BE1022998B1 - Compositions et procédés de glycosylation de protéines - Google Patents

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BE1022998B1 BE2015/5846A BE201505846A BE1022998B1 BE 1022998 B1 BE1022998 B1 BE 1022998B1 BE 2015/5846 A BE2015/5846 A BE 2015/5846A BE 201505846 A BE201505846 A BE 201505846A BE 1022998 B1 BE1022998 B1 BE 1022998B1
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Abstract

La présente invention concerne des oligosaccharyl transférases permettant de N-glycosyler des protéines d'intérêt in vitro et dans des cellules . hôtes. L'invention concerne également des procédés d'utilisation de ces oligosaccharyl transférases, des acides nucléiques codant ces oligosaccharyl transférases et des cellules hôtes comprenant ces oligosaccharyl transférases. En outre, l'invention concerne des glycoconjugués générés au moyen de ces oligosaccharyl transférases.

Description

COMPOSITIONS ET PROCÉDÉS DE GLYCOSYLATION DE PROTÉINES 1. Introduction
La présente invention concerne des oligosaccharyl transférases permettant de N-glycosyler des protéines d'intérêt in vitro et dans des cellules hôtes. L'invention concerne également des procédés d'utilisation de ces oligosaccharyl transférases, des acides nucléiques codant ces oligosaccharyl transférases et des cellules hôtes comprenant ces oligosaccharyl transférases. En outre, l'invention concerne des glycoconjugués générés au moyen de ces oligosaccharyl transférases. 2. Contexte de l'invention
Les vaccins à glycoconjugué sont largement connus pour leur capacité à prévenir de nombreuses infections bactériennes potentiellement mortelles. On considère généralement que les vaccins à glycoconjugué sont efficaces et sûrs et ils sont utilisés chez les humains depuis plus de 30 ans. La production classique des glycovaccins implique souvent la modification chimique de protéines immunogènes de support avec des antigènes polysaccharidiques de bactéries pathogènes. Cependant, plus récemment, des procédés biotechnologiques de production de vaccins à glycoconjugué sont apparus, grâce auquel on s'attend à réduire les coûts de production et à augmenter davantage l'homogénéité et éventuellement l'activité thérapeutique et l'innocuité des préparations vaccinales à glycoconjugué.
Chez les cellules eucaryotes, la glycosylation des azotes est un mécanisme crucial de modification des protéines post-traduction impliquant plusieurs enzymes. Chez les cellules procaryotes, la glycosylation des azotes est catalysée par certaines N-oligosaccharyl-transférases bactériennes (N-OST). Le groupe de gènes de glycosylation des protéines de Campylobacter jejuni (C. jejuni) comprend le gène pglB, qui code une N-OST liée à la membrane (PglBcj) . PglBcj peut être exprimée dans des hôtes bactériens classiques, tels qu'Escherichia coli (E. coli), et peut glycosyler les protéines périplasmiques co-exprimées portant au moins un motif de glycosylation D/E-Y-N-X-S/T (Y, X Φ P) exposé en surface. PglBcj peut transférer des antigènes polysaccharidiques bactériens sur les protéines de C. jejuni, ainsi que sur des protéines immunogènes de support d'autres organismes contenant des sites de glycosylation génétiquement modifiés. PglBcj peut transférer des oligosaccharides de C. jejuni et, jusqu'à un certain degré, des structures lipopoly-saccharidiques d'antigènes 0 de bactéries à Gram-négatif et des polysaccharides antigéniques capsulaires de bactéries à Gram-positif.
La présente divulgation propose des N-OST recombinantes dont les spécificités vis-à-vis du substrat sont modifiées et des procédés d'utilisation des N-OST recombinantes pour produire des vaccins à glycoconjugué. Ces N-OST recombinantes peuvent être utilisées de manière avantageuse dans la N-glycosylation des protéines. 3. Résumé
Dans un aspect, il est proposé dans le présent document une N-oligosaccharyl transférase modifiée recombinante (N-OST), dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglB de Campylobacter jejuni (PglBcj) comprenant une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N311, K482, D483 et A669.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé N311 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G) , l'alanine, la valine (V), la leucine (L) ou 1'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N311V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K482 par un acide aminé basique choisi parmi la lysine (K) ou l'arginine (R).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution K482R.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution D483H.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé A669 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H et une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution supplémentaire à la position d'acide aminé N534.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N534Q.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H et une substitution A669V.
Une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglB de Campylobacter lari (PglBci) comprenant trois substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488 et D489, et une autre substitution d'acide aminé dans une région comprenant les positions d'acide aminé P667 à 1672 de PglBci (PYAQFI) . , La N-OST modifiée recombinante selon la revendication 6, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489 et K668.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglB de Campylobacter lari (PglBci) comprenant une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489 et K668. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé N314 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G) , l'alanine, la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N314V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K488 par un acide aminé basique choisi parmi la lysine (K) ou l'arginine (R).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution K488R.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution D483H.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K668 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H et une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489, N535 et K668.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N535Q.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H, une substitution N535Q et une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut lier de manière détectable un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice à une protéine de support pour produire une protéine de support N-glycosylée.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est choisie dans le groupe constitué par l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, l'anatoxine diphtérigue, l'anatoxine tétanique, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur agglutinant A, le facteur agglutinant B, FimH d'E. coli, FimHC d'E. coli, l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, les variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB), la toxine cholérique, les variants détoxifiés de la toxine cholérique, la protéine sat d'E. coli, le domaine passager de la protéine sat d'E. coli, AcrA de C. jejuni et les glycoprotéines naturelles de C. jejuni.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu du sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice comprend un antigène.
Dans certains modes de réalisation, l'antigène comprend un antigène d'E. coli, un antigène de Salmonella sp, un antigène de Pseudomonas sp. , un antigène de Klebsiella sp., un antigène 0 d'Acinetobacter, un antigène de Chlamydia trachomatis, un antigène de Vibrio choiera, un antigène de Listeria sp., un antigène de Légionella pneumophila sérotypes 1 à 15, un antigène de Bordetella parapertussis, un antigène de Burkholderia mallei ou de pseudomallei, un antigène de Francisella tularensis, un antigène de Campylobacter sp. ; un antigène de Clostridium difficile, un antigène de Streptococcus pyrogenes, un antigène de Streptococcus agalacticae, un antigène de Neisseria meningitidis, un antigène de Candida albicans, , un antigène de Haemophilus influenza, un antigène d’Enterococcus faecalis, un antigène de Borrelia burgdorferi, un antigène de Neisseria meningitidis, un antigène de Haemophilus influenza, un antigène de Leishmania major, ou un antigène de Shigella sonnei, ou un antigène de Streptococcus pneumoniae.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support et l'oligosaccharide ou le polysaccharide proviennent d'un organisme différent de C. jejuni ou C. lari.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support et l'oligosaccharide ou le polysaccharide proviennent d'organismes différents.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support provient de C. jejuni ou C. lari.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support provient d'un organisme différent de C. jejuni ou C. lari.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support N-glycosylée comprend le polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus (CPS 5) et 1'hémolysine A détoxifiée (H1A) de S. aureus.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support N-glycosylée comprend le polysaccharide capsulaire CP8 de Staphylococcus aureus (CPS 8) et le facteur agglutinant A (ClfA) d'E. coli.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support N-glycosylée comprend le polysaccharide capsulaire CPI de Streptococcus pneumoniae (CPS 1) et l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA).
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice présente un monosaccharide galactose à son extrémité réductrice.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut produire un rendement de la protéine de support N-glycosylée qui est détectable à des niveaux de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois supérieurs au niveau de base dans un essai détectant la protéine de support N-glycosylée.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut augmenter le rendement de production de la protéine de support N-glycosylée de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport au rendement obtenu en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, une N-OST modifiée recombinante présentant seulement une unique, une double ou une triple substitution d'acide aminé, comme par exemple PglBcj (N534QV) ou PglBci (N535Q) ) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut augmenter la vitesse de production de la protéine de support N-glycosylée de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport à la vitesse de production obtenue en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, une N-OST modifiée recombinante présentant seulement une unique, une double ou une triple substitution d'acide aminé, comme par exemple PglBcj (N534Q) ou PglBci (N535Q) ) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut donner un niveau de glycosylation in vivo ou in vitro du support avec l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu du sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice d'au moins 1 %, d'au moins 3 %, d'au moins 5 %, d'au moins 10 %, d'au moins 15 %, d'au moins 20 %, d'au moins 25 %, d'au moins 30 %, d'au moins 35 %, d'au moins 40 %, d'au moins 45 %, d'au moins 50 %, d'au moins 55 %, d'au moins 60 %, d'au moins 65 % ou d'au moins 70 %.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglBcj · comprenant une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H et une substitution A699V.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglBçj comprenant une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H, une substitution N534Q et une substitution A699V.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglBci comprenant une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H et une substitution K698.V.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglBci comprenant une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H, une substitution N535Q et une substitution K698V.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document un acide nucléique codant une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend en outre une glycosyltransférase recombinante.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une cellule hôte comprenant un acide nucléique proposé dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule procaryote.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule d'E. coli.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document un procédé de production d'un bioconjugué comprenant la culture d'une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications précédentes dans un milieu de culture de cellules.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend une protéine de support et une PglBcj modifiée recombinante ou une PglBci modifiée recombinante.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend en outre une glycosyltransférase recombinante.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est choisie parmi l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur agglutinant A, le facteur agglutinant B, FimH d'E. coli, FimHC d'E. coli, l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, les variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB), la toxine cholérique, les variants détoxifiés de la toxine cholérique, la protéine sat d'E. coli, le domaine passager de la protéine sat d 'E. coli, AcrA de C. jejuni et les glycoprotéines naturelles de C. jejuni.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est une protéine de support N-glycosylée.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est une protéine de support N-glycosylée naturelle de C. jejuni.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est une protéine de support N-glycosylée hétérologue de C. jejuni.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support N-glycosylée ne présente pas un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice de son composant oligosaccharidique ou polysaccharidique.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support N-glycosylée présente un galactose à l'extrémité réductrice de son composant oligosaccharidique ou polysaccharidique.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CPI de Streptococcus pneumoniae (CPS 1) et l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA).
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus (CPS 5) et 1'hémolysine A détoxifiée (H1A) de S. aureus.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP8 de Staphylococcus aureus (CPS 8) et le facteur agglutinant A (Clf A) d'E. coli.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend l'antigène 0 de Plesiomonas shigelloides 017 (017) et une EPA. .
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut augmenter la vitesse de production du bioconjugué.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut produire un rendement du bioconjugué qui est détectable à des niveaux de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois supérieurs au niveau de base dans un essai détectant la protéine de support N-glycosylée.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut augmenter le rendement de production du bioconjugué de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport au rendement obtenu en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de . substitution d'acide aminé (par exemple, une N-OST modifiée recombinante présentant seulement une unique, une double ou une triple substitution d'acide aminé, comme par exemple PglBcj (N534Q) ou PglBci (N535Q) ) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante peut augmenter la vitesse de production du bioconjugué de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport à la vitesse obtenue en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, au moins 1 %, au moins 3 %, au moins 5 %, au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 % ou au moins 70 % de la protéine de support dans une cellule hôte sont N-glycosylés pour former le bioconjugué.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprenant en outre la purification du bioconjugué à partir de la culture de la cellule hôte. 4. Brève description des dessins
La figure 1 présente des exemples de résultats d'un criblage d'une production améliorée du bioconjugué CP5-Hla catalysée par PglB, faisant appel à des N-NOST PglB modifiées de Campylobacter jejuni (PglBcj) .
La figure 2 présente des exemples de résultats d'un criblage d'une production du bioconjugué CP8-ClfA, faisant appel à des N-NOST PglB modifiées de Campylobacter jejuni (PglBcj) .
La figure 3 présente des exemples de résultats d'un criblage d'une production améliorée du bioconjugué CPl-EPA catalysée par PglB, faisant appel à des N-NOST PglB modifiées de Campylobacter jejuni (PglBcj) .
La figure 4 présente des exemples de résultats
d'un criblage d'une production améliorée du bioconjugué 017 de Plesiomonas shigelloides (shigeiia sonnei) -EPA catalysée par PglB, faisant appel à des N-NOST PglB modifiées de Campylobacter jejuni (PglBcj) .
La figure 5 illustre une structure cristalline de la PglB de Campylobacter jejuni développée par la modélisation d'homologie « Phyre », un logiciel Web de modélisation, en utilisant les informations relatives à la structure cristalline de la PglB de C. lari. La position des acides aminés utilisés pour la mutation est surlignée en rouge.
La figure 6 représente des alignements d'homologues bactériens de la PglB (A) dans la région EL5, notamment le motif 287QLKFYxxR294 de C. jejuni et N311 de C. jejuni, et (B) au voisinage des résidus Y77/S80 de C. jejuni et K482/D843 de C. jejuni. La PglB de C. jejuni a été utilisée comme modèle de recherche pour Protein BLAST et les séquences non redondantes ont été alignées avec le programme MegAlignTM en utilisant l'algorithme ClustalW (DNASTAR, Madison, WI, USA). Les résidus de PglBcj conservés dans les séquences d'autres espèces sont grisés. Les résidus de C. jejuni présentant un intérêt sont indiqués au-dessus et les acides aminés correspondants dans les séquences homologues de N-OST sont encadrés. 5. Abréviations L'abréviation « cuo », telle qu'utilisée dans le présent document, signifie « à usage de codon optimisé. » L'abréviation « CP », telle qu'utilisée dans le présent document, signifie « polysaccharide capsulaire ». L'abréviation « EL », telle qu'utilisée dans le présent document, signifie « boucle externe ». L'abréviation « N-OST », telle qu'utilisée dans le présent document, signifie N-oligosaccharyl transférase. L'abréviation « PglBcj », telle qu'utilisée dans le présent document, fait référence à la N-OST PglB de Campylobacter jejuni (C. jejuni). L'abréviation « PglBci », telle qu'utilisée dans le présent document, fait référence à la N-OST PglB de Campylobacter lari (C. lari). 6. Description détaillée
Il est proposé dans le présent document une N-oligosaccharyl transférase modifiée recombinante (N-OST) comprenant quatre substitutions d'acide aminé. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante comprend cinq substitutions d'acide aminé ou plus (par exemple, six, sept, huit, neuf ou dix substitutions d'acide aminé).
Dans un aspect, il est proposé dans le présent document une N-OST PglB modifiée recombinante de Campylobacter jejuni (PglBcj) comprenant quatre substitutions d'acide aminé. Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend des substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N311, K482, D483 et A669. Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H et une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend cinq substitutions d'acide aminé. Dans certains modes de réalisation, la PglBcy modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend des substitutions d'acides aminés aux positions d'acide aminé N311, K482, D483, N534 et A669. Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution 'D483H, une substitution N534Q et une substitution A669V.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une N-OST PglB modifiée recombinante de Campylobacter lari (PglBci) comprenant quatre substitutions d'acide aminé. Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend trois substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488 et D489, et une autre substitution d'acide aminé dans une région comprenant les positions d'acide aminé P667 à 1672 de PglBci (PYAQFI) . Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend des substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489 et K668. Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H et une substitution K669V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend cinq substitutions d'acide aminé. Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend quatre substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489 et N535, et une autre substitution d'acide aminé dans une région comprenant les positions d'acide aminé P667 à 1672 de PglBci (PYAQFI). Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend des substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489, N535 et K668. Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H, une substitution N535Q et une substitution K669V.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document (par exemple, PglBcj (N311V-K482R-D483H-A669V) ou PglBci (N314V-K488R-D489H-K668V)) est capable d'utiliser un oligosaccharide ou un polysaccharide décrit dans le présent document (Section 6.2) comme substrat pour la N-glycosylation d'une protéine de support décrite dans le présent document (Section 6.3) au niveau d'une séquence consensus de N-glycosylation qui ne peut pas être utilisée (ou qui ne peut pas être utilisée à dès niveaux détectables) par la forme de type sauvage de la N-OST (par exemple, PglBcj (de type sauvage) ou PglBci(de type sauvage)).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut utiliser un tel oligosaccharide ou polysaccharide pour produire des niveaux détectables d'une protéine de support N-glycosylée, par exemple in vivo ou in vitro.
Les niveaux de la protéine de support glycosylée peuvent être déterminés par des procédés connus de l'état de l'art tels que, mais sans s'y limiter, une ELISA, la CLHP, la LC-MS et équivalents ; voir, par exemple, Section 6.8, Section 6.10 et les exemples 2 à 4) . Dans certains modes de réalisation, la production · de la protéine de support N-glycosylée est détectée par ELISA. Dans certains modes de réalisation, la production de la protéine de support N-glycosylée est détectée par Western Blot.
Dans certains modes de réalisation, le niveau de la protéine de support glycosylée sont détectables si la protéine de support glycosylée peut être détectée dans un essai avec un signal indiquant la protéine de support glycosylée à des niveaux de plus de deux ou trois écart-types (> 2o ou > 3o) au-dessus du signal de base moyen ou médian de l'essai, ou de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, ou de plus de 10 fois au-dessus du signal de base de 1'essai.
Dans certains modes de réalisation, le signal de base de l'essai est le signal moyen ou médian d'essai d'expériences témoins négatives réalisées en l'absence d'une N-OST. Dans certains modes de réalisation, le signal de base de l'essai est le signal moyen ou médian d'essai d'expériences témoins négatives réalisées en présence d'une N-OST de type sauvage.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support glycosylée peut être détectée à un niveau qui est de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois supérieur au niveau de base dans un essai détectant le bioconjugué (par exemple, dans un essai ELISA, par CLHP, LC-MS ; voir également Section 6.8 et Section 6.10) .
Une modification dans une N-OST proposée dans le présent document peut être située à une distance spécifiée à partir du motif monosaccharidique à l'extrémité réductrice du composant oligo- ou polysaccharidique d'une protéine de support glycosylée qui est liée à N-OST. Pour confirmer qu'une telle modification aboutit à une spécificité modifiée vis-à-vis du substrat, n'importe quel essai de routine pour la glycosylation des protéines peut être utilisé. De telles N-OST modifiées peuvent être utilisées pour générer des bioconjugués dans les cellules hôtes procaryotes décrites dans le présent document. Des compositions comprenant les bioconjugués résultants sont également décrites dans le présent document. Dans un mode de réalisation spécifique, une telle N-OST modifiée est capable d'utiliser comme substrat un oligo- ou poly-saccharide qui est dépourvu d'un sucre à substitution N-acétyle à l'extrémité réductrice pour produire des niveaux détectables d'une protéine de support glycosylée.
Dans certains modes de réalisation, le N-oligo-saccharyl modifié recombinant peut augmenter le rendement de production du bioconjugué à un niveau de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois supérieur au niveau de base dans un essai détectant le bioconjugué.
Le niveau de base dans un essai détectant un bioconjugué peut être, par exemple, le signal moyen ou médian obtenu dans des expériences témoins qui sont réalisées en l'absence de la N-OST ou qui sont réalisées en utilisant une N-OST de type sauvage.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut produire un bioconjugué à des rendements plus élevés et/ou à des taux plus élevés qu'une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, une N-OST modifiée recombinante présentant seulement une unique, une double ou une triple substitution d'acide aminé, comme par exemple
PglBcj (N534Q) ou PglBci (N535QV) ) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. 6.1. N-oligosaccharyl transférases (Section 6.1)
Dans un aspect, il est proposé dans le présent document une N-oligosaccharyl transférase modifiée recombinante (N-OST) PglB de Campylobacter jejuni (PglBcj) comprenant quatre substitutions d'acide aminé. Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N311, K482, D483 et A669.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend cinq substitutions d'acide aminé. Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend des substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N311, K482, D483 et A669.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé N311 par un acide aminé aliphatique, comme par exemple la glycine (G), l'alanine (A), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I) . Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution N311V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K482 par un acide aminé basique, comme par exemple la lysine (K) ou l'arginine (R) . Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution K482R.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution D483H.
Dans certains modes de - réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé A669 par un acide aminé aliphatique, comme par exemple la glycine (G) , la valine (V) , la leucine (L) ou l'isoleucine (I). Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H et une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution N534Q.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H, une substitution N534Q et une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante peut lier de manière détectable un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice à une protéine de support pour produire une protéine de support N-glycosylée.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une N-oligosaccharyl transférase modifiée recombinante (N-OST) PglB de Campylobacter lari (PglBci) comprenant quatre substitutions d'acide aminé.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend trois substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488 et D489, et une autre substitution d'acide aminé dans une région comprenant les positions d'acide aminé P667 à 1672 de PglBci (PYAQFI ) .
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend des substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489 et K668.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé N314 par un acide aminé aliphatique, comme par exemple la glycine (G), l'alanine (A), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I) . Dans · certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution N314V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBcj modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K488 par un acide aminé basique, comme par exemple la lysine (K) ou l'arginine (R) . Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution K488R.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution D489H.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K668 par un acide aminé aliphatique, comme par exemple la glycine (G) , la valine (V) , la leucine (L) ou l'isoleucine (I). Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H et une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend cinq substitutions d'acide aminé.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution N535Q.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H, une substitution N535Q et une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, la PglBci modifiée recombinante peut lier de manière détectable un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice à une protéine de support pour produire une protéine de support N-glycosylée. L'oligosaccharide et le polysaccharide peuvent comprendre un quelconque des oligosaccharides ou polysaccharides décrits dans le présent document. Voir, par exemple, Section 6.2. Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide et le polysaccharide comprennent un polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus (CPS 5) , un polysaccharide capsulaire CP8 de Staphylococcus aureus, un polysaccharide capsulaire CPI de Streptococcus pneumoniae (CPS 1) ou l'antigène 0 de Plesiomonas shigelloides 017 (017). Voir, par exemple, les figures 1 à 4.
La protéine de support peut comprendre l'une quelconque des protéines de support décrites dans le présent document. Voir, par exemple, Section 6.3. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est une toxine a (hémolysine a, Hla), un facteur agglutinant CP5 (Clfa5) ou une exotoxine A de P. aerugïnosa (EPA). Voir, par exemple, les figures 1 à 4 .
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support N-glycosylée est un bioconjugué CP5-Hla, un bioconjugué CP8-ClfA, un bioconjugué CP1-EPA ou un bioconjugué 017-EPA. Voir, par exemple, les figures 1 à 4 .
Des essais permettant de confirmer et de quantifier l'activité des N-OST modifiées recombinantes proposée dans le présent document sont bien connus de l'homme du métier (par exemple, une ELISA, un Western Blot, un SDS-PAGE) et comprennent les essais décrits dans les Sections 6.8 et 6.10.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux de glycosylation in vivo ou in vitro.d'une protéine de support avec un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice entre environ 2 fois et environ 100 fois, entre environ 5 fois et environ 80 fois, entre environ 10 fois et environ 60 fois, entre environ 10 fois et environ 20 fois ou entre environ 20 fois et environ 40 fois, par rapport au taux d'une forme de type sauvage de la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document, ou par rapport à une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux de glycosylation in vivo ou in vitro d'une protéine de support avec un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport au taux d'une forme de type sauvagede la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document, ou par rapport à une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, les taux de glycosylation de la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document et de la forme de type sauvage de la N-OST recombinante peuvent être comparés par la comparaison des taux de glycosylation de la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document et de la N-OST de type sauvage d'une protéine de support avec un polysaccharide ou un oligosaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice.
Dans certains modes de réalisation, le taux de glycosylation de la N-OST modifiée recombinante d'une protéine de support avec un polysaccharide ou un oligosaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice est comparé au taux de glycosylation d'une N-OST de type sauvage d'une protéine de support avec un polysaccharide ou un oligosaccharide présentant un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice. Dans certains modes de réalisation, le taux de glycosylation de N-OST de type sauvage d'une protéine de support avec un polysaccharide ou un oligosaccharide présentant un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice est défini comme étant un taux relatif de 100 %. Dans certains modes de réalisation, le taux de glycosylation des NOST recombinantes d'une protéine de support avec un polysaccharide ou un oligosaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice représente au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 %, au moins 70 %, au moins 75 % ou au moins 80 % du taux relatif d'une N-OST de type sauvage.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le rendement de glycosylation in vivo ou in vitro d'une protéine de support avec un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice entre environ 2 fois et environ 100 fois, entre environ 5 fois et environ 80 fois, entre environ 10 fois et environ 60 fois, entre environ 10 fois et environ 20 fois ou entre environ 20 fois et environ 40 fois par rapport au rendement obtenu avec une forme de type sauvage de la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document, ou par rapport à une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une N-OST modifiée recombinante présentant une unique substitution, comme une PglBcj (N534Q) modifiée recombinante. Voir, par exemple, la figure 1.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une N-OST , modifiée recombinante présentant une double substitution, comme une PglBcj (N311V-N534Q) modifiée recombinante, une PglBcy (K482R-N534Q) modifiée recombinante, une PglBcj (D483H-N534Q) modifiée recombinante, une PglBcj (N311V-N534Q) modifiée recombinante ou une PglBcj (N534Q-A669V) modifiée recombinante. Voir, par exemple, la figure 1.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une N-OST modifiée recombinante présentant une triple substitution, comme une PglBcj (K482R-D483H-N534Q) modifiée recombinante. Voir, par exemple, la figure 3.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le rendement de glycosylation in vivo ou in vitro d'une protéine de support avec un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport au rendement obtenu avec une forme de type sauvage de la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document, ou par rapport à une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, une N-OST modifiée recombinante présentant seulement une unique, une double ou une triple substitution d'acide aminé, comme par exemple PglBcj (N534Q) ou PglBci (N535Q) ) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le rendement de glycosylation in vivo ou in vitro d'une protéine de support avec un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice à un niveau qui est détectable à plus de 2 fois, à plus de 3 fois, à plus de 4 fois, à plus de 5 fois, à plus de 6 fois, à plus de 7 fois, à plus de 8 fois, à plus de 9 fois, à plus de 10 fois, à plus de 11 fois, à plus de 12 fois, à plus de 13 fois, à plus de 14 fois, à plus de 15 fois, à plus de 17 fois, à plus de 20 fois, à plus de 25 fois, à plus de 30 fois, à plus de 35 fois, à plus de 40 fois, à plus de 45 fois, à plus de 50 fois, à plus de 60 fois, à plus de 70 fois, à plus de 80 fois, à plus de 90 fois ou à plus de 100 fois au-dessus du niveau de base (par exemple, un signal moyen ou médian d'expériences témoins réalisées en l'absence d'une N-OST) dans un essai détectant la N-glycosylation d'une protéine de support (par exemple, une ELISA, la CLHP, la LC-MS ; voir également Section 5.8 et Section 5.10).
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut donner un niveau de glycosylation in vivo ou un niveau de glycosylation in vitro de la protéine de support entre environ 1 % et environ 70 %, entre environ 3 % et environ 65 %, entre environ 5 % et environ 60 %, entre environ 5 % et environ 55 %, entre environ 10 % et environ 50 %, entre environ 15 % et environ 45 %, entre environ 20 % et environ 40 %, ou entre environ 25 % et environ 35 %.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée,recombinante proposée dans le présent document peut donner un niveau de glycosylation in vivo ou un niveau de glycosylation in vitro de la protéine de support d'au moins 1 %, d'au moins 3 %, d'au moins 5 %, d'au moins 10 %, d'au moins 15 %, d'au moins 20 %, d'au moins 25 %, d'au moins 30 %, d'au moins 35 %, d'au moins 40 %, d'au moins 45 %, d'au moins 50 %, d'au moins 55 %, d'au moins 60 %, d'au moins 65 % ou d'au moins 70 %.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support comprend deux ou plus de deux séquences consensus de N-glycosylation. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut glycosyler in vitro ou in vivo toutes les séquences consensus de N-glycosylation de la protéine de support. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut glycosyler au moins 10 %, au moins 20 %, au moins 30 %, au moins 40 %, au moins 50 %, au moins 60 %, au moins 70 %, au moins 80 % ou au moins 90 % de toutes les séquences consensus de N-glycosylation de la protéine de support. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut glycosyler in vitro ou in vivo entre environ 10 % et environ 70 %, entre 20 % et environ 60 %, ou entre environ 30 % et environ 50 % de toutes les séquences consensus de N-glycosylation d'une protéine de support.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de support comprend une ou plusieurs séquences consensus de N-glycosylation. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est une population de protéines de support. Dans certains modes de réalisation, la NOST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut glycosyler in vitro ou in vivo au moins 1 %, au moins 3 %, au moins 5 %, au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 % ou au moins 70 % de toutes les séquences consensus de N-glycosylation des protéines de support d'une population de protéines support. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut glycosyler in vitro ou in vivo entre environ 10 % et environ 70 %, entre 20 % et environ 60 %, ou entre environ 30 % et environ 50 % de toutes les séquences consensus de N-glycosylation des protéines de support d'une population de protéines support.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter l'homogénéité de la glycosylation in vivo ou in vitro d'une protéine de support avec un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice par rapport à l'homogénéité de glycosylation in vivo ou in vitro obtenue avec une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, une N-OST modifiée recombinante présentant seulement une unique, une double ou une triple substitution d'acide aminé, comme par exemple PglBcj (N534Q) ou PglBci (N535Q) ) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. L'homogénéité de la glycosylation in vivo ou in vitro d'une protéine de support peut être déterminée, par exemple, par la détermination des niveaux de glycosylation de différentes protéines de support d'une population de protéines de support glycosylées (par exemple, en pourcentage (%) de site de glycosylation qui sont glycosylés dans différentes protéines de support d'une population de protéines de support glycosylées ou en l'exprimant sous la forme d'un écart-type de niveaux de glycosylation de protéines de support glycosylées d'une population de protéines de support glycosylées). Dans certains modes de réalisation, la N-OST recombinante peut diminuer l'écart-type des niveaux de glycosylation de protéines de support dans une population de protéines de support glycosylées d'au moins 10 %, d'au moins 20 %, d'au moins 30 %, d'au moins 40 % ou d'au moins 50 %, par rapport à l'écart-type des niveaux de glycosylation de protéines de support obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice comprend le polysaccharide capsulaire CPI de Streptococcus pneumoniae (CPS 1) et la protéine de support comprend l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA). Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de l'EPA d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de l'EPA avec le polysaccharide capsulaire CPI de Streptococcus pneumoniae (CPS 1) d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice comprend le polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus (CPS 5) et la protéine de support comprend 1'hémolysine A détoxifiée (H1A) de S. aureus. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de H1A d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de H1A avec le polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice comprend le polysaccharide capsulaire CP8 de Staphylococcus aureus (CPS 8) et la protéine de support comprend le facteur agglutinant A (ClfA) d'E. coli. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de ClfA d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la ' N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de ClfA avec le polysaccharide capsulaire CP8 de Staphylococcus aureus (CPS 8) d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice comprend l'antigène 0 de Plesiomonas shigelloides 017 (017) et la protéine de support comprend une EPA. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de l'EPA d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peut augmenter le taux ou le rendement de glycosylation in vitro ou in vivo de l'EPA avec l'antigène 0 de Plesiomonas shigelloides 017 (017) d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois ou d'au moins 5 fois, par rapport au taux ou au rendement de glycosylation in vitro ou in vivo obtenu avec une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document est dérivée d'un organisme procaryote du genre Campylobacter. Dans certains modes de réalisation, la N-OST recombinante provient de Campylobacter jejuni ou de Campylobacter lari (par exemple, le produit pglB du gène PglB de C. jejuni, PglBcj, ou de C. lari, PglBci) .
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document est une PglBcy modifiée recombinante, un homologue de
PglBcj modifiée recombinante ou une version modifiée recombinante d'un variant de PglBcj d'origine naturelle. Les homologues de PglBcj peuvent comprendre les homologues de PglBcj d'origine naturelle, par exemple, comme donné en exemple sur la figure 6, et les homologues non naturels de PglBcj. Les homologues de PglBcj peuvent comprendre des protéines présentant une identité de séquence d'au moins 70 %, d'au moins 75 %, d'au moins 80 %, d'au moins 85 %, d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 96 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec une PglBcj de SEQ ID NO : 1.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document est une PglBci recombinante, un homologue de PglBci modifiée recombinante ou une version modifiée recombinante d'un variant de PglBci d'origine naturelle. Les homologues de PglBci peuvent comprendre les homologues de PglBci d'origine naturelle, par exemple, comme donné en exemple sur la figure 6, et les homologues non naturels de PglBci. Les homologues de PglBci peuvent comprendre des protéines présentant une identité de séquences d'au moins 70 %, d'au moins 75 %, d'au moins 80 %, d'au moins 85 %, d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 96 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec une PglBci de SEQ ID NO : 2.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend un fragment de PglB, par exemple un fragment de PglBcj ou un fragment de PglBci. Dans certains modes de réalisation, le fragment de PglB comprend au moins 350, au moins 400, au moins 450, au moins 500, au moins 550, au moins 600 ou au moins 650 acides aminés consécutifs d'une PglB pleine longueur. (a) Modifications de PglBçj
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document est N-OST de type sauvage, modifiée recombinante, par exemple PglBcj de type sauvage. Dans certains modes de réalisation, la PglBcy de type sauvage est une PglBcy sauvage de SEQ ID NO : 1, ou d'un variant d'origine naturelle de celle-ci :
MLKKEYLKNP YLVLFAMIIL AYVFSVFCRF YWVWWASEFN EYFFNNQLMI ISNDGYAFAE GARDMIAGFH QPNDLSYYGS SLSALTYWLY KITPFSFESI ILYMSTFLSS LVVIPTILLA NEYKRPLMGF VAALLASIAN SYYNRTMSGY YDTDMLVIVL PMFILFFMVR MILKKDFFSL IALPLFIGIY LWWYPSSYTL NVALIGLFLI YTLIFHRKEK IFYIAVILSS LTLSNIAWFY QSAIIVILFA LFALEQKRLN FMIIGILGSA TLIFLILSGG VDPILYQLKF YIFRSDESAN LTQGFMYFNV NQTIQEVENV DLSEFMRRIS GSEIVFLFSL FGFVWLLRKH KSMIMALPIL VLGFLALKGG LRFTIYSVPV MALGFGFLLS EFKAIMVKKY SQLTSNVCIV FATILTLAPV FIHIYNYKAP TVFSQNEASL LNQLKNIANR EDYWTWWDY GYPVRYYSDV KTLVDGGKHL GKDNFFPSFA LSKDEQAAAN MARLSVEYTE KSFYAPQNDI LKTDILQAMM KDYNQSNVDL FLASLSKPDF KIDTPKTRDI YLYMPARMSL IFSTVASFSF INLDTGVLDK PFTFSTAYPL DVKNGEIYLS NGVVLSDDFR SFKIGDNVVS VNSIVEINSI KQGEYKITPI DDKAQFYIFY LKDSAIPYAQ FILMDKTMFN SAYVQMFFLG NYDKNLFDLV INSRDAKVFK LKIYPYDVPD YA (b) Modifications de PglBci
Dans certains modes de réalisation, les N-OST modifiées décrites dans le présent document sont des NOST de type sauvage, modifiées recombinantes, par exemple PglBci de type sauvage (PglB de Campylobacter lari) . Dans certains modes de réalisation, la PglBcy de type sauvage est une PglBci de type sauvage de SEQ ID NO : 2, ou d'un variant d'origine naturelle de celle-ci :
MKLQQNFTDN NSIKYTCILI LIAFAFSVLC RLYWVAWASE FYEFFFNDQL
MITTNDGYAF AEGARDMIAG FHQPNDLSYF GSSLSTLTYW LYSILPFSFE
SIILYMSAFF ASLIVVPIIL IAREYKLTTY GFIAALLGSI ANSYYNRTMS
GYYDTDMLVL VLPMLILLTF IRLTINKDIF TLLLSPVFIM IYLWWYPSSY
SLNFAMIGLF GLYTLVFHRK EKIFYLTIAL MIIALSMLAW QYKLALIVLL
FAIFAFKEEK INFYMIWALI FISILILHLS GGLDPVLYQL KFYVFKASDV
QNLKDAAFMY FNVNETIMEV NTIDPEVFMQ RISSSVLVFI LSFIGFILLC
KDHKSMLLAL PMLALGFMAL RAGLRFTIYA VPVMALGFGY FLYAFFNFLE
KKQIKLSLRN KNILLILIAF FSISPALMHI YYYKSSTVFT SYEASILNDL
KNKAQREDYV VAWWDYGYPI RYYSDVKTLI DGGKHLGKDN FFSSFVLSKE
QIPAANMARL SVEYTEKSFK ENYPDVLKAM VKDYNKTSAK DFLESLNDKD
FKFDTNKTRD VYIYMPYRML RIMPVVAQFA NTNPDNGEQE KSLFFSQANA
IAQDKTTGSV MLDNGVEIIN DFRALKVEGA SIPLKAFVDI ESITNGKFYY
NEIDSKAQIY LLFLREYKSF VILDESLYNS SYIQMFLLNQ YDQDLFEQIT
NDTRAKIYRL KR
Oligosaccharides et polysaccharides (Section 6.2)
Les oligosaccharides qui peuvent être liés à une protéine de support par une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peuvent contenir entre 2 et 100 motifs monosaccharidiques, par exemple, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 motifs monosaccharidiques. Les polysaccharides qui peuvent être liés à une protéine de support par une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document peuvent contenir plus de 100 motifs monosaccharidiques, par exemple, 101, 110, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 motifs monosaccharidiques ou plus.
Les protéines de support ou N-OST peuvent comprendre l'une quelconque des N-OST ou l'une quelconque des protéines support décrites dans le présent document. Voir, par exemple, Sections 6.1 et 6.3.
Dans certains modes de réalisation, le sucre à l'extrémité réductrice de l'oligosaccharide ou du polysaccharide est un pentose, un hexose ou un heptose. Dans certains modes de réalisation, le sucre à l'extrémité réductrice de l'oligosaccharide ou du polysaccharide est un aldopentose ou un cétopentose. Dans certains modes de réalisation, le pentose est un D-arabinose, un D-lyxose, un D-ribose, un D-xylose, un D-ribulose ou un D-xylulose. Dans certains modes de réalisation, le sucre à l'extrémité réductrice de l'oligosaccharide ou du polysaccharide est un aldohexose ou un cétohexose. Dans certains modes de réalisation, l'hexose est, par exemple, un D-allose, un D-altrose, un D-glucose, un D-mannose, un D-gulose, un D-idose, un D-galactose, un D-talose, un D-psicose, un D-fructose, un D-sorbose ou un D-tagatose. Dans certains modes de réalisation, le sucre à l'extrémité réductrice de l'oligosaccharide ou du polysaccharide est un désoxy ou di-désoxy sucre, comme par exemple un rhamnose, un fucose ou un abéquose. Dans certains modes de réalisation, le sucre à l'extrémité réductrice de l'oligosaccharide ou du polysaccharide est un aldoheptose ou un cétoheptose. Dans certains modes de réalisation, 1'heptose est un mannoheptulose.
Les oligosaccharides et polysaccharides qui peuvent être liés à une protéine de support par les N-OST recombinantes proposées dans le présent document peuvent provenir de n'importe quel organisme, par exemple un organisme procaryote ou un organisme eucaryote. Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide provient d'un organisme pathogène, par exemple un pathogène humain ou un pathogène animal (par exemple, un animal d'élevage ou un animal de compagnie) . Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide provient d'un organisme bactérien. Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide peut provenir d'E. coli, de Salmonella sp (par exemple, S. enterica subsp. Enterica, S. enterica subsp. Salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. Diarizonae, S. enterica subsp. Houtenae, S. bongori, et S. enterica subsp. Indica, Pseudomonas sp (P. aeruginosa), Klebsiella sp. (par exemple, K. pneumonia), Acinetobacter, Chlamydia trachomatis,
Vibrio choiera, Listeria sp., par exemple, L. monocytogenes, Légionella pneumophila, Bordetella parapertussis, Burkholderia mallei et pseudomallei, Francisella tularensis, Campylobacter sp. (C. jejuni) ; Clostridium difficile, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyrogenes, E. coli, Streptococcus agalacticae, Neisseria meningitidis, Candida albicans, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, Leishmania major.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou polysaccharide comprend un antigène, par exemple, un épitope qui est immunogène chez un humain ou un animal (par exemple, un animal d'élevage ou un animal de compagnie). Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un antigène 0 d' E. coli (par exemple, 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019, 020, 021, 022, 023, 024, 025, 026, 027, 028, 029, 030, 032, 033, 034, 035, 036, 037, 038, 039, 040, 041, 042, 043, 044, 045, 046, 048, 049, 050, 051, 052, 053, 054, 055, 056, 057, 058, 059, 060, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 070, 071, 073, 074, 075, 076, 077, 078, 079, 080, 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088, 089, 090, 091, 092, 093, 095, 096, 097, 098, 099, 0100, 0101, 0102, 0103, 0104, 0105, 0106, 0107, 0108, 0109, 0110, OUI, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0119, 0120, 0121, 0123, 0124, 0125, 0126, 0127, 0128, 0129, 0130, 0131, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0137, 0138, 0139, 0140, 0141, 0142, 0143, 0144,0145, 0146, 0147, 0148, 0149, 0150, 0151, 0152, 0153, 0154, 0155, 0156, 0157, 0158, 0159, 0160, 0161, 0162, 0163, 0164, 0165, 0166, 0167, 0168, 0169, 0170, 0171, 0172, 0173, 0174, 0175, 0176, 0177, 0178, 0179, 0180, 0181, 0182, 0183, 0184, 0185, 0186, 0187), des antigènes de Salmonella sp (S. enterica subsp. Enterica, S. enterica subsp. Salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. bongori ou S. enterica subsp. indica et les types 0 1 à 67, comme décrit dans Grimont P, Weill F : Antigenic formulae of the
Salmonella servoras. In., 9th édition edn. Geneva : WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella ; 2007, Pseudomonas sp. (P. aeruginosa 0 sérotypes 1 à 20 [Rocchetta HL, Burrows LL, Lam JS : Genetics of O-antigen biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology et Molecular Biology Reviews : MMBR 1999, 63(3) : 523-553]), Klebsiella sp. (par exemple, K. pneumonia sérotypes 01, 02 (et les sous-sérotypes) , 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010, 011, 012, [Trautmann M, Held TK, Cross AS : 0 antigen seroepidemiology of Klebsiella clinical isolâtes and implications for immunoprophylaxis of Klebsiella infections. Vaccine 2004, 22(7) : 818-821]), des antigènes 0 d'Acinetobacter (par exemple, les antigènes 0 d'A. baumannii identifiés dans Pantophlet R, Nemec A, Brade L, Brade H, Dijkshoorn L : 0-antigen diversity among Acinetobacter baumannii strains from the Czech Republic et Northwestern Europe, as determined by lipopolysaccharide-specific monoclonal antibodies. Journal of Clinical Microbiology 2001, 39(7) : 25762580), des antigènes 0 de Chlamydia trachomatis (sérotypes A, B, C, D, E, F, G, H, I J, K, Ll, L2, L3) , des antigènes 0 de Vibrio choiera 01 à 155, Listeria sp., en particulier L. monocytogenes type 1, 2, 3, 4 et leurs sous-sérotypes, des antigènes 0 de Légionella pneumophila sérotypes 1 à 15, des antigènes 0 de Bordetella parapertussis, des antigènes 0 de Burkholderia mallei et pseudomallei, Francisella tularensis, Campylobacter sp. (C. jejuni) ; les polysaccharides capsulaires de Clostridium difficile (sérotypes A, G, H, K, SI, S4, D, Cd-5, K Toma et al. 1988, et C. perfringens sérotypes A, B, C, D et E) , Staphylococcus aureus type 5 et 8, Streptococcus pyrogenes (polysaccharides capsulaires sérotypes de streptocoque du groupe B) , E. coli, Streptococcus agalacticae (polysaccharides capsulaires de streptocoque du groupe A) , Neisseria meningitidis (sérotypes A, B, C, W, Y, X), Candida albicans, Haemophilus influenza, polysaccharides capsulaires d'Enterococcus faecalis type I à V ; et d'autres structures polysaccharidiques de surface, par exemple les glycolipides de Borrelia burgdorferi (Hossain H,
Wellensiek HJ, Geyer R, Lochnit G : Structural analysis of glycolipids from Borrelia burgdorferi. Biochimie 2001, 83(7) : 683-692), le glycane 0 de la piline de
Neisseria meningitidis [Borud B, Aas FE, Vik A, Winther-Larsen HC, Egge-Jacobsen W, Koomey M : Genetic, structural, and antigenic analyses of glycan diversity in the O-linked protein glycosylation Systems of human Neisseria species. Journal of Bacteriology 2010, 192(11) : 2816-2829 ; Borud B, Viburiene R, Hartley MD,
Paulsen BS, Egge-Jacobsen W, Imperiali B, Koomey M :
Genetic and molecular analyses reveal an evolutionary trajectory for glycan synthesis in a bacterial protein glycosylation System. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011, 108(23) : 9643-9648] et un lipooligosaccharide (LOS), un LOS de Haemophilus influenza, un lipo-phosphoglycane de Leishmania major [McConville MJ,
Bacic A, Mitchell GF, Handman E : Lipophosphoglycan of Leishmania major that vaccinâtes against cutaneous leishmaniasis contains an alkylglycerophosphoinositol lipid anchor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1987, 84(24) : 8941-8945 ; McConville MJ, Ferguson MA : The structure, biosynthesis et function of glycosylated phosphatidylinositols in the parasitic protozoa and higher eukaryotes. The Biochemical Journal 1993, 294 (Pt 2) : 305-324]), les antigènes glucidiques associés aux tumeurs (le glycosyl phosphatidylinositol de la malaria, 1'arabinomannane de mycobacterium tuberculosis [Astronomo RD, Burton DR : Carbohydrate vaccines : developing sweet solutions to sticky situations ? Nature Reviews Drug Discovery 2010, 9(4) : 308-324].
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide est un polysaccharide de Staphylococcus aureus {S. aureus) ou de Salmonella enterica sv. (S. enterica sv.). Dans certains modes de réalisation, le polysaccharide est un polysaccharide CP5 de S. aureus ou un polysaccharide LT2 de S. enterica sv. Typhimurium.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice. Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprenant le sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice peut comprendre, par exemple, un antigène O d'E. coli (par exemple 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019, 020, 021, 022, 023, 024, 025, 026, 027, 028, 029, 030, 032, 033, 034, 035, 036, 037, 038, 039, 040, 041, 042, 043, 044, 045, 046, 048, 049, 050, 051, 052, 053, 054, 055, 056, 057, 058, 059, 060, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 070, 071, 073, 074, 075, 076, 077, 078, 079, 080, 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088, 089, 090, 091, 092, 093, 095, 096, 097, 098, 099, 0100, 0101, 0102, 0103, 0104, 0105, 0106, 0107, 0108, 0109, O110, OUI, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0119, 0120, 0121, 0123, 0124, 0125, 0126, 0127, 0128, 0129, 0130, 0131, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0137, 0138, 0139, 0140, 0141, 0142, 0143, 0144,0145, 0146, 0147, 0148, 0149, 0150, 0151, 0152, 0153, 0154, 0155, 0156, 0157, 0158, 0159, 0160, 0161, 0162, 0163, 0164, 0165, 0166, 0167, 0168, 0169, 0170, 0171, 0172, 0173, 0174, 0175, 0176, 0177, 0178, 0179, 0180, 0181, 0182, 0183, 0184, 0185, 0186, 0187), un polysaccharide capsulaire de Staphylococcus aureus {S. aureus) (par exemple, CP5 ou CP8) , un polysaccharide capsulaire de Francisella tularensis Schu4, un polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae capsules (par exemple, CPI, 4, 5, 12, 25, 38, 44, 45 ou 46), le glycane 0 de la piline de Neisseria meningitidis [Borud B, Aas FE, Vik A, Winther-Larsen HC, Egge-Jacobsen W, Koomey M : Genetic, structural, et antigenic analyses of glycan diversity in the 0-linked protein glycosylation Systems of human Neis^seria species. Journal of Bacteriology 2010, 192 (11) : 2816-2829 ; Borud B, Viburiene R, Hartley MD, Paulsen BS, Egge-Jacobsen W, Imperiali B, Koomey M : Genetic and molecular analyses reveal an evolutionary trajectory for glycan synthesis in a bacterial protein glycosylation System. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011, 108(23) :9643-9648], un antigène 0 de Burkholderia mallei et pseudomallei, un antigène 0 de Bordetella parapertussis, un antigène 0 de Légionella pneumophila sérotypes 1 à 15, un antigène 0 de Listeria sp., en particulier un antigène 0 de L. monocytogenes type 1, 2, 3, 4, un antigène 0 de Pseudomonas sp. (P. aeruginosa 0 sérotypes 1 à 20 [Rocchetta HL, Burrows LL, Lam JS : Genetics of 0-antigen biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR 1999, 63(3) : 523-553]), un antigène O de Klebsiella sp. (par exemple, K. pneumonia sérotypes 01, 02 (et les sous-sérotypes), 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010, 011, 012, [Trautmann M, Held TK, Cross AS : 0 antigen seroepidemiology of Klebsiella clinical isolâtes and implications for immunoprophylaxis of Klebsiella infections. Vaccine 2004, 22(7) : 818-821]), un antigène 0 de Shigella sp. (par exemple, S. dysenteriae, S. sonnei, S. flexneri, S. boydii), un antigène 0 d'Acinetobacter (par exemple, les antigènes 0 d'A. baumannii identifiés dans Pantophlet R, Nemec A, Brade L, Brade H, Dijkshoorn L : 0-antigen diversity among Acinetobacter baumannii strains from the Czech Republic et Northwestern Europe, as determined by lipopolysaccharide-specific monoclonal antibodies. Journal of Clinical Microbiology 2001, 39(7) : 2576-2580), ou un antigène 0 de Listeria sp.
Les sucres N-acétylés peuvent comprendre un substituant amino-acétyle (N-acétyle) sur un ou plusieurs atomes de carbone du sucre. Par exemple, un sucre N-acétylé peut comprendre un substituant N-acétyle sur l'atome C2 d'un motif monosaccharidique, tel qu'un motif glucose (N-acétylglucosamine).
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un sucre à l'extrémité réductrice qui n'est pas N-acétylé. Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprenant le sucre non N-acétylé à l'extrémité réductrice peut comprendre, par exemple, 020 d'E. coli, un antigène de Salmonella sp (par exemple, S. enterica subsp. Enterica, S. enterica subsp. Salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. bongori ou S. enterica subsp. Indica ou S. Typhi), un antigène 0 de type 1 à 67, un polysaccharide capsulaire de streptocoques du groupe A (S. pyrogenes) , de streptocoques du groupe B, et des sérotypes CPS de S. pneumoniae (codant wchA, wcjG ou wcjH dans leur groupe de gènes capsulaires, c'est-à-dire tous les sérotypes sauf CPI, 4, 5, 12, 25, 38, 44, 45, 46) , ou un antigène 0 de Salmonella enterica sv. {S. enterica sv. ) .
Dans certains modes de réalisation, l'oligo saccharide ou le polysaccharide comprend un polysaccharide CP5 de S. aureus ou un polysaccharide LT2 de S. enterica sv. Typhimurium, un antigène O de
Vibrio choiera (par exemple, 01 à 155) , ou un antigène 0 de Listeria sp. (par exemple, L. monocytogenes type 1, 2, 3, 4) .
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un résidu D-N-acétylfucosamine (D-FucNAc) à son extrémité réductrice, comme par exemple les polysaccharides capsulaires de S. aureus sérotypes 5, 8 ou un antigène 0 de P. aeruginosa sérotype 02, 05, 011, 016.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un résidu 4-amino-d-N-acétylfucosamine (D-FucNAc4N) à son extrémité réductrice, comme par exemple certains oligosaccharides ou polysaccharides de S. pneumoniae, comme le sérotype 1, un antigène 0 de Shigella sonnei ou 017 de Plesiomonas shigelloides.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un résidu D-N-acétylquinosamine (D-QuiNAc) à son extrémité réductrice, comme par exemple un antigène 0 de P. aeruginosa sérotypes 06, 01, ou Francisella tularensis sérotype Schu4.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un résidu galactose à son extrémité réductrice, comme par exemple LT2 de S. enterica.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide comprend un polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae sérotype 5, E. coli 01, 02, Cronobacter sakazakii 05, c'est-à-dire un poly- et oligo-saccharide à extrémité réductrice D-GlcNAc lié en 1-4 à un L-Rhamnose en configuration bêta.
Protéines de support (Section 6.3)
Des protéines de support peuvent être liées à des oligosaccharides ou des polysaccharides par des N-OST recombinantes proposées dans le présent document. Voir, par exemple, Section 6.1.
La protéine de support peut être n'importe quelle protéine de support naturelle (provenant du même organisme que celui de la N-OST) ou* n'importe quelle protéine de support hétérologue (provenant d'un organisme différent de celui de la N-OST). Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est un immunogène. Les protéines de support peuvent être des protéines pleines longueurs ou des fragments de celles-ci. Des exemples de protéines de support comprennent, sans s'y limiter, l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique, l'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur agglutinant A (ClfA), le facteur agglutinant B, FimH dΈ. coli, FimHC d'E. coli, l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, les variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB), la toxine cholérique, les variants détoxifiés de la toxine cholérique, la protéine sat d'E. coli, le domaine passager de la protéine sat d'E. coli, AcrA de C. jejuni et les glycoprotéines naturelles de C. jejuni. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA).
Dans certains modes de réalisation, les protéines de support N-glycosylées par une N-OST recombinante décrite dans le présent document sont modifiées, par exemple modifiées de telle manière que la protéine est moins toxique et/ou plus sensible à la glycosylation, etc. Dans certains modes de réalisation, les protéines de support sont modifiées de manière à ce que le nombre de sites de glycosylation dans les protéines de support soit maximisé afin d'administrer la protéine à des concentrations plus basses, par exemple dans une composition immunogène, sous sa forme de bioconjugué. Par conséquent, dans certains modes de réalisation, les protéines de support décrites dans le présent document sont modifiées afin de comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus de 10 sites de glycosylation qui' seraient normalement associés à la protéine de support (par exemple, par rapport au nombre de sites de glycosylation associés à la protéine de support dans son état natif/naturel, par exemple son état « de type sauvage »). Dans certains modes de réalisation, l'introduction de sites de glycosylation est réalisée par l'insertion de séquences consensus de glycosylation (par exemple, (i) la séquence consensus Asn-X-Ser(Thr), dans laquelle X est/sont choisi(s) indépendamment parmi les acides aminés sauf Pro ; ou (ii) la séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T, dans laquelle X et Z sont choisis indépendamment parmi les acides aminés sauf Pro) n'importe où dans la structure primaire de la protéine. L'introduction de ces sites de glycosylation peut être réalisée, par exemple, par l'ajout de nouveaux acides aminés à la structure primaire de la protéine (les sites de glycosylation sont ajoutés, en totalité ou en partie), ou par la modification des acides aminés existants dans la protéine afin de générer les sites de glycosylation (aucun acide aminé n'est ajouté à la protéine, mais des acides aminés sélectionnés de la protéine sont mutés afin de former des sites de glycosylation). L'homme du métier sait que la séquence d'acides aminés d'une protéine peut être modifiée facilement en utilisant des approches connues de l'état de l'art, par exemple des approches de recombinaison qui comprennent la modification de la séquence d'acide nucléique codant la protéine. Dans des modes de réalisation spécifiques, des séquences consensus de qlycosylation sont introduites dans des réqions spécifiques de la protéine de support, par exemple des structures de surface de la protéine, à l'extrémité N-ou C-terminale de la protéine et/ou dans des boucles qui sont stabilisées par des ponts disulfure au niveau de la base de la protéine. Dans certains modes de réalisation, la séquence consensus classique de qlycosylation de 5 acides aminés peut être prolonqée par des résidus lysine pour permettre une qlycosylation plus efficace et, par conséquent, la séquence consensus insérée peut coder 5, 6 ou 7 acides aminés qui doivent être insérés ou qui remplacent les acides aminés accepteurs de la protéine.
Les N-OST peuvent comprendre l'une quelconque des N-OST décrites dans le présent document. Voir, par exemple, Section 6.1.
Dans certains modes de réalisation, les protéines de support comprennent une « étiquette », une séquence d'acides aminés qui permet l'isolement et/ou l'identification de la protéine de support. Par exemple, l'ajout d'une étiquette à une protéine de support décrite dans le présent document peut être utile lors de la purification de cette protéine et, par conséquent, lors de la purification des vaccins à base de conjuqué comprenant la protéine de support marquée. Des exemples d'étiquettes pouvant être utilisées ici comprennent, sans s'y limiter, les étiquettes à base d'histidine (HIS) (par exemple, l'étiquette hexahistidine ou étiquette 6XHis), FLAG-TAG et les étiquettes HA. Dans certains modes de réalisation, les étiquettes utilisées ici peuvent être éliminées, par exemple éliminées par des agents chimiques ou par des moyens enzymatiques, dès qu'elles ne sont plus du tout nécessaires, par exemple après la purification de la protéine.
Acides nucléiques (Section 6.4)
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document des acides nucléiques codant les N-OST modifiées recombinantes proposées dans le présent document (par exemple, Section 6.1). . Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution d'acide aminé dans les acides aminés N311, K482, D483 et A669.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution de l'acide aminé N311 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), l'alanine, la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution N311V.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution de l'acide aminé K482 par un acide aminé basique choisi parmi la lysine (K) ou 1'arginine (R).
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution K482R.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution D483H.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution de l'acide aminé A669 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcy recombinante modifiée comprenant une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution N311V, une substitution
K482R, une substitution D483H et une substitution A669V substitution.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution d'acide aminé dans les acides aminés N311, K482, D483, N534 et A669.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBçj recombinante modifiée comprenant une substitution N534Q.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H, une substitution N534Q et une substitution A669V.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une ,PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution d'acide aminé dans les acides aminés N314, K488, D489 et une autre substitution d'acide aminé dans une région comprenant les positions d'acide aminé P667 à 1672 de PglBci (PYAQFI).
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution d'acide aminé dans les acides aminés N314, K488, D489 et K668.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution de l'acide aminé N314 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), l'alanine, la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution N314V.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution de l'acide aminé K488 par un acide aminé basique choisi parmi la lysine (K) ou 1'arginine (R).
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution K488R.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution D489H.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution de l'acide aminé K668 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H et une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBci recombinante modifiée comprenant une substitution d'acide aminé dans les acides aminés N314, K488, D489, N535 et K668.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution N535Q.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques codent une PglBcj recombinante modifiée comprenant une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H, une substitution N535Q et une substitution K668V.
Dans certains modes de réalisation, il est proposé dans le présent document des acides nucléiques codant une pglB de Campylobacter jejuni ou de Campylobacter lari, l'acide nucléique étant un codon optimisé pour une expression dans une cellule hôte. Dans des modes de réalisation spécifiques, la cellule hôte est E. coli. Dans des modes de réalisation encore plus spécifiques, les séquences à codon optimisé sont les séquences mentionnées dans les exemples (Section 7).
Cellules hôtes (Section 6.5)
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend deux ou plus de deux N-OST recombinantes modifiées proposées dans le présent document (par exemple, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus de 10 N-OST recombinantes).
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document une cellule hôte comprenant un acide nucléique proposé dans le présent document (par exemple, codant une N-OST recombinante proposée dans le présent document, par exemple, Section 6.1). Voir, par exemple, Section 6.5. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend deux ou plus de deux acides nucléiques proposés dans le présent document (par exemple, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus de 10 acides nucléiques).
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend une ou plusieurs autres enzymes supplémentaires utiles pour la production d'un bioconjugué ou la N-glycosylation d'une protéine de support (par exemple, une glycosyltransférase) . Dans certains modes de réalisation, au moins une des enzymes supplémentaires utiles pour la production d'un bioconjugué est une enzyme recombinante. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend deux ou plus de deux enzymes supplémentaires utiles pour la production d'un bioconjugué (par exemple, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus de 10 enzymes supplémentaires).
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule procaryote. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule d'E. coli. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. Voir, par exemple, Section 6.1. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend une protéine de support et une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document. Voir, par exemple, Sections 6.1 et 6.3. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend une protéine de support, une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document et une glycosyltransférase recombinante. Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document est une PglBcy recombinante. Voir, par exemple, Section 6.1 (a). Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document est une PglBci recombinante. Voir, par exemple, Section 6.1(a).
Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes utilisées pour produire les bioconjugués décrits dans le présent document sont génétiquement modifiées de façon à comprendre des acides nucléiques hétérologues, par exemple des acides nucléiques hétérologues codant une ou plusieurs protéines de support et/ou des acides nucléiques hétérologues codant une ou plusieurs protéines, par exemple des gènes codant une ou plusieurs protéines. Dans certains modes de réalisation, des acides nucléiques hétérologues codant des protéines impliquées dans les voies de glycosylation (par exemple, des voies de glycosylation procaryote et/ou eucaryote) sont introduits dans les cellules hôtes décrites dans le présent document. De tels acides nucléiques peuvent coder des protéines telles que, sans s'y limiter, des oligosaccharyl transférases et/ou des glycosyltransférases. Des acides nucléiques hétérologues (par exemple, des acides nucléiques codant des protéines de support et/ou des acides nucléiques codant d'autres protéines, par exemple des protéines impliquées dans la glycosylation) peuvent être introduits dans les cellules hôtes décrites dans le présent document en utilisant n'importe quel procédé connu de l'homme du métier, par exemple 1'électroporation, une transformation chimique par choc thermique, une transformation naturelle, une transduction de phage et une conjugaison. Dans certains modes de réalisation, des acides nucléiques hétérologues sont introduits dans les cellules hôtes décrites dans le présent document en utilisant un plasmide, par exemple les acides nucléiques hétérologues sont exprimés dans les cellules hôtes par un plasmide (par exemple, un vecteur d'expression). Dans certains modes de réalisation, des acides nucléiques hétérologues sont introduits dans les cellules hôtes décrites dans le présent document en utilisant le procédé d'insertion décrit dans la publication de demande de brevet international No. WO 2014/057 109.
Dans certains modes de réalisation, des modifications supplémentaires peuvent être introduites (par exemple, en utilisant des techniques recombinaisons) dans les cellules hôtes décrites dans le présent document. Par exemple, des acides nucléiques de la cellule hôte (par exemple, des gènes) codant des protéines formant une partie d'éventuelles voies de glycosylation qui sont en concurrence ou qui interfèrent (par exemple, qui sont en concurrence ou qui interfèrent avec un ou plusieurs gènes hétérologues impliqués dans la glycosylation qui sont introduits de manière recombinante dans la cellule hôte) peuvent être supprimés ou modifiés dans l'arrière-plan (« background ») de la cellule hôte (génome) de manière à les rendre inactifs/ dysfonctionnels (c'est-à-dire que les acides nucléiques de la cellule hôte qui sont supprimés/modifiés ne codent pas une protéine fonctionnelle ou ne codent pas une protéine quelle qu'elle soit). Dans certains modes de réalisation, quand des acides nucléiques sont supprimés du génome des cellules hôtes proposées dans le présent document, ils sont remplacés par une séquence souhaitable, par exemple une séquence qui est utile pour la production d'une glycoprotéine.
Des exemples de gènes pouvant être supprimés dans les cellules hôtes (et, dans certains cas, remplacés par d'autres séquences d'acide nucléique souhaitées) comprennent les gènes des cellules hôtes impliqués dans la biosynthèse des glycolipides, comme waaL (voir, par exemple, Feldman et al., 2005, PNAS USA 102 : 30163021), le groupe de biosynthèse du lipide A core (waa), le groupe pour le galactose (gai), le groupe pour l'arabinose (ara), le groupe pour l'acide coionique (wc) , le groupe pour les polysaccharides insulaires, les gènes de biosynthèse de 1'undécaprénol-p (par exemple, uppS, uppP), les gènes de recyclage d'und-P, les enzymes métaboliques impliquées dans la biosynthèse des sucres activés par les nucléotides, le groupe pour les antigènes communs entérobactériens et les groupes de modifications des antigènes 0 de prophage comme le groupe gtrABS.
Les cellules hôtes décrites dans le présent document peuvent produire les protéines de support N-glycosylées décrites dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, les protéines de support N-glycosylées produites par les cellules hôtes décrites dans le présent document sont des antigènes, par exemple des antigènes viraux ou bactériens, qui peuvent être utilisés dans des vaccins. Dans certains modes de réalisation, les protéines de support N-glycosylées produites par les cellules hôtes décrites dans le présent document peuvent être l'une quelconque des protéines de support décrites dans le présent document, lesdites protéines de support étant modifiées par les cellules hôtes décrites dans le présent document afin de posséder une ou plusieurs caractéristiques bénéfiques, par exemple la protéine de support est N-glycosylée.
Certains des exemples ci-dessous décrivent l'application des procédés décrits dans le présent document sur des cellules hôtes E. coli à Gram-négatif ; cependant, n'importe quelle cellule hôte connue de l'homme du métier peut être utilisée pour produire des protéines de support N-glycosylées, notamment des archées, des cellules hôtes procaryotes différentes d'E. coli et des cellules hôtes eucaryotes.
Des exemples de cellules hôtes procaryotes pouvant être utilisées selon les procédés décrits dans le présent document comprennent, sans s'y limiter, les espèces Escherichia, les espèces Shigella, les espèces Klebsiella, les espèces Xhantomonas, les espèces Salmonella, les espèces Yersinia, les espèces Lactococcus, les espèces Lactobacillus, les espèces Pseudomonas, les espèces Corynebacterium, les espèces Streptomyces, les espèces Streptococcus, les espèces Staphylococcus, les espèces Bacillus et les espèces Clostridium.
Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes décrites dans le présent document comprennent un génome dans lequel une ou plusieurs séquences d'ADN ont été introduites, les séquences d'ADN codant une protéine ou comprenant un groupe d'opérons/gènes impliqué dans la N-glycosylation des protéines. Par exemple, dans certains modes de réalisation, une cellule hôte décrite dans le présent document comprend un génome dans lequel un ou plusieurs des ADN suivants ont été insérés : un ADN codant une N-OST, un ADN codant une glycosyltransférase, un ADN codant une protéine de support, un ADN comprenant un groupe de gènes rfb, un ADN comprenant un groupe de gènes pour polysaccharides capsulaires et/ou un ADN codant une épimérase.
Les cellules hôtes peuvent comprendre des N-OST recombinantes proposées dans le présent document ou des acides nucléiques codant les N-OST recombinantes proposées dans le présent document, moyennant quoi les N-OST recombinantes peuvent provenir de n'importe quel organisme ayant des N-OST, notamment un organisme eucaryote ou un organisme procaryote. Dans certains modes de réalisation, la protéine N-OST ou l'acide nucléique codant une N-OST provient du genre Campylobacter (par exemple, le gène pglB de C. jejuni ou de C. lari) .
Les cellules hôtes décrites dans le présent document peuvent comprendre une glycosyltransférase connue de l'état de l'art ou une séquence d'acide nucléique codant une glycosyltransférase connue de l'état de l'art. Dans certains modes de réalisation, la glycosyltransférase est une glycosyltransférase décrite dans la publication de demande de brevet international No. WO 2011/138 361, dont la description est incorporée à la présente à titre de référence dans sa globalité. Dans certains modes de réalisation, la glycosyltransférase provient d'une bactérie à Gram-positif, par exemple la glycosyltransférase provient de S. aureus. Dans certains modes de réalisation, la glycosyltransférase est le polysaccharide capsulaire 5 de S. aureus. Dans certains modes de réalisation, la glycosyltransférase est le polysaccharide capsulaire 8 de S. aureus. Dans certains modes de réalisation, la glycosyltransférase provient d'une bactérie à Gram-négatif, par exemple E. coli. Dans certains modes de réalisation, la glycosyltransférase provient d'un eucaryote.
Les cellules hôtes décrites dans le présent document peuvent comprendre ou produire une protéine de support connue de l'état de l'art ou comprendre une séquence d'acide nucléique codant une protéine de support connue de l'état de l'art. Les protéines de support produites par les cellules hôtes décrites dans le présent document comprennent au moins une séquence consensus de N-glycosylation, par exemple la séquence consensus (i) Asn-X-Ser(Thr) , dans laquelle X est choisi indépendamment parmi les acides aminés sauf Pro ; ou (ii) D/E-X-N-Z-S/T, dans laquelle X et Z sont choisis indépendamment parmi les acides aminés sauf Pro. Par conséquent, la cellule hôte peut comprendre des séquences d'ADN codant une séquence consensus de N-glycosylation. La cellule hôte peut comprendre n'importe quelle protéine de support connue de l'état de l'art, notamment les protéines de support décrites dans la Section 6.3. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est une exotoxine A de P. aeruginosa (EPA), notamment une EPA qui a été modifiée de manière à comprendre au moins une séquence consensus de N-glycosylation. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est la toxine cholérique B. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est AcrA. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est H1A (hémolysine a) . Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est ClfA.
Bioconjugués (Section 6.6)
Les bioconjugués décrits dans le présent document sont des conjugués entre une protéine (par exemple, l'une quelconque des protéines de support décrites dans le présent document ; par exemple, Section 6.3) et un oligosaccharide ou un polysaccharide (par exemple, l'un quelconque des oligosaccharides ou polysaccharides décrits dans le présent document ; voir, par exemple, Section 6.2) préparés dans une cellule hôte, la machinerie de la cellule hôte liant l'oligosaccharide ou le polysaccharide à la protéine (par exemple, des liaisons sur des azotes). Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide est un antigène (par exemple, l'un quelconque des antigènes décrits dans le présent document ; voir, par exemple, Section 6.2). Les glycoconjugués peuvent comprendre des bioconjugués, ainsi que des conjugués antigène glucidique (par exemple, oligo- et poly-saccharides)-protéine préparés par d'autres moyens, par exemple par liaison chimique de la protéine et de l'antigène glucidique.
Les N-OST modifiées recombinantes proposées dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.1) peuvent être utilisées pour produire des cellules hôtes qui produisent des bioconjugués comprenant une protéine de support N-glycosylée. Dans certains modes de réalisation, il est proposé dans le présent document des bioconjugués comprenant une protéine de support N-glycosylée avec un antigène (par exemple, un oligosaccharide ou un polysaccharide) décrit dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est EPA, ClfA ou H1A. Les bioconjugués décrits dans le présent document peuvent comprendre, par exemple et sans s'y limiter, l'une quelconque des protéines de support décrites dans le présent document. Les bioconjugués décrits dans le présent document peuvent comprendre, par exemple et sans s'y limiter, l'un quelconque des oligosaccharides ou polysaccharides décrits dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, il est proposé dans le présent document un bioconjugué contenant une protéine de support conjuguée à un ou plusieurs parmi 01, 02, 04, 06, 07, 08, 011, 015, 016, 017, 018, 020, 022, 025, 073, 075 et/ou 083 d'E. coli. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est EPA.
Dans certains modes de réalisation, il est proposé dans le présent document un bioconjugué contenant une protéine de support conjugué à un ou plusieurs polysaccharides différents de P. aeruginosa. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est EPA, ClfA, ou HlA.
Dans certains modes de réalisation, il est proposé dans le présent document un bioconjugué contenant une protéine de support conjuguée à un ou plusieurs polysaccharides différents de Streptococcus pneumoniae. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est EPA, ClfA, ou HlA. Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CPI de Streptococcus pneumoniae (CPS 1) et l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA). Voir, par exemple, la figure 3.
Dans certains modes de réalisation, il est proposé dans le présent document un bioconjugué comprenant une protéine de support conjuguée à un ou plusieurs polysaccharides différents de Staphylococcus aureus. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est EPA, ClfA, ou H1A. Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus (CPS 5) 1'hémolysine A détoxifiée (H1A) de S. aureus. Voir, par exemple, la figure 1. Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP8 de Staphylococcus aureus (CPS 8) et le facteur agglutinant A (ClfA) d'E. coli. Voir, par exemple, la figure 2.
Dans certains modes de réalisation, il est proposé dans le présent document un bioconjugué comprenant une protéine de support conjuguée à un ou plusieurs polysaccharides différents de Plesiomonas shigelloides. Dans certains modes de réalisation, la protéine de support est EPA, ClfA, ou H1A. Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend l'antigène 0 de Plesiomonas shigelloides 017 (017) et une EPA. Voir, par exemple, la figure 4.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est l'exotoxine de Pseudomonas aeruginosa (EPA)-01 de S. dysenteriae (EPA-01), 1'EPA-polysaccharide capsulaire de type 5 de S. aureus (EPA-CP5), l'EPA-LT2 de Salmonella enterica (S. enterica) (EPA-LT2).
Procédés de production d'un bioconjugué (Section 6.7)
Dans certains modes de réalisation, les N-OST modifiées recombinantes proposées dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.1) peuvent être utilisées pour produire un bioconjugué proposé dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.6), tel qu'un glycoconjugué. Dans certains modes de réalisation, les N-OST modifiées recombinantes proposées dans le présent document peuvent être utilisées pour produire des vaccins à conjugué, c'est-à-dire des vaccins qui contiennent un oligosaccharide ou un polysaccharide (voir, par exemple, Section 6.2) et un antigène protéique du pathogène contre lequel le vaccin est conçu.
Dans un autre aspect, il est proposé dans le présent document un procédé de production d'un bioconjugué, le procédé comprenant la culture d'une cellule hôte proposée dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.5) dans un milieu de culture de cellules. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend un acide nucléique codant une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.1 et Section 6.4). Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend un acide nucléique codant une protéine de support décrite dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.3 et Section 6.4) . Dans certains modes de réalisation, la protéine de support contient une ou plusieurs séquences consensus de N-glycosylation. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend un acide nucléique codant une glycosyl-transférase (voir, par exemple, Section 6.2 et Section 6.5).
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est une protéine de support N-glycosylée. La protéine de support N-glycosylée peut comprendre un composant oligosaccharidique ou polysaccharidique incluant l'un quelconque des oligosaccharides ou polysaccharides décrits dans le présent document. Voir, par exemple, Section 6.2. La protéine de support N-glycosylée peut comprendre l'une quelconque des protéines de support décrites dans le présent document. Voir, par exemple, Section 6.3. Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est un polypeptide N-glycosylé naturel de C. jejuni (notamment un composant oligosaccharidique ou polysaccharidique de C. jejuni et une protéine de support de C. jejuni) . Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est un polypeptide glycosylé hétérologue de C. jejuni (notamment un composant polysaccharidique et/ou une protéine de support qui ne proviennent pas de C. jejuni) . Dans certains modes de réalisation, le polypeptide glycosylé ne contient pas de sucre N-acétylé à son extrémité réductrice. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide glycosylé présente un galactose à son extrémité réductrice.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est produit à une vitesse qui est entre environ 2 fois à environ 100 fois, entre environ 5 fois à environ 80 fois, entre environ 10 fois à environ 60 fois, entre environ 10 fois à environ 20 fois ou environ 20 fois à environ 40 fois plus élevée quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document que quand est utilisée une cellule hôte comprenant une forme de type sauvaqe de la N-OST recombinante, ou quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjuqué est produit à une vitesse plus de 2 fois, plus de 3 fois, plus de 4 fois, plus de 5 fois, plus de 6 fois, plus de 7 fois, plus de 8 fois, plus de 9 fois, plus de 10 fois, plus de 11 fois, plus de 12 . fois, plus de 13 fois, plus de 14 fois, plus de 15 fois, plus de 17 fois, plus de 20 fois, plus de 25 fois, plus de 30 fois, plus de 35 fois, plus de 40 fois, plus de 45 fois, plus de 50 fois, plus de 60 fois, plus de 70 fois, plus de 80 fois, plus de 90 fois ou plus de 100 fois plus élevée quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document que quand est utilisée une cellule hôte comprenant une forme de type sauvage de la N-OST modifiée recombinante, ou quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est produit à un rendement qui est entre environ 2 fois et environ 100 fois, entre environ 5 fois et environ 80 fois, entre environ 10 fois et environ 60 fois, entre environ 10 fois et environ 20 fois ou entre environ 20 fois et environ 40 fois plus élevé quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST recombinante de la présente divulgation que quand est utilisée une cellule hôte comprenant une forme de type sauvage de la N-OST modifiée recombinante, ou quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est produit à un rendement qui est plus de 2 fois, plus de 3 fois, plus de 4 fois, plus de 5 fois, plus de 6 fois, plus de 7 fois, plus de 8 fois, plus de 9 fois, plus de 10 fois, plus de 11 fois, plus de 12 fois, plus de 13 fois, plus de 14 fois, plus de 15 fois, plus de 17 fois, plus de 20 fois, plus de 25 fois, plus de 30 fois, plus de 35 fois, plus de 40 fois, plus de 45 fois, plus de 50 fois, plus de 60 fois, plus de 70 fois, plus de 80 fois, plus de 90 fois ou plus de 100 fois plus élevé quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document que quand est utilisée une cellule hôte comprenant une forme de type sauvage de la N-OST modifiée recombinante, ou quand est utilisée une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé (par exemple, présentant une, deux ou trois substitutions d'acide aminé) que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une N-OST modifiée recombinante présentant une unique substitution, comme la PglBcj (N534Q) modifiée recombinante. Voir, par exemple, la figure 1.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une N-OST modifiée recombinante présentant une double substitution, comme une PglBcj (N311V-N534Q) modifiée recombinante, une PglBcy (K482R-N534Q) modifiée recombinante, une PglBcy (D483H-N534Q) modifiée recombinante, une PglBcj (N311V-N534Q) modifiée recombinante ou une PglBcj (N534Q-A669V) modifiée recombinante. Voir, par exemple, la figure 1.
Dans certains modes de réalisation, la N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante proposée dans le présent document comprend une N-OST modifiée recombinante présentant une triple substitution, comme une PglBcj (K482R-D483H-N534Q) modifiée recombinante. Voir, par exemple, la figure 3.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué est produit à un rendement qui est détectable à plus de 2 fois, à plus de 3 fois, à plus de 4 fois, à plus de 5 fois, à plus de 6 fois, à plus de 7 fois, à plus de 8 fois, à plus de 9 fois, à plus de 10 fois, à plus de 11 fois, à plus de 12 fois, à plus de 13 fois, à plus de 14 fois, à plus de 15 fois, à plus de 17 fois, à plus de 20 fois, à plus de 25 fois, à plus de 30 fois, à plus de 35 fois, à plus de 40 fois, à plus de 45 fois, à plus de 50 fois, à plus de 60 fois, à plus de 70 fois, à plus de 80 fois, à plus de 90 fois ou à plus de 100 fois du niveau de base (par exemple, un signal moyen ou médian d'expériences témoins réalisées en l'absence d'une N-OST) dans un essai détectant la N-glycosylation d'une protéine de support (par exemple, ELISA, CLHP, LC-MS ; voir également Section 6.8 et Section 6.10).
Dans certains modes de réalisation, entre environ 1 % et environ 70 %, entre environ 3 % et environ 65 %, entre environ 5 % et environ 60 %, entre environ 10 % et environ 55 %, entre environ 15 % et environ 50 %, entre environ 20 % et environ 45 %, entre environ 20 % et environ 45 %, entre environ 25 % et environ 40 % ou entre environ 30 % et environ 35 % de la protéine de support dans la cellule hôte sont glycosylés pour former le bioconjugué.
Dans certains modes de réalisation, au moins 1 %, au moins 3 %, au moins 5 %, au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 % ou au moins 70 % de la protéine de support dans la cellule hôte sont glycosylés pour former le bioconjugué.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CPI de
Streptococcus pneumoniae (CPS 1) et l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA).
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP5 de
Staphylococcus aureus (CPS 5) et 1'hémolysine A détoxifiée (H1A) de S. aureus.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP8 de
Staphylococcus aureus (CPS 8) et le facteur agglutinant A (ClfA) d'E. coli.
Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué comprend l'antigène 0 de Plesiomonas shigelloides 017 (017) et une EPA.
Dans certains modes de réalisation, les procédés comprennent en outre la purification du bioconjugué à partir de la culture de la cellule hôte. Des procédés de purification de bioconjugués, comme des protéines de support N-glycosylées, à partir de cultures de cellules hôtes sont connus de l'état de l'art. Voir, par exemple, Jan-Christer Janson, Protein Purification : Principles, High Resolution Methods, and Applications. Wiley ; 3e édition (22 mars 2011) .
Procédés analytigues (Section 6.8)
Divers procédés peuvent être utilisés pour analyser les compositions structurelles et les longueurs des chaînes glucidiques des bioconjugués ou des protéines de support N-glycosylées décrits dans le présent document.
Dans un mode de réalisation, une hydrazinolyse peut être utilisée pour analyser les glycanes. Tout d'abord, les polysaccharides sont libérés de leurs supports protéiques par incubation avec de l'hydrazine selon les instructions du fabricant (Kit Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release, Oxfordshire, RU). L'hydrazine nucléophile attaque la liaison glycosidique entre le polysaccharide et la protéine de support et permet la libération des glycanes fixés. Les groupes N-acétyle sont perdus lors de ce traitement et doivent être reconstitués par une nouvelle N-acétylation. Les glycanes libres sont purifiés sur des colonnes de carbone, puis marqués à l'extrémité réductrice avec le fluorophore 2-aminobenzamide (Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB. Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide et anthranilic acid. Anal Biochem. 20 septembre 1995 ; 230(2) : 229-38) . L'es polysaccharides marqués sont séparés sur une colonne GlycoSep-N (GL Sciences) conformément au protocole CLHP de Royle et al. (Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM. An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantifies of glycoproteins. Anal Biochem. 1er mai 2002 ; 304(1) : 70-90). Le chromatogramme de fluorescence résultant indique la longueur du polysaccharide et le nombre de motifs répétitifs. Des informations concernant la structure peuvent être recueillies en collectant des pics individuels, puis en réalisant une analyse MS/MS. Ainsi, la composition en monosaccharide et la séquence du motif répétitif peuvent être confirmées et, en outre, l'homogénéité de la composition de polysaccharide peut être identifiée. Des pics spécifiques de poids moléculaire bas peuvent être analysés par MALDI-MS/MS et le résultat est utilisé pour confirmer la séquence du glycane. Chaque pic correspond à un polymère constitué d'un certain nombre de motifs répétitifs et de fragments de ceux-ci. Le chromatogramme permet donc de mesurer la distribution des longueurs des polymères. Le temps d'élution est une indication de la longueur du polymère, l'intensité de la fluorescence étant corrélée avec l'abondance molaire pour le polymère respectif.
Dans un autre mode de réalisation, un SDS-PAGE ou une électrophorèse capillaire sur gel peut être utilisée pour analyser les glycanes et les glycoconjugués. La longueur des polymères pour les glycanes antigénique 0 qui sont synthétisés ici est définie par le nombre de motifs répétitifs qui sont assemblés linéairement. Ceci signifie que le motif classique de type échelle est une conséquence de différents nombres de motifs répétitifs qui composent le glycane. Par conséquent, deux bandes proches l'une de l'autre en SDS PAGE ou dans d'autres techniques qui séparent par la taille diffèrent de seulement un seul motif répétitif. Ces différences discrètes sont exploitées lors de l'analyse de glycoprotéines pour la taille des glycanes : la protéine de support non glycosylée et le glycoconjugué ayant des longueurs de chaînes polymères différentes se séparent en fonction de leur mobilité électrophorétique. Le premier nombre de motifs répétitifs détectables (ni) et le nombre moyen de motifs répétitifs (nmoyen) présents sur un glycoconjugué sont mesurés. Ces paramètres peuvent être utilisés pour démontrer une uniformité d'un lot à l'autre ou la stabilité du polysaccharide.
Dans un autre mode de réalisation, une SM de masse élevée et un CLHP d'exclusion stérique peuvent être utilisées pour mesurer la taille des glycoconjugués complets.
Dans un autre mode de réalisation, un essai à 1'anthrone-acide sulfurique peut être utilisé pour mesurer les rendements en polysaccharides (Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC. Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products : method development and validation. Biologicals. mars 2008 ; 36(2) : 134-41.
Epub 26 novembre 2007). (a) Changement de l'utilisation des sites de glycosylation ·
Pour montrer que l'utilisation des sites dans une protéine spécifique est modifiée, l'utilisation des sites de glycosylation peut être quantifiée. Des procédés permettant de le faire sont présentés ci-dessous . LC-MS/MS sur glycopeptide : les glycoconjugués sont digérés avec une ou plusieurs protéases, et les peptides sont séparés grâce à un procédé chromatographique approprié (C18, CLHP HILIC à interaction hydrophile, colonnes GlycoSepN, SE CLHP, AE CLHP), et les différents peptides sont identifiés par MS/MS. Ce procédé peut être utilisé avec ou sans raccourcissement préalable des chaînes glucidiques par des procédés chimiques (dégradation de smith) ou enzymatiques. Une quantification des pics des glycopeptides par détection UV entre 215 nm et 280 nm permet la détermination relative de l'utilisation des sites de glycosylation. CLHP d'exclusion stérique : une utilisation plus élevée des sites de glycosylation est reflétée par un temps d'élution plus rapide à partir d'une colonne de SE CLHP. Voir également (a). (b) Homogénéité . L'homogénéité des glycoconjugués (l'homogénéité des résidus glucidiques liés) peut être évaluée grâce à des procédés qui mesurent la longueur des glycanes et le rayon hydrodynamique. Bénéfices (Section 6.9) .
Les N-OST recombinantes proposées dans le présent document (voir, par exemple, Section 5.1) et les procédés proposés dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.7) pour utiliser la N-OST recombinante proposée dans le présent document (voir, par exemple, Section 6.1) sont particulièrement importants et intéressants sur le plan commercial, car ils permettent une fermentation rapide, avec des rendements élevés, sur grande échelle et à faible coût de préparation de bioconjugués hautement homogènes (par exemple, une préparation de glycoconjugués ou des préparations vaccinales à base de conjugués). Les N-OST recombinantes proposées dans le présent document permettent une production économiquement viable de bioconjugués présentant une valeur commerciale et thérapeutique, comme des vaccins à base de conjugués.
On s'attend à ce que les procédés de production enzymatique faisant appel aux N-OST recombinantes proposées dans le présent document fournissent des préparations de bioconjugués plus homogènes et reproductibles que les procédés de synthèse chimique couramment utilisés. On s'attend à ce que la reproductibilité et la robustesse des procédés de production biotechnologique de bioconjugués faisant appel aux N-OST recombinantes proposées dans le présent document contribuent à réduire les coûts de production. D'une manière générale, on pense que l'homogénéité en particulier des vaccins biothérapeutiques à conjugués affecte la sûreté clinique des produits médicamenteux.
Procédés analytiques permettant de tester les bénéfices (Section 6.10)
Rendement. Le rendement est mesuré par la quantité de glucides dérivée d'un litre d'une culture de production bactérienne réalisée dans un bioréacteur dans les conditions régulées et optimisées. Après la purification du glycoconjugué, le rendement en glucides peut être mesuré directement par l'essai faisant appel à l'anthrone ou par ELISA en utilisant des antisérums spécifiques des glucides. Des mesures indirectes sont possibles en utilisant la quantité de protéines (mesurée par les essais BCA, de Lowry ou de bardford bien connus) et la longueur des glycanes et la structure pour calculer une quantité théorique de glucides par gramme de protéines. En outre, le rendement peut également être mesuré en séchant la préparation de glycoprotéine à partir d'un tampon volatil et en utilisant une balance pour mesurer le poids.
Homogénéité. L'homogénéité signifie la variabilité de la longueur des glycanes et éventuellement le nombre de sites de glycosylation. Les procédés mentionnés ci-dessus peuvent être utilisés à cette fin. La SE-CLHP permet de mesurer le rayon hydrodynamique. Plus le nombre de sites de glycosylation dans le support est élevé, plus la variation du rayon hydrodynamique est élevée par rapport à un support contenant moins de sites de glycosylation. Cependant, quand des chaînes individuelles de glycane sont analysées, elles peuvent être davantage homogènes en raison de la longueur davantage régulée. La longueur des glycanes est mesurée par hydrazinolyse, SDS PAGE et CGE. En outre, l'homogénéité peut également signifier que certains schémas d'utilisation des sites de glycosylation changent vers une plage plus large/plus étroite. Ces facteurs peuvent être mesurés par LC-MS/MS des glycopeptides.
Exemples (Sections 7) ·
Exemple 1 : conception et construction de mutants de
PglB (Section 7.1)
Cet exemple montre que le polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus (CPS 5) est un substrat pour les oligosaccharyl transférases PglB modifiées de C. jejuni proposées dans le présent document.
PglB de type sauvage (wt) à marquage HA C-terminal a été amplifié à partir de l'ADN génomique de C. jejuni et cloné dans les sites de restriction Eco RI et Bam HI de pEXT21 sous le contrôle du promoteur pTacI, pour ainsi rendre son expression inductible par IPTG, et le plasmide pGVXN114 a été obtenu.
Sur la base de la séquence d'acides aminés de PglBwt, l'utilisation de codons a été optimisée pour une expression dans E. coli. PglB non marqué à utilisation de codons optimisée (cuo) a ensuite été cloné dans les sites de restriction Eco RI et bam HI de pEXT21 pour obtenir pGVXN970. Il a été produit une série de mutants de PglB contiennent un, deux, trois, quatre ou cinq échanges d'acide aminé par rapport à la séquence de PglBcuo présente dans pGVXN970.
La séquence d'acides aminés de PglB dans pGVXN970 a été modifiée par mutagenèse dirigée, de façon à ce que le résidu asparagine (N) en position 534, qui procure un site potentiel de N-glycosylation, soit changé pour un résidu glutamine (Q) , ce qui a permis d'obtenir le plasmide pGVXN971 (N534Q).
En outre, les échanges d'acides aminés suivants ont été introduits dans la séquence de PglB par mutagenèse dirigée : • N311V-N534Q-A669V, pour obtenir le plasmide pGVXN1219 ; • N311V-K482R-D483H-A669V, pour obtenir le plasmide pGVXN1221.
En utilisant pGVXN1219, les échanges d'acides aminés suivants ont été introduits par mutagenèse dirigée : • N311V-K482R-D483H-N534Q-A669V, pour obtenir pGVXNl22 0. pGVXN971 a été utilisé pour introduire les mutations suivantes par mutagenèse dirigée : • K482R-D483H-N534Q, pour obtenir le plasmide pGVXNl222 ; • K482R-N534Q, pour obtenir le plasmide pGVXN1223 ; • D483H-N534Q, pour obtenir le plasmide pGVXN1224 ; • N311V-N534Q, pour obtenir le plasmide pGVXN1225 ; • N534Q-A669V, pour obtenir le plasmide pGVXN1226.
Exemple 2 : ciblage de PglB pour une production améliorée du bioconjugué CP5-Hla en utilisant différents mutants de PglB (Section 7.2)
Cet exemple montre que le polysaccharide capsulaire CP5 de Staphylococcus aureus (CPS 5) est un substrat pour des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes proposées dans le présent document.
La figure 1 présente les résultats d'un criblage pour une production améliorée du bioconjugué CP5-Hla catalysée par PglB en utilisant des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes.
Des cellules d'E. coli StGVXN1717 (W3110 AwecA-wzzE, ArlmB-wecG: :Clm, AwaaL, AwbbL: : IS5) contenant pGVXN393 (CPS5) ont été co-transformées par électroporation avec les plasmides pGVXN570 (Hlanisg) et un des plasmides de PglB indiqués (pGVXNH4, pGVXN97 0, pGVXN971, pGVXNl219, pGVXN1221, pGVXN1223, pGVXN1224, pGVXN1225 ou pGVXNl226, respectivement) et les bactéries transformées ont été cultivées pendant une nuit à 37 °C sur des plaques de gélose de sélection contenant les trois antibiotiques tétracycline [20 pg/ml], ampicilline [100 pg/ml] et spectinomycine [40 pg/ml]. 50 ml de pré-cultures liquides dans des fioles d'Erlenmeyer de 100 ml contenant les antibiotiques tétracycline [20 pg/ml], ampicilline [100 pg/ml] et spectinomycine [40 pg/ml] ont été inoculées le jour suivant avec les colonies qui s'étaient développées sur les plaques de gélose de sélection et ont été incubées pendant une nuit à 37 °C et 170 tours/minute. Les précultures ont ensuite été diluées avec un milieu liquide jusqu'à une DC>600nm de 0,1 et l'expression de HlaHise et PglB a été induite à une DC>6oonm entre 0,71 et 0,84 par l'ajout de 0,1 % d'arabinose et de 1 mM d'isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG), respectivement.
Après une incubation d'une nuit à 37 °C et 150 tours/minute, les cellules ont été collectées par centrifugation et 50 équivalents de DO ont été lavés avec 2 ml de NaCl à 0,9 %. Pour extraire le contenu périplasmique soluble, le culot cellulaire lavé a été remis en suspension dans 1 ml de tampon de lyse (30 mM de Tris-HCl pH 8,5, 1 mM d'EDTA pH 8,0, 20 % de saccharose, contenant un lysozyme [1 mg/ml final]), et incubé 30 minutes sur une roue rotative à 4 °C. La suspension a été clarifiée par centrifugation à 14 000 tours/minute à 4 °C pendant 20 minutes et le surnageant a été conservé en tant qu'extrait périplasmique (PPE).
Les protéines périplasmiques marquées (His6) ont été enrichies par chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) en utilisant la résine
IMAC Hypercel de chez PALL. En détail, 1 ml du surnageant PPE clarifié a été complété avec 0,25 ml de tampon de liaison 5x (150 mM de Tris-HCl pH 8,0, 2,5 M de NaCl, 50 mM d'imidazole pH 8,0, 4 mM de MgCl2) et
incubé avec 100 μΐ de résine IMAC qui avait été préalablement équilibrée avec du tampon de liaison lx (30 mM de Tris-HCl pH 80, 500 mM de NaCl, 10 mM d'imidazole pH 8,0) pendant 30 minutes à température ambiante sur une roue rotative. La résine a été mise sous la forme d'un culot par centrifugation et les protéines non liées ont été éliminées. La résine a été transférée dans une colonne de purification (Costar, filtre à tube de centrifugation Spin-X) et lavée deux fois avec 200 μΐ de tampon de lavage (lx PBS pH 7,0 ; 10 mM d'imidazole) et éluée avec 100 μΐ de tampon d'élution (lx PBS pH 7,0 ; 500 mM d'imidazole). 45 μΐ de la fraction éluée ont été mélangés avec 15 μΐ de tampon Laemmli [4x] et mis à ébullition pendant 5 minutes à 98 °C avant d'être chargés sur un SDS-PAGE (4-12 % de gel NuPAGE). 25 μΐ ont été utilisés par couloir sur le SDS-PAGE (4-12 % de gel NuPAGE, tampon de migration MOPS, 80 minutes à 170 V) . Les protéines ont ensuite été soumises à un électrotransfert (« electroblot ») sur une membrane de nitrocellulose en utilisant les dispositifs et procédés . de séchage (« dry-blotting ») du système iBlot de Thermo Fisher Scientific- Inc.
Les protéines à marquage His soumises à l'électrotransfert (« electroblot ») ont été détectées sur la membrane de nitrocellulose avec un anticorps anti-His (Qiagen N° 34660) et un anticorps secondaire anti- , souris conjugué à la peroxydase (Sigma, A0412).
Une analyse par Western Blot anti-His a été réalisée sur les protéines extraites d’E. coli
StGVXN1717 (wbbL::IS5, waaL", Δ ECA(wecA-wzzE), (rlmB-wecG)::Clm) co-transformées avec le plasmide pGVXN393 qui dirige l'expression recombinante de CPS 5, avec un plasmide pour l'expression recombinante de la protéine de support Hlatus6 contenant un site de glycosylation et une étiquette hexahistidine(His6) C-terminale (pGVXN570) et un des plasmides variants conférant l'expression des mutants de pglB indiqués.
Les plasmides indiqués (voir la figure 1) ont été testés dans le criblage de pglB décrit et la formation du glycoconjugué CP5-Hla correspondant est représentée dans les couloirs 2 à 10 de la figure 1.
Après induction, les cellules ont été collectées et les protéines ont été extraites du périplasme et enrichies par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (IMAC) et éluées dans du tampon PBS contenant de l'imidazole. Les échantillons purifiés ont été soumis à un SDS-PAGE (4-12 % de gel) et à un électro-transfert (« electroblot ») sur une membrane de nitrocellulose développée par anti-His.
La figure 1 illustre les résultats pour les échantillons suivants : • Couloir 1 : échelle de protéines précolorées servant de règle de page ;
Couloir 2 : échantillon de protéines issu de Stl717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN970 (pglBcuo) ] induit ; • Couloir 3 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN971 (pglBcuo N534Q) ] induit ; • Couloir 4 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN1219 (pglBcuo N311V-N534Q-A669V) ] induit ; • Couloir 5 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN3 93 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V) ] induit ; • Couloir 6 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN1223 (pglBcuo K482R-N534Q) ] induit ; • Couloir 7 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN1224 (pglBcuo D483H-N534Q) ] induit ; • Couloir 8 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN1225 (pglBcuo N311V-N534Q) ] induit ; • Couloir 9 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN3 93 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXNl226 (pglBcuo N534Q-A669V) ] induit ; • Couloir 10 : échantillon de protéines issu de
Stl717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (Hla), pGVXN114 (pglB„t-HAj .
Exemple 3 : ciblage de PglB pour une production améliorée du bioconjugué CP8-ClfA en utilisant différents mutants de PglB (Section 7.3)
Cet exemple montre que le polysaccharide capsulaire CP8 de Staphylococcus aureus est un substrat pour des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes proposées dans le présent document.
La figure 2 présente des exemples de résultats d'un criblage pour une production du bioconjugué CP8-Clfa en utilisant des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes.
Une ' analyse par Western Blot anti-His a été réalisée sur les protéines extraites d'E. coli
StGVXNl795 (wbbL::IS5, waaL-, Δ ECA, (rlmB-wecG)) cotransformées avec le plasmide pGVXNN564 qui dirige l'expression recombinante de CP 8, avec un plasmide pour l'expression recombinante de la protéine de support ClfAHis6 contenant un site de glycosylation et une étiquette hexahistidine(His6) C-terminale (pGVXNN1188) et un des plasmides variants conférant l'expression des mutants de pglB indiqués.
Les plasmides indiqués (voir la figure 2) ont été testés dans le criblage de pglB décrit et le glycoconjugué CP8-ClfA correspondant.
La figure 2 illustre les résultats pour les échantillons suivants : • Couloir 1 : échelle de protéines précolorées servant de règle de page • Couloir 2 : échantillon de protéines issu de
Stl795 [pGVXN564, pGVXNH88 (ClfA) , pGVXN970 (pglB à utilisation de codons optimisée (cuo)] induit ; • Couloir 3 : échantillon de protéines issu de stl7 95 [pGVXN564, pGVXNH88 (ClfA), pGVXN971 (pglBcuo K482R)] induit ; • Couloir 4 : échantillon de protéines issu de stl795 [pGVXN564, pGVXNH88 (ClfA), pGVXN1214 (pglBcuoD483H)] induit ; • Couloir 5 : échantillon de protéines issu de
Stl7 95 [pGVXN5 64, pGVXN1188 (ClfA), pGVXN1215 (pglBcuoK482R-D483H)] induit ; • Couloir 6 : échantillon de protéines issu de
Stl795 [pGVXN564, pGVXN1188 (ClfA), pGVXN1217 (pglBcuo N311V)] induit ; • Couloir 7 : échantillon de protéines issu de stl7 95 [pGVXN564, pGVXN1188 (ClfA), pGVXNl218 (pglBcuo N311V-A669V)] induit ; • Couloir 8 : échantillon de protéines issu de stl7 95 [pGVXN564, pGVXN1188 (ClfA), pGVXNl219 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-N534Q-A669V)] induit ; • Couloir 9 : échantillon de protéines issu de ’ stl7 95 [pGVXN5 64, pGVXN1188 (ClfA), pGVXNl221 (pglBcuo N311V-K482R-D induit.
Exemple 4 : exemple de ciblage de PglB pour une production améliorée du bioconjugué CP1-EPA en utilisant différents mutants de PglB (Section 7.4)
Cet exemple montre que le polysaccharide capsulaire CPI de Streptococcus pneumoniae (CPS 1) est un substrat pour des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes proposées dans le présent document.
La figure 3 présente des exemples de résultats d'un criblage pour une production amélioré du bioconjugué CP1-EPA catalysée par PglB en utilisant des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes.
Des cellules d'E. coli StGVXN3600 (W3110 ΔιvecA-wzzE àwaaL Arfb016 : : rf\bPs017AwbgW) contenant pGVXN767 (CPS1) et pGVXN930 (ARNtrare) ont été co-transformées par électroporation avec les plasmides pGVXN1077 (EPA hîs6) et une des plasmides de pglB indiqués (pGVXN114, pGVXN970, pGVXN971, pGVXN1219, pGVXN1220, pGVXN1221, pGVXN1222, pGVXN1223, pGVXN1224, pGVXNl225, ou pGVXN1226, respectivement) ou pGVXN72 (plasmide témoin pEXT21 « vide ») et les bactéries transformées ont été cultivées pendant une nuit à 37 °C sur des plaques de gélose de sélection contenant les quatre antibiotiques tétracycline [20 pg/ml], chloramphénicol [30 pg/ml], kanamycine [50 pg/ml] et spectinomycine [40 pg/ml]. 50 ml de pré-cultures liquides dans des fioles d'Erlenmeyer de 100 ml contenant les antibiotiques tétracycline [20 pg/ml], chloramphénicol [30 pg/ml], kanamycine [50 pg/ml] et spectinomycine [40 pg/ml] ont été inoculées le jour suivant avec les colonies qui s'étaient développées sur les plaques de gélose de sélection et ont été incubées pendant une nuit à 37 °C et 150 tours/minute. Les pré-cultures ont ensuite été diluées avec un milieu liquide jusqu'à une DC>6oonm de 0,1 et l'expression de EPAhiss et le variant PglB a été induite à une DOeoonm entre 0,48 et 0,52 par l'ajout de 0,1 % d'arabinose et de 1 mM d'isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG), respectivement.
Après une incubation d'une nuit à 37 °C et 150 tours/minute, 50 équivalents de DO ont été collectés par centrifugation (4000 tours/minute, 15 minutes, 4 °C) et ont été lavés avec 4 ml de NaCl à 0,9 %. Pour extraire le contenu périplasmique soluble, le culot cellulaire lavé a été remis en suspension dans 1 ml de tampon de lyse (30 mM de Tris-HCl pH 8,5, 1 mM d'EDTA pH 8,0, 20 % de saccharose, contenant un lysozyme [1 mg/ml final]), et incubé 30 minutes sur une roue rotative à 4 °C. La suspension a été clarifiée par centrifugation à 14 000 tours/minute à 4 °C pendant 15 minutes et le surnageant a été conservé en tant qu'extrait périplasmique (PPE).
Les protéines périplasmiques marquées (His6) ont été enrichies par chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) en utilisant la résine IMAC Hypercel de chez PALL. En détail, 1 ml du surnageant PPE clarifié a été complété avec 0,25 ml de tampon de liaison 5x (150 mM de Tris-HCl pH 8,0, 2,5 M de NaCl, 50 mM d'imidazole pH 8,0, 4 mM de MgCl2) et incubé avec 100 μΐ de résine IMAC qui avait été préalablement équilibrée avec du tampon de liaison lx (30 mM de Tris-HCl pH 80, 500 mM de NaCl, 10 mM d'imidazole pH 8,0) pendant 30 minutes à température ambiante sur une roue rotative. La résine a été mise sous la forme d'un culot par centrifugation et les protéines non liées ont été éliminées. La résine a été transférée dans une colonne de centrifugation (Costar, filtre à tube de centrifugation Spin-X) et lavée deux fois avec 200 μΐ de tampon de lavage (30 mM de Tris-HCl pH 8,0 ; 500 mM de NaCl, 10 mM d'imidazole) et éluée avec 100 μΐ de tampon d'élution (30 mM de Tris-HCl pH 8,0 ; 50 mM de NaCl, 500 mM d'imidazole).
La concentration en protéines se trouvant dans l'échantillon élué a été déterminée par analyse Nanodrop.
La fraction éluée (100 μΐ) a été mélangée avec 33,3 μΐ de tampon Laemmli [4x] et mise à ébullition pendant 5 minutes à 98 °C avant d'être chargée sur un SDS-PAGE (4-12 % de gel NuPAGE) . 5 pg ont été utilisés par couloir sur le SDS-PAGE (4-12 % de gel NuPAGE Midi, tampon de migration MOPS, 75 minutes à 200 V à 4 °C) . Les protéines ont ensuite été soumises à un électrotransfert (« electroblot ») sur une membrane de nitrocellulose en utilisant les dispositifs et procédés de séchage (« dry-blotting ») à sec du système iBlot de Thermo Fisher Scientific Inc.
Les protéines à marquage His soumises à l'électrotransfert (« electroblot ») ont été détectées sur la membrane de nitrocellulose avec un anticorps anti-His (Qiagen N° 34660) et un anticorps secondaire antisouris conjugué à la peroxydase (Sigma, A0412).
Une analyse par Western Blot anti-His a été réalisée sur les protéines extraites d'E. coli StGVXN3600 (W3110 ΔwecA-wzzE ΔwaaL ArfbOl 6 : : rfjbPs017AwbgW) co-transformées avec les plasmides pGVXN930 (fournissant des ARNt de codons rares), pGVXN767 qui dirige l'expression recombinante de CPS 1, avec un plasmide pour l'expression recombinante de la protéine de support EPAhîs6 contenant deux sites de glycosylation et une étiquette hexahistidine(His6) C-terminale (pGVXN1077) et un des plasmides variants indiqués conférant l'expression des mutants de pglB indiqués ou du squelette plasmidique vide pEXT21 (pGVXN72) en tant que témoin.
Les plasmides correspondants ont été testés dans le criblage de pglB décrit et la formation du glycoconjugué CP1-EPA correspondant est représentée dans les couloirs 3 à 13 de la figure 3.
Après induction, les cellules ont été collectées et les protéines ont été extraites du périplasme et enrichies par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (IMAC) et éluées avec du tampon Tris contenant de 1'imidazole. Les échantillons purifiés ont été soumis à un SDS-PAGE (4-12 % de NuPAGE) et à un électro-transfert (« electroblot ») sur une membrane de nitrocellulose développée par anti-His.
Après induction, les cellules ont été collectées et les protéines ont été extraites du périplasme et enrichies par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (IMAC) et éluées avec du tampon Tris contenant de 1'imidazole. Les échantillons purifiés ont été soumis à un SDS-PAGE (4-12 % de NuPAGE) et à un électro-transfert (« electroblot ») sur une membrane de nitrocellulose développée par anti-His.
La figure 3 illustre les résultats pour les échantillons suivants : • Couloir 1 : échelle de protéines précolorées servant de règle de page ; • Couloir 2 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPAhîs6) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXN72 (pEXt21)] induit ; • Couloir 3 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPAmse) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXN970 (pglBCUo) ] induit ; • Couloir 4 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXNl077 (ΕΡΑηιξ<ϊ) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXN971 (pglBCUo N534Q) ] induit ; • Couloir 5 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXNl077 (EPAhiss) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXNl219 (pglBCUo N311V-N534Q-A669V) ] induit ; • Couloir 6 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPAmse) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXN1220 (pglBCUo N311V- K482R-D483H-N534Q-A669V)] induit ; • Couloir 7 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPAhiss) , pGVXN767 (S.p. CPS1), pGVXN1221 (pglBCUo N311V-K482R-D483H-A669V) ] induit ; • Couloir 8 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPAniss) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXNl222 (pglBCUo K482R-D483H-N534Q) ] induit ; • Couloir 9 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPAhisî) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXNl223 (pglBCUo K482R-N534Q) ] induit ; • Couloir 10 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPAHise) r pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXNl224 (pglBCUo D483H-N534Q)] induit ; • Couloir 11 : échantillon de protéines issu de
St3600 [pGVXN930, pGVXNl077 (EPAnise) , pGVXN767 (S.p.CPSl), pGVXNl225 (pglBCUo N311V-N534Q) ] induit ; • Couloir 12 : échantillon de protéines issu de St3600 [pGVXN930, pGVXN1077 (EPA Mise), pGVXN767 {S.p.C PSI), pGVXN122 6 (pglBCUo N534Q-A669V) ] induit ; • Couloir 13 : échantillon de protéines issu de St3600 [pGVXN930, pGVXNl077 (EPAHiSe) , pGVXN767 (S.p. CPS1), pGVXN114 (pglB„t-HA] induit ; • Couloir 14 : échelle de protéines précolorées servant de règle de page.
Exemple 5 : ciblage de PglB pour une production améliorée du bioconjugué 017-EPA en utilisant différents mutants de PglB (Section 7.5)
Cet exemple montre que l'antigène 0 de P. shigelloides 017 (017) est un substrat pour des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes proposées dans le présent document.
La figure 4 présente des exemples de résultats d'un criblage pour une production amélioré du bioconjugué 017 de Plesiomonas shigelloides (Shigella sonnei)-EPA catalysée par PglB en utilisant des exemples de N-OST PglBcj modifiées recombinantes proposées dans le présent document.
Une analyse par Western Blot anti-S. sonnei a été réalisée sur les protéines extraites d'E. coli StGVXN2174 (W3110 ΔwecA-wzzE AwaaL ArfbOl6 : :rfbPs017) co-transformées avec les plasmides pGVXN930 (fournissant des ARNt de codons rares) , avec un plasmide pour l'expression recombinante de la protéine de support EPAHis6 contenant deux sites de glycosylation et une étiquette hexahistidine (His6) C-terminale (pGVXN150) et un des plasmides variants indiqués conférant l'expression des mutants de pglB indiqués ou du squelette plasmidique vide pEXT21 (pGVXN72) en tant que témoin.
Les plasmides correspondants ont été testés dans le criblage de pglB décrit et la formation du glycoconjugué 017-EPA correspondant est représentée dans les couloirs 3 à 7 de la figure 4.
Après induction, les cellules ont été collectées et les protéines ont été extraites du périplasme et enrichies par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (IMAC) et éluées avec du tampon Tris contenant de l'imidazole. Les échantillons purifiés ont été soumis à un SDS-PAGE (4-12 % de NuPAGE) et à un électro-transfert (« electroblot ») sur une membrane de nitrocellulose développée par anti-S. sonnei.
La figure 4 illustre les résultats pour les échantillons suivants : • Couloir 1 : échelle de protéines précolorées servant de règle de page • Couloir 2 : échantillon de protéines issu de
St2174 [pGVXN930, pGVXN150 (EPAatsff) , pGVXN72 (pEXT21)] induit ; • Couloir 3 : échantillon de protéines issu de
St2174 [pGVXN930, pGVXN150 (EPAmse) , pGVXN970 (pglBcuo) ] induit ; • Couloir 4 : échantillon de protéines issu de
St2174 [pGVXN930, pGVXN150 (EPAmse) , pGVXN1220 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-N534Q-A669V)] induit ; • Couloir 5 : échantillon de protéines issu de
St2174 [pGVXN930, pGVXN150 (EPA mse), pGVXN114 (pglB„t-HA] .
La portée de la présente divulgation ne doit pas être limitée par les modes de réalisations spécifiques décrits dans le présent document. En effet, diverses modifications du sujet de l'invention proposé dans le présent document, en plus de celles décrites, deviendront apparentes à l'homme du métier à la lecture de la description précédente et des figures jointes. De telles modifications sont destinées à appartenir à la portée des revendications annexées.
Diverses publications, divers brevets et diverses demandes de brevets sont cités dans le présent document, leur description étant incorporé à la présente à titre de référence dans leur globalité. L'invention est décrite en outre dans les paragraphes suivants : 1. Une N-oligosaccharyl transférase modifiée recombinante (N-OST), dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglB de Campylobacter jejuni (PglBcj) comprenant une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N311, K482, D483 et A669. 2. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 1, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé N311 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), l'alanine, la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I). 3. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 1 ou 2, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N311V. 4. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 3, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K482 par un acide aminé basique choisi parmi la lysine (K) ou l'arginine (R). 5. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 4, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution K482R. 6. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 5, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution D483H. 7. La PglBcj modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 6, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé A669 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G) , la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I). 8. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 7, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution •A66 9V.
9. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 8, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H .et une substitution A669V. 10. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 9, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution supplémentaire à la position d'acide aminé N534. 11. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 10, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N534Q. 12. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 11, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H et une substitution A669V. 13. Une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglB de
Campylobacter lari (PglBci) comprenant trois substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488 et D489, et une autre substitution d'acide aminé dans une région comprenant les positions d'acide aminé P667 à 1672' de PglBci (PYAQFI). 14. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 6, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489 et K668. 15. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 13 ou 14, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé N314 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), l'alanine, la valine (V) , la leucine (L) ou l'isoleucine (I). 16. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 6, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N314V. 17. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 16, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K488 par un acide aminé basique choisi parmi la lysine (K) ou l'arginine (R). 18. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 3 à 17, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution K488R. 19. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 3 à 18, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution D483H. 20. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 19, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K668 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I). 21. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 20, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution K668V. 22. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 21, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H et une substitution K668V. 23. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 6 à 22, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488, D489, N535 et K668. 24. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 23, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N535Q. 25. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 24, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H, une substitution N535Q et une substitution K668V. 26. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 25, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut lier de manière détectable un oligosaccharide ou- un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice à une protéine de support pour produire une protéine de support N-glycosylée. 27. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 7, dans laquelle la protéine de support est choisie dans le groupe constitué par l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur agglutinant A, le facteur agglutinant B, FimH d'E. coli, FimHC d'E. coli, l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, les variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB), la toxine cholérique, les variants détoxifiés de la toxine cholérique, la protéine sat d'E. coli, le domaine passager de la protéine sat d'E. coli, AcrA de C. jejuni et les glycoprotéines naturelles de C. jejuni. 28. La N-OST modifiée recombinante du paragraphe 7 ou 27, dans laquelle l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu du sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice comprend un antigène. 29. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 28, dans laquelle l'antigène comprend un antigène d'E. coli, un antigène de Salmonella sp, un antigène de Pseudomonas sp., un antigène de Klebsiella sp., un antigène 0 d' Acinetobacter, un antigène de Chlamydia trachomatis, un antigène de Vibrio choiera, un antigène de Listeria sp., un antigène de Légionella pneumophila sérotypes 1 à 15, un antigène de Bordetella parapertussis, un antigène de Burkholderia mallei ou de pseudomallei, un antigène de Francisella tularensis, un antigène de Campylobacter sp. ; un antigène de Clostridium difficile, un antigène de Streptococcus pyrogenes, un antigène de Streptococcus agalacticae, un antigène de Neisseria meningitidis, un antigène de Candida albicans, un antigène de Haemophilus influenza, un antigène d'Enterococcus faecalis, un antigène de Borrelia burgdorferi, un antigène de Neisseria meningitidis, un antigène de Haemophilus influenza, un antigène de Leishmania major, ou un antigène de Shigella sonnei, ou un antigène de Streptococcus pneumoniae. 30. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 29, dans laquelle la protéine de support et l'oligosaccharide ou le polysaccharide proviennent d'un organisme différent de C. jejuni ou C. lari. 31 La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 30, dans laquelle la protéine de support et l'oligosaccharide ou le polysaccharide proviennent d'organismes différents. 32. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 31, dans laquelle la protéine de support provient de C. jejuni ou C. lari. 33. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 31, dans laquelle la protéine de support provient d'un organisme différent de C. jejuni ou C. lari. 34. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 33, dans laquelle la protéine de support N-glycosylée comprend le polysaccharide capsulaire CP5 (CPS 5) de Staphylococcus aureus et 1'hémolysine A détoxifiée (H1A) de S. aureus. 35. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 33, dans laquelle la protéine de support N-glycosylée comprend le polysaccharide capsulaire CP8 (CPS 8) de Staphylococcus aureus et le facteur agglutinant A (ClfA) d'E. coli. 36. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 33, dans laquelle la protéine de support N-glycosylée comprend le polysaccharide capsulaire CPI (CPS 1) de Streptococcus pneumoniae et l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA). 37. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 7 à 33, dans laquelle l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice présente un monosaccharide galactose à son extrémité réductrice. 38. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 37, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut produire un rendement de la protéine de support N-glycosylée qui est détectable à des niveaux de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois supérieurs au niveau de base dans un essai détectant la protéine de support N-glycosylée. 39. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 37, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut augmenter le rendement de production de la protéine de support N-glycosylée de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 7 0 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport au rendement obtenu en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 37. 40. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 37, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut augmenter la vitesse de production de la protéine de support N-glycosylée de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport à la vitesse de production obtenue en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 37. 41. La N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 37, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut donner un niveau de glycosylation in vivo ou in vitro du support avec l'oligosaccharide ou le polysaccharide dépourvu du sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice d'au moins 1 %, d'au moins 3 %, d'au moins 5 %, d'au moins 10 %, d'au moins 15 %, d'au moins 20 %, d'au moins 25 %, d'au moins 30 %, d'au moins 35 %, d'au moins 40 %, d'au moins 45 %, d'au moins 50 %, d'au moins 55 %, d'au moins 60 %, d'au moins 65 % ou d'au moins 70 %. 42. Une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est PglBcj comprenant une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H et une substitution A699V. 43. Une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est PglBcj comprenant une substitution N311V, une substitution K482R, une substitution D483H, une substitution N534Q et une substitution A699V. 44. Une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est PglBci comprenant une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H et une substitution K698V. 45. Une N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est PglBci comprenant une substitution N314V, une substitution K488R, une substitution D489H, une substitution N535Q et une substitution K698V. 46. Un acide nucléique codant une N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 45. 47. Une cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 45. 48. La cellule hôte du paragraphe 10, comprenant en outre une glycosyltransférase recombinante. 49. Une cellule hôte comprenant un acide nucléique du paragraphe 46. 50. La cellule hôte selon l'un quelconque des paragraphes précédents, dans laquelle la cellule hôte est une cellule procaryote. 51. La cellule hôte du paragraphe 50, dans laquelle la cellule hôte est une cellule dΈ. coli. 52. Un procédé de production d'un bioconjugué comprenant la culture d'une cellule hôte selon l'un quelconque des paragraphes précédents dans un milieu de culture de cellules. 53. Le procédé du paragraphe 14, dans lequel la cellule hôte comprend une protéine de support et une PglBcj modifiée recombinante. 54. Le procédé du paragraphe 14 ou 53, dans lequel la cellule hôte comprend en outre une glycosyl-transférase recombinante. 55. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 54, la protéine de support est choisie dans le groupe constitué par l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur agglutinant A, le facteur agglutinant B, FimH dΈ. coli, FimHC d'E. coli, l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, les variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB), la toxine cholérique, les variants détoxifiés de la toxine cholérique, la protéine sat d'E. coli, le domaine passager de la protéine sat d'E. coli, AcrA de C. jejuni et les glycoprotéines naturelles de C. jejuni. 56. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 55, dans lequel le bioconjugué est une protéine de support N-glycosylée. 57. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 56, dans lequel le bioconjugué est une protéine de support N-glycosylée naturelle de C. jejuni. 58. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 56, dans lequel le bioconjugué est une protéine de support N-glycosylée hétérologue de C. jejuni. 59. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 58, dans lequel la protéine de support N-glycosylée ne présente pas un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice de son composant oligosaccharidique ou polysaccharidique. ' 60. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 59, dans lequel la protéine de support N-glycosylée présente un galactose à l'extrémité réductrice de son composant oligosaccharidique ou polysaccharidique. 61. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 59, dans lequel le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CPI (CPS 1) de Streptococcus pneumoniae et l'exotoxine A de P. aeruginosa (EPA). 62. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 59, dans lequel le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP5 (CPS 5) de Staphylococcus aureus et 1'hémolysine A détoxifiée (H1A) de S. aureus. 63. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 59, dans lequel le bioconjugué comprend le polysaccharide capsulaire CP8 (CPS 8) de Staphylococcus aureus et le facteur agglutinant A (ClfA) d’E. coli. 64. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes 14 à 59, dans lequel le bioconjugué comprend l'antigène 0 de Plesiomonas shigelloid.es 017 (017) et une EPA. • 65. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes précédents, dans lequel la N-OST modifiée recombinante peut augmenter la vitesse de production du bioconjugué. 66. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes précédents, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut produire un rendement du bioconjugué qui est détectable à des niveaux de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois supérieurs au niveau de base dans un essai détectant la protéine de support N-glycosylée. 67. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes précédents, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut augmenter le rendement de production du bioconjugué de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport au rendement obtenu en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé gue la N-OST modifiée recombinante selon l'un guelcongue des paragraphes 1 à 45. 68. Le procédé selon l'un quelcongue des paragraphes précédents, dans lequel la N-OST modifiée recombinante peut augmenter la vitesse de production du bioconjugué de plus de 20 %, de plus de 30 %, de plus de 40 %, de plus de 50 %, de plus de 60 %, de plus de 70 %, de plus de 80 %, de plus de 90 %, de plus de 2 fois, de plus de 3 fois, de plus de 4 fois, de plus de 5 fois, de plus de 6 fois, de plus de 7 fois, de plus de 8 fois, de plus de 9 fois, de plus de 10 fois, de plus de 11 fois, de plus de 12 fois, de plus de 13 fois, de plus de 14 fois, de plus de 15 fois, de plus de 17 fois, de plus de 20 fois, de plus de 25 fois, de plus de 30 fois, de plus de 35 fois, de plus de 40 fois, de plus de 45 fois, de plus de 50 fois, de plus de 60 fois, de plus de 70 fois, de plus de 80 fois, de plus de 90 fois ou de plus de 100 fois par rapport à la vitesse obtenue en utilisant une N-OST de type sauvage ou une N-OST modifiée recombinante présentant moins de substitution d'acide aminé que la N-OST modifiée recombinante selon l'un quelconque des paragraphes 1 à 45. 69. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes précédents, dans lequel au moins 1 %, au moins 3 %, au moins 5 %, au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 % ou au moins 70 % de la protéine de support dans une cellule hôte sont N-glycosylés pour former le bioconjugué. 70. Le procédé selon l'un quelconque des paragraphes précédents, comprenant en outre la purification du bioconjugué à partir de la culture de la cellule hôte.

Claims (9)

  1. REVENDICATIONS 1. N-oligosaccharyl transférase modifiée recombinante (N-OST) , dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglB de Campylobacter jejuni (PglBcj) comprenant une substitution d'acide aminé aux positions d'acide aminé N311, K482, D483 et A669 dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé A669 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I).. 2. N-OST modifiée recombinante selon la revendication 1, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé N311 par un acide aminé aliphatique choisi dans le groupe constitué par la glycine (G), l'alanine, la valine (V), la leucine (L) ou l'isoleucine (I). 3. N-OST modifiée recombinante selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution de l'acide aminé K482 par l'arginine (R). 4. N-OST modifiée recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend une substitution D483H.
  2. 5. PglBCj modifiée recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante comprend la substitution de l'acide aminé A669 par la valine(V). 6. N-OST modifiée recombinante, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante est la PglB de Campylobacter lari (PglBCi) comprenant trois substitutions d'acide aminé aux positions d'acide aminé N314, K488 et D489, et une autre substitution d'acide aminé à l'acide aminé K668. 7. N-OST modifiée recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut lier de manière détectable un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice à une protéine de support pour produire une protéine de support N-glycosylée. 8. N-OST modifiée recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la N-OST modifiée recombinante peut lier de manière détectable un oligosaccharide ou un polysaccharide dépourvu d'un sucre N-acétylé à l'extrémité réductrice à une protéine de support pour produire une protéine de support N-glycosylée.
  3. 9. Acide nucléique codant une N-OST modifiée recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
  4. 10. Cellule hôte comprenant une N-OST modifiée recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
  5. 11. Cellule hôte selon la revendication 10, comprenant en outre une glycosyltransférase recombinante.
  6. 12. Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 9.
  7. 13. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans laquelle la cellule hôte est une cellule d'E. coli.
  8. 14. Procédé de production d'un bioconjugué comprenant la culture de la cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 dans un milieu de culture de cellules.
  9. 15. Procédé selon la revendication 14, comprenant en outre la purification du bioconjugué à partir de la culture de la cellule hôte.
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