Grandes Blancos) primeramente inoculados.

VIII.1. Diseño experimental y objetivo El experimento en los cerdos primeramente inoculados con influenza se llevó a cabo con el objeto de evaluar el aumento en las respuestas humorales mediante las vacunas de influenza inducidas por AS03 formuladas con este adyuvante de aceite en agua.

Se utilizaron cerdos con el objeto de evaluar un intervalo de dosis de AS03 en un modelo animal cercano a los seres humanos. Los cerdos muestran una larga lista de analogías biológicas que establecen este animal como fisiológicamente el más cercano al hombre con muy pocas excepciones (Douglas R., 1972). Más aún, comúnmente se observa la manifestación de la infección por influenza en cerdos.

Vlll.1.1. Grupo de tratamiento (Tabla 17) Los grupos de 10 cerdos Large White (Grandes Blancos) adultos hembras se inocularon primeramente en el día 0 con el virus de influenza integral trivalente inactivado con formalina (25 microgramos de hemagiutinina (HA) para cada cepa) intranasalmente en un volumen total de 200 microlitros. Las cepas de primera inoculación consistieron en cepas homologas a las cepas de vacuna (25 microgramos de H1N1 inactivado integral de hemagiutinina (HA) A / Nueva Caledonia / 20/99, H3N2 A / Panamá / 2007/99 y B / Shangdong / 7/97). Veintiocho días más tarde, los cerdos se vacunaron con una sola dosis de la vacuna candidata intramuscularmente en un volumen total de 500 microlitros. Los cerdos se inmunizaron con formulaciones que contenían antígenos disociados solos (llanos disociados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos disociados con adyuvante de un intervalo de dosis de AS03 (completa, 1/2 o 1/5). Las cepas utilizadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos virales H1N1 A / Nueva Caledonia / 20/99, H3N2 A / Panamá / 2007/99 y B / Shangdong / 7/97 (15 microgramos de hemagiutinina (HA) para las cepas de H1N1 A / Nueva Caledonia / 20/99, H3N2 A / Panamá / 2007/99, y 17.5 microgramos para la cepa B / Shangdong / 7/97 como en una dosis humana).

Grupos (10 cerdos/grupo): Tabla 17 Gr Antígeno / Formulación Otro Tratamiento Disociado trivalente / Llano (sin Primera inoculación 1 adyuvante) heteróloga DO Gr Antígeno / Formulación Otro Tratamiento Primera inoculación 2 Disociado trivalente / AS03 heteróloga DO Primera inoculación 3 Disociado trivalente / AS031/2 heteróloga DO Primera inoculación 4 Disociado trivalente / AS031/5 heteróloga DO VIII.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Disociado trivalente / llano Se prepara una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X100, y Succinato de vitamina E (VES), con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microgramos/mililitro de Tween 80, de 110 microgramos/mililitro de Tritón X100, y de 100 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla toman en cuenta su contenido en las cepas.

La formulación de una dosis de 500 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4, preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 17.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

Disociado trivalente /AS03 Una pre-mezcla de Tween 80, Tritón X100, y Succinato de vitamina E (VES), se prepara con el objeto de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 microgramos/mililitro de Tween 80, 110 microgramos/mililitro de Tritón X100, y 100 microgramos/mililitro de VES. Las cantidades utilizadas en la pre-mezcla toman en cuenta su contenido en las cepas.

La formulación de una dosis de 500 microlitros se prepara extemporáneamente de acuerdo con la siguiente secuencia: agua para inyecciones + Regulador de solución salina (suero regulado con fosfato (PBS) concentrado 10 veces, pH de 7.4, preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + Pre-mezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H1N1 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 15 microgramos de cepa H3N2 de hemaglutinina (HA), 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 17.5 microgramos de cepa B de hemaglutinina (HA), 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 250 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de dosis completa, o 125 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de media dosis, ó 50 microlitros de emulsión SB62 para AS03 de media dosis, 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora en seguida del final de su preparación.

VIII.1.3 Lecturas (Tabla 18) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió antes de la primera inoculación intranasal (día 0) antes de la inmunización (día 28), y 14 días después de la inmunización (10 cerdos/grupo). Las muestras de suero se probaron mediante la prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl).

Tabla 18 VIII.2. Resultados y conclusiones VIII.2.1. Inmunidad humoral Los resultados se presentan en la Figura 12. Cualquiera que sea la dilución del adyuvante, las formulaciones trivalentes disociadas con adyuvante AS03 indujeron una respuesta de inhibición de hemaglutinación (Hl) más fuerte a todas las cepas que a la formulación trivalente llana en este modelo de primera inoculación homologa, aunque no siempre se alcanzó el significado estad ístico para las tres cepas. Se observó un efecto de la dosis de adyuvante con ligeras diferencias de cepa a cepa. Para las cepas menos inm unogénicas, tales como B/S hangdong , solamente la vacuna disociada trivalente con adyuvante de una dosis completa de AS03 fue significativamente diferente de la vacuna llana. En contraste con la vacuna disociada trivalente con adyuvante de una dosis completa de AS03, una dosis reducida de AS03 fracasó para aumentar las titulaciones de inhibición de hemagluti nación ( H l ) para las tres cepas por arriba de las que se ven con la vacuna llana.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica, la cual comprende un sacárido y/o proteína de estafilococo y una composición adyuvante, la cual consiste en una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 7 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 7 miligramos de tocol, y de 0.1 a 3 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana, en donde la dosis es de entre 0.4 mililitros y 1.5 mililitros.

2. Una composición de vacuna, la cual comprende un sacárido y/o proteína de estafilococo y una composición adyuvante, la cual consiste en una emulsión de aceite en agua, en donde esta emulsión de aceite en agua comprende de 0.5 a 7 miligramos de aceite metabolizable, de 0.5 a 7 miligramos de tocol, y de 0.1 a 3 miligramos de un agente emulsionante, por dosis humana, en donde la dosis es de entre 0.4 mililitros y 1.5 mililitros.

3. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 1 a 10, de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, de 5 a 6 miligramos (por ejemplo, de 2 a 3, de 5 a 6, o de 9 a 10 miligramos) de aceite metabolizable, por dosis humana.

4. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde la emulsión de aceite en agua comprende 0.5 a 11, de 1 a 11 , de 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8, de 5 a 7, o de 5 a 6 miligramos (por ejemplo, de 10 a 11 , de 5 a 6, de 2.5 a 3.5, o de 1 a 3 miligramos) de tocol, por dosis humana.

5. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en donde la emulsión de aceite en agua comprende de 0.1 a 5, de 0.2 a 5, de 0.3 a 4, de 0.4 a 3, o de 2 a 3 miligramos (por ejemplo, de 0.4 a 1.2, de 2 a 3, o de 4 a 5 miligramos) de agente emulsionante, por dosis humana.

6. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cantidad de aceite metabolizable es de 5.35 miligramos, por dosis humana.

7. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde la cantidad de aceite metabolizable es de 2.14 miligramos, por dosis humana.

8. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde la cantidad de tocol es de 5.94 miligramos, por dosis humana.

9. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde la cantidad de tocol es de 2.38 miligramos, por dosis humana.

10. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, en donde la cantidad de agente emulsionante es de 2.425 miligramos, por dosis humana.

11. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, en donde la cantidad de agente emulsionante es de 0.97 miligramos, por dosis humana.

12. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, en donde el aceite metabolizable es escualeno.

13. Una composición inmunogénica como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el tocol es alfa-tocoferol.

14. Una composición inmunogénica como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el agente emulsionante es mono-oleato de sorbitán de polioxietileno.

15. Una composición inmunogénica como se reclama en la reivindicación 14, en donde el mono-oleato de sorbitán de polioxietileno se selecciona a partir del grupo que comprende: Polisorbato® 80 ó Tween® 80.

16. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, en donde el volumen de la dosis es de 0.5 mililitros.

17. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, en donde el volumen de la dosis es de 0.7 mililitros.

18. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, en donde el volumen de la dosis es de 1.0 mililitros.

19. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual comprende un sacárido de PNAG de estafilococo.

20. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual comprende un sacárido de S. aureus tipo 5 y/u 8.

21. La composición inmunogénica de la reivindicación 19 ó 20, en donde los sacáridos se conjugan con una proteína portadora.

22. La composición inmunogénica de la reivindicación 21, en donde la proteína portadora se selecciona a partir del grupo que consiste en toxoide de tétanos, toxoide de difteria, CRM197, exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa, neumolisina, proteína D a partir de H. influenzae, una proteína estafilocócica, toxoide alfa, ClfA y SdrG.

23. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, la cual además comprende una proteína estafilocócica, una función inmunológica equivalente a la misma, o un fragmento de la misma.

24. La composición inmunogénica de la reivindicación 23, en donde la proteína estafilocócica o el fragmento de la misma es una proteína de enlace de componente extracelular seleccionado a partir del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína de enlace de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de enlace de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, GehD de Lipasa, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de enlace de vitronectina, proteína de enlace de fibrinógeno, coagulasa, Fig, y MAP.

25. La composición inmunogénica de la reivindicación 23, en donde la proteína estafilocócica o el fragmento de la misma es una proteína transportadora seleccionada a partir del grupo que consiste en transportador ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportador de Mg2+, SitC, y transportador ABC de Ni.

26. La composición inmunogénica de la reivindicación 23, en donde la proteína estafilococica o el fragmento de la misma es una toxina o un regulador de virulencia seleccionado a partir del grupo que consiste en toxina alfa (Hla), mutante H35R de toxina alfa, proteína activadora de ARN III (RAP).

27. La composición inmunogénica de cualquiera de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, la cual comprende 2 o más proteínas estafilocócicas seleccionadas a partir de cuando menos 2 grupos diferentes seleccionados a partir de: cuando menos una proteína de enlace de componente extracelular estafilocócico o un fragmento de la misma, seleccionada a partir del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína de enlace de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de enlace de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, GehD de Lipasa, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de enlace de vitronectina, proteína de enlace de fibrinógeno, coagulasa, Fig, y MAP; cuando menos una proteína transportadora estafilocócica o un fragmento de la misma, seleccionada a partir del grupo que consiste en transportador ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportador de Mg2 + , SitC, y transportador ABC de Ni; cuando menos un regulador estafilocócico de virulencia, toxina, o un fragmento del mismo, seleccionado a partir del grupo que consiste en toxina alfa (Hla), mutante H35R de toxina alfa, proteína activadora de ARN III (RAP).

28. Un método para el tratamiento o la prevención de una infección o enfermedad por estafilococos, el cual comprende administrar a un paciente que sufra de, o que sea susceptible a, la enfermedad, una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.

29. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una infección o enfermedad por estafilococos.

30. El uso de una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en la elaboración de un medicamento para utilizarse en la terapia profiláctica o en la terapia de una infección o enfermedad por estafilococos.