ES2907211T3 - Composiciones y métodos para la glicosilación de proteínas - Google Patents

Composiciones y métodos para la glicosilación de proteínas Download PDF

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Abstract

N-oligosacariltransferasa recombinante que es la PglB de Campylobacter jejuni (PglBCj) o la PglB de Campylobacter lari (PglBCl), en la que la N-oligosacariltransferasa (N-OST) recombinante puede ligar de manera detectable un oligosacárido o polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor a una proteína transportadora en una secuencia consenso de N-glicosilación, en la que uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y77, S80, S196, N311, Y462, K482, D483 y G477 de PglBCj están modificados.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la glicosilación de proteínas
1. INTRODUCCIÓN
En el presente documento se describen oligosacariltransferasas para su uso en la N-glicosilación de proteínas de interés in vitro y en células huésped. En el presente documento también se proporcionan métodos para usar tales oligosacariltransferasas, ácidos nucleicos que codifican para tales oligosacariltransferasas, y células huésped que comprenden tales oligosacariltransferasas. En el presente documento también se proporcionan glicoconjugados mediante el uso de tales oligosacariltransferasas.
2. ANTECEDENTES
Las vacunas glicoconjugadas se reconocen ampliamente por su capacidad para prevenir muchas infecciones bacterianas potencialmente mortales. Las vacunas glicoconjugadas generalmente se consideran eficaces y seguras y se han usado en seres humanos durante más de 30 años. La producción convencional de glicovacunas a menudo implica la modificación química de proteínas transportadoras inmunogénicas con antígenos polisacarídicos de bacterias patógenas. Sin embargo, más recientemente, han surgido procedimientos biotecnológicos para producir vacunas glicoconjugadas que se espera que reduzcan los costes de producción y aumenten adicionalmente la homogeneidad y posiblemente la potencia y seguridad de las preparaciones de vacunas glicoconjugadas.
En células eucariotas, la glicosilación ligada a N es un mecanismo clave de modificación de proteínas postraduccional que implica varias enzimas. En células procariotas, la glicosilación ligada a N está catalizada por determinadas N-oligosacariltransferasas (N-OST) bacterianas. El grupo de genes de glicosilación de proteínas de Campylobacter jejuni (C. jejuni) incluye el gen pglB, que codifica para una N-OST unida a la membrana (PglBcj). PglBcj puede expresarse en huéspedes bacterianos convencionales, tales como Escherichia coli (E. coli), y puede glicosilar proteínas periplásmicas coexpresadas que portan al menos un motivo de glicosilación D/E-Y-N-X-S/T (Y, X t P) expuesto en la superficie. PglBCj puede transferir antígenos polisacarídicos bacterianos a proteínas de C. jejuni, así como a proteínas transportadoras inmunogénicas de otros organismos que contienen sitios de glicosilación modificados por ingeniería. PglBCj puede transferir oligosacáridos de C. jejuni y, hasta cierto punto, estructuras de lipopolisacárido de antígeno O de bacterias Gram-negativas y polisacáridos de antígeno capsular de bacterias Gram-positivas. Lizak et al en Journal of Biological Chemistry vol. 289, n.° 2, páginas 735-746 (2013) describen un motivo catalíticamente esencial en el bucle externo 5 de la oligosacariltransferasa bacteriana PglB.
La presente divulgación proporciona N-OST recombinantes con especificidades de sustrato modificadas y métodos de uso de las N-OST recombinantes para la producción de vacunas glicoconjugadas. Tales N-OST recombinantes pueden usarse ventajosamente en la N-glicosilación de proteínas.
3. SUMARIO
En un aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante que es la PglB de Campylobacter jejuni (PglBCj) o la PglB de Campylobacter lari (PglBCl), en la que la N-oligosacariltransferasa (N-OST) recombinante puede ligar de manera detectable un oligosacárido o polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor a una proteína transportadora en una secuencia consenso de N-glicosilación, en la que uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y77, S80, S196, N311, Y462, K482, D483 y G477 de PglBCj están modificados.
En algunas realizaciones, la actividad N-OST de ligar el oligosacárido o polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor a la proteína transportadora en la secuencia de N-glicosilación se detecta mediante ELISA.
En algunas realizaciones, la señal de ELISA que indica la actividad N-OST es detectable si es >2o o >3o por encima de la señal de fondo de ELISA.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora es una proteína transportadora natural del mismo organismo que la N-OST. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es una proteína transportadora heteróloga de un organismo diferente que la N-OST.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora se selecciona del grupo que consiste en exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A detoxificada de S. aureus, factor de aglutinación A, factor de aglutinación B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes detoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes detoxificadas de la toxina colérica, proteína sat de E. coli, el dominio pasajero de la proteína sat de E. coli, AcrA de C. jejuni y glicoproteínas naturales de C. jejuni.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora tiene al menos un motivo de glicosilación. En algunas realizaciones, el al menos un motivo de glicosilación comprende D/E-Y-N-X-S/T (X, Y t P). En algunas realizaciones, el al menos un motivo de glicosilación comprende Asn-X-Ser(Thr), en el que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro. En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor comprende un antígeno.
En algunas realizaciones, el antígeno incluye un antígeno de E. coli, un antígeno de Salmonella sp, un antígeno de Pseudomonas sp., un antígeno de Klebsiella sp., un antígeno de acinetobacter O, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Vibrio cholera, un antígeno de Listeria sp., un antígeno de los serotipos 1 a 15 de Legionella pneumophila, un antígeno de Bordetella parapertussis, un antígeno de Burkholderia mallei o pseudomallei, un antígeno de Francisella tularensis, un antígeno de Campylobacter sp.; un antígeno de Clostridium difficile, un antígeno de Streptococcus pyrogenes, un antígeno de Streptococcus agalacticae, un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Candida albicans, un antígeno de Haemophilus influenza, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Haemophilus influenza, un antígeno de Leishmania major, o un antígeno de Shigella sonnei o Streptococcus pneumoniae (por ejemplo, CP1, CP4, y similares).
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor es un polisacárido de Staphylococcus aureus o de Salmonella enterica sv. En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor es un polisacárido CP5 de Staphylococcus aureus o LT2 de Salmonella enterica sv. Typhimurium.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede aumentar el rendimiento de la glicosilación in vivo o la glicosilación in vitro de la proteína transportadora con el polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor para producir la proteína transportadora glicosilada a un nivel de más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces por encima del nivel de fondo en un ensayo que detecta la proteína transportadora glicosilada.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede aumentar la tasa de glicosilación in vivo o glicosilación in vitro de la proteína transportadora con el polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor en más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces en comparación con una forma de tipo natural de la N-oligosacariltransferasa recombinante.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede glicosilar in vivo o in vitro al menos el 1%, al menos el 3%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65% o al menos el 70% de la proteína transportadora con el polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende una modificación en uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-oligosacariltransferasa recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada.
En algunas realizaciones, la distancia de 2,5-4,0 A es la distancia desde la primera unidad de monosacárido terminal en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido. En algunas realizaciones, la distancia de 2,5­ 4,0 A es desde la segunda unidad de monosacárido terminal en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido. En algunas realizaciones, la distancia de 2,5-4,0 A es desde la tercera unidad de monosacárido terminal en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido. En algunas realizaciones, la distancia de 2,5­ 4,0 A es desde un aminoácido conservado en el centro catalítico de la N-oligosacariltransferasa recombinante en el modelo estructural de un complejo de la N-oligosacariltransferasa recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada (por ejemplo, K522, N311, H 479, G476, Y462, G477, Y77, S80 o S199 de PglBCj), véase, por ejemplo, la figura 2).
En algunas realizaciones, la modificación en el uno o más aminoácidos es una sustitución de aminoácido.
En algunas realizaciones, el uno o más aminoácidos incluyen un aminoácido que es un aminoácido no conservado en una familia filogenética de N-oligosacariltransferasas. En algunas realizaciones, el aminoácido no conservado está conservado en menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20% o menos del 10% de los miembros de la familia filogenética de N-oligosacariltransferasas.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende una modificación en dos o más aminoácidos. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende una modificación en tres o más aminoácidos. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende una modificación en cuatro o más aminoácidos.
En algunas realizaciones, al menos uno del uno o más aminoácidos está ubicado en un bucle periplásmico de un dominio transmembrana de la N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, el bucle periplásmico del dominio transmembrana es un bucle externo grande 5 (EL5). En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante es PglBcy y el EL5 es EL5 de PglBcy.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende además una mutación en uno o más aminoácidos en un motivo QLKFYxxR. En algunas realizaciones, el motivo Q287LKFYxxR294 es un motivo Q287LKFYxxR294. En algunas realizaciones, el motivo Q287LKFYxxR294 es el motivo Q287LKFYxxR294 de PglBcy.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante es una PglBcy recombinante.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida es una proteína transportadora glicosilada natural de C. yeyuni. En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida es una proteína transportadora glicosilada heteróloga de C. yeyuni.
En algunas realizaciones, el componente de oligosacárido o polisacárido de la proteína transportadora N-glicosilada unida tiene un monosacárido de galactosa en su extremo reductor.
En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y77, S80, S196, N311, Y462, H479, K522, G476 y G477 de PglBcy están modificados. En algunas realizaciones, N311 de PglBcy está modificado. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución N311V o una sustitución N3111. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende además una modificación en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y77 y S80. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Y77H, Y77T, Y77W, Y77R, Y77K, Y77A, Y77G, S80R y S80H. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Y77H y S80R.
En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende además una modificación de aminoácido en uno o más aminoácidos del motivo Q287LKFYxxR294 de PglBcy. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una modificación de aminoácido en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Q287, L288 y K289. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste en Q287P, Q287K, Q287R, L288M, L288F, L288I, L288C, K289R, K289N, K289Q y R294K.
En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución de aminoácido N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido Y77H y N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido S80R y N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido Q287P y Y77H o Q287P y S80R. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido S80R, Q287P y N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido Y77H, Q287P y N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido Y77H, S80R, Q287P y N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido Y77H, S80R, Q287P, K289R y N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido N311V y A699V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende las sustituciones de aminoácido K482R y D483H.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa (N-OST) recombinante que comprende una modificación en uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-oligosacariltransferasa recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácido.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora se selecciona del grupo que consiste en exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A detoxificada de S. aureus, factor de aglutinación A, factor de aglutinación B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes detoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes detoxificadas de la toxina colérica, proteína sat de E. coli, el dominio pasajero de la proteína sat de E. coli, AcrA de C. jejuni y glicoproteínas naturales de C. jejuni.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor comprende un antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno incluye un antígeno de E. coli, un antígeno de Salmonella sp, un antígeno de Pseudomonas sp., un antígeno de Klebsiella sp., un antígeno de acinetobacter O, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Vibrio cholera, un antígeno de histeria sp., un antígeno de los serotipos 1 a 15 de Legionella pneumophila, un antígeno de Bordetella parapertussis, un antígeno de Burkholderia mallei o pseudomallei, un antígeno de Francisella tularensis, un antígeno de Campylobacter sp.; un antígeno de Clostridium difficile, un antígeno de Streptococcus agalacticae, un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Candida albicans, un antígeno de Haemophilus influenza, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Haemophilus influenza, un antígeno de Leishmania major, o un antígeno de Shigella sonnei o Streptococcus pneumoniae (por ejemplo, CP1, CP4, y similares).
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende modificaciones en dos o más aminoácidos. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende modificaciones en tres o más aminoácidos. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende modificaciones en cuatro o más aminoácidos.
En algunas realizaciones, al menos uno del uno o más aminoácidos está ubicado en un bucle periplásmico de un dominio transmembrana de la N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, el bucle periplásmico del dominio transmembrana es un bucle externo grande 5 (EL5). En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante es la PglB de Campylobacter jejuni (PglBCj) y el EL5 es el EL5 de PglBCj.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende además una modificación en uno o más aminoácidos en un motivo QLKFYxxR. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende además una modificación en uno o más aminoácidos en un motivo Q287LKFYxxR294. En algunas realizaciones, el motivo QLKFYxxR es el motivo Q287LKFYxxR294 de PglBCj.
En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido es una sustitución de un aminoácido no conservado en una familia filogenética de N-oligosacariltransferasas.
En algunas realizaciones, el producto de polipéptido N-glicosilado unido es una proteína transportadora N-glicosilada natural procedente del mismo organismo que la N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada es una proteína transportadora N-glicosilada heteróloga, en la que el componente de oligosacárido o polisacárido de la proteína transportadora N-glicosilada es de un organismo diferente que la N-oligosacariltransferasa recombinante y/o el componente de proteína transportadora de la proteína transportadora N-glicosilada es de un organismo diferente que la N-oligosacariltransferasa recombinante.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante es PglBCj recombinante.
En algunas realizaciones, el producto de polipéptido N-glicosilado unido es una proteína transportadora glicosilada natural de C. jejuni. En algunas realizaciones, el producto de polipéptido N-glicosilado unido es una proteína transportadora glicosilada heteróloga de C. jejuni. En algunas realizaciones la proteína transportadora glicosilada heteróloga de C. jejuni es exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (EPA)-O1 de S. dysenteriae (EPA-O1), EPA-polisacárido capsular de tipo 5 de S. aureus (EPA-CP5) o EPA-LT2 de Salmonella enterica (S. enterica) (EPA-LT2).
En algunas realizaciones, el componente de oligosacárido o polisacárido de la proteína transportadora N-glicosilada unida no tiene un N-acetil-monosacárido en su extremo reductor. En algunas realizaciones, el componente de oligosacárido o polisacárido de la proteína transportadora N-glicosilada unida tiene un monosacárido de galactosa en su extremo reductor.
En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos del grupo que consiste en Y77, S80, S196, N311, Y462, H479, K522, G476 y G477 de PglBCj están modificados. En algunas realizaciones, de PglBCj está modificado. En algunas realizaciones, la PglBCj recombinante comprende una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en N311V y N311I. En algunas realizaciones, la PglBCj recombinante comprende una sustitución de aminoácido N311V. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y77 y S80 de PglBCj están modificados. En algunas realizaciones, la PglBCj recombinante comprende una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Y77H, Y77T, Y77W, Y77R, Y77K, Y77A, Y77G, S80R y S80H. En algunas realizaciones, la PglBCj recombinante comprende sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste en Y77H y S80R.
En algunas realizaciones, la PglBCj recombinante comprende además una modificación de uno o más aminoácidos del motivo Q287LKFYxxR294 de PglBCj. En algunas realizaciones, la PglBCj recombinante comprende una modificación de uno más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Q287, L288 y K289. En algunas realizaciones, la PglBCj recombinante comprende una sustitución seleccionada del grupo que consiste en Q287P, Q287K, Q287R, L288M, L288F, L288I, L288C, K289R, K289N, K289Q y R294K.
En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución Y77H y una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución S80R y una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución Q287P y una sustitución Y77H o una mutación de sustitución Q287P y una sustitución S80R. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución S80R, una sustitución Q287P y una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución Y77H, una sustitución Q287P y una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución Y77H, una sustitución S80R, una sustitución Q287P y una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución Y77H, una sustitución S80R, una sustitución Q287P, una sustitución K289R y una sustitución N311V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución N311V y una sustitución A699V. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución K482R y una sustitución D483H.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede ligar de manera detectable un oligosacárido o polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor a una proteína transportadora.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede ligar de manera detectable un oligosacárido o polisacárido que tiene un monosacárido de galactosa en el extremo reductor a una proteína transportadora.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido es un oligosacárido o polisacárido de Staphylococcus aureus o de Salmonella entérica sv.. En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido es un oligosacárido o polisacárido CP5 de Staphylococcus aureus o LT2 de Salmonella entérica sv. Typhimurium.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede aumentar el rendimiento de la glicosilación in vivo o la glicosilación in vitro de la proteína transportadora con el oligosacárido o polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor para producir la proteína transportadora glicosilada a un nivel de más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces por encima del nivel de fondo en un ensayo que detecta la proteína transportadora glicosilada.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede aumentar la tasa de glicosilación in vivo o in vitro de una proteína transportadora con el oligosacárido o polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor en más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces en comparación con una forma de tipo natural de la N-oligosacariltransferasa recombinante.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante puede producir un nivel de glicosilación in vivo o un nivel de glicosilación in vitro de la proteína transportadora de al menos el 1%, al menos el 3%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60% o al menos el 70%.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una sustitución N311V.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una mutación N311V y una sustitución Y77H.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una mutación N311V y una sustitución S80R.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una mutación N311V y una mutación Y77H y una sustitución S80R.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una mutación N311V y una sustitución Q287P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una mutación N311V, una sustitución Y77H y una sustitución Q287P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una mutación N311V, una sustitución S80R y una sustitución Q287P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una sustitución N311V, una sustitución Y77H, una sustitución S80R y una sustitución Q287P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una sustitución N311V y una sustitución A669V.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una sustitución N311V, una sustitución Y77H, una sustitución S80R, una sustitución Q287P y una sustitución K289R.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una sustitución K482R y una sustitución D483H.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBcy que comprende una sustitución N311V y una sustitución A669V.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ (PglB de c. /ari) que comprende una sustitución N314V.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una mutación N314V y una sustitución Y79H.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una mutación N314V y una sustitución S82R.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una mutación N314V y una mutación Y79H y una sustitución S82R.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una mutación N314V y una sustitución Q289P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una mutación N314V, una sustitución Y79H y una sustitución Q289P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una mutación N314V, una sustitución s 82R y una sustitución Q289P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una sustitución N314V, una sustitución Y79H, una sustitución S82R y una sustitución Q289P.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa recombinante PglBc/ que comprende una sustitución K488R y una sustitución D489H.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una N-oligosacariltransferasa recombinante descrita en el presente documento.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una célula huésped que comprende una N-oligosacariltransferasa recombinante descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la célula huésped comprende además una glicosiltransferasa recombinante.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de E. co/i.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de producción de un bioconjugado que comprende cultivar una célula huésped descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una proteína transportadora y una N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende además una glicosiltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante es una PglBcy recombinante.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora se selecciona del grupo que consiste en exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A detoxificada de S. aureus, factor de aglutinación A, factor de aglutinación B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes detoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes detoxificadas de la toxina colérica, proteína sat de E. coli, el dominio pasajero de la proteína sat de E. coli, AcrA de C. jejuni y glicoproteínas naturales de C. jejuni.
En algunas realizaciones, el bioconjugado es una proteína transportadora N-glicosilada. En algunas realizaciones, el bioconjugado es una proteína transportadora N-glicosilada natural de C. jejuni. En algunas realizaciones, el bioconjugado es una proteína transportadora N-glicosilada heteróloga de C. jejuni. En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada no tiene un N-acetil-azúcar en el extremo reductor de su componente de oligosacárido o polisacárido. En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada tiene una galactosa en el extremo reductor de su componente de oligosacárido o polisacárido.
En algunas realizaciones, el mutante de N-oligosacariltransferasa recombinante puede aumentar la tasa de producción de bioconjugados en más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces en comparación con la tasa lograda con una forma de tipo natural de la N-oligosacariltransferasa recombinante.
En algunas realizaciones, el mutante de N-oligosacariltransferasa recombinante puede aumentar el rendimiento de producción de bioconjugados hasta un nivel de más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces por encima del nivel de fondo en un ensayo que detecta el bioconjugado.
En algunas realizaciones, se glicosila al menos el 1%, al menos el 3%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, o al menos el 70% de la proteína transportadora en una célula huésped para formar el bioconjugado.
En algunas realizaciones, el método comprende además purificar el bioconjugado a partir del cultivo de células huésped.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de examen de una biblioteca de N-oligosacariltransferasas recombinantes, comprendiendo cada N-oligosacariltransferasa recombinante una modificación en uno o más aminoácidos, que comprende poner en contacto cada miembro de la biblioteca de N-oligosacariltransferasas recombinantes con una proteína transportadora y un oligosacárido o polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en su extremo reductor para producir un bioconjugado.
En algunas realizaciones, el bioconjugado es una proteína transportadora N-glicosilada.
En algunas realizaciones, el contacto se produce in vitro. En algunas realizaciones, el contacto se produce in vivo. En algunas realizaciones, el contacto se produce en una célula huésped. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de E. coli.
En algunas realizaciones, la biblioteca de N-oligosacariltransferasas recombinantes comprende al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 500, al menos 750 o al menos 1.000 N-oligosacariltransferasas recombinantes.
En algunas realizaciones, la biblioteca de N-oligosacárido transferasas recombinantes comprende una o más N-oligosacárido transferasas recombinantes descritas en el presente documento.
En algunas realizaciones, el método comprende además analizar la tasa o el rendimiento de producción del bioconjugado.
En algunas realizaciones, el método comprende además seleccionar una o más N-oligosacariltransferasas recombinantes de la biblioteca de N-oligosacariltransferasas recombinantes.
En algunas realizaciones, la una o más N-oligosacariltransferasas recombinantes se seleccionan si la N-oligosacariltransferasa recombinante produce el bioconjugado a una tasa que es más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces más rápida que la tasa de una forma de tipo natural de la N-oligosacariltransferasa recombinante.
En algunas realizaciones, el uno o más mutantes de N-oligosacariltransferasa se seleccionan si el mutante de N-oligosacariltransferasa produce el bioconjugado a un rendimiento que es detectable a un nivel de más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces por encima del nivel de fondo en un ensayo que detecta el bioconjugado.
En algunas realizaciones, la una o más N-oligosacariltransferasas recombinantes se seleccionan si la N-oligosacariltransferasa recombinante glicosila al menos el 1%, al menos el 3%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, o al menos el 70% de una proteína transportadora en la célula huésped.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de identificación de una N-oligosacariltransferasa recombinante que tiene una selectividad de sustrato modificada en relación con una forma de tipo natural de la N-oligosacariltransferasa, que comprende modificar uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 Á desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-oligosacariltransferasa recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada.
En algunas realizaciones, el método comprende modificar dos o más aminoácidos de la N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, el método comprende modificar tres o más aminoácidos de la N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, el método comprende modificar cuatro o más aminoácidos de la N-oligosacariltransferasa recombinante.
En algunas realizaciones, al menos uno del uno o más aminoácidos está ubicado en un bucle periplásmico de un dominio transmembrana de la N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, el bucle periplásmico del dominio transmembrana es un bucle externo grande 5 (EL5).
En algunas realizaciones, el método comprende además mutar uno o más aminoácidos en un motivo QLKFYxxR de la N-oligosacariltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, el motivo QLKFYxxR es un motivo Q287LKFYxxR294. En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida es una proteína transportadora N-glicosilada natural.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida es una proteína transportadora N-glicosilada heteróloga. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante es una PglBcj recombinante. En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida es una proteína transportadora N-glicosilada natural de C. jejuni. En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida es una proteína transportadora N-glicosilada heteróloga de C. jejuni.
En algunas realizaciones, el componente de oligosacárido o polisacárido de la proteína transportadora N-glicosilada unida no tiene un N-acetil-monosacárido en su extremo reductor. En algunas realizaciones, el componente de oligosacárido o polisacárido de la proteína transportadora N-glicosilada unida tiene un monosacárido de galactosa en su extremo reductor.
En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante tiene una selectividad de sustrato modificada in vitro. En algunas realizaciones, la N-oligosacariltransferasa recombinante tiene una selectividad de sustrato modificada in vivo.
4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 representa estructuras del sustrato de heptasacárido natural de C. jejuni de PglBcy y de dos sustratos de polisacárido no naturales con eficiencia de glicosilación decreciente de arriba a abajo. GalNAc: 2-N-acetilgalactosamina, Glc: glucosa, DATDH: 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxihexosa, PP-und: transportador de undecaprenil-pirofosfato, Rha: ramnosa, Gal: galactosa, GlcNAc: N-acetilglucosamina, ManNAc: N-acetilmanosamina, OAc: modificación de O-acetilo, FucNAc: N-acetilfucosamina, Man: manosa, Abe: abecuosa (3,6-desoxi-D-galactosa).
La figura 2 representa un modelado a modo de ejemplo de estructuras de oligosacárido cuando interaccionan con PglBcj. La figura 2A representa una conformación a modo de ejemplo de OS de C. jejuni (representación de barras y esferas de color gris claro) y la unidad de repetición LT2 de S. entérica (representación de barras de color gris oscuro) en el sitio activo, eligiéndose la posición de la unión con el péptido aceptor como punto fijo durante el modelado dinámico. La figura 2B representa una conformación a modo de ejemplo de OS de C. jejuni (representación de barras y esferas de color gris claro). La figura 2C representa una conformación a modo de ejemplo de la unidad de repetición LT2 de S. entérica (representación de barras de color gris oscuro). La estructura principal de PglBcj se muestra en color gris (cinta) y los grupos fosfato de la membrana como esferas de color gris claro. Los residuos que se encuentran en estrecha proximidad con respecto al OS natural se representan como representaciones de barras y esferas de color gris claro. Una línea discontinua ilustra la conectividad del bucle externo no estructurado EL5.
La figura 3 ilustra los resultados de un examen de DWP-ELISA a modo de ejemplo de una biblioteca de mutagénesis por saturación que aleatoriza el residuo N311 de PglBcj. La figura 3A muestra los resultados del examen usando la cepa huésped y anticuerpos de detección para los polisacáridos CP5 de S. aureus. La figura 3B muestra los resultados del examen usado la cepa huésped y anticuerpos de detección para los polisacáridos LT2 de S. enterica. Los círculos abiertos indican clones de biblioteca; los triángulos rellenos indican clones de control positivo que expresan PglB de tipo natural (pGVXN1413), los triángulos sombreados indican clones de control negativo que expresan PglBmut inactiva (pGVXN408). Los clones secuenciados están marcados por un elipsoide.
La figura 4 representa alineaciones de homólogos bacterianos de PglB (A) en la región EL5, incluyendo el motivo 287QLKFYxxR294 de C. jejuni y N311 de C. jejuni, y (B) en las proximidades de los residuos Y77/S80 de C. jejuni y K482/D843 de C. jejuni. Se usó PglB de C. jejuni como molde de búsqueda para proteínas en BLAST y las secuencias no redundantes se alinearon con el programa MegAlign™ usando el algoritmo ClustalW (DNASTAR, Madison, WI, EE.UU.). Los residuos de PglBCj conservados en las secuencias de otras especies están sombreados. Los residuos relevantes de C. jejuni se indican en la parte superior y los aminoácidos correspondientes en las secuencias homólogas de N-OST están recuadrados.
La figura 5 representa un gráfico que ilustra el efecto de sustituciones de aminoácido dentro los posibles residuos de PglBCj que interaccionan con azúcares, Y462, G476, G477 y H479, en la producción in vivo de CP5-EPA en cultivos en DWP inducidos durante la noche. Pocillos de referencia (valores del 100%, fondo corregido): pGVXN1050 (plásmido de molde de tipo natural). Se representan los números promedio y las desviaciones estándar de clones por triplicado por variante.
La figura 6 ilustra el efecto de la variante N322V de PglB sobre la formación de glicoproteínas en un matraz de agitación analizado mediante inmunotransferencia de tipo Western. La figura 6A ilustra los resultados obtenidos con LT2-EPA en la cepa huésped S. enterica SGSC228 (pGVXN150). La figura 6B ilustra los resultados obtenidos con CP5-EPA en la cepa huésped E. coli St1717 (pGVXN150, pGVXN393). La figura 6C ilustra los resultados obtenidos con O1-EPA en la cepa huésped E. coli CLM24 (pGVXN64, pGVXN150). La figura 6D ilustra los resultados obtenidos con EPA-OS de C. jejuni en la cepa huésped E. coli CLM24 (pACYC(pglmut), pGVXN150). Los mismos experimentos que los mostrados en la figura 5, extractos periplásmicos normalizados por biomasa, volúmenes de carga similares, muestras de un cultivo en matraz de agitación por variante. PglB de tipo natural: pGVXN970, N311V de PglB: pGVXN1217. Masa molecular teórica de EPA-6H no glicosilada: 69,4 kDa.
La figura 7 ilustra el efecto de la sustitución de aminoácido N311V de PglBCj sobre la glicosilación de EPA con tres polisacáridos heterólogos y oligosacáridos naturales. Símbolos abiertos: PglB de tipo natural (pGVXN970), símbolos cerrados; N311V de PglB (pGVXN1217). La figura 7A ilustra los resultados a modo de ejemplo obtenidos con la cepa huésped y anticuerpos de detección para polisacáridos CP5 de S. aureus. La figura 7B ilustra los resultados a modo de ejemplo obtenidos con la cepa huésped y anticuerpos de detección para polisacáridos LT2 de S. enterica sv. Thyphimurium. La figura 7C ilustra los resultados obtenidos con la cepa huésped y anticuerpos de detección para polisacáridos O1 de S. dysenteriae. La figura 7D ilustra los resultados obtenidos con la cepa huésped y anticuerpos de detección para oligosacáridos de C. jejuni. Se representan las señales de ELISA con corrección de fondo para extractos periplásmicos normalizados por biomasa de cultivos en matraz de agitación, valores promedio y desviaciones estándar de n = 3 repeticiones biológicas.
La figura 8 ilustra el efecto de N311V sobre la expresión de PglB con etiqueta de HA y la formación de CP5-EPA en un experimento en matraz de agitación. La figura 8A ilustra los resultados de un análisis de inmunotransferencia de tipo Western anti-HA de PglB-HA en una cepa huésped de E. coli St1717 (pGVXN150, pGVXN393). La figura 8B ilustra los resultados de un transcurso de tiempo de la formación de CP5-EPA analizada mediante ELISA de tipo sándwich de extractos periplásmicos normalizados por biomasa. Los símbolos abiertos representan los resultados para PglB-HA de tipo natural. Los símbolos cerrados representan los resultados para N311V de PglB-HA. Se muestran los valores promedio y las desviaciones estándar para n = 3 cultivos repetidos.
La figura 9 representa los resultados a modo de ejemplo de una tercera ronda de evolución dirigida de PglBCj, empleando la permutación al azar de mutaciones neutras y ligeramente beneficiosas. La figura 10A ilustra los resultados del examen de una biblioteca representativa de 96 pocillos. Los círculos abiertos ilustran clones de biblioteca; los triángulos rellenos ilustran N311V de PglB (plásmido molde pGVXN1418); los triángulos sombreados ilustran PglBmut inactiva (pGVXN408). La figura 10B ilustra una verificación de mejoras en DWP después de la retransformación. Se representan los valores promedio y las desviaciones estándar para n = 3 clones repetidos/pocillo por plásmido variante, tipo natural: pGVXN1413 y N311V: pGVXN1418. La figura 10C ilustra los resultados a modo de ejemplo de un análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western de proteínas purificadas por afinidad con Ni-NTA producidas con PglB de tipo natural (pGVXN970), N311V de PglB (pGVXN1217) o S80R-Q287P-N311V de PglB (clon de biblioteca 2B2) en matraces de agitación (volúmenes de carga similares, la concentración de proteína total (A280) se ajustó a to 2 mg ml-1). Peso molecular teórico de EPA-6H no glicosilada: 69,4 kDa.
La figura 10 representa los resultados del examen a modo de ejemplo para una biblioteca de PglBcy con los residuos aleatorizados K482 y D483 de PglBcy. Círculos abiertos: clones de biblioteca, triángulos cerrados: PglB-HA de tipo natural (pGVXN407), triángulos abiertos: PglB inactiva (pGVXN408). El clon Fa8_G10 que alberga la doble mutación K482R-D483H está marcado con un círculo.
La figura 11 muestra un gráfico de barras que ilustra que K482-D483H de PglBcy puede mejorar la producción de CP5-EPA en cultivos en matraz de agitación. Se prepararon extractos de proteínas periplásmicas normalizados por biomasa 4 h después de la inducción y después de la incubación durante la noche (o/n) y se analizaron mediante ELISA de tipo sándwich. Barras rellenas: PglBq -HA de tipo natural (pGVXN1 14), barras abiertas: K482R-D483H de PglBCj-HA (pGVXN635). Valores promedio y desviaciones estándar de n = 3 cultivos repetidos. Se restó la absorbancia de ELISA de fondo (PglB inactiva, pGVXN115).
La figura 12 muestra un análisis de inmunotransferencia de tipo Western que ilustra que K482-D483H de PglBcy puede mejorar la glicosilación de Hla de S. aureus con polisacáridos CP5 de S. aureus. Se muestra el análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western de proteínas periplásmicas después de la purificación con HisT rap. Se cargaron volúmenes similares de las fracciones de elución con las concentraciones de proteína más altas (A280).
5. ABREVIATURAS
La abreviatura “CP”, tal como se usa en el presente documento, significa “polisacárido capsular”.
La abreviatura “EL”, tal como se usa en el presente documento, significa “bucle externo”.
La abreviatura “N-OST”, tal como se usa en el presente documento, significa N-oligosacariltransferasa.
La abreviatura “PglBcy”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la N-OST PglB de Campylobacter yeyuni (c. yeyuni).
La abreviatura “PglBci”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la N-OST PglB de campylobacter lari (c. lari).
6. DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa (N-OST) modificada con una especificidad de sustrato modificada. Específicamente, en el presente documento se proporcionan N-OST modificados que pueden usar oligosacáridos o polisacáridos como sustratos para la N-glicosilación de proteínas en una secuencia consenso de N-glicosilación que no pueden usarse (o no pueden usarse a niveles detectables) por la forma de tipo natural de la N-OST. En determinadas realizaciones, la N-OST modificada puede usar un oligosacárido o polisacárido de este tipo para producir niveles detectables de una proteína transportadora N-glicosilada, por ejemplo, in vivo o in vitro. Los niveles de proteína transportadora glicosilada pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, ELISA, HPLC, CL-EM y similares; véase, por ejemplo, la sección 6.10, la sección 6.12 y los ejemplos 2-3). En algunas realizaciones, la producción de la proteína transportadora N-glicosilada se detecta mediante ELISA.
En algunas realizaciones, los niveles de proteína transportadora glicosilada son detectables si la proteína transportadora glicosilada puede detectarse en un ensayo con una señal que indica proteína transportadora glicosilada a niveles de más de dos o tres desviaciones estándar ( >2o o >3o) por encima del promedio o la mediana de la señal de fondo del ensayo, o más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, o más de 10 veces por encima de la señal de fondo del ensayo.
En algunas realizaciones, la señal de fondo del ensayo es el promedio la mediana de la señal del ensayo de experimentos de control negativo realizados en ausencia de una N-OST. En algunas realizaciones, la señal de fondo del ensayo es el promedio o la mediana de la señal del ensayo de experimentos de control negativo realizados en presencia de una N-OST de tipo natural.
En determinadas realizaciones, la proteína transportadora glicosilada puede detectarse a un nivel que está más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces por encima del nivel de fondo en un ensayo que detecta el bioconjugado (por ejemplo, en un ensayo ELISA, mediante HPLC, CL-EM; véanse también la sección 6.10 y la sección 6.12).
Una modificación en una N-OST proporcionada en el presente documento puede ubicarse dentro de una distancia especificada de la unidad de monosacárido en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora glicosilada que se une a la N-OST. Para confirmar que una modificación de este tipo da como resultado la especificidad de sustrato alterada, puede usarse cualquier ensayo de rutina para la glicosilación de proteínas. Una N-OST modificada de este tipo puede usarse para generar bioconjugados en células procariotas huésped tal como se describe en el presente documento. En el presente documento también se dan a conocer composiciones que comprenden los bioconjugados resultantes. En una realización específica, una N-OST modificada de este tipo puede usar un oligosacárido o polisacárido que carece de un azúcar sustituido con N-acetilo en el extremo reductor como sustrato para producir niveles detectables de una proteína transportadora glicosilada.
En algunas realizaciones, el mutante de N-oligosacariltransferasa recombinante puede aumentar el rendimiento de producción de bioconjugados hasta un nivel de más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces por encima del nivel de fondo en un ensayo que detecta el bioconjugado.
Los niveles de fondo en un ensayo que detecta un bioconjugado pueden ser, por ejemplo, el promedio o la mediana de una señal obtenida en experimentos de control que se realizan en ausencia de la N-OST o que se realizan usando N-OST de tipo natural.
6.1 N-oligosacariltransferasas
En un aspecto, en el presente documento se proporciona una N-oligosacariltransferasa (N-OST) recombinante, en la que la N-OST recombinante puede ligar de manera detectable un oligosacárido o un polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor a una proteína transportadora. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante comprende modificaciones de uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 0,5-10,0 A desde la unidad de monosacárido en el extremo reductor del componente de polisacárido de un producto de proteína transportadora glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y el producto de proteína transportadora glicosilada. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácido. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante comprende modificaciones de uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de polisacárido de un producto de proteína transportadora glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y el producto de proteína transportadora glicosilada. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácido. Véanse, por ejemplo, la figura 2 y la sección 6.3.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una N-OST recombinante que incluye modificaciones de uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 1,0-10,0 A desde la unidad de monosacárido en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante es una N-OST recombinante que incluye modificaciones de uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede ligar de manera detectable un oligosacárido o un polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor a una proteína transportadora. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácido. Véanse, por ejemplo, la figura 2 y la sección 6.3.
En algunas realizaciones, la distancia de 2,5-4,0 A es la distancia desde la primera unidad de monosacárido terminal en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido. En algunas realizaciones, la distancia de 2,5­ 4,0 A es desde la segunda unidad de monosacárido terminal en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido. En algunas realizaciones, la distancia de 2,5-4,0 A es desde la tercera unidad de monosacárido terminal en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido. En algunas realizaciones, la distancia de 2,5­ 4,0 A es desde un aminoácido conservado en el centro catalítico de la N-oligosacariltransferasa recombinante en el modelo estructural de un complejo de la N-oligosacariltransferasa recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada (por ejemplo, K522, N311, H 479, G476, Y462, G477, Y77, S80 o S199 de PglBcy), véase, por ejemplo, la figura 2).
En algunas realizaciones, la distancia de 0,5-10,0 A desde la unidad de monosacárido en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada es una distancia de entre aproximadamente 1,0 y 9,0 A, una distancia de entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 8,0 A, una distancia de entre aproximadamente 2,0 A y aproximadamente 6,0 A o una distancia de entre aproximadamente 2,5 A y 4,0 A. En algunas realizaciones, la distancia de 1,0-10,0 A desde la unidad de monosacárido en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada es una distancia de aproximadamente 1,0 A, de aproximadamente 1,5 A, de aproximadamente 2,0 A, de aproximadamente 2,5 A, de aproximadamente 3,0 A, de aproximadamente 3,5 A, de aproximadamente 4,0 A, de aproximadamente 4,5 A, de aproximadamente 5,0 A, de aproximadamente 5,5 A, de aproximadamente 6,0 A, de aproximadamente 6,5 A, de aproximadamente 7,0 A, de aproximadamente 7,5 A, de aproximadamente 8,0 A, de aproximadamente 8,5 A, de aproximadamente 9,0 A o de aproximadamente 10,0 A. Véanse, por ejemplo, la figura 2 y la sección 6.3.
Los ensayos para confirmar la actividad de las N-OST descritos en el presente documento los conocen bien los expertos en la técnica (por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia de tipo Western) e incluyen los ensayos descritos en las secciones 6.10 y 6.12. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante incluye modificaciones de uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada, la N-OST recombinante puede ligar de manera detectable el oligosacárido o el polisacárido que carece del N-acetil-azúcar en el extremo reductor a la proteína transportadora y la actividad de la N-OST puede confirmarse mediante un ensayo descrito en las secciones 6.10 o 6.12. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácido.
Los oligosacáridos y polisacáridos pueden incluir cualquier oligosacárido o polisacárido descrito en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.4.
Las proteínas transportadoras pueden comprender cualquier proteína transportadora descrita en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.5.
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante comprende modificaciones en, por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de una N-OST y el producto de proteína transportadora glicosilada.
En algunas realizaciones, al menos una o más modificaciones en el uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de una N-OST y el producto de proteína transportadora glicosilada está ubicada en un bucle periplásmico de un dominio transmembrana de la N-OST. En algunas realizaciones, el bucle periplásmico es el bucle externo grande 5 (EL5) de una N-OST. En algunas realizaciones, el bucle periplásmico es EL5 de PglBcy, de un homólogo de PglBcy, o de variantes de la misma que se producen de manera natural (véanse, por ejemplo, las figuras 4 y 9 para la lista de homólogos de PglBcy).
Las N-OST pueden incluir motivos de secuencia conservada, tales como el motivo QLKFYxxR. Véase, por ejemplo, la figura 9. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante comprende modificaciones en al menos un aminoácido en el motivo QLKFYxxR. En algunas realizaciones, el motivo QLKFYxxR es un motivo Q287LKFYxxR294 (véase, por ejemplo, PglBcy según la SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, la N-OST recombinante comprende modificaciones, por ejemplo, en al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco aminoácidos en el motivo QLKFYxxR. En algunas realizaciones, el motivo QLKFYxxR es el motivo QLKFYxxR de PglBcy, de un homólogo de PglBcy, o de variantes de la misma que se producen de manera natural.
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante comprende modificaciones de uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de una N-OST y la proteína transportadora N-glicosilada y comprende además modificaciones en uno o más aminoácidos en un motivo QLKFYxxR.
En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácido comprenden una sustitución de aminoácido. Un aminoácido puede sustituirse por un aminoácido proteinogénico natural o por un aminoácido artificial. En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácido comprenden una sustitución de un aminoácido no conservado (es decir, modificaciones de aminoácidos que no están conservadas entre las N-OST de diferentes organismos). En algunas realizaciones, el aminoácido no conservado está conservado en menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20% o menos del 10% de los miembros de la familia filogenética de N-oligosacariltransferasas. En algunas realizaciones, el aminoácido no conservado está conservado en aproximadamente entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 90%, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 80%, entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 70% o entre aproximadamente el 40% y aproximadamente el 60% de los miembros de la familia filogenética de N-oligosacariltransferasas.
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede aumentar la tasa de glicosilación in vivo o in vitro de una proteína transportadora con un polisacárido en entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 100 veces, en entre aproximadamente 5 veces y aproximadamente 80 veces, en entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 60 veces, en entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 20 veces o en entre aproximadamente 20 veces y aproximadamente 40 veces en comparación con la tasa de una forma de tipo natural de la N-OST recombinante. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede aumentar la tasa de glicosilación in vivo o in vitro de una proteína transportadora con un polisacárido en más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces en comparación con la tasa de una forma de tipo natural de la N-OST recombinante.
En algunas realizaciones, las tasas de glicosilación de la N-OST recombinante y la forma de tipo natural de la N-OST recombinante pueden compararse mediante la comparación de las tasas de glicosilación de la N-OST recombinante y la N-OST de tipo natural de una proteína transportadora con un polisacárido u oligosacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor.
En algunas realizaciones, la tasa de glicosilación de la N-OST recombinante de una proteína transportadora con un polisacárido u oligosacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor se compara con la tasa de glicosilación de una N-OST de tipo natural de una proteína transportadora con un polisacárido u oligosacárido que tiene un N-acetil-azúcar en el extremo reductor.
En algunas realizaciones, la tasa de glicosilación de la N-OST de tipo natural de una proteína transportadora con un polisacárido u oligosacárido que tiene un N-acetil-azúcar en el extremo reductor se define como una tasa relativa del 100%.
En algunas realizaciones, la tasa de glicosilación de la N-OST recombinante de una proteína transportadora con un polisacárido u oligosacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor es de al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, o al menos el 80% de la tasa relativa de una N-OST de tipo natural.
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede aumentar el rendimiento de glicosilación in vivo o in vitro de una proteína transportadora con un polisacárido en entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 100 veces, en entre aproximadamente 5 veces y aproximadamente 80 veces, en entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 60 veces, en entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 20 veces o en entre aproximadamente 20 veces y aproximadamente 40 veces en comparación con el rendimiento logrado con una forma de tipo natural de la N-OST recombinante. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede aumentar el rendimiento de glicosilación in vivo o in vitro de una proteína transportadora con un polisacárido en más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces en comparación con el rendimiento logrado con una forma de tipo natural de la N-OST recombinante.
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede producir un nivel de glicosilación in vivo o un nivel de glicosilación in vitro de la proteína transportadora de entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 70%, de entre aproximadamente el 3% y aproximadamente el 65%, de entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 60%, de entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 55%, de entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 50%, de entre aproximadamente el 15% y aproximadamente el 45%, de entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 40%, o de entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 35%. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede producir un nivel de glicosilación in vivo o un nivel de glicosilación in vitro de la proteína transportadora de al menos el 1%, al menos el 3%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65% o al menos el 70%.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora comprende dos o más secuencias consenso de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede glicosilar in vitro o in vivo todas las secuencias consenso de N-glicosilación en la proteína transportadora. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede glicosilar al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de todas las secuencias consenso de N-glicosilación en la proteína transportadora. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede glicosilar in vitro o in vivo entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 70%, entre el 20% y aproximadamente el 60%, o entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 50% de todas las secuencias consenso de N-glicosilación en una proteína transportadora.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora comprende una o más secuencias consenso de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es una población de proteínas transportadoras. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede glicosilar in vitro o in vivo al menos el 1%, al menos el 3%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65% o al menos el 70% de todas las secuencias consenso de N-glicosilación en las proteínas transportadoras de una población de proteínas transportadoras. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante puede glicosilar in vitro o in vivo entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 70%, entre el 20% y aproximadamente el 60%, o entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 50% de todas las secuencias consenso de N-glicosilación en las proteínas transportadoras de una población de proteínas transportadoras.
La N-OST recombinante puede proceder de cualquier organismo que tenga una N-OST. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante procede de un organismo eucariota. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante procede de un organismo procariota. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante procede de Campylobacter jejuni (C. jejuni), Campylobacter coli (C. coli), Campylobacter lari (C. lari), Campylobacter upsaliensis (C. upsaliensis), Campylobacter curvus (C. curvus), Campylobacter concisus (C. concisus), Campylobacter hominis (C. hominis), Campylobacter gracilis (C. gracilis), Campylobacter showae (C. showae), Sulfurimonas autotrophica (S. autotrophica), Sulfurimonas denitrificans (S. denitrificans), Sulfurospirillum deleyianum (S. deleyianum), Sulfuricurvum kujiense (S. kujiense), Nautilia profundicola (N. profundicola), Sulfuvorum sp. NBC37-1, Wolinella succinogenes (W. succinogenes), Caminibacter mediatlanticus (C. mediatlanticus), Nitratiruptor sp. SB155-2, Helicobacter pullorum (H. pullorum), Helicobacter Canadensis (H. Canadensis), Helicobacter winghamensis (Helicobacter winghamensis), Desulfurobacterium thermolithotr (D. thermolithotr), Desulfomicrobium baculatum (D. baculatum), Desulfovibrio vulgaris (D. vulgaris), Desulfovibrio alkaliphilus (D. alkaliphilus), Desulfohalobium retbaense (D. retbaense), Deferribacter desulfuricans (D. desulfuricans), Desulfovibrio salexigenes (D. salexigenes), Desulfovibrio piger (D. salexigenes), Desulfovibrio aespoeensis (D. aespoeensis), Cand. Puniceispirillum marinum, Calditerrivibrio nitroreducens (C. nitroreducens) o Metanothermus fervidus (M. fervidus).
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante se deriva de un organismo procariota del género Campylobacter. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante procede de Campylobacter jejuni o Campylobacter lari (por ejemplo, el producto génico de pglB, PglB, de C. jejuni, PglBCj, o de C. lari, PglBCl).
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante es una PglBCj recombinante, un homólogo de PglBCj recombinante o una versión recombinante de una variante de PglBCj que se produce de manera natural. Los homólogos de PglBCj pueden comprender homólogos de PglBCj que se producen de manera natural, por ejemplo, tal como se ejemplifica en las figuras 4 y 6, y homólogos de PglBCj que no se producen de manera natural. Los homólogos de PglBCj pueden comprender proteínas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con una PglBCj de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la N-OST recombinante es una PglBCl recombinante, un homólogo de PglBCl recombinante o una versión recombinante de una variante de PglBCl que se produce de manera natural. Los homólogos de PglBCl pueden comprender homólogos de PglBCl que se producen de manera natural, por ejemplo, tal como se ejemplifica en la figura 4, y homólogos de PglBCl que no se producen de manera natural. Los homólogos de PglBCl pueden comprender proteínas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con una PglBCl de SEQ ID NO: 2.
Algunas posiciones de aminoácidos están conservadas en diferentes miembros de una familia filogenética de N-OST. Véase, por ejemplo, la figura 4. Algunas posiciones de aminoácidos están conservadas en al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o en el 100% de los miembros de una familia filogenética de N-OST. En algunas realizaciones, los aminoácidos en posiciones de aminoácidos conservadas están modificados en las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento.
En algunas realizaciones, la N-OST modificada recombinante comprende un fragmento de PglB, por ejemplo, un fragmento de PglBCj o un fragmento de PglBCl. En algunas realizaciones, el fragmento de PglB comprende al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, al menos 500, al menos 550, al menos 600 o al menos 650 aminoácidos consecutivos de una PglB de longitud completa.
(a) Modificaciones de PglBcy
En algunas realizaciones, las N-OST modificadas descritas en el presente documento son N-OST de tipo natural modificadas, por ejemplo, PglBcy de tipo natural. En algunas realizaciones, la PglBcy de tipo natural es una PglBcy de tipo natural de SeQ ID NO: 1, o de una variante de la misma que se produce de manera natural:
MLKKEYLKNP YLVLFAMIIL AYVFSVFCRF YWVWWASEFN EYFFNNQLMI ISNDGYAFAE
GARDMIAGFH QPNDLSYYGS SLSALTYWLY KITPFSFESI ILYMSTFLSS LVVIPTILLA
NEYKRPLMGF VAALLASIAN SYYNRTMSGY YDTDMLVIVL PMFILFFMVR MILKKDFFSL
IALPLFIGIY LWWYPSSYTL NVALIGLFLI YTLIFHRKEK IFYIAVILSS LTLSNIAWFY
QSAIIVILFA LFALEQKRLN FMIIGILGSA TLIFLILSGG VDPILYQLKF YIFRSDESAN
LTQGFMYFNV NQTIQEVENV DLSEFMRRIS GSEIVFLFSL FGFVWLLRKH KSMIMALPIL
VLGFLALKGG LRFTIYSVPV MALGFGFLLS EFKAIMVKKY SQLTSNVCIV FATILTLAPV
F1HIYNYKAP TVFSQNEASL LNQLKNIANR EDYWTWWDY GYPVRYYSDV KTLVDGGKHL
GKDNFFPSFA LSKDEQAAAN MARLSVEYTE KSFYAPQNDI LKTDILQAMM KDYNQSNVDL
FLASLSKPDF KIDTPKTRDI YLYMPARMSL IFSTVASFSF INLDTGVLDK PFTFSTAYPL
DVKNGEIYLS NGVVLSDDFR SFKIGDNVVS VNSIVEINSI KQGEYKITPI DDKAQFYIFY
LKDSAIPYAQ FILMDKTMFN SAYVQMFFLG NYDKNLFDLV INSRDAKVFK LKIYPYDVPD
YA
En algunas realizaciones, uno o más de los aminoácidos Y77, S80, S196, N311, Y462, H479, K522, G476 o G477 de PglBcy, o cualquier combinación de los mismos, están modificados.
En algunas realizaciones, el aminoácido N311 de PglBcy está modificado. En algunas realizaciones, la modificación de N311 es una sustitución N311V o N311I. En algunas realizaciones, la modificación de N311 es una sustitución N311V. En algunas realizaciones, los aminoácidos N311 y Y77 de PglBcy están modificados. En algunas realizaciones, la modificación de Y77 es una sustitución Y77H, Y77T, Y77W, Y77R, Y77K, Y77A o Y77G. En algunas realizaciones, la modificación de Y77 es una sustitución Y77H.
En algunas realizaciones, los aminoácidos N311 y S80 de PglBcy están modificados. En algunas realizaciones, la modificación de S80 es una sustitución S80R o una sustitución s 80H. En algunas realizaciones, la modificación de S80 es una sustitución S80R.
En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una modificación en al menos un aminoácido del motivo Q287LKFYxxR294 de PglBcy. En algunas realizaciones, al menos un aminoácido de Q287, L288 o K289 de PglBcy está modificado. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución Q287P, Q287K, Q287R, L288M, L288F, L288I, L288C, K289R, K289N, K289Q o R294K.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V y una sustitución Y77H.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V y una sustitución S80R.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución Y77H y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución S80R y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V, una sustitución S80R y una sustitución Q287p .
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V, una sustitución Y77H y una sustitución Q287p .
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una mutación N311V, una sustitución Y77H, una sustitución S80r y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V, una sustitución Y77H, una sustitución S80R, una sustitución Q287P y una sustitución K289R.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución N311V y una sustitución A699V.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución K482R y una sustitución D483H.
En algunas realizaciones, la sustitución puede ser una sustitución de aminoácido conservativa (por ejemplo, de un aminoácido básico a otro aminoácido básico). En algunas realizaciones, la sustitución puede ser una sustitución de aminoácido no conservativa (por ejemplo, de un aminoácido básico a un aminoácido ácido).
(b) Modificaciones de PglBc/
En algunas realizaciones, las N-OST modificadas descritas en el presente documento son N-OST de tipo natural modificadas, por ejemplo, PglBc/ de tipo natural (PglB de Campy/obacter /ari). En algunas realizaciones, la PglBc/ de tipo natural es una PglBc/ de tipo natural de SEQ ID NO: 2, o de una variante de la misma que se produce de manera natural:
MKLQQNFTDN NSIKYTCILI LIAFAFSVLC RLYWVAWASE FYEFFFNDQL
MITTNDGYAF AEGARDMIAG FHQPNDLSYF GSSLSTLTYW LYSILPFSFE
SIILYMSAFF ASLIVVPIIL IAREYKLTTY GFIAALLGSI ANSYYNRTMS
GYYDTDMLVL VLPMLILLTF IRLTINKDIF TLLLSPVFIM IYLWWYPSSY
SLNFAMIGLF GLYTLVFHRK EKIFYLTIAL MIIALSMLAW QYKLALIVLL
FAIFAFKEEK INFYMIWALI FISILILHLS GGLDPVLYQL KFYVFKASDV
QNLKDAAFMY FNVNETIMEV NTIDPEVFMQ RISSSVLVFI LSFIGFILLC
KDHKSMLLAL PMLALGFMAL RAGLRFTIYA VPVMALGFGY FLYAFFNFLE
KKQIKLSLRN KNILLILIAF FSISPALMHI YYYKSSTVFT SYEASILNDL
KNKAQREDYV VAWWDYGYPI RYYSDVKTLI DGGKHLGKDN FFSSFVLSKE
QIPAANMARL SVEYTEKSFK ENYPDVLKAM VKDYNKTSAK DFLESLNDKD
FKFDTNKTRD VYIYMPYRML RIMPWAQFA NTNPDNGEQE KSLFFSQANA
IAQDKTTGSV MLDNGVEIIN DFRALKVEGA SIPLKAFVDI ESITNGKFYY
NEIDSKAQIY LLFLREYKSF VILDESLYNS SYIQMFLLNQ YDQDLFEQIT
NDTRAKIYRL KR
En algunas realizaciones, uno o más de los aminoácidos Y79, S82, N314, K488 o D489 de PglBc/, o cualquier combinación de los mismos, están modificados.
En algunas realizaciones, el aminoácido N314 de PglBc/ está modificado. En algunas realizaciones, la modificación de N314 es una sustitución N314V o N314I. En algunas realizaciones, la modificación de N314 es una sustitución N314V.
En algunas realizaciones, los aminoácidos N314 y Y797 de PglBc/ están modificados. En algunas realizaciones, la modificación de Y79 es una sustitución Y79H, Y79T, Y79W, Y79R, Y79K, Y79A o Y79G. En algunas realizaciones, la modificación de Y79 es una sustitución Y79H.
En algunas realizaciones, los aminoácidos N314 y S82 de PglBc/ están modificados. En algunas realizaciones, la modificación de S82 es una sustitución S82R o una sustitución S82H. En algunas realizaciones, la modificación de S82 es una sustitución S82R.
En algunas realizaciones, la PglBc/ recombinante comprende una modificación en al menos un aminoácido del motivo QLKFYxxR de PglBc/. En algunas realizaciones, al menos el aminoácido Q289 está modificado. En algunas realizaciones, la PglBc/ recombinante comprende una sustitución Q289P, Q289K o Q289R.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución N314V.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución N314V y una sustitución Y79H.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución N314V y una sustitución S82R.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución Y79H y una sustitución Q289P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución S82R y una sustitución Q289P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución N314V, una sustitución S82R y una sustitución Q289P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una sustitución N314V, una sustitución Y79H y una sustitución Q289P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona una PglBc/ recombinante que comprende una mutación N314V, una sustitución Y79H, una sustitución S82r y una sustitución Q289P.
En algunas realizaciones, la sustitución puede ser una sustitución de aminoácido conservativa (por ejemplo, de un aminoácido básico a otro aminoácido básico). En algunas realizaciones, la sustitución puede ser una sustitución de aminoácido no conservativa (por ejemplo, de un aminoácido básico a un aminoácido ácido).
6.2 Métodos de examen
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de examen de una biblioteca de N-OST recombinantes proporcionada en el presente documento, que incluye poner en contacto cada miembro de la biblioteca de N-OST recombinantes con una proteína transportadora y un oligosacárido o un polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en su extremo reductor para producir un bioconjugado.
En algunas realizaciones, el bioconjugado es una proteína transportadora N-glicosilada.
Los oligosacáridos y polisacáridos pueden incluir cualquier oligosacárido o polisacárido descrito en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.4.
Las proteínas transportadoras pueden comprender cualquier proteína transportadora descrita en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.5.
En algunas realizaciones, el contacto se produce in vitro. En algunas realizaciones, el contacto se produce in vivo. En algunas realizaciones, el contacto se produce en una célula huésped descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de E. co/i.
En algunas realizaciones, la biblioteca de N-OST recombinantes comprende una o más N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones, la biblioteca de N-OST recombinantes comprende al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 500, al menos 750 o al menos 1.000 N-OST recombinantes. En algunas realizaciones, la biblioteca de N-OST recombinantes comprende entre aproximadamente 2 y aproximadamente 1.000, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 800, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 600, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 400, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 N-OST recombinantes.
En algunas realizaciones, el método comprende además determinar la tasa o el rendimiento de producción del bioconjugado. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar el nivel de conjugación (por ejemplo, el nivel de glicosilación en porcentaje de proteína transportadora glicosilada) del bioconjugado. En la técnica se conocen métodos para determinar la tasa o el rendimiento de producción de un bioconjugado o el nivel de conjugación del bioconjugado. Véanse, por ejemplo, la sección 6.9, la sección 6.10, la sección 6.12 y los ejemplos 2­ 3.
En algunas realizaciones, el método comprende además seleccionar una o más N-OST recombinantes de la biblioteca de N-OST recombinantes.
En algunas realizaciones, la una o más N-OST recombinantes se seleccionan si la N-OST recombinante produce bioconjugado a una tasa que es entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 100 veces, entre aproximadamente 5 veces y aproximadamente 80 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 60 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 40 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 30 veces, o entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 20 veces más rápida que la tasa de una N-OST de tipo natural. En algunas realizaciones, la una o más N-OST recombinantes se seleccionan si la N-OST recombinante produce bioconjugado a una tasa que es más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces más rápida que la tasa de una N-OST de tipo natural.
En algunas realizaciones, la uno o más N-OST recombinantes se seleccionan si el mutante de N-OST produce entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 100 veces, entre aproximadamente 5 veces y aproximadamente 80 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 60 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 40 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 30 veces, o entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 20 veces la cantidad de bioconjugado en comparación con una N-OST de tipo natural. En algunas realizaciones, el uno o más mutantes de N-oligosacariltransferasa se seleccionan si el mutante de N-OST produce más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces la cantidad de bioconjugado en comparación con una N-OST de tipo natural.
En algunas realizaciones, la una o más N-OST recombinantes se seleccionan si la N-OST recombinante glicosila entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 70%, entre aproximadamente el 3% y aproximadamente el 65%, entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 60%, entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 55%, entre aproximadamente el 15% y aproximadamente el 50%, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 45%, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 40%, o entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 35% de la proteína transportadora in vitro (por ejemplo, en un recipiente de reacción) o in vivo (por ejemplo, en una célula huésped). En algunas realizaciones, la una o más N-OST recombinantes se seleccionan si la N-OST recombinante glicosila al menos el 1%, al menos el 3%, el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, o al menos el 70% de la proteína transportadora in vitro (por ejemplo, en un recipiente de reacción) o in vivo (por ejemplo, en una célula huésped).
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de identificación de una N-OST recombinante proporcionada en el presente documento que tiene una selectividad de sustrato modificada en relación con una forma de tipo natural de la N-OST recombinante, que incluye sustituir uno o más aminoácidos (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más aminoácidos) cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-OST recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada.
En algunas realizaciones, el mutante de N-OST tiene una selectividad de sustrato modificada in vitro. En algunas realizaciones, el mutante de N-OST tiene una selectividad de sustrato modificada in vivo.
6.3 Modelos estructurales
Los modelos estructurales usados para describir las N-OST recombinantes dadas a conocer en el presente documento comprenden un complejo de la N-OST recombinante y una proteína transportadora N-glicosilada unida y pueden obtenerse usando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, el modelo estructural puede obtenerse usando cristalografía de rayos X o espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN). Se describen métodos a modo de ejemplo para obtener modelos estructurales de complejos de proteínas, por ejemplo, en Bernhard Rupp, Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology, Garland Science, 1a edición (20 de octubre de 2009); Eaton E. Lattman y Patrick J. Loll; Protein Crystallography: A Concise Guide, Johns Hopkins University Press; 1a edición (26 de marzo de 2008); Arthur G. Palmer III y Wayne J. Fairbrother; Protein NMR Spectroscopy, Segunda Edición: Principles and Practice; Academic Press, 2a edición (28 de diciembre de 2005). El modelo estructural puede ser, por ejemplo, un modelo de estructura de rayos X o un modelo de estructura de RMN de un complejo de una N-OST y un transportador N-glicosilado unido. En algunas realizaciones, el modelo estructural puede ser un modelo de homología de un complejo de la N-OST recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada unida. Véanse, por ejemplo, el ejemplo 1 y la figura 2. Los componentes de oligosacárido o polisacárido y proteínas transportadoras de una proteína transportadora N-glicosilada pueden modelarse en una conformación de producto o en una conformación de sustrato.
Los modelos estructurales usados para describir las N-OST recombinantes dadas a conocer en el presente documento pueden comprender cualquier N-OST, cualquier proteína transportadora, o cualquier oligosacárido o polisacárido dado a conocer en el presente documento. Véanse, por ejemplo, las secciones 6.1, 6.4 y 6.5.
El modelo estructural puede comprender el modelo de una N-OST recombinante de longitud completa o de un fragmento de la misma. El modelo estructural puede construirse, por ejemplo, usando una N-OST recombinante, una N-OST recombinante de tipo natural, o una N-OST purificada a partir de un organismo que expresa N-OST. En algunas realizaciones, el modelo estructural comprende el sitio catalítico de la N-OST. El modelo estructural puede modelar una N-OST a partir de cualquier organismo que tenga una N-OST. El modelo estructural puede modelar cualquier N-OST recombinante descrita en el presente documento. Véase, por ejemplo, la figura 4. En algunas realizaciones, el modelo estructural es un modelo de homología generado usando la estructura resuelta experimentalmente de PglB de C. lari (PDBid 3RCE) como molde. Véase, por ejemplo, el ejemplo 1. El modelo estructural puede construirse usando el oligosacárido o polisacáridos y/o la proteína transportadora descritos en el presente documento. La N-OST,
la proteína transportadora y el componente de oligosacárido o polisacárido usados para construir el modelo estructural
pueden proceder todos del mismo organismo o de dos o tres organismos diferentes.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida comprende un componente de oligosacárido
o polisacárido natural (un componente de oligosacárido o polisacárido procedente del mismo organismo que la N-OST). En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida comprende un componente de
oligosacárido o polisacárido heterólogo (un componente de oligosacárido o polisacárido de un organismo diferente
que la N-OST). En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida comprende un componente
de oligosacárido o polisacárido natural de Campylobacter jejuni (C. jejuni; un componente de oligosacárido o
polisacárido de C. jejuni). En algunas realizaciones, la proteína transportadora N-glicosilada unida comprende un
componente de oligosacárido o polisacárido heterólogo de C. jejuni (un componente de oligosacárido o polisacárido
que no es de C. jejuni).
En el modelo estructural, las distancias físicas, por ejemplo, entre determinadas cadenas laterales de aminoácidos de
N-OST y la unidad de monosacárido en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una
proteína transportadora N-glicosilada unida, pueden determinarse usando cualquier método o herramienta de software
conocido por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Chang, G. et al., An internal coordinate Monte-Carlo Method
for Searching Conformational Space. J. Am. Chem. Soc, 1989, 111, 4379; Saunders, M., et al., Conformations of
cicloheptadecane: A Comparison of Methods for Conformational Searching. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1419.
6.4 Oligosacáridos y polisacáridos
Los oligosacáridos que pueden ligarse a una proteína transportadora mediante las N-OST recombinantes
proporcionadas en el presente documento pueden tener entre 2 y 100 unidades de monosacárido, por ejemplo, 2, 4,
6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 unidades de monosacárido. Los polisacáridos que pueden ligarse
a una proteína transportadora mediante las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento pueden
tener más de 100 unidades de monosacárido, por ejemplo, 101, 110, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,
1.000 unidades de monosacárido o más.
Las proteínas transportadoras o N-OST pueden comprender cualquier N-OST o cualquier proteína transportadora
dada a conocer en el presente documento. Véase, por ejemplo, las secciones 6.1 y 6.5.
En algunas realizaciones, el azúcar en el extremo reductor del oligosacárido o polisacárido es una pentosa, hexosa o
heptosa. En algunas realizaciones, el azúcar en el extremo reductor del oligosacárido o polisacárido es una
aldopentosa o una cetopentosa. En algunas realizaciones, la pentosa es una D-arabinosa, una D-lixosa, una D-ribosa,
una D-xilosa, una D-ribulosa o una D-xilulosa. En algunas realizaciones, el azúcar en el extremo reductor del
oligosacárido o polisacárido es una aldohexosa o una cetohexosa. En algunas realizaciones, la hexosa es, por
ejemplo, una D-alosa, D-altrosa, D-glucosa, D-manosa, D-gulosa, D-idosa, D-galactosa, D-talosa, D-psicosa, D-fructosa, D-sorbosa o D-tagatosa. En algunas realizaciones, el azúcar en el extremo reductor del oligosacárido o
polisacárido es un desoxi o un di-desoxi-azúcar, tal como, por ejemplo, una ramnosa, una fucosa o una abecuosa. En
algunas realizaciones, el azúcar en el extremo reductor del oligosacárido o polisacárido es una aldoheptosa o una
cetoheptosa. En algunas realizaciones, la heptosa es una manoheptulosa.
Los oligosacáridos y polisacáridos que puede ligarse a una proteína transportadora mediante las N-OST
recombinantes proporcionadas en el presente documento pueden proceder de cualquier organismo, por ejemplo, un
organismo procariota o un organismo eucariota. En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido procede de
un organismo patógeno, por ejemplo, un patógeno de ser humano o un patógeno de animal (por ejemplo, de un animal
de granja o una mascota). En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido procede de un organismo
bacteriano. En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido puede proceder de E. coli, Salmonella sp (por
ejemplo, S. enterica subsp. Enterica, S. enterica subsp. Salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp.
Diarizonae, S. enterica subsp. Houtenae, S. bongori, y S. enterica subsp. Indica, Pseudomonas sp (P. aeruginosa),
Klebsiella sp. (por ejemplo, K. pneumonia), Acinetobacter, Chlamydia trachomatis, Vibrio cholera, Listeria sp., por
ejemplo, L. monocytogenes, Legionella pneumophila, Bordetella parapertussis, Burkholderia mallei y pseudomallei,
Francisella tularensis, Campylobacter sp. (C. jejuni); Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Streptococcus
pyrogenes, E. coli, Streptococcus agalacticae, Neisseria meningitidis, Candida albicans, Haemophilus influenza,
Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, Leishmania major.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un antígeno, por ejemplo, un epítopo que es
inmunogénico en un ser humano o un animal (por ejemplo, un animal de granja o una mascota). En algunas
realizaciones, el oligosacárido o el polisacárido comprende un antígeno O de E. coli (por ejemplo, O1, O2, O3, O4,
O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27,
O43, O44, O45, O65, O66, O68,
Figure imgf000020_0001
O88, O89, O90, O96, O97, O98, O99, O100, O101, 0102, 0103, 0104, 0105, 0106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113,
O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, O187), antígenos O y tipos 1-67 de Salmonella sp (S. entérica subsp. Entérica, S. entérica subsp. Salamae, S. entérica subsp. arizonae, S. entérica subsp. diarizonae, S. entérica subsp. houtenae, S. bongori, o S. entérica subsp. indica, tal como se detalla en [44], Pseudomonas sp. (serotipos 1-20 de O de P. aeruginosa [45]), Klebsiella sp. (por ejemplo, serotipos O1, O2 de K. pneumonia (y subserotipos), O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, 011, O12, [46]), antígenos O de Acinetobacter (por ejemplo, antígenos O de A. baumannii identificados en [47]), antígenos O de Chlamydia trachomatis (serotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I J, K, LI, L2, L3), antígenos O, de O1 a 155, de Vibrio cholera, tipo 1, 2, 3, 4 y subserotipos de los mismos de Listeria sp., en particular de L. monocytogenes, antígenos O, serotipos 1 a 15 de Legionella pneumophila, antígenos O de Bordetella parapertussis, antígenos O de Burkholderia mallei y pseudomallei, Francisella tularensis, Campylobacter sp. (C. jejuni); polisacáridos capsulares de Clostridium difficile (serotipos A, G, H, K, S1, S4, D, Cd-5, K Toma et al. 1988, y serotipos A, B, C, D y E de C. perfringens), tipo 5 y 8 de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes (polisacáridos de serotipo capsular de estreptococo del grupo B), E. coli, Streptococcus agalacticae (polisacáridos capsulares de estreptococo del grupo A), Neisseria meningitidis (serotipos A, B, C, W, Y, X), Candida albicans, Haemophilus influenza, polisacáridos capsulares de tipo I-V de Enterococcus faecalis; y otras estructuras de polisacárido de superficie, por ejemplo, los glicolípidos de Borrelia burgdorferi ([48]), el glicano O [49, 50] y el lipooligosacárido (LOS) de Neisseria meningitidis pilin, LOS de Haemophilus influenza, lipofosfoglicano [51, 52] de Leishmania major), antígenos de hidratos de carbono asociados con tumores (glicosilfosfatidilinositol de la malaria, arabinomanano de Mycobacterium tuberculosis [53].
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido es un polisacárido de Staphylococcus aureus (S. aureus) o de Salmonella entérica sv. (S. entérica sv.). En algunas realizaciones, el polisacárido es el polisacárido CP5 de S. aureus o el polisacárido LT2 de S. entérica sv. Typhimurium.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un N-acetil-azúcar en el extremo reductor. En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido que comprende el N-acetil-azúcar en el extremo reductor puede comprender, por ejemplo, un antígeno O de E. coli (por ejemplo, O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, 012, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, O187), un polisacárido capsular de Staphylococcus aureus (S. aureus) (por ejemplo, CP5 o CP8), un polisacárido capsular de Francisella tularensis Schu4, un polisacárido capsular de S. pneumoniae capsules (por ejemplo, CP1, 4, 5, 12, 25, 38, 44, 45 o 46), un glicano O de Neisseria meningitidis pilin [49, 50], un antígeno O de Burkholderia mallei y pseudomallei, un antígeno O de Bordetella parapertussis, un antígeno O, serotipos 1 a 15 de Legionella pneumophila, un antígeno O de Listeria sp., en particular un antígeno O de L. monocytogenes tipo 1, 2, 3, 4, un antígeno O de Pseudomonas sp. (serotipos de 1-20 de O de P. aeruginosa [45]), un antígeno O de Klebsiella sp. (por ejemplo, serotipos O1, O2 (y subserotipos), O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, o 10, O11, O12 de K. pneumonia, [46]), un antígeno O de Shigella sp. (por ejemplo, S. dysenteriae, S. sonnei, S. flexneri, S. boydii), un antígeno O de Acinetobacter (por ejemplo, antígenos O de A. baumannii identificados en [47]), o un antígeno O de Listeria sp.
Los N-acetil-azúcares pueden comprender un sustituyente amino-acetilo (N-acetil) en uno o más átomos de carbono del azúcar. Por ejemplo, un N-acetil-azúcar puede comprender un sustituyente N-acetilo en el átomo C2 de una unidad de monosacárido, tal como una unidad de glucosa (N-acetilglucosamina).
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un azúcar en el extremo reductor que no está N-acetilado. En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido que comprende el azúcar no N-acetilado en el extremo reductor puede comprender, por ejemplo, O20 de E. coli, un antígeno de Salmonella sp (por ejemplo, S. entérica subsp. Enterica, S. entérica subsp. Salamae, S. entérica subsp. arizonae, S. entérica subsp. diarizonae, S. entérica subsp. houtenae, S. bongori, o S. enterica subsp. Indica o S. Typhi), un antígeno O de tipo 1-67, un polisacárido capsular de estreptococos del grupo A (S. pyrogenes), de estreptococos del grupo B, y los serotipos CSP de S. pneumoniae (que codifican para wchA, wcjG o wcjH en sus grupos de genes capsulares, es decir todos los serotipos excepto CP1, 4, 5, 12, 25, 38, 44, 45, 46), o un antígeno O de Salmonella enterica sv. (S. enterica sv.).
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un polisacárido CP5 de S. aureus o LT2 de S. enterica sv. Typhimurium, un antígeno O de Vibrio cholera (por ejemplo, de O1 a 155), o un antígeno O de Listeria sp. (por ejemplo, tipo 1, 2, 3, 4 de L. monocytogenes).
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un residuo de D-N-acetilfucosamina (D-FucNAc) en su extremo reductor, tal como, por ejemplo, polisacáridos capsulares, serotipos 5, 8, de S. aureus o antígeno O, serotipos O2, O5, O11, O16 de P. aeruginosa.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un residuo de 4-amino-d-N-acetilfucosamina (D-FucNAc4N) en su extremo reductor, tal como, por ejemplo, determinados oligosacáridos o polisacáridos de S. pneumoniae, como el serotipo 1, el antígeno O de Shigella sonnei, u O17 de Plesiomonas shigelloides.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un residuo de D-N-acetilquinosamina (D-QuiNAc) en su extremo reductor, tal como, por ejemplo, el antígeno O, serotipos O6, O1 de P. aeruginosa, o el serotipo Schu4 de Francisella tularensis.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un residuo de galactosa en su extremo reductor, tal como, por ejemplo, LT2 de S. enterica.
En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido comprende un polisacárido capsular serotipo 5 de S. pneumoniae, O1, O2 de E. coli, O5 de Cronobacter sakazakii, es decir, polisacárido y oligosacárido con un extremo reductor D-GlcNAc unido en 1-4 a una L-ramnosa en configuración beta.
6.5 Proteínas transportadoras
Las proteínas transportadoras pueden ligarse a oligosacáridos o polisacáridos mediante las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.1.
La proteína transportadora puede ser cualquier proteína transportadora natural (procedente del mismo organismo que la N-OST) o cualquier proteína transportadora heteróloga (de un organismo diferente que la N-OST). En algunas realizaciones, la proteína transportadora es un inmunógeno. Las proteínas transportadoras pueden ser proteínas de longitud completa o fragmentos de las mismas. Las proteínas transportadoras a modo de ejemplo comprenden, sin limitación, exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A detoxificada de S. aureus, factor de aglutinación A, factor de aglutinación B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes detoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes detoxificadas de la toxina colérica, proteína sat de E. coli, el dominio pasajero de la proteína sat de E. coli, AcrA de C. jejuni y glicoproteínas naturales de C. jejuni. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es exotoxina A de P. aeruginosa (EPA).
En algunas realizaciones, las proteínas transportadoras N-glicosiladas por una N-OST recombinante descritas en el presente documento se modifican, por ejemplo, se modifican de tal manera que la proteína sea menos tóxica y/o más susceptible a glicosilación, etc. En algunas realizaciones, las proteínas transportadoras se modifican de manera que el número de sitios de glicosilación en las proteínas transportadoras se maximice de manera que permita que se administren concentraciones más bajas de la proteína, por ejemplo, en una composición inmunogénica, en su forma bioconjugada. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras descritas en el presente documento se modifican para comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sitios de glicosilación que normalmente estarían asociados con la proteína transportadora (por ejemplo, en relación con el número de sitios de glicosilación asociados con la proteína transportadora en su estado nativo/natural, por ejemplo, “de tipo natural”). En algunas realizaciones, la introducción de sitios de glicosilación se lleva a cabo mediante la inserción de secuencias consenso de glicosilación (por ejemplo, (i) la secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) la secuencia consenso D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro) en cualquier parte de la estructura primaria de la proteína. La introducción de tales sitios de glicosilación puede llevarse a cabo, por ejemplo, añadiendo nuevos aminoácidos a la estructura primaria de la proteína (los sitios de glicosilación se añaden en su totalidad o en parte), o modificando aminoácidos existentes en la proteína con el fin de generar los sitios de glicosilación (no se añaden aminoácidos a la proteína, sino que aminoácidos seleccionados de la proteína se mutan para formar sitios de glicosilación). Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia de aminoácidos de una proteína puede modificarse fácilmente usando enfoques conocidos en la técnica, por ejemplo, enfoques recombinantes que comprenden la modificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína. En realizaciones específicas, se introducen secuencias consenso de glicosilación en regiones específicas de la proteína transportadora, por ejemplo, en estructuras de superficie de la proteína, en los extremos N o C-terminal de la proteína, y/o en bucles que se estabilizan mediante puentes disulfuro en la base de la proteína. En determinadas realizaciones, la secuencia consenso de glicosilación clásica de 5 aminoácidos puede extenderse mediante residuos de lisina para una glicosilación más eficaz, y por tanto, la secuencia consenso insertada puede codificar para 5, 6 o 7 aminoácidos que deben insertarse o que reemplazan a los aminoácidos de la proteína aceptora.
Las N-OST pueden comprender cualquier N-OST dada a conocer en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.1.
En algunas realizaciones, las proteínas transportadoras comprenden una “etiqueta”, una secuencia de aminoácidos que permite el aislamiento y/o la identificación de la proteína transportadora. Por ejemplo, añadir una etiqueta a una proteína transportadora descrita en el presente documento puede ser útil en la purificación de esa proteína y, por tanto, en la purificación de vacunas conjugadas que comprenden proteína transportadora con etiqueta. Las etiquetas a modo de ejemplo que pueden usarse en el presente documento comprende, sin limitación, etiquetas de histidina (HIS) (por ejemplo, etiqueta de hexahistidina, o etiqueta de 6XHis), etiquetas de FLAG-TAG y HA. En determinadas realizaciones, las etiquetas usadas en el presente documento pueden eliminarse, por ejemplo, eliminarse mediante agentes químicos o mediante medios enzimáticos, una vez que ya no son necesarias, por ejemplo, una vez que la proteína se ha purificado.
6.6 Ácidos nucleicos
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, la sección 6.1).
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican para una PglBcy recombinante en la que uno o más de los aminoácidos Y77, S80, S196, N311, Y462, H479, K522, G476 o G477 están modificados.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican para una PglBcy en la que el aminoácido N311 de PglBcy está modificado. En algunas realizaciones, la modificación de N311 es una sustitución N311V o N311I. En algunas realizaciones, la modificación de N311 es una sustitución N311V.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican para una PglBcy recombinante en la que los aminoácidos N311 y Y77 están modificados. En algunas realizaciones, la modificación de Y77 es una sustitución Y77H, Y77T, Y77W, Y77R, Y77K, Y77A o Y77G. En algunas realizaciones, la modificación de Y77 es una sustitución Y77H.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican para una PglBcy recombinante en la que los aminoácidos N311 y S80 de PglBcy están modificados. En algunas realizaciones, la modificación de S80 es una sustitución S80R o una sustitución S80H. En algunas realizaciones, la modificación de S80 es una sustitución S80R.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican para una PglBcy recombinante en la que la PglBcy recombinante comprende una modificación en al menos un aminoácido del motivo Q287LKFYxxR294 de PglBcy. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican para una PglBcy recombinante en la que al menos un aminoácido de Q287, L288 o K289 de PglBcy está modificado. En algunas realizaciones, la PglBcy recombinante comprende una sustitución Q287P, Q287K, Q287R, L288M, L288F, L288I, L288C, K289R, K289N, K289Q o R294K.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V y una sustitución Y77H.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V y una sustitución S80R.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución Y77H y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución S80R y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V, una sustitución S80R y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V, una sustitución Y77H y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una mutación N311V, una sustitución Y77H, una sustitución S80R y una sustitución Q287P.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V, una sustitución Y77H, una sustitución S80R, una sustitución Q287P y una sustitución K289R.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución N311V y una sustitución A699V.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica para una PglBcy recombinante que comprende una sustitución K482R y una sustitución D483H.
6.7 Células huésped
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una célula huésped que comprende una N-OST recombinante proporcionada en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende dos o más N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más N-OST recombinantes).
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico proporcionado en el presente documento (por ejemplo, que codifica para una N-OST recombinante proporcionada en el presente documento, por ejemplo, sección 6.1). Véase, por ejemplo, la sección 6.6. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende dos o más ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ácidos nucleicos).
En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una o más enzimas adicionales útiles para la producción de bioconjugados o la N-glicosilación de proteínas transportadoras (por ejemplo, una glicosiltransferasa). En algunas realizaciones, al menos una de las enzimas adicionales útiles para producción de bioconjugados es una enzima recombinante. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende dos o más enzimas adicionales útiles para la producción de bioconjugados (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enzimas adicionales).
En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de E. coli. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una N-OST recombinante proporcionada en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.1. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una proteína transportadora y una N-OST recombinante proporcionada en el presente documento. Véase, por ejemplo, las secciones 6.1 y 6.5. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una proteína transportadora, una N-OST recombinante proporcionada en el presente documento, y una glicosiltransferasa recombinante. En algunas realizaciones, la N-OST recombinante es una PglBcy recombinante. Véase, por ejemplo, la sección 6.1(a).
En determinadas realizaciones, las células huésped usadas para producir los bioconjugados descritos en el presente documento se modifican por ingeniería para comprender ácidos nucleicos heterólogos, por ejemplo, ácidos nucleicos heterólogos que codifican para una o más proteínas transportadoras y/o ácidos nucleicos heterólogos que codifican para una o más proteínas, por ejemplo, genes que codifican para una o más proteínas. En algunas realizaciones, se introducen ácidos nucleicos heterólogos que codifican para proteínas implicadas en rutas de glicosilación (por ejemplo, rutas de glicosilación procariotas y/o eucariotas) en las células huésped descritas en el presente documento. Tales ácidos nucleicos pueden codificar para proteínas incluyendo, sin limitación, oligosacariltransferasas y/o glicosiltransferasas. Pueden introducirse ácidos nucleicos heterólogos (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican para proteínas transportadoras y/o ácidos nucleicos que codifican para otras proteínas, por ejemplo, proteínas implicadas en glicosilación) en las células huésped descritas en el presente documento usando cualquier método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, electroporación, transformación química por choque térmico, transformación natural, transducción en fagos y conjugación. En algunas realizaciones, se introducen ácidos nucleicos heterólogos en las células huésped descritas en el presente documento usando un plásmido, por ejemplo, los ácidos nucleicos heterólogos se expresan en las células huésped mediante un plásmido (por ejemplo, un vector de expresión). En algunas realizaciones, se introduce ácidos nucleicos heterólogos en las células huésped descritas en el presente documento usando el método de inserción descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2014/057109.
En determinadas realizaciones, pueden introducirse modificaciones adicionales (por ejemplo, usando técnicas recombinantes) en las células huésped descritas en el presente documento. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de las células huésped (por ejemplo, genes) que codifican para proteínas que forman parte de una ruta de glicosilación posiblemente competidora o que interfiere (por ejemplo, compite o interfiere con uno o más genes heterólogos implicados en glicosilación que se introducen de manera recombinante en la célula huésped) pueden delecionarse o modificarse en el trasfondo de la célula huésped (genoma) de manera que la vuelva inactiva/disfuncional (es decir, los ácidos nucleicos de las células huésped que se delecionan/modifican no codifican para una proteína funcional o no codifican para una proteína en absoluto). En determinadas realizaciones, cuando los ácidos nucleicos se delecionan del genoma de las células huésped proporcionadas en el presente documento, se reemplazan por una secuencia deseable, por ejemplo, una secuencia que es útil para la producción de glicoproteínas.
Genes a modo de ejemplo que puede delecionarse en células huésped (y, en algunos casos, reemplazarse por otras secuencias deseadas de ácido nucleico) incluyen genes de células huésped implicados en la biosíntesis de glicolípidos, tales como como waaL (véase, por ejemplo, Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), grupo de biosíntesis de núcleo de lípido A (waa), grupo de galactosa (gal), grupo de arabinosa (ara), grupo de ácido colónico (wc), grupo de polisacárido capsular, genes de biosíntesis de undecaprenol-p (por ejemplo uppS, uppP), genes de reutilización de und-P, enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de azúcares activada por nucleótidos, grupo de antígenos comunes enterobacterianos, y grupos de modificación de antígeno O de profagos como el grupo gtrABS.
Las células huésped descritas en el presente documento pueden producir las proteínas transportadoras N-glicosiladas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, las proteínas transportadoras N-glicosiladas producidas por las células huésped descritas en el presente documento son antígenos, por ejemplo, antígenos virales o bacterianos que pueden usarse en vacunas. En algunas realizaciones, las proteínas transportadoras N-glicosiladas producidas por las células huésped descritas en el presente documento pueden ser cualquier proteína transportadora descrita en el presente documento, en las que dichas proteínas transportadoras se modifican por las células huésped descritas en el presente documento para que posean una o más características beneficiosas, por ejemplo, la proteína transportadora se N-glicosila.
Algunos de los ejemplos a continuación describen la aplicación de los métodos descritos en el presente documento en células huésped de E. coli Gram negativas; sin embargo, podría usarse cualquier célula huésped conocida por los expertos en la técnica para producir proteínas transportadoras N-glicosiladas, incluyendo arqueas, células procariotas huésped distintas de E. coli, y células huésped eucariotas.
Células huésped procariotas a modo de ejemplo que pueden usarse según los métodos descritos en el presente documento comprenden, sin limitación, especies de Escherichia, especies de Shigella, especies de Klebsiella, especies de Xhantomonas, especies de Salmonella, especies de Yersinia, especies de Lactococcus, especies de Lactobacillus, especies de Pseudomonas, especies de Corynebacterium, especies de Streptomyces, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, especies de Bacillus y especies de Clostridium.
En determinadas realizaciones, las células huésped descritas en el presente documento comprenden un genoma en el que se ha introducido una o más secuencias de ADN, en el que las secuencias de ADN codifican para una proteína o comprenden un grupo de operón/gen implicado en la N-glicosilación de proteínas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una célula huésped descrita en el presente documento comprende un genoma en el que se ha insertado uno o más de los siguientes: ADN que codifica para una N-OST, ADN que codifica para una glicosiltransferasa, ADN que codifica para una proteína transportadora, ADN que comprende un grupo de genes rfb, ADN que comprende para un grupo de genes de polisacárido capsular, y/o ADN que codifica para una epimerasa.
Las células huésped pueden incluir N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento o ácidos nucleicos que codifican para las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento, por lo que las N-OST recombinantes pueden proceder de cualquier organismo que tenga N-OSt , incluyendo un organismo eucariota o un organismo procariota. En algunas realizaciones, la proteína N-OST o el ácido nucleico que codifica para N-OST procede del género Campylobacter (por ejemplo, el gen pglB de C. jejuni).
Las células huésped descritas en el presente documento pueden comprender una glicosiltransferasa conocida en la técnica o una secuencia de ácido nucleico que codifica para una glicosiltransferasa conocida en la técnica. En algunas realizaciones, la glicosiltransferasa es una glicosiltransferasa descrita en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2011/13836.
En algunas realizaciones, la glicosiltransferasa procede de una bacteria Gram positiva, por ejemplo, la glicosiltransferasa procede de S. aureus. En algunas realizaciones, la glicosiltransferasa es el polisacárido capsular 5 de S. aureus. En algunas realizaciones, la glicosiltransferasa es el polisacárido capsular 8 de S. aureus. En algunas realizaciones, la glicosiltransferasa procede de una bacteria Gram negativa, por ejemplo, E. coli. En algunas realizaciones, la glicosiltransferasa procede de un eucariota.
Las células huésped descritas en el presente documento pueden comprender o producir una proteína transportadora conocida en la técnica o comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína transportadora conocida en la técnica. Las proteínas transportadoras producidas por las células huésped descritas en el presente documento comprenden al menos una secuencia consenso de N-glicosilación, por ejemplo, o bien la secuencia consenso (i) Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro. Por consiguiente, la célula huésped puede comprender secuencias de ADN que codifican para una secuencia consenso de N-glicosilación. La célula huésped puede incluir cualquier proteína transportadora conocida en la técnica, incluyendo las proteínas transportadoras descritas en la sección 5.5. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es una exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), incluyendo EPA que se ha modificado para comprender al menos una secuencia consenso de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es la toxina colérica B. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es AcrA. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es H1A. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es ClfA.
6.8 Bioconjugados
Los bioconjugados descritos en el presente documento con conjugados entre una proteína (por ejemplo, cualquier proteína transportadora descrita en el presente documento; por ejemplo, la sección 6.5) y un oligosacárido o un polisacárido (por ejemplo, cualquier oligosacárido o polisacárido descrito en el presente documento; véase, por ejemplo, la sección [00201]) preparado en una célula huésped, en los que la maquinaria de la célula huésped une el oligosacárido o polisacárido a la proteína (por ejemplo, enlaces de N). En algunas realizaciones, el oligosacárido o polisacárido es un antígeno (por ejemplo, cualquier antígeno descrito en el presente documento; véase, por ejemplo, la sección 6.4). Los glicoconjugados pueden incluir bioconjugados, así como conjugados de antígeno de azúcar (por ejemplo, oligosacáridos y polisacáridos)-proteína preparados mediante otros medios, por ejemplo, mediante unión química de la proteína y el antígeno de azúcar.
Las N-OST recombinantes descritas en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 6.1) pueden usarse para producir células huésped que producen bioconjugados que comprende una proteína transportadora N-glicosilada. En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan bioconjugados que incluyen una proteína transportadora N-glicosilada con un antígeno (por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido) descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es EPA. Los bioconjugados descritos en el presente documento pueden comprender, por ejemplo y sin limitación, cualquier proteína transportadora descrita en el presente documento. Los bioconjugados descritos en el presente documento pueden comprender, por ejemplo y sin limitación, cualquier oligosacárido o polisacárido descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína transportadora glicosilada heteróloga de C. jejuni es exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (EPA)-O1 de S. dysenteriae (EPA-O1), EPA-polisacárido capsular de tipo 5 de S. aureus (EPA-CP5) o EPA-LT2 de Salmonella enterica (S. enterica) (EPA-LT2).
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que incluye EPA y uno o más oligosacáridos o polisacáridos diferentes descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que incluye una proteína transportadora conjugada con uno o más de O1, O2, O4, o 6, O7, O8, O11, 015, 016, 017, 018, O20, O22, o 25, O73, O75 y/u O83 de E. coli. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es EPA.
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que incluye una proteína transportadora conjugada con uno o más polisacáridos diferentes de P. aeruginosa. En algunas realizaciones, la proteína transportadora es EPA.
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende una proteína transportadora conjugada con uno o más polisacáridos diferentes de K. pneumonia. En una realización específica, la proteína transportadora es EPA.
6.9 Métodos para producir un bioconjugado
En algunas realizaciones, las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 6.1) pueden usarse para producir un bioconjugado proporcionado en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 6.8), tal como un glicoconjugado. En algunas realizaciones, las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento pueden usarse para producir vacunas de conjugado, es decir vacunas que contienen un oligosacárido o polisacárido (véase, por ejemplo, la sección 5.4) y un antígeno proteico del patógeno contra el que se diseña la vacuna.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de producción de un bioconjugado que incluye cultivar una célula huésped proporcionada en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 6.7) en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica para una N-OST modificada recombinante proporcionada en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 6.1 y la sección 6.6). En algunas realizaciones, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica para una proteína transportadora descrita en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 6.5 y la sección 6.6). En algunas realizaciones, la proteína transportadora tiene una o más secuencias consenso de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica para una glicosiltransferasa (véase, por ejemplo, la sección 6.6 y la sección 6.7).
En algunas realizaciones, el bioconjugado es una proteína transportadora N-glicosilada. La proteína transportadora N-glicosilada puede comprender un componente de oligosacárido o polisacárido que incluye cualquier oligosacárido o polisacárido descrito en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección [00201]. La proteína transportadora N-glicosilada puede comprender cualquier proteína transportadora descrita en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 6.5. En algunas realizaciones, el bioconjugado es un polipéptido N-glicosilado natural de C. jejuni (incluyendo un componente de oligosacárido o polisacárido de C. jejuni y una proteína transportadora de C. jejuni). En algunas realizaciones, el bioconjugado es un polipéptido glicosilado heterólogo de C. jejuni (incluyendo un componente de polisacárido y/o una proteína transportadora que no procede de C. jejuni). En algunas realizaciones, el polipéptido glicosilado no tiene un N-acetil-azúcar en su extremo reductor. En algunas realizaciones, el polipéptido glicosilado tiene una galactosa en su extremo reductor.
En algunas realizaciones, el bioconjugado se produce a una tasa más rápida comparada de entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 100 veces, entre aproximadamente 5 veces y aproximadamente 80 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 60 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 20 veces o entre aproximadamente 20 veces y aproximadamente 40 veces cuando se usa una célula huésped que incluye una N-OST recombinante de esta divulgación que cuando se usa una célula huésped que incluye una forma de tipo natural de la N-OST recombinante. En algunas realizaciones, el bioconjugado se produce a una tasa más rápida de más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces cuando se usa una célula huésped que incluye una N-OST recombinante de esta divulgación que cuando se usa una célula huésped que incluye una forma de tipo natural de la N-OST recombinante.
En algunas realizaciones, el bioconjugado se produce a un rendimiento mayor comparado de entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 100 veces, entre aproximadamente 5 veces y aproximadamente 80 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 60 veces, entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 20 veces o entre aproximadamente 20 veces y aproximadamente 40 veces cuando se usa una célula huésped que incluye una N-OST recombinante de esta divulgación que cuando se usa una célula huésped que incluye una forma de tipo natural de la N-OST recombinante. En algunas realizaciones, el bioconjugado se produce a un rendimiento mayor de más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 6 veces, más de 7 veces, más de 8 veces, más de 9 veces, más de 10 veces, más de 11 veces, más de 12 veces, más de 13 veces, más de 14 veces, más de 15 veces, más de 17 veces, más de 20 veces, más de 25 veces, más de 30 veces, más de 35 veces, más de 40 veces, más de 45 veces, más de 50 veces, más de 60 veces, más de 70 veces, más de 80 veces, más de 90 veces o más de 100 veces cuando se usa una célula huésped que incluye una N-OST recombinante de esta divulgación que cuando se usa una célula huésped que incluye una forma de tipo natural de la N-OST recombinante.
En algunas realizaciones, se glicosila entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 70%, entre aproximadamente el 3% y aproximadamente el 65%, entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 60%, entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 55%, entre aproximadamente el 15% y aproximadamente el 50%, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 45%, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 45%, entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 40%, o entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 35% de la proteína transportadora en la célula huésped para formar el bioconjugado.
En algunas realizaciones, se glicosila al menos el 1%, al menos el 3%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, o al menos el 70% de la proteína transportadora en la célula huésped para formar el bioconjugado.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el bioconjugado del cultivo de células huésped. En la técnica se conocen métodos para purificar bioconjugados, tales como proteínas transportadoras N-glicosiladas, a partir de cultivos de células huésped. Véase, por ejemplo, Jan-Christer Janson, Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. Wiley; 3 edición (22 de marzo de 2011).
6.10 Métodos analíticos
Pueden usarse diversos métodos para analizar las composiciones estructurales y las longitudes de cadena de azúcar de los bioconjugados o proteínas transportadoras N-glicosiladas descritas en el presente documento.
En una realización, puede realizarse hidrazinolisis para analizar glicanos. En primer lugar, los polisacáridos se liberan de sus proteínas transportadoras mediante incubación con hidrazina según las instrucciones del fabricante (Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, RU). El nucleófilo hidrazina ataca el enlace glicosídico entre el polisacárido y la proteína transportadora y permite la liberación de log glicanos unidos. Durante este tratamiento se pierden los grupos N-acetilo y tienen que reconstituirse mediante una nueva N-acetilación. Los glicanos libres se purifican en columnas de carbono y posteriormente se marcan en el extremo reductor con el fluoróforo 2-aminobenzamida (Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB. Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem. 20 de septiembre de 1995;230(2):229-38). Los polisacáridos marcados se separan en una columna GlycoSep-N (GL Sciences) según el protocolo de HPLC de Roile et al. (Roile L, Mattu TS, Hart E, Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM. Una base de datos analítica y estructural proporciona una estrategia para secuenciar O-glicanos a partir de cantidades en microgramos de glicoproteínas. Anal Biochem. 1 de mayo de 2002;304(1):70-90). El cromatograma de fluorescencia resultante indica la longitud del polisacárido y el número de unidades de repetición. Puede reunirse información estructural recogiendo picos individuales y realizando posteriormente un análisis de EM/EM. De ese modo, pudo confirmarse la composición del monosacárido y la secuencia de la unidad de repetición, y además pudo identificarse la homogeneidad de la composición del polisacárido. Los picos específicos de bajo peso molecular pueden analizarse mediante MALDI-EM/EM y el resultado se usa para confirmar la secuencia de glicanos. Cada pico corresponde a un polímero que consiste en un número determinado de unidades de repetición y fragmentos de los mismos. Por tanto, el cromatograma permite medir la distribución de longitudes del polímero. El tiempo de elución es una indicación de la longitud del polímero, la intensidad de fluorescencia se correlaciona con la abundancia molar del polímero respectivo.
En otra realización, puede usarse SDS-PAGE o electroforesis capilar en gel para evaluar glicanos y glicoconjugados. La longitud del polímero para los glicanos del antígeno O que se sintetizan en el presente documento se define por el número de unidades de repetición que se ensamblan linealmente. Esto significa que el patrón típico en forma de escalera es una consecuencia de los diferentes números de unidades de repetición que componen el glicano. Por tanto, dos bandas una al lado de la otra en SDS-PAGE u otras técnicas que se separan por tamaño difieren únicamente en una sola unidad de repetición. Estas diferencias discretas se aprovechan cuando se analizan glicoproteínas para determinar el tamaño de los glicanos: la proteína transportadora no glicosilada y el glicoconjugado con diferentes longitudes de cadena de polímero se separan según sus movilidades electroforéticas. Se mide el primer número de unidades de repetición detectable (m) y el número de unidades de repetición promedio (npromedio) presentes en un glicoconjugado. Estos parámetros pueden usarse para demostrar la consistencia de lote a lote o la estabilidad del polisacárido.
En otra realización, podría aplicarse EM de alta masa y HPLC de exclusión por tamaño para medir el tamaño de los glicoconjugados completos.
En otra realización, puede usarse un ensayo de antrona-ácido sulfúrico para medir el rendimiento del polisacárido (Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC. Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals. Marzo de 2008;36(2): 134-41. Epub 26 de noviembre de 2007).
(a) Change en el uso del sitio de glicosilación
Para demostrar que el uso del sitio en una proteína específica cambia, puede cuantificarse el uso del sitio de glicosilación. Los métodos para hacerlo se enumeran a continuación.
Cl-EM/ES de glicopéptidos: los glicoconjugados se digieren con proteasa(s) y los péptidos se separan mediante un método cromatográfico adecuado (C18, HPLC de interacción hidrófila HILIC, columnas GlycoSepN, SE HPLC (HPLC de exclusión por tamaño), AE HPLC (HPLC de intercambio aniónico) y se identifican los diferentes péptidos usando EM/EM. Este método puede usarse con o sin acortamiento previo de la cadena de azúcar mediante métodos químicos (degradación de Smith) o enzimáticos. La cuantificación de los picos de glicopéptidos usando detección UV a de 215 a 280 nm permite la determinación relativa del uso del sitio de glicosilación.
HPLC de exclusión por tamaño: un mayor uso del sitio de glicosilación se refleja por un momento de elución más temprano de una columna SE HPLC. Véase también (a).
(b) Homogeneidad
La homogeneidad del glicoconjugado (la homogeneidad de los residuos de azúcar unidos) puede evaluarse usando métodos que miden la longitud del glucano y el radio hidrodinámico.
6.11 Beneficios
Las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 5,1) y los métodos proporcionados en el presente documento (véanse, por ejemplo, las secciones 6.2 y 6.9) de uso de la N-OST recombinante proporcionada en el presente documento (véase, por ejemplo, la sección 6.1) son de particular importancia y relevancia comercial, ya que permiten una fermentación rápida, de alto rendimiento, a gran escala y de bajo coste de preparaciones de bioconjugado altamente homogéneas (por ejemplo, preparación de glicoconjugados o preparaciones de vacunas conjugadas). Las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento permiten una producción económicamente viable de bioconjugados comercial y terapéuticamente valiosos, tales como las vacunas conjugadas. Se espera que los procedimientos de producción enzimática usando las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento produzcan preparaciones de bioconjugado más homogéneas y reproducibles que los métodos de síntesis química usados comúnmente. Se espera que la reproducibilidad y robustez de los métodos de producción la producción biotecnológica de bioconjugados usando las N-OST recombinantes proporcionadas en el presente documento contribuyan a una reducción de los costes de producción. En general se cree que la homogeneidad de las vacunas conjugadas especialmente bioterapéuticas afecta a la seguridad clínica de las especialidades farmacéuticas.
6.12 Métodos analíticos para someter a prueba el beneficio
Rendimiento. El rendimiento se mide como la cantidad de hidratos de carbono derivados de un litro de cultivo de producción bacteriana que crece en un biorreactor en condiciones controladas y optimizadas. Tras la purificación del glicoconjugado, los rendimientos de los hidratos de carbono pueden medirse directamente o bien mediante el ensayo de antrona, o bien mediante ELISA usando antisueros específicos de hidratos de carbono. Son posibles mediciones indirectas mediante el uso de la cantidad de proteína (medida mediante ensayos bien conocidos de BCA, Lowry, o Bardford) y la longitud y estructura del glicano para calcular la cantidad teórica de hidratos de carbono por gramo de proteína. Además, el rendimiento también puede medirse secando la preparación de glicoproteínas de un tampón volátil y usando una balanza para medir el peso.
Homogeneidad. Homogeneidad significa la variabilidad de la longitud de los glicanos y posiblemente el número de sitios de glicosilación. Para este fin pueden usarse los métodos enumerados anteriormente. La SE-HPLC permite la medición del radio hidrodinámico. Números mayores de sitios de glicosilación en el transportador conducen a una mayor variación en el radio hidrodinámico en comparación con un transportador con menos sitios de glicosilación. Sin embargo, cuando se analizan cadenas de glicano individuales, pueden ser más homogéneas debido a la longitud más controlada. La longitud del glicano se mide mediante hidrazinolisis, SDS PAGE y CGE. Además, la homogeneidad también puede significar que determinados patrones de uso del sitio de glicosilación cambian a un rango más amplio/más estrecho. Estos factores pueden medirse mediante CL-EM/EM de glicopéptidos.
7. EJEMPLOS
7.1 Ejemplo 1: Modelado de PglBcj y unión de oligosacáridos in silico
Se generó un conjunto de modelos de homología de PglB de C. jejuni usando diferentes métodos de modelado por homología con la estructura experimental de C. lari como molde (PDBid 3RCE). Se seleccionó el modelo generado con el método HHpredB (Soding J, Biegert A, Lupas AN. The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acid Res. 2005:33,W244-8.) porque sus coordenadas se puntuaron mejor por la herramienta de estimación de la calidad del modelo, QMEAN (Benkert P, Biasini M, Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bioinformatics. 2011: 27:343-350). A continuación, se transfirieron el ion Mg2+ y el péptido aceptor de la estructura de C. lari (PDBid 3RCE). Para visualizar la orientación de la proteína en la membrana citoplásmica, se derivó un modelo de bicapa fosfolipídica según la entrada de la base de datos OPM para C. lari (Lomize MA, Pogozheva ID, Joo H, Mosberg HI, Lomize AL. OPM database and PPM web server: resources for positioning of proteins in membranes. Nucleic Acid Res. 201240:D370-6.). Se parametrizaron el ligando de heptasacárido natural de C. jejuni y la primera unidad de repetición de los polisacáridos LT2 de S. entérica teniendo en cuenta las cargas y los tautómeros, y se generaron conformaciones de baja energía. (Shelley JC, Cholleti A, Frye LL, Greenwood JR, Timlin MR, Uchimaya M: J Comput Aided Mol Des. 2007, (12):681 -91). Estas conformaciones de baja energía se colocaron entonces en el modelo y se muestrearon conformacionalmente (Kolossváry, I.; Guida, W. C. Low-mode Conformational Search Elucidated. Application to C39H80 and Flexible Docking of 9-Deazaguanine Inhibitors to PNP. J. Comput. Chem. 1999, 20, 1671.) El sacárido se definió como una subestructura que se mueve libremente y se impusieron restricciones de posición en todos los átomos de la estructura principal de la proteína y en todos los átomos en un radio de 6 A alrededor del OS. Se aplicaron restricciones de distancia en el enlace CO-N y N-C1 entre el la primera unidad de sacárido y ASP-N. Se realizó un muestreo conformacional de 1000 etapas aplicando OPLS (Kaminski, G. A.; Friesner, R. A.; Tirado-Rives, J.; Jorgensen, W. J. J. Phys. Chem. B 2001, 105, 6474).), incluyendo un modelo de agua de átomo completo y una ventana de 35 kcalmol-1 para examinar las posibles conformaciones, que se refinaron con un protocolo similar empleando una ventana de energía más estrecha de 21 kJmoM.
La selección de posibles residuos de PglBcj que interaccionan con oligosacáridos como dianas para la mutagénesis requirió la generación de un modelo de homología que se generó usando la estructura resuelta experimentalmente de PglB de C. lari (PDBid 3RCE) como molde. Se simuló la unión del sustrato de N-glicano natural de C. jejuni y de la primera unidad de repetición del polisacárido LT2 heterólogo de S. entérica a PglBCj. En la figura 1 se muestra la composición de subunidades de monosacárido del sustrato de oligosacárido nativo y de las unidades de repetición de dos polisacáridos heterólogos analizados en este estudio. Las estructuras de oligosacáridos se muestrearon conformacionalmente mientras estaban unidas covalentemente al nitrógeno de amida del residuo de asparagina dentro del péptido aceptor. Se supuso que la conformación de la enzima y por tanto del ligando era de tipo producto, es decir, justo antes de la liberación del sitio activo. Por tanto, los modelos estructurales no consideran ninguno de los factores para la unión inicial del sustrato de oligosacárido (OS) unido a undecaprenil-pirofosfato. En la figura 2A se muestran ejemplos de conformaciones predichas para OS de C. jejuni y la primera unidad de repetición de LT2 de S. enterica. Las interacciones generales con los residuos de proteínas y la orientación relativa en el sitio de unión diferían sustancialmente entre los dos oligosacáridos. En las figuras 2b y 2C se muestran capturas de las conformaciones favorecidas termodinámicamente. Mientras que el sustrato de OS natural ofrecía una multitud de parejas de enlaces de hidrógeno consigo mismo y con los residuos circundantes de PglBq de tipo natural, la unidad de repetición del antígeno O de LT2 carecía de interacciones similares, lo que respalda un modelo mecánico en el que la baja eficacia de transferencia se produce por una unión deficiente del sustrato de hidrato de carbono al sitio activo. La unidad de repetición del antígeno O de LT2 está compuesta por cuatro hexosas (figura 1) que carecen de sustituyentes de N-acetilo, lo que limita las posibilidades de formación de enlaces de hidrógeno.
Para seleccionar posiciones de mutagénesis dentro de la secuencia de PglBwT, se usó el modelo generado para identificar cadenas laterales de aminoácidos que se ubican a una distancia de 2,5-4 A del N-glicano natural de C. jejuni. Los siguientes residuos coincidieron con este criterio: Y77, S80, S196, N311, Y462, H479 y K522 (figura 2B). En el caso de G476 y G477, se predijo que el átomo de oxígeno del carbonilo de la estructura principal del polipéptido está muy cerca del azúcar más interno (figura 2B).
7.2 Ejemplo 2: Mutagénesis de residuos predichos que interaccionan con azúcar
En la tabla 1 se describen las cepas bacterianas y los plásmidos usados en este estudio. Se usó E. coli W3110 waaL como cepa huésped para la producción de los glicoconjugados EPA-OS de C. jejuni y EPA-O1 de Shigella, y EPA-CP5 en experimentos de glicosilación in vivo. Se usó S. entérica sv. Typhimurium SGSC228 que produce polisacáridos LT2 y carece del gen waaL funcional para la producción de LT2-EPA. Se usaron células E. coli ultracompetentes para la transformación inicial de variantes y bibliotecas de plásmidos construidos. Se usó E. coli DH5a como huésped convencional para la producción y el almacenamiento de plásmidos.
Tabla 1. Cepas y plásmidos
Cepa / plásmido Descripción Marcador de Referencia selección
Cepas bacterianas TetR A (mcrA)183 A (mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAI CmR Stratagene E. coli XL10-Gold supE44 thi-1 recAI gyrA96 relAI lac Hte [F' proAB
latiqZAM15 Tn 10 (TetR) Amy CamR]
E. coli DH5a K-12 § 80dlacZAM15 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+) Clontech supE44 thi-1 gyrA96 relAI A(lacZYA-argF)U169 F- -E. coli CLM24 W3110 A waaL - (4)
E. coli StGVXN1717 W3110 A waaL AwecA-wzzE ArmlB-wecG::cat CmR (7)
S. enterica sv. Typhimurium LT2; waaL446 (5) SGSC228
Plásmidos
pACT3Kan Vector de número de copias medio para la expresión KanR (11)
inducible por IPTG; laci, Ptac, ori: pACYC184/p15a
pEXT21 Vector de bajo número de copias para la expresión SpR (47)
inducible por IPTG; laci, Ptac, ori: IncW
pACY C(pglmut) Heptasacáridos de C. jejuni, expresión constitutiva; CmR (2)
operón pgl de C. jejuni con variante de PglB inactiva
W458A-D459A (PglBmut), ori: pACYC184/p15a
pGVXN64 Polisacáridos LPS O1 de Shigella dysenteriae, expresión TetR (8)
constitutiva; ori: IncPa
pGVXN115 PglBmut, expresión inducible por IPTG; vector pEXT21 SpR (8)
(ori: IncW)
pGVXN150 Exotoxoide A de Pseudomonas aeruginosa (EPA) con 2 AmpR (7)
N-sitios de glicosilación modificados por ingeniería,
expresión inducible de L-arabinosa; péptido señal de
ssDsbA N-terminal para la secreción a periplasma y
etiqueta de 6H C-terminal, ori: pBR322
pGVXN393 Polisacáridos capsulares CP5 de aureus, expresión TetR (7)
constitutiva; ori: IncPa
pGVXN408 PglB-HA W458A-D459A inactiva de C. jejuni (PglBmut), KanR (11)
expresión inducible por IPTG; vector pACT3Kan
pGVXN925 PglB con etiqueta de hemaglutinina ( H a ) C-terminal de AmpR Este estudio C. jejuni, codones optimizados para E. coli; vector pUC57
de clonación de alto número de copias
pGVXN970 PglBCj de tipo natural, sin etiquetas, codones optimizados SpR Este estudio para E. coli, expresión inducible por IPTG; vector
pEXT21
pGVXN1049 PglB-HA de C. jejuni, codones optimizados para E. coli, KanR Este estudio expresión inducible por IPTG; vector pACT3Kan
pGVXN1050 PglBCj de tipo natural, sin etiquetas, codones optimizados KanR Este estudio para E. coli, expresión inducible por IPTG; vector
pACT3Kan
pGVXN1217 N311V de PglBCj, derivado de pGVXN970 SpR Este estudio pGVXN1413 PglBCj de tipo natural, expresión semiconstitutiva; vector KanR Este estudio pACT3Kan de tamaño reducido sin laci
pGVXN1415 N311V-A669V de PglBCj, expresión semiconstitutiva; KanR Ihssen et al., vector pACT3Kan de tamaño reducido sin laci, aislado de en una biblioteca de mutagénesis por saturación de preparación pGVXN1050
pGVXN1418 N311V de PglBCj, derivado de pGVXN1415 KanR Este estudio pGVXN1942 S80R-Q287P-N311V de PglBCj, aislado de una biblioteca KanR Este estudio con permutaciones al azar, derivado de pGVXN1418
La PglB con codones optimizados se expresó a partir del plásmido pEXT21 de bajo número de copias y se obtuvo de una empresa de servicios de síntesis de genes (Genescript). Se construyó un plásmido molde para la construcción de bibliotecas de pglB mediante subclonación por PCR de pglB-HA con codones optimizados desde pGVXN925 a pACT3Kan, usando los sitios de restricción Kpn\ y BamH\ (pGVNX1049), seguido por la inserción de un codón de terminación TAA delante de la secuencia que codifica para la etiqueta de péptido de HA por QuikChange (pGVNX1050). Se construyó un plásmido molde pGVXN1413 derivado de pACT3Kan de tamaño reducido que carece del gen represor lacI (expresión semiconstitutiva de PglB) mediante ligación de un fragmento obtenido por Kpn\-BamH\ de pGVXN1050 (que codifica para PglB de tipo natural) en el fragmento de estructura principal del vector obtenido por BamH\-Kpn\ de pGvXN1415. Se construyó el plásmido molde de tamaño reducido pGVXN1418 (N311V de PglB) para bibliotecas de segunda ronda mediante ligación de un fragmento obtenido por AscI-BamH de pGVXN1050 (último tercio del gen pglB de tipo natural) en un fragmento obtenido por BamH\-AscI de pGVXN1415. Todos los plásmidos se validaron mediante secuenciación de ADN.
Se añadieron los antibióticos apropiados a todos los medios de crecimiento para garantizar el mantenimiento del plásmido (Ampicilina, Amp: 100 mg l-1, Cloranfenicol, Cm: 10 mg M, Kanamicina, Kan: 30 mg M, Espectimomicina, Sp: 80 mg l-1, Tetraciclina, Tet: 20 mg l-1).
Los cebadores mutagénicos y los servicios de secuenciación se obtuvieron de Microsynth (Balgach, Suiza). QuikChange construyó variantes y bibliotecas de PglB usando pGVXN1050, pGVXN1415 o pGVXN1418 como molde. Las mutaciones deseadas se verificaron mediante secuenciación.
Solo se facilitan las secuencias de los cebadores directos de cada par de cebadores, para los cebadores inversos se usaron las secuencias complementarias inversas respectivas. Los codones degenerados en la(s) posición/posiciones mutada(s) están subrayados. Mutagénesis por saturación de N311: 5'- GC TTC ATG TAC T t C A a C GTT NNK CAG ACG a T c CAA GAA GTG G -3' (SEQ \D NO: 3), mutagénesis por saturación de Y77: 5'- CAT CAG CCG AAC GAT CTG AGT NNK TAC GGT AGC T c T CTG TCC G -3'(SEQ \D NO: 4), aleatorización de cuatro aminoácido (Ala, Ser, Cys, Gly) de G476-G477 5'- C GAT GTT AAA ACG CTG GTC GAC KST KST AAA CAC CTG GGC AAG G -3' (SEQ \D NO: 5), mutagénesis por saturación de S805'- CG AAC GAT CTG AGT TAT TAC GGT NNK TCT CTG TCC GCG CTG ACC -3' (SEQ \D NO: 6), mutagénesis por saturación de Q2875'- GGT GTT GAT CCG ATT CTG TAC NNK CTG AAA TTT TAT ATC TTC CGC TCA G -3' (SEQ \D NO:7), mutagénesis por saturación de L2885'- GTT GAT CCG ATT CTG TAC CAG NNK AAA TTT TAT ATC TTC CGC TCA GAT G -3' (SEQ \D NO: 8), mutagénesis por saturación de K2895'- GAT CCG ATT CTG TAC CAG CTG NNK TTT TAT ATC TTC CGC TCA GAT GAA TCG -3' (SEQ \D NO: 9), mutagénesis por saturación de F2905'- CCG ATT CTG TAC CAG CTG AAA NNK TAT ATC TTC CGC TCA GAT GAA TCG -3' (SEQ \D NO: 10), mutagénesis por saturación de Y291 5'- CG ATT CTG TAC CAG CTG AAA TTT NNK ATC TTC CGC TCA GAT GAA TCG -3' (SEQ \D NO: 11), mutagénesis por saturación de R2945'- G TAC CAG CTG AAA TTT TAT ATC TTC NNK TCA GAT GAA TCG GCA AAC CTG -3' (SEQ \D NO: 12). Las bibliotecas de la primera ronda se construyeron usando como molde los plásmidos pGVXN1050 o pGVXN1413 con PglB de tipo natural. Las bibliotecas de la segunda ronda se construyeron usando como molde pGVXN1418 (N311V de PglB) o pGVXN1930 (N311V de Pg\b-HA). Las bibliotecas de mutantes iniciales se basaron en el pGVXN1050 como plásmido molde. Sin embargo, se encontró que tales bibliotecas producían repetidamente plásmidos variantes con una estructura principal de vector reducida de 2,1 kB debido a un acontecimiento de recombinación en una secuencia repetitiva presente en la secuencia de pACT3 original. La reducción de tamaño condujo a pérdida del gen represor lacI, lo que a su vez facilitó la expresión semiconstitutiva de PglB y un aumento de dos veces en los niveles de EPA-CP5 (publicado en otra parte). Con el fin de evitar tal recombinación no deseada, se usaron pGVXN1413, pGVXN1418 y pGVXN1930 como molde en las bibliotecas posteriores.
Se construyó una biblioteca con permutaciones al azar de variantes de segunda ronda neutras y ligeramente beneficiosas con el kit de mutagénesis dirigida a múltiples sitios según las instrucciones de fabricante (Stratagene). Se usó una mezcla de tres oligonucleótidos, cebador 5'- CAT CAG CCG AAC GAT CTG AGT YMT TAC GGT M g T TCT CTG TCC GCG CTG AC -3' (SEQ \D NO: 13) dirigido a la región Y77 y una razón molar de 4:1 de cebadores 5'-C GGT GTT GAT CCG ATT CTG TAC MVG WTK MAK TTT TAT ATC TTC CGC TCA GAT GAA TCG -3' y 5'- C GGT GTT GAT CCG ATT CTG TAC MVG WTK CGT TTT TAT ATC TTC CGC TCA GAT GAA TCG -3' (SEQ \D NO: 14) dirigidos a la región EL5. Se usó como molde la variante mejorada N322V de PglB (pGVXN1418).
Para el examen se usaron solo las bibliotecas con menos del 20% de clones de tipo natural. Las bibliotecas de plásmidos se produjeron resuspendiendo al menos 1000 colonias de XL10-Gold (5000 colonias para la biblioteca con permutaciones al azar) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido por la purificación de plásmidos con un kit Miniprep convencional. Las bibliotecas de plásmidos se transformaron en cepas de expresión de E. coli y S. entérica usando procedimientos de electroporación convencionales.
Se examinaron las bibliotecas de mutantes y los plásmidos variantes individuales en placas de 96 pocillos profundos tal como se describió anteriormente, excepto que se redujo la concentración de \PTG añadida en la inducción a 30 pM con el fin de reducir la formación de cuerpos de inclusión. Se aislaron plásmidos variantes de PglB de las cepas de expresión mediante nueva transformación de preparaciones de plásmidos en células E. coli DH5a químicamente competentes y selección para resistencia a kanamicina únicamente. Las mutaciones se caracterizaron mediante secuenciación de Sanger de plásmidos purificados, empleando dos lecturas superpuestas. Se usaron S. entérica SGSG228 (pGVXN150), E. coli St1717 (pGVXN150, pGVXN393) y E. coli W3110 waaL (pGVXN64, pGVXN150) químicamente competentes o electrocompetentes como cepas huésped para exámenes de DWP-ELISA de LT2-EPA, CP5-EPA y O1-EPA, respectivamente.
Las cepas huésped para la producción de EPA-CP5, EPA-LT2 y EPA-O1 en experimentos en matraz de agitación fueron similares a los experimentos en DWP. Se usó E. coli W3110 waaL (pACYc(pglmut), pGVXN150) como cepa huésped para la producción del OS EPA-Cj. Se registró la cinética de formación de glicoproteínas mediante la preparación de extractos de proteína periplásmica normalizados por biomasa a intervalos regulares tras la inducción, seguido por ELISA de tipo sándwich. Se inocularon tubos de precultivo por triplicado con medio LB (extracto de levadura 5 g l-1, NaCl 10 g l-1 y 5 g l-1) con colonias únicas individuales a partir de placas de transformación o siembra por estría recientes y se incubaron durante la noche a 37°C y 160 rpm. Se inocularon 1:50 matraces Erlenmeyer por triplicado con el 50% v/v de medio LB-M9 (extracto de levadura 5 g l-1, triptona 10 g l-1, Na2HPO4 -7H2O 12,8 g l-1, KH2PO43,0 g l-1, NaCl 0,5 g l-1, NH4Cl 1,0 g l-1, MgSO4 -7H2O 2 mM y CaCl20,1 mM) a partir de precultivos en tubo y se incubaron a 37°C y 160 rpm. A una DO600 de 0,5, se añadieron ipTG 1 mM y L-arabinosa 4 g l-1 para la inducción y se redujo la velocidad de agitador hasta 100 rpm. En el caso de la cepa huésped de Salmonella, se observó degradación de EPA/EPA-LT2 en cultivos en cultivos en matraces de agitación en LB-M9 después de la inducción durante la noche. Pudo impedirse la degradación mediante el uso de un medio complejo de alta resistencia (2YT, extracto de levadura 10 g l-1, triptona 14 g l-1, sales M9), reduciendo la DO600 en la inducción hasta 0,3-0,4 y cambiando a incubación estática (crecimiento completamente anaerobio) después de la inducción.
Se prepararon extractos periplásmicos. Los extractos se diluyeron de 1000 a 20.000 veces en PBS con leche en polvo al 1% p/v y se analizaron mediante ELISA de tipo sándwich. Para el análisis de los datos solo se usaron las diluciones que produjeron señales de ELISA no saturadas (absorbancia a 450 nm por debajo de 1,0). Para la purificación de las proteínas con cola de hexahistidina, se reunieron extractos periplásmicos de cultivos en matraz de agitación durante la noche por triplicado y se realizó cromatografía de afinidad al Ni según protocolos convencionales usando columnas HiTrap FF (GE Healthcare). Se llevaron a cabo SDS-PAGE y tinción de Coomassie usando métodos convencionales. Se cuantificó la intensidad combinada relativa de las glicoformas EPA-LT2 con el software ImageJ (imagej.nih.gov).
Los extractos de proteínas periplásmicas se diluyeron de manera apropiada y se analizaron mediante ELISA de tipo sándwich en placas de 96 pocillos. El anticuerpo de captura para todos los análisis ELISA fue antisuero de cabra anti-EPA purificado con proteína G. Se usaron anticuerpo de conejo anti-CP5 de S. aureus, anticuerpo de conejo anti-O:5/O:4 de Salmonella (Staten Serum Institute, Denmark), anticuerpo de conejo anti-O1 de Shigella y anticuerpo de conejo anti-C. jejuni para la detección de oligosacáridos y polisacáridos ligados a EPA. Se usaron antisuero de cabra anti-IgG de conejo acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) (Bio-Rad, Reinach, Suiza) y sustrato Ultra-TMB (Thermo-Scientific/Pierce) para el revelado de ELISA. Se detuvo la reacción de HRP mediante la adición de H2SO42M y se midió la absorbancia a 450 nm (señal de ELISA) frente al aire con un lector de placas. Se eligieron tiempos de revelado apropiados de modo que pudiera evitarse la saturación de la señal (absorbancia máxima 450 nm < 1,0). Las señales se sometieron a corrección de fondo restando los valores de absorbancia promedio de las muestras derivadas de cepas de control isogénicas que expresaban PglBmut. Se realizó análisis de inmunotransferencia de tipo Western de proteínas periplásmicas y de células totales tal como se describió anteriormente. Se detectaron EPA y PglB-HA mediante anticuerpos primarios de conejo anti-EPA (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y de conejo anti-HA (Sigma-Aldrich), respectivamente. Se detectaron oligosacáridos y polisacáridos conjugados con EPA con los mismos anticuerpos que se usaron para el ELISA.
En el modelo de PglBcj con OS de C. jejuni, el grupo amida de N311 formó un enlace de hidrógeno directo con el grupo hidroxilo en C6 del segundo monosacárido, es decir, GalNAc (contado desde el extremo reductor) (figura 2A). Se transformó un plásmido pglB en el que se había cambiado N311 aleatoriamente a los otros 19 aminoácidos, en una cepa de Salmonella que expresaba los polisacáridos LT2 y una forma no tóxica de exotoxina (EPA) de Pseudomonas aeruginosa. El examen en una placa de 96 pocillos usando ELISA específico de glicoproteínas produjo tres clones que mostraron eficacia de glicosilación mejorada significativamente en comparación con PglB de tipo natural (figura 3A). En todos ellos, el residuo N311 estaba mutado a valina (codones: 2x GTT, 1x GTG).
La misma biblioteca se transformó entonces en células E. coli que expresaban EPA y el polisacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus. Se identificaron siete clones que mostraron una eficacia de glicosilación mejorada en comparación con PglB de tipo natural mediante la medición de la productividad de CP5-EPA mediante ELISA (figura3B). Seis de ellos albergaban la sustitución de aminoácido N311V (codones GTG y GTT) y uno presentaba la mutación N311I (codón ATT). La alta fracción de clones activos (« 80%) indica que N311 es altamente tolerante a la mutación, lo que está de acuerdo con la considerable variabilidad en esta posición en secuencias homólogas de N-OST (figura 4).
Se mutagenizó otro aminoácido localizado en estrecha proximidad al sitio de unión del oligosacárido igual que anteriormente. Y77 reside en un bucle periplásmico del dominio transmembrana y puede interaccionar con oligosacáridos a través de enlaces de hidrógeno directos y mediados por agua según el modelo (figura 2A). Se encontró que el residuo era altamente tolerante a la mutación (el 80-90% de clones productores de CP5-EPA en una biblioteca de mutagénesis por saturación); lo que corresponde de nuevo con un alto grado de variabilidad en las secuencias de proteínas homólogas (figura 4). Sólo se encontraron sustituciones de aminoácido neutras (Y77L, Y77F), pero no se identificaron variantes mejoradas.
También se modelaron los residuos Y462, G476, G477 y H479 para que estuvieran muy cerca del oligosacárido natural unido en el modelo de PglBcy (figura 2A); sin embargo, están altamente conservados en N-OST bacterianas. Pese a restringir los cambios a sustituciones de aminoácido que se producen de manera natural, las señales del glicoconjugado CP5-EPA se redujeron en un 50-90% en las variantes de PglBcy Y462, G476, G477 y H479, con la notable excepción de G476P y H479N que se encontró que eran mutaciones neutras (figura 5). Las combinaciones al azar de los aminoácidos pequeños alanina, serina, cisteína y glicina en G476-G477 condujeron todas ellas a la producción reducida o suprimida de CP5-EPA.
En resumen, a partir de esta primera ronda de mutagénesis de aminoácidos en estrecha proximidad al sitio de unión del oligosacárido de PglB, N311 se identificó como la posición con el mayor impacto en la mejora de los rendimientos de glicosilación. Además, Y77 también se identificó como tolerante a la mutación.
7.3 Ejemplo 3: Efecto de N311V sobre las tasas de formación de glicoproteínas
Se analizó el efecto de la variante N311V de PglBo j sobre las tasas de glicosilación in vivo para diferentes sustratos de oligosacáridos/polisacárido en cultivo en matraz de agitación (figura 6). Se expresaron N311V de PglBcy y PglBwt a partir de un vector de bajo número de copias. Las células que expresaban la N-OST mutante produjeron 8 veces más LT2-EPA después de la inducción durante la noche (figura 6A). Los factores de mejora después de 2 h y 4 h de inducción fueron de 22 y 11 veces, respectivamente. La tasa inicial de formación de CP5-EPA aumentó en un factor de 5,1 (figura 6B). Las tasas iniciales de formación de O1-EPA también aumentaron dos veces en N311V mutante (figura 6C), aunque este sustrato de polisacárido no se usó en exámenes de biblioteca. En cambio, no se encontró un efecto significativo para la glicosilación de EPA in vivo con el sustrato de OS natural de C. yeyuni de PglB. El aumento en la señal de ELISA a lo largo del tiempo y el efecto beneficioso o neutro de N311V correspondieron a los resultados de inmunotransferencia de tipo Western para muestras de proteína periplásmica a modo de ejemplo (figura 7).
Para analizar la causa del efecto beneficioso de la producción de N311V, se construyeron variantes de PglB de tipo natural y N311V de PglB con una etiqueta de péptido de hemaglutinina (HA) C-terminal. Esto permitió seguir los niveles de expresión de PglB durante los experimentos. Las bandas específicas de PglB-HA en muestras de proteínas de células completas normalizadas por biomasa que se originaban a partir de mutantes eran menos intensas y más variables que las de PglB de tipo natural (figura 8A). Tras la inducción aparecieron productos de degradación correspondientes en tamaño al dominio periplásmico C-terminal, lo que indica un efecto desestabilizador de la mutación. Pese al aparente efecto negativo en la estabilidad de PglB, la producción de EPA-CP5 seguida por ELISA aumentó de nuevo significativamente en células que expresan N311V de PglBcy (figura 8B).
7.4 Ejemplo 4: Rondas adicionales de mutagénesis y examen
Siguiendo el principio de mutagénesis por saturación iterativa, se usó N311V de PglBcy como molde para la aleatorización de Y77 y S80. El último residuo también varía entre los homólogos de PglB (figura 4) y se orienta hacia el sitio de unión del sustrato de oligosacárido modelado justo por encima de la posición en la que el bucle externo EL1 sobresale de la membrana (figura 2). Se encontró que tanto Y77 como S80 eran altamente tolerantes a la mutación, con un 70-80% de clones activos cuando se examinaron para determinar la producción de LT2-EPA (table 1). Se secuenciaron los diez clones con las señales de ELISA más altas, y se cambió Y77 a diversos aminoácidos, con un sesgo hacia residuos con cadenas laterales básicas (table 2). En la biblioteca de NNK que aleatoriza a S80, la variante S80R fue dominante en los clones mayor rendimiento (tabla 2).
Tabla 2. Tolerancia a la mutación de residuos de PglBcj mutados en bibliotecas de mutagénesis por saturación de segunda ronda y sustituciones de aminoácido identificados en los 10 clones con las señales de ELISA de LT2-EPA más altas. Los clones se contaron como activos cuando las señales de ELISA con corrección de fondo alcanzaron más del 10% del valor promedio de los pocillos de control de N311V.
Residuo de PglBcy Fracción de clones activos en Mutaciones identificadas en 10 biblioteca de NNK mejores clones
Y77 86% Y77H (2x)
Y77T
Y77W
Y77R
Y77K (2x)
Y77A
Y77G
S80 81% S80R (8x)
S80H
Q287 65% Q287P (4x)
Q287K (2x)
Q287R
L288 61% L288M (2x)
L288F
L288I
L288I
K289 78% K289R (4x)
K289N (2x)
K289Q (2x)
F290 16% ninguna (todos de tipo natural) Y291 3,9% ninguna (todos de tipo natural) R294 22% R294K
El motivo Q287LKFYxxR294 de PglBcy dentro de la parte N-terminal de EL5 está altamente conservado en secuencias de PglB de especies de Campylobacter, pero no en N-OST de especies relacionadas de manera más distante (figura 9). Debido a la observación de que las dos subunidades de azúcar más internas de los glicanos ligados a N de especies de Campylobacter son similares (1a 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxihexosa, 2a N-acetil-hexosamina), se lanzó la hipótesis de que los residuos del motivo Q287LKFYxxR294 específico de Campylobacter pueden influir en la especificidad de los oligosacáridos. Se generaron bibliotecas de mutagénesis por saturación en estas posiciones con la variante N311V mejorada como molde. Cuando se examinó la producción de LT2-EPA en la cepa huésped, se observó una clara diferencia para las partes primera y segunda del motivo (tabla 2). Mientras que la mutagénesis por saturación de Q287, L288 y K289 produjo un 60-80% de clones activos, los residuos adyacentes F290, Y291 y r 294 fueron altamente sensibles a la mutación. Los 10 clones de mayor rendimiento de las bibliotecas de Q287, L288 y K289 mostraron sustituciones de aminoácido no aleatorias (tabla 2). La prolina y los aminoácidos cargados positivamente lisina y arginina estaban sobrerrepresentados en la posición Q287. En L288 se encontraron exclusivamente residuos hidrófobos alternativos (M, I, F o C). Se observó un sesgo para los residuos o bien con amida (Q, N) o bien con cadenas laterales cargadas positivamente (R) en la posición K289 (tabla 2).
En una etapa final, se sometió a permutaciones al azar las mutaciones neutras y ligeramente beneficiosas encontradas para los residuos Y77, S80, Q287, L288 y K289. Cuando se examinaron 720 clones de esta biblioteca para la producción de LT2-EPA, se identificaron numerosos valores atípicos positivos, de los cuales se facilita un ejemplo en la figura 10A. Se secuenciaron los clones con un aumento de al menos 2,5 veces en las señales de ELISA en comparación con la señal promedio de clones de control de molde en la misma placa (n = 14). Se detectó S80R en el 79% (n = 11), Q287P en el 43% (n = 6) y Y77H en el 29% (n = 4) de estos clones, respectivamente. Los mutantes dobles Y77H-N311V y S80R-N31 IV se encontraron dos y cuatro veces, respectivamente. Q287P se produjo solo en combinación con o bien Y77H o bien S80R. Y77S, L288I, L288F, K289R y K289Q se encontraron una vez o dos veces en combinación con las mutaciones observadas con más frecuencia, lo que indica que estas sustituciones de aminoácido eran neutras.
Volvieron a transformarse plásmidos variantes mejorados representativos en la cepa de expresión de EPA-LT2 y volvieron a examinarse en minicultivos en DWP por triplicado (figura 10B). Se verificó un efecto beneficioso aditivo significativo tanto para Y77H (2,1 veces con respecto a N311V) como para S80R (1,8 veces con respecto a N311V). Cuando se combinó con S80R-N311V, Q287P condujo a un aumento adicional en las señales de ELISA de EPA-LT2 en un factor de 1,7, dando como resultado un factor de 15 de mejora total en relación con PglB de tipo natural en cultivos en DWP inducidos durante la noche (figura 10B). La mejora aditiva de la formación de EPA-LT2 también se observó cuando el material purificado por cromatografía de afinidad Ni-NTA procedentes de cultivos en matraz de agitación se observó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western (figura 10C). Las glicoformas hibridaron con anticuerpos específicos para los serotipos O:4 y O:5 de Salmonella, detectando el azúcar abecuosa de ramificación dentro del polisacárido LT2 y su forma O-acetilada, respectivamente. Usando un software de cuantificación de imágenes, se aumentó la intensidad combinada de las bandas de glicoformas (> 80 kDa) en factores de 9 y 16 para las variantes N311V y S80R-Q287P-N31 1V de PglBcy, respectivamente.
En conclusión, se ha demostrado que se identificaron satisfactoriamente N-OST recombinantes con especificidades de sustrato modificadas. Específicamente, se identificaron N-OST que pueden conjugar proteínas transportadoras con oligosacáridos o polisacáridos que carecen de grupos N-acetilo en la unidad de monosacárido en los extremos no reductores de los oligosacáridos o polisacáridos. Ventajosamente, las N-OST identificadas comprenden determinadas sustituciones de aminoácido y permiten la producción de glicovacunas médicamente relevantes a tasas aumentadas y con rendimientos aumentados en comparación con las N-OST de tipo natural.
7.5 Ejemplo 5: Mutagénesis de los residuos K482 y D483 de PglB de C. jejuni
Se aleatorizaron simultáneamente los residuos K482 y D483 no conservados de PglBcy a 12 aminoácidos químicamente diversos no redundantes (S, N, I, V, D, G, F, Y, C, L, H, R) mediante QuikChange usando el cebador de oligonucleótido directo 5'- GTA GAT GGT GGA AAG CAT TTW GGT NDT NDT AAT TTT TTC CCT TCT TTT GCT TTA AGC -3' y el cebador inverso 5'- GCT TAA AGC AAA AGA AGG GAA AAA ATT AHN AHN ACC WAA ATG CTT TCC ACC ATC TAC -3' (codones mutados subrayados; N = A, T, G o C; D = A, T o G; W = A o T). Se usó como molde el plásmido pGVXN407 de número de copias medio inducible por IPTG que codifica para la secuencia génica para PglB de tipo natural con etiqueta de HA C-terminal. Se verificó la calidad de la biblioteca mediante la secuenciación de 20 clones seleccionados aleatoriamente. Todos los nucleótidos deseados se detectaron en los codones mutados y la proporción de clones con secuencia de PglB de tipo natural estuvo por debajo del 15%. La biblioteca, denominada Fa, se transformó en la cepa de expresión E. coli St1717 (pGVXN150, pGVXN393) y se examinó en placas de 96 pocillos profundos tal como se describió anteriormente (Ihssen et al., 2012, BMC Biotechnolgy 12:67). En total se examinaron 801 clones, mostrando los resultados del examen a modo de ejemplo en la figura 10. El clon Fa8_G10 (marcado con un círculo en la figura 10) mostró señales de ELISA específicas para glicoproteína significativamente aumentadas cuando se volvió a examinar en 8 pocillos repetidos y se encontró que albergaba la mutación doble K482R-D483H de PglBcy (tabla 3). Los cambios de aminoácido K482R-D483H se introdujeron en la secuencia de PglB de tipo natural del plásmido pGVXN114 de bajo número de copias por QuikChange, dando como resultado el plásmido pGVXN635. Los plásmidos de tipo natural y variante se transformaron en la cepa de expresión E. coli St1717 (pGVXN150, pGVXN393) y se analizó la producción de CP5-EPA en un experimento en matraces de agitación por triplicado tal como se describió anteriormente (Ihssen et al., 2012, BMC Biotechnolgy 12:67). El mutante doble K482R-d 483H de PglBcy facilitó un aumento de 1,2 a 2,0 veces en los niveles de CP5-EPA tal como se determina mediante ELISA de tipo sándwich (figura 11).
Tabla 2. Nuevo examen y secuenciación de clones de alto rendimiento de la biblioteca Fa con residuos aleatorizados K482 y D483 de PglBcy.
Clon Veces de diferencia de Nivel de significación para Resultados de absorbancia en ELISA de CP5- el aumento en secuenciación EPA (450 nm) con respecto al comparación con PglB de (sustituciones de plásmido pGVXN407 de tipo natural tipo natural (Valor de P en aminoácido en PglBcy) (valor promedio de n = 8 pocillos prueba de la T)
repetidos)
Fa8_G10 1,63 0,0025 K482R D483H Fa6_D10 1,43 0,002 L480F K482R D483F
Fa7_C7 1,22 0,096 L480F K482S D483H
Se transformaron los plásmidos pGVXN114 y pGVXN635 de PglBcy de tipo natural y de la variante K482R-D483H, respectivamente, en la cepa de expresión E. coli St2457 (pGVXN570, pGVXN393) que expresa a-hemolisina (Hla) de S. aureus con un sitio de glicosilación modificado por ingeniería. Las cepas se inocularon a partir de precultivos durante la noche hasta una DO600 de 0,1 en cultivos en matraz de 1 litro (medio SOB cloranfenicol, ampicilina, tetraciclina y espectinomicina) y se incubaron a 37°C con agitación. A una DO600 de aproximadamente 1,0, se indujo la expresión de PglB y Hla añadiendo IPTG 1 mM y L-arabinosa 2 g l-1, respectivamente. En un experimento de control se omitió IPTG. Los cultivos inducidos se incubaron con agitación durante la noche a 37°C hasta la recogida. El tiempo de incubación total fue de aproximadamente 23 h.
En el experimento con inducción, se recogieron 1200 OD para ambas cepas, mientras que en experimento sin inducción para PglB, se recogió un total de 1500 OD de los cultivos durante la noche. Después de lavar las células sedimentadas una vez con NaCl al 0,9%, se resuspendieron las células hasta una DO600 de 50 en tampón de resuspensión (sacarosa al 25%, EDTA 10 mM, Tris HCl 200 mM HCl, pH 8,5). Se hicieron rotar las suspensiones celulares durante 20 min. Entonces se separaron las células mediante centrifugación y se resuspendieron hasta una DO600 de 50 en tampón de choque osmótico (Tris HCl 10 mM HCl, pH 8,5) y se incubaron durante 30 min con agitación suave. Después de otra etapa de centrifugación, se añadió MgCh 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM y Tris HCl 30 mM (pH 8,0) al sobrenadante. Se purificaron Hla con cola de His y CP5-Hla del sobrenadante (= fluido de choque osmótico) siguiendo procedimientos convencionales. Se analizaron las fracciones (1 ml) que cubrían el pico de elución a A280 de los cuatro experimentos mediante SDS-PAGE (tinción de Coomassie), inmunotransferencia de tipo Western anti-CP5 e inmunotransferencia de tipo Western anti-His (figura 12). Las bandas específicas para CP5 (recuadro con líneas discontinuas) fueron más fuertes para la cepa que expresaba K482R-D483H de PglBcy (pGVXN635) que para la cepa que expresaba PglBcy de tipo natural (pGVXN114). Se encontró una mejora en los cultivos en matraz de agitación tanto inducidos por IPTG como no inducidos. Se cuantificó la intensidad global de las bandas específicas para CP5 en el intervalo de masa molecular de 50-110 kDa con el software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Se restó el valor de Grey del fondo local. Los eluatos de HisTrap en la cepa que expresaba K482R-D483H de PglBcy contenían 2,0 veces más CP5-Hla que los de la cepa que expresaba PglBcy de tipo natural.
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Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    i . N-oligosacariltransferasa recombinante que es la PglB de Campylobacter jejuni (PglBcy) o la PglB de Campylobacter lari (PglBci), en la que la N-oligosacariltransferasa (N-OST) recombinante puede ligar de manera detectable un oligosacárido o polisacárido que carece de un N-acetil-azúcar en el extremo reductor a una proteína transportadora en una secuencia consenso de N-glicosilación, en la que uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y77, S80, S196, N311, Y462, K482, D483 y G477 de PglBcy están modificados.
  2. 2. N-oligosacariltransferasa recombinante según la reivindicación 1, en la que la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende una modificación en uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales están ubicadas dentro de una distancia de 2,5-4,0 A desde una de las tres unidades de monosacárido terminales en el extremo reductor del componente de oligosacárido o polisacárido de una proteína transportadora N-glicosilada unida en un modelo estructural de un complejo de la N-oligosacariltransferasa recombinante y la proteína transportadora N-glicosilada.
  3. 3. N-oligosacariltransferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que N-oligosacariltransferasa recombinante comprende una modificación en dos o más aminoácidos.
  4. 4. N-oligosacariltransferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que al menos uno del uno o más aminoácidos está ubicado en un bucle periplásmico de un dominio transmembrana de la N-oligosacariltransferasa recombinante.
  5. 5. N-oligosacariltransferasa recombinante según la reivindicación 1, en la que la N-oligosacariltransferasa recombinante comprende además una mutación en uno o más aminoácidos en un motivo QLKFYxxR.
  6. 6. N-oligosacariltransferasa recombinante según la reivindicación 5, en la que N311 de PglBcy está modificado.
  7. 7. Mutante de N-oligosacariltransferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la PglBcy recombinante comprende además una modificación en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y77 y S80.
  8. 8. Mutante de N-oligosacariltransferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la PglBcy recombinante comprende además una modificación de aminoácido en uno o más aminoácidos del motivo Q287LKFYxxR294 de PglBcy.
  9. 9. Mutante de N-oligosacariltransferasa recombinante según la reivindicación 8, en el que la PglBcy recombinante comprende una modificación de aminoácido en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Q287, L288, K289 y R294.
  10. 10. Ácido nucleico que codifica para una N-oligosacariltransferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  11. 11. Célula huésped que comprende una N-oligosacariltransferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  12. 12. Método de producción de un bioconjugado que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 11 en un medio de cultivo celular.
  13. 13. Método según la reivindicación 12, que comprende además purificar el bioconjugado a partir del cultivo de células huésped.
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