JP2021506318A - 免疫原性組成物 - Google Patents

免疫原性組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2021506318A
JP2021506318A JP2020534492A JP2020534492A JP2021506318A JP 2021506318 A JP2021506318 A JP 2021506318A JP 2020534492 A JP2020534492 A JP 2020534492A JP 2020534492 A JP2020534492 A JP 2020534492A JP 2021506318 A JP2021506318 A JP 2021506318A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
amino acid
species
polypeptide
host cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2020534492A
Other languages
English (en)
Inventor
ファリドモアイヤー，アミレザ
マリエッタ ゲルバー，サビナ
マリエッタ ゲルバー，サビナ
ヨッヘン ケムラー，シュテファン
ヨッヘン ケムラー，シュテファン
Original Assignee
グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム, グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム filed Critical グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
Publication of JP2021506318A publication Critical patent/JP2021506318A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、グリコシル化部位コンセンサス配列を含有する、改変された黄色ブドウ球菌ClfAタンパク質を開示する。本発明はまた、改変されたClfAタンパク質及び抗原(例えば、黄色ブドウ球菌糖抗原)を含むコンジュゲートを開示し、抗原は、改変されたClfAタンパク質のアミノ酸残基に(直接的に又はリンカーを介して)連結されている。【選択図】なし

Description

本発明は、免疫原性組成物及びワクチン、それらの製造、並びに医薬におけるこのような組成物の使用の分野に関する。より具体的には、本発明は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来のポリペプチド、及びワクチン抗原としてのその使用、具体的には、糖抗原にコンジュゲートした担体タンパク質としての使用に関する。
黄色ブドウ球菌は、菌血症、心内膜炎、肺炎、及び創傷感染などの侵襲性ヒト感染症の主要な原因である。黄色ブドウ球菌は、抗生物質耐性を急速に生じさせ、一般的に使用される抗生物質、例えば、メチシリン、及びさらには最終手段であるバンコマイシンの抗生物質に対して耐性である菌株が出現している。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は病院で流行しており、地域関連MRSA株は世界的に広がっており、世界的に大きな課題となっている。
したがって、ブドウ球菌性疾患を予防するためのワクチンが緊急に必要とされている。臨床試験では、莢膜多糖(CPS)コンジュゲート、個々のタンパク質抗原、及びリポテイコ酸に対するモノクローナル抗体(mAbs)などのいくつかのワクチンが試験されている。しかしながら、いずれも様々な開発段階では失敗しており、現在までのところ、黄色ブドウ球菌に対するワクチンは市販されていない。
液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘発する黄色ブドウ球菌ワクチンは、現在、評価段階にあり、両方の付着因子を含むタンパク抗原、例えば、クランピング因子A(ClfA)及びCPSは、多成分ワクチンに含めるために検討されている重要な抗原である。
細菌の宿主細胞外マトリックス成分への付着は、細菌感染の重要な初期段階である。ClfAは、病原性に必要とされる重要な黄色ブドウ球菌付着因子であり、細菌が宿主防御機構を回避するのを助ける。ECM中のフィブリノーゲンに結合し、宿主組織の付着及びコロニー形成を助長し、さらに、フィブリノーゲンにおける細菌細胞の凝集及び被覆を引き起こし、これは、細菌上のオプソニンの沈着を障害することによって免疫回避を促進する。したがって、ClfAは、黄色ブドウ球菌多成分ワクチンに含まれる有望な抗原である。
黄色ブドウ球菌株の90%は、5型又は8型の莢膜多糖のいずれかを発現し、そのため、CP5及びCP8を含むワクチンは、循環する黄色ブドウ球菌株の大多数に対して防御する可能性がある。黄色ブドウ球菌莢膜多糖を含むワクチンは、ブドウ球菌に対する防御免疫応答を作り出すために使用されてきたが、CPS単独を含むワクチンは、十分に有効であることは証明されていない。シュードモナスエキソタンパク質A(StaphVAX-Nabi Biopharmaceuticals)にコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌5型及び8型の莢膜多糖のコンジュゲートを含むワクチンが臨床試験において試験されており、PhI及びIIにおいて安全性及び有効性が実証されたが、国際公開第WO03/61558号に記載されているように、PhIIIでは必要とされる評価項目を達成することができなかった。
黄色ブドウ球菌CPS及びClfA(Andersonら、2012年、Hum Vaccine Immunother 8巻: 1585〜1594頁)を含む多成分ワクチンが、PhIヒト試験で試験されている。ワクチンは、PhIにおいてオプソニン性抗CP抗体及び阻害性抗ClfA抗体を誘導し、現在、待機的脊椎固定術患者における予防的使用のためのPhIIb有効性試験で試験されている。
担体タンパク質としての緑膿菌(P. aeruginosa)EPA又は黄色ブドウ球菌ClfAを有する黄色ブドウ球菌CP8のバイオコンジュゲートは、国際公開第WO2015/082571号に記載されている。CP8-EPAバイオコンジュゲートは、ウサギにおいてオプソニン抗体を誘導することができ、CP8-EPAバイオコンジュゲートをマウスにワクチン接種すると、血清型8の黄色ブドウ球菌によって誘導される菌血症から保護された。したがって、CP8-ClfAバイオコンジュゲートは、黄色ブドウ球菌に対するワクチンに使用される可能性がある。
本発明は、PglBのグリコシル化部位を導入するために改変されたブドウ球菌ClfAタンパク質、及びそのバイオコンジュゲートを提供する。
したがって、本発明の一態様において、配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列、例えば配列番号4を含むか又はそれからなるポリペプチドであって、アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(X及びZは、独立してプロリンとは別の任意のアミノ酸である)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むという点で改変されているポリペプチドが提供される。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列は、配列番号3のアミノ酸残基313〜340の間の1つ以上のアミノ酸で、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている。
ある実施形態では、前記コンセンサス配列は、配列番号3におけるアミノ酸残基Q327、D329、P331及び/若しくはI337と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3のアミノ酸残基Q327、D329、P331、及び/若しくはI337と同等であるアミノ酸位置で置換されている。
ある実施形態では、前記コンセンサス配列は、配列番号3におけるアミノ酸残基Q327、D329、若しくはI337と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3のアミノ酸残基Q327、D329、P331、若しくはI337と同等であるアミノ酸位置で置換されている。
好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列は、配列番号3におけるアミノ酸残基I337と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において置換されている。
ある実施形態では、前記コンセンサス配列は、配列K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)を有し、XはQ(グルタミン)であり、ZはA(アラニン)である(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))。
ポリペプチドは、さらに、配列番号3のアミノ酸配列に関してP116からS及びY118からA(配列番号1の配列におけるP336及びY338位に対応する)、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列における同等の位置から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、配列番号4〜5若しくは10〜12を含み得る。
ポリペプチドは、N末端にさらなるセリン残基(例えば、配列番号6若しくは配列番号12)、及び/又はC末端にさらなる残基、例えば、Gly若しくはGly-Ser(例えば、配列番号32)を含み得る。
ポリペプチドは、宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムにタンパク質を方向付けることができるシグナル配列を含み得、任意選択的に前記シグナル配列は配列番号13〜20、好ましくは配列番号13から選択され、任意選択的に前記タンパク質は配列番号5又は11と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。
ポリペプチドは、ClfAタンパク質の精製に有用であるペプチドタグを含み得、任意選択的に前記ペプチドタグは6個のヒスチジン残基を含み、任意選択的に前記ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置し、任意選択的に前記ペプチドタグはリンカー、例えば、Gly又はGly-Serによって先行され、任意選択的に前記タンパク質は配列番号25、配列番号26又は配列番号27と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。
本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチドに連結されている抗原、好ましくは多糖抗原を含むコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明のポリペプチドをコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、糖に連結された、ポリペプチドを含む(又はそれからなる)バイオコンジュゲートを生産(生成)するプロセスが提供され、前記方法は、(i)タンパク質の生産に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記宿主細胞によって生産されたバイオコンジュゲートを単離することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明のプロセスによって生産されたバイオコンジュゲートが提供され、前記バイオコンジュゲートは、ポリペプチドに連結された糖を含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む免疫原性組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、ポリペプチド又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、本発明の免疫原性組成物を作製する方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防する方法が提供され、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、黄色ブドウ球菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法が提供され、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、対象における黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法が提供され、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬(薬剤)の製造における、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートが提供される。
黄色ブドウ球菌由来のクランピング因子におけるタンパク質ドメインの概要を示す図である。 非常にN末端(突然変異体1)又は非常にC末端(突然変異体30)のいずれかに導入されたグリコシル化部位の遺伝子座を示す、黄色ブドウ球菌クランピング因子ドメインN2及びN3(ClfAN2N3、PDB識別子1N67)の結晶構造を示す図である。 異なるClfAグリコサイト突然変異体バイオコンジュゲートの抗Hisウエスタンブロットを示す図である。 図３ａの続きである。 図３ｂの続きである。 図４ａの続きである。 異なるClfAグリコサイト突然変異体バイオコンジュゲートの抗CP8ウエスタンブロットを示す図である。 図５ａの続きである。 図５ｂの続きである。 図６ａの続きである。 CP8-ClfAN2N3突然変異体1(D244KDQNATK)バイオコンジュゲートの発現及び精製を示す図である。 CP8-ClfAN2N3突然変異体30(I557KDQNATK)バイオコンジュゲートの発現及び精製を示す図である。 グリコサイト突然変異体1と比較した、担体タンパク質ClfAN2N3グリコサイト突然変異体30との関連における黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲート生成のタンパク質安定性の改善を示す図である。 ClfAN2N3突然変異体30に対する異なるシグナル配列による生成収量への影響を示す図である。
図面の説明
図１：黄色ブドウ球菌由来のクランピング因子におけるタンパク質ドメインの概要を示す図である。図1は、黄色ブドウ球菌クランピング因子ClfAのドメイン構成の概略図である。フィブリノーゲン結合サブドメインN1-N2-N3を強調し、サブドメインN2に位置する解毒突然変異の位置と性質を示す。数字は、アミノ酸位置(各ドメインの開始点)を指す。SS=シグナル配列;N1-N3:フィブリノーゲン結合サブドメイン;R=セリン-アスパラギン酸ジペプチドリピート領域;W=細胞壁貫通領域;M=膜貫通領域。
図２：非常にN末端(突然変異体1)又は非常にC末端(突然変異体30)のいずれかに導入されたグリコシル化部位の遺伝子座を示す、黄色ブドウ球菌クランピング因子ドメインN2及びN3(ClfAN2N3、PDB識別子1N67)の結晶構造を示す図である。図2は、黄色ブドウ球菌クランピング因子ドメインN2N3(ClfAN2N3、Deivanayagamら、EMBO J.、2002年、PDB識別子1N67)の結晶構造を表し、試験された極端なN末端及びC末端グリコシル化部位A:非常にN末端にある部位(D244KDQNATK=突然変異体1)、及びB:非常にC末端にある部位(I557KDQNATK=突然変異体30)を示す。
図３、４：異なるClfAグリコサイト突然変異体バイオコンジュゲートの抗Hisウエスタンブロットを示す図である。陽性対照としてのD328KDQNRTK(プラスミド633)及びEPA-CP8を用いて、実施例1に記載される突然変異体1〜30のためのCP8-ClfAN2N3バイオコンジュゲート生成の抗Hisウエスタンブロット分析。レーン1:タンパク質マーカー(M)。ブロット:ウサギα-His 1:2000、ヤギα-マウス1:20,000。
図５、６：異なるClfAグリコサイト突然変異体バイオコンジュゲートの抗CP8ウエスタンブロットを示す図である。陽性対照としてのD328KDQNRTK(プラスミド633)及びEPA-CP8を用いた、実施例1に記載される突然変異体1〜30のためのCP8-ClfAN2N3バイオコンジュゲート生成の抗CP8ウエスタンブロット分析。ブロット:ウサギα-CP8-EPA-His 1:1000、ヤギα-ウサギ1:10000。
図７：CP8-ClfAN2N3突然変異体1(D244KDQNATK)バイオコンジュゲートの発現及び精製を示す図である。図7は、20Lバイオリアクター中の3つのプラスミドシステムから発現され、均質に精製された、CP8-ClfAN2N3突然変異体1の最終生成物の抗ClfA及び抗CP8ウエスタンブロット分析であるSDS-PAGE SimplyBlue SafeStainを示す。A) SimplyBlue Safe Stain、B) 抗ClfAN2N3ウエスタンブロット分析、C) 均一に精製されたCP8-ClfAN2N3 mut1(mut1)及び非グリコシル化ClfAN2N3 wt(U-wt)の抗CP8ウエスタンブロット。
図８：CP8-ClfAN2N3突然変異体30(I557KDQNATK)バイオコンジュゲートの発現及び精製を示す図である。図8は、20Lバイオリアクター中の1つのプラスミドシステムから発現され、均質に精製された、CP8-ClfAN2N3突然変異体30の最終生成物の抗ClfA及び抗CP8ウエスタンブロット分析であるSDS-PAGE SimplyBlue SafeStainを示す。A) SimplyBlue Safe Stain、及びB)抗ClfAN2N3ウエスタンブロット分析、並びにC) 均一に精製されたCP8-ClfAN2N3 mut30(mut30)及び非グリコシル化ClfAN2N3 mut30(U-mut30)の抗CP8ウエスタンブロット。
図９：グリコサイト突然変異体1と比較した、担体タンパク質ClfAN2N3グリコサイト突然変異体30との関連における黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲート生成のタンパク質安定性の改善を示す図である。3つのプラスミドシステムを用いたCP8-ClfAN2N3バイオコンジュゲート生成のウエスタンブロット分析は、グリコサイト突然変異体1(レーン2)と比較してグリコサイト突然変異体30(レーン3)のタンパク質分解が減少していることを示す。レーン1=タンパク質マーカー。
図１０：ClfAN2N3突然変異体30に対する異なるシグナル配列による生成収量への影響を示す図である。異なるシグナル配列:大腸菌(E. coli)ジスルフィドオキシドレダクターゼDsbAシグナル配列(DsbA)、S. フレキシネル(S. flexneri)鞭毛Pリングタンパク質シグナル配列(Flgl)、大腸菌易熱性エンテロトキシンIIB、B鎖シグナル配列(LTIIb)、大腸菌マルトース結合タンパク質MalEシグナル配列(MalE)、P. カロトボラム(P. carotovorum)ペクターゼリアーゼ2前駆体シグナル配列(PelB)、S. アガラクティエ(S. agalactiae)表面免疫原性タンパク質シグナル配列(SipA)、大腸菌トランスロケーションタンパク質シグナル配列(TolB)、大腸菌外膜タンパク質シグナル配列(OmpA)を用いて生成されたHRHRタグを有するClfA-CP8-ClfAN2N3突然変異体30の抗Hisウエスタンブロット。レーン1: PageRulerプレステインドタンパク質マーカー、レーンA: DsbAシグナル配列、レーンB: Flglシグナル配列、レーンC: LTIIbシグナル配列、レーンD: MalEシグナル配列、レーンE: PelBシグナル配列、レーンF: SipAシグナル配列、レーンG: TolBシグナル配列、レーンH: OmpAシグナル配列。
詳細な説明
専門用語
担体タンパク質:コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を作製するために抗原(例えば、糖抗原)に共有結合したタンパク質。担体タンパク質は、T細胞がコンジュゲートした抗原に対してT細胞性免疫を活性化する。
プロリン(プロ、P)とは別の任意のアミノ酸:アラニン(ala、A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、セリン(ser、S)、スレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、及びバリン(val、V)からなる群から選択されるアミノ酸を指す。
ClfA:黄色ブドウ球菌由来のクランピング因子A
CP:莢膜多糖。
LPS:リポ多糖。
wzy:多糖重合を触媒する酵素をコードする多糖ポリメラーゼ遺伝子。コードされた酵素は、オリゴ糖単位を非還元末端に転移し、グリコシド結合を形成する。
waaL:膜結合酵素をコードするO抗原リガーゼ遺伝子。コードされた酵素は、ウンデカプレニル-二リン酸(UPP)結合O抗原をリピドAコアオリゴ糖に転移し、リポ多糖を形成する。
Und-PP:ウンデカプレニルピロリン酸。
Und-P:ウンデカプレニルリン酸。
還元末端:オリゴ糖又は多糖の還元末端は、グリコシド結合に関与せず、したがって開鎖型に変換することができる遊離アノマー炭素を有する単糖である。
本明細書で使用される場合、用語「バイオコンジュゲート」とは、宿主細胞バックグラウンドで調製されたタンパク質(例えば、担体タンパク質)と抗原(例えば、糖)との間のコンジュゲートを指し、宿主細胞機構は、抗原をタンパク質に連結する(例えば、N結合)。通常、バイオコンジュゲートでは、多糖は、N-アセチルグルコサミンを介してアスパラギンに結合する。
本明細書で使用される場合、治療薬(例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン)を対象に投与する文脈において、用語「有効量」とは、予防効果及び/又は治療効果(複数可)を有する治療薬の量を指す。特定の実施形態では、「有効量」とは、以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療薬の量を指す:(i)細菌感染又はそれに関連する症状の重症度を減少又は軽減する、(ii)細菌感染又はそれに関連する症状の持続時間を減少させる、(iii)細菌感染又はそれに関連する症状の進行を予防する、(iv)細菌感染又はそれに関連する症状の退行を引き起こし、(v)細菌感染症又はそれに関連する症状の発症又は発病を予防する、(vi)細菌感染又はそれに関連する症状の再発を予防する、(vii)細菌感染に関連する臓器不全を減少させる、(viii)細菌感染を有する対象の入院を減少させる、(ix)細菌感染を有する対象の入院期間を減少させる、(x)細菌感染を有する対象の生存を増加させる、(xi)対象における細菌感染を除去する、(xii)対象における細菌複製を阻害又は減少させる、及び/又は(xiii)別の治療薬の予防効果又は治療効果(複数可)を増大又は改善する。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、動物、具体的には哺乳動物、例えば霊長類(例えば、ヒト)を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ドナーオリゴ糖又は多糖」とは、オリゴ糖又は多糖がそれから誘導されるオリゴ糖又は多糖を指す。ドナーオリゴ糖及び多糖は、本明細書で使用される場合、第1のリピート単位の還元末端にヘキソース単糖(例えば、グルコース)を含む。ドナーオリゴ糖又は多糖という用語の使用は、オリゴ糖又は多糖がインサイチュで改変されることを示唆することを意味しない。むしろ、ドナーオリゴ糖又は多糖という用語の使用は、野生型の状態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、PglB)活性の弱い基質であるか、又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、例えば、PglB)活性の基質ではないオリゴ糖又は多糖を指すことを意味する。ドナーオリゴ糖又は多糖の例としては、黄色ブドウ球菌CP5及びCP8を含む細菌由来のものが挙げられる。当業者は、オリゴ糖又は多糖が、第1のリピート単位の還元末端にヘキソース単糖(例えば、グルコース)を含むかどうか、したがって、このようなオリゴ糖又は多糖が、本明細書に包含されるドナーオリゴ糖又は多糖であるかどうかを容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ヘキソース単糖誘導体」とは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性の基質となり得るヘキソース単糖の誘導体を指す。一般的に、ヘキソース単糖誘導体は、2位にアセトアミド基を含む単糖を含む。例示的なヘキソース単糖誘導体には、GlcNAc、HexNAc、デオキシHexNAc、又は2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソースが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリッドオリゴ糖又は多糖」とは、第1のリピート単位の還元末端にヘキソースを含まないが、代わりに第1のリピート単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含む、操作されたオリゴ糖又は多糖を指す。
本明細書で使用される場合、2つのアミノ酸又は核酸配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、整列された場合、そのアミノ酸又は塩基のパーセンテージは、2つの配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性又は配列同一性は、当該技術分野において公知であるソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら、編集、1987年、Supplement 30)の7.7.18節に記載されているものを用いて決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティが12であり、ギャップ拡張ペナルティが2であり、BLOSUMマトリックスが62であるアフィンギャップサーチを用いて、Smith-Waterman相同性サーチアルゴリズムによって決定される。Smith-Waterman相同性サーチアルゴリズムは、Smith & Waterman (1981年) Adv. Appl. Math. 2巻: 482〜489頁に開示されている。任意の具体的な配列(例えば、具体的な配列番号)に対する同一性パーセンテージは、理想的には、その配列の全長にわたって計算される。異なる長さの2つの配列間の配列同一性パーセンテージは、好ましくは、より長い配列長にわたって計算される。
本明細書で使用される場合、用語「免疫原性断片」は、その断片に特異的な宿主動物、例えばヒトにおいて、体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘発することができる、全体よりも小さい抗原の一部である。タンパク質の断片は、当該技術分野において公知である技術を用いて、例えば、組換え的に、タンパク質分解消化によって、又は化学合成によって生成することができる。ポリペプチドの内部断片又は末端断片は、ポリペプチドをコードする核酸の一端(末端断片について)又は両端(内部断片について)から1つ以上のヌクレオチドを除去することによって生じさせることができる。典型的には、断片は、全長配列の少なくとも10、20、30、40又は50個の連続したアミノ酸を含む。しかしながら、断片はまた、長さが100個以上、200個以上、300個以上又は400個以上のアミノ酸であり得る。断片は、N末端及びC末端のいずれか又は両方から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40若しくは50個のアミノ酸を付加又は除去することによって容易に改変することができる。
本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、又は親水性にほとんど影響ないか又は全く影響がなく、免疫原性の低下をもたらさないで、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを伴う。例えば、これらは、以下の基:バリン、グリシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、及びフェニルアラニン、チロシン内の置換であり得る。ポリペプチドの配列に対する保存的アミノ酸改変(及びコードするヌクレオチドに対する対応する改変)は、親ポリペプチドのものと類似する機能的及び化学的特徴を有するポリペプチドを生成し得る。
本明細書で使用される場合、用語「欠失」は、タンパク質配列からの1つ以上のアミノ酸残基の除去である。典型的には、1〜6残基(例えば、1〜4残基)以下が、タンパク質分子内の任意の1つの部位で欠失される。
本明細書で使用される場合、用語「挿入」は、タンパク質配列中の1つ以上の非天然アミノ酸残基の付加である。典型的には、約1〜7残基(例えば、1〜4残基)以下が、タンパク質分子内の任意の1つの部位に挿入される。
タンパク質
クランピング因子A(ClfA)は、フィブリノーゲンγ鎖を結合する黄色ブドウ球菌接着タンパク質であり、ほとんどすべての黄色ブドウ球菌株に存在する。これは、重要な毒素因子であり、敗血症性関節炎及び心内膜炎の病因に寄与する。ClfAは、フィブリノーゲンのγ鎖のC末端に結合し、それによってフィブリノーゲン溶液中で細菌のクランピングを誘導することができる。黄色ブドウ球菌上でのClfAの発現は、マクロファージと好中球の両方による食作用を阻害する。好中球では、これは、フィブリノーゲン依存性とフィブリノーゲン非依存性の機構の両方に起因する。対照的に、血小板は、GPIIb/IIIaとの相互作用を介してClfAを発現する細菌によって活性化され、凝集をもたらす。これは、フィブリノーゲンが存在する場合に最も効率的に実行されるが、血小板活性化のためのフィブリノーゲン非依存性経路も存在する。
ClfAは、520アミノ酸のN末端Aドメイン(フィブリノーゲン結合領域)を含有し、3つの別々に折り畳まれたサブドメインN1、N2及びN3を含む。Aドメインに続いて、セリン-アスパラギン酸ジペプチドリピート領域、並びに細胞壁及び膜貫通領域があり、これは、細胞壁への選別酵素促進アンカーのためのLPDTGモチーフを含有する。
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列由来であり得、これは、免疫原性断片及び/又は配列番号1の変異体(例えば、配列番号3)である。
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、全長配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、少なくとも約60個、少なくとも約100個、少なくとも約300個、又は少なくとも約400個の連続するアミノ酸残基を含む配列番号1の免疫原性断片から誘導することができ、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。天然ClfAのフィブリノーゲン結合ドメインは、図1に示されるように、3つの別々に折り畳まれたサブドメインN1、N2及びN3からなることが公知である。これらのドメインは、これらのドメインの1つ以上を除去及び/又は改変することによって改変され得る。一実施形態では、配列番号1の断片1は、正確に又は少なくとも1つ、2つ又は3つのドメインを含有する。別の実施形態では、配列番号1の断片は、正確に又は少なくとも2つ又は3つのドメインを含有する。別の実施形態では、配列番号1の断片は、少なくとも2つのドメイン、好ましくはドメインN2及びN3を含有する。ある実施形態では、配列番号1の断片1は、配列番号1のN1(残基39〜220)のアミノ酸残基を含み得る(又はそれらからなり得る)。ある実施形態では、配列番号1の断片は、配列番号1のN2(残基221〜368)のアミノ酸残基を含み得る(又はそれらからなり得る)。ある実施形態では、配列番号1の断片は、配列番号1のN3(残基369〜560)2のアミノ酸残基を含み得る(又はそれらからなり得る)。ある実施形態では、配列番号1の断片は、配列番号1のN1N2N3(残基39〜560)のアミノ酸残基(配列番号2)を含み得る(又はそれらからなり得る)。好ましい実施形態では、配列番号1の断片は、配列番号1のN2N3(残基221〜560)のアミノ酸残基(配列番号3)を含み得る(又はそれらからなり得る)。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ClfAのサブドメインN1、N2及びN3(配列番号2)、又は配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含み得る(又はそれらからなり得る)。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、サブドメインN2及びN3(配列番号3)、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含み得る(又はそれらからなり得る)。
したがって、本発明は、配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含む(又はそれからなる)ポリペプチドであって、アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むという点で改変されているポリペプチドを提供する。これらの配列は、クローニング目的のためにN末端セリンを付加することによって改変され得る。配列は、さらに、解毒突然変異、例えば、本明細書に記載される解毒突然変異のいずれか1つ又はすべてを含むように改変され得る。
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列に由来し得、これは、1個以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変されている配列番号1の変異体である。アミノ酸置換は、保存的であるか又は非保存的であり得る。1つの態様では、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加又はそれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、単一の変異体において組み合わせることができる。ある実施形態では、本発明の改変されたClfAタンパク質は、1〜10、5〜10、1〜5、1〜3、1〜2又は1個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、又は付加される変異体に由来し得る。例えば、本発明のポリペプチドは、さらなるN末端セリンを含むという点において、配列番号3の変異体(例えば、配列番号12)であるアミノ酸配列から誘導することができる。
ある実施形態では、本発明は、B細胞エピトープ又はT細胞エピトープを含む断片及び/又は変異体を含む。このようなエピトープは、例えば、PSIPREDプログラム(David Jones、Brunel Bioinformatics Group、Dept. Biological Sciences、Brunel University、Uxbridge UB8 3PH、UKによる)、及びJameson及びWolf (CABIOS 4巻:181〜186頁[1988年])に記載される方法に基づいて計算される抗原性指標を用いて、2D構造予測の組み合わせを用いて予測することができる。
用語「ポリペプチド」とは、ClfAアミノ酸配列(例えば、配列番号3のClfAアミノ酸配列を有するか又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を有する)を指し、ClfAアミノ酸配列は、野生型ClfAアミノ酸配列であり得、これは、1つ以上のアミノ酸の付加、置換又は欠失(例えば、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)から選択されるコンセンサス配列(複数可)の付加によるか、又はD/E-X-N-Z-S/T(配列番号22)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号23)から選択されるコンセンサス配列による1つ以上のアミノ酸の置換による)によって改変されている。ポリペプチドはまた、さらなる改変(付加、置換、欠失)、並びに1つ以上のコンセンサス配列(複数可)の付加又は置換を含み得る。例えば、ClfAタンパク質は、以下に記載されるように、フィブリノーゲン結合を減少又は排除するための解毒突然変異を含有し得、野生型ClfAタンパク質のシグナル配列は、欠失又は代替シグナル配列で置換され得、及び/又はペプチドタグは付加され得る。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、天然に存在しないClfAタンパク質であり得る。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号10の配列を含む。
本発明の実施形態では、ClfAアミノ酸配列(例えば、配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるClfAアミノ酸配列を有する)は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))コンセンサス配列によって置換されている。例えば、ClfAアミノ酸配列(例えば、配列番号3)における単一のアミノ酸は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))コンセンサス配列で置き換えられ得る。あるいは、ClfAアミノ酸配列(例えば、配列番号3、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるClfAアミノ酸配列)中の2、3、4、5、6又は7個のアミノ酸は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))コンセンサス配列で置き換えられ得る。
D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)から選択されるコンセンサス配列の導入は、ポリペプチドをグリコシル化し得る。したがって、本発明はまた、ポリペプチドがグリコシル化された、本発明のポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、ClfAアミノ酸配列の特定の領域、例えば、タンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はタンパク質の基部におけるジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。本発明のある態様では、コンセンサス配列(複数可)の位置は、改善されたグリコシル化、例えば、収率の増加を提供する。ある実施形態では、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))から選択されるコンセンサス配列(複数可)は、C末端の改変されたClfAアミノ酸配列のC末端に、例えば、C末端から25アミノ酸以下の位置に配置される。ある実施形態では、コンセンサス配列は、配列番号1の557位に対応するアミノ酸と置換される(例えば、配列番号7〜12)。
ある実施形態では、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))から選択されるコンセンサス配列は、配列番号1の1つ以上のアミノ酸残基533-560(例えば、1つ以上のアミノ酸残基(複数可)550-560の代わりに、又はアミノ酸残基Q547、P549、P551若しくはI557、好ましくはI557の代わりに)、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列中の同等の位置において(例えば、配列番号3のアミノ酸配列中の同等の位置において)又は配列番号1と少なくとも少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列中の同等の位置において(例えば、配列番号3のアミノ酸配列中の同等の位置、すなわち、Q327、D329、P331又はI337;例えば、配列番号7-12において)付加若しくは置換されている。
「アミノ酸...の間」(例えば、「アミノ酸533-560の間」)への言及は、アミノ酸配列のN末端から連続的に数えるアミノ酸番号を指し、例えば、「配列番号1のアミノ酸533-560...の間」への言及は、533番目と560番目のアミノ酸の両方を含む、配列番号1の533番目と560番目のアミノ酸の間のアミノ酸配列における位置を指すことは、当業者は理解される。したがって、「D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))から選択されるコンセンサス配列が、アミノ酸残基533-560の間の1つ以上のアミノ酸で付加され又はそれと置換されている」実施形態では、コンセンサス配列は、配列番号1のアミノ酸番号533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559若しくは560のいずれか1つ(又はそれ以上)で付加され又はそれと置換されている場合がある。当業者は、ClfAアミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列、又はその断片、例えば、配列番号3若しくは配列番号4である場合、「アミノ酸間...」への言及は、この配列が、2つの配列間の配列同一性を最大限にするために(配列アラインメントツールは、Clustal Omega(www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)MUSCLE(www(.)ebi(.)ac(.)uk)又はT-コーヒー(www(.)tcoffee(.)org)に限定されないことを理解する。一態様では、配列アラインメントツールは、Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)である。例えば、配列番号1の前記アミノ酸番号は、配列番号3及び4のアミノ酸番号313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339又は340に対応する。
配列番号1の変異体及び/又は断片からのアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異された配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違を導くことができるが、しかしながら、突然変異された配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、したがって、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。
ある実施形態では、本発明の改変されたタンパク質は、少なくとも1、2、3若しくは4個のD/E-X-N-X-S/Tコンセンサス配列、又は正確には1、2、3、4、5、若しくは6個のD/E-X-N-X-S/Tコンセンサス配列を含む。ある実施形態では、本発明の改変されたタンパク質は、少なくとも1、2、3若しくは4個のD/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)コンセンサス配列、又は正確には1、2、3、4、5、若しくは6個のD/E-X-N-X-S/T(配列番号22)コンセンサス配列を含む。ある実施形態では、本発明の改変されたタンパク質は、少なくとも1、2、3若しくは4個のK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)コンセンサス配列、又は正確には1、2、3、4、5、若しくは6個のK-D-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)コンセンサス配列を含む。ある実施形態では、本発明の改変されたタンパク質は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)から選択される単一のコンセンサス配列を含む。ある実施形態では、コンセンサス配列は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)であり、XはQ(グルタミン)であり、ZはA(アラニン)であり、例えば、D-Q-N-A-Tである。ある実施形態では、コンセンサス配列は、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)であり、XはQ(グルタミン)であり、ZはR(アルギニン)であり、例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号24)である。好ましい実施形態では、コンセンサス配列は、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)であり、XはQ(グルタミン)であり、ZはA(アラニン)であり、例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23)である。
ClfAのフィブリノーゲン結合活性は、ClfAが毒性因子として作用するのに必要であるため、ClfAタンパク質を改変して、インビボで投与され得るために、フィブリノーゲン結合活性を減少又は排除することができる。ポリペプチドは、国際公開第WO2011/007004号に記載される突然変異の1つ、例えば、配列番号1の残基P336及びY338(配列番号3の残基P116及びY118)に対応するアミノ酸の1つ又は好ましくは両方における突然変異を有し得、例えば、P336S及び/又はY338Aである。例示的な配列は、配列番号4-6、10-12及び25-27の配列である。
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、ポリペプチドの単離及び/又は同定を可能にするアミノ酸の配列をさらに含む。例えば、本発明のポリペプチドにタグを付加することは、そのタンパク質の精製、したがって、タグ化された、改変されたClfAタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製において有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグ(例えば、ヘキサヒスチジンタグ、又は6×Hisタグ)、FLAG-TAG及びHAタグを含む。一実施形態では、タグは、ヘキサヒスチジンタグである。ある種の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、取り外し可能であり、例えば、タンパク質が精製された後に、もはや必要とされなくなった場合、例えば、化学剤によって又は酵素的手段によって除去される。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に6個のヒスチジン残基を含む。一態様では、本発明の改変されたClfAタンパク質は、配列番号4、5又は6の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含み(又はそれらからなり)、前記アミノ酸配列は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)コンセンサス配列(例えば、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)又はK-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))、及びペプチドタグ(例えば、アミノ酸配列のC末端の6個のヒスチジン残基)を含む。任意選択的に、本発明のポリペプチドは、配列番号25、25又は27と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムにClfAタンパク質を指向することができるシグナル配列を含む。特定の実施形態では、シグナル配列は、大腸菌フラジェリン(FlgI)[MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号13)]由来である。他の実施形態では、シグナル配列は、大腸菌外膜ポーリンA(OmpA)[MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(配列番号14)]、大腸菌マルトース結合タンパク質(MalE)[MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(配列番号15)]、エルウィニア・カロトボランス(Erwinia carotovorans)ペクターゼリアーゼ(PelB)[MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(配列番号16)]、易熱性大腸菌エンテロトキシンLTIIb[MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA(配列番号17)]、大腸菌DsbA[MKKIWLALAGLVLAFSASA(配列番号18)]、TolB[MKQALRVAFGFLILWASVLHA(配列番号19)]又はSipA[MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS(配列番号20)]由来である。ある実施形態では、シグナル配列は、配列番号13〜20と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。一態様では、シグナル配列は、大腸菌フラジェリンシグナル配列(FlgI)[MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号13)]と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。シグナル配列を含む、例示的な改変されたClfA配列は、配列番号5、11及び26である。
ある実施形態では、例えば、配列番号5及び11のように、シグナル配列と成熟タンパク質の配列の開始との間に、さらなるアミノ酸残基(例えば、セリン又はアラニン)が付加される。このような残基は、リーダー配列のより効率的な切断をもたらすという利点を有する。
一態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含み(又はそれらからなり)、前記アミノ酸配列は、アミノ酸置換P116からS及びY118からA、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)コンセンサス配列(例えば、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)又はK-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))を含み、前記コンセンサス配列は、好ましくは、アミノ酸残基I337、アミノ酸配列のC末端の6-Hisタグ、及び任意選択的にシグナル配列、好ましくはシグナル配列のN末端のFlgLシグナル配列(配列番号:13)、任意選択的に、続くさらなるセリン残基と置換される。ある実施形態では、本発明の改変されたClfAタンパク質は、配列番号10〜12又は配列番号25-27から選択されるアミノ酸配列と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、本発明は、配列番号10〜12又は配列番号25-27から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば、配列番号10-12又は25-26のいずれか1つと少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。例えば、配列番号10-12又は25-27のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。このようなポリヌクレオチドを含むベクターは、本発明のさらなる態様である。
コンジュゲート
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む(又はそれからなる)コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を提供し、ポリペプチドは、例えば、抗原、好ましくは多糖又はオリゴ糖抗原に共有結合で連結されている。
ある実施形態では、コンジュゲートは、抗原に共有結合で連結された、配列番号4〜12又は25〜27の配列と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する、本発明のポリペプチドを含む(又はそれからなる)コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を含み、抗原は、ポリペプチドのアミノ酸残基に(直接的に又はリンカーを介して)連結されている。
ある実施形態では、ポリペプチドは、化学的コンジュゲーション法を用いて得ることができる化学的連結を介して、抗原に共有結合で連結されている(すなわち、コンジュゲートは、化学的コンジュゲーションによって生成される)。
ある実施形態では、化学的コンジュゲーション法は、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイスクシンイミド化学からなる群から選択される。コンジュゲートは、米国特許出願公開第2007/10184072号(Hausdorff)、米国特許第4,365,170号(Jennings)及び米国特許第4,673,574号(Anderson)に記載される直接還元アミノ化法によって調製することができる。他の方法は、欧州特許出願公開第0161188号、欧州特許出願公開第208375号及び欧州特許出願公開第0477508号に記載されている。あるいは、コンジュゲーション法は、シアン酸エステルを形成するために、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)による糖の活性化に依存し得る。このようなコンジュゲートは、PCT出願公開第WO93/15760号、ユニフォームドサービス大学(Uniformed Services University)、並びに同第WO95/08348号及び同第WO96/29094号に記載されている。また、Chu C.ら、Infect. Immunity、1983年 245〜256頁を参照されたい。
一般的に、ポリペプチド上の次のタイプの化学基をカップリング/コンジュゲーションに用いることができる。
A)カルボキシル(例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を介する)。一実施形態では、この基は、直接糖上のアミノ基に、又はカルボジイミド化学、例えばEDACを有するリンカー上のアミノ基に連結される。
B)アミノ基(例えば、リジンを介する)。一実施形態では、この基は、直接糖上のカルボキシル基に、又はカルボジイミド化学、例えばEDACを有するリンカー上のカルボキシル基に連結される。別の実施形態では、この基は、直接糖上の、CDAP若しくはCNBrで活性化されたヒドロキシル基に又はリンカー上のこのような基に、アルデヒド基を有する糖若しくはリンカーに、スクシンイミドエステル基を有する糖又はリンカーに結合される。
C)スルフィドリル(例えば、システインを介する)。一実施形態では、この基は、ブロモ若しくはクロロアセチル化された糖、又はマレイミド化学を有するリンカーに連結される。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
D)ヒドロキシル基(例えば、チロシンを介する)。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
E)イミダゾリル基(例えば、ヒスチジンを介する)。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
F)グアニジル基(例えば、アルギニンを介する)。
G)インドリル基(例えば、トリプトファンを介する)。
糖については、一般的に、以下の基:OH、COOH又はNH2がカップリングに使用することができる。アルデヒド基、例えば、過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などが、異なる処置後に生じ得る。
直接的カップリングアプローチ:
糖-OH+CNBr又はCDAP----->シアン酸エステル+NH2-タンパク質---->コンジュゲート
糖-アルデヒド+NH2-タンパク質---->シッフ塩基+NaCNBH3---->コンジュゲート
糖-COOH+NH2-タンパク質+EDAC---->コンジュゲート
糖-NH2+COOH-タンパク質+EDAC---->コンジュゲート
スペーサー(リンカー)を介した間接的カップリングアプローチ:
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----NH2---->糖----NH2+COOH-タンパク質+EDAC----->コンジュゲート
糖-OH+CNBr又はCDAP---->シアン酸エステル+NH2-----SH----->糖----SH+SH-タンパク質(露出したシステインを有する天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾(改変)後に得られたタンパク質)-----糖-S-S-タンパク質
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----SH------->糖----SH+マレイミド-タンパク質(アミノ基の修飾(改変))---->コンジュゲート
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2-----SH--->糖-SH+ハロアセチル化タンパク質---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2-----NH2--->糖------NH2+EDAC+COOH-タンパク質---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+SH-タンパク質(露出したシステインを有する天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾(改変)後に得られたタンパク質)----->糖-S-S-タンパク質
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+マレイミド-タンパク質(アミノ基の修飾(改変))---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2----SH--->糖-SH+ハロアセチル化タンパク---->コンジュゲート
糖-アルデヒド+NH2-----NH2---->糖---NH2+EDAC+COOH-タンパク質---->コンジュゲート
注釈:上記のEDACの代わりに、任意の適切なカルボジイミドを使用することができる。
ある実施形態では、抗原は、ポリペプチドに直接連結されている。
ある実施形態では、抗原は、リンカーを介して改変されたポリペプチドに結合される。任意選択的に、リンカーは、4〜12個の炭素原子を有するリンカー、二官能性リンカー、末端に1又は2個の反応性アミノ基を含有するリンカー、B-プロピオンアミド、ニトロフェニル-エチルアミン、ハロアシルハライド、6-アミノカプロン酸及びADHからなる群から選択される。したがって、活性化された糖は、ポリペプチド上のアミノ基に直接又はスペーサー(リンカー)基を介してカップリングされ得る。例えば、スペーサーは、シスタミン又はシステアミンであり得、マレイミド活性化された、ポリペプチド(例えば、GMBS(4-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる)又はハロアセチル化された、ポリペプチド(例えば、SIAB(スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノ安息香酸)、又はSIA(スクシンイミジルヨード酢酸)、又はSBAP(スクシンイミジル-3-(ブロモアセトアミド)プロピオン酸)を用いる)との反応後に得られるチオエーテル連結を介して、改変されたClfAにカップリンさせることができるチオール化された多糖を得ることができた。ある実施形態では、シアン酸エステル(任意選択的にCDAP化学によって作製される)は、ヘキサンジアミン又はADH(アジピン酸ジヒドラジド)とカップリングされ、アミノ誘導体化された糖は、カルボジイミド(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC又はEDC))化学を用いて、改変されたClfAタンパク質上のカルボキシル基を介して、ポリペプチドにコンジュゲートされる。このようなコンジュゲートは、PCT出願公開第WO93/15760号、ユニフォームドサービス大学(Uniformed Services University)、並びに同第WO95/08348号及び同第WO96/29094号に記載されている。
ある実施形態では、抗原が連結された、ポリペプチドのアミノ酸残基は、アスパラギン残基ではなく、この場合、コンジュゲートは、典型的には、化学的コンジュゲーションによって生成される。ある実施形態では、抗原が連結された、ポリペプチド上のアミノ酸残基は、Ala、Arg、Asp、Cys、Gly、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、及びValからなる群から選択される。任意選択的に、アミノ酸は、末端アミン基を含有するアミノ酸、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、チロシン、ヒスチジン又はトリプトファンである。任意選択的に、抗原は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファンから選択されるポリペプチド上のアミノ酸に共有結合で連結されている。好ましくは、抗原はアスパラギン残基に連結される。
ある実施形態では、抗原が連結された、ポリペプチド上のアミノ酸残基は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)コンセンサス配列の一部ではない。ある実施形態では、抗原が連結された、ポリペプチド上のアミノ酸残基は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)コンセンサス配列中のアスパラギン残基ではない。
あるいは、別の実施形態では、抗原は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えば、アスパラギン)から選択される、ポリペプチド上のアミノ酸に連結されている。別の実施形態では、抗原が連結された、ポリペプチド上のアミノ酸残基は、アスパラギン残基である。別の実施形態では、抗原が結合された、ポリペプチド上のアミノ酸残基は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)コンセンサス配列の一部(例えば、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)コンセンサス配列中のアスパラギン)である。
多糖抗原
ある実施形態では、本発明のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)中の抗原の1つは、糖、例えば、細菌莢膜糖、細菌リポ多糖又は細菌オリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、細菌莢膜糖である。
糖は、黄色ブドウ球菌5型莢膜糖、黄色ブドウ球菌8型莢膜糖、髄膜炎菌(N. meningitidis)血清群A莢膜糖(MenA)、髄膜炎菌血清群C莢膜糖(MenC)、髄膜炎菌血清群Y莢膜糖(MenY)、N髄膜炎菌血清群W莢膜糖(MenW)、インフルエンザ菌(H. influenzae)b型莢膜糖(Hib)、B群連鎖球菌I群莢膜糖、B群連鎖球菌II群莢膜糖、B群連鎖球菌III群莢膜糖、B群連鎖球菌IV群莢膜糖、B型連鎖球菌V群莢膜糖、チフス菌(Salmonella typhi)由来のVi糖、髄膜炎菌LPS(例えば、L3及び/又はL2)、カタラーリス菌(M. catarrhalis)LPS、インフルエンザ菌LPS、赤痢菌(Shigella)O抗原、緑膿菌O抗原、大腸菌O抗原又は肺炎連鎖球菌莢膜多糖からなる群から選択され得る。
ある実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌由来の細菌莢膜糖である。黄色ブドウ球菌由来の細菌莢膜糖は、黄色ブドウ球菌血清型5又は8の莢膜糖から選択され得る。例えば、抗原は、血清型8由来の黄色ブドウ球菌莢膜糖であり得る。
本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌由来の細菌莢膜糖のリピート単位である。本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型5又は8由来の細菌莢膜糖のリピート単位を含む。
本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型8由来の細菌莢膜糖のリピート単位を含む。本発明の実施形態では、抗原は、以下を含む:
式中、「n」は任意の整数であるが、好ましくは以下に定義されるものである(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型5由来の細菌莢膜糖のリピート単位を含む。本発明の実施形態では、抗原は、以下を含む:
式中、「n」は任意の整数であるが、好ましくは以下に定義されるものである(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
ある実施形態では、抗原は、多糖又はオリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、2個以上の単糖、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の単糖を含む。ある実施形態では、抗原は、20、15、12、10、9又は8個以下の単糖を含有するオリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10又は5個以下の単糖を含有するオリゴ糖である。
宿主細胞
本発明はまた、以下:
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明のポリペプチドをコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
含む宿主細胞を提供する。
本発明のバイオコンジュゲートを生成するために使用することができる宿主細胞には、古細菌、原核生物宿主細胞、及び真核生物宿主細胞が含まれる。本発明のバイオコンジュゲートの生成に使用するための例示的な原核宿主細胞には、限定されないが、エシェリキア属(Escherichia)種、シゲラ属(Shigella)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属(Salmonella)種、エルシニア属(Yersinia)種、ラクトコッカス属(Lactococcus)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)種、バチルス属(Bacillus)種、及びクロストリジウム属(Clostridium)種が挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。
ある実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートを生成するために使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、1つ以上の担体タンパク質をコードする異種核酸、及び/又は1つ以上のタンパク質をコードする異種核酸、例えば、1つ以上のタンパク質をコードする遺伝子をコードする異種核酸を含むように操作される。特定の実施形態では、グリコシル化経路(例えば、原核生物及び/又は真核生物のグリコシル化経路)に関与するタンパク質をコードする異種核酸は、本発明の宿主細胞に導入され得る。このような核酸は、限定されないが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを含むタンパク質をコードし得る。異種核酸(例えば、担体タンパク質をコードする核酸、及び/又は他のタンパク質、例えば、グリコシル化に関与するタンパク質をコードする核酸)は、方法、例えば、エレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、天然の形質転換、ファージ形質導入、及びコンジュゲーションを用いて本発明の宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態では、異種核酸は、プラスミドを用いて本発明の宿主細胞に導入され、例えば、異種核酸は、プラスミド(例えば、発現ベクター)によって宿主細胞内で発現される。別の特定の実施形態では、異種核酸は、国際特許出願第PCT/EP2013/068737号(WO14/037585号として公開)に記載される挿入方法を用いて、本発明の宿主細胞に導入される。
したがって、本発明はまた、以下:
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明のポリペプチドをコードする核酸、
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸、及び
vi)フリッパーゼ(例えば、wxy)をコードする核酸
を含む宿主細胞を提供する。
ある実施形態では、さらなる改変は、本発明の宿主細胞に(例えば、組換え技術を用いて)を導入することができる。例えば、おそらく競合又は干渉するグリコシル化経路の一部を形成する(例えば、宿主細胞に組換え的に導入される、グリコシル化に関与する1つ以上の異種遺伝子と競合又は干渉する)タンパク質をコードする宿主細胞核酸(例えば、遺伝子)は、宿主細胞バックグラウンド(ゲノム)において、それらを不活性/機能不全にさせる方法で欠失又は改変され得る(すなわち、欠失/改変された宿主細胞核酸は、機能性タンパク質をコードしないか、又はタンパク質を全くコードしない)。ある実施形態では、核酸が本発明の宿主細胞のゲノムから欠失された場合、それらは、望ましい配列、例えば、糖タンパク質生成に有用である配列で置き換えられる。
宿主細胞において欠失され得る(及び、いくつかの場合では、他の所望の核酸配列と置き換えられ得る)例示的な遺伝子には、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、例えば、waaL(例えば、Feldmanら、2005年、PNAS USA 102巻:3016〜3021頁を参照されたい)、リピドAコア生合成クラスター(waa)、ガラクトースクラスター(gal)、アラビノースクラスター(ara)、コラン酸クラスター(wc)、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-ピロリン酸生合成遺伝子(例えば、uppS(ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ)、uppP(ウンデカプレニルジホスファターゼ))、Und-Pリサイクル遺伝子、ヌクレオチド活性化糖生合成に関与する代謝酵素、腸内細菌共通抗原クラスター、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原修飾(改変)クラスターが含まれる。
このような改変された原核生物宿主細胞は、抗原、例えば、本発明のポリペプチドに結合した糖抗原を含む生体コンジュゲートを生成することができる酵素をコードする核酸を含む。このような宿主細胞は、糖抗原の生成に特異的な核酸を自然に発現することができ、又は宿主細胞は、このような核酸を発現するように作製することができる。すなわち、ある種の実施形態では、前記核酸は、宿主細胞に対して異種である。ある種の実施形態では、糖抗原の生成に特異的な1つ以上の前記核酸は、宿主細胞に対して異種であり、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ある種の実施形態では、本発明の宿主細胞は、タンパク質のN-グリコシル化において活性な追加の酵素をコードする核酸を含み、例えば、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸及び/又は他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の核酸をさらに含む。
莢膜多糖遺伝子クラスターを含む核酸配列は、本発明の宿主細胞に挿入され得る。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞に挿入される莢膜多糖遺伝子クラスターは、大腸菌株、ブドウ球菌株(例えば、黄色ブドウ球菌)、連鎖球菌株(例えば、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌(S. pyrogenes)、S. アガラクティエ(S. agalacticae))、又はバークホルデリア菌株(例えば、鼻疽菌(B. mallei)、類鼻疽菌(B. pseudomallei)、バークホルデリア・タイランデンシス(B. thailandensis))由来の莢膜多糖遺伝子クラスターである。バイオコンジュゲートを生成することができるこのような宿主細胞を作製する方法の開示は、国際公開第WO06/119987号、同第WO09/104074号、同第WO11/62615号、同第WO11/138361号、同第WO14/57109号、同第WO14/72405号、及び同第WO16/20499号に見出される。
ある実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞中のプラスミドに改変されたClfAタンパク質をコードする核酸を含む。
グリコシル化機構
本発明の宿主細胞は、ハイブリッドオリゴ糖及び/又は多糖を生成することができる遺伝子機構(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ)をコードする核酸、並びに抗原を本発明のポリペプチドに連結することができる遺伝子機構を含み、及び/又は含むように改変することができる。
黄色ブドウ球菌莢膜多糖は、グラム陰性菌におけるO多糖合成のポリメラーゼ依存性経路と相同性を共有する保存された経路によって、細菌膜担体脂質のウンデカプレニルピロリン酸にアセンブルされる。O抗原のアセンブルは、DPドナーからウンデカプレニルリン酸に、糖リン酸が転移することによって開始される。脂質連結O抗原は、異なるグリコシルトランスフェラーゼの連続的な作用によって、内膜の細胞質側でアセンブルされる。次に、糖脂質は、ペリプラズム腔に反転され、重合される。O抗原リガーゼWaaLをオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBで置き換えることによって、重合したO抗原は、脂質Aコアというよりはむしろ、タンパク質担体に移すことができる。
グリコシルトランスフェラーゼ
本発明の宿主細胞は、オリゴ糖又は多糖のリピート単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。ある実施形態では、前記リピート単位は、還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖のリピート単位は、還元末端にヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖のリピート単位に由来する。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み得る。一態様では、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の遺伝子に対して異種である。前記グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属(Aeromonas)種、フランシセラ属(Francisella)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、プロテウス属(Proteus)種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属(Listeria)種、又はカンピロバクター属(Campylobacter)種由来であり得る。特定の実施形態では、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、wecAであり、任意選択的に大腸菌由来のwecAである(wecAは、UDP-GlcNAcからGlcNAcをUndP上にアセンブルさせることができる)。ある実施形態では、ヘキソース単糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノトール、フコース及びマンノース(例えば、ガラクトース)からなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み得る。特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、シゲラ・ボイディ(Shigella boyedii)由来のガラクトシルトランスフェラーゼ(wfeD)である。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)である。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。ガルフトランスフェラーゼ、例えば、wfdK及びwbeYは、Galf(ガラクトフラノース)をUDP-Galfから-GlcNAc-P-P-ウンデカカプレニルに転移することができる。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。
ある実施形態では、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ(wciP)、例えば、大腸菌O21由来のwciPを含む。
一実施形態では、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1のリピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1のリピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、グルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)、例えば、大腸菌O21由来のwciQを含む。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8遺伝子クラスターから選択されるオリゴ糖又は多糖のリピート単位を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼを含む。特定の実施形態では、オリゴ糖又は多糖のリピート単位を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5遺伝子クラスター由来である。黄色ブドウ球菌CP5及びCP8は、緑膿菌O11抗原合成遺伝子と類似の構造を有し、そのため、これらの遺伝子を大腸菌単糖合成遺伝子と組み合わせて、リピート三糖単位からなるウンデカプレニルピロリン酸連結されたCP5又はCP8ポリマーを合成することができる。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapKを含むCP5又はCP8糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む。任意選択的に、本発明の宿主細胞はまた、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capPを含む。あるいは、本発明の宿主細胞はまた緑膿菌O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB、wecCを含む。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapKを含むCP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む。任意選択的に、本発明の宿主細胞はまた、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capPを含む。あるいは、本発明の宿主細胞はまた、緑膿菌O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB、wecCを含む。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼを含み、このグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ
N-結合タンパク質のグリコシル化-標的タンパク質のポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加-は、真核生物の小胞体で起こる翻訳後修飾の最も一般的なタイプである。このプロセスは、小胞体内の保存配列Asn-X-Ser/Thr(Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸である)内の新生タンパク質のアスパラギン残基に、脂質担体(ドリコールリン酸)から予めアセンブルしたオリゴ糖の転移に関与する酵素オリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体(OST)によって達成される。
細菌、食物媒介性病原体カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)はまた、それ自身のグリコシル化機構を有するという事実に起因して、そのタンパク質をN-グリコシル化し得ることが示されている(Wackerら、Science、2002年、298巻(5599号):1790〜3頁)。この反応に関与する機構は、「pgl」(タンパク質のグリコシル化に関して)と呼ばれるクラスターによってコードされる。
C.ジェジュニのグリコシル化機構は、大腸菌に伝達され、大腸菌細胞によって発現される組換えタンパク質のグリコシル化を可能にする。従前の研究は、N-グリコシル化を行うことができる大腸菌株を生じさせる方法を実証している(例えば、Wackerら、Science、2002年、298巻(5599号):1790〜3頁; Nita-Lazarら、Glycobiology、2005年、15巻(4号):361〜7頁; Feldmanら、Proc Natl Acad Sci U S A、2005年、102巻(8号):3016〜21頁; Kowarikら、EMBO J. 2006年、25巻(9号):1957〜66頁; Wackerら、Proc Natl Acad Sci U S A、2006年、103巻(18号):7088〜93頁;国際特許出願公開第WO2003/074687号、同第WO2006/119987号、同第WO2009/104074号、同第WO/2011/06261号、及び同第WO2011/138361号を参照されたい)。最適化された特性を有するPglB突然変異体は、国際公開第WO2016/107818号に記載される。好ましい突然変異体は、実施例に記載されているように、PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669Vである。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、N-グリコシル化コンセンサスモチーフ、例えばAsn-X-Ser(Thr)(Xは、Proを除く任意のアミノ酸であり得る)又はAsp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(X及びZは、Proを除く任意の天然アミノ酸から独立して選択される)を含む新生ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に、脂質結合されたオリゴ糖を転移させる(国際公開第WO2006/119987号を参照されたい)。例えば、国際公開第WO2003/074687号及び同第WO2006/119987号を参照されたい。これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞に対して天然であり得、又は上記される遺伝学的アプローチを用いて宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼはカンピロバクター由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。別の特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(すなわち、pglB、例えば、Wackerら、2002年, Science 298巻:1790〜1793頁、また、例えば、NCBI Gene ID: 3231775、UniProtアクセッション番号O86154を参照されたい)である。別の特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである(例えば、NCBI Gene ID: 7410986を参照されたい)。
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする前記核酸配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする前記核酸配列は、プラスミド媒介性である。
別の特定の実施形態では、本明細書では、(i)黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖クラスターに由来するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記グリコシルトランスフェラーゼは前記宿主細胞のゲノムに組み込まれるグリコシルトランスフェラーゼ、(ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする核酸であって、前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸はプラスミド媒介性であり、及び/又は宿主細胞のゲノムに組み込まれる核酸、並びに(iii)本発明のポリペプチドであって、前記ポリペプチドはプラスミド媒介性であるか又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるポリペプチドを含む、改変された原核宿主細胞が提供される。また、(i)黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖クラスターに由来するグリコシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のゲノムに組み込み、(ii)プラスミド媒介性であり及び/又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする1つ以上の核酸を宿主細胞に組み込み、並びに(iii)プラスミド媒介性であるか又は宿主細胞のゲノムに組み込む本発明のポリペプチドを宿主細胞に組み込むことを含む、改変された原核宿主細胞を作製する方法も提供される。
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸で置き換えられており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子がC.ジェジュニpglBで置き換えられているものである。
ポリメラーゼ
ある実施形態では、ポリメラーゼ(例えば、wzy)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、ポリメラーゼは宿主細胞に対して異種である)。ある実施形態では、ポリメラーゼは、細菌ポリメラーゼである。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。
ある実施形態では、莢膜多糖生合成経路のポリメラーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。
別の特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌莢膜多糖生合成経路のポリメラーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のwzy遺伝子(cap5J/cap8I)である。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、CP8の莢膜多糖遺伝子クラスターからのwzy遺伝子(cap8I)である。
別の特定の実施形態では、前記ポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌莢膜多糖クラスターの一部として前記宿主細胞に組み込まれ(例えば、発現されるゲノム又はプラスミドに挿入され)、前記黄色ブドウ球菌莢膜多糖クラスターは、wzyポリメラーゼを含むように改変されている。
特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌wzyポリメラーゼをコードする核酸配列は、本発明の宿主細胞に挿入されるか又は発現される。したがって、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌wzyポリメラーゼをさらに含むことができる。
フリッパーゼ
ある実施形態では、フリッパーゼ(wzx又は相同体)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、フリッパーゼは宿主細胞に対して異種である)。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼをさらに含むことができる。ある実施形態では、フリッパーゼは、細菌フリッパーゼである。フリッパーゼは、野生型リピート単位、及び/又はそれらに対応する操作された(ハイブリッド)リピート単位を細胞質から宿主細胞(例えば、大腸菌)のペリプラズムに移行させる。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み得る。
特定の実施形態では、莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。
別の特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。ある種の態様では、本発明の宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のcapK遺伝子である。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、CP8の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のcapK遺伝子である。
本発明の宿主細胞に導入することができる他のフリッパーゼは、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来である(例えば、pglK)。
単糖を修飾(改変)する酵素
アクセサリー酵素
ある実施形態では、1つ以上のアクセサリー酵素をコードする核酸は、本発明の宿主細胞に導入される。したがって、本発明の宿主細胞は、これらのアクセサリー酵素の1つ以上をさらに含み得る。1つ以上の補助酵素をコードするこのような核酸は、プラスミド媒介性であるか、又は本発明の宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。例示的なアクセサリー酵素には、限定されないが、エピメラーゼ、分枝、修飾(改変)(例えば、コリン、グリセリンリン酸、ピルビン酸を付加するため)、アミド化、鎖長調節、アセチル化、ホルミル化、重合化酵素が含まれる。
ある種の実施形態では、単糖を修飾することができる酵素は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、単糖を修飾することができる酵素は、宿主細胞に対して異種である)。このような酵素には、例えば、エピメラーゼ及びラセマーゼが含まれる。したがって、本発明の宿主細胞は、エピメラーゼ及び/又はラセマーゼをさらに含み得る。
ある実施形態では、エピメラーゼ及びラセマーゼは、細菌由来である。ある種の実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるエピメラーゼ及び/又はラセマーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来である。
ある種の実施形態では、本発明の宿主細胞に挿入されるエピメラーゼは、国際特許出願公開第WO2011/062615号(その開示は全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されたエピメラーゼである。一実施形態では、エピメラーゼは、大腸菌株O157のZ3206遺伝子によってコードされるエピメラーゼである。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011/062615号、及びRushら、2009年、The Journal of Biological Chemistry 285巻:1671〜1680頁を参照されたい。別の実施形態では、エピメラーゼは、galE(UPD-ガラクトースエピメラーゼ)Z3206であり、galEは、GlcNAc-P-P-ウンデカプレニルをGalNAc-P-P-ウンデカプレニルに変換する。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、エピメラーゼをコードする核酸配列を含み、エピメラーゼをコードする前記核酸配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ムターゼ、例えば、glf(UDP-ガラクトピラノースムターゼ)をさらに含む。
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、RcsA(CP合成の活性化因子)をさらに含む。RcsAは、大腸菌におけるコラン酸莢膜多糖の合成に必要な不安定な正の調節因子である。
遺伝的バックグラウンド
本発明の宿主細胞を生じさせるために用いることができる例示的な宿主細胞には、限定されないが、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、及びクロストリジウム属種が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌である。
ある実施形態では、宿主細胞の遺伝学的バックグラウンドは、例えば、1つ以上の遺伝子の欠失によって改変される。宿主細胞において欠失され得る(及び、いくつかの場合では、他の所望の核酸配列と置き換えられ得る)例示的な遺伝子は、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、例えば、waaL(例えば、Feldmanら、2005年、PNAS USA 102巻:3016〜3021頁を参照されたい)、O抗原クラスター(rfb又はwb)、腸内細菌共通抗原クラスター(wec)、リピドAコア生合成クラスター(waa)、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原修飾(改変)クラスターを含む。特定の実施形態では、waaL遺伝子、gtrA遺伝子、gtrB遺伝子、gtrS遺伝子、又はwecクラスター由来の遺伝子若しくは複数の遺伝子、又はrfb遺伝子クラスター由来の遺伝子若しくは複数の遺伝子のうちの1つ以上は、本発明の原核生物宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。一実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子、gtrA遺伝子、gtrB遺伝子、gtrS遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。別の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子及びgtrS遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。別の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子及びwecクラスター由来の遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。
バイオコンジュゲート
本発明の宿主細胞は、抗原、例えば多糖又はオリゴ糖抗原、例えば、本発明のポリペプチドに連結された黄色ブドウ球菌糖抗原を含むバイオコンジュゲートを生成するために使用することができる。宿主細胞を用いてバイオコンジュゲートを生成する方法は、例えば、国際公開第WO2003/074687号、同第WO2006/119987号及び同第WO2011/138361号に記載されている。本明細書に記載されているように、バイオコンジュゲートは、それらが製造においてより少ない化学物質を必要とし、生じる最終生成物に関してより一貫性があるという点において、抗原-担体タンパク質の化学的コンジュゲートを上回る有利な特性を有する。
ある実施形態では、本明細書では、黄色ブドウ球菌抗原に連結された、ポリペプチドを含むバイオコンジュゲートが提供される。特定の実施形態では、前記黄色ブドウ球菌抗原は、莢膜糖(例えば、莢膜多糖)である。特定の実施形態では、本明細書では、本発明のポリペプチドと、黄色ブドウ球菌血清型CP5又はCP8の莢膜糖(例えば、莢膜多糖)から選択される抗原とを含むバイオコンジュゲートが提供される。特定の実施形態では、本明細書では、本発明のポリペプチドと、黄色ブドウ球菌血清型CP8の莢膜糖(例えば、莢膜多糖)由来の抗原とを含むバイオコンジュゲートが提供される。
本発明のバイオコンジュゲートは、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、陽イオン交換、陰イオン交換、アフィニティー、及びサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度によって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。例えば、Saraswatら、2013年、Biomed. Res. Int. ID#312709 (1〜18頁)を参照されたい。また、国際公開第WO2009/104074号に記載されている方法を参照されたい。さらに、精製を容易にするために、本明細書に記載されているか、又は当該技術分野において公知である異種ポリペプチド配列にバイオコンジュゲートを融合させることができる。例えば、陽イオン交換による精製のために、ClfAタンパク質は、ペプチドタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグを組み込むことができる。具体的なバイオコンジュゲートを精製するために使用される実際の条件は、部分的には、合成戦略、並びに因子、例えば、バイオコンジュゲートの正味の電荷、疎水性、及び/又は親水性に依存し、当業者には明らかである。
本発明のさらなる態様は、糖に連結された、ポリペプチドを含む(又はそれからなる)バイオコンジュゲートを生成する方法であり、前記方法は、(i)タンパク質の生成に適した条件下で(及び任意選択的に糖の生成に適した条件下で)本発明の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記宿主細胞によって生成されたバイオコンジュゲートを単離することを含む。
本発明のさらなる態様は、本発明のプロセスによって生成されたバイオコンジュゲートであり、前記バイオコンジュゲートは、ポリペプチドに連結された糖を含む。
分析方法
種々の方法を用いて、本発明のバイオコンジュゲートの構造組成及び糖鎖長を分析することができる。
一実施形態では、ヒドラジン分解を用いてグリカンを分析することができる。第一に、多糖は、製造業者の指示に従ってヒドラジンとともにインキュベートすることにより、タンパク質担体から放出される(Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit、Oxfordshire、UK)。求核剤であるヒドラジンは、多糖と担体タンパク質との間のグリコシド結合を攻撃し、結合したグリカンの放出を可能にする。N-アセチル基はこの処理中に喪失し、再N-アセチル化によって再構成される必要がある。遊離グリカンをカーボンカラム上で精製し、続いて、還元末端でフルオロフォア2-アミノベンズアミドで標識する。Bigge JC、Patel TP、Bruce JA、Goulding PN、Charles SM、Parekh RB: Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 1995年、230巻(2号):229〜238頁を参照されたい。RoyleらのHPLCプロトコールに従って、標識された多糖をGlycoSep-Nカラム(GL Sciences)上で分離する。Royle L、Mattu TS、Hart E、Langridge JI、Merry AH、Murphy N、Harvey DJ、Dwek RA、Rudd PM: An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins. Anal Biochem 2002年、304巻(1号):70〜90頁を参照されたい。得られた蛍光クロマトグラムは、多糖の長さ及びリピート単位の数を示す。構造情報は、個々のピークを回収し、続く、MS/MS分析を行うことによって収集することができる。これにより、単糖組成及びリピート単位の配列を確認することができ、さらに多糖組成の均一性を確認することができた。
別の実施形態では、SDS-PAGE又はキャピラリーゲル電気泳動を用いて、グリカン及びバイオコンジュゲートを評価することができる。O抗原グリカンのポリマー長は、直線的にアセンブルされたリピート単位の数によって定義される。これは、典型的なラダー様パターンが、グリカンを構成する異なるリピート単位数の結果であることを意味する。したがって、SDS PAGE、又はサイズによって分離される他の技術において、互いに隣り合う2つのバンドは、1つのリピート単位だけ異なる。これらの個別の違いは、グリカンサイズに関して、糖タンパク質を分析する場合に利用される:グリコシル化されていない担体タンパク質と、異なるポリマー鎖長を有するバイオコンジュゲートは、それらの電気泳動移動度に従って分離される。バイオコンジュゲート上に存在する第1の検出可能なリピート単位数(n1)及び平均リピート単位数(naverage)を測定する。これらのパラメータは、バッチ間の一貫性又は多糖の安定性を示すために使用することができる。
別の実施形態では、高質量MS及びサイズ排除HPLCを適用して、完全なバイオコンジュゲートのサイズを測定することができる。
別の実施形態では、アントロン-硫酸アッセイを使用して、多糖の収率を測定することができる。Leyva A、Quintana A、Sanchez M、Rodriguez EN、Cremata J、Sanchez JC: Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization 2008年、36巻(2号):134〜141頁を参照されたい。別の実施形態では、メチルペントースアッセイを使用して、多糖の収率を測定することができる。例えば、Discheら、J Biol Chem. 1948年9月、175巻(2号):595〜603頁を参照されたい。
グリコシル化部位の使用の変化
特定のタンパク質における部位の使用が、挿入された系とは対照的に、複数のプラスミド系において変化することを示すために、グリコシル化部位の使用を定量化する必要がある。そうする方法を以下に列挙する。
グリコペプチドLC-MS/MS:バイオコンジュゲートをプロテアーゼ(複数可)で消化し、ペプチドを適切なクロマトグラフィー法(C18、親水性相互作用HPLC HILIC、GlycoSepNカラム、SE HPLC、AE HPLC)により分離し、異なるペプチドをMS/MSを用いて同定する。この方法は、化学的(スミス分解)又は酵素的方法により、以前の糖鎖を短縮するか又は短縮することなく、使用することができる。215〜280nmでのUV検出を用いてグリコペプチドピークを定量することにより、グリコシル化部位の使用を相対的に決定することができる。
サイズ排除HPLC:より高いグリコシル化部位の使用は、SE HPLCカラムからのより早期の溶出時間によって反映される。
均一性
バイオコンジュゲートの均一性(すなわち、結合した糖残基の均一性)は、グリカン長及び流体力学的半径を測定する方法を用いて評価することができる。
分析方法
収量:収量は、制御され、最適化された条件下でバイオリアクター中で増殖させた1リットルの細菌生成培養物から得られた炭水化物量として測定される。バイオコンジュゲートの精製後、炭水化物収量は、アントロンアッセイ又は炭水化物特異的抗血清を用いるELISAのいずれかによって直接測定することができる。タンパク質量(BCA、Lowry、又はBradfordアッセイで測定される)及び糖鎖長と構造を用いて、タンパク質1gあたりの理論的な炭水化物量を計算することにより、間接的な測定が可能である。さらに、収量はまた、揮発性緩衝液から糖タンパク質調製物を乾燥させ、天秤を用いて重量を測定することによって測定することができる。
安定性。タンパク質又はグリココンジュゲートの安定性は、分解生成物の生成を検出するために、SDS-PAGE及び/若しくはウエスタンブロットによって、又はCD、質量分析若しくは当該技術分野において公知である他の方法によってアッセイすることができる。安定性は、生成直後、又は1、2、3、4週間以上、1、2、3、4、5、6ヵ月以上、例えば4、10、20又は30℃以上での保存後にアッセイすることができる。
均一性:均一性は、グリカンの長さと、おそらくグリコシル化部位の数の変動性を意味する。この目的のために、上記で列挙された方法を使用することができる。SE-HPLCは、流体力学的半径の測定を可能にする。担体中のグリコシル化部位の数が多いことにより、グリコシル化部位が少ない担体と比較して、流体力学的半径の変動が大きくなる。しかしながら、単一のグリカン鎖を分析した場合、長さがより制御されているため、それらはより均質である可能性がある。グリカン長は、ヒドラジン分解、SDS PAGE、及びCGEによって測定される。さらに、均一性はまた、ある種のグリコシル化部位の使用パターンがより広い/より狭い範囲に変化することを意味し得る。これらの因子は、グリコペプチドLC-MS/MSによって測定することができる。
菌株の安定性及び再現性。選択圧の非存在下での細菌発酵中の菌株安定性は、生成培養細胞中の組換えDNAの有無を確認する直接法及び間接法によって測定される。培養体積の影響は、培養時間を長くすることによってシミュレートすることができ、これは世代時間を長くすることを意味する。発酵の世代が長ければ長いほど、組換えエレメントが失われる可能性が高くなる。組換えエレメントの欠失は、不安定性と考えられる。間接的な方法は、選択カセットと、組換えDNA、例えば、プラスミド中の抗生物質耐性カセットとの結合に依存する。生成培養細胞は、選択培地、例えば、抗生物質又は選択システムに関連する他の化学物質が補充されたLBプレート上に播種され、耐性コロニーは、それぞれの選択化学物質に関連する組換えDNAが陽性であるとみなす。複数のプラスミドシステムの場合、複数の抗生物質に対する耐性コロニーを計数し、3種類の耐性をすべて含有する細胞の割合を安定集団とみなす。あるいは、定量PCRを用いて、3つの組換えエレメントの組換えDNAの量を、選択の存在下、非存在下、及び発酵の異なる時点で測定することができる。したがって、組換えDNAの相対量及び絶対量を測定し、比較する。生成プロセスの再現性は、本出願に記載された方法により一貫性バッチを完全に分析することによって測定される。
免疫原性組成物
本発明のポリペプチド及びコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)は、免疫原性組成物及びワクチンに含めるのに特に適している。本発明は、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
また、本発明のポリペプチド又はコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、本発明の免疫原性組成物を作製する方法が提供される。
免疫原性組成物は、本発明のポリペプチド又はコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)の免疫学的に有効な量、並びに任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量の個体への投与が、単回投薬又は一連の一部のいずれかとして、治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康状態及び身体状態、年齢、所望の防御の程度、ワクチンの処方、及び他の関連する因子に依存して変化する。その量は、日常的な試行を通じて判断することができる比較的幅広い範囲にあることが期待される。
本発明がまた希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどを含有し得る場合の免疫原性組成物。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質、ポリオールなどが存在し得る。
本発明のポリペプチド又はコンジュゲート(又はバイオコンジュゲート)を含む免疫原性組成物は、医薬投与に使用するのに適した任意の追加の成分を含み得る。特定の実施態様では、本発明の免疫原性組成物は、一価の製剤である。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、多価製剤、例えば、二価、三価、及び四価の製剤である。例えば、多価製剤は、1を超える抗原、例えば、1を超えるコンジュゲートを含む。
本発明の免疫原性組成物は、任意選択的に、さらなる抗原をさらに含む。このような追加の抗原の例は、黄色ブドウ球菌タンパク質又は莢膜多糖である。
ワクチン
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチンを提供する。
薬学的に許容される賦形剤及び担体は、当業者によって選択され得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤又は担体は、緩衝液、例えば、Tris(トリメタミン)、リン酸塩(例えば、リン酸ナトリウム)、酢酸塩、ホウ酸塩(例えば、ホウ酸ナトリウム)、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジン及びコハク酸塩(例えば、コハク酸ナトリウム)、適切には塩化ナトリウム、ヒスチジン、リン酸ナトリウム又はコハク酸ナトリウムを含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化マグネシウムを含むことができる。任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤は、溶解性及び/又は安定性を安定化する少なくとも1つの成分を含有する。可溶化剤/安定化剤の例としては、洗剤、例えば、ラウレルサルコシン及び/又はポリソルベート(例えば、TWEEN(商標)80)が挙げられる。また、安定化剤の例には、ポロキサマー(例えば、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338及びポロキサマー407)が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート-80(TWEEN(商標)80)、ポリソルベート-60(TWEEN(商標)60)、ポリソルベート-40(TWEEN(商標)40)及びポリソルベート-20(TWEEN(商標)20)、又はポリオキシエチレンアルキルエーテル(適切にはポリソルベート-80)が含まれ得る。代替の可溶化剤/安定化剤には、アルギニン、及びガラス形成ポリオール(例えば、スクロース、トレハロースなど)が挙げられる。薬学的賦形剤は、保存剤、例えば、フェノール、2-フェノキシエタノール、又はチオマーサルであり得る。他の薬学的に許容される賦形剤としては、糖(例えば、ラクトース、スクロース)、及びタンパク質(例えば、ゼラチン及びアルブミン)が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、水、生理食塩水、水性デキストロース及びグリセロール溶液が挙げられる。多数の薬学的に許容される賦形剤及び担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、E. W. Martin、Mack Publishing Co. Easton、PA、第5版(975)に記載されている。
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、1つ以上の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液及び/又はスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液をさらに含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、緩衝液を含まない。
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、1つ以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸カリウムアルミニウム)、又はこのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、塩を含まない。
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、保存剤、例えば、水銀誘導体チメロサールをさらに含むことができる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、0.001%〜0.01%のチメロサールを含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、保存剤を含まない。
本発明のワクチン又は免疫原性組成物はまた、典型的には、多用量フォーマットでパッケージされた場合、抗菌剤を含み得る。例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、2-フェノキシエタノールを含み得る。
本発明のワクチン又は免疫原性組成物はまた、洗剤、例えば、ポリソルベート、例えばTWEEN(商標)80を含み得る。洗剤は、一般的に、低レベル、例えば<0.01%で存在するが、抗原製剤を安定化させるために、より高いレベル、例えば、最大10%のレベルが示唆されている。
本発明の免疫原性組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、使用前に保存することができ、例えば、組成物は、(例えば、約-20℃又は約-70℃で)凍結保存することができ、冷蔵条件下(例えば、約4℃)で保存することができ、又は室温で保存することができる。
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、溶液中に貯蔵するか又は凍結乾燥することができる。ある実施形態では、溶液は、糖、例えば、スクロース、トレハロース又はラクトースの存在下で凍結乾燥される。別の実施形態では、本発明のワクチンは、使用前に凍結乾燥され、即座に再構成される。
ワクチン調製物は、一般的にVaccine Design (「The subunit and adjuvant approach」(Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995年) Plenum Press New York)に記載されている。リポソーム内のカプセル化は、Fullerton、米国特許第4,235,877号に記載されている。
アジュバント
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバントを含むか又はアジュバントと組み合わせて投与される。本発明の免疫原性組成物又はワクチンと組み合わせて投与するためのアジュバントは、前記免疫原性組成物又はワクチンの投与前、同時、又は投与後に投与することができる。一部の実施形態では、用語「アジュバント」とは、本発明のワクチンの免疫原性組成物と組み合わせて又はその一部として投与された場合、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を増強し、増大し、及び/又は強化するが、化合物が単独で投与された場合には、ポリペプチド/コンジュゲート/バイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。一部の実施形態では、アジュバントは、ポリペプチド、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせ、アレルギー又は他の有害反応を生成しない。
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバント化される。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって免疫応答を増大することができる。アジュバントの具体的な例としては、限定されないが、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(MPL)(英国特許GB2220211を参照されたい)、MF59(Novartis)、AS01(GlaxoSmithKline)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(TWEEN(商標)80、ICL Americas,Inc.)、イミダゾピリジン化合物(国際公開第WO2007/109812号として公開された国際出願第PCT/US2007/064857号を参照されたい)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開第WO2007/109813号として公開された国際出願第PCT/US2007/064858号を参照されたい)、及びサポニン、例えば、QS21などの(Kensilら、Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編集、Powell & Newman、Plenum Press、NY、1995年)、米国特許第5,057,540号を参照されたい)が含まれる。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、水中油型エマルジョン(例えば、スクアレン又はピーナッツ油)であり、任意選択的に、免疫刺激剤、例えば、モノホスホリルリピドAと組み合わせる(Stouteら、N. Engl. J. Med. 336巻、86〜91頁(1997年)を参照されたい)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today、1998年11月15日)。
本発明の一態様では、アジュバントは、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)又はリン酸アルミニウムである。
本発明の別の態様では、アジュバントは、TH1又はTH2型の応答のいずれかの優先的な誘導因子であるように選択される。高レベルのTh1型サイトカインは、所定の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を好む傾向があり、一方、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を好む傾向がある。Th1型とTh2型の免疫応答の区別は絶対的なものではないことを覚えておくことが重要である。実際には、個体は、主にTh1又は主にTh2であると記載される免疫応答を支持する。しかしながら、Mosmann及びCoffman(Mosmann, T.R.及びCoffman、R.L. (1989年) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology、7巻、145〜173頁)によってマウスCD4+ve T細胞クローンにおいて説明されているという点では、サイトカインファミリーを考慮することは、しばしば好都合である。伝統的に、Th1型の応答は、Tリンパ球によるINF-γ及びIL-2サイトカインの生成と関連している。Th1型の免疫応答の誘導にしばしば直接的に関連する他のサイトカイン、例えばIL-12は、T細胞によって生成されない。対照的に、Th2型の応答は、Il-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌と関連している。主としてTh1応答を促進する適切なアジュバント系としては、モノホスホリルリピドA又はその誘導体、具体的には3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)(その調製については、英国特許出願公開第2220211A号を参照されたい)、MPL、例えば、リポソーム、例えば、コレステロール及びDPOCを含むリポソーム中の3D-MPL及びサポニンQS21、並びにモノホスホリルリピドA、例えば、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)又は水中油型エマルジョンのいずれかとの組み合わせが挙げられる。このような組み合わせにおいて、抗原及び3D-MPLは、同じ粒子構造に含有され、抗原及び免疫刺激シグナルのより効率的な送達を可能にする。研究は、3D-MPLが、ミョウバン吸着した抗原の免疫原性をさらに増大させ得ることを示している[Thoelenら、Vaccine (1998年) 16巻:708〜14頁;欧州特許第689454-B1号]。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(国際公開第WO96/02555号)はまた、TH1応答の優先的な誘導因子であり、本発明における使用に適している。
本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、アジュバント組成物(欧州特許出願公開第399843号、国際公開第WO95/17210号)として有用であることが示唆されているため、これらは水中油型エマルジョンを含有することができる。国際公開第WO95/17210号(2〜10%スクアレン、2〜10%アルファトコフェロール、及び0.3〜3%Tween 80を含む水中油型エマルジョン、並びに単独又はQS21及び/又は3D-MPLと組み合わせたそれらの使用を開示する)、国際公開第WO99/12565号(代謝可能な油、サポニン及びステロール及びMPLを含む水中油型エマルジョン組成物を開示する)、又は国際公開第WO99/11241号に記載される水中油型エマルジョンを使用することができる。さらに、国際公開第WO09/127676号及び同第WO09/127677号に開示される水中油型エマルジョンもまた適している。特定の実施形態では、免疫原性組成物又はワクチンは、サポニン、例えばQS21をさらに含む。免疫原性組成物又はワクチンはまた、水中油型エマルジョン及びトコフェロール(国際公開第WO95/17210号)を含み得る。
投与方法
本発明の免疫原性組成物又はワクチンを使用して、前記免疫原性組成物又はワクチンを全身又は粘膜経路を介して投与することによって、感染に感受性の哺乳動物を保護又は治療することができる。これらの投与には、筋肉内(IM)、腹腔内、皮内(ID)若しくは皮下経路による注射、又は口腔/消化管、呼吸器、泌尿生殖器への粘膜投与が含まれ得る。例えば、鼻腔内(IN)投与は、肺炎又は中耳炎の治療に使用され得る(肺炎球菌の鼻咽頭保菌がより効果的に予防され、したがって、その初期段階での感染を減弱させることができるためである)。本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、単回用量として投与することができるが、それらの成分はまた、同時に又は異なる時間に、一緒に同時投与され得る(例えば、肺炎球菌多糖は、互いに対する免疫応答の最適な調整のために、別々に、同時に、又はワクチンのいずれかの細菌タンパク質成分の投与後の1〜2週間に投与することができる)。同時投与について、任意選択のTh1アジュバントは、異なる投与のいずれか又は全てに存在し得るが、しかしながら、本発明の1つの具体的な態様では、それは、免疫原性組成物又はワクチンのポリペプチド成分と組み合わせて存在する。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、多糖は、IM(又はID)に投与することができ、細菌タンパク質は、IN(又はID)に投与することができる。さらに、本発明のワクチンは、初回用量のためにIMで、及び追加免疫用量のためにINで投与することができる。
一態様では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、筋肉内送達経路によって投与される。筋肉内投与は、大腿部又は上腕部に行うことができる。注射は、典型的には、針(例えば、皮下注射針)を介して行われるが、代わりに、無針注射が使用され得る。典型的な筋肉内用量は0.5mlである。
別の態様では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、皮内投与によって投与される。ヒトの皮膚は、表皮を覆う角質層と呼ばれる外側の「角質」キューティクルを含む。この表皮の下には真皮と呼ばれる層があり、順番に皮下組織を覆う。皮内注射の従来の技術である「マントゥー法」は、皮膚を洗浄し、次に、片手で伸ばし、狭いゲージの針(26〜31ゲージ)のベベルを上向きにして、針を10〜15°の角度で挿入する工程を含む。針のベベルが挿入されると、針のバレルが下降し、皮膚の下でそれを持ち上げるわずかな圧力を与えながらさらに前進する。次に、液体は非常にゆっくりと注入され、それによって皮膚表面にブレブ又はバンプを形成し、続いて、針をゆっくりと引き抜く。
より最近では、液体剤を皮膚の中又は全体に投与するように特別に設計されたデバイスが記載されており、例えば、国際公開第WO99/34850号及び欧州特許出願公開第1092444号に記載されたデバイス、また、例えば、国際公開第WO01/13977号、米国特許第5,480,381号、米国特許第5,599,302号、米国特許第5,334,144号、米国特許第5,993,412号、米国特許第5,649,912号、米国特許第5,569,189号、米国特許第5,704,911号、米国特許第5,383,851号、米国特許第5,893,397号、米国特許第5,466,220号、米国特許第5,339,163号、米国特許第5,312,335号、米国特許第5,503,627号、米国特許第5,064,413号、米国特許第5,520,639号、米国特許第4,596,556号、米国特許第4,790,824号、米国特許第4,941,880号、米国特許第4,940,460号、国際公開第WO97/37705号及び国際公開第WO97/13537号に記載されたジェット噴射デバイスが挙げられる。ワクチン調製物の皮内投与の別の方法には、従来の注射器及び針、又は固形ワクチンの弾道送達用に設計されたデバイス(国際公開第WO99/27961号)、又は経皮パッチ(国際公開第WO97/48440号、同第WO98/28037号)、又は皮膚表面に適用されるデバイス(経皮又は経皮送達、国際公開第WO98/20734号、同第WO98/28037号)が含まれ得る。
別の態様では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、鼻腔内投与によって投与される。典型的には、免疫原性組成物又はワクチンは、例えば、肺に吸入されることなく、鼻咽頭領域に局所的に投与される。免疫原性組成物又はワクチン製剤を肺に入れることなく又は実質的に入れることなく、鼻咽頭領域に送達させる鼻腔内送達デバイスを使用することが望ましい。本発明によるワクチンの鼻腔内投与に適したデバイスは、スプレーデバイスである。適切な市販の鼻腔スプレーデバイスとしては、ACCUSPRAY(商標)(Becton Dickinson)が挙げられる。
ある実施形態では、鼻腔内使用のためのスプレーデバイスは、デバイスの性能がユーザによって印加される圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは、圧力閾値デバイスとして公知である。閾値圧力が印加された場合にだけ、ノズルから液体が放出される。これらのデバイスは、規則的な液滴サイズを有するスプレーを達成することを容易にする。本発明とともに使用するのに適した圧力閾値デバイスは、当該技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第WO91/13281号及び欧州特許出願公開第311863号及び同第516636号に記載されている。このようなデバイスは、Pfeiffer GmbHから市販されており、また、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe、1999年9月にも記載されている。
別の実施形態では、鼻腔内デバイスは、1〜200μm、例えば、10〜120μmの範囲の液滴(液体として水を使用して測定される)を生成する。10μm未満では吸入のリスクがあり、したがって、10μm未満では約5%以下の液滴を有することが望ましい。120μmを超える液滴は、より小さな液滴と同様に拡散せず、そのため、120μmを超える液滴の約5%以下を有することが望ましい。
初回ワクチン接種後、対象は、適切な間隔で1回又は数回の追加免疫を受けることができる。
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、前記免疫原性組成物又はワクチンを全身又は粘膜経路を介して投与することによって、感染に感受性である哺乳動物、例えばヒトを保護又は治療するために使用することができる。これらの投与には、筋肉内(IM)、腹腔内(IP)、皮内(ID)若しくは皮下(SC)経路を介した注射、又は口腔/消化管、呼吸器、泌尿生殖器への粘膜投与を介した注射が含まれ得る。本発明のワクチンは、単回用量として投与することができるが、それらの成分はまた、同時に又は異なる時間に、一緒に同時投与され得る(例えば、肺炎球菌糖コンジュゲートは、互いに対する免疫応答の最適な調整のために、別々に、同時に、又は本発明のいずれかのポリペプチド、コンジュゲート、若しくはバイオコンジュゲートの投与後の1〜2週間に投与することができる)。同時投与について、任意選択のアジュバントは、異なる投与のいずれか又は全てに存在し得る。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、多糖コンジュゲートは、IM(又はID)に投与することができ、本発明のポリペプチド、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、IN(又はID)に投与することができる。さらに、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、初回用量のためにIMで、及び追加免疫用量のためにINで投与することができる。
投薬量
各免疫原性組成物又はワクチン用量中のコンジュゲート抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な副作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原が使用され、どのようにしてそれが示されるかに依存して変化する。ポリペプチドの含有量は、典型的には1〜100μg、適切には5〜50μgの範囲である。糖の含有量は、典型的には0.1〜10μg、適切には1〜5μgの範囲である。
ヒトの使用に適した体積の用量は、一般的には0.25〜1.5mlであるが、皮膚への投与には0.05ml〜0.2mlの低い体積を用いることができる。一実施形態では、ヒト用量は0.5mlである。さらなる実施形態では、ヒト用量は、0.5mlよりも高く、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9又は1mlである。さらなる実施形態では、ヒト用量は、1ml〜1.5mlである。別の実施形態では、具体的には、免疫原性組成物が小児集団に対するものである場合、ヒト用量は、0.5ml未満、例えば0.25〜0.5mlであり得る。
予防的及び治療的使用
本発明はまた、本発明のポリペプチド、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを対象に投与することを含む、対象の細菌感染を治療及び/又は予防する方法を提供する。ポリペプチド、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、免疫原性組成物又はワクチンの形態であり得る。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、細菌による対象(例えば、ヒト対象)の感染の予防に使用される。本発明のポリペプチド、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを用いて治療及び/又は予防することができる細菌感染には、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種によって引き起こされるものが含まれる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)による感染を治療又は予防するために使用される。
また、本明細書では、本発明のポリペプチド、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む、細菌に対する対象における免疫応答を誘導する方法が提供される。一実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有する。別の実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本発明のポリペプチド、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを用いて、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対する免疫応答を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明のポリペプチド、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを用いて、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)に対する免疫応答を誘導する。
また、本明細書では、本発明のポリペプチド、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む、細菌に対する対象におけるオプソニン食作用性抗体の生成を誘導する方法が提供される。一実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有する。別の実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本明細書に提供される本発明のポリペプチド、又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を用いて、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対するオプソニン食作用性抗体の生成を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明のポリペプチド、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を使用して、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)に対するオプソニン食作用性抗体の生成を誘導する。
例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、院内感染を含む黄色ブドウ球菌感染に対する予防に使用され得る。より具体的には、対象は、皮膚感染、肺炎、髄膜炎、骨髄炎心内膜炎、毒性ショック症候群、及び/又は敗血症から保護され得る。本発明はまた、対象の骨及び関節の黄色ブドウ球菌感染からの保護に有用である(したがって、限定されないが、骨髄炎、敗血症性関節炎、及び人工関節感染を含む障害の予防に有用である)。多くの場合、これらの疾患は、黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの形成と関連している場合がある。
黄色ブドウ球菌は、種々の哺乳動物(ウシ、イヌ、ウマ、及びブタを含む)に感染するが、本発明で使用するための好ましい哺乳動物はヒトである。ヒトは、小児(例えば、幼児又は乳児)、10代の若者、又は成人であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、人工骨若しくは関節を有し得、又は、選択的手術を待っている患者、具体的には、人工骨若しくは関節の意図されたレシピエント(例えば、術前整形外科手術患者)であり得る。しかしながら、ワクチンは、これらのグループにのみ適しておらず、より一般的にはヒト集団において使用され得る。
本発明のワクチン調製物は、全身又は粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することによって、黄色ブドウ球菌感染に感受性のあるヒトを保護又は治療するために使用することができる。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内若しくは皮下経路を介した注射、又は口腔/消化管、呼吸器、泌尿生殖管への粘膜投与を介した注射が含まれる。
ある実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性組成物又はワクチン(小児用ワクチン)の治療有効量を投与することによって、乳児(本発明との関連では、0〜2歳として定義される)において免疫応答を誘発する改良された方法である。ある実施形態では、ワクチンは、小児用ワクチンである。
ある実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの治療有効量を投与することによって、高齢集団(本発明との関連では、患者は、年齢が50歳以上、典型的には55歳以上、より一般的には60歳以上である場合、高齢者とみなされる)において免疫応答を誘発する改良された方法である。ある実施形態では、ワクチンは、高齢者用のワクチンである。
本発明は、それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防するための方法を提供し、本発明のポリペプチド、本発明のコンジュゲート、本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンの治療有効量を前記対象に投与することを含む。
本発明は、ヒト宿主を黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化する方法を提供し、本発明のポリペプチド、本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンの免疫防御用量を宿主に投与することを含む。
本発明は、対象において黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、本発明のポリペプチド、本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンの治療的又は予防的に有効な量を投与することを含む。
本発明は、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、本発明のポリペプチド、本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンを提供する。
本発明は、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明のポリペプチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの使用を提供する。
黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患は、例えば、皮膚感染、肺炎、髄膜炎、対象の骨及び関節の黄色ブドウ球菌感染(例えば、敗血症性関節炎、人工関節感染又は骨髄炎)、心内膜炎、毒性ショック症候群、及び/又は敗血症であり得る。この疾患は、院内感染であり得る。
本特許明細書中で引用される全ての参考文献又は特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の態様は、連続した番号付き段落に要約される。
1. 配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含み、前記コンセンサス配列が、配列番号3のアミノ酸残基313〜340の間の1つ以上のアミノ酸で、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されているという点で改変されているポリペプチド。
2. 前記コンセンサス配列が、配列番号3におけるアミノ酸残基Q327、D329、P331又若しくはI337と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3におけるアミノ酸残基Q327、D329、若しくはI337と同等であるアミノ酸位置で置換されている、段落1に記載のポリペプチド。
3. 配列番号3においてアミノ酸残基I337と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3におけるアミノ酸残基I337と同等であるアミノ酸位置で置換されている単一のコンセンサス配列を含有する、段落2に記載のポリペプチド。
4. XがQ(グルタミン)であり、ZがA(アラニン)である、段落1〜3のいずれか1つに記載のポリペプチド(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))。
5. アミノ酸配列が、配列番号3のアミノ酸配列に関してP116からS及びY118からA(又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列における同等の位置)から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換によってさらに改変され、任意選択的に配列番号4〜5又は10〜12のいずれか1つの配列を含む、段落1〜4のいずれか1つに記載のポリペプチド。
6. 配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含み(又はそれらからなり)、前記アミノ酸配列は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(X及びZは、独立してプロリンとは別の任意のアミノ酸である)コンセンサス配列を含み、該コンセンサス配列が配列番号3のI337位のアミノ酸と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3のアミノ酸残基Q327、D329、又はI337と同等であるアミノ酸位置で置換されている、段落5に記載のポリペプチド。
7. N末端にさらなるセリン残基を有するポリペプチドであって、任意選択的に前記ポリペプチドは、配列番号6若しくは配列番号12と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有し、及び/又はC末端にさらなるグリシン又はグリシン-セリン残基を有するポリペプチドであって、任意選択的に前記ポリペプチドは、配列番号32と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落1〜6のいずれか1つに記載のポリペプチド。
8. アミノ酸配列が、宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムにポリペプチドを方向付けることができるシグナル配列をさらに含み、任意選択的に前記シグナル配列は配列番号13〜20から選択され、任意選択的に前記ポリペプチドは配列番号5若しくは配列番号11と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド。
9. アミノ酸配列が、ClfAタンパク質の精製に有用であるペプチドタグをさらに含み、任意選択的に前記ペプチドタグは6個のヒスチジン残基を含み、任意選択的に前記ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に配置され、任意選択的に前記ポリペプチドは配列番号25、配列番号26若しくは配列番号27と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落1〜8に記載のいずれか1つのポリペプチド。
10. 前記ポリペプチドがグリコシル化されている、段落1〜9のいずれか1つに記載のポリペプチド。
11. 抗原、例えば、多糖又はオリゴ糖抗原に連結されている、段落1〜10のいずれか1つに記載のポリペプチドを含むコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
12. コンジュゲートが、任意選択的に、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイルスクシンイミド化学からなる群から選択される化学コンジュゲーション法を用いて得られる化学連結を通じて、直接的に又はリンカーを介して抗原に共有結合されている、段落11に記載のコンジュゲート。
13.抗原が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えば、アスパラギン)から選択される、ポリペプチド上のアミノ酸に連結されている、段落11又は段落12に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
14. 抗原が、糖、任意選択的に、黄色ブドウ球菌血清型5又は8の莢膜糖から任意選択的に選択される細菌莢膜糖(例えば、黄色ブドウ球菌由来)である、段落11〜13のいずれか1つに記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
15. 抗原は、黄色ブドウ球菌血清型8由来の細菌莢膜糖である、段落14に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
16.段落1〜10のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
17.段落16に記載のポリヌクレオチドを含むベクター
18.グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
段落1〜10のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする核酸、及び任意選択的に
ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞。
19.(a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルされたグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落18に記載の宿主細胞。
20.Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、段落19に記載の宿主細胞。
21.前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾(改変)される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、段落18〜20のいずれか一つに記載の宿主細胞。
22.Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)、若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であり、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、段落18〜21のいずれか一つに記載の宿主細胞。
23.黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ、及び/又はcapK、並びに任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO及び/又はcapPを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落18〜22のいずれか一つに記載の宿主細胞。
24.黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ、及び/又はcapK、並びに任意選択的に緑膿菌O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB及び/又はwecCを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位を合成するのに十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落18〜23のいずれか一つに記載の宿主細胞。
25.オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニに由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼはカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子は宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、段落18〜24のいずれか一つに記載の宿主細胞。
26.前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸を含み、任意選択的に前記莢膜多糖ポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、段落18〜25のいずれか一つに記載の宿主細胞。
27.前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記フリッパーゼは黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、段落18〜26のいずれか一つに記載の宿主細胞。
28.前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素、任意選択的にエピメラーゼをさらに含み、任意選択的に、前記エピメラーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的に前記エピメラーゼは、大腸菌由来であり、任意選択的に大腸菌O157由来のZ3206又はgalEである、段落18〜27のいずれか一つに記載の宿主細胞。
29.ポリペプチドをコードする核酸が、宿主細胞中のプラスミドにある、段落18〜28のいずれか一つに記載の宿主細胞。
30.大腸菌である、段落18〜29のいずれか一つに記載の宿主細胞。
31.糖に連結された、ポリペプチドを含むバイオコンジュゲートを生成する方法であって、(i)タンパク質の生成に適した条件下で、段落18〜30のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。
32. 前記バイオコンジュゲートは、ポリペプチド、例えば、段落1〜10のいずれか1つに記載のポリペプチドに連結された糖を含む、段落31の方法によって生成されるバイオコンジュゲート。
33.段落1〜10のいずれか一つに記載のポリペプチド、又は段落11〜15のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落32に記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
34.ポリペプチド又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、段落33に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
35.段落34に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。
36.それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防する方法であって、段落1〜10のいずれか一つに記載のポリペプチド、又は段落11〜15のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落32に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
37.ヒト宿主を黄色ブドウ球菌感染に対して免疫する方法であって、段落1〜10のいずれか一つに記載のポリペプチド、又は段落11〜15のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落32に記載のバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。
38.対象において黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、段落1〜10のいずれか一つに記載のポリペプチド、又は段落11〜15のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落32に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む方法。
39.黄色ブドウ球菌感染により引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、段落1〜10のいずれか一つに記載のポリペプチド、又は段落11〜15のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落32に記載のバイオコンジュゲート。
本発明をよりよく理解し得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきではない。
[実施例1]
ClfAグリコサイト突然変異体のスクリーニング
黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP8をコードするプラスミド(CPS8;pGVXN564)及びカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB N534Q突然変異体のコドン使用を最適化したバージョンをコードするプラスミド(pGVXN971)を有する大腸菌株StGVXN1690、クローン6D(W3110ΔwaaL;ΔECA(rffG-rffM)::cat)の化学コンピテント細胞は、大腸菌OmpAシグナル配列を有し、C末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する、指示された(表を参照されたい)黄色ブドウ球菌クランピング因子N2N3グリコサイト突然変異体をコードするプラスミドを用いて形質転換された。
大腸菌株StGVXN1690の1つの陽性対照化学コンピテント細胞として、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP8をコードするプラスミド(CPS8;pGVXN564)、及びカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼのコドン使用を最適化したバージョンをコードするプラスミドPglB N534Q突然変異体(pGVXN971)を有するクローン6D(W3110ΔwaaL;ΔECA(rffG-rffM)::cat)は、大腸菌DsbAシグナル配列及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する、緑膿菌外タンパク質Aをコードするプラスミド(pGVXN150)(pEC415-DsbA-ss-EPA2xglycosites His6)で形質転換された。
大腸菌株StGVXN1690の第2の陽性対照化学コンピテント細胞として、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP8をコードするプラスミド(CPS8;pGVXN564)、及びカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB N534Q突然変異体のコドン使用を最適化したバージョンをコードするプラスミド(pGVXN971)を有する、クローン6D(W3110ΔwaaL;ΔECA(rffG-rffM):::cat)は、大腸菌DsbAシグナル配列及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する、黄色ブドウ球菌クランピング因子グリコサイト突然変異体(D328KDQNRTK)をコードするプラスミド(pGVXN633)で形質転換された。
大腸菌株StGVXN1690の陰性対照化学コンピテント細胞として、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP8をコードするプラスミド(CPS8;pGVXN564)、及びカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB N534Q突然変異体のコドン使用を最適化したバージョンをコードするプラスミド(pGVXN971)を有する、クローン6D(W3110ΔwaaL;ΔECA(rffG-rffM):::cat)は、大腸菌OmpAシグナル配列及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する、グリコサイトを含まない黄色ブドウ球菌クランピング因子をコードするプラスミド(pGVXN974)で形質転換された。
細胞を、3種類の抗生物質アンピシリン[100μg/ml]、テトラサイクリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[40μg/ml]が補足された選択Luriaブロス(LB)寒天プレート上で一晩増殖させた。新たに増殖させた形質転換体を、抗生物質アンピシリン[100μg/ml]、テトラサイクリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[40μg/ml]が補足された1mlのLB前培養に接種し、96ウェル中で一晩、37℃で振とうした。一晩の培養後、100μlの前培養物を用いて、10mMのMgCl2及び抗生物質アンピシリン[100μg/ml]、テトラサイクリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[40μg/ml]が補足された900μlのTerrificブロス(TB)を接種した。37℃で150分間の培養後、培養物を1mM IPTG及び0.1%アラビノースで誘導し、37℃でo/n培養した。細胞を96ディープウェルプレート内で10分間、3700rpmで遠心分離により細胞を回収した。ペリプラズム含有量を、200μlの溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA pH8.0、20%スクロース、リゾチーム含有[最終1mg/ml])で30分間、4℃で抽出した。ペリプラズム抽出物(PPE)を遠心分離(15分間、3700rpm)により除去し、各上清の150μlを、新しい96ウェルプレート(=装填)中で37.5μlの5×結合緩衝液(150mM Tris-HCl pH8.0、2.5M NaCl、50mMイミダゾール pH8.0、4mM MgCl2)と混合した。「装填物」を、1×結合緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、10mMイミダゾール pH8.0)で先に平衡化した50μl/ウェルのNi-NTAアガロースを含有する新しい96ウェルプレートに移し、1時間、周囲温度でインキュベートした。スラリーを新しい96ウェルプレート(1つのフィルターデバイス/ウェルを含む)に移した。結合タンパク質を含むNi-NTAアガロースを、300rcfで2分間、フィルター上に遠心分離し、フロースルーを捨てた。フィルターを1×結合緩衝液で2回洗浄し、結合タンパク質をフィルターあたり50μlの溶出緩衝液(1×PBS pH7.0;500mMイミダゾール)で溶出させた。
20μlの4×Lammli試料緩衝液を溶出された各試料に添加し、混合し、95℃で10分間煮沸した。ウエスタンブロットによる分析について、これらの試料のレーンあたり30μlを4〜12%のNuPAGEゲル上に装填し、タンパク質をニトロセルロース膜上でエレクトロブロットし、抗His抗体(Qiagen N°34660;図3及び4)及び二次抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート抗体(Sigma、A0412)、又は抗CP8抗体及び二次抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート抗体(BioRad、170-6515;図5及び6)で検出した。抗CP8ウエスタンブロットにより、黄色ブドウ球菌クランピング因子グリコサイト突然変異体mut1、mut27、mut28、及びmut30のコンジュゲート形成が明らかになった。
[実施例2]
グリコサイト突然変異体1と比較した担体タンパク質ClfAN2N3グリコサイト突然変異体30との関連での黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲート生成のタンパク質安定性の改善
実施例1に記載される突然変異体1及び30のグリコシル化効率及び安定性を直接比較した。
StGVXN8966株(W3110 waaL::pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V; O16::O11_wbjB-wbpM; ΔrmlB-wecG;wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌クランピング因子ドメインN2N3グリコサイト突然変異体mut 1をコードするプラスミド(ClfAN2N3、pGVXN1188)又はクランピング因子ドメインN2N3グリコサイト突然変異体mut 30をコードするプラスミド(pGVXN2592)で個別に形質転換された。
細胞をTB培地中で増殖させ、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP8(CPS8)を、大腸菌ゲノムに組み込まれた遺伝子クラスターから構成的に発現させた。組み込まれたオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBを1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導し、プラスミド媒介性ClfAN2N3を0.6%アラビノースを用いて、0.95と1.05の光学濃度OD600nmで誘導した。
37℃で一晩誘導した後、細胞を回収し、CP8-ClfAN2N3バイオコンジュゲートを、1mg/mlリゾチームが補足された溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA、20%(w/v)スクロース)を用いてペリプラズム調製物によって抽出した。遠心分離後、上清からペリプラズムタンパク質を回収し、4〜12%SDS-PAGE上に装填し、ニトロセルロース膜上にブロットし、抗ヒスチジンタグ抗体で検出した。装填されたタンパク質は、細胞の光学密度について正規化された。結果を図9に示す。
[実施例3]
3つのプラスミドシステムからのCP8-ClfAN2N3突然変異体1バイオコンジュゲートの発現及び精製
図7は、20Lバイオリアクター中の3つのプラスミドシステムから発現され、均質に精製された、CP8-ClfAN2N3 mut1の最終生成物の抗ClfA及び抗CP8のウエスタンブロット分析であるSDS-PAGE SimplyBlue SafeStainを示す。
大腸菌OmpAシグナル配列を有する、黄色ブドウ球菌クランピング因子ドメインN2N3グリコサイト突然変異体mut1をコードするプラスミドを有し、並びにC末端ヘキサヒスチジン親和性タグpGVXN1188及び黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP8(CPS8)pGVXN564をコードするプラスミドを有するクローン6D(W3110ΔwaaL;ΔECA(rffG-rffM)::cat)であるStGVXN1690株は、エレクトロポレーションにより、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglB野生型のコドン使用を最適化したプラスミドpGVXN970で形質転換され、選択寒天プレート上に播種された。
細胞を400mlのLB前培養物に接種し、一晩37℃で振とうし、7リットル(L)のTerrificブロス(TB)培地を含む20Lのバイオリアクター(newMBR FE_03/20L)に接種した。組換え多糖を恒常的に発現させ、一方で、PglB及びClfAN2N3 mut1は、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)及び0.6%アラビノースを用いてそれぞれ40の光学濃度OD600nmで誘導され、容器は、108のOD600nm及び10Lの全体積に到達するまで一晩37℃でTB培地を供給され、合計40時間(h)誘導を継続した。
誘導後、合計803,600のODを回収し、0.9%塩化ナトリウムで洗浄した。100,000のODからのCP8-ClfAN2N3 mut1バイオコンジュゲートを浸透ショック処理により抽出した。細胞を、125mlの再懸濁緩衝液(75%スクロース、30mM EDTA、600mM Tris HCl pH8.5)が補足された250ml 1/3×TBS(Tris緩衝生理食塩水、Fisher Scientific)に再懸濁し、20分間、4℃で回転させてインキュベートした。細胞をペレット化し、375mlの浸透ショック緩衝液(10mM Tris HCl pH8.0)に再懸濁し、30分間、4℃で再度インキュベートした。細胞をペレット化し、上清(420ml)は、21mlの1M塩化マグネシウム及び110mlの5×結合緩衝液150mM Tris-HCl、pH8.0、2500mM NaCl、25mMイミダゾールが補足され、0.2μmフィルターで濾過された。40mlのIMAC(固定化金属アフィニティークロマトグラフィー)ビーズは、30mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールで平衡化され、30分間、室温で撹拌することにより試料とともにインキュベートされた。レジンをXK26/20カラム(GE Healthcare)に充填し、30mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールで2カラム体積について洗浄した。タンパク質は、15カラム体積で30mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、500mMイミダゾールに到達する勾配を用いて溶出された。画分を4〜12% SDS-PAGEで分析し、抗Hisのウエスタンブロットで発色させ、バイオコンジュゲートを含有するすべての画分をプールし(110ml)、30mM Bis-Tris pH6.5、50mM NaClで平衡化したPallQカラム(Pall)上に直接装填した。タンパク質を30mM Bis-Tris pH6.5、500mM NaClになる20カラム体積の勾配により溶出させ、画分を4〜12%SDS-PAGEにより分析し、SimplyBlue Safe Stainで染色し、抗HisのWestern Blotにより可視化した。大部分のバイオコンジュゲート及び最小の非グリコシル化種を含有する画分をプール(42ml)し、4℃で一晩、4Lの5mM Na-リン酸pH7.2、150mM NaClに対して透析した。試料を5mM Na-リン酸pH7.2、150mM NaClで平衡化されたヒドロキシアパタイトカラム(Biorad)上に装填し、最大500mM Na-リン酸pH7.2、150mM NaClの差動勾配によって溶出した。画分を4〜12%SDS-PAGEで分析し、SimplyBlue Safe Stainで染色し、より長いグリカンを含有する画分をプールした。プールした試料(55ml)を10kDa分子量カットオフ(MWCO)フィルター(Millipore)中で濃縮し、サイズ排除カラム(Superdex 200 10/300、GE Healthcare)に注入し、平衡化し、1×TBS(Tris緩衝生理食塩水、Fisher Scientific)中で泳動させた。画分を4〜12%のSDS-PAGEで分析し、SimplyBlue Safe Stainで染色し、最小の非グリコシル化タンパク質及び不純物を含有する最も清浄な画分をプールし、滅菌濾過した。
[実施例4]
1つのプラスミドシステムからのCP8-ClfAN2N3 mut30バイオコンジュゲートの発現及び精製
図8は、2Lバイオリアクター中の1プラスミドシステムから発現され、均質に精製された、CP8-ClfAN2N3 mut30の最終生成物の抗ClfA及び抗CP8のウエスタンブロット分析であるSDS-PAGE SimplyBlue SafeStainを示す。
StGVXN8966株(W3110 waaL::pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V; O16::O11_ wbjB-wbpM;ΔrmlB-wecG;wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat)は、エレクトロポレーションにより、S. フレキシネル鞭毛Pリングタンパク質シグナル配列(Flgl)を有する、黄色ブドウ球菌クランピング因子ドメインN2N3グリコサイト突然変異体mut30をコードし、C末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有するプラスミド(pGVXN2685)で形質転換され、選択寒天プレート上に播種された。
10mM MgCl2が補足された400ml LB前培養液に細胞を接種し、一晩37℃で振とうし、1.4L TB培地を含有する2Lバイオリアクター(Infors Multitron)に接種した。組換え多糖を恒常的に発現させ、一方で、PglB及びClfAを1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)及び0.6%アラビノースでそれぞれ33の光学濃度OD600nmで誘導し、容器にTB培地とともに一晩供給し、1.8リットルの全体積に到達させた。
一晩の誘導後、合計138,600のODを回収し、0.9%塩化ナトリウムで洗浄した。バイオコンジュゲートを浸透圧ショック処理により抽出した。細胞(30,000 OD600同等量)を、50mlの再懸濁緩衝液(75%スクロース、30mM EDTA、600mM Tris HCl pH8.5)が補足された100ml 1/3×TBS(Tris緩衝生理食塩水、Fisher Scientific)に再懸濁し、30分間、4℃で回転させてインキュベートした。細胞をペレット化し、150mlの浸透ショック緩衝液(10mM Tris HCl pH8.0)に再懸濁し、30分間、4℃で再度インキュベートした。細胞をペレット化し、上清は、50mM MgCl2及び5×結合緩衝液が補足され、30mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールに到達させた。50mlのIMAC(固定化金属アフィニティークロマトグラフィー)ビーズは、30mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールで平衡化し、1時間、室温で撹拌することにより試料とともにインキュベートされた。レジンをXK26カラム(GE Healthcare)に充填し、30mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールで5カラム体積について洗浄した。タンパク質は、15カラム体積で30mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、500mMイミダゾールに到達する勾配を用いて溶出された。画分を4〜12% SDS-PAGEで分析し、抗Hisのウエスタンブロットで発色させ、バイオコンジュゲートを含有するすべての画分をプールし(128ml)、30mM Bis-Tris pH6.5、50mM NaClで平衡化したPallQカラム(Pall)上に直接装填した。タンパク質を30mM Bis-Tris pH6.5、500mM NaClになる20カラム体積の勾配により溶出させ、画分を4〜12% SDS-PAGEにより分析し、SimplyBlue Safe Stainで染色し、抗HisのWestern Blotにより可視化した。大部分のバイオコンジュゲート及び最小の非グリコシル化種を含有する画分をプール(55ml)し、4℃で一晩、4Lの5mM Na-リン酸pH7.2、150mM NaClに対して透析した。試料を5mM Na-リン酸pH7.2、150mM NaClで平衡化されたヒドロキシアパタイトカラム(Biorad)上に装填し、最大500mM Na-リン酸pH7.2、150mM NaClの差動勾配によって溶出した。画分を4〜12%SDS-PAGEで分析し、SimplyBlue Safe Stainで染色し、より長いグリカンを含有する画分を、より短いグリカンを含有する画分とは別々にプールした。プールした試料を10kDa MWCOフィルター(Millipore)中で別々に濃縮し、サイズ排除カラム(Superdex 200 10/300、GE Healthcare)に注入し、1×TBS(Tris緩衝生理食塩水、Fisher Scientific)中で泳動させた。画分を4〜12%のSDS-PAGEで分析し、SimplyBlue Safe Stainで染色し、最小の非グリコシル化タンパク質を含有する最も清浄な画分をプールし、滅菌濾過した。
[実施例5]
フラジェリンシグナル配列対OmpAシグナル配列からの担体発現を伴う黄色ブドウ球菌CP8-ClfAN2N3 mut30バイオコンジュゲート生成性の増大
図10は、ClfAN2N3 mut30に対する異なるシグナル配列による生成収量への影響を示し、S. フレキシネル鞭毛Pリングタンパク質Flglからのシグナル配列を有するCP8-ClfAN2N3 mut30バイオコンジュゲート生成性の増大を強調する。
StGVXN8966株(W3110 waaL::pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V; O16::O11_ wbjB-wbpM;ΔrmlB-wecG;wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat)は、エレクトロポレーションにより、個々に、大腸菌ジスルフィドオキシドレダクターゼDsbAシグナル配列(DsbA、pGVXN2684)、S. フレキシネル鞭毛Pリングタンパク質シグナル配列(Flgl、pGVXN2685)、大腸菌易熱性エンテロトキシンIIB、B鎖シグナル配列(LTIIb、pGVXN2686)、大腸菌マルトース結合タンパク質MalEシグナル配列(MalE、pGVXN2687)、P. カロトボラムペクターゼリアーゼ2前駆体シグナル配列(PelB、pGVXN2688)、S. アガラクティエ表面免疫原性タンパク質シグナル配列(SipA、pGVXN2689)、大腸菌トランスロケーションタンパク質シグナル配列(TolB、pGVXN2691)、大腸菌外膜タンパク質シグナル配列(OmpA、pGVXN2692)を有する黄色ブドウ球菌クランピング因子ドメインN2N3グリコサイト突然変異体mut30をコードするプラスミドで形質転換された。
細胞をTB培地中で増殖させ、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP8(CPS8)を、大腸菌ゲノムに組み込まれた遺伝子クラスターから構成的に発現させた。組み込まれたオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBを1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導し、プラスミド媒介性ClfAN2N3を0.6%アラビノースを用いて、0.86と0.96の間の光学濃度OD600nmで誘導した。
37℃で一晩誘導した後、細胞を回収し、CP8-ClfAN2N3バイオコンジュゲートを、1mg/mlリゾチームが補足された溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA、20%(w/v)スクロース)を用いてペリプラズム調製物によって抽出した。遠心分離後、上清からペリプラズムタンパク質を回収し、4〜12%SDS-PAGE上に装填し、ニトロセルロース膜上にブロットし、抗ヒスチジンタグ抗体で検出した。装填されたタンパク質は、細胞の光学密度について正規化された。結果を図10に示す。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際、本明細書に提供される主題の種々の変更は、記載されるものに加えて、前述の説明及び付随する図面から当業者に明らかになる。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることを意図している。
種々の刊行物、特許及び特許出願が本明細書で引用され、それらの開示は、全体が参照により組み込まれる。

Claims (40)

  1. 配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(X及びZは、独立してプロリンとは別の任意のアミノ酸である)から選択される1つ以上のコンセンサス配列を含み、前記コンセンサス配列が、配列番号3のアミノ酸残基313〜340の間の1つ以上のアミノ酸で、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されているという点で改変されているポリペプチド。
  2. 前記コンセンサス配列が、配列番号3におけるアミノ酸残基Q327、D329、P331又はI337と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3のアミノ酸残基Q327、D329、若しくはI337と同等であるアミノ酸位置で置換されている、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号3におけるアミノ酸残基I337と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3のアミノ酸残基I337と同等であるアミノ酸位置で置換されている単一のコンセンサス配列を含有する、請求項2に記載のポリペプチド。
  4. XがQ(グルタミン)であり、ZがA(アラニン)である(例えば、K-D-Q-N-A-T-K(配列番号23))、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. アミノ酸配列が、配列番号3のアミノ酸配列に関してP116からS及びY118からA(又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列における同等の位置)から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含み、任意選択的に配列番号4〜5又は10〜12のいずれか1つの配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含み(又はそれらからなり)、前記アミノ酸配列は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号21)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号22)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)コンセンサス配列を含み、該コンセンサス配列が配列番号3のI337位のアミノ酸と置換され、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列において配列番号3のアミノ酸残基Q327、D329、又はI337に同等であるアミノ酸位置で置換されている、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. N末端にさらなるセリン残基を有し、任意選択的に、配列番号6若しくは12と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有し、及び/又はC末端にさらなるグリシン又はグリシン-セリン残基を有し、任意選択的に、配列番号32と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記アミノ酸配列が、宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムにポリペプチドを方向付けることができるシグナル配列をさらに含み、任意選択的に前記シグナル配列は配列番号13〜20から選択され、任意選択的に前記ポリペプチドは配列番号5若しくは配列番号11と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. アミノ酸配列が、ClfAタンパク質の精製に有用であるペプチドタグをさらに含み、任意選択的に前記ペプチドタグは6個のヒスチジン残基を含み、任意選択的に前記ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置し、任意選択的に前記ポリペプチドは配列番号25、配列番号26若しくは配列番号27と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 前記ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 抗原、例えば、多糖又はオリゴ糖抗原に連結されている、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
  12. コンジュゲートが、任意選択的に、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイルスクシンイミド化学からなる群から選択される化学コンジュゲーション法を用いて得られる化学連結を通じて、直接的に又はリンカーを介して抗原に共有結合されている、請求項11に記載のコンジュゲート。
  13. 抗原が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えばアスパラギン)から選択される、ポリペプチド上のアミノ酸に連結されている、請求項11又は12に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
  14. 抗原が、糖、任意選択的に、黄色ブドウ球菌血清型5又は8の莢膜糖から任意選択的に選択される細菌莢膜糖(例えば、黄色ブドウ球菌由来)である、請求項11〜13のいずれか一項に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
  15. 抗原が、黄色ブドウ球菌血清型8由来の細菌莢膜糖である、請求項14に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
  16. 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  17. 請求項16に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  18. グリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の核酸、
    オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
    請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸、及び任意選択的に
    ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
    を含む宿主細胞。
  19. (a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項18に記載の宿主細胞。
  20. Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア属(Escherichia)種、シゲラ属(Shigella)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属(Salmonella)種、エルシニア属(Yersinia)種、アエロモナス属(Aeromonas)種、フランシセラ属(Francisella)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、プロテウス属(Proteus)種、ラクトコッカス属(Lactococcus)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)種、バチルス属(Bacillus)種、クロストリジウム属(Clostridium)種、リステリア属(Listeria)種、又はカンピロバクター属(Campylobacter)種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、請求項19に記載の宿主細胞。
  21. 前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、請求項18〜20のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  22. Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌(E. coli)O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であるか、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、請求項18〜21のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  23. 黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapK、並びに任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO及び/又はcapPを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項18〜22のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  24. 黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapK、並びに任意選択的に、緑膿菌(P. aeruginosa)O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB及び/又はwecCを含む、黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項18〜23のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  25. オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、請求項18〜24のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  26. 前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記莢膜多糖ポリメラーゼが、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、請求項18〜25のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  27. 前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記フリッパーゼが、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、請求項18〜26のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  28. 前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素、任意選択的にエピメラーゼをさらに含み、任意選択的に、前記エピメラーゼが、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的に前記エピメラーゼが、大腸菌由来であり、任意選択的に大腸菌O157由来のZ3206又はgalEである、請求項18〜27のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  29. ポリペプチドをコードする核酸が、宿主細胞中のプラスミドにある、請求項18〜28のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  30. 大腸菌である、請求項18〜29のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  31. 糖に連結された、ポリペプチドを含むバイオコンジュゲートを生産する方法であって、(i)タンパク質の生産に適した条件下で、請求項18〜30のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。
  32. ポリペプチド、例えば請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドに連結された糖を含む、請求項31に記載の方法によって生産されるバイオコンジュゲート。
  33. 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項11〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項32に記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
  34. ポリペプチド又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、請求項33に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
  35. 請求項34に記載の免疫原性組成物、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。
  36. それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防するための方法であって、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項11〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項32に記載のバイオコンジュゲート、又は請求項35に記載のワクチンの治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
  37. ヒト宿主を黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化する方法であって、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項11〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項32に記載のバイオコンジュゲート、又は請求項35に記載のワクチンの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。
  38. 対象において黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項11〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項32に記載のバイオコンジュゲート、又は請求項35に記載のワクチンの治療的又は予防的に有効な量を投与することを含む方法。
  39. 黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項11〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項32に記載のバイオコンジュゲート、又は請求項35に記載のワクチン。
  40. 黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項11〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項32に記載のバイオコンジュゲート、又は請求項35に記載のワクチンの使用。
JP2020534492A 2017-12-21 2018-12-19 免疫原性組成物 Pending JP2021506318A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1721582.3 2017-12-21
GBGB1721582.3A GB201721582D0 (en) 2017-12-21 2017-12-21 S aureus antigens and immunogenic compositions
PCT/EP2018/085857 WO2019121926A1 (en) 2017-12-21 2018-12-19 Immunogenic composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2021506318A true JP2021506318A (ja) 2021-02-22

Family

ID=61131713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020534492A Pending JP2021506318A (ja) 2017-12-21 2018-12-19 免疫原性組成物

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11819544B2 (ja)
EP (1) EP3728293A1 (ja)
JP (1) JP2021506318A (ja)
CN (1) CN111801343A (ja)
BR (1) BR112020012216A2 (ja)
CA (1) CA3086264A1 (ja)
GB (1) GB201721582D0 (ja)
MX (1) MX2020006328A (ja)
WO (1) WO2019121926A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201802339D0 (en) * 2018-02-13 2018-03-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
MA55365B1 (fr) * 2019-03-18 2023-09-27 Janssen Pharmaceuticals Inc Procedes de production de bioconjugues de polysaccharides o-antigenes d'e. coli, leurs compositions et leurs procedes d'utilisation
EP3770269A1 (en) 2019-07-23 2021-01-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Quantification of bioconjugate glycosylation
EP3777884A1 (en) * 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524844A (ja) * 2010-05-06 2013-06-20 グリコヴァキシン アーゲー 莢膜グラム陽性菌のバイオコンジュゲートワクチン
JP2017523794A (ja) * 2014-08-08 2017-08-24 グリコヴァキシン アーゲー バイオコンジュゲート生成において使用するための改変型宿主細胞

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
EP0027888B1 (en) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Semiconductor switch
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
DE3734306A1 (de) 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE4005528C2 (de) 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
DE69333107T2 (de) 1992-02-11 2004-01-29 Jackson H M Found Military Med Dualer träger für immunogene konstrukte
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
ES2162139T5 (es) 1993-03-23 2008-05-16 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Composiciones de vacuna que contienen monofosforil-lipido a 3-o-desacilado.
ATE254475T1 (de) 1993-09-22 2003-12-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
AU713040B2 (en) 1994-07-15 1999-11-18 University Of Iowa Research Foundation, The Immunomodulatory oligonucleotides
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
NZ304715A (en) 1995-03-22 1999-07-29 Jackson H M Found Military Med Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
EP0914178B1 (en) 1996-06-18 2003-03-12 Alza Corporation Device for enhancing transdermal agent delivery or sampling
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
DK0957972T3 (da) 1996-12-20 2003-07-21 Alza Corp Anordning og fremgangsmåde til at forøge transdermal middelflux
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
ES2298316T3 (es) 1997-09-05 2008-05-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas.
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN1285753A (zh) 1997-12-02 2001-02-28 鲍德杰克特疫苗公司 透皮给药微粒疫苗组合物
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20030113350A1 (en) 2001-09-19 2003-06-19 Fattom Ali I. Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations
PT1481057E (pt) 2002-03-07 2006-05-31 Eidgenoess Tech Hochschule Sistema e metodo para a producao de proteinas glicosiladas recombinantes num hospedeiro procariota
DE602006017207D1 (de) 2005-05-11 2010-11-11 Eth Zuerich Rekombinante n-glykosylierte proteine aus prokaryontischen zellen
CA2646891A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
EP2010537B1 (en) 2006-03-23 2011-12-28 Novartis AG Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
ES2684129T3 (es) 2008-02-20 2018-10-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Bioconjugados preparados a partir de proteínas N-glicosiladas recombinantes procedentes de células procariotas
MX2010011393A (es) 2008-04-16 2010-11-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna.
PL2271360T3 (pl) 2008-04-16 2016-03-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Szczepionka
WO2011007004A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Treatment of infections
WO2011006261A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ocean Harvest Technology (Canada) Inc. Natural and sustainable seaweed formula that replaces synthetic additives in fish feed
HUE038456T2 (hu) 2009-11-19 2018-10-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bioszintetikus rendszer, amely immunogén poliszaccharidokat termel prokarióta sejtekben
AU2013311534A1 (en) 2012-09-10 2015-03-12 Glycovaxyn Ag Bioconjugates comprising modified antigens and uses thereof
CN110423716A (zh) 2012-10-12 2019-11-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 宿主细胞修饰方法
WO2014072405A1 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Glycovaxyn Ag Production of recombinant vaccine in e. coli by enzymatic conjugation
CN106163550A (zh) 2013-12-04 2016-11-23 格林考瓦因有限公司 通过大肠杆菌中合成的糖蛋白疫苗预防金黄色葡萄球菌感染
JP6850724B2 (ja) 2014-12-30 2021-03-31 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム タンパク質グリコシル化のための組成物および方法
GB201802339D0 (en) * 2018-02-13 2018-03-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524844A (ja) * 2010-05-06 2013-06-20 グリコヴァキシン アーゲー 莢膜グラム陽性菌のバイオコンジュゲートワクチン
JP2017523794A (ja) * 2014-08-08 2017-08-24 グリコヴァキシン アーゲー バイオコンジュゲート生成において使用するための改変型宿主細胞

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLOS ONE, vol. Vol.3, Issue5, JPN6022050117, 2008, pages 2206, ISSN: 0004931984 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111801343A (zh) 2020-10-20
MX2020006328A (es) 2021-02-15
CA3086264A1 (en) 2019-06-27
GB201721582D0 (en) 2018-02-07
US11819544B2 (en) 2023-11-21
EP3728293A1 (en) 2020-10-28
BR112020012216A2 (pt) 2020-11-24
US20210077607A1 (en) 2021-03-18
WO2019121926A1 (en) 2019-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BE1024767B1 (fr) Composition immunogene
US11819544B2 (en) Immunogenic composition
US20220242920A1 (en) Immunogenic composition
AU2019221496B2 (en) Immunogenic composition comprising staphylococcal antigens
US20230060184A1 (en) Immunogenic composition
US20200179505A1 (en) Immunogenic composition
JP2021528059A (ja) グリコシル化されたＣｏｍＰピリンバリアント、製造方法及びその使用
US20230293657A1 (en) Vaccine
EP3777884A1 (en) Immunogenic composition
WO2023118033A1 (en) Vaccine
JP2024517754A (ja) Ｏ－結合型グリコシル化に十分な最小シークオン

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211216

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20211216

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221129

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230213

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230725