BR112015014991B1 - Anticorpo específico para e. coli mdr, plasmídeo, cassete de expressão, célula hospedeira, método de produção do anticorpo, método para identificar um anticorpo candidato, preparação farmacêutica e de diagnóstico, epítopo, imunogênio e ácido nucleico utilizados - Google Patents

Abstract

anticorpo específico para e. coli mdr, plasmídeo, cassete de expressão, célula hospedeira, método de produção do anticorpo, método para identificar um anticorpo candidato, preparação farmacêutica e de diagnóstico, epítopo, imunogênio e ácido nucleico utilizados. a presente invenção se refere a um anticorpo isolado que se liga especificamente ao antígeno o25b de cepas de e. coli multidroga resistentes (mdr), seu uso diagnóstico e terapêutico, método de produção do anticorpo, incluindo uma sequencia de nucleotídeos, plasmídeo e células hospedeiras isolados como usadaos na produção do anticorpo; e ainda um epítopo isolado reconhecido pelo anticorpo especifico. 1 / 1

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção diz respeito a um anticorpo especificamente ligado ao antígeno LPS O25b de cepas de E. coli multidroga resistente (MDR).

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] O lipopolissacarídeo (LPS) é o antígeno mais abundante na superfície de patógenos enterobacterianos. Tipicamente, o LPS possui três partes estruturais: i) Lipídeo A (também conhecido como endotoxina), ii) oligossacarídeo do núcleo e iii) antígeno O. Esse último é constituído por subunidades de repetição de 3-6 açúcares (dependendo do sorotipo). O lipídeo A e o OS do núcleo são relativamente bem conservados em uma única espécie enterobacteriana, no entanto, suas acessibilidades aos anticorpos são limitadas. Por outro lado, os antígenos O são altamente acessíveis, mas muito diversos em relação à sua estrutura (no E. coli existem aproximadamente 180 tipos diferentes de O).

[003] Os anticorpos, ao contrário dos antígenos O, são capazes de ligar-se à superfície do E. coli, consequentemente, são utilizados tanto para diagnóstico (por exemplo, tipagem de O para estudos de epidemiologia) como são sugeridos como medidas terapêuticas. No entanto, dada a enorme variabilidade estrutural, não é fácil um amplo espectro de proteção com anticorpos específicos para o antígeno O.

[004] Infecções extraintestinais provocadas por E. coli são causadoras comuns de significativa morbidade e mortalidade. Cepas de E. coli multidroga resistente (MDR) que surgiram recentemente provocam uma significativa proporção de infecções por E. coli.

[005] As opções de tratamento contra essas cepas MDR estão se tornando muito limitadas uma vez que elas desenvolveram resistência à maioria das classes de antibióticos clinicamente importantes. Portanto, uma opção de tratamento alternativo, por exemplo, uma imunização passiva com anticorpos monoclonais (mAbs) é uma grande promessa para o futuro.

[006] Nos últimos anos, surgiu uma linhagem clonal bem definida de E. coli MDR, o ST131-O25b:H4, causando aproximadamente 10% de todas as infecções extraintestinais por E. coli e cerca de metade das infecções por E. coli MDR (Peirano et al. Int J Antimicrob Agents 2010 Apr;35(4):316-21; Rogers et al. J Antimicrob Chemother 2011 Jan;66(1):1-14; Woodford et al. FEMS Microbiol Rev. 2011 Sep;35(5):736-55.). As cepas que pertencem a essa linhagem apresentam heterogeneidade limitada, assim, podem ser consideradas muito parecidas em relação ao repertório antigênico. A vasta maioria das cepas que pertencem a esse agrupamento expressa o antígeno O25b e, portanto, para a identificação desse clone, utiliza um gene específico (dentro do locus de síntese do LPS) que codifica para as enzimas que sintetizam esse antígeno (Clermont et al. J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5):1024-8.). Alternativamente, pode ser utilizada aglutinação com soro de tipagem O25, apesar do antígeno O dessa linhagem diferir do clássico antígeno O25 (consequentemente, ele foi denominado O25b), conforme sugerido pelas diferenças genéticas. No entanto, o soro de tipagem O25 não consegue distinguir os clones do O25 não MDR do O25b MDR.

[007] Rogers et al. (J Antimicrob Chemother 2011 Jan;66(1):1-14) descreve a detecção da cepa de E. coli O25b-ST131 por três características principais, ou seja, seu sorogrupo (O25b), seu grupo filogenético (B2) e seu ST (ST131). Cada uma dessas características é divulgada para auxiliar na detecção. É descrita uma variedade de técnicas moleculares, isto é, MLST, métodos de detecção rápida com base em PCR, sequência repetitiva de PCR e PFGE. Foram utilizados antissoros policlonais (produzidos em comparação a uma cepa de O25a), incluindo uma variedade de imunoglobulinas, para determinar o antígeno O25, não diferenciando os subtipos.

[008] Jadhay et al. (PLOS ONE 2011;6(3): e18063) descreve as características da virulência e as afinidades genéticas de cepas que foram positivas para o subgrupo O25b, que se encontravam ligadas ao tipo virulento/multirresistente B2- O25b-ST131-CTX-M-15. Isolados clínicos humanos foram analisados e classificados em sorotipos e foram obtidos os perfis marcadores de virulência. Foram identificadas cepas O25 positivas por sorotipagem usando antissoro policlonal contra antígenos O - O1 a O173. As cepas O25 positivas foram então submetidas à genotipagem por PCR alelo específica visando o locus do gene do subgrupo rfbO25b.

[009] Mora et al. (Int. J. Antimicrobial Agents 2011;37(1): 16-21) descreve o surgimento de alguns grupos clonais entre o CTX-M-14 produzindo isolados clínicos de E. coli, entre eles o O25b: H4-B2-ST131. A tipagem foi feita com antissoro específico O (policlonal).

[010] Clermont et al. (J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5):1024-8) divulga um ensaio de PCR alelo-específica pabB para o E. coli O25b ST131.

[011] Szijarto et al, (FEMS Microbiol Lett 2012;332:131-6) descreve a tipagem molecular de cepas isoladas de E. coli com base na estrutura do núcleo da molécula de LPS. O tipo do núcleo dos isolados foi determinado por PCR usando primers que visavam os genes no operon do núcleo e específicos para os núcleos do tipo R1-4 e K-12, respectivamente.

RESUMO DA INVENÇÃO

[012] O objetivo da presente invenção é fornecer um anticorpo direcionado contra cepas MDR de E. coli, com especificidade melhorada, para ser utilizado na prevenção ou na terapia de infecções por E. coli causadas por cepas que carregam o O25b. Outro objetivo é fornecer meios e métodos que sejam capazes de diagnosticar a bactéria E. coli MDR de forma rápida e confiável.

[013] Os objetivos são solucionados através do assunto da presente invenção.

[014] De acordo com a invenção, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente ao antígeno O25b de cepas de E. coli multidroga resistente (MDR).

[015] Especificamente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[016] Especificamente, o anticorpo é específico para ligar-se somente ao antígeno O25b, ou específico-cruzada para ligar-se a um epítopo compartilhado pelos antígenos O25a e O25b.

[017] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo é específico-cruzado para ligar-se aos antígenos O25b e O25 ou O25a, por exemplo, afinidades iguais, mais do que iguais, semelhantes ou diferentes.

[018] Especificamente, o anticorpo da invenção preferencialmente se liga ao antígeno O25b, em comparação ao antígeno O25a do E. coli, ou pelo menos com afinidade igual para ambos os antígenos.

[019] De acordo com uma incorporação específica, o anticorpo possui afinidade pelo menos duas vezes maior para ligar-se ao antígeno O25b, quando comparado ao antígeno O25a, especificamente com uma diferença de pelo menos duas vezes, ou pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos 5 vezes, ou ainda pelo menos 10 vezes, na ligação ou com o antígeno O25b ou com o O25a, por exemplo, diferença na afinidade e/ou avidez.

[020] De acordo com um aspecto específico, a ligação específica ao O25b é caracterizada pela maior afinidade para ligar-se ao antígeno O25b, quando comparado à ligação ao antígeno O25b por um soro policlonal produzido contra cepas de E. coli O25 ou O25a, conforme determinado por imunoensaio, de preferência, imunotransferência, ELISA ou outros métodos imunológicos. A maior afinidade de ligação é especificamente com uma diferença pelo menos duas vezes, ou pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos 5 vezes, ou ainda pelo menos 10 vezes.

[021] Especificamente, o antígeno O25b, como alvo do anticorpo da invenção, é predominante em uma ou mais cepas, e mais especificamente está presente na grande maioria das cepas ST131.

[022] Especificamente, o epítopo reconhecido pelo anticorpo está presente na superfície de cepas ST131-O25b:H4 encapsuladas e não encapsuladas, por exemplo, cepas mutantes.

[023] De acordo com um aspecto mais específico, o anticorpo tem um sítio de ligação de um anticorpo monoclonal de comprimento integral, ou um fragmento desse anticorpo, compreendendo pelo menos um domínio de anticorpo que incorpora um sítio de ligação, cujo anticorpo é, preferencialmente, um anticorpo selecionado a partir de um grupo consistindo de murino, lhama, coelho, cabra, vaca, quimérico, anticorpos humanizados ou humanos, anticorpos de cadeia pesada, Fab, Fd, scFv e anticorpos de domínio único como VH, VHH ou VL, de preferência um anticorpo lgG humano ou um anticorpo lgG de murino.

[024] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo tem afinidade para ligar-se ao antígeno O25b com um Kd menor do que 10-7M, de preferência menor do que 10-8M, especificamente em um estado monomérico.

[025] De acordo com um aspecto mais específico, in vitro, o anticorpo exibe potência bactericida em uma amostra de soro compreendendo cepas vivas de E. coli MDR do tipo selvagem.

[026] De acordo com outro aspecto específico, in vitro, o anticorpo estimula a absorção das cepas vivas de E. coli MDR do tipo selvagem por células fagocíticas.

[027] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo denominado como 8D5-1G10 ou 8D10-C8.

[028] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo contém o mesmo sítio de ligação que o anticorpo denominado como 8D5-1G10 ou 8D10-C8.

[029] De acordo com um aspecto específico, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente ao antígeno O25b de cepas multidroga resistentes (MDR) de E. coli, o qual contém o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 5D5-1G10, ou que é derivado do anticorpo 8D5-1G10, ou uma variante funcionalmente ativa do anticorpo 8D5-1G10, de preferência onde o anticorpo 8D5- 1G10 seja caracterizado por: a) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzida pela célula hospedeira depositada sob DSM 26763; e/ou b) a região variável da cadeia pesada do anticorpo produzida pela célula hospedeira sob DSM 26762; c) ou é empregada uma variante funcionalmente ativa de (a) e/ou (b).

[030] De acordo com uma incorporação específica, o anticorpo é o anticorpo 8D5-1G10, ou uma variante funcionalmente ativa dele.

[031] Nesse documento, encontram-se exemplificados outros anticorpos da invenção, que são denominados 6D1-1B2 e 8A1-1G8. Eles são clones com sequências da CDR semelhantes ao 8D5-1G10, aqui também entendidos como variantes da CDR funcionalmente ativas.

[032] Especificamente, o anticorpo denominado como 8D5-1G10 é composto por uma cadeia leve de anticorpo incluindo a região variável codificada pela sequência de codificação do plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 26763, e por uma cadeia pesada de anticorpo incluindo a região variável codificada pela sequência de codificação do plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 26762.

[033] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo é derivado do anticorpo 8D5-1G10, onde: - a região variável da cadeia leve do anticorpo é codificada por um plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 26763, ou uma variante funcionalmente ativa; e/ou - a região variável da cadeia pesada do anticorpo é codificada por um plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 26762, ou uma variante funcionalmente ativa.

[034] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo é derivado de um anticorpo, onde: - a região variável da cadeia leve do anticorpo é produzida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26763, ou uma variante funcionalmente ativa; e/ou - a região variável da cadeia pesada do anticorpo é produzida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26762, ou uma variante funcionalmente ativa.

[035] De acordo com outro aspecto específico, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado que é específico-cruzada para ligar-se a um epítopo compartilhado pelos antígenos O25a e O25b, e que inclui o sítio de ligação do antígeno do anticorpo 8D10-C8, ou que é derivado do anticorpo 8D10-C8, ou uma variante funcionalmente ativa do anticorpo 8D10-C8, preferencialmente onde o anticorpo 8D10-C8 seja caracterizado por: a) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzida pela célula hospedeira depositada sob DSM 28171; e/ou b) a região variável da cadeia pesada do anticorpo produzida pela célula hospedeira sob DSM 28172; c) ou é empregada uma variante funcionalmente ativa de (a) e/ou (b).

[036] De acordo com uma incorporação específica, o anticorpo é o anticorpo 8D10-C8, ou uma variante funcionalmente ativa dele.

[037] Especificamente, o anticorpo denominado como 8D10-C8 é composto por uma cadeia leve de anticorpo incluindo a região variável codificada pela sequência de codificação do plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 28171, e por uma cadeia pesada de anticorpo incluindo a região variável codificada pela sequência de codificação do plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 28172.

[038] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo é derivado do anticorpo 8D10-C8, onde: - a região variável da cadeia leve do anticorpo é codificada por um plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 28171, ou uma variante funcionalmente ativa; e/ou - a região variável da cadeia pesada do anticorpo é codificada por um plasmídeo incluído na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 28172, ou uma variante funcionalmente ativa.

[039] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo é derivado de um anticorpo, onde: - a região variável da cadeia leve do anticorpo é produzida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 28171, ou uma variante funcionalmente ativa; e/ou - a região variável da cadeia pesada do anticorpo é produzida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 28172, ou uma variante funcionalmente ativa.

[040] Especificamente, a variante funcionalmente ativa é uma variante da CDR, por exemplo, que compreenda uma CDR, mais especificamente uma sequência loop da CDR, com uma sequência de aminoácido com pelo menos 60% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidade de sequência.

[041] Especificamente, o anticorpo é derivado desses anticorpos, empregando as respectivas sequências da CDR, ou mutantes da CDR, incluindo variantes da CDR funcionalmente ativas, por exemplo, com 1, 2 ou 3 mutações de ponto dentro do loop da CDR.

[042] Especificamente, a variante funcionalmente ativa difere do anticorpo parental em pelo menos uma mutação de ponto na sequência de aminoácido, de preferência na CDR, onde o número de mutações de ponto em cada uma das sequências de aminoácidos da CDR é 0, 1, 2 ou 3.

[043] De acordo com um aspecto específico, a invenção fornece um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos: A - que codifica a região variável da cadeia leve de anticorpo denominado 8D5- 1G10-LC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 26763; e/ou - que codifica a região variável da cadeia pesada de anticorpo denominado 8D5-1G10-HC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 26762; ou B - que codifica a região variável da cadeia leve de anticorpo denominado 8D10-C8-LC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 28171; e/ou - que codifica a região variável da cadeia pesada de anticorpo denominado 8D10-C8-HC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 28172.

[044] De acordo com outro aspecto específico, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo uma sequência de codificação para expressar uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de um anticorpo da invenção, cujo cassete de expressão ou sequência de codificação é derivado de um plasmídeo selecionado de um grupo consistindo de um plasmídeo da invenção.

[045] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção fornece um método para produzir um anticorpo da invenção, onde uma célula hospedeira é transformada com um plasmídeo da invenção ou com o cassete de expressão da invenção.

[046] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo um plasmídeo da invenção ou o cassete de expressão da invenção.

[047] Especificamente, a célula hospedeira é depositada sob: A DSM 26763 e/ou DSM 26762; ou B DSM 28171 e/ou DSM 28172.

[048] Uma incorporação específica se refere a um método para a produção de um anticorpo da invenção, onde uma célula hospedeira da invenção é cultivada ou mantida em condições para produzir o referido anticorpo.

[049] De acordo com um outro aspecto da invenção, a invenção fornece um método para identificar um anticorpo candidato compreendendo: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpo; e (b) avaliar a ligação de um anticorpo presente ou produzido pela amostra com um epítopo reconhecido por um anticorpo denominado como 8D5-1G10 ou 8D10C8, onde uma reação positiva entre o anticorpo e o epítopo identifica o anticorpo como anticorpo candidato.

[050] De acordo com um outro aspecto da invenção, a invenção fornece um método para identificar um anticorpo candidato compreendendo: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpo; e (b) avaliar a ligação de um anticorpo presente ou produzido pela amostra com antígeno O25b de uma cepa ST131-O25b:H4, e antígeno O25 de uma cepa não MDR de E. coli, ou o antígeno O25a, onde uma reação específica positiva entre o anticorpo e o antígeno O25b em relação ao antígeno O25, ou em relação ao antígeno O25a, identifica o anticorpo como anticorpo candidato.

[051] Especificamente, o anticorpo candidato é um anticorpo candidato de proteção, tal como para utilização terapêutica, ou um anticorpo candidato para diagnóstico.

[052] Ainda, de acordo com outro aspecto da invenção, a invenção fornece um método para produzir um anticorpo da invenção compreendendo: (a) fornecer um anticorpo candidato identificado de acordo com a invenção; e (b) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um derivado dele com a mesma especificidade de ligação ao epítopo que o anticorpo candidato.

[053] De acordo com outro aspecto da invenção, a invenção fornece um método para produzir um anticorpo da invenção compreendendo: (a) imunizar um animal não humano com um epítopo reconhecido por um anticorpo denominado como 8D5-1g10 ou 8D10-C8; (b) formar linhagens celulares imortalizadas a partir de células B isoladas; (c) fazer triagem das linhagens celulares obtidas em b) para identificar uma linhagem celular que produza um anticorpo monoclonal que se ligue ao epítopo; e (d) produzir o anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo, ou um derivado dele com a mesma especificidade de ligação ao epítopo que o anticorpo monoclonal.

[054] De acordo com um outro aspecto da invenção, a invenção fornece um método para produzir um anticorpo da invenção compreendendo: (a) imunizar um animal não humano com antígeno O25b de uma cepa ST131- O25b:H4 e isolar células B produtoras de anticorpos; (b) formar linhagens celulares imortalizadas a partir de células B isoladas; (c) fazer a triagem das linhagens celulares para identificar uma linhagem celular produtora de um anticorpo monoclonal que, de preferência, se ligue ao antígeno O25b, em relação ao antígeno O25, ou ao antígeno O25a de E. coli; e (d) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um derivado dele com a mesma especificidade de ligação ao epítopo que o anticorpo candidato.

[055] De acordo com um outro aspecto, a invenção fornece a utilização médica de um anticorpo da invenção. Especificamente, o anticorpo é fornecido para utilização no tratamento de um indivíduo em risco ou sofrendo de uma infecção por E. coli MDR, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo para limitar a infecção do indivíduo ou para melhorar uma condição de enfermidade resultante de tal infecção, de preferência para o tratamento ou profilaxia de pielonefrite, bacteremia secundária, sepse, peritonite, meningite e pneumonia associada à ventilação.

[056] Especificamente, o anticorpo é fornecido por morte bactericida do E. coli MDR, de preferência uma cepa ST131-O25b:H4, independentemente do polissacarídeo capsular expresso pela cepa.

[057] De acordo com um aspecto específico, é fornecido ainda um método de tratamento onde um indivíduo em risco ou sofrendo de uma infecção por E. coli MDR é tratado, cujo método compreenda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo para limitar a infecção no indivíduo ou para melhorar uma condição de enfermidade resultante de tal infecção, de preferência um método para o tratamento ou a profilaxia de pielonefrite, bacteremia secundária, sepse, peritonite, meningite e pneumonia associada à ventilação.

[058] Especificamente, o método de tratamento é fornecido por morte bactericida do E. coli MDR, de preferência uma cepa ST131-O25b:H4, independentemente do polissacarídeo capsular expresso pela cepa.

[059] De acordo com um aspecto específico, a imunoterapia usando o anticorpo da invenção pode proteger de forma eficaz contra infecção bacteriana ativa, por exemplo, tal como determinado em diversos modelos animais.

[060] Especificamente, o anticorpo pode neutralizar a endotoxemia letal. Essa atividade funcional pode ser determinada em um modelo in vivo adequado (infecção com LPS purificado).

[061] O anticorpo é especificamente eficaz contra E. coli MDR por morte mediada pelo complemento, por exemplo, como determinado por um ensaio bactericida no soro (SBA) in vitro, por exemplo, com pelo menos 20% de morte das bactérias acima das amostras de controle (sem adição de anticorpo ou controle irrelevante mAb).

[062] O anticorpo é especificamente eficaz contra E. coli MDR por fagocitose mediada por anticorpo, por exemplo, como determinado por um ensaio de morte por opsonofagocitose (OPK) in vitro, por exemplo, com pelo menos 20% de absorção das bactérias ingressantes ou contagem final de cfu 20% menor, em relação às amostras de controle (sem adição de anticorpo ou controle irrelevante mAb).

[063] O anticorpo é especificamente eficaz contra E. coli MDR através da neutralização das funções da endotoxina, por exemplo, conforme determinado por um ensaio do LAL in vitro, ou ensaio do repórter de receptor tipo toll-4 (TLR4), por exemplo, com pelo menos 20% de redução nas atividades da endotoxina em comparação às amostras de controle (sem adição de anticorpo ou controle irrelevante mAb).

[064] De acordo com uma incorporação específica, o anticorpo é administrado em uma formulação parentérica ou por mucosa.

[065] De acordo com um outro aspecto, a invenção fornece uma preparação farmacêutica de um anticorpo da invenção, preferencialmente compreendendo uma formulação parentérica ou por mucosa, opcionalmente contendo um carregador ou excipiente farmacêuticamente aceitável.

[066] De acordo com um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo da invenção para utilização em diagnóstico para detectar ou determinar a infecção por E. coli em um indivíduo, provocada por cepas MDR que expressam o antígeno LPS O25b, tal como as infecções do trato urinário inferior e superior, incluindo a cistite ou a uretrite, pielonefrite ascendente ou hematogênica, especialmente em pacientes diabéticos, assim como com bacteremia, sepse, peritonite ou colonização intestinal.

[067] Especificamente, o anticorpo é fornecido para utilização conforme a invenção, onde uma infecção sistêmica com E. coli MDR em um indivíduo é determinada ex vivo pelo contato de uma amostra de fluido corporal de tal indivíduo com o anticorpo, onde uma reação imune específica do anticorpo determina a infecção.

[068] Especificamente, uma amostra de fluido corporal é testada em relação à reação imune específica, cuja amostra seja selecionada de um grupo consistindo de urina, sangue, isolados de sangue ou cultura de sangue, aspirado, esputo, fluido de lavagem de indivíduos intubados e fezes.

[069] Especificamente, a utilização do diagnóstico, de acordo com a invenção, diz respeito à determinação do sorotipo de E. coli in vitro a partir de uma cultura pura de E. coli recuperada de uma amostra clínica.

[070] De acordo com um outro aspecto, a invenção fornece uma preparação de diagnóstico de um anticorpo da invenção, opcionalmente contendo o anticorpo com um rótulo e/ou um reagente de diagnóstico adicional com um rótulo, tal como um reagente que reconheça especificamente o anticorpo ou um complexo imune do anticorpo com o respectivo antígeno alvo, e/ou uma fase sólida para imobilizar pelo menos um anticorpo e o reagente de diagnóstico. A preparação de diagnóstico pode ser fornecida como uma composição ou como um conjunto de partes, por exemplo, compreendendo componentes, tais como componentes que compreendam: a) a preparação do anticorpo de diagnóstico, e/ou b) reagente adicional de diagnóstico, e/ou uma fase sólida para imobilizar pelo menos um anticorpo e o reagente de diagnóstico, ou como um componente em separado ou como um carregador de quaisquer componentes a) e/ou b) acima.

[071] Os ensaios de diagnóstico preferidos da invenção compreendem o anticorpo da invenção imobilizado sobre uma fase sólida, por exemplo, esferas de látex, partículas de ouro, etc., por exemplo, para testar a aglutinação pelo anticorpo de bactérias que expressam o antígeno O25b ou o antígeno O25b livre (ou isolado) obtido a partir de uma amostra a ser testada.

[072] Alguns ensaios de diagnóstico podem envolver dois anticorpos diferentes com especificidade e/ou afinidade diferentes de ligação ao O25b e/ou O25a, assim, possivelmente, diferenciando entre os antígenos O25b e O25a.

[073] De acordo com um aspecto específico, a invenção fornece companion diagnostics (método de desenvolvimento com teste diagnóstico de validação) para determinar a infecção em um indivíduo com E. coli MDR pelo diagnóstico da invenção ou pelo método de diagnóstico da invenção, para fornecer a base de tratamento com um agente terapêutico contra tal infecção, por exemplo, empregando imunoterapia, tal como o tratamento com um anticorpo da invenção.

[074] De acordo com um aspecto específico, a invenção fornece um diagnóstico sensível à beira do leito para diagnosticar a infecção em um indivíduo com E. coli MDR, através da determinação de LPS livres, por exemplo, a partir de uma amostra clínica onde a quantidade de bactéria viva é limitada. A sensibilidade desse ensaio é especificamente menor do que 100 ng, de preferência menor do que 10 ng de LPS.

[075] De acordo com um outro aspecto, a invenção fornece um epítopo isolado reconhecido pelo anticorpo denominado 8D5-1G10 ou 8D10-C8. Esse epítopo pode consistir de um único epítopo ou uma mistura de epítopos compreendendo variantes do epítopo, cada uma delas reconhecida pelo anticorpo denominado 8D5-1G10 ou 8D10-C8. Especificamente, o epítopo do anticorpo 8D10-C8 é compartilhado e predominante em ambos os antígenos O25b e O25a, assim o anticorpo é considerado como sendo específico-cruzada, e ainda, preferencialmente, ligando-se ao antígeno O25b pelo menos com igual afinidade ao da ligação ao antígeno O25a.

[076] De acordo com um outro aspecto, a invenção fornece um imunogênio compreendendo: (a) um epítopo da invenção; (b) opcionalmente, outros epítopo não associados nativamente com o referido epítopo em (a); e (c) um carregador.

[077] Especificamente, o carregador é um carregador farmacêuticamente aceitável, de preferência compreendendo um tampão e/ou substâncias adjuvantes.

[078] Preferencialmente, o imunogênio da invenção é fornecido em uma formulação de vacina, de preferência para uso parenteral.

[079] Especificamente, o imunogênio da invenção é fornecido para utilização médica, especificamente para utilização no tratamento de um indivíduo pela administração de uma quantidade eficaz do referido imunogênio para proteger o indivíduo de uma infecção por E. coli MDR, ou para evitar uma condição de enfermidade que resulte na referida infecção.

[080] Especificamente, o imunogênio da invenção é fornecido para induzir uma resposta imune protetora.

[081] De acordo com um aspecto específico, é fornecido ainda um método de tratamento onde um indivíduo em risco de uma infecção por E. coli MDR é tratado, cujo método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do imunogênio para evitar infecção em um indivíduo, em particular, para proteger contra E. coli MDR patogênica.

[082] De acordo com um outro aspecto adicional, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo da invenção ou que codifica um epítopo da invenção.

FIGURAS

[083] Figura 1: Coloração da superfície de diferentes cepas ST131:O25b que expressam os antígenos O25b, O25a ou O2 por mAbs específicos para O25b (com ou sem reatividade cruzada em relação ao antígeno O25a).

[084] Figura 2: Reatividade de diferentes mAbs e soro de coelho O25 para moléculas de LPS O25a e O25b purificadas em um ensaio de imunotransferência.

[085] Figura 3: (a): Estrutura da unidade de repetição do antígeno O25b de E. coli. (b): Estrutura da unidade de repetição do O25a de E. coli (também referido como O25, algumas vezes referido como O25(a)) para comparação (Kenne et al, 1985).

[086] Figura 4: Detecção do antígeno O25b que expressa cepas de E. coli com ensaio de aglutinação usando mAb 8D5-1G10 acoplado às esferas de látex.

[087] Figura 5: Detecção do antígeno O25b solúvel com ensaio de aglutinação usando mAb 8D5-1G10 acoplado às esferas de látex.

[088] Figura 6: Proteção fornecida pela imunização passiva de camundongos com mAbs de murino específicos para O25b contra uma posterior infecção intravenosa letal por um isolado clínico ST131:O25b.

[089] Figura 7: Morte bacteriana dependente do complemento mediada por mAbs específicos para O25b.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[090] O termo “anticorpo” conforme aqui utilizado refere-se aos polipeptídeos ou às proteínas que consistem de ou compreendem domínios de anticorpos, que são entendidos como domínios constantes e/ou variáveis das cadeias pesadas de imunoglobulinas, com ou sem uma sequência ligante. Polipeptídeos são entendidos como domínios de anticorpos se compreenderem uma estrutura barril-beta consistindo de pelo menos duas fitas betas de uma estrutura de domínio de anticorpo ligadas por uma sequência loop. Os domínios de anticorpos podem ser de estrutura nativa ou modificada por mutagênese ou derivatização, por exemplo, para modificar as propriedades de ligação do antígeno ou qualquer outra propriedade, tal como a estabilidade ou as propriedades funcionais, tal como a ligação aos receptores Fc, FcRn, e/ou receptores Fcgama.

[091] O anticorpo, conforme utilizado aqui, tem um sítio de ligação específico para ligar um ou mais antígenos, ou um ou mais epítopos de tais antígenos, especificamente compreendendo um sítio de ligação da CDR de um único domínio variável de anticorpo, tais como VH, VL ou VHH, ou um sítio de ligação de pares de domínios variáveis de anticorpos, tal como um par VL/VH, um anticorpo compreendendo um par de domínios VL/VH e domínios constantes de anticorpos, tais como Fab, F(ab’), (Fab)2, scFv, Fv, ou um anticorpo de comprimento integral.

[092] O termo “anticorpo”, conforme aqui utilizado, se refere particularmente aos formatos de anticorpos que compreendem ou consistem de domínios variáveis de anticorpos únicos, tais como VH, VL ou VHH, ou combinações de domínios de anticorpos variáveis e/ou constantes com ou sem uma sequência de ligação ou região do hinge, incluindo pares de domínios variáveis de anticorpos, tais como um par VL/VH, um anticorpo compreendendo ou consistindo de um par de domínios VL/VH e domínios constantes de anticorpos, tais como anticorpos de cadeia pesada, Fab, F(ab’), (Fab)2, scFv, Fd, Fv, ou um anticorpo de comprimento integral, por exemplo, de um anticorpo do tipo lgG (por exemplo, um subtipo lgG1, IgG2, IgG3 ou lgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE, lgM. O termo "anticorpo de comprimento integral” pode ser utilizado para referir-se a qualquer molécula de anticorpo que compreenda pelo menos a maior parte do domínio Fc e outros domínios geralmente encontrados em um monômero de anticorpo de ocorrência natural. Essa frase é utilizada aqui para enfatizar que uma molécula de um anticorpo em particular não é um fragmento de anticorpo.

[093] O termo “anticorpo” inclui especificamente anticorpos na forma isolada, por exemplo, que estão significativamente livres de outros anticorpos dirigidos contra diferentes antígenos alvos ou compreendendo um arranjo estrutural diferente de domínios de anticorpo. Ainda, um anticorpo isolado pode estar compreendido em uma preparação de combinação, contendo uma combinação de anticorpo isolado, por exemplo, com pelo menos outro anticorpo, tais como os anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo, apresentando diferentes especificidades.

[094] O termo “anticorpo” aplica-se aos anticorpos de origem animal, incluindo a espécie humana, tais como os mamíferos, incluindo o humano, murino, coelho, cabra, lhama, vaca e cavalo, ou de origem aviária, como a galinha.

[095] O termo “anticorpo” se aplica ainda aos anticorpos quiméricos com sequências de origem de espécies diferentes, tais como as sequências de origem humana e de murino.

[096] O termo “quimérico”, utilizado em relação a um anticorpo, refere-se aos anticorpos nos quais uma parte de cada uma das sequências de aminoácidos de cadeias pesadas e leves é homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertençam a uma classe em particular, enquanto que o segmento remanescente da cadeia é homólogo às sequências correspondentes em outra espécie ou classe. Geralmente, a região variável tanto das cadeias pesadas quanto das leves imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero, enquanto que as partes constantes são homólogas às sequências de anticorpos derivadas de outra espécie. Por exemplo, a região variável pode ser derivada de fontes atualmente conhecidas utilizando-se células B ou hibridomas prontamente disponíveis de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações celulares humanas.

[097] O termo “anticorpo” se aplica ainda aos anticorpos humanizados.

[098] Conforme aqui utilizado em relação a um anticorpo, o termo “humanizado” refere-se a uma molécula que apresenta um sítio de ligação do antígeno que é significativamente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, em que a estrutura remanescente da imunoglobulina da molécula está baseada na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. O sítio de ligação do antígeno pode ou compreender domínios variáveis completos fundidos nos domínios constantes ou apenas regiões determinantes de complementaridade (CDR) implantadas em regiões estruturais adequadas nos domínios variáveis. Os sítios de ligação ao antígeno podem ser do tipo selvagem ou serem modificados, por exemplo, por uma ou mais substituições de aminoácidos, de preferência modificados para se assemelharem ao máximo às imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências da CDR (por exemplo, um anticorpo humanizado de rato que contenha todas as seis CDRs do anticorpo do rato). Outras formas possuem uma ou mais CDRs que são alteradas em relação ao anticorpo original.

[099] O termo “anticorpo” se aplica ainda aos anticorpos humanos.

[100] O termo “humano", conforme utilizado em relação a um anticorpo, é entendido incluir anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. O anticorpo humano da invenção pode incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica para um sítio, in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs. Os anticorpos humanos incluem os anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulina humana.

[101] O termo se aplica especificamente aos anticorpos de qualquer classe ou subclasse. Dependendo da sequência de aminoácidos, do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser enquadrados nas principais classes de anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e muitos deles podem ainda ser divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2.

[102] O termo se aplica ainda aos anticorpos monoclonais e policlonais, especificamente um anticorpo recombinante, cujo termo inclui todos os anticorpos e estruturas de anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como os anticorpos de origem animal, por exemplo, mamíferos, incluindo o humano, que compreenda genes ou sequências de origem diferente, por exemplo, anticorpos quiméricos ou humanizados, ou anticorpos derivados de hibridoma. Outros exemplos referentes aos anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, ou anticorpos isolados a partir de uma biblioteca recombinante, combinatória, de anticorpos ou domínios de anticorpos, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing das sequências genéticas do anticorpo em relação a outras sequências de DNA.

[103] Fica entendido que o termo “anticorpo” também se refere aos derivados de um anticorpo, em particular, derivados funcionalmente ativos. Um derivado de anticorpo é entendido como qualquer combinação de um ou mais domínios de anticorpo ou anticorpos e/ou uma proteína de fusão, no qual qualquer domínio do anticorpo pode ser fundido em qualquer posição de uma ou mais outras proteínas, tais como outros anticorpos, por exemplo, uma estrutura de ligação compreendendo loops da CDR, um polipeptídeo receptor, mas também ligantes, proteínas scaffold, enzimas, toxinas e assim por diante. Um derivado do anticorpo pode ser obtido pela associação ou ligação com outras substâncias por diversas técnicas químicas, tal como o acoplamento covalente, interação eletrostática, ligação de dissulfeto, etc. Outras substâncias ligadas ao anticorpo podem ser os lipídeos, carboidratos, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e inorgânicas ou qualquer combinação delas (por exemplo, PEG, pró-fármacos ou fármacos). Em uma incorporação específica, o anticorpo é um derivado que compreende um tag adicional que permite uma interação específica com o composto biologicamente aceitável. Na presente invenção, não existe uma limitação específica em relação ao tag utilizável, na medida em que não tem nenhum impacto negativo, ou tem um impacto tolerável, sobre a ligação do anticorpo ao seu alvo. São exemplos de tags desejáveis o His- tag, Myc-tag, FLAG-tag, Strep-tag, Calmodulin-tag, GST-tag, MBP-tag e S-tag. Em outra incorporação específica, o anticorpo é um derivado compreendendo um rótulo. O termo “rótulo”, conforme aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição detectável que está direta ou indiretamente conjugado ao anticorpo de modo a gerar um anticorpo “rotulado”. O rótulo pode ser detectável por si mesmo, por exemplo, rótulos radioisótopos ou fluorescentes, ou em caso de um rótulo enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que seja detectável.

[104] Os derivados preferidos, conforme aqui descrito, são funcionalmente ativos em relação à ligação do antígeno, preferencialmente com potência para combater o E. coli MDR e sua endotoxina, por exemplo, como determinado em um ensaio de SBA, OPK ou LAL, ou para proteger contra infecção bacteriana ou neutralizar endotoxemia letal.

[105] Anticorpos derivados de um anticorpo parental ou uma sequência de anticorpos aqui são particularmente entendidos como mutantes ou variantes obtidos por, por exemplo, in silico ou engenharia recombinante ou senão por derivatização ou síntese química.

[106] Especificamente, um anticorpo derivado de um anticorpo da invenção pode compreender pelo menos uma ou mais regiões da CDR, ou as variantes da CDR, sendo funcionalmente ativo na ligação diferencial ao antígeno O25b, por exemplo, ligando-se específica ou seletivamente ao antígeno O25b.

[107] Fica entendido que o termo “anticorpo” também se refere às variantes de um anticorpo.

[108] O termo “variante” refere-se particularmente aos anticorpos, tais como os anticorpos mutantes ou os fragmentos de anticorpos, por exemplo, obtidos por métodos de mutagênese, em particular para excluir, trocar, introduzir uma inserção em uma sequência de aminoácidos de um anticorpo específico, ou região, ou derivatizar quimicamente uma sequência de aminoácidos, por exemplo, nos domínios constantes, para manipular a estabilidade do anticorpo, a função efetora ou a meia-vida, ou em domínios variáveis para melhorar as propriedades de ligação ao antígeno, por exemplo, por técnicas de maturação da afinidade. Pode ser empregado qualquer um dos métodos de mutagênese, incluindo mutações de ponto em posições desejadas, por exemplo, técnicas de randomização. Em alguns casos as posições são, por exemplo, escolhidas aleatoriamente ou com qualquer um dos possíveis aminoácidos ou com uma seleção dos aminoácidos preferidos para randomizar as sequências de anticorpos. O termo “mutagênese” refere-se a qualquer técnica reconhecida na arte para alterar uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos. Os tipos preferidos de mutagênese incluem a mutagênese por PCR propenso a erros, mutagênese por saturação ou outra mutagênese sítio dirigida.

[109] O termo “variante” engloba especificamente variantes funcionalmente ativas.

[110] Como utilizado aqui, o termo “variante funcionalmente ativa” de um anticorpo significa uma sequência que resulta da modificação dessa sequência (um anticorpo parental ou uma sequência parental), por exemplo, por inserção, exclusão ou substituição de um ou mais aminoácidos, tais como por técnicas de recombinação ou derivatização química de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos, ou nucleotídeos na sequência de nucleotídeos, ou em uma ou ambas as extremidades da sequência, e cuja modificação não afete (em especial não prejudique) a atividade dessa sequência. No caso de um sítio de ligação que apresente especificidade para um antígeno alvo selecionado, a variante funcionalmente ativa de um anticorpo deve ainda apresentar especificidade de ligação pré-determinada, embora possa ser alterada, por exemplo, para alterar a especificidade fina para um epítopo específico, a afinidade, a avidez, taxa Kon ou Koff, etc. Especificamente, as variantes funcionalmente ativas de um anticorpo da invenção possuem a potência para ligar-se ao antígeno O25b e a especificidade ou a seletividade para, de preferência, ligar-se ao antígeno O25b em relação aos outros antígenos do E. coli, por exemplo, ligando-se ao antígeno O25b do E. coli e não ao O25a, ou não se ligando significativamente ao antígeno O25a, ou ligando-se especificamente de forma cruzada a ambos, O25b e O25a, mas não se ligando aos outros antígenos do E. coli.

[111] As variantes funcionalmente ativas podem ser obtidas, por exemplo, alterando-se a sequência de um anticorpo parental, por exemplo, um anticorpo que compreenda o mesmo sítio de ligação do anticorpo denominado 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10, ou 8D10-C8, mas com modificações dentro da região do anticorpo, além do sítio de ligação, ou derivadas de um anticorpo parental, qualquer um dos anticorpos 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10, ou 8D10-C8, por uma modificação dentro do sítio de ligação, sem prejudicar a ligação ao antígeno, e preferencialmente deverá ter uma atividade biológica semelhante ao anticorpo parental, incluindo a capacidade para ligar-se ao antígeno O25b de forma específica ou seletiva, por exemplo, ligando-se ao antígeno O25b do E. coli e não se ligando ao antígeno O25a do E. coli, ou não se ligando significativamente ao antígeno O25a, ou ligando-se especificamente de forma cruzada a ambos, O25b e O25a, mas não se ligando aos outros antígenos do E. coli. Opcionalmente, as variantes funcionalmente ativas podem ainda incluir potência de morte mediada pelo complemento em um ensaio de SBA, e/ou, opcionalmente, incluir ainda potência de fagocitose mediada por anticorpo em um ensaio de OPK, e/ou, opcionalmente, incluir ainda uma função de neutralização de endotoxinas em um ensaio de LAL, por exemplo, com significativamente a mesma atividade biológica, conforme determinado pelo ensaio de ligação específica ou teste funcional para atingir o E. coli MDR.

[112] Por exemplo, as variantes funcionalmente ativas dos anticorpos 6D1-1B2 e 8A1-1G8 possuem, consideravelmente, as mesmas e semelhantes afinidades de ligação do anticorpo 8D5-1G10 (veja tabela abaixo).

[113] O termo “significativamente a mesma atividade biológica”, conforme utilizado aqui, refere-se à atividade conforme indicado, por ser significativamente a mesma atividade pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou ainda pelo menos 100%, ou pelo menos 110%, ou pelo menos 120%, ou pelo menos 130%, ou pelo menos 140%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 160%, ou pelo menos 170%, ou pelo menos 180%, ou pelo menos 190%, por exemplo, até 200% da atividade, conforme determinada para o anticorpo parental.

[114] As variantes ou derivados preferidos, conforme aqui descritos, são funcionalmente ativos em relação à ligação ao antígeno, de preferência com potência para especificamente ligar-se ao antígeno O25b, e não se ligar aos outros antígenos do E. coli, por exemplo, ligando-se ao antígeno O25b do E. coli e não se ligando ao antígeno O25a, ou ligando-se especificamente de forma cruzada a ambos, O25b e O25a, por exemplo, ligando-se preferencialmente ao antígeno O25b em relação ao antígeno O25a, ou ligando-se ao O25b com afinidade maior em comparação ao soro de tipagem policlonal produzido contra cepas de O25 (O25a). As variantes preferidas não se ligam aos outros antígenos do E. coli, com uma diferença de valor de Kd de pelo menos 2 logs, de preferência pelo menos 3 logs e, opcionalmente, incluindo ainda a potência de morte mediada pelo complemento em um ensaio de SBA, por exemplo para atingir uma redução significativa nas contagens bacterianas em relação às amostras de controle que não contenham o anticorpo, e/ou opcionalmente incluindo ainda a potência de uma fagocitose mediada por anticorpo em um ensaio de OPK, tal como para atingir uma redução significativa nas contagens bacterianas em relação às amostras de controle que não contenham o anticorpo, e/ou opcionalmente incluindo ainda a função de neutralização das endotoxina em um ensaio de sinalização LAL ou TLR4, tal como para atingir uma redução significativa nos LPS livres em relação às amostras de controle que não contenham o anticorpo, por exemplo, com significativamente a mesma atividade biológica, conforme determinada pelo ensaio de ligação específica ou teste funcional para atingir o E. coli MDR. A significativa redução dos analitos em vários ensaios geralmente significa a redução de pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98%, até a completa redução de aproximadamente 100% (+/- 1%).

[115] Em uma incorporação preferida a variante funcionalmente ativa de um anticorpo parental a) é um fragmento biologicamente ativo do anticorpo, o fragmento compreendendo pelo menos 50% da sequência da molécula, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% e mais preferencialmente pelo menos 97%, 98% ou 99%. b) é derivada do anticorpo com pelo menos uma substituição, adição e/ou exclusão de aminoácido, onde a variante funcionalmente ativa tem uma identidade de sequência em relação à molécula ou à parte dela, tal como um anticorpo de identidade de sequência pelo menos de 50%, de preferência pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, e mais preferencialmente pelo menos 97%, 98% ou 99%; e/ou c) consiste do anticorpo ou uma variante funcionalmente ativa dele e, adicionalmente, pelo menos um aminoácido ou nucleotídeo heterólogo ao polipeptídeo ou sequência de nucleotídeos.

[116] Em uma incorporação preferida da invenção, a variante funcionalmente ativa do anticorpo em conformidade com a invenção é essencialmente idêntica à variante descrita acima, mas difere em seus polipeptídeos ou em sua sequência de nucleotídeos, respectivamente, no fato de que é derivada de uma sequência homóloga de uma espécie diferente. Estes são referidos como variantes ou análogos de ocorrência natural.

[117] O termo “variante funcionalmente ativa” também inclui as variantes alélicas de ocorrência natural, assim como os mutantes ou quaisquer outras variantes de ocorrência natural. Conforme conhecido na arte, uma variante alélica é uma forma alternada de um (poli) peptídeo que é caracterizado por possuir uma substituição, exclusão ou adição de um ou mais aminoácidos que essencialmente não altera a função biológica do polipeptídeo.

[118] As variantes funcionalmente ativas podem ser obtidas por alterações na sequência no polipeptídeo ou na sequência de nucleotídeos, por exemplo, uma ou mais mutações de ponto, onde as alterações na sequência retêm uma função do polipeptídeo ou da sequência de nucleotídeos inalterados, quando utilizado em combinação com a invenção. Essas alterações na sequência podem incluir, mas não estão limitadas a substituições (conservadoras), adições, exclusões, mutações e inserções.

[119] Variantes funcionalmente ativas específicas são variantes da CDR. Uma variante da CDR inclui uma sequência de aminoácidos modificada por pelo menos um aminoácido na região da CDR, onde tal modificação pode ser uma alteração química ou parcial da sequência de aminoácidos, cuja modificação permita que a variante retenha as características biológicas da sequência não modificada. Uma alteração parcial da sequência de aminoácidos da CDR pode ser por exclusão ou substituição de um ou muitos aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, ou por adição ou inserção de um ou muitos aminoácidos, por exemplo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, ou por adição ou inserção de um ou muitos aminoácidos, por exemplo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, ou combinação dessas. As substituições nos resíduos de aminoácidos podem ser substituições conservadoras, por exemplo, substituindo um aminoácido hidrofóbico por um aminoácido alternativo hidrofóbico.

[120] As substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias e propriedades químicas. Os exemplos de tais famílias são os aminoácidos com cadeias laterais básicas, com cadeias laterais ácidas, com cadeias laterais alifáticas não polares, com cadeias laterais aromáticas não polares, com cadeias laterais polares não carregadas, com pequenas cadeias laterais, com grandes cadeias laterais, etc.

[121] Uma mutação de ponto é particularmente entendida como a manipulação de um polinucleotídeo que resulta na expressão de uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos não manipulada na substituição ou troca, exclusão ou inserção de um ou mais aminoácidos simples (não consecutivos) ou duplos para aminoácidos diferentes.

[122] As mutações de ponto preferidas referem-se à troca de aminoácidos de mesma polaridade e/ou carga. Nesse sentido, os aminoácidos referem-se aos vinte aminoácidos de ocorrência natural codificados por sessenta e quatro códons triplos. Esses 20 aminoácidos podem ser divididos naqueles que apresentam cargas neutras, positivas e negativas.

[123] Os aminoácidos “neutros” são mostrados abaixo, juntamente com seus códigos de três e uma letra, respectivamente, e polaridade: Alanina: (Ala, A) não polar, neutra; Aspargina: (Asn, N) polar, neutra; Cisteína: (Cys, C) não polar, neutra; Glutamina: (Gln, Q) polar, neutra; Glicina: (Gly, G) não polar, neutra; Isoleucina: (Ile, l) não polar, neutra; Leucina: (Leu, L) não polar, neutra; Metionina: (Met, M) não polar, neutra; Fenilalanina: (Phe, F) não polar, neutra; Prolina: (Pro, P) não polar, neutra; Serina: (ser, S) polar, neutra; Treonina: (Thr, T) polar, neutra; Triptofano: (Trp, W) não polar, neutra; Tirosina: (Tyr, Y) polar, neutra; Valina: (Val, V) não polar, neutra; e Histidina: (His, H) polar, positiva (10%) neutra (90%).

[124] Os aminoácidos “positivamente” carregados são: Arginina: (Arg, R) polar, positiva; e Lisina: (Lys, K) polar, positiva.

[125] Os aminoácidos “negativamente” carregados são: Ácido aspártico: (Asp, D) polar, negativa; e Ácido glutâmico: (Glu, E) polar, negativa.

[126] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos”, em relação às sequências de anticorpos e homólogos aqui descritos, é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que seja idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica específica, após o alinhamento da sequência e introdução de gaps, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e sem considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. Os especialistas na arte podem determinar parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir um alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências a serem comparadas.

[127] Uma variante de anticorpo é especificamente entendida por incluir homólogos, análogos, fragmentos, modificações ou variantes com um padrão de glicosilação específico, por exemplo, produzidos por glicomanipulação, que sejam funcionais e possam atuar como equivalentes funcionais, por exemplo, ligando-se aos alvos específicos e com propriedades funcionais.

[128] Um anticorpo da presente invenção pode ou não exibir uma função efetora Fc. Preferencialmente, o anticorpo exibe a função efetora Fc e é funcionalmente ativa em um ensaio de SBA e/ou OPK. Anticorpos específicos podem estar desprovidos de uma metade Fc ativa, desse modo compostos por domínios de anticorpos que não contenham uma parte Fc de um anticorpo, ou que não contenham um sítio de ligação do receptor Fcgama, ou compreendendo domínios de anticorpos com falta da função efetora Fc, por exemplo, por modificações para reduzir as funções efetoras Fc. Anticorpos alternativos podem ser manipulados para incorporar modificações para aumentar as funções efetoras fc, em particular para melhorar a atividade OPK e/ou SBA.

[129] Essas modificações podem ser efetuadas por mutagênese, por exemplo, mutações no sítio de ligação do receptor Fcgama ou por derivados ou agentes para interferir na atividade ADCC e/ou CDC de um formato de anticorpo, para dessa forma atingir uma redução ou aumento da função efetora Fc.

[130] Uma redução significativa da função efetora FC geralmente é entendida por referir-se a uma função efetora Fc menor do que 10% do formato não modificado (tipo selvagem), de preferência menor do que 5%, conforme medido por atividade de ADCC e/ou CDC. Um aumento significativo da função efetora FC geralmente é entendido por referir-se a um aumento na função efetora Fc de pelo menos 10% do formato não modificado (tipo selvagem), de preferência 20%, 30%, 40% ou 50%, conforme medido por atividade de ADCC e/ou CDC.

[131] O termo variantes “glicomanipuladas”, em relação às sequências de anticorpos, refere-se às variantes de glicosilação que tenham propriedades imunogênicas modificadas, ADCC e/ou CDC, como resultado da glicomanipulação. Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidratos em posições conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, com cada isótopo possuindo uma matriz distinta de estruturas de carboidratos N-ligados, cuja variabilidade afeta o conjunto de proteínas, a secreção ou a atividade funcional. Os anticorpos do tipo lgG1 são glicoproteínas que possuem um sítio de glicosilação N-ligada conservado em Asn297 em cada domínio de CH2. Os dois oligossacarídeos biantenários complexos fixados ao Asn297 estão enterrados entre os domínios de CH2, formando contatos extensivos com o esqueleto do polipeptídeo e suas presenças são essenciais para o anticorpo mediar as funções efetoras, tais como a morte bacteriana mediada pelo complemento dependente do anticorpo ou a absorção pelas células fagocíticas. A remoção do N-Glicano em N297, por exemplo, através da mutação de N297, por exemplo para A, ou T299, geralmente resulta em formatos de anticorpo aglicosilado com reduzida função efetora.

[132] As principais diferenças na glicosilação do anticorpo ocorrem entre as linhagens celulares e pequenas diferenças são vistas para uma dada linhagem celular crescida em diferentes condições de cultura. A expressão em células bacterianas geralmente fornece um anticorpo aglicosilado. Foi relatado que células de CHO com expressão regulada por tetraciclina de β(1,4)-N- acetilglicosaminiltransferase III (Gn TIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GlcNAc bissector, apresentam melhor atividade funcional (ADCC) (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180). Além da escolha das células hospedeiras, os fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, a formulação do meio, a densidade da cultura, a oxigenação, o pH, os esquemas de purificação e assim por diante.

[133] Os termos “sítio de ligação ao antígeno” ou “sítio de ligação" referem-se à parte de um anticorpo que participa na ligação ao antígeno. O sítio de ligação ao antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis N-terminais (“V”) das cadeias pesadas (“H”) e/ou leves (“L”), ou os domínios variáveis deles. Três estiramentos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesadas e leves, referidos como "regiões hipervariáveis", encontram-se interpostos entre estiramentos flanqueadores mais conservados, conhecidos como regiões estruturais. O sítio de ligação ao antígeno fornece uma superfície que é complementar à superfície tridimensional de um epítopo ou antígeno ligado, e as regiões hipervariáveis são referidas como "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". O sítio de ligação incorporado na CDR aqui também é chamado de "sítio de ligação da CDR".

[134] O termo “antígeno” conforme aqui utilizado, alternadamente com os termos “alvo” ou “antígeno alvo”, refere-se a uma molécula alvo completa, ou a um fragmento de tal molécula, reconhecida por um sítio de ligação ao antígeno. Especificamente, as subestruturas de um antígeno, por exemplo, uma estrutura de polipeptídeo ou carboidrato, geralmente referida como “epítopos”, por exemplo, epítopos de célula B ou epítopo de célula T, que são imunologicamente importantes, podem ser reconhecidas como tal sítio de ligação. Antígenos específicos, como os antígenos O25b ou O25a, são fornecidos como antígenos isolados, ou então na forma de células de E. coli ou frações celulares.

[135] O termo “epítopo”, conforme aqui utilizado, refere-se, em particular, a uma estrutura molecular que pode ser um parceiro de ligação específica ou ser parte de um parceiro de ligação específica em relação ao sítio de ligação de um anticorpo. Um epítopo pode ter ocorrência natural ou artificial e ser composto por um carboidrato, uma estrutura peptídica, um ácido graxo, uma substância orgânica, bioquímica ou inorgânica ou seus derivados e quaisquer combinações entre esses. Se um epítopo estiver compreendido em uma estrutura peptídica, tal como um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, geralmente ele compreenderá pelo menos 3 aminoácidos, de preferência de 5 a 40 aminoácidos e mais preferencialmente entre 10-20 aminoácidos. Os epítopos podem ser epítopos lineares ou conformacionais. Um epítopo linear é compreendido por um segmento único de uma sequência primária de um polipeptídeo ou cadeia de carboidrato. Os epítopo lineares podem ser contíguos ou sobrepostos. Os epítopos conformacionais são compostos por aminoácidos ou carboidratos reunidos pelo dobramento do polipeptídeo para formar uma estrutura terciária e os aminoácidos não são necessariamente adjacentes um aos outros na sequência linear. Especificamente, e em relação aos antígenos do polipeptídeo, um epítopo conformacional ou descontínuo é caracterizado pela presença de dois ou mais resíduos de aminoácidos discretos, separados na sequência primária, mas montando uma estrutura consistente na superfície da molécula quando o polipeptídeo se dobra na(o) proteína/antígeno nativo.

[136] Aqui o termo “epítopo” refere-se particularmente ao epítopo simples reconhecido por um anticorpo ou a uma mistura de epítopos compreendendo variantes do epítopo, cada uma delas reconhecida por um anticorpo que reconhece especificamente o alvo, por exemplo, o epítopo especificamente reconhecido por um anticorpo selecionado de um grupo consistindo de anticorpos denominados 6D1- 1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 e 8D10-C8. Especificamente, o epítopo visado por um anticorpo selecionado de um grupo consistindo de 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 e 8D10-C8 é um epítopo carboidrato.

[137] O termo “expressão” é entendido da seguinte maneira. Moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência de codificação desejada de um produto de expressão, tal como, por exemplo, um anticorpo conforme aqui descrito, e sequências de controle, tais como, por exemplo, um promotor em ligação operável, podem ser utilizadas para fins de expressão. Hospedeiros transformados ou transfectados com essas sequências são capazes de produzir as proteínas codificadas. A fim de efetuar a transformação, o sistema de expressão pode ser incluído em um vetor, no entanto, o DNA relevante também pode ser integrado ao cromossomo do hospedeiro. Especificamente, o termo refere-se a uma célula hospedeira e a um vetor compatível em condições adequadas, por exemplo, para a expressão de uma proteína codificada pelo DNA estranho carregado pelo vetor e introduzido na célula hospedeira.

[138] DNA codificante é uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos em particular para um polipeptídeo ou proteína em particular, tal como, por exemplo, um anticorpo. DNA promotor é uma sequência de DNA que inicia, regula, medeia ou controla a expressão do DNA codificante. DNA promotor e DNA codificante podem ser provenientes do mesmo gene ou de genes diferentes e podem ser provenientes do mesmo organismo ou de organismos diferentes. Os vetores de clonagem recombinante geralmente incluirão um ou mais sistemas de replicação para clonagem ou expressão, um ou mais marcadores para seleção no hospedeiro, por exemplo, resistência ao antibiótico, e um ou mais cassetes de expressão.

[139] “Vetores”, conforme utilizado aqui, são definidos como sequências de DNA necessárias para a transcrição de sequências clonadas de nucleotídeos recombinantes, ou seja, de genes recombinantes e para a tradução de seus mRNAs em um organismo hospedeiro adequado.

[140] Um “cassete de expressão” refere-se a um DNA que codifica uma sequência ou segmento de DNA que codifica para um produto de expressão que pode ser inserido em um vetor nos sítios de restrição definidos. Os sítios de restrição do cassete são projetados para garantir a inserção do cassete na estrutura de leitura indicada. Geralmente, o DNA estranho é inserido em um ou mais sítios de restrição do DNA vetor e, a seguir, é transportado pelo vetor para dentro de uma célula hospedeira juntamente com o DNA vetor transmissível. Um segmento ou sequência de DNA que possua um DNA inserido ou adicionado, tal como um vetor de expressão, também pode ser chamado de "construção de DNA".

[141] Os vetores de expressão compreendem o cassete de expressão e, adicionalmente, geralmente compreendem uma origem para a replicação autônoma nas células hospedeiras ou um sítio de integração do genoma, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de síntese de aminoácido ou um gene que confira resistência a antibióticos, como a zeocina, canamicina, G418 ou higromicina), alguns sítios de clivagem de enzima de restrição, uma sequência promotora adequada e um terminador de transcrição, cujos componentes estão operacionalmente ligados em conjunto. O termo “vetor”, conforme aqui utilizado, inclui sequências de nucleotídeos que se replicam autonomamente, assim como sequências de nucleotídeos que se integram ao genoma. Um tipo comum de vetor é um “plasmídeo”, que geralmente é uma molécula autocontida de DNA de fita dupla e que pode prontamente aceitar um DNA adicional (estranho) e que pode ser prontamente introduzido em uma célula hospedeira adequada. Um vetor plasmídeo geralmente contém DNA codificante e DNA promotor e tem um ou mais sítios de restrição adequados para a inserção do DNA estranho. Especificamente, os termos “vetor” ou “plasmídeo” referem-se a um veículo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene estranho), pode ser introduzida em uma célula hospedeira de modo a transformar o hospedeiro e promover a expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida.

[142] O termo “célula hospedeira”, conforme aqui utilizado, refere-se às células de indivíduos primários que são transformadas para produzir uma proteína recombinante em particular, tal como um anticorpo conforme descrito aqui, e qualquer progênie dela. Deve-se entender que nem todas as progênies são exatamente idênticas em relação à célula parental (devido às mutações deliberadas ou inadvertidas ou às diferenças no ambiente), no entanto, essas progênies alteradas estão incluídas nessas condições, desde que a progênie retenha a mesma funcionalidade da célula originalmente transformada. O termo “linhagem da célula hospedeira” refere-se a uma linhagem celular de células hospedeiras quando utilizada para expressar um gene recombinante para produzir polipeptídeos recombinantes, tais como os anticorpos recombinantes. O termo “linhagem celular”, conforme aqui utilizado, refere-se a um clone estabelecido de um tipo celular em particular que adquiriu a capacidade de proliferar-se durante um período de tempo prolongado. Essa célula hospedeira ou linhagem celular hospedeira pode ser mantida em cultura celular e/ou cultivada para produzir um polipeptídeo recombinante.

[143] Uma “resposta imune” em relação a uma composição, por exemplo, uma composição imunogênica, aqui também denominada “imunogenia”, compreende um antígeno ou epítopo, ou uma vacina, conforme aqui descrito, é o desenvolvimento no hospedeiro ou indivíduo de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo em relação à composição ou vacina de interesse. Geralmente, essa resposta consiste do indivíduo produzindo anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas direcionadas especificamente para um antígeno ou antígenos incluído(s) na composição ou vacina de interesse.

[144] Uma “resposta imune protetora” é entendida como resposta imune terapêutica e refere-se a uma resposta imune em relação a um antígeno derivado de um patógeno, que de alguma forma previne, melhora, trata ou pelo menos detém parcialmente os sintomas, os efeitos colaterais ou a progressão da doença. Especificamente, o desencadeamento da resposta imune protetora proporciona um resultado significativamente melhor de uma infecção induzida ou natural, ou de uma infecção por toxina, em comparação a uma população não imune.

[145] Uma composição imunogênia ou imunogênica geralmente compreende o antígeno ou epítopo e um carregador que pode, especificamente, compreender um adjuvante. O termo “adjuvante” refere-se a um composto que, ao ser administrado em conjunto com um antígeno, aumenta e/ou redireciona a resposta imune ao antígeno, mas ao ser administrada sozinha não gera uma resposta imune ao antígeno. Os adjuvantes podem aumentar uma resposta imune por diversos mecanismos, incluindo o recrutamento de linfócitos, estímulo das células B e/ou T e estímulo dos macrófagos. São exemplos de carregadores os lipossomas ou peptídeos catiônicos, são exemplos de adjuvantes o fosfato de alumínio ou o hidróxido de alumínio, o MF59 ou o oligonucleotídeo CpG.

[146] Os termos “isolado” ou “isolamento”, conforme aqui utilizado em relação a um ácido nucléico, um anticorpo ou qualquer composto, referem-se a tal composto que tenha sido suficientemente separado do ambiente ao qual estaria naturalmente associado, de forma a existir na forma “significativamente pura”. “Isolado” não necessariamente significa a exclusão de misturas artificiais ou sintéticas junto com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interfiram na atividade fundamental, e que podem, por exemplo, estar presentes devido a uma purificação incompleta. Em particular, as moléculas isoladas de ácido nucleico da presente invenção também incluem aquelas sintetizadas quimicamente.

[147] Em relação aos ácidos nucleicos da invenção, algumas vezes é utilizado o termo “ácido nucleico isolado”. Esse termo, quando aplicado ao DNA, refere-se a uma molécula de DNA que esteja separada das sequências com as quais estaria imediatamente contígua no genoma de ocorrência natural do organismo no qual tenha sido originado. Por exemplo, um “ácido nucleico isolado” pode compreender uma molécula de DNA inserida em um vetor, tal como um plasmídeo ou vetor de vírus, ou integrado no DNA genômico de uma célula procariótica ou eucariótica ou organismo hospedeiro. Quando aplicado ao RNA, o termo “ácido nucleico isolado” refere-se essencialmente a uma molécula de RNA codificada por uma molécula de DNA isolada conforme definida acima. Alternativamente, o termo pode referir-se a uma molécula de RNA que tenha sido suficientemente separada de outros ácidos nucleicos com os quais estaria associado em seu estado natural (ou seja, nas células ou nos tecidos). Um “ácido nucleico isolado” (ou DNA ou RNA) pode ainda representar uma molécula produzida diretamente por meios biológicos ou sintéticos e separada de outros componentes presentes durante a sua produção.

[148] Com relação aos polipeptídeos ou proteínas, tais como os anticorpos ou epítopos da invenção, o termo “isolado” refere-se especificamente aos compostos que estão livres ou consideravelmente livres de materiais aos quais estariam naturalmente associados, tais como os outros compostos com os quais se encontram em seu ambiente natural, ou o ambiente no qual tenham sido preparados (por exemplo, cultura celular) quando tal preparação seja por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Compostos isolados podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda serem isolados para efeitos práticos. Os polipeptídeos ou polinucleotídeos podem ser misturados com carregadores ou excipientes farmacêuticamente aceitáveis quando utilizados em diagnóstico ou terapia. Em particular, o anticorpo isolado da invenção difere das preparações de soro policlonal produzidas contra cepas de O25(a) porque ele é fornecido em uma forma isolada e purificada, de preferência é fornecido em uma preparação que compreenda o anticorpo isolado como única substância ativa. No entanto, isso não impede que o anticorpo isolado seja fornecido em um produto de combinação que compreenda um número limitado de outros anticorpos (isolados) bem definidos. Os anticorpos isolados podem também ser fornecidos como carregadores sólidos, semilíquidos ou líquidos, tais como esferas.

[149] Os termos “neutralizante” ou “neutralização” são aqui utilizados no sentido mais amplo e referem-se a qualquer molécula que iniba um patógeno, tal como o E. coli MDR, de infectar um indivíduo ou que iniba o patógeno de promover infecções pela produção de potentes toxinas proteicas ou que iniba as toxinas de danificar uma célula alvo em um indivíduo, independentemente do mecanismo pelo qual a neutralização é conseguida. Por exemplo, a neutralização pode ser conseguida por um anticorpo que iniba a ligação e/ou a interação da endotoxina do E. coli MDR com seu receptor cognato nas células alvos (por exemplo, ligando-se ao receptor TLR4). A neutralização pode ocorrer ainda pela remoção das moléculas de endotoxinas da circulação pelas funções mediadas por Fc.

[150] A potência da neutralização geralmente é determinada em um ensaio padrão, por exemplo, teste de LAL, onde a inibição da atividade biológica da endotoxina é medida, por exemplo, por colorimetria.

[151] O termo “E. coli MDR” é entendido da seguinte maneira. Infecções com E. coli multidroga resistente que se encontram em uma parte significativa são devidas à linhagem clonal ST131-O25b:H4 que surgiu apenas na última década e tornou-se um clone globalmente resistente e dominante. E. coli multirresistente é particularmente entendido como aquelas cepas que demonstram resistência para três ou mais classes de antibióticos, por exemplo, os agentes/grupos: penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos, aminoglicosídeos, tetraciclinas, fuoroquinolonas, nitrofurantoína, trimetoprim (e suas combinações), fosfomicina, polimixinas, cloranfenicol, aztreonam, tigeciclina.

[152] O polissacarídeo capsular ácido (CPS) é uma camada de polissacarídeo espessa, tipo muco, que circunda a maioria dos patógenos E. coli. Portanto, é surpreendente que o epítopo específico reconhecido por um anticorpo da invenção seja especificamente acessível a ambas as cepas de E. coli MDR, as encapsuladas e as não encapsuladas.

[153] Os anticorpos que combatem ou neutralizam o E. coli MDR são agentes que interferem nos patógenos e nas reações patogênicas, portanto, capazes de limitar ou prevenir a infecção e/ou melhorar uma condição de enfermidade resultante da infecção, ou inibem a patogênese do E. coli MDR, em particular a disseminação e replicação no ou dentro dos compartimentos/sítios corporais estéreis do hospedeiro. Nesse sentido, “anticorpos protetores” são entendidos aqui como anticorpos que são responsáveis pela imunidade em relação a um agente infeccioso observado na imunidade ativa ou passiva. Em particular, os anticorpos protetores conforme aqui descritos possivelmente são utilizados para fins terapêuticos, por exemplo, para profilaxia ou terapia, para prevenir, melhorar, tratar ou pelo menos deter parcialmente os sintomas da doença, os efeitos colaterais ou progressão de doença induzida por um patógeno. Especificamente, os anticorpos protetores são capazes de matar ou impedir a replicação das células vivas de E. coli, por exemplo, induzindo as atividades bactericidas ou de opsonofagocitose do soro, ou removendo por completo as células bacterianas ou as moléculas LPS dos sítios corporais estéreis após as aplicações terapêuticas (ou seja, dada uma infecção estabelecida). Alternativamente, anticorpos protetores profilaticamente aplicados inibem o estabelecimento de uma infecção (ou seja, a disseminação de E. coli de sítios não estéreis para compartimentos corporais estéreis) por um dos mecanismos citados acima ou por outros.

[154] O termo “antígeno O25b” é aqui entendido como o antígeno O do LPS com estrutura elucidada no exemplo 2 e na Figura 3 (a). A estrutura é semelhante, mas distinta daquela do antígeno O25(a). O O25b é aqui entendido como um sorotipo que é semelhante, mas distinto do O25a (ver Figura 3 (a)).

[155] O termo “antígeno O25” é aqui entendido como o antígeno feito de a unidade de repetição do pentassacarídeo descrito por Kenne et al. (Kenne L, Lindberg B, Madden JK, Lindberg AA, Gemski P Jr. Structural studies of the Escherichia coli O-antigen 25. Carbohydr Res. 28;122(2):249-56, 1983). Antes de identificar o antígeno O25b, o termo O25 permaneceu como O25a, conforme descrito aqui (ver Figura 3 (b)).

[156] O termo “antígeno O25a” é aqui entendido como um sinônimo para antígeno O25.

[157] O termo “recombinante”, conforme aqui utilizado, significa “ser preparado por ou o resultado de manipulação genética”. Um hospedeiro recombinante compreende especificamente um vetor de expressão ou vetor de clonagem ou foi geneticamente manipulado para conter uma sequência de ácido nucleico recombinante, em particular empregando-se uma sequência de nucleotídeos estranha ao hospedeiro. Uma proteína recombinante é produzida por expressão de um respectivo ácido nucleico recombinante em um hospedeiro. O termo “anticorpo recombinante”, conforme aqui utilizado, inclui anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um rato) que seja transgênico ou transcromossômico para genes da imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir deles, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios e recombinantes, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam splicing das sequências genéticas da imunoglobulina humana em relação a outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes compreendem os anticorpos manipulados para incluir rearranjos e mutações que ocorrem, por exemplo, durante a maturação do anticorpo.

[158] Conforme aqui utilizado, os termos "especificidade” ou “ligação específica” referem-se a uma reação de ligação que é determinante do ligante cognato de interesse em uma população heterogênea de moléculas. Assim, em condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio), um anticorpo se liga especificamente ao seu alvo em particular e não se liga em uma quantidade significativa a outras moléculas presentes em uma amostra. A ligação específica significa que a ligação é seletiva em termos de identidade, afinidade ou avidez de ligação alta, média ou baixa, para o alvo, conforme selecionada. A ligação seletiva geralmente é alcançada se a constante de ligação ou a dinâmica da ligação for pelo menos 10 vezes diferente (entendido como pelo menos uma diferença de 1 log), de preferência a diferença é de pelo menos 100 vezes (entendido como pelo menos uma diferença de 2 logs) e mais preferido pelo menos 1000 vezes (entendido como pelo menos uma diferença de 3 logs). Os termos “especificidade” ou “ligação específica” também são entendidos para aplicação aos ligantes que se ligam a uma ou mais moléculas, por exemplo, ligantes do tipo específicos-cruzada.

[159] O anticorpo da invenção é especificamente seletivo para ligar-se apenas ao antígeno O25b, ou preferencialmente ligar-se ao antígeno O25b em relação ao antígeno O25a, ou ligar-se ao O25b com maior afinidade quando comparado ao soro policlonal produzido contra cepas de O25a, cujo soro se liga ao antígeno O25b com baixa afinidade. Assim, o anticorpo da invenção pode ser entendido por se ligar diferencialmente a esses antígenos, por exemplo, pelo menos com afinidade igual, ou mais do que afinidade igual, tal como com uma afinidade diferente com uma diferença de Kd de pelo menos 1 log, de preferência de pelo menos 2 logs, mais preferencialmente pelo menos 3 logs. Tal anticorpo que se liga seletivamente ao antígeno O25b em relação ao antígeno O25a é de preferência utilizado para fins de diagnóstico ou terapêutico. Para alguns fins de diagnóstico é especificamente utilizado um anticorpo que se liga apenas ao antígeno O25b de uma maneira detectável.

[160] O uso dos termos “apresentando a mesma especificidade”, “apresentando o mesmo sítio de ligação" ou “ligando-se ao mesmo epítopo” indica que anticorpos monoclonais equivalentes exibem as mesmas ou essencialmente as mesmas características, ou seja, características de imunorreação (ligação) semelhantes, e competem para ligarem-se a uma sequência de ligação alvo pré-selecionada. A especificidade relativa de uma molécula de anticorpo para um alvo em particular pode ser relativamente determinada por ensaios de competição, por exemplo, como descrito em Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988).

[161] O termo "indivíduo”, conforme utilizado aqui, refere-se a um mamífero de sangue quente, particularmente um ser humano. Em particular, o uso médico da invenção, ou do respectivo método de tratamento, se aplica a um indivíduo que necessite de profilaxia ou de tratamento de uma condição de enfermidade associada à infecção por E. coli MDR ou que esteja sofrendo da enfermidade, incluindo a fase inicial ou a fase tardia da doença. O termo “paciente” inclui indivíduos humanos e outros mamíferos que recebem ou o tratamento profilático ou o terapêutico. O termo “tratamento” é então entendido como incluir tanto o tratamento profilático quanto o terapêutico.

[162] Por exemplo, um indivíduo é tratado para profilaxia ou terapia para condições de enfermidade por E. coli MDR. Em particular, é tratado o indivíduo ou que se encontra em risco de infecção, ou que esteja desenvolvendo tal doença ou em recorrência da doença, ou um indivíduo que esteja sofrendo de tal infecção e/ou doença associada a tal infecção.

[163] Especificamente, o termo “profilaxia” refere-se a medidas preventivas que se destinam a cobrir a prevenção do início da patogênese ou medidas profiláticas para reduzir o risco da patogênese.

[164] Especificamente, conforme aqui descrito, o método para tratar, prevenir ou retardar uma condição de enfermidade em um indivíduo é pela interferência na patogênese do E. coli MDR como agente causador da condição.

[165] Os termos “significativamente puro” ou “purificado”, conforme utilizado aqui, referem-se a uma preparação que compreenda pelo menos 50% (p/p), de preferência pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de um composto, tal como uma molécula de ácido nucleico ou um anticorpo. A pureza é medida por métodos adequados para o composto (por exemplo, métodos cromatográficos, eletroforese em gel de poliacrilamida, análise por HPLC, e assemelhados).

[166] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, aqui utilizado alternadamente com qualquer um dos termos “quantidade eficaz” ou “quantidade suficiente” de um composto, por exemplo, um anticorpo ou imunogênio da presente invenção, é uma quantidade ou atividade suficiente para, ao ser administrada ao indivíduo, produzir efeitos benéficos ou resultados desejados, incluindo resultados clínicos e, como tal, uma quantidade eficaz, ou o sinônimo dela, depende do contexto ao qual está sendo aplicada.

[167] Uma quantidade eficaz destina-se a significar a quantidade de um composto que é suficiente para tratar, prevenir ou inibir essas doenças ou distúrbios. No contexto da doença, quantidades terapeuticamente eficazes do anticorpo, conforme aqui descrito, são especificamente utilizadas para tratar, modular, atenuar, reverter ou afetar uma doença ou uma condição que, por exemplo, beneficie uma inibição da patogênese do E. coli MDR, a adesão e colonização das superfícies mucosas, a replicação não controlada dentro de sítios corporais estéreis e a toxicidade de células hospedeiras por produtos bacterianos.

[168] A quantidade do composto que corresponderá a essa quantidade eficaz irá variar dependendo de vários fatores, tais como o medicamento ou composto administrado, a formulação farmacêutica, a via de administração, o tipo da doença ou distúrbio, a identidade do indivíduo ou hospedeiro a ser tratado, e assim por diante, mas, todavia, pode ser rotineiramente determinada por um versado na arte.

[169] O anticorpo ou o imunogênio da presente invenção pode ser profilaticamente utilizado para inibir o início da infecção por E. coli MDR ou para tratar terapeuticamente a infecção por E. coli MDR, particularmente infecções por E. coli MDR que são conhecidas por serem refratárias ou, no caso de um indivíduo específico, provaram ser refratárias ao tratamento com outras terapias por antibióticos convencionais.

[170] Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo conforme aqui descrito, tal como fornecida a um paciente humano em necessidade, pode especificamente estar na faixa de 0,5-500 mg, de preferência 1-400 mg, ainda mais preferencialmente até 300 mg, até 200 mg, até 100 mg ou até 10 mg, embora doses mais altas possam ser indicadas, por exemplo, para tratar condições agudas da doença.

[171] Além disso, um regime de tratamento ou prevenção de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da presente invenção pode consistir de uma única administração, ou alternativamente compreender uma série de aplicações. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado pelo menos uma vez ao ano, pelo menos uma vez a cada seis meses ou pelo menos uma vez ao mês. No entanto, em outra incorporação, o anticorpo pode ser administrado ao indivíduo a partir de cerca de uma vez por semana até cerca de uma administração diária para um dado tratamento. A extensão do período de tratamento depende de uma variedade de fatores, tais como a gravidade da doença, ou se doença é aguda ou crônica, a idade do paciente, a concentração e a atividade do formato do anticorpo. Também é apropriado que a dosagem eficaz utilizada para o tratamento ou para a profilaxia possa aumentar ou diminuir ao longo de um regime de tratamento ou profilaxia em particular. As alterações na dosagem podem resultar e tornarem-se aparentes por ensaios padrão de diagnóstico conhecidos na arte. Em algumas circunstâncias, pode ser necessária a administração crônica.

[172] Uma quantidade eficaz de uma imunogênio, conforme descrito aqui, tal como fornecido a um paciente em risco de desenvolver uma condição de enfermidade associada à infecção por E. coli MDR, pode especificamente estar na faixa de 1-15 mg/kg por dosagem.

[173] Por exemplo, o imunogênio pode ser administrado como uma primeira dosagem seguido por uma ou mais dosagem(ns) de reforço, dentro de certo intervalo de tempo, de acordo com um esquema de imunização prime-boost para induzir uma resposta imune eficaz de longa duração à infecção por E. coli MDR. Um esquema de vacina preferido deve cobrir a administração de três doses, por exemplo, uma primeira dose no dia 0, uma segunda dose no dia 5-40 e uma terceira dose no dia 10-100, de preferência nos dias 0, 28 e 90. De acordo com um esquema acelerado preferido, a administração pode ser nos dias 0, 7 e 14. Os esquemas acelerados podem ser indicados para profilaxia, por exemplo, para pacientes que enfrentarão uma cirurgia eletiva. Geralmente o alumínio é utilizado como adjuvante, por exemplo, como fosfato ou hidróxido.

[174] Portanto, o assunto objeto do presente estudo está baseado na descoberta de mAbs de murino altamente específico para O25b. Esses anticorpos têm um ótimo potencial como reagentes de diagnóstico para a identificação de cepas MDR que pertençam à linhagem ST131. Além disso, em particular após a humanização, esse mAbs são adequados para serem utilizados para profilaxia (por exemplo para grupos de alto risco) e para tratamento de infecções por E. coli causadas por cepas ST131-O25b:H4.

[175] Os antígenos de carboidrato O25b e O25 (O25a) foram planejados para serem idênticos ou muito semelhantes com base no fato do soro imune contra O25 ser rotineiramente utilizado na identificação diagnóstica de cepas de E. coli que expressam os antígenos O25b. O histórico genético da síntese do antígeno O em cepas ST131 não está totalmente elucidada, no entanto, um gene específico dentro do agrupamento rfb (que codifica a síntese do antígeno O) forma a base da identificação por PCR de cepas O25b. Além disso, nenhum dado estrutural apoiou qualquer diferença entre os antígenos O25(a) e O25b até o momento.

[176] Desse modo, foi uma surpresa o fato de um anticorpo da invenção poder ligar-se especificamente ao antígeno O25b e especificamente diferenciar entre os antígenos O25b e O25a.

[177] Para confirmar a diferença genética entre os antígenos O25b e O25a que expressam as cepas de E. coli, o agrupamento rfb que codifica a síntese do antígeno O foi sequenciado a partir de uma cepa 81009 disponível comercialmente (Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6) usando um método primer walking começando com oligonucleotídeos específicos para conservar os genes flanqueadores: gnd e galF. O contig resultante do operon rfb é 11.300 bp de comprimento e apenas parcialmente homólogo em relação à codificação das enzimas de síntese do antígeno O25 (número de acesso NCBI GU014554). Foi descoberto um segmento de 2043 bp de comprimento na extremidade 3' do operon rfb do O25b não homólogo à região correspondente do operon rfb do O25, onde esse segmento foi substituído por uma sequência de 6267 bp de comprimento que codifica a síntese e o transporte da fucose.

[178] A estrutura da unidade de repetição biológica O-específica PS (RU), presente no LPS isolado do E. coli ST131, foi analisada em detalhes em uma fração purificada construída pela substituição do OS do núcleo por uma unidade de repetição (RU). A RU do LPS ST131 é um pentassacarídeo O-acetilado com a estrutura ilustrada na Fig. 3.

[179] De fato, a estrutura da RU do ST131O-PS difere da RU do LPS O25 relatado por Kenne et al. (Kenne, Lindberg et al., Carbohydr Res. 1983 Oct 28; 122(2):249-56) e no melhor de nosso conhecimento é um novo sorotipo-O entre os lipopolissacarídeos do E. coli (Stenutz et al. FEMS Microbiol Rev. 2006 May; 30(3):382-403. Review). Adicionalmente, os resultados preliminares da espectrometria de massa MALDI-TOF e as análises de composição (análises de açúcares e metilação) de um oligossacarídeo do núcleo isolado do LPS ST131 apoio o tipo K-12, que foi anteriormente relatado por Szijártó V. et al. com base em análises genéticas (Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6). Foi mostrado que o LPS ST131 é composto por duas principais glicoformas dos oligossacarídeos do núcleo (OS). O tipo da glicoforma é dependente da presença ou da ausência do polissacarídeo O-específico (PS). A glicoforma prevalecente do OS do núcleo não substituído é a versão truncada do oligossacarídeo do núcleo K-12, que é desprovido do dissacarídeo ^7)-α-Hepp-(1^6)-α-Glcp. A presença desse dissacarídeo é a diferença entre o OS do núcleo O-PS substituído e o OS do núcleo não substituído.

[180] De acordo com um aspecto específico, é fornecido um anticorpo que se liga seletivamente ao epítopo específico do O25b, por exemplo, ligando-se ao mesmo epítopo do anticorpo 8D5-1G10, ou qualquer um dos anticorpos denominados como 6D1-1B2 ou 8A1-1G8 ou 8D10-C8, cujo termo inclui as variantes que se ligam essencialmente ao mesmo epítopo, ou que compreendem o mesmo sítio de ligação do anticorpo 8D5-1G10, ou qualquer um dos anticorpos denominados 6D1-1B2 ou 8A1-1G8 ou 8D10-C8, cujo termo inclui variantes que compreendem essencialmente o mesmo sítio de ligação. Os anticorpos denominados como 6D1-1B2, 8A1-1G8 e 8D5-1G10 particularmente compreendem um sítio de ligação que especificamente diferencia entre o antígeno O25b e o antígeno O25a e que se liga somente ao antígeno O25b. O anticorpo denominado como 8D10-C8 particularmente compreende um sítio de ligação especificamente cruzado que se liga aos antígenos O25b e O25a e, preferencialmente, se liga ao antígeno O25b em comparação ao antígeno O25a.

[181] Os anticorpos são referidos como “se ligam ao mesmo epítopo” ou “compreendem o mesmo sítio de ligação” ou possuem “essencialmente as mesmas características de ligação”, se os anticorpos competem de forma cruzada de modo que apenas um anticorpo possa se ligar ao epítopo em um dado ponto de tempo, ou seja, um anticorpo impede a ligação ou o efeito de modulação do outro.

[182] Os termos “compete” ou “compete de forma cruzada”, conforme aqui utilizados em relação a um anticorpo, significam que um primeiro anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno, se liga a um epítopo de uma forma suficientemente semelhante à ligação de um segundo anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno, tal que o resultado da ligação do primeiro anticorpo, com seu epítopo cognato, seja detectado como reduzido na presença do segundo anticorpo comparado à ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. Pode acontecer a alternativa onde a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo também seja detectado como reduzido na presença do primeiro anticorpo, mas pode não ser o caso. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epítopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu respectivo epítopo. No entanto, quando cada anticorpo inibe de forma detectável a ligação do outro anticorpo ao seu epítopo cognato, com extensão igual, maior ou menor, os anticorpos são referidos como "competem de forma cruzada" uns com os outros para ligarem-se aos seus respectivos epítopos. Tanto os anticorpos competidores quanto os competidores de forma cruzada estão cobertos pela presente invenção.

[183] Aqui, competição significa uma maior inibição relativa de cerca de 30% conforme determinado pela análise ELISA para competição, por exemplo, como descrito na seção dos Exemplos. Pode ser desejável definir um limite maior de inibição relativa como critério para qual o nível adequado de competição em um contexto particular, por exemplo, quando a análise de competição for utilizada para selecionar ou triar novos anticorpos projetados com a função pretendida da ligação do O25b. Assim, por exemplo, é possível definir critérios para a ligação competitiva, onde pelo menos 40% da inibição relativa seja detectada, ou pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou ainda pelo menos 100%, antes de o anticorpo ser considerado suficientemente competitivo.

[184] Especificamente, é fornecido um anticorpo que compreende a região variável de qualquer um dos anticorpos denominados como 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 ou 8D10-C8, em particular pelo menos uma das sequências da CDR, de preferência pelo menos duas, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos seis das sequências da CDR de um anticorpo selecionado de um grupo consistindo dos anticorpos 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 e 8D10-C8, ou variantes da sua CDR que sejam funcionalmente ativas. Mais especificamente, é fornecido qualquer um dos anticorpos denominados como 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 ou 8D10-C8.

[185] Especificamente, o anticorpo denominado como anticorpo 8D5-1G10 ou anticorpo 8D10-C8, ou qualquer variante funcionalmente ativa deles, podem ser produzidos empregando-se material depositado ou a respectiva sequência de nucleotídeos contida em seu interior, tal como um dos plasmídeos e/ou uma das células hospedeiras depositadas.

[186] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo 8D5-1G10, ou uma variante funcionalmente equivalente dele, pode ser derivado de um anticorpo compreendendo uma região variável codificada por qualquer um dos plasmídeos incorporados nas células hospedeiras depositadas sob DSM 26763 e/ou DSM 26762, por exemplo, empregando-se uma sequência da CDR parcial ou mutada (pontual) do material depositado para manipular o anticorpo específico ou qualquer variante funcionalmente ativa dele.

[187] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo 8D5-1G10, ou uma variante funcionalmente equivalente dele, pode ser derivado de ou empregando-se a região variável de um anticorpo produzido por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26763 e/ou DSM 26762, por exemplo, empregando-se uma sequência parcial, por exemplo, uma ou mais das sequências da CDR, do material depositado para manipular o anticorpo específico ou qualquer variante funcionalmente ativa dele.

[188] Especificamente, a variante do anticorpo 6D1-1B2 ou 8A1-1G8 é uma variante da CDR do anticorpo 8D5-1G10 que é funcionalmente ativo, por exemplo, com alterações parciais em pelo menos uma das sequências da CDR.

[189] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo 8D10-C8, ou uma variante funcionalmente equivalente dele, pode ser derivado de um anticorpo compreendendo uma região variável codificada por qualquer um dos plasmídeos incorporados nas células hospedeiras depositadas sob DSM 28171 e/ou DSM 28172, por exemplo, empregando-se uma sequência da CDR parcial ou mutada (pontual) do material depositado para manipular o anticorpo específico ou qualquer variante funcionalmente ativa dele.

[190] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo 8D10-C8, ou uma variante funcionalmente equivalente dele, pode ser derivado de ou empregando-se a região variável de um anticorpo produzido por uma célula hospedeira depositada sob DSM 28171 e/ou DSM 28172, por exemplo, empregando-se uma sequência parcial, por exemplo, uma ou mais das sequências da CDR, do material depositado para manipular o anticorpo específico ou qualquer variante funcionalmente ativa dele.

[191] Em certos aspectos, a invenção fornece tais anticorpos variantes, de preferência anticorpos monoclonais, mais preferencialmente anticorpos de murino, humanizados ou humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde qualquer uma das cadeias pesadas ou região variável VH ou as respectivas CDRs compreendem uma sequência de aminoácidos, tal como derivados do respectivo plasmídeo depositado e/ou da respectiva célula hospedeira depositada.

[192] Em certos aspectos, a invenção fornece tais anticorpos variantes, de preferência anticorpos monoclonais, mais preferencialmente anticorpos de murino, humanizados ou humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde qualquer uma das cadeias leves ou região variável VL ou as respectivas CDRs compreendem uma sequência de aminoácidos, tal como derivados do respectivo plasmídeo depositado e/ou da respectiva célula hospedeira depositada.

[193] Em certos aspectos, a invenção fornece tais anticorpos variantes, de preferência anticorpos monoclonais, mais preferencialmente anticorpos de murino, humanizados ou humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde qualquer uma das cadeias pesadas e leves ou regiões variáveis VH/VL ou as respectivas CDRs compreendem uma sequência de aminoácidos, tal como derivados dos respectivos plasmídeos depositados e/ou das respectivas células hospedeiras depositadas.

[194] Em certos aspectos, a invenção também fornece tais anticorpos variantes, compreendendo as respectivas sequências de ligação, tal como as sequências variáveis e/ou as sequências da CDR, tal como derivados do material depositado, onde as sequências de ligação, por exemplo, qualquer sequência da CDR, compreendem uma sequência que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade em relação à sequência de aminoácidos, tal como derivados do material depositado e onde a variante é uma variante funcionalmente ativa.

[195] Conforme aqui descrito em um aspecto da invenção, são fornecidas moléculas de anticorpo caracterizadas, por exemplo, pela capacidade de competir com o anticorpo monoclonal 8D5-1G10 ou 8D10-C8 para ligarem-se ao antígeno O25b. Qualquer um dos anticorpos 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 é um anticorpo lgG3 de murino e o anticorpo 8D10-C8 é um anticorpo lgG2b de murino que carrega cadeias leves kappa, que os inventores isolaram e caracterizaram. Os domínios variáveis do anticorpo 8D5-1G10 ou do anticorpo 8D10-C8 são expressos pelo material depositado como aqui referenciado. Assim, as características de ligação, conforme determinadas pela cadeia leve e pela cadeia pesada, e os domínios Vl/VH do anticorpo 8D5-1G10 ou do anticorpo 8D10-C8, são aqui totalmente divulgados, permitindo seus usos como um anticorpo parental ou a comparação com as variantes funcionalmente ativas ou com os anticorpos competidores da invenção.

[196] O domínio variável maduro da cadeia pesada do 8D5-1G10 (8D5-1G10- HC) é, por exemplo, produzido empregando-se a célula hospedeira de DSM 26762, ou a respectiva informação de sequência do plasmídeo codificante nele incorporado.

[197] O domínio variável maduro da cadeia leve do 8D5-1G10 (8D5-1G10-LC) é, por exemplo, produzido empregando-se a célula hospedeira de DSM 26763, ou a respectiva informação de sequência do plasmídeo codificante nele incorporado.

[198] O domínio variável maduro da cadeia pesada do 8D10-C8 (8D10-C8-HC) é, por exemplo, produzido empregando-se a célula hospedeira de DSM 28172, ou a respectiva informação de sequência do plasmídeo codificante nele incorporado.

[199] O domínio variável maduro da cadeia leve do 8D10-C8 (8D10-C8-LC) é, por exemplo, produzido empregando-se a célula hospedeira de DSM 28171, ou a respectiva informação de sequência do plasmídeo codificante nele incorporado.

[200] O diferencial da afinidade de ligação para preferencialmente ligar-se ao antígeno O25b em relação aos outros antígenos do E. coli, por exemplo, quaisquer antígenos de carboidrato exceto o antígeno O25 ou quaisquer antígenos do núcleo, é preferencialmente pelo menos 10 vezes maior, ou seja, com uma diferença de Kd de pelo menos 10, de preferência pelo menos 100 vezes maior, mais preferido pelo menos 1000 vezes maior.

[201] O diferencial de afinidade de ligação para preferencialmente ligar-se ao antígeno O25b é especificamente pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 6 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes maior, em comparação ao soro de tipagem comercial, tal como o antissoro de alto título de E. coli O25 do Statens Serum Institut (#81369).

[202] O diferencial de afinidade de ligação para preferencialmente ligar-se ao antígeno O25b em relação ao antígeno O25a é especificamente pelo menos igual ou mais do que igual, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes, ou pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 6 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes maior.

[203] Os anticorpos preferidos da invenção se ligam a qualquer um dos antígenos individuais citados, em particular ao antígeno O25b, com alta afinidade, em particular com taxa alta e/ou baixa, ou uma alta avidez por ligação. A afinidade de ligação de um anticorpo geralmente é caracterizada em termos de concentração do anticorpo, na qual a metade dos sítios de ligação do antígeno esteja ocupada, conhecido como a constante de dissociação (Kd ou KD). Geralmente, um ligante é considerado um ligante de alta afinidade com um Kd<10-7 M, em alguns casos, por exemplo, para fins terapêuticos, com afinidades mais elevadas, por exemplo, com um Kd<10-8 M, de preferência um Kd<10-9 M, ainda mais preferido é um Kd<10-10 M.

[204] Ainda, em uma incorporação particularmente preferida, as afinidades de ligação do antígeno individual são afinidades médias, por exemplo, com um Kd menor do que 10-6 e até 10-7 M, por exemplo, ao ligar-se pelo menos a dois antígenos.

[205] De acordo com a invenção, podem ser fornecidos ligantes de afinidade média, de preferência em conjunto com um processo de maturação da afinidade, se necessário.

[206] A maturação da afinidade é o processo pelo qual são produzidos anticorpos com afinidades aumentadas para um antígeno alvo. Com as alterações estruturais de um anticorpo, incluindo a mutagênese de aminoácidos ou como uma consequência da mutação somática nos segmentos genéticos da imunoglobulina, são produzidas e selecionadas variantes de um sítio de ligação, em relação a um antígeno, com afinidades mais elevadas. Os anticorpos com afinidades maturadas podem exibir uma afinidade maior em vários logfold do que um anticorpo parental. Anticorpos parentais simples também podem sofrer maturação da afinidade. Alternativamente, um conjunto de anticorpos com semelhantes afinidades de ligação ao antígeno alvo pode ser considerado com estruturas parentais, que são diversificadas para se obter anticorpos simples com afinidade maturada ou conjuntos de tais anticorpos com afinidade maturada.

[207] De acordo com a invenção, a variante preferida de um anticorpo com afinidade maturada exibe pelo menos um aumento de 10 vezes na afinidade de ligação, de preferência, pelo menos um aumento de 100 vezes. A maturação da afinidade pode ser empregada ao longo das campanhas de seleção empregando-se a respectivas bibliotecas de moléculas parentais, ou com anticorpos que possuam afinidade de ligação média para obter-se o anticorpo da invenção com a propriedade de ligação ao alvo específico de uma afinidade de ligação Kd<10-7 M. Alternativamente, a afinidade pode ainda ser mais aumentada por maturação da afinidade do anticorpo de acordo com a invenção para obter-se os altos valores que correspondam a um Kd menor do que 10-8 M ou menor do que 10-9 M, de preferência menor do que 10-10 M ou ainda menor do que 10-11 M, mais preferencialmente na faixa de picomolar.

[208] Um aspecto específico refere-se a um anticorpo da invenção caracterizado por uma atividade funcional antibacteriana específica, tal como morte bacteriana mediada pelo complemento e absorção e morte por opsonofagocitose.

[209] Células efetoras fagocíticas podem ser ativadas por meio de outra rota empregando-se ativação do complemento. Os anticorpos que se ligam à superfície dos antígenos nos micro-organismos atraem o primeiro componente da cascata do complemento com sua região Fc e iniciam a ativação do sistema complemento "clássico”. Isso resulta na estimulação das células efetoras fagocíticas que finalmente matam a bactéria alvo pelo mecanismo dependente de complemento e do anticorpo (CDC).

[210] De acordo com uma incorporação específica, o anticorpo da invenção apresenta atividade citotóxica na presença de células efetoras imunes conforme medido em um ensaio padrão de SBA ou OPK. O anticorpo da invenção pode apresentar uma atividade citotóxica, conforme determinado ou por ensaio de SBA ou por ensaio de OPK, se existir um aumento significativo na porcentagem de morte bacteriana quando comparado a um controle. A atividade bactericida relativa ao SBA ou ao OPK é preferencialmente medida como a porcentagem absoluta de aumento que, preferencialmente, é maior do que 5%, mais preferencialmente maior do que 10%, ainda mais preferido que seja maior que 20%, 30%, 40% ou 50%.

[211] Os anticorpos da presente invenção podem ser identificados ou obtidos empregando-se o método do hibridoma. Nesse método, um rato, ou outro animal hospedeiro adequado, tal como um hamster, é imunizado para induzir ou extrair os linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão especificamente ligar-se à proteína utilizada para a imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando-se um agente de fusão adequado, tal como o polietilenoglicol, para formar uma célula hibridoma.

[212] O meio de cultura no qual as células hibridomas estão crescendo é avaliado quanto à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células hibridomas é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA).

[213] Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma fonte de anticorpos (parentais), por exemplo, obtidos por imunização de camundongo com um mutante não encapsulado de um representante 81009 da cepa ST131-O25b:H4 (por exemplo, 81009Δkps:kan) substituindo-se o agrupamento kps (que codifica a síntese capsular) com um cassete que codifica a resistência à canamicina. As amostras de soro obtidas do camundongo podem então ser analisadas e o baço do rato mostrando o título mais elevado de lgG contra o antígeno O25b (em ELISA e Western Blot) pode ser utilizado para a geração de hibridomas. Após a subclonagem, podem ser selecionados os clones de hibridoma, com os anticorpos secretados especificamente para os antígenos O25b, assim como ligados à superfície das cepas vivas de E. coli do tipo selvagem que expressam os antígenos O25b. Esse mAbs podem então ser purificados a partir dos sobrenadantes do hibridoma para depois serem testados para sua ligação específica ao antígeno O25b e, possivelmente, para sua afinidade de ligação diferencial ligando-se, preferencialmente, ao antígeno O25b em relação ao antígeno O25a e para a manipulação dos anticorpos, por exemplo, para diferentes fins de diagnóstico ou terapêuticos.

[214] Anticorpos que se ligam de forma diferenciada, aqui também chamados de anticorpos seletivos, em alguns casos, surgem através da triagem dos antígenos simples. Para aumentar a probabilidade de isolamento de clones que se ligam de forma diferenciada é possível aplicar múltiplas pressões seletivas por triagem progressiva dos antígenos diferentes. As estratégias de seleção dos mAb especiais empregam os componentes O25b e O25a ou outros antígenos de E. coli em uma forma alternada.

[215] O(s) antígeno(s) recombinante(s) pode(m) ser utilizado(s) para selecionar anticorpos de uma biblioteca de anticorpos, por exemplo, uma biblioteca de anticorpos apresentada em levedura.

[216] Em outro evento, a ligação seletiva pode ser ainda mais melhorada por métodos de otimização do anticorpo já conhecidos na arte. Por exemplo, determinadas regiões das regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina aqui descritas podem estar sujeitas a uma ou mais estratégias de otimização, incluindo o embaralhamento da cadeia leve, mutagênese de destino, amagalmação da CDR e mutagênese dirigida da CDR selecionada e/ou regiões estruturais.

[217] Os métodos de triagem para a identificação de anticorpos com as propriedades desejadas de ligação seletiva podem ser realizados por tecnologias de exibição (usando fago, bactéria, levedura ou células de mamífero). A reatividade pode ser avaliada com base no ELISA, Western blotting ou coloração de superfície com citometria de fluxo, por exemplo, usando ensaios padronizados.

[218] Uma vez identificados os anticorpos que se ligam de forma diferenciada e que possuam as propriedades desejadas, pode ser determinado o epítopo dominante ou os epítopos reconhecidos pelos anticorpos. Os métodos para o mapeamento do epítopo são bastante conhecidos e divulgados na arte, por exemplo, em Epitope Mapping: A Practical Approach, Westwood and Hay, eds., Oxford University Press, 2001.

[219] O mapeamento do epítopo diz respeito à identificação do epítopo ao qual um anticorpo se liga. Existem muitos métodos conhecidos dos especialistas na arte para a determinação da localização dos epítopos nas proteínas, incluindo a análise de cristalografia do complexo anticorpo-antígeno, os ensaios de competição, os ensaios de expressão de fragmento de gene e os ensaios à base de peptídeos sintéticos. Um anticorpo que “se liga ao mesmo epítopo”, como um anticorpo de referência, aqui é entendido como segue. Quando dois anticorpos reconhecem os epítopos que são idênticos ou os epítopos que estão sobrepostos estericamente, os anticorpos são referidos como aqueles que se ligam aos mesmos ou essencialmente aos mesmos ou significativamente aos mesmos epítopos. Um método comumente utilizado para determinar se dois anticorpos se ligam a epítopos idênticos, ou que se estão sobrepostos estericamente, é o ensaio de competição, que pode ser configurado em diversos formatos usando ou o antígeno rotulado ou o anticorpo rotulado. Geralmente, um antígeno é imobilizado em uma placa de 96 poços e mede-se a capacidade dos anticorpos não rotulados em bloquear a ligação dos anticorpos rotulados, usando rótulos radiativos ou enzimáticos.

[220] Uma vez identificados os anticorpos com as propriedades de ligação diferenciada desejadas, esses anticorpos, incluindo os fragmentos de anticorpo, podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na arte, incluindo, por exemplo, técnicas de hibridoma ou tecnologia de DNA recombinante.

[221] Por exemplo, anticorpos monoclonais recombinantes podem ser produzidos isolando-se o DNA que codifica as cadeias de anticorpo necessárias e transfectando-se uma célula hospedeira recombinante com as sequências de codificação para a expressão, usando vetores de expressão recombinantes bastante conhecidos, por exemplo, os plasmídeos da invenção ou cassete(s) de expressão que compreenda(m) as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências do anticorpo. As células hospedeiras recombinantes podem ser procarióticas e eucarióticas, como aquelas descritas acima.

[222] De acordo com um aspecto específico, a sequência de nucleotídeos pode ser utilizada para manipulação genética para humanizar o anticorpo ou para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser manipulada para se assemelhar às regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for utilizado em testes clínicos e tratamentos em humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência do anticorpo para obter-se uma afinidade mais elevada em relação ao alvo O25b e uma maior eficácia contra o E. coli MDR. Ficará evidente para o especialista na arte que uma ou mais alterações de polinucleotídeos podem ser feitas ao anticorpo e ainda manter sua capacidade de ligação ao O25b alvo.

[223] A produção de moléculas de anticorpos, por diferentes meios, geralmente é bem compreendida. A Patente dos EUA 6331415 (Cabilly et al.), por exemplo, descreve um método para a produção recombinante de anticorpos onde as cadeias pesadas e leves são expressas simultaneamente a partir de um vetor simples ou a partir de dois vetores em separado em uma célula simples. Wibbenmeyer et al. (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191 -202) e Lee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101 :189-198) descrevem a produção de anticorpos monoclonais a partir de cadeias pesadas e leves produzidas separadamente usando os plasmídeos expressos em culturas separadas de E. coli. Muitas outras técnicas importantes para a produção de anticorpos são fornecidas, por exemplo, em Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).

[224] Se desejado, o anticorpo da invenção, por exemplo, o anticorpo 8D5- 1G10 ou o anticorpo 8D10-C8, ou o respectivo sítio de ligação ou CDR podem ser sequenciados e a sequência de polinucleotídeos ou uma variante de sequência ou mutante dela pode então ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo pode ser mantida no vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser ampliada e congelada para uso futuro. A produção de anticorpos monoclonais recombinantes em cultura celular pode ser realizada através da clonagem dos genes do anticorpo a partir das células B por meios conhecidos na arte.

[225] Em outro aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica a produção do anticorpo recombinante da presente invenção.

[226] Em outro aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica a produção do epítopo recombinante da presente invenção ou uma molécula que compreende tal epítopo da presente invenção. No entanto, o epítopo da invenção também pode ser produzido sinteticamente, por exemplo, através de quaisquer métodos de síntese bem conhecidos na arte.

[227] Um anticorpo ou epítopo que codifica o ácido nucleico pode ter qualquer característica desejável e compreender quaisquer características ou combinações destas. Assim, por exemplo, um anticorpo ou epítopo que codifica o ácido nucleico pode estar na forma de DNA, RNA, ou um híbrido desse, e pode incluir bases de ocorrência não natural, um esqueleto modificado, por exemplo, um esqueleto de fosfotioato que promove a estabilidade do ácido nucleico, ou ambos. O ácido nucleico vantajosamente pode ser incorporado em um cassete de expressão, vetor ou plasmídeo da invenção, compreendendo características que promovam a expressão, replicação e/ou seleção desejadas na(s) célula(s) hospedeira(s) alvo. Os exemplos de tais características incluem a origem do componente de replicação, o componente gene de seleção, o componente promotor, o componente elemento realçador, o componente sequência de poliadenilação, o componente de terminação, e assim por diante, numerosos exemplos adequados conhecidos.

[228] A presente divulgação fornece ainda as construções de DNA recombinante que compreendem uma ou mais das sequências de nucleotídeos descritas aqui. Essas construções recombinantes são utilizadas em conjunto com um vetor, tal como um plasmídeo, um fagemídeo, um fago ou um vetor viral, no qual é inserida uma molécula de DNA que codifica qualquer anticorpo divulgado.

[229] Os anticorpos monoclonais são produzidos utilizando-se qualquer método que produza moléculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura. Os exemplos de métodos adequados para preparar anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497) e o método de hibridoma de célula B humana (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987)).

[230] Além disso, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo ou um imunogênio conforme descrito aqui e um carregador ou excipiente farmacêuticamente aceitável. Essas composições farmacêuticas podem ser administradas em conformidade com a presente invenção como uma injeção em bolus ou infusão ou por infusão contínua. Carregadores farmacêuticos adequados para facilitar tais meios de administração são bem conhecidos na arte.

[231] Carregadores farmacêuticos aceitáveis geralmente incluem quaisquer e todos os solventes adequados, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção, e assim por diante, que sejam fisiologicamente compatíveis com um anticorpo ou com uma composição ou combinação relacionada fornecida pela invenção. Outros exemplos de carregadores farmacêuticamente aceitáveis incluem a água esterilizada, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e assim por diante, assim como as combinações deles.

[232] Em um aspecto, um anticorpo pode ser combinado com um ou mais carregadores adequados para uma rota de administração desejada, os anticorpos podem ser, por exemplo, misturados com lactose, sacarose, amido, celulose, ésteres de ácidos alcanóicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácido fosfórico e sulfúrico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidina, álcool polivinílico e, opcionalmente, na forma de comprimido ou encapsulado para uma administração convencional. Alternativamente, um anticorpo pode ser dissolvido em solução salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, soluções coloidais de carboximetilcelulose, etanol, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, goma adracante e/ou vários tampões. Outros carregadores, adjuvantes e modos de administração são bem conhecidos na arte farmacêutica. Um carregador pode incluir um material de liberação controlada ou material de retardamento de tempo, tal como o monoestearato de glicerina sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na arte.

[233] Adicionalmente, os carregadores farmacêuticamente aceitáveis são conhecidos na arte e descritos em, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. As formulações líquidas podem ser soluções, emulsões ou suspensões e podem incluir excipientes, tais como agentes de suspensão, solubilizantes, surfactantes, conservantes e agentes quelantes.

[234] As composições farmacêuticas são contempladas quando um anticorpo ou imunogênio da presente invenção e um ou mais agentes terapeuticamente ativos forem formulados. As formulações estáveis do anticorpo e do imunogênio da presente invenção são preparadas para armazenamento misturando-se a referida imunoglobulina que possua o grau de pureza desejado com carregadores, excipientes ou estabilizadores opcionais farmacêuticamente aceitáveis, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As formulações para serem utilizadas na administração in vivo são esterilizadas, de preferência, na forma de uma solução aquosa esterilizada. Isso pode ser facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis ou outros métodos. O anticorpo e outros agentes ativos terapeuticamente ativos aqui divulgados também podem ser formulados como imunolipossomas e/ou encapsulados em microcápsulas.

[235] A administração da composição farmacêutica compreende um anticorpo ou imunogênio da presente invenção, pode ser feita por diversas formas, incluindo oralmente, por via subcutânea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, através da mucosa, tópica, por exemplo, géis, pomadas, loções, cremes, etc., por via intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, por exemplo, empregando tecnologia inalável ou sistemas de entrega pulmonar, através da vagina, por meio parenteral, retal ou intraocular.

[236] As formulações exemplos utilizadas para administração parentérica incluem aquelas adequadas para injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa como, por exemplo, uma solução estéril, emulsão ou suspensão.

[237] Em uma incorporação, o anticorpo ou imunogênio da presente invenção é o único agente terapeuticamente ativo administrado ao indivíduo, por exemplo, como um modificador da doença ou monoterapia preventiva.

[238] Alternativamente, o anticorpo ou imunogênio da presente invenção é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos, incluindo, mas não limitado ao tratamento padrão, por exemplo, antibióticos, inibidores de inflamação esteroides ou não esteroides, e/ou outra terapia à base de anticorpo, por exemplo, empregando agentes antibacterianos ou anti-inflamatórios.

[239] A terapia de combinação particularmente emprega um regime padrão, por exemplo, conforme utilizado para tratar a infecção por E. coli MDR. Isso pode incluir os antibióticos, por exemplo, tigeciclina, linezolida, meticilina e/ou vancomicina.

[240] Em uma terapia de combinação, o anticorpo pode ser administrado como uma mistura, ou concomitantemente com um ou mais outros regimes terapêuticos, por exemplo, antes, simultaneamente ou após a terapia concomitante.

[241] A administração profilática dos imunogênios em alguns casos pode empregar uma vacina que compreenda o imunogênio da presente invenção, ou seja, uma vacina monovalente. Ainda, pode ser usada uma vacina multivalente compreendendo diferentes imunogênios para induzir uma resposta imune contra o mesmo ou contra diferentes patógenos alvos.

[242] As propriedades biológicas do anticorpo, o imunogênio ou as respectivas preparações farmacêuticas da invenção, podem ser caracterizadas em experimentos ex vivo na célula, no tecido e em todo o organismo. Como já conhecido na arte, os medicamentos geralmente são testados in vivo em animais, incluindo, mas não limitados aos camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e macacos, de modo a medir a eficácia do medicamento para o tratamento contra uma doença ou modelo de doença, ou para medir a farmacocinética, a farmacodinâmica, a toxicidade e outras propriedades do medicamento. Os animais podem ser referidos como os modelos de doenças. Geralmente a terapêutica é testada em camundongos, incluindo, mas não limitada ao camundongo nude, camundongo SCID, camundongo xenográfico e camundongo transgênico (incluindo os knockins e knockouts). Essa experimentação pode proporcionar dados significativos para a determinação do potencial do anticorpo a ser utilizado como um agente terapêutico ou como um agente profilático com meia- vida adequada, função efetora, atividade neutralizante (cruzada) e/ou resposta imune mediante uma imunoterapia ativa ou passiva. Para a experimentação, pode ser utilizado qualquer organismo, de preferência mamífero. Por exemplo, devido à sua semelhança genética com os humanos e primatas, os macacos podem ser modelos terapêuticos adequados e, desse modo, podem ser utilizados para testar e eficácia, a toxicidade, a farmacocinética, a farmacodinâmica, a meia-vida, ou outra propriedade do agente ou da composição em questão. Em última instância, os testes em humanos são necessários para a aprovação do medicamento e, assim, evidentemente, esses experimentos estão contemplados. Dessa forma, o anticorpo, o imunogênio e as respectivas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser testados em humanos para determinar sua eficácia terapêutica ou profilática, sua eficácia, imunogenicidade, farmacocinética e/ou outras propriedades clínicas.

[243] A invenção fornece ainda o anticorpo da invenção em questão para fins de diagnóstico, por exemplo, para a utilização em método de detecção e determinação quantitativa da concentração de uma carga bacteriana ou do anticorpo como imunorreagente ou alvo em uma amostra de fluido biológico.

[244] A invenção também fornece métodos para detectar o grau de sepse ou infecção por E. coli MDR em uma amostra biológica, por exemplo, a carga de uma amostra com E. coli MDR, tal como um fluido corporal, compreendendo a etapa de colocar a amostra em contato com um anticorpo da invenção. O anticorpo da invenção pode ser empregado em qualquer método de ensaio conhecido, tal como em ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche diretos e indiretos, ensaios de imunoprecipitação e ensaios imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA).

[245] O ensaio de diagnóstico preferido é realizado conforme segue. Anticorpos específicos para o antígeno alvo são imobilizados em esferas de látex que são incubadas com as bactérias presentes ou isoladas dos fluidos corporais. A reação positiva pode ser detectada a olho nu devido à agregação das esferas de látex coloridas na presença do respectivo antígeno cognato expresso na superfície da bactéria.

[246] Um fluido corporal, conforme utilizado de acordo com a presente invenção, inclui amostras biológicas de um indivíduo, tal como um extrato de tecido, urina, sangue, soro, fezes e catarro.

[247] Em uma incorporação, o método compreende colocar em contato um suporte sólido com um excesso de um determinado tipo de fragmento de anticorpo que forme especificamente um complexo com o alvo, em condições que permitam ao anticorpo se fixar à superfície do suporte sólido. O suporte sólido resultante, ao qual o anticorpo se encontra fixado, é então colocado em contato com uma amostra de fluido biológico de modo que o alvo no fluido biológico se ligue ao anticorpo e forme um complexo anticorpo-alvo. O complexo pode ser rotulado com um marcador detectável. Alternativamente, o alvo ou o anticorpo podem ser rotulados antes da formação do complexo. Por exemplo, um marcador detectável (rótulo) pode ser conjugado ao anticorpo. O complexo pode então ser detectado e quantitativamente determinado, dessa forma detectando-se e determinando-se quantitativamente a concentração do alvo na amostra de fluido biológico.

[248] Para aplicações em particular, o anticorpo da invenção é conjugado a um rótulo ou molécula repórter, selecionada a partir de um grupo consistindo de moléculas orgânicas, rótulos enzimáticos, rótulos radioativos, rótulos coloridos, rótulos fluorescentes, rótulos cromogênicos, rótulos luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos metálicos, metais, ouro coloidal e misturas desses. Anticorpos conjugados aos rótulos ou moléculas repórter podem ser utilizados, por exemplo, em sistemas de ensaio ou métodos de diagnóstico, por exemplo, para diagnosticar infecção por E. coli MDR ou condições de enfermidade a ela associadas.

[249] O anticorpo da invenção pode ser conjugado a outras moléculas que permitem a detecção simples de tal conjugado, por exemplo, em ensaios de ligação (por exemplo, ELISA) e estudos de ligação.

[250] Outro aspecto da presente invenção fornece um kit compreendendo um anticorpo que pode incluir, além de um ou mais anticorpos, vários agentes de diagnóstico ou terapêuticos. O kit também pode incluir instruções para uso em um método de diagnóstico ou terapêutico. Essas instruções, por exemplo, podem ser fornecidas em um dispositivo incluído no kit, por exemplo, ferramentas ou um dispositivo para preparar uma amostra biológica para fins de diagnóstico, tal como a separação de uma célula e/ou uma fração contendo uma proteína, antes de determinar a carga de E. coli MDR para diagnosticar uma doença. Vantajosamente, tal kit inclui um anticorpo e um agente ou reagente de diagnóstico que pode ser utilizado em um ou mais dos vários métodos de diagnóstico aqui descritos. Em outra incorporação preferida, o kit inclui um anticorpo, por exemplo, na forma liofilizada, opcionalmente inclui instruções e um meio para reconstituir o liofilizado, e/ou em combinação com carregador(es) farmacêuticamente aceitável(is) que possa(m) ser misturado(s) antes do uso para formar uma composição injetável para administração em curto prazo.

[251] Os anticorpos denominados 8D5-1G10 e 8D10-C8, especificamente qualquer uma das cadeias leves e/ou cadeias pesadas do anticorpo, são ainda caracterizados pelo material biológico depositado no DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b / Inhoffenstraβe 7B, 38124 Braunschweig (DE).

[252] Os depósitos referem-se às culturas de E. coli transformados, cada uma contendo um plasmídeo clonado com uma inserção de um gene de interesse. Os genes de interesse são os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal de rato 8D5-1G10 (lgG3) e as cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal de rato 8D10-C8 (lgG2b).

[253] DSM 26763 é uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmídeo que compreende o domínio variável que codifica a sequência da cadeia leve do 8D5-1G10 (8D5-1G10-LC). Escherichia coli 8D5-1G10-VL = DSM 26763, data da deposição: 15 de janeiro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria.

[254] DSM 26762 é uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmídeo que compreende o domínio variável que codifica a sequência da cadeia pesada do 8D5-1G10 (8D5-1G10-HC). Escherichia coli 8D5-1G10-VH = DSM 26762, data da deposição: 15 de janeiro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria.

[255] DSM 28171 é uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmídeo que compreende o domínio variável que codifica a sequência da cadeia leve do 8D10-C8 (8D10-C8-LC). Escherichia coli 8D10-C8-VL = DSM 28171, data da deposição: 11 de dezembro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria.

[256] DSM 28172 é uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmídeo que compreende o domínio variável que codifica a sequência da cadeia pesada do 8D10-C8 (8D10-C8-HC). Escherichia coli 8D10-C8-VH = DSM 28172, data da deposição: 11 de dezembro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria.

[257] O assunto das definições a seguir é considerado incorporações da presente invenção: 1. Um anticorpo isolado que se liga especificamente ao antígeno O25b de cepas de E. coli multidroga resistentes (MDR). 2. O anticorpo de acordo com a definição 1, que é específico-cruzada aos antígenos O25b e O25, e/ou, preferencialmente ligando-se ao antígeno O25b em relação ao antígeno O25a de E. coli, preferencialmente com uma afinidade maior quando comparada à ligação ao antígeno O25b por um soro policlonal produzido contra cepas de E. coli O25 (agora conhecido e aqui referido como O25a), conforme determinado por imunoensaio, comparado ao soro de tipagem policlonal produzido contras cepas O25a, de preferência onde o anticorpo tenha afinidade pelo menos igual a ambos os antígenos, O25b e O25a, como determinado por imunoensaio, de preferência imunotransferência, ELISA ou outros métodos imunológicos. 3. O anticorpo de acordo com a definição 1 ou 2, onde o antígeno O25b é predominante em uma ou mais cepas ST131-O25b:H4. 4. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 3, onde o epítopo reconhecido pelo anticorpo encontra-se presente na superfície de cepas ST131-O25b:H4 encapsuladas ou não encapsuladas. 5. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 4, que tenha um sítio de ligação de um anticorpo monoclonal de comprimento completo, ou um fragmento desse anticorpo, compreendendo pelo menos um domínio de anticorpo que incorpora um sítio de ligação, cujo anticorpo seja, preferencialmente, um anticorpo selecionado a partir de um grupo consistindo de murino, lhama, coelho, cabra, vaca, quimérico, anticorpos humanizados ou humanos, anticorpos de cadeia pesada, Fab, Fd, scFv e anticorpos de domínio único como VH, VHH ou VL, de preferência um anticorpo lgG1 humano. 6. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 5, que tenha afinidade para ligar-se ao antígeno O25b com um Kd menor do que 10-7M, de preferência, menos do que 10-8M. 7. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 6, que exiba potência bactericida in vitro em uma amostra de soro que compreenda cepas vivas de E. coli MDR tipo selvagem, e/ou que estimule a absorção de cepas vivas de E. coli MDR tipo selvagem por células fagocíticas in vitro. 8. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 7, onde o anticorpo se ligue ao mesmo epítopo que o anticorpo denominado como 8D5-1G10 ou 8D10-C8. 9. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 8, onde o anticorpo compreenda o mesmo sítio de ligação que o anticorpo denominado como 8D5-1G10 ou 8D10-C8. 10. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 9, onde o anticorpo seja derivado de um anticorpo que seja caracterizado por uma região variável, que seja - possível de ser obtido a partir de uma célula hospedeira depositada sob DSM 26763 e/ou DSM 26762, ou uma variante funcionalmente ativa dela; ou - possível de ser obtido a partir de uma célula hospedeira depositada sob DSM 28171 e/ou DSM 28172, ou uma variante funcionalmente ativa dela. 11. O anticorpo de acordo com a definição 10, compreendendo: A (a) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzida por ou possível de ser obtida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26763; e/ou (b) a região variável da cadeia pesada do anticorpo produzida por ou possível de ser obtida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26762; e/ou (c) ou uma variante funcionalmente ativa de (a) e/ou (b). ou B (d) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzida por ou possível de ser obtida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 28171; e/ou (e) a região variável da cadeia pesada do anticorpo produzida por ou possível de ser obtida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 28172; (f) ou uma variante funcionalmente ativa de (a) e/ou (b). 12. O anticorpo de acordo com a definição 10 ou 11, onde a variante funcionalmente ativa compreenda uma CDR com uma sequência de aminoácidos que apresente pelo menos 60% de identidade de sequência. 13. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 10 a 12, onde a variante funcionalmente ativa difira do anticorpo parental em pelo menos uma mutação de ponto na sequência de aminoácidos, de preferência na CDR, onde o número de mutações de ponto em cada uma das sequências de aminoácidos da CDR seja ou 0, ou 1, ou 2, ou 3. 14. Um plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos A - que codifique uma região variável da cadeia leve de anticorpo denominado 8D5-1G10-LC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 26763; e/ou - que codifique uma região variável da cadeia pesada de anticorpo denominado 8D5-1G10-HC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 26762; ou B - que codifique uma região variável da cadeia leve de anticorpo denominado 8D10-C8-LC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 28171; e/ou - que codifique uma região variável da cadeia pesada de anticorpo denominado 8D10-C8-HC incluído na célula hospedeira depositada sob DSM 28172. 15. Um cassete de expressão que compreenda uma sequência de codificação para expressar uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, cujo cassete de expressão ou sequência de codificação seja derivado de um plasmídeo de acordo com a definição 14. 16. O método de produção de um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13, onde uma célula hospedeira é transformada com um plasmídeo da reivindicação 14, ou o cassete de expressão de acordo com a definição 15. 17. Uma célula hospedeira compreendendo um plasmídeo de acordo com a definição 14 ou o cassete de expressão de acordo com a definição 15. 18. A célula hospedeira de acordo com a definição 17, que é depositada sob A - DSM 26763 e/ou DSM 26762; ou B - DSM 28171 e/ou DSM 28172. 19. O método de produção de um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13, onde uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 17 ou 18 é cultivada ou mantida em condições para produzir o referido anticorpo. 20. Um método para identificar um anticorpo candidato compreendendo: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpo; e (b) avaliar a ligação de um anticorpo presente ou produzido pela amostra com um epítopo reconhecido por um anticorpo denominado como 8D5-1G10 ou 8D10C8, onde uma reação positiva entre o anticorpo e o epítopo identifica o anticorpo como anticorpo candidato. 21. Um método para identificar um anticorpo candidato compreendendo: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpo; e (b) avaliar a ligação de um anticorpo presente ou produzido pela amostra com antígeno O25b de uma cepa ST131-O25b:H4, e o antígeno O25a de uma cepa de E. coli não MDR, onde uma reação específica positiva entre o anticorpo e o antígeno O25b em relação ao antígeno O25a identifica o anticorpo como anticorpo candidato. 22. Um método de produção de um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13 compreendendo (a) fornecer um anticorpo candidato identificado de acordo com a reivindicação 20 ou 21; e (b) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um derivado dele com a mesma especificidade de ligação ao epítopo que o anticorpo candidato. 23. Um método de produção de um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13 compreendendo (a) Imunizar um animal não humano com um epítopo reconhecido por um anticorpo denominado como 8D5-1g10 ou 8D10-C8; (b) formar linhagens celulares imortalizadas a partir de células B isoladas; (c) fazer a triagem das linhagens celulares obtidas em b) para identificar uma linhagem celular que produza um anticorpo monoclonal que se ligue ao epítopo; e (d) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um derivado dele com a mesma especificidade de ligação ao epítopo que o anticorpo candidato. 24. Um método de produção de um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13 compreendendo (a) imunizar um animal não humano com antígeno O25b de uma cepa ST131- O25b:H4 e isolar células B produtoras de anticorpos; (b) formar linhagens celulares imortalizadas a partir de células B isoladas; (c) fazer a triagem das linhagens celulares para identificar uma linhagem celular que produza um anticorpo monoclonal que, de preferência, se ligue ao antígeno O25b em relação ao antígeno O25a de E. coli; e (d) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um derivado dele com a mesma especificidade de ligação ao epítopo que o anticorpo candidato. 25. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13, para utilização no tratamento de um indivíduo em risco ou sofrendo de uma infecção por E. coli MDR, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo para limitar a infecção do indivíduo ou para melhorar uma condição de enfermidade resultante de tal infecção, de preferência para o tratamento ou profilaxia de pielonefrite, bacteremia secundária, sepse, peritonite, meningite e pneumonia associada à ventilação. 26. O anticorpo para utilização de acordo com a definição 25, para a morte bactericida do E. coli MDR, de preferência uma cepa 25-ST131:O25b, independentemente do polissacarídeo capsular expresso pela cepa. 27. O anticorpo para utilização de acordo com a definição 25 ou 26, onde o anticorpo é administrado em uma formulação por via mucosa ou parentérica. 28. A preparação farmacêutica de um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13, compreendendo uma formulação parentérica ou por mucosa, opcionalmente contendo um carregador ou excipiente farmacêuticamente aceitável. 29. O anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13, para utilização em diagnóstico para determinar a infecção por E. coli em um indivíduo, provocada por cepas MDR que expressam o antígeno LPS O25b, tal como as infecções do trato urinário inferior e superior, incluindo a cistite ou a uretrite, pielonefrite ascendente ou hematogênica, especialmente em pacientes diabéticos, assim como com bacteremia, sepse, peritonite ou colonização intestinal. 30. O anticorpo para utilização de acordo com a definição 29, onde uma infecção sistêmica com E. coli MDR em um indivíduo é determinada ex vivo pelo contato de uma amostra de fluido corporal de tal indivíduo com o anticorpo, onde uma reação imune específica do anticorpo determina a infecção. 31. O anticorpo para utilização de acordo com a definição 29 ou 30, onde uma amostra de fluido corporal é testada em relação à reação imune específica, cuja amostra seja selecionada de um grupo consistindo de urina, sangue, isolados de sangue ou cultura de sangue, aspirado, esputo, fluido de lavagem de indivíduos intubados e fezes. 32. O anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma das definições 20 a 31, onde o sorotipo de E. coli é determinado in vitro a partir de uma cultura de E. coli pura recuperada de uma amostra clínica. 33. A preparação de diagnóstico de um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13, opcionalmente contendo o anticorpo com um rótulo e/ou um reagente de diagnóstico adicional com um rótulo e/ou uma fase sólida para imobilizar pelo menos um dos anticorpos e o reagente de diagnóstico. 34. O epítopo isolado reconhecido pelo anticorpo denominado como 8D5- 1G10 ou 8D10-C8. 35. Um imunogênio compreendendo: (a) um epítopo de acordo com a definição 34; (b) opcionalmente, outros epítopos não associados nativamente com o referido epítopo em (a); e (c) um carregador. 36. O imunogênio de acordo com a definição 35, onde o referido carregador é um carregador farmacêuticamente aceitável, de preferência compreendendo um tampão e/ou substâncias adjuvantes. 37. O imunogênio de acordo com a definição 35 ou 36, em uma formulação de vacina, de preferência para uso parenteral. 38. O imunogênio de acordo com qualquer uma das definições de 35 a 37, para utilização no tratamento de um indivíduo pela administração de uma quantidade eficaz do referido imunogênio para proteger o indivíduo de uma infecção por E. coli MDR, ou para prevenir uma condição de enfermidade que resulte da referida infecção. 39. O imunogênio de acordo com a definição 38 para induzir uma resposta imune protetora. 40. O ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo de acordo com qualquer uma das definições de 1 a 13 ou um epítopo de acordo com a definição 35. A descrição anterior será mais plenamente entendida com referência aos exemplos a seguir. No entanto, esses exemplos são meramente representativos dos métodos para a prática de uma ou mais incorporações da presente invenção e não devem ser considerados como limitadores do escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Anticorpos O25b específicos

[258] Nós geramos um mutante não encapsulado de um representante 81009 da cepa ST131-O25b:H4 (81009Δ kps: kan, [Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6]) substituindo o agrupamento kps (que codifica a síntese capsular) com um cassete que codifica a resistência à canamicina. Foram utilizadas dosagens subletais de células vivas ou inativadas em formaldeído dessa cepa mutante para imunizar camundongos por 4 vezes em intervalos de duas semanas. A seguir, as amostras de soro obtidas do camundongo foram analisadas e o baço do rato mostrando o título mais elevado de lgG contra o antígeno O25b (em ELISA, imunotransferência e coloração da superfície) foi utilizado para a geração de hibridomas. Após a subclonagem, foram selecionados vários clones de hibridoma, cujos anticorpos secretados específicos para os antígenos O25b, assim como aqueles ligados à superfície das cepas vivas de E. coli do tipo selvagem que expressavam os antígenos O25b. Esses mAbs foram purificados a partir dos sobrenadantes do hibridoma para testes posteriores.

[259] Conforme ilustrado na Fig. 1, foi determinado que todos os anticorpos ligados aos vários diferentes isolados clínicos eram cepas ST131-O25b:H4, independentemente do polissacarídeo capsular expresso (K5, K2 ou tipos desconhecidos de K). Em relação à ligação às cepas que expressavam o antígeno O25a, foram identificados dois tipos de mAbs. Um grupo representado por mAb 8D5- 1G10, não se ligou à superfície das cepas O25a, enquanto que o outro grupo de mAbs representado por 8D10-C8 foi reativo-cruzada para as cepas O25a. No entanto, nenhum dos mAbs se ligou a quaisquer cepas de E. coli que expressavam antígenos não relacionados, ou seja, O2 (Figura 1) ou outros O-tipos (não mostrado).

[260] A especificidade dos mAbs foi ainda confirmada por análise de imunotransferência usando LPS purificado (Figura 2). Os mAbs reconheceram as moléculas de LPS das cepas ST131 contendo o antígeno O25b, no entanto, eram diferentes em seu potencial reativo-cruzada para os antígenos de LPS O25a. Enquanto o mAb 8D5-1G10 reagiu exclusivamente com o antígeno O25b, o mAb 8D10-C8 foi reativo-cruzada para o O25a. Essa reatividade-cruzada observada foi comparada àquela exibida pelo soro O25 de tipagem comercial (Statens Serum Institut, alto título de antissoro O25 de E. coli, #81369) rotineiramente utilizado para a detecção de cepas ST131:O25b). O soro de coelho comercial mostrou uma preferência clara para ligar-se aos antígenos O25a vs. LPS O25b. Ao contrário, o mAb 8D10-C8 de murino reagiu com as moléculas de LPS O25b pelo menos com a mesma intensidade das moléculas de O25a. Uma análise quantitativa posterior revelou que a razão de intensidade de ligação ao O25b vs O25a é pelo menos 10 vezes maior no caso do mAB 8D10-C8, em comparação com o soro de tipagem comercial.

[261] Todos os dados acima sugerem que existem dois tipos de mAbs O25b- específico, aqueles que são altamente específicos para o O25b e aqueles que reconhecem um epítopo compartilhado pelos antígenos O25a e O25b. Consequentemente, nossos dados confirmam que a estrutura do O25b de fato difere daquela do antígeno O25 clássico (isto é, O25a). A nova estrutura da subunidade O25b foi elucidada conforme descrito no Exemplo 2.

[262] Os domínios variáveis das cadeias pesadas (VH) e das cadeias leves (VL) dos mAbs O25b-específico foram ampliados a partir do clones de hibridoma usando-se RT-PCR com primers degenerados das cadeias pesada e leve e sequenciados. As sequências foram analisadas com BLAST para o banco de dados lg, assim como IMGT/V-QUEST, e as regiões da CDR foram definidas conforme a nomenclatura de Kabat.

[263] As sequências variáveis de cadeia leve e pesada do mAb 8D5-1G10 foram clonadas nos respectivos vetores, que foram utilizados para transformar as células hospedeiras de E. coli depositadas em DSMZ sob os números de acesso: DSM 26763 e DSM 26762.

[264] As sequências variáveis de cadeia leve e pesada do mAb 8D10-C8 foram clonadas nos respectivos vetores, que foram utilizados para transformar as células hospedeiras de E. coli depositadas em DSMZ sob os números de acesso: DSM 28171 e DSM 28172.

Exemplo 2: Análise da estrutura do antígeno O25b

[265] O LPS da E. coli ST131 foi isolado por um método de fenol/água a quente e purificado por diálise, digestão com proteinase K e ultracentrifugação. O rendimento médio das preparações de LPS foi de 2,61% de massa bacteriana seca. O LPS foi analisado por SDS_PAGE, mostrando frações consistindo de oligossacarídeos do núcleo (OS) substituídos por diferentes números de unidades de repetição de oligossacarídeo (RU), assim como por oligossacarídeos do núcleo não substituídos. O polissacarídeo O-específico (O-PS) e diferentes componentes do oligossacarídeo foram liberados por hidrólise ácida suave e isolados por filtração em gel sobre Bio-Gel P-10. As frações foram analisadas por análises de açúcar e metilação, espectroscopia de RMN e espectroscopia de massa MALDI_TOF (MS).

[266] A estrutura do O-OS RU foi determinada com o uso de uma fração constituída do OS do núcleo substituído por uma única RU. A análise dos monossacarídeos indicou a presença de Rha, Glc, Gal, Hep e menor quantidade de GlcN. Foram identificadas quantidades equimolares de derivados do terminal Rhap, terminal Glcp, Glcp 3,6-substituído, Rhap substituído, com quantidades traços de GlcpN 3-substituído e designadas para o O-OS RU. Acetatos de alditol metilados parcialmente remanescente de Hepp 7-substituído, Glcp 6-substituído, Glcp 2- substituído, Galp terminal, Glcp 3,6-substituído e Hepp terminal constituíram o oligossacarídeo do núcleo tipo K-12. Os derivados do Hepp 3,4-substituído, Hepp 3,4,7-substituído e o Kdo não puderam ser detectados durante as análises padronizadas de metilação e de açúcar, devido à substituição pelo P e PPEtn e também devido a presença do grupo carboxila, respectivamente.

[267] A estrutura da RU do PS O-específico do LPS ST131 foi determinada com o uso de espectroscopia de RMN. A determinação completa das ressonâncias do 1H e do 13C do O-PS foi obtida combinando-se as informações obtidas dos experimentos COSY, TOCSY e NOESY, bem como dos experimentos HSQC-DEPT, HMBC e HSQC-TOCSY. O espectro do HSQC-DEPT 1H, 13C continha sinais para 13 prótons e carbonos anoméricos e um sistema de spins Kdo. Esses sinais são derivados do oligossacarídeo do núcleo e de uma RU do PS O-específico. A região de campo elevado continha um sinal de CH3 do grupo O-acetil, um sinal de CH3 do grupo N-acetil, assim como dois sinais para campo mais alto de CH3 característico de açúcares 6-deoxi (Rha). O espectro indicou uma estrutura de tetradecassacarídeo do oligossacarídeo investigado. Devido à alta heterogeneidade relativa ao P, PP e PEtn, completos sistemas de spins para oito açúcares da extremidade não redutora foram completamente resolvidos com ênfase na estrutura da RU e sua ligação ao OS do núcleo K-12.

[268] As conectividades interresíduos entre os resíduos de açúcar adjacentes foram observadas pelos experimentos de NOESY e HMBC. O espectro HMBC exibiu picos-cruzados entre o próton anomérico e o carbono na posição de ligação e entre o carbono anomérico e o próton na posição de ligação, que confirmou a sequência de resíduos de açúcar na região não redutora do polissacarídeo.

[269] Com base nessas medições, foi determinada a unidade de repetição do PS O25b-específico (Fig. 3 (a)), que é um pentassacarídeo com ^3)-β-Glcp NAc (resíduo K) como um resíduo da RU substituindo o primeiro resíduo do OS do núcleo: ^7)-α-Hepp (resíduo L). Devido à possível contaminação das frações mais longas do PS, foi impossível identificar a posição de substituição da primeira RU por posterior RU da cadeia O-específica. Além disso, sem maiores análises estruturais detalhadas dessas frações, pode ser descartada a presença de GlcNAc em subsequentes unidade de repetição como a-anômero (o que foi anteriormente relatado para alguns polissacarídeos de E. coli).

[270] Os pesos moleculares do OS do núcleo, OS do núcleo substituído por uma RU e, finalmente, o RU do O-PS foram confirmados com o uso de MALDI-TOF MS (dados não mostrados). Todos os espectros foram interpretados com base na estrutura aqui elucidada da RU do LPS ST131 e as glicoformas anteriormente identificadas do OS do núcleo K-12 (Duda et al. Microbiology. 2011 Jun;157(Pt 6):1750-60. Doi: 10.1099/mic.0.046912-0. Epub 2011 Mar 3; Muller-Loennies et al. J Biol Chem. 2003 Sep 5;278(36):34090-101. Epub 2003 Jun 20). A análise MALDI- MS do espectro de baixa resolução da fração consistindo de OS do núcleo substituído com O-PS mais curtos mostrou agrupamentos de íons com a predominância dos seguintes íons: m/z 2797.2, m/z 3659.6, m/z 4522.0, e m/z 5383.6 atribuídos ao OS do núcleo (com P e PPEtn) substituído com 1, 2, 3 e 4 Rus, respectivamente. A diferença de massa média entre esses íons foi de 862,1 Da e coincidiu com a massa média calculada da RU PS O-específica (861,8 Da, RU- H2O).

[271] Considerando o peso molecular da RU e comparando os resultados de MS para outras frações, nós mostramos a presença da glicoforma OS do núcleo mais longas, consistindo do dissacarídeo ^7)-α-Hepp-(1^6)-a-Glcp na região mais externa do núcleo como um local de substituição com a primeira RU (Fig. 3 (a)). Foi demonstrado que o LPS ST131 consistia de duas principais glicoformas de OS do núcleo. O tipo da glicoforma é dependente da presença ou da ausência do PS O- específico. A glicoforma predominante do OS do núcleo não substituído é a versão truncada do oligossacarídeo do núcleo K-12, que é desprovido do dissacarídeo ^7)- α-Hepp-(1^6)-α-Glcp. Tal dissacarídeo é a diferença entre o OS do núcleo O-PS substituído e o OS do núcleo não substituído.

Exemplo 3: Ensaio de diagnóstico O25b-específico para E. coli

[272] O mAb 8D5-1G10 O25b-específico foi ligado às esferas de látex de diâmetro 1 μm (Polysciences) seguindo-se as instruções do fabricante. As esferas de látex acopladas foram testadas para o potencial de aglutinação de diferentes cepas de E. coli. Uma alça de inoculação de bactérias (aproximadamente 108 cfu) foi misturada com 10 μl de suspensão a 1% de esferas de látex mAb-acopladas em PBS. Conforme ilustrado na Fig. 4, cepas de E. coli expressando antígenos O25b mostraram um forte padrão de aglutinação após agitação suave por poucos segundos. No sentido contrário, cepas de E. coli expressando o antígeno O25a ou O2 não aglutinaram com o mesmo reagente. Portanto, esse suposto reagente de diagnóstico é considerado ser mais específico do que o reagente de aglutinação do atual estado da arte (ou seja, soro de coelho policlonal contra O25) utilizado para a detecção de E. coli O25b (e O25a)-positiva.

[273] Além disso, como é recomendado que em ensaios de aglutinação o soro comercial anti-O25 seja utilizado com células de E. coli mortas pelo calor (ou seja, lisadas), nós testamos se o mAbs O25b - purificado ou acoplado às esferas de látex - apresentaria maior sensibilidade, isto é, se eles seriam capazes de aglutinar células vivas de E. coli na presença de polissacarídeos capsulares intactos. Foi testado um amplo painel de isolados clínico O25b e os resultados com algumas cepas representativas estão apresentados na Tabela I. A melhora na sensibilidade foi encontrada em dois aspectos: i) cepas representativas #1 e #2 foram aglutináveis com ambos os mAbs O25b-específicos, livres ou acoplados à esfera, em um formato não mortas pelo calor (ou seja, bactérias vivas diretamente retiradas de uma placa de ágar), enquanto que a aglutinação com o soro de coelho O25 comercial exigiu uma lise prévia das bactérias por calor, ii) cepas representativas #3 e #4 não foram capazes de serem aglutinadas com o soro comercial mesmo em um formato mortas por calor, enquanto que os mesmos lisados apresentaram resultados positivos com o mAb 8D5-1G10 purificado. É importante ressaltar que quando o mesmo anticorpo foi acoplado às esferas de látex, a aglutinação se desenvolveu mesmo com células bacterianas nativas. Esses resultados indicam uma sensibilidade superior dos mAbs acoplados às esferas em um ensaio de aglutinação, o que é corroborado pelo fato de que todas as cepas de E. coli O25b positivas testadas até agora mostraram uma aglutinação positiva com esse reagente mesmo sem qualquer tratamento prévio (isto é, sem produzir um lisado morto por calor). Além disso, usar esse reagente como uma ferramenta de diagnóstico para a detecção de bactérias que expressam O25b tem a vantagem sobre a técnica com base no PCR de apenas apresentar resultado positivo com bactérias que de fato expressam o antígeno alvo. Por exemplo, a cepa representativa #5 na Tabela I foi PCR positiva para o gene específico para O25b rotineiramente utilizado em diagnósticos, no entanto, foi negativa em todos os ensaios de aglutinação. Foi comprovado que essa cepa exibe um fenótipo de LPS bruto (não O-antígenos expressos), portanto, o resultado de PCR poderia ser considerado como um positivo falso. Evitar essa positividade falsa é de grande importância quando os ensaios são utilizados para companion diagnostics, ou seja, para selecionar pacientes infectados com cepas de E. coli que expressam O25b, e que poderiam se beneficiar de abordagens terapêuticas específicas para O25b.

[274] Também foi testado o potencial para detectar moléculas de LPS O25b livres por mAbs acoplados às esferas de látex. Quantidades diferentes de LPS O25b altamente purificadas na faixa de 1-1000 ng foram incubadas com 10 μl de suspensão de esferas em PBS 1%. Conforme ilustrado na Fig. 5, foi visualizado um padrão de aglutinação dependente da dosagem: Os melhores resultados foram obtidos com 100 ng do LPS livre, a aglutinação foi ainda detectável com 1000 ou 10 ng, enquanto que não foi detectável com 1 ng de LPS O25b livre. Tabela I. Comparação dos resultados de aglutinação obtidos com várias cepas de O25b usando soro de tipagem O25 comercial e mAb 8D5-1G10 específico para O25b.

Exemplo 4: Efeito antibacteriano dos mAbs específicos para O25b

[275] Testou-se o potencial efeito protetor dos mAbs O25b-específicos (com ou sem reatividade cruzada para O25a) em um modelo letal de bacteremia de murino. Grupos de 5 camundongos receberam 100 μg de 8D5-1G10 ou 8D10-C8 purificados, intraperitoneamente. 24 horas mais tarde, os camundongos foram infectados intravenosamente por uma dose letal (previamente determinada em um experimento piloto) de cepa de E. coli 81009 (2x108 CFU/rato) expressando o antígeno O25b. A letalidade do camundongo foi monitorada diariamente por 3 semanas. A Fig. 6 mostra os resultados combinados de 2 experimentos independentes com resultados similares. Enquanto 90% dos camundongos imunizados com PBS sucumbiram à infecção, ambos os mAbs testados forneceram aumento estatisticamente significativo (teste de Logrank) na sobrevida durante o período monitorado de 3 semanas pós-infecção.

[276] A fim de corroborar esses dados in vivo, o efeito bactericida dos mAbs purificados também foi testado in vitro. 2 mL de uma cultura semilog de cepa de E. coli 81009 foram lavados duas vezes em PBS e ressuspendida para a concentração final de 5x105 CFU/mL. 10 μl dessa suspensão bacteriana foram pré-incubadas por 15 minutos a 4°C com 4 μg do respectivo mAbs diluído em 40 μl de tampão 1640- RPMI suplementado com albumina humana a 3%. Posteriormente, 50 μl de soro humano (previamente adsorvido com cepa de E. coli 81009) foram adicionados à reação e incubados a 37°C por 1, 2 e 3 horas. O CFU e as concentrações de anticorpo finais na reação foram 5x104 CFU/mL e 40 μg/mL, respectivamente, em um volume total de 100 μl. Alíquotas de 10 μl foram plaqueadas em placas de TSB para contagem de colônia nos pontos de tempo especificados.

[277] Conforme ilustrado na Fig. 7, ambos os mAbs testados foram capazes de reduzir significativamente o CFU no período de estudo de 3 horas. Ao contrário, as bactérias misturas com um mAb irrelevante ou sem anticorpos mostraram crescimento constante nesse meio. No caso em que o complemento foi inativado nas amostras de soro (por 30 minutos, incubação a 56°C), não foi observada morte bacteriana por quaisquer mAbs (dados não mostrados). Esses resultados provam que ambos os mAbs O25b-específicos podem desencadear o efeito bactericida mediado pelo complemento.

Claims (4)

1. UM IMUNOGÊNIO caracterizado por compreender: (a) o antígeno compreendendo a estrutra: (b) opcionalmente, outros epítopos não associados nativamente com o referido antígeno em (a) e (c) um carregador, onde o carregador é um carregador farmaceuticamente aceitável compreendendo um buffer.

2. IMUNOGÊNIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser fornecido em uma formulação de vacina.

3. IMUNOGÊNIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser fornecido em uma vacina multivalente.

4. IMUNOGÊNIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser fornecido em uma composicao farmacêutica.