JP6850724B2 - タンパク質グリコシル化のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本明細書には、in vitroで、および宿主細胞内で、対象となるタンパク質をN-グリコシル化するのに使用するためのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(oligosaccharyl transferase)が記載される。このようなオリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用する方法、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞も本明細書に提供される。また、このようなオリゴサッカリルトランスフェラーゼを用いることによって生成された糖コンジュゲート(glycoconjugate)も本明細書に提供される。
糖コンジュゲートワクチンは、生命を脅かす多くの細菌感染症を予防するその能力のために広く認識されている。糖コンジュゲートワクチンは、一般的に有効で安全であると考えられており、30年以上にわたってヒトに使用されてきた。従来の糖質ワクチンの製造には、多くの場合、病原菌の多糖抗原による免疫原性キャリアタンパク質の化学的修飾が必要である。しかし、最近になって、糖コンジュゲートワクチンを製造するための生物工学的方法が登場してきており、こうした方法は、生産コストを低減させ、糖コンジュゲートワクチン製剤の均質性と、おそらくは効力および安全性とを、さらに向上させることが期待されている。
一態様においては、組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼが本明細書で提供され、該組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、還元末端にN-アセチル糖を欠くオリゴ糖または多糖を、N-グリコシル化コンセンサス配列でキャリアタンパク質に検出可能に連結することができる。
いくつかの実施形態では、前記1個以上のアミノ酸の改変は、アミノ酸の置換である。
いくつかの実施形態では、組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、組換えPglBCjである。
いくつかの実施形態では、結合したN-グリコシル化キャリアタンパク質のオリゴ糖または多糖成分は、その還元末端にガラクトース単糖を有する。
いくつかの実施形態では、組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、組換えPglBCjである。
別の態様においては、N311V置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCjが本明細書で提供される。
別の態様においては、N311V変異およびY77H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCjが本明細書に提供される。
別の態様においては、N311V変異およびS80R置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCjが本明細書に提供される。
別の態様においては、N311V変異およびQ287P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCjが本明細書に提供される。
別の態様においては、N311V置換およびA669V置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCjが本明細書に提供される。
別の態様においては、K482R置換およびD483H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCjが本明細書に提供される。
別の態様においては、N311V置換およびA669V置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCjが本明細書に提供される。
別の態様においては、N314V変異およびY79H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBClが本明細書に提供される。
別の態様においては、N314V変異およびS82R置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBClが本明細書に提供される。
別の態様においては、N314V変異およびQ289P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBClが本明細書に提供される。
別の態様においては、K488R置換およびD489H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBClが本明細書に提供される。
別の態様においては、本明細書に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸が本明細書に提供される。
別の態様においては、本明細書に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、組換えグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む。
別の態様においては、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌細胞である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、宿主細胞培養物からバイオコンジュゲートを精製することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、前記バイオコンジュゲートはN-グリコシル化されたキャリアタンパク質である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記バイオコンジュゲートの生産速度または収量を分析することをさらに含む。
本明細書で使用する略語「CP」は、「莢膜多糖」(capsular polysaccharide)を意味する。
本明細書で使用する略語「EL」は、「外部ループ」(external loop)を意味する。
本明細書で使用する略語「N-OST」は、N-オリゴサッカリルトランスフェラーゼを意味する。
本明細書で使用する略語「PglBCj」は、カンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)のN-OST PglBを指す。
本明細書で使用する略語「PglBCl」は、カンピロバクター・ラリ(C. lari)のN-OST PglBを指す。
本明細書には、改変された基質特異性を有する改変型N-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(N-OST)が提供される。具体的には、N-グリコシル化コンセンサス配列でタンパク質をN-グリコシル化するための基質として、N-OSTの野生型形態によっては使用され得ない(または検出可能なレベルで使用され得ない)オリゴ糖または多糖を用いることができる改変型N-OSTが本明細書で提供される。特定の実施形態では、改変型N-OSTは、例えばin vivoまたはin vitroで、N-グリコシル化キャリアタンパク質の検出可能なレベルを生産するために、このようなオリゴ糖または多糖を使用することができる。グリコシル化キャリアタンパク質のレベルは、ELISA、HPLC、LC-MSなどを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法により測定することができる;例えば、セクション6.10、セクション6.12、および実施例2〜3を参照されたい。いくつかの実施形態では、N-グリコシル化キャリアタンパク質の生産は、ELISAによって検出される。
一態様においては、組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(N-OST)が本明細書で提供され、該組換えN-OSTは、還元末端にN-アセチル糖を欠くオリゴ糖または多糖をキャリアタンパク質に検出可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、組換えN-OSTは、1個以上のアミノ酸の改変を含み、該アミノ酸は、その側鎖が、組換えN-OSTとグリコシル化キャリアタンパク質産物との複合体の構造モデルにおいて、結合したグリコシル化キャリアタンパク質産物の多糖成分の還元末端にある単糖単位から0.5〜10.0Åの距離内に位置するものである。いくつかの実施形態では、該改変はアミノ酸の置換である。いくつかの実施形態では、組換えN-OSTは、1個以上のアミノ酸の改変を含み、該アミノ酸は、その側鎖が、組換えN-OSTとグリコシル化キャリアタンパク質産物との複合体の構造モデルにおいて、結合したグリコシル化キャリアタンパク質産物の多糖成分の還元末端にある3つの末端単糖単位の1つから2.5〜4.0Åの距離内に位置するものである。いくつかの実施形態では、該改変はアミノ酸の置換である。例えば、図2およびセクション6.3を参照されたい。
前記オリゴ糖および多糖は、本明細書に記載の任意のオリゴ糖または多糖を含むことができる。例えば、セクション6.4を参照されたい。
前記キャリアタンパク質は、本明細書に記載の任意のキャリアタンパク質を含むことができる。例えば、セクション6.5を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変型N-OSTは、改変された野生型N-OST、例えば野生型PglBCjである。いくつかの実施形態では、野生型PglBCjは、配列番号1の野生型PglBCj、またはその天然の変異体である:
別の実施形態では、N311V置換およびY77H置換を含む組換えPglBCjが本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V置換およびS80R置換を含む組換えPglBCjが本明細書で提供される。
別の実施形態では、S80R置換およびQ287P置換を含む組換えPglBCjが本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V置換、Y77H置換およびQ287P置換を含む組換えPglBCjが本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V置換、Y77H置換、S80R置換およびQ287P置換を含む組換えPglBCjが本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V置換、Y77H置換、S80R置換、Q287P置換およびK289R置換を含む組換えPglBCjが本明細書で提供される。
別の実施形態では、K482R置換およびD483H置換を含む組換えPglBCjが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変型N-OSTは、改変された野生型N-OST、例えば野生型PglBCl(カンピロバクター・ラリのPglB)である。いくつかの実施形態では、野生型PglBClは、配列番号2の野生型PglBCl、またはその天然の変異体である:
いくつかの実施形態では、PglBClのアミノ酸N314が改変される。いくつかの実施形態では、N314の改変は、N314VまたはN314I置換である。いくつかの実施形態では、N314の改変はN314V置換である。
いくつかの実施形態では、PglBClのアミノ酸N314およびS82が改変される。いくつかの実施形態では、S82の改変は、S82R置換またはS82H置換である。いくつかの実施形態では、S82の改変はS82R置換である。
別の実施形態では、N314V置換およびY79H置換を含む組換えPglBClが本明細書で提供される。
別の実施形態では、N314V置換およびS82R置換を含む組換えPglBClが本明細書で提供される。
別の実施形態では、S82R置換およびQ289P置換を含む組換えPglBClが本明細書で提供される。
別の実施形態では、N314V置換、Y79H置換およびQ289P置換を含む組換えPglBClが本明細書で提供される。
別の実施形態では、N314V置換、Y79H置換、S82R置換およびQ289P置換を含む組換えPglBClが本明細書で提供される。
別の態様においては、本明細書に記載の組換えN-OSTのライブラリーをスクリーニングする方法が本明細書で提供され、この方法は、組換えN-OSTのライブラリーの各メンバーを、キャリアタンパク質および還元末端にN-アセチル糖を欠くオリゴ糖または多糖と接触させて、バイオコンジュゲートを生成させることを含む。
いくつかの実施形態では、該バイオコンジュゲートはN-グリコシル化されたキャリアタンパク質である。
前記キャリアタンパク質は、本明細書に記載の任意のキャリアタンパク質を含み得る。例えば、セクション6.5を参照されたい。
いくつかの実施形態では、前記方法は、組換えN-OSTのライブラリーから1つ以上の組換えN-OSTを選択することをさらに含む。
本明細書に開示される組換えN-OSTを説明するために使用される構造モデルは、組換えN-OSTと、結合したN-グリコシル化キャリアタンパク質との複合体を含み、当業者に公知の任意の方法を用いて得ることができる。例えば、構造モデルは、X線結晶学または核磁気共鳴分光法(NMR)を用いて得ることができる。タンパク質複合体の構造モデルを得るための代表的な方法は、例えば、Bernhard Rupp, Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology, Garland Science, 1 edition (October 20, 2009); Eaton E. Lattman and Patrick J. Loll; Protein Crystallography: A Concise Guide, Johns Hopkins University Press; 1 edition (March 26, 2008); Arthur G. Palmer III and Wayne J. Fairbrother; Protein NMR Spectroscopy, Second Edition: Principles and Practice; Academic Press, 2 edition (December 28, 2005)に記載される。構造モデルは、例えば、N-OSTと結合N-グリコシル化キャリアタンパク質との複合体のX線構造モデルまたはNMR構造モデルであり得る。いくつかの実施形態では、構造モデルは、組換えN-OSTと結合N-グリコシル化キャリアタンパク質との複合体のホモロジーモデルであり得る。例えば、実施例1および図2を参照されたい。N-グリコシル化キャリアタンパク質のオリゴ糖または多糖成分およびキャリアタンパク質成分は、生成物コンフォメーションまたは基質コンフォメーションでモデル化することができる。
本明細書で提供される組換えN-OSTによってキャリアタンパク質に連結され得るオリゴ糖は、2〜100の単糖単位を有することができ、例えば、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90または100の単糖単位を有する。本明細書で提供される組換えN-OSTによってキャリアタンパク質に連結され得る多糖は、100を超える単糖単位を有することができ、例えば、101、110、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000の単糖単位またはそれ以上を有する。
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、例えば、S.エンテリカLT2のように、その還元末端にガラクトース残基を含む。
キャリアタンパク質は、本明細書で提供される組換えN-OSTによってオリゴ糖または多糖に連結され得る。例えば、セクション6.1を参照されたい。
N-OSTは、本明細書に開示された任意のN-OSTを含むことができる。例えば、セクション6.1を参照されたい。
別の態様においては、本明細書(例えば、セクション6.1)に記載の組換えN-OSTをコードする核酸が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、核酸は、PglBCjのアミノ酸N311が改変されたPglBCjをコードする。いくつかの実施形態では、N311の改変は、N311VまたはN311I置換である。いくつかの実施形態では、N311の改変は、N311V置換である。
いくつかの実施形態では、核酸は、PglBCjのアミノ酸N311およびS80が改変された組換えPglBCjをコードする。いくつかの実施形態では、S80の改変は、S80R置換またはS80H置換である。いくつかの実施形態では、S80の改変は、S80R置換である。
別の実施形態では、N311V置換およびY77H置換を含む組換えPglBCjをコードする核酸が本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V置換およびS80R置換を含む組換えPglBCjをコードする核酸が本明細書で提供される。
別の実施形態では、S80R置換およびQ287P置換を含む組換えPglBCjをコードする核酸が本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V置換、Y77H置換およびQ287P置換を含む組換えPglBCjをコードする核酸が本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V変異、Y77H置換、S80R置換およびQ287P置換を含む組換えPglBCjをコードする核酸が本明細書で提供される。
別の実施形態では、N311V置換およびA699V置換を含む組換えPglBCjをコードする核酸が本明細書で提供される。
別の実施形態では、K482R置換およびD483H置換を含む組換えPglBCjをコードする核酸が本明細書で提供される。
別の態様においては、本明細書に記載の組換えN-OSTを含む宿主細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、該宿主細胞は、本明細書に記載の2つ以上の組換えN-OST(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の組換えN-OST)を含む。
本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、宿主細胞内で生産されたタンパク質(例えば、本明細書に記載の任意のキャリアタンパク質;例えば、セクション6.5)とオリゴ糖または多糖(例えば、本明細書に記載の任意のオリゴ糖または多糖;例えば、セクション[00201])とのコンジュゲート(複合体)であり、この場合には、宿主細胞機構がオリゴ糖または多糖を該タンパク質に連結する(例えば、N-結合)。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は抗原(例えば、本明細書に記載の任意の抗原;例えば、セクション6.4参照)である。糖コンジュゲートは、バイオコンジュゲートだけでなく、他の手段によって、例えばタンパク質と糖抗原の化学結合によって調製された糖抗原(例えば、オリゴ糖および多糖)-タンパク質コンジュゲートをも含むことができる。
いくつかの実施形態では、EPAと、1種以上の異なる本明細書に記載のオリゴ糖または多糖とを含むバイオコンジュゲートが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えN-OST(例えば、セクション6.1参照)は、糖コンジュゲートなどの本明細書に記載のバイオコンジュゲート(例えば、セクション6.8参照)を生産するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えN-OSTは、コンジュゲートワクチン、すなわち、オリゴ糖または多糖(例えば、セクション5.4参照)と病原体(これに対してワクチンが設計される)のタンパク質抗原とを含むワクチン、を製造するために使用され得る。
様々な方法を用いて、本明細書に記載のバイオコンジュゲートまたはN-グリコシル化キャリアタンパク質の構造組成および糖鎖長を分析することができる。
別の実施形態では、完全な糖コンジュゲートのサイズを測定するために、高質量MSおよびサイズ排除HPLCを適用することができる。
特定のタンパク質における該部位の利用が変化することを示すために、グリコシル化部位利用を定量化することができる。そうするための方法を以下に示す。
サイズ排除HPLC:より高いグリコシル化部位の利用は、SE HPLCカラムからのより早い溶出時間に反映される。(a)も参照のこと。
糖コンジュゲートの均質性(結合した糖残基の均質性)は、グリカンの長さおよび流体力学的半径を測定する方法を用いて評価することができる。
本明細書に記載の組換えN-OST(例えば、セクション5.1参照)および本明細書に記載の組換えN-OST(例えば、セクション6.1参照)を使用する本明細書に記載の方法(例えば、セクション6.2および6.9参照)は、高度に均質なバイオコンジュゲート調製物(例えば、糖コンジュゲート調製物またはコンジュゲートワクチン製剤)の迅速で高収量の、大規模かつ低コストの発酵を可能にするため、特に商業上重要でありかつ適切である。本明細書に記載の組換えN-OSTは、コンジュゲートワクチンのような商業上および治療上価値のあるバイオコンジュゲートの経済的に実施可能な生産を可能にする。本明細書に記載の組換えN-OSTを使用する酵素的生産プロセスは、一般的に使用される化学合成法よりも均質で、再現可能なバイオコンジュゲート調製物をもたらすと期待される。本明細書に記載の組換えN-OSTを使用する生物工学的バイオコンジュゲート生産方法の再現性およびロバスト性は、生産コストの低減に寄与すると期待される。特に生物学的薬剤であるコンジュゲートワクチンの均質性は、医薬品の臨床的安全性に影響を及ぼすと一般に考えられている。
収量: 収量は、最適制御された条件下でバイオリアクター内で増殖させた細菌生産培養物1リットルから得られる炭水化物(carbohydrate)量として測定される。糖コンジュゲートの精製後、炭水化物の収量は、アントロンアッセイまたは炭水化物特異的抗血清を用いるELISAのいずれかによって、直接測定することができる。間接測定は、タンパク質の量(周知のBCA、ローリー(Lowry)、またはブラッドフォード(bardford)アッセイで測定)およびグリカンの長さと構造を用いてタンパク質1グラムあたりの理論炭水化物量を計算することによって可能である。さらに、収量は、揮発性緩衝液から糖タンパク質調製物を乾燥させ、はかりを使って重さを量ることにより、測定することもできる。
本発明は、以下のパラグラフでさらに説明される:
34. 組換えPglBCjが置換N311Vまたは置換N311Iを含む、パラグラフ33に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
35. 組換えPglBCjが置換N311Vを含む、パラグラフ34に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
58. オリゴ糖または多糖成分が抗原を含む、パラグラフ55に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
69. 前記改変がアミノ酸置換である、パラグラフ55〜68のいずれか1つに記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
70. アミノ酸置換が非保存アミノ酸の置換である、パラグラフ69に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
80. PglBCjのN311が改変される、パラグラフ79に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
82. 組換えPglBCjがアミノ酸置換N311Vを含む、パラグラフ81に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
89. 組換えPglBCjが置換N311Vを含む、パラグラフ73〜78のいずれか1つに記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
107. N311V変異およびY77H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
108. N311V変異およびS80R置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
110. N311V変異およびQ287P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
111. N311V変異、Y77H置換およびQ287P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
112. N311V変異、S80R置換およびQ287P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
113. N311V置換、Y77H置換、S80R置換およびQ287P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
114. N311V置換およびA669V置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
116. K482R置換およびD483H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
117. N311V置換およびA669V置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCj。
119. N314V変異およびY79H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCl。
120. N314V変異およびS82R置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCl。
122. N314V変異およびQ289P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCl。
123. N314V変異、Y79H置換およびQ289P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCl。
124. N314V変異、S82R置換およびQ289P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCl。
125. N314V置換、Y79H置換、S82R置換およびQ289P置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCl。
126. K488R置換およびD489H置換を含む組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBCl。
128. パラグラフ1〜127のいずれか1つに記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞。
129. 組換えグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、パラグラフ128に記載の宿主細胞。
130. パラグラフ128に記載の核酸を含む宿主細胞。
131. 宿主細胞が原核細胞である、前記パラグラフのいずれか1つに記載の宿主細胞。
132. 宿主細胞が大腸菌細胞である、パラグラフ131に記載の宿主細胞。
134. 宿主細胞がキャリアタンパク質および組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む、パラグラフ133に記載の方法。
135. 宿主細胞が組換えグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、パラグラフ134に記載の方法。
136. 組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼが組換えPglBCjである、パラグラフ134に記載の方法。
139. バイオコンジュゲートが天然C.ジェジュニN-グリコシル化キャリアタンパク質である、パラグラフ134に記載の方法。
140. バイオコンジュゲートが異種C.ジェジュニN-グリコシル化キャリアタンパク質である、パラグラフ134に記載の方法。
141. N-グリコシル化キャリアタンパク質が、そのオリゴ糖または多糖成分の還元末端にN-アセチル糖を有しない、パラグラフ138に記載の方法。
142. N-グリコシル化キャリアタンパク質が、そのオリゴ糖または多糖成分の還元末端にガラクトースを有する、パラグラフ141に記載の方法。
146. 宿主細胞培養物からバイオコンジュゲートを精製することをさらに含む、前記パラグラフのいずれか1つに記載の方法。
149. 前記接触がin vitroで起こる、パラグラフ147または148に記載の方法。
150. 前記接触がin vivoで起こる、パラグラフ147または148に記載の方法。
151. 前記接触が宿主細胞内で起こる、パラグラフ150に記載の方法。
152. 宿主細胞が原核細胞である、パラグラフ151に記載の方法。
153. 宿主細胞が大腸菌細胞である、パラグラフ151に記載の方法。
160. バイオコンジュゲートの生産速度または収量を分析することをさらに含む、パラグラフ133〜159のいずれか1つに記載の方法。
163. 組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼの3個以上のアミノ酸を改変することを含む、パラグラフ161に記載の方法。
164. 組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼの4個以上のアミノ酸を改変することを含む、パラグラフ161に記載の方法。
166. 膜貫通ドメインのペリプラズムループが大きな外部ループ5 (EL5)である、パラグラフ165に記載の方法。
168. QLKFYxxRモチーフがQ287LKFYxxR294モチーフである、パラグラフ167に記載の方法。
171. 組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼが組換えPglBCjである、パラグラフ161に記載の方法。
7.1 実施例1:PglB Cj およびin silicoオリゴ糖結合のモデリング
C.ジェジュニPglBのホモロジーモデルのセットは、テンプレートとして実験的C.ラリ構造(PDBid 3RCE)を用いた異なるホモロジーモデリング法を用いて作成した。HHpredB法(Soeding J, Biegert A, Lupas AN. The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acids Res. 2005:33, W244-8)で作成されたモデルが選択されたが、それは、その座標がQMEANモデル品質評価ツール(Benkert P, Biasini M, Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bioinformatics. 2011: 27:343-350)によってより良いスコアを付けられたためである。次に、Mg2+イオンおよびアクセプターペプチドをC.ラリ構造(PDBid 3RCE)から移した。細胞質膜中の該タンパク質の配向を可視化するために、リン脂質二重層モデルをC.ラリのOPMデータベースエントリーに従って誘導した(Lomize MA, Pogozheva ID, Joo H, Mosberg HI, Lomize AL. OPM database and PPM web server: resources for positioning of proteins in membranes. Nucleic Acids Res. 2012 40:D370-6)。C.ジェジュニの天然ヘプタサッカリドリガンドおよびS.エンテリカLT2多糖の第1反復単位を、電荷および互変異性体を考慮してパラメータ化し、低エネルギーコンフォメーションを作成させた(Shelley JC, Cholleti A, Frye LL, Greenwood JR, Timlin MR, Uchimaya M: J Comput Aided Mol Des. 2007, (12):681-91)。次いで、これらの低エネルギーコンフォメーションをモデルに入れて、立体構造的にサンプリングした(Kolossvary, I.; Guida, W. C. Low-mode Conformational Search Elucidated. Application to C39H80 and Flexible Docking of 9-Deazaguanine Inhibitors to PNP. J. Comput. Chem. 1999, 20, 1671)。サッカリドは自由に動く基礎構造と定義され、全てのタンパク質骨格原子と、OS周囲の半径6Åの全ての原子に位置制約(position constraint)を加えた。第1サッカリド単位とASP-Nとの間のCO-NおよびN-C1結合に距離拘束(distance constraint)を適用した。全原子水モデル(full atom water model)および35kcal mol-1ウィンドウを含むOPLS (Kaminski, G. A.; Friesner, R. A.; Tirado-Rives, J.; Jorgensen, W. J. J. Phys. Chem. B 2001, 105, 6474)を適用して、1000ステップのコンフォメーションサンプリングをセットアップし、可能性があるコンフォメーションをスクリーニングして、21kJ mol-1のより狭いエネルギーウィンドウを用いて同様のプロトコルによりリファインした。
本研究で使用した細菌株およびプラスミドを表1に記載する。大腸菌W3110 waaLを、in vivoグリコシル化実験でEPA-C.ジェジュニOSおよびEPA-赤痢菌O1糖コンジュゲート、ならびにEPA-CP5を生産させるための宿主株として使用した。LT2多糖を生産しかつ機能性waaL遺伝子を欠くS.エンテリカ血清型ティフィムリウムSGSC228をLT2-EPA生産のために使用した。ウルトラコンピテント大腸菌細胞を、構築されたプラスミドライブラリーおよび変異体の初期形質転換に使用した。大腸菌DH5αをプラスミドの生産および貯蔵のための標準宿主として使用した。
様々なオリゴ糖/多糖基質についてのin vivoグリコシル化速度に対するPglBCj変異体N311Vの効果を、振盪フラスコ培養で分析した(図6)。PglBCjN311VおよびPglBwtを低コピー数ベクターから発現させた。変異体N-OSTを発現する細胞は、一晩誘導後に8倍多くのLT2-EPAを生成した(図6A)。2時間および4時間の誘導後の改善倍率は、それぞれ22倍および11倍であった。CP5-EPA形成の初期速度は5.1倍増加した(図6B)。O1-EPA形成の初期速度も変異体N311Vにおいて2倍に増加した(図6C)が、ライブラリースクリーニングではこの多糖基質を使用しなかった。対照的に、PglBの天然C.ジェジュニOS基質によるEPAのin vivoグリコシル化では、有意な効果が見られなかった。ELISAシグナルの経時的増加およびN311Vの有益なまたは中立的な効果は、例示的ペリプラズムタンパク質サンプルについてのウェスタンブロットの結果に対応した(図7)。
反復的な飽和変異導入の原理に従って、PglBCj N311VをY77およびS80のランダム化のためのテンプレートとして使用した。後者の残基はまた、PglBホモログ間で変化し(図4)、外部ループEL1が膜から突き出ている位置のすぐ上でモデル化オリゴ糖基質結合部位に面している(図2)。Y77およびS80は両方とも非常に変異耐性であり、LT2-EPA生産についてスクリーニングしたとき70〜80%が活性クローンであることが見出された(表1)。最も高いELISAシグナルを示した10個のクローンの配列を決定したところ、Y77は多様なアミノ酸に変化したが、塩基性側鎖を有する残基に偏っていた(表2)。S80をランダム化するNNKライブラリーでは、変異体S80Rが上位パフォーマンスクローンの中で優勢であった(表2)。
保存されていないPglBCj残基K482およびD483を、フォワードオリゴヌクレオチドプライマー5'- GTA GAT GGT GGA AAG CAT TTW GGT NDT NDT AAT TTT TTC CCT TCT TTT GCT TTA AGC -3'およびリバースプライマー5'- GCT TAA AGC AAA AGA AGG GAA AAA ATT AHN AHN ACC WAA ATG CTT TCC ACC ATC TAC -3'(変異コドンには下線を引いた;N=A、T、GまたはC; D=A、TまたはG; W=AまたはT)を用いたQuikChangeによって、12種の重複なしの(non-redundant)、化学的に多様なアミノ酸(S、N、I、V、D、G、F、Y、C、L、H、R)に同時にランダム化した。C末端HAタグを有する野生型PglBの遺伝子配列をコードする、中程度のコピー数の、IPTG誘導プラスミドpGVXN407をテンプレートとして使用した。ライブラリーの品質は、無作為に選別した20個のクローンの配列を決定することによって確認した。全ての所望のヌクレオチドが変異コドンで検出され、野生型pglB配列を有するクローンの割合は15%以下であった。このライブラリー(Faと命名した)を大腸菌St1717 (pGVXN150, pGVXN393)発現株に導入して形質転換し、以前に記載されたように(Ihssen et al., 2012, BMC Biotechnolgy 12:67)、96ディープウェルプレートでスクリーニングした。全部で801個のクローンをスクリーニングし、例示的なスクリーニング結果を図10に示す。クローンFa8_G10 (図10に丸で囲った)は、8つのレプリケートウェルで再スクリーニングした場合、著しく増加した糖タンパク質特異的ELISAシグナルを示し、二重変異PglBCj K482R-D483Hを有することが判明した(表3)。アミノ酸変化K482R-D483HをQuikChangeにより低コピー数プラスミドpGVXN114の野生型pglB配列に導入し、プラスミドpGVXN635を得た。野生型および変異型プラスミドを大腸菌St1717 (pGVXN150, pGVXN393)発現株に導入して形質転換し、CP5-EPAの生産を、以前に記載されたように(Ihssen et al., 2012, BMC Biotechnolgy 12:67)、3つ組の振盪フラスコ実験で分析した。二重変異体PglBCjK482R-D483Hは、サンドイッチELISAで測定して、CP5-EPAレベルの1.2〜2.0倍の増加を促した(図11)。
様々な刊行物、特許および特許出願が本明細書中で引用されており、それらの開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (15)
- 配列番号1のカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)のPglB(PglBCj)に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(N-OST)であって、還元末端にN-アセチル糖を欠くオリゴ糖または多糖を、N-グリコシル化コンセンサス配列でキャリアタンパク質に検出可能に連結することができることを特徴とし、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)のPglB (PglBCj)のY77、S80、N311、K482、およびD483からなる群より選択される1個以上のアミノ酸が改変されており、Y77はH、T、W、R、K、AもしくはGに改変され;S80はRもしくはHに改変され;N311はVもしくはIに改変され;K482はRもしくはSに改変され;またはD483はHもしくはFに改変されている、上記組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 更にPglBCjのH479、K522およびG476から選択される1個以上のアミノ酸の改変を含み、H479がNもしくはWに改変されているか、またはG476がPに改変されている、請求項1に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼが1個以上のアミノ酸の改変を含み、該アミノ酸は、その側鎖が、組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼとN-グリコシル化キャリアタンパク質との複合体の構造モデルにおいて、結合したN-グリコシル化キャリアタンパク質のオリゴ糖または多糖成分の還元末端にある3つの末端単糖単位の1つから2.5〜4.0Åの距離内に位置するものである、請求項1または2に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼが2個以上のアミノ酸の改変を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 前記1個以上のアミノ酸の少なくとも1つが、組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼの膜貫通ドメインのペリプラズムループに位置する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、PglBCjのQLKFYxxRモチーフ中のQ287、L288、K289、F290、Y291およびR294に対応する残基からなる群より選択される1個以上のアミノ酸の変異をさらに含む、請求項2に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- PglBCjのN311が改変されている、請求項6に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 組換えPglBCjが、Y77およびS80からなる群より選択される1個以上のアミノ酸の改変をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 組換えPglBCjが、PglBCjのQ287LKFYxxR294モチーフの1個以上のアミノ酸のアミノ酸改変をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 組換えPglBCjが、Q287、L288、K289およびR294からなる群より選択される1個以上のアミノ酸のアミノ酸改変を含む、請求項9に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 配列番号2のカンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)のPglB(PglB Cl )に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(N-OST)であって、還元末端にN-アセチル糖を欠くオリゴ糖または多糖を、N-グリコシル化コンセンサス配列でキャリアタンパク質に検出可能に連結することができることを特徴とし、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)のPglB (PglB Cl )のY79、S82、N314、K488、およびD489からなる群より選択される1個以上のアミノ酸が改変されており、Y79はH、T、W、R、K、AもしくはGに改変され;S82はRもしくはHに改変され;N314はVもしくはIに改変され;K488はRに改変され;またはD489はHに改変されている、上記組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換えN-オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞。
- 請求項13に記載の宿主細胞を細胞培養培地中で培養することを含む、バイオコンジュゲートの生産方法。
- 宿主細胞培養物からバイオコンジュゲートを精製することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
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