CN102334033A - 生物学流体中供检测新生儿败血病用的生物标志 - Google Patents

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Abstract

本发明关注使用全局蛋白质组方法来鉴定并检测新生儿败血病的生物学流体生物标志。

Description

生物学流体中供检测新生儿败血病用的生物标志
发明领域
本发明关注使用全局蛋白质组方法来鉴定并检测生物学流体中的新生儿败血病和新生儿败血病相关并发症的生物标志。
发明背景
败血病是新生儿加强护理收治的新生儿的一项严重问题。它与死亡率、发病率升高、和住院期长度延长有关。如此，这些感染的人力和财政成本两者都较高。可能的(“排除”或“疑似”)早期发作败血症仍然是新生儿加强护理病房(NICU)的最常见收治诊断。虽然早期发作败血病的比率随早产和低出生重量两者的程度而增加，但是尚未显示特定的实验室测试足够精确地容许鉴定患有“真实的”血流感染，并且因此需要用全程抗生素治疗的患者。因此，抗生素使用是“经证实的”败血病的比率的许多倍，而且这些药剂的过度使用促成新生儿加强护理病房中的抗性生物体的生长(Clarke 2004)。另外，住院期的延长不能测量地增加NICU的护理成本，而且提高来自随后医院获得的微生物的医院败血症的风险。
美国卫生与人类服务部疾病控制和预防中心将早期发作感染定义为在住院期间在生命的前72小时期间发生的感染，而晚期发作感染在该时间期后发生(Lopez 2002)。医院感染相当于晚期发作，或生命的前72小时后的感染(Craft 2001)。感染率可以规定为收治百分比、活产婴儿百分比、或者按每1000患者日的感染数目计。早期发作感染率以约千分之二活产一致地运行。因为20％至30％的早产新生儿可以具有两种或更多种医院感染事件，所以每患者日的感染率可能给出晚期发作感染强度的更准确的观念，而每患者组(收治、活产婴儿、出生重量范围、孕龄范围)的比率给出发作或发生率的良好观念。
新生儿加强护理病房(NICU)医院或晚期发作感染率在过去十年里已经升高(Craft 2001，Zafar 2001)。每例收治形成医院感染的新生儿的总数从6.2％(Ferguson 1996)变化至33％(Hentschel 1999)，或者在以每1000患者日的总感染报告时，比率从4.8(Ferguson 1996)变化至22(Drews 1995)。血流感染(医院败血病)从3％变化至28％的收治(Ferguson 1996，Hentschel 1999，Berger1998，Horbar 2001，Nagata 2002)。感染率的可变性取决于孕龄、为报告调查的婴儿的分布、及特定的环境和护理实践(Gaynes 1996)。
用于诊断真正的早期发作败血病的黄金标准仍然是已知病原体的阳性血液培养的发现。通常，在新生儿在临床过程中具有下列至少两项特征和1mL或更大体积的阳性血液培养时，会认为存在早期发作败血病：
1)大于100.4°F的发热、分娩期间延长的过早膜破裂(大于12小时持续时间)、或推测的绒毛膜羊膜炎的母体史
2)分娩时出现恶臭或化浓的羊水
3)与败血病一致的临床发现，其可以包括下列任何体征：低的5分钟阿普加(Apgar)评分(小于6)、苍白、发绀、低血压、呼吸急促、心动过速、呼吸暂停、腹部膨胀、喂养不良、或嗜睡
4)支持实验室数据，其包括CBC上的WBC计数＜8000/mm3或＞35,000/mm3；I:T嗜中性粒细胞计数＞2；CRP＞8；或胸腔放射照片上的肺炎。
这提出需要鉴定分娩时获得的生物学流体内的败血病相关生物标志，其能够鉴定患有早期发作新生儿败血病和新生儿败血病相关并发症的受试者以便于早期治疗。新生儿败血病及其相关发病率的风险降低可以较多地取决于有风险患者的较早期鉴定。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种用于在哺乳动物受试者中诊断新生儿败血病的方法，包括：(a)相对于正常的生物学流体或已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平，在自所述受试者获得的生物学流体的样品中测试一种或多种选自下组的蛋白质的水平：C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、白介素-1受体辅助蛋白前体(SEQ ID NO：2)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、白介素-1受体样1前体(SEQ ID NO：4)、血清淀粉状蛋白A蛋白前体(SEQ ID NO：5)、CD5抗原样前体(SEQ ID NO：6)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、骨髓蛋白聚糖前体(SEQ ID NO：8)、硒结合蛋白1(SEQ ID NO：9)、脂多糖结合蛋白前体(SEQ ID NO：10)、硫酸软骨素蛋白聚糖4前体(SEQ ID NO：11)、骨桥蛋白前体(SEQ ID NO：12)、ρGDP解离抑制剂2(SEQ ID NO：13)、碳酸酐酶2(SEQ IDNO：14)、嗜中性粒细胞明胶酶关联脂笼蛋白前体(SEQ ID NO：15)、胶原α-5(IV)链前体(SEQ ID NO：16)、结缔组织生长因子前体(SEQ ID NO：17)、巨噬细胞集落刺激因子1前体(SEQ ID NO：18)、蛋白质激酶C结合蛋白NELL2前体(SEQID NO：19)、Neudesin前体(SEQ ID NO：20)、蛋白质二硫化物异构酶前体(SEQID NO：21)、核糖核酸酶胰前体(SEQ ID NO：22)、δ样蛋白前体(SEQ IDNO：23)、嗜铬粒蛋白-A前体(SEQ ID NO：24)、骨调蛋白前体(SEQ ID NO：25)、胶原α-2(I)链前体(SEQ ID NO：26)、原低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体(SEQID NO：27)、层粘连蛋白亚基γ-1前体(SEQ ID NO：28)、层粘连蛋白亚基β-1前体(SEQ ID NO：29)、胶原α-1(II)链前体(SEQ ID NO：30)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、蛋白FAM3C前体(SEQ ID NO：32)、α-辅肌动蛋白-1(SEQ ID NO：33)、F-肌动蛋白加帽蛋白亚基α-1(SEQ ID NO：34)、氨肽酶N(SEQ ID NO：35)、胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、细胞粘附分子1前体(SEQ ID NO：37)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、Exostosin-2(SEQ ID NO：39)、组织蛋白酶D前体(SEQ ID NO：40)、神经源性基因座notch同系物蛋白3前体(SEQ ID NO：41)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ IDNO：42)、Noelin前体(SEQ ID NO：43)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQID NO：44)、内质蛋白前体(SEQ ID NO：45)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型前体(SEQ ID NO：46)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性链前体(SEQ ID NO：47)、埃兹蛋白(SEQ ID NO：48)、肝型脂肪酸结合蛋白(SEQ ID NO：49)、可能的G蛋白偶联受体116前体(SEQ ID NO：50)、Seprase(SEQ ID NO：51)、癌蛋白诱导的转录物3蛋白前体(SEQ ID NO：52)、缺氧上调型蛋白1前体(SEQ ID NO：53)、跨高尔基体网络膜内在蛋白2前体(SEQ IDNO：54)、转酮酶(SEQ ID NO：55)、受体型酪氨酸蛋白质磷酸酶F前体(SEQ IDNO：56)、细胞间粘附分子1前体(SEQ ID NO：57)、低密度脂蛋白受体前体(SEQID NO：58)、78kDa葡萄糖调节型蛋白前体(SEQ ID NO：59)、punc e11相邻物前体(SEQ ID NO：60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO：61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO：62)、基质金属蛋白酶9(SEQ IDNO：64)、α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)、和应激诱导的磷蛋白1(SEQ IDNO：63)；并(b)若所述水平相对于所述正常的生物学流体中的水平显示统计学显著差异，或者相对于所述已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平不显示统计学显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
在某些实施方案中，方法包括测试任意组合的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种等的所列蛋白质的水平。
在一个具体的实施方案中，受试者是人患者。
在某些实施方案中，生物学流体选自下组：脐带血、脑脊液、和新生儿血清。在一个具体的实施方案中，生物学流体是脐带血。
在另一个实施方案中，在出生的24小时内确定诊断。
在一个实施方案中，使用适合于测定所述蛋白质水平的装置来执行测试。在另一个实施方案中，通过使用由合适的处理器执行的软件程序来实施测试。在某些实施方案中，程序包含在储存于实体介质上的软件中。在某些其它实施方案中，实体介质选自下组：CD-ROM、软盘、硬盘、DVD、和与处理器关联的存储器。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括制备记录诊断或测试结果的报告的步骤。在一个实施方案中，将报告记录或储存于实体介质上。在一个具体的实施方案中，实体介质是纸。在另一个实施方案中，实体介质选自下组：CD-ROM、软盘、硬盘、DVD、和与处理器关联的存储器。
在某些其它实施方案中，本发明的方法进一步包括将所述诊断的结果与感兴趣方通信的步骤。在一个实施方案中，感兴趣方是患者或主治内科医生。在另一个实施方案中，通信以书写、通过电子邮件、或者通过电话进行。
在一个实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQ IDNO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)的水平，并且若相对于正常的脐带血，一种或多种所述测试蛋白质在脐带血样品中显示显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。在某些实施方案中，方法包括若相对于正常的脐带血，所有所述测试蛋白质在脐带血样品中显示显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
在一个实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和白介素-6前体(SEQ ID NO：3)的水平，并且若相对于正常的脐带血，一种或多种所述测试蛋白质在脐带血样品中显示显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。在其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)的水平。在又一些其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和β-2-微球蛋白前体(SEQ IDNO：7)的水平。在又一些其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)的水平。在又一些其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ IDNO：42)的水平。在又一些其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)的水平。在又一些其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和基质金属蛋白酶9(SEQ IDNO：64)的水平。在又一些其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ IDNO：31)的水平。在又一些其它实施方案中，方法包括测试蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)的水平。
在某些实施方案中，通过免疫测定法、通过质谱术、或者通过使用蛋白质阵列来测定所列蛋白质的水平。
在另一个方面，本发明提供了任一种或多种选自下组的蛋白质在制造用于早期诊断受试者中的新生儿败血病的生物学流体的蛋白质组概况中的用途：C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、白介素-1受体辅助蛋白前体(SEQ IDNO：2)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、白介素-1受体样1前体(SEQ ID NO：4)、血清淀粉状蛋白A蛋白前体(SEQ ID NO：5)、CD5抗原样前体(SEQ ID NO：6)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、骨髓蛋白聚糖前体(SEQ ID NO：8)、硒结合蛋白1(SEQ ID NO：9)、脂多糖结合蛋白前体(SEQ ID NO：10)、硫酸软骨素蛋白聚糖4前体(SEQ ID NO：11)、骨桥蛋白前体(SEQ ID NO：12)、ρGDP解离抑制剂2(SEQ ID NO：13)、碳酸酐酶2(SEQ ID NO：14)、嗜中性粒细胞明胶酶关联脂笼蛋白前体(SEQ ID NO：15)、胶原α-5(IV)链前体(SEQ ID NO：16)、结缔组织生长因子前体(SEQ ID NO：17)、巨噬细胞集落刺激因子1前体(SEQ IDNO：18)、蛋白质激酶C结合蛋白NELL2前体(SEQ ID NO：19)、Neudesin前体(SEQ ID NO：20)、蛋白质二硫化物异构酶前体(SEQ ID NO：21)、核糖核酸酶胰前体(SEQ ID NO：22)、δ样蛋白前体(SEQ ID NO：23)、嗜铬粒蛋白-A前体(SEQ ID NO：24)、骨调蛋白前体(SEQ ID NO：25)、胶原α-2(I)链前体(SEQ IDNO：26)、原低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体(SEQ ID NO：27)、层粘连蛋白亚基γ-1前体(SEQ ID NO：28)、层粘连蛋白亚基β-1前体(SEQ ID NO：29)、胶原α-1(II)链前体(SEQ ID NO：30)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、蛋白FAM3C前体(SEQ ID NO：32)、α-辅肌动蛋白-1(SEQ ID NO：33)、F-肌动蛋白加帽蛋白亚基α-1(SEQ ID NO：34)、氨肽酶N(SEQ ID NO：35)、胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、细胞粘附分子1前体(SEQ ID NO：37)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、Exostosin-2(SEQ ID NO：39)、组织蛋白酶D前体(SEQ ID NO：40)、神经源性基因座notch同系物蛋白3前体(SEQ IDNO：41)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、Noelin前体(SEQ IDNO：43)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、内质蛋白前体(SEQ ID NO：45)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型前体(SEQ IDNO：46)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性链前体(SEQ IDNO：47)、埃兹蛋白(SEQ ID NO：48)、肝型脂肪酸结合蛋白(SEQ ID NO：49)、可能的G蛋白偶联受体116前体(SEQ ID NO：50)、Seprase(SEQ ID NO：51)、癌蛋白诱导的转录物3蛋白前体(SEQ ID NO：52)、缺氧上调型蛋白1前体(SEQID NO：53)、跨高尔基体网络膜内在蛋白2前体(SEQ ID NO：54)、转酮酶(SEQID NO：55)、受体型酪氨酸蛋白质磷酸酶F前体(SEQ ID NO：56)、细胞间粘附分子1前体(SEQ ID NO：57)、低密度脂蛋白受体前体(SEQ ID NO：58)、78kDa葡萄糖调节型蛋白前体(SEQ ID NO：59)、punc e11相邻物前体(SEQ IDNO：60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO：61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO：62)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)、和应激诱导的磷蛋白1(SEQ ID NO：63)。
在某些实施方案中，蛋白质组概况包括任意组合的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种等所列蛋白质水平的信息。
在一个具体的实施方案中，受试者是人患者。
在某些实施方案中，生物学流体选自下组：脐带血、新生儿血清和脑脊液。在一个具体的实施方案中，生物学流体是脐带血。
在一个实施方案中，蛋白质组概况包含所述蛋白质水平的信息，且其中若相对于正常的生物学流体，一种或多种所述测试蛋白质在生物学流体样品中显示显著差异，则做出所述受试者患有新生儿败血病的诊断。
在另一个实施方案中，在出生的24小时内确定诊断。
在一个实施方案中，蛋白质组概况包含蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQID NO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ IDNO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)水平的信息，且其中若相对于正常的生物学流体，一种或多种所述测试蛋白质在生物学流体样品中显示显著差异，则做出所述受试者患有新生儿败血病的诊断。在一个具体的实施方案中，若相对于正常的生物学流体，所有所述测试蛋白质在生物学流体样品中显示显著差异，则做出所述受试者患有新生儿败血病的诊断。
在某些实施方案中，通过免疫测定法、通过质谱术、或者通过使用蛋白质阵列来测定所列蛋白质的水平。
在又一个方面，本发明提供了一种免疫测定试剂盒，其包含用于检测一种或多种选自下组的蛋白质的抗体和试剂：C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、白介素-1受体辅助蛋白前体(SEQ ID NO：2)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、白介素-1受体样1前体(SEQ ID NO：4)、血清淀粉状蛋白A蛋白前体(SEQ IDNO：5)、CD5抗原样前体(SEQ ID NO：6)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、骨髓蛋白聚糖前体(SEQ ID NO：8)、硒结合蛋白1(SEQ ID NO：9)、脂多糖结合蛋白前体(SEQ ID NO：10)、硫酸软骨素蛋白聚糖4前体(SEQ ID NO：11)、骨桥蛋白前体(SEQ ID NO：12)、ρGDP解离抑制剂2(SEQ ID NO：13)、碳酸酐酶2(SEQ ID NO：14)、嗜中性粒细胞明胶酶关联脂笼蛋白前体(SEQ ID NO：15)、胶原α-5(IV)链前体(SEQ ID NO：16)、结缔组织生长因子前体(SEQ ID NO：17)、巨噬细胞集落刺激因子1前体(SEQ ID NO：18)、蛋白质激酶C结合蛋白NELL2前体(SEQ ID NO：19)、Neudesin前体(SEQ ID NO：20)、蛋白质二硫化物异构酶前体(SEQ ID NO：21)、核糖核酸酶胰前体(SEQ ID NO：22)、δ样蛋白前体(SEQ ID NO：23)、嗜铬粒蛋白-A前体(SEQ ID NO：24)、骨调蛋白前体(SEQ IDNO：25)、胶原α-2(I)链前体(SEQ ID NO：26)、原低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体(SEQ ID NO：27)、层粘连蛋白亚基γ-1前体(SEQ ID NO：28)、层粘连蛋白亚基β-1前体(SEQ ID NO：29)、胶原α-1(II)链前体(SEQ ID NO：30)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、蛋白FAM3C前体(SEQ ID NO：32)、α-辅肌动蛋白-1(SEQ ID NO：33)、F-肌动蛋白加帽蛋白亚基α-1(SEQ ID NO：34)、氨肽酶N(SEQ ID NO：35)、胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、细胞粘附分子1前体(SEQ ID NO：37)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、Exostosin-2(SEQ ID NO：39)、组织蛋白酶D前体(SEQ ID NO：40)、神经源性基因座notch同系物蛋白3前体(SEQ ID NO：41)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、Noelin前体(SEQ ID NO：43)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、内质蛋白前体(SEQ ID NO：45)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型前体(SEQ ID NO：46)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性链前体(SEQ ID NO：47)、埃兹蛋白(SEQ ID NO：48)、肝型脂肪酸结合蛋白(SEQ ID NO：49)、可能的G蛋白偶联受体116前体(SEQ IDNO：50)、Seprase(SEQ ID NO：51)、癌蛋白诱导的转录物3蛋白前体(SEQ IDNO：52)、缺氧上调型蛋白1前体(SEQ ID NO：53)、跨高尔基体网络膜内在蛋白2前体(SEQ ID NO：54)、转酮酶(SEQ ID NO：55)、受体型酪氨酸蛋白质磷酸酶F前体(SEQ ID NO：56)、细胞间粘附分子1前体(SEQ ID NO：57)、低密度脂蛋白受体前体(SEQ ID NO：58)、78kDa葡萄糖调节型蛋白前体(SEQ IDNO：59)、punc e11相邻物前体(SEQ ID NO：60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO：61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO：62)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)、和应激诱导的磷蛋白1(SEQ ID NO：63)。
在另一个方面，本发明提供了一种免疫测定试剂盒，其包含用于检测一种或多种选自下组的蛋白质的抗体和试剂：胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQ IDNO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)。
在一个实施方案中，免疫测定试剂盒包含用于检测所有所列蛋白质的抗体和试剂。
在又一个方面，本发明提供了一份报告，其包含测试的结果和/或基于测试的诊断，包括(a)相对于正常的生物学流体或已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平，在自所述受试者获得的生物学流体的样品中测试一种或多种选自下组的蛋白质的水平：C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、白介素-1受体辅助蛋白前体(SEQ ID NO：2)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、白介素-1受体样1前体(SEQ ID NO：4)、血清淀粉状蛋白A蛋白前体(SEQ ID NO：5)、CD5抗原样前体(SEQ ID NO：6)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、骨髓蛋白聚糖前体(SEQ ID NO：8)、硒结合蛋白1(SEQ ID NO：9)、脂多糖结合蛋白前体(SEQID NO：10)、硫酸软骨素蛋白聚糖4前体(SEQ ID NO：11)、骨桥蛋白前体(SEQID NO：12)、ρGDP解离抑制剂2(SEQ ID NO：13)、碳酸酐酶2(SEQ ID NO：14)、嗜中性粒细胞明胶酶关联脂笼蛋白前体(SEQ ID NO：15)、胶原α-5(IV)链前体(SEQ ID NO：16)、结缔组织生长因子前体(SEQ ID NO：17)、巨噬细胞集落刺激因子1前体(SEQ ID NO：18)、蛋白质激酶C结合蛋白NELL2前体(SEQ IDNO：19)、Neudesin前体(SEQ ID NO：20)、蛋白质二硫化物异构酶前体(SEQ IDNO：21)、核糖核酸酶胰前体(SEQ ID NO：22)、δ样蛋白前体(SEQ ID NO：23)、嗜铬粒蛋白-A前体(SEQ ID NO：24)、骨调蛋白前体(SEQ ID NO：25)、胶原α-2(I)链前体(SEQ ID NO：26)、原低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体(SEQ IDNO：27)、层粘连蛋白亚基γ-1前体(SEQ ID NO：28)、层粘连蛋白亚基β-1前体(SEQ ID NO：29)、胶原α-1(II)链前体(SEQ ID NO：30)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、蛋白FAM3C前体(SEQ ID NO：32)、α-辅肌动蛋白-1(SEQID NO：33)、F-肌动蛋白加帽蛋白亚基α-1(SEQ ID NO：34)、氨肽酶N(SEQ IDNO：35)、胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、细胞粘附分子1前体(SEQ ID NO：37)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、Exostosin-2(SEQID NO：39)、组织蛋白酶D前体(SEQ ID NO：40)、神经源性基因座notch同系物蛋白3前体(SEQ ID NO：41)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、Noelin前体(SEQ ID NO：43)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ IDNO：44)、内质蛋白前体(SEQ ID NO：45)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型前体(SEQ ID NO：46)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性链前体(SEQ ID NO：47)、埃兹蛋白(SEQ ID NO：48)、肝型脂肪酸结合蛋白(SEQID NO：49)、可能的G蛋白偶联受体116前体(SEQ ID NO：50)、Seprase(SEQ IDNO：51)、癌蛋白诱导的转录物3蛋白前体(SEQ ID NO：52)、缺氧上调型蛋白1前体(SEQ ID NO：53)、跨高尔基体网络膜内在蛋白2前体(SEQ ID NO：54)、转酮酶(SEQ ID NO：55)、受体型酪氨酸蛋白质磷酸酶F前体(SEQ ID NO：56)、细胞间粘附分子1前体(SEQ ID NO：57)、低密度脂蛋白受体前体(SEQ IDNO：58)、78kDa葡萄糖调节型蛋白前体(SEQ ID NO：59)、punc e11相邻物前体(SEQ ID NO：60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO：61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO：62)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)、和应激诱导的磷蛋白1(SEQ ID NO：63)；并(b)若所述水平相对于所述正常的生物学流体中的水平显示统计学显著差异，或者相对于所述已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平不显示统计学显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
在又一个方面，本发明提供了一种实体介质，其储存测试的结果和/或基于测试的诊断，包括(a)相对于正常的生物学流体或已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平，在自所述受试者获得的生物学流体的样品中测试一种或多种选自下组的蛋白质的水平：C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、白介素-1受体辅助蛋白前体(SEQ ID NO：2)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、白介素-1受体样1前体(SEQ ID NO：4)、血清淀粉状蛋白A蛋白前体(SEQ ID NO：5)、CD5抗原样前体(SEQ ID NO：6)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、骨髓蛋白聚糖前体(SEQ ID NO：8)、硒结合蛋白1(SEQ ID NO：9)、脂多糖结合蛋白前体(SEQ ID NO：10)、硫酸软骨素蛋白聚糖4前体(SEQ ID NO：11)、骨桥蛋白前体(SEQ ID NO：12)、ρGDP解离抑制剂2(SEQ ID NO：13)、碳酸酐酶2(SEQ IDNO：14)、嗜中性粒细胞明胶酶关联脂笼蛋白前体(SEQ ID NO：15)、胶原α-5(IV)链前体(SEQ ID NO：16)、结缔组织生长因子前体(SEQ ID NO：17)、巨噬细胞集落刺激因子1前体(SEQ ID NO：18)、蛋白质激酶C结合蛋白NELL2前体(SEQID NO：19)、Neudesin前体(SEQ ID NO：20)、蛋白质二硫化物异构酶前体(SEQID NO：21)、核糖核酸酶胰前体(SEQ ID NO：22)、δ样蛋白前体(SEQ IDNO：23)、嗜铬粒蛋白-A前体(SEQ ID NO：24)、骨调蛋白前体(SEQ ID NO：25)、胶原α-2(I)链前体(SEQ ID NO：26)、原低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体(SEQID NO：27)、层粘连蛋白亚基γ-1前体(SEQ ID NO：28)、层粘连蛋白亚基β-1前体(SEQ ID NO：29)、胶原α-1(II)链前体(SEQ ID NO：30)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、蛋白FAM3C前体(SEQ ID NO：32)、α-辅肌动蛋白-1(SEQ ID NO：33)、F-肌动蛋白加帽蛋白亚基α-1(SEQ ID NO：34)、氨肽酶N(SEQ ID NO：35)、胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、细胞粘附分子1前体(SEQ ID NO：37)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、Exostosin-2(SEQ ID NO：39)、组织蛋白酶D前体(SEQ ID NO：40)、神经源性基因座notch同系物蛋白3前体(SEQ ID NO：41)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ IDNO：42)、Noelin前体(SEQ ID NO：43)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQID NO：44)、内质蛋白前体(SEQ ID NO：45)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型前体(SEQ ID NO：46)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性链前体(SEQ ID NO：47)、埃兹蛋白(SEQ ID NO：48)、肝型脂肪酸结合蛋白(SEQ ID NO：49)、可能的G蛋白偶联受体116前体(SEQ ID NO：50)、Seprase(SEQ ID NO：51)、癌蛋白诱导的转录物3蛋白前体(SEQ ID NO：52)、缺氧上调型蛋白1前体(SEQ ID NO：53)、跨高尔基体网络膜内在蛋白2前体(SEQ IDNO：54)、转酮酶(SEQ ID NO：55)、受体型酪氨酸蛋白质磷酸酶F前体(SEQ IDNO：56)、细胞间粘附分子1前体(SEQ ID NO：57)、低密度脂蛋白受体前体(SEQID NO：58)、78kDa葡萄糖调节型蛋白前体(SEQ ID NO：59)、punc e11相邻物前体(SEQ ID NO：60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO：61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO：62)、基质金属蛋白酶9(SEQ IDNO：64)、α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)、和应激诱导的磷蛋白1(SEQ IDNO：63)；并(b)若所述水平相对于所述正常的生物学流体中的水平显示统计学显著差异，或者相对于所述已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平不显示统计学显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
附图简述
图1描绘了脐带血DIGE分析：(A)对照(红色)对疑似败血病(SS)(绿色)DIGE凝胶。(B)对照(红色)对经确认的败血病(CS)(绿色)DIGE凝胶。没有差异表达的点表现为黄色。(C)疑似败血病(SS)对对照间的差异表达的点。(D)经确认的败血病(CS)对对照间的差异表达的点。以红色突出显示的点测定为下调大于等于2倍，而以绿色突出显示的点测定为上调大于等于2倍。
图2描绘了将来自对照、疑似败血病(SS)、和经确认的败血病(CS)新生儿受试者的脐带血蛋白质的谱计数加载入GeneMaths软件中以进行差异表达显现。蛋白质使用以200次迭代的欧几里得(Euclidean)距离学习分级聚类，并在图2A中显示。还显示了上调(图2B)和下调的蛋白质(图2C)的选定的亚簇。相应标记了选定的亚簇在图2A中的位置。
发明详述
I.定义
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley&Sons(New York，NY1994)给本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般指导。
术语“新生儿败血病”在本文中用于描述新生儿的血液感染，并且包括与此类感染有关的所有并发症。新生儿败血病相关的并发症包括但不限于呼吸窘迫综合征(RDS)、中枢神经系统(CNS)并发症例如脑室周围出血和脑室周围白质软化、智力低下、大脑性瘫痪(CP)、失能和死亡。
术语“蛋白质组”在本文中用于描述给定时间的生物学样品中的显著分数的蛋白质。蛋白质组的概念与基因组从根本上不同。虽然基因组实质上是静态的，但是蛋白质组响应内部和外部事件而不断变化。
术语“蛋白质组概况”用于指给定时间的生物学样品例如生物学流体中的多种蛋白质的表达样式的呈现。蛋白质组概况可以例如以质谱呈现，但是也包括基于蛋白质的任何物理化学或生物化学特性的其它呈现。如此，蛋白质组概况可以例如基于蛋白质的电泳特性的差异，如通过二维凝胶电泳，例如通过2-D PAGE所测定的，而且可以例如以二维电泳凝胶中的多个点呈现。
即使在没有明确鉴定的蛋白质的情况中，差异表达谱可以具有重要的诊断价值。然后，可以例如通过免疫印迹来检测单一蛋白质点，使用蛋白质阵列来检测多个点或蛋白质。蛋白质组概况通常呈现或含有范围可以为几个峰至呈现50或更多个峰的复杂谱的信息。如此，例如，蛋白质组概况可以含有或呈现至少2、或至少5或至少10或至少15、或至少20、或至少25、或至少30、或至少35、或至少40、或至少45、或至少50、或至少60、或至少65、或至少70、或至少75、或至少80、或至少85、或至少85、或至少90、或至少95、或至少100、或至少125、或至少150、或至少175、或至少200种蛋白质。
如本文中所使用的，术语“生物学流体”指自人或其它动物衍生的液体材料。生物学流体包括但不限于脐带血、新生儿血清、脑脊液(CSF)、宫颈-阴道流体(CVF)、羊水、血清、血浆、尿液、脑脊液、母乳、粘液、唾液、和汗液。
“患者响应”可以使用指明对患者的益处的任何终点来评估，包括但不限于(1)至少在某种程度上抑制病理学状况的进展，(2)预防病理学状况，(3)至少在某种程度上减轻一种或多种与病理学状况有关的症状；(4)治疗后的存活长度延长；和/或(5)治疗后给定时间点的死亡率降低。
术语“治疗/处理”指治疗性处理和防范性或预防性措施两者，其中目的是预防或减缓(减轻)靶定的病理学状况或病症。需要治疗的对象包括那些已经患有病症的对象及那些倾向于患有病症的对象或那些要预防病症的对象。
如本文中所使用的，任何特定蛋白质的名称包括所有片段、前体、和天然存在的变体，诸如可变剪接和等位变体和同等型，及命名的蛋白质的可溶形式，以及其它物种中的天然序列同系物(包括所有天然存在的变体)。如此，例如，在叙述测试触珠蛋白前体(Swiss-Prot登录号P00738)水平时，该叙述明确包括测试以Swiss-Prot登录号P00738所列的蛋白质的任何片段、前体、或天然存在的变体，及其非人同系物和其天然存在的变体(若受试者是非人的话)。
II.详细描述
本发明关注通过对生物学流体，诸如脐带血的蛋白质组分析来早期、可靠和非侵入性测试新生儿败血病和/或新生儿败血病相关并发症的方法和手段。本发明进一步关注鉴定新生儿败血病的生物标志。在另一个方面，本发明关注蛋白质在制备或制造作为用于早期测定新生儿败血病的手段的蛋白质组概况中的用途。本发明利用本领域中公知的蛋白质组学技术，如记载于例如下列教科书，在此通过提及而明确收录其内容：Proteome Research：NewFrontiers in Functional Genomics(Principles and Practice)，M.R.Wilkins等编，Springer Verlag，1007；2-D Proteome Analysis Protocols，Andrew L Link编，Humana Press，1999；Proteome Research：Two-Dimensional Gel Electrophoresisand Identification Methods(Principles and Practice)，T.Rabilloud编，SpringerVerlag，2000；Proteome Research：Mass Spectrometry(Principles and Practice)，P.James编，Springer Verlag，2001；Introduction to Proteomics，D.C.Liebler编，Humana Press，2002；Proteomics in Practice：A Laboratory Manual of ProteomeAnalysis，R.Westermeier等编，John Wiley&Sons，2002。
本领域技术人员会认可与本文中所描述的方法和材料相似或等同的许多方法和材料，它们可以在本发明的实践中使用。实际上，本发明决不受限于所描述的方法和材料。
1.生物学流体中表达的蛋白质和多肽的鉴定
依照本发明，可以使用本领域中已知的多种方法来实施对生物学流体的蛋白质组学分析。生物学流体包括例如脐带血、新生儿血清、脑脊液(CSF)、宫颈-阴道流体(CVF)、羊水、血清、血浆、尿液、脑脊液、母乳、粘液、唾液、和汗液。
通常，比较来自不同来源的样品，诸如正常的生物学流体(正常样品)和测试生物学流体(测试样品)的蛋白质样式(蛋白质组图谱)以检测疾病中上调或下调的蛋白质。然后，可以切出这些蛋白质以鉴定和完全表征，例如使用肽质量指纹法和/或质谱术和测序法来进行，或者可以直接使用正常的和/或疾病特异的蛋白质组图谱来诊断感兴趣的疾病，或者以确认疾病的存在或缺失。
在比较分析中，重要的是以完全相同的方式处理正常样品和测试样品，以便正确地呈现蛋白质的相对水平或多度，并获得精确的结果。总蛋白质的需要量会取决于所使用的分析技术，而且本领域技术人员可以容易地确定。存在于生物学样品中的蛋白质通常依照其pI和分子量通过二维凝胶电泳(2-DE)来分开。蛋白质首先使用等电聚焦(一维凝胶电泳)通过其电荷来分开。此步骤可以例如使用商品化的固定化pH梯度(IPG)条来实施。第二维是正常的SDS-PAGE分析，其中使用聚焦的IPG条作为样品。2-DE分离后，可以用常规的染料，如考马斯蓝或银染色来显现蛋白质，并使用已知的技术和设备，诸如例如Bio-Rad GS800密度计和PDQUEST软件(这两者都是商品化的)来对其成像。然后，自凝胶切出个别的点，将其脱色，并进行胰蛋白酶消化。可以通过质谱术(MS)分析肽混合物。或者，可以例如通过毛细管高压液相层析(HPLC)分离肽，并可以通过MS个别地或集合地对其分析。
质谱仪由离子源、质量分析仪、离子检测仪、和数据获得单元构成。首先，将肽在离子源中离子化。然后，将离子化的肽依照其质荷比在质量分析仪中分离，并检测分开的离子。已经在蛋白质分子中广泛使用质谱术，特别是自基质辅助激光解吸离子化/飞行时间(MALDI-TOF)和电喷射离子化(ESI)法的发明以来。有数种型式的质谱仪，包括例如MALDI-TOF和三或四极-TOF，或与ESI偶联的离子阱质量分析仪。如此，例如，Q-Tof-2质谱仪利用直交飞行时间分析仪，其容许同时检测在完全质谱范围间的离子。关于进一步的详情，参见例如Chemusevich等，J.Mass Spectrom.36：849-865(2001)。若想要的话，可以通过本领域中已知的技术，诸如质谱术的某些变型，或埃德曼(Edman)降解来测定肽片段和最终它们来源的蛋白质的氨基酸序列。
2.新生儿败血病的早期检测
新生儿败血病(定义为新生儿的血液感染)难以在临床上诊断。尽管在新生儿护理上有进展，但是来自新生儿败血病的死亡率和发病率仍然较高(Stoll 2002)。新生儿败血病是新生儿发病(包括神经发育结果不良和新生儿死亡)的一项重要贡献因素。新生儿败血病相关并发症包括例如呼吸窘迫综合征(RDS)、中枢神经系统(CNS)并发症、大脑性瘫痪(CP)、失能和死亡。
新生儿败血病的最高比率在低出生重量(LBW)婴儿、那些在出生时具有受抑制的呼吸功能的婴儿、和那些具有母体产期风险因素的婴儿中发生。早期发作新生儿败血病的风险因素包括产科并发症，包括早产分娩、过早膜破裂、母体出血，其原因是例如前置胎盘、胎盘早期脱离、羊水、胎盘、尿道或子宫内膜的感染、毒血症、急促分娩(precipitous delivery)、和分娩期间频繁的阴道检查。延长的住院期和受污染的医院设备是晚期发作新生儿败血病的常见原因。能引起新生儿败血病的生物体包括下列非限制性例子：凝固酶阴性葡萄球菌(staphylococci)包括表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、和头状葡萄球菌(S.capitis)、B群葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus fecalis)和屎肠球菌(E.faecium)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(P.aerugmosa)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、牛链球菌(Streptococcusbovis)、α-溶血性链球菌、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)和淋病炎奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)。通常，引起早期发作新生儿败血病的生物体是产时由于自宫颈的上行性感染、自母亲经胎盘或者随胎儿通过产道而获得的。
不幸地，由于非特异性且微小的早期体征，新生儿败血病的诊断是困难的。新生儿败血病的体征和症状包括例如体温变化、呼吸问题、腹泻、低血糖、运动减少、吮吸减少、发作(seizure)、心率缓慢、腹部区域肿胀、呕吐、和黄疸。用于诊断新生儿败血病的黄金标准是血液培养；然而，即使在存在败血病的强临床指标时及即使在后来通过尸体检查证明细菌感染的情况中也发生阴性血液培养(Kaufman D，Fairchild KD，Clin Microbiol Rev.2004Jul；17(3)：638-80)。此外，常常难以在新生儿，尤其是早产新生儿中获得足够的血液样品。鉴于其快速进展和高死亡率，通常施用快速的经验抗生素疗法，直到血液培养结果。初始疗法可以包括氨苄青霉素或青霉素G和氨基糖苷，例如庆大霉素、或头孢噻肟。鉴于与新生儿败血病有关的阴性结果及在目前用于检测新生儿败血病的可用手段上缺乏信心，抗生素治疗的使用不仅是常见的，而且是延长的，这促成新生儿病原体中的药物抗性。因此，用于新生儿败血病和新生儿败血病相关并发症的早期、可靠的且非侵入性的标志物的开发是必要的，以容许治疗和干预优化新生儿的结果，并使潜在不必要的抗生素的使用或延长使用最小化。
3.使用生物学流体中的生物标志来早期检测并诊断新生儿败血病
在一个方面，本发明提供了使用蛋白质组方法使用生物学流体诸如脐带血中鉴定的生物标志来诊断新生儿败血病和新生儿败血病相关并发症的可靠的非侵入性方法。在某些实施方案中，与新生儿败血病相关的生物标志是用于早期和晚期发作中枢神经系统(CNS)并发症的预测物。在一个实施方案中，生物标志是用于脑室周围出血和/或脑室周围白质软化的预测物。在另一个实施方案中，生物标志是用于智力低下的预测物。
在一个实施方案中，本发明容许在样品收集的约30分钟和24小时内检测新生儿败血病和新生儿败血病相关并发症生物标志。在某些实施方案中，在样品收集的约30分钟和48小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在另一个实施方案中，在样品收集的约48小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在又一个实施方案中，在样品收集的约24小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在又一个实施方案中，在样品收集的约12小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在另一个实施方案中，在样品收集的约4小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在其它实施方案中，在样品收集的约2小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在一个实施方案中，在样品收集的约1小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在另一个实施方案中，在样品收集的约30分钟内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。
在某些其它实施方案中，在出生的约30分钟和48小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在另一个实施方案中，在出生的约48小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在又一个实施方案中，在出生的约24小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在又一个实施方案中，在出生的约12小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在另一个实施方案中，在出生的约4小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在其它实施方案中，在出生的约2小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在一个实施方案中，在出生的约1小时内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。在另一个实施方案中，在出生的约30分钟内诊断早期发作新生儿败血病和/或相关并发症。
如前文所记录的，在本发明的语境中，术语“蛋白质组概况”用于指给定时间的生物学样品例如生物学流体中的多种蛋白质的表达样式的呈现。蛋白质组概况可以例如呈现为质谱，但是也包括基于蛋白质的任何物理化学或生物化学特性的其它呈现。虽然有可能鉴定生物学流体的蛋白质组中存在的所有或一些蛋白质并对它们测序，但是这对于依照本发明生成的蛋白质组概况的诊断用途是不必要的。特定疾病的诊断可以基于正常蛋白质组概况与存在要诊断的疾病或病理学状况时在相同情况下获得的相同生物学流体的蛋白质组概况之间的特征性差异(独特的表达标记(expression signature))。独特的表达标记可以是测试或参照生物学样品的蛋白质组概况内以统计学显著方式与自相同类型的来源获得的相应的正常生物学样品的蛋白质组概况不同的任何独特的特征或基序。例如，如果蛋白质组概况以质谱形式呈现，那么独特的表达标记通常是与相应的正常样品的质谱在定性或定量上不同的峰或峰组合。如此，可以认为质谱中的新峰或新峰组合的出现，或者质谱中的现有峰或现有峰组合的幅度或形状的任何统计学显著变化，或者现有峰的消失是独特的表达标记。在比较自哺乳动物受试者获得的测试样品的蛋白质组概况与包含病理学母体或胎儿状况特征性的独特表达标记的参照样品的蛋白质组概况时，若其与参照样品共享独特的表达标记，则哺乳动物受试者诊断为患有此类病理学状况。
可以通过比较自要诊断的受试者获得的生物学流体的蛋白质组概况与以相同方式获得并处理的相同种类的正常的生物学流体的蛋白质组概况来诊断特定的病理学母体/胎儿状况。若测试样品的蛋白质组概况与正常样品的蛋白质组概况基本上相同，则认为受试者没有主题病理学母体/胎儿状况。若测试样品的蛋白质组概况相对于正常样品的蛋白质组概况显示独特的表达标记，则受试者诊断为患有所讨论的母体/胎儿状况。
或者/另外，可以比较测试样品的蛋白质组概况与参照样品的蛋白质组概况，所述参照样品自独立诊断为患有所讨论的病理学母体/胎儿状况的受试者的生物学流体获得。在此情况中，若测试样品的蛋白质组概况与参照样品的蛋白质组概况共享代表独特的表达标记的至少一种特征，或特征组合，则受试者诊断为患有病理学状况。
用于比较蛋白质组概况的统计学方法是本领域中公知的。例如，在质谱的情况中，蛋白质组概况以沿着该谱的水平轴的关键质量/电荷(M/Z)位置处的峰幅度值定义。因而，特征性蛋白质组概况可以例如以由给定M/Z值处的谱幅度的组合形成的样式表征。可以通过用合适的算法匹配测试样品的蛋白质组概况(样式)与参照或正常样品的蛋白质组概况(样式)来确定特征性表达标记的存在或缺失，或两种概况的实质同一性。用于分析蛋白质组样式的统计学方法披露于例如Petricoin III等，The Lancet 359：572-77(2002)；Issaq等，Biochem Biophys Commun 292：587-92(2002)；Ball等，Bioinformatics18：395-404(2002)；及Li等，Clinical Chemistry Journal，48：1296-1304(2002)。
在一个具体的实施方案中，以蛋白质阵列或免疫测定法形式实施本发明的诊断测试。
4.蛋白质阵列
在最近数年中，蛋白质阵列作为用于检测蛋白质、监测其表达水平、及调查蛋白质相互作用和功能的有力手段已经获得广泛认可。在可以使用自动化手段同时实施大量测定时，它们实现高通量蛋白质分析。在微阵列或芯片形式(其最初开发用于DNA阵列)中，可以在使用材料最少而产生大量数据的情况中实施此类测定。
虽然如上文所描述的通过2D凝胶电泳和质谱术的蛋白质组分析是非常有效的，但是它不总是提供需要的高灵敏度，而且这可能漏掉以低多度表达的许多蛋白质。在其高效率外，蛋白质微阵列提供改善的灵敏度。
通过使用本领域中公知的多种共价和非共价附着化学来将蛋白质固定化于固体表面，诸如玻璃、硅、微孔、硝酸纤维素、PVDF膜、和微珠上，从而形成蛋白质阵列。固体支持物在缀合规程前后应当是化学稳定的，容许良好的点形态学，展现最小的非特异性结合，不应在检测系统中促成背景，而且应当与不同检测系统相容。
一般地，蛋白质微阵列使用通常用于读取DNA阵列的相同检测方法。类似地，与读取DNA微阵列所使用的相同的仪器可适用于蛋白质阵列。
如此，可以用经荧光标记的来自两种不同来源诸如正常的和患病的生物学流体的蛋白质来探查捕捉阵列(例如抗体阵列)。在此情况中，读数基于荧光信号变化，其作为靶蛋白表达水平变化的反映。备选的读数包括但不限于荧光共振能量转移、表面等离振子共振、滚环DNA扩增、质谱术、共振光散射、和原子力显微术。
关于进一步的详情，参见例如Zhou H等，Trends Biotechnol.19：S34-9(2001)；Zhu等，Current Opin.Chem.Biol.5：40-45(2001)；Wilson和Nock，Angew Chem Int Ed Engl 42：494-500(2003)；及Schweitzer和Kingsmore，CurrOpin Biotechnol 13：14-9(2002)。生物分子阵列还披露于2002年6月18日公告的美国专利No.6,406,921，在此通过提及而其全部公开内容明确收录。
5.免疫测定法
也可以以本领域中公知的多种免疫测定形式来实施本发明的诊断方法。有两类主要的免疫测定法，即同质的和异质的。在同质免疫测定法中，抗原与抗体间的免疫学反应和检测两者都在同质反应中实施。异质免疫测定法包括至少一个分离步骤，其容许区别反应产物与未反应的试剂。
ELISA是一种异质免疫测定法，其自20世纪70年代早期起已经在实验室实践中获得广泛使用。可以使用该测定法来检测各种形式的抗原。
在“三明治式”形式中，将所测定的抗原保持在两种不同抗体间。在此方法中，首先用固相抗体包被固体表面。然后，添加含有抗原(即诊断蛋白质)的测试样品，或含有所测量抗原的组合物，并让抗原与结合的抗体起反应。洗掉任何未结合的抗原。然后，让已知量的经酶标记的抗体与结合的抗原起反应。在反应后洗掉任何过量的未结合的经酶连接的抗体。然后，添加该测定法中使用的酶的底物，并且底物与酶之间的反应产生颜色变化。可见的颜色变化的量是缀合有特定酶的结合抗体的直接测量，并且因此测试样品中存在的抗原。
ELISA也可以作为竞争性测定法使用。在竞争性测定法形式中，将含有要测定的抗原的测试标本与精确量的经酶标记的抗原混合，并且这两者都竞争对附着于固体表面的抗抗原抗体的结合。洗掉过量的游离的经酶标记的抗原，之后添加酶底物。源自酶-底物相互作用的颜色强度的量是所测试的样品中的抗原量的测量。同质免疫测定法包括例如酶倍增免疫测定技术(EMIT)，其通常包括包含要测量的一种或多种化合物的生物学样品、要测量的化合物的经酶标记的分子、结合要测量的化合物的一种或多种特异性抗体、和特定酶显色底物。在典型的EMIT中，将过量的特异性抗体添加至生物学样品。若生物学样品含有要检测的蛋白质，则此类蛋白质结合抗体。然后，将测量量的相应的经酶标记的蛋白质添加至混合物。用添加的经酶标记的蛋白质的分子占据没有被样品中的蛋白质分子占据的抗体结合位点。因此，因为仅游离的经酶标记的蛋白质可以对底物起作用，所以酶活性被降低。从无色转化成有色形式的底物量确定混合物中留下的游离酶的量。要在样品中检测的高浓度蛋白质引起较高的吸光度读数。样品中较少的蛋白质导致较小的酶活性和因此较低的吸光度读数。在抗原-酶复合物被抗体结合时使酶标记物失活使EMIT成为独特的系统，使测试能够在没有如用其它免疫测定法所必需的分开结合的与未结合的化合物的情况中实施。
本发明的一部分还是一种免疫测定试剂盒。在一个方面，本发明包括三明治式免疫测定试剂盒，其包含捕捉抗体和检测抗体。捕捉抗体和检测抗体可以是单克隆或多克隆的。在另一个方面，本发明包括诊断试剂盒，其包含侧流装置，诸如免疫层析条(ICS)测试，其使用免疫流层析进行。侧流装置采用侧流测定技术，如一般记载于美国专利No.4,943,522；4,861,711；4,857,453；4,855,240；4,775,636；4,703,017；4,361,537；4,235,601；4,168,146；4,094,647的，通过提及而将每篇的全部内容收录。在又一个方面，免疫测定试剂盒可以在分开的容器中包含例如(a)对诊断特定母体/胎儿状况，诸如新生儿败血病中使用的多肽具有结合特异性的单克隆抗体；(b)和抗抗体免疫球蛋白。可以利用此免疫测定试剂盒来实施本文中所提供的各种方法。可以以约0.001mg至约100克，且更优选的是约0.01mg至约1克的量提供单克隆抗体和抗抗体免疫球蛋白。抗抗体免疫球蛋白可以是多克隆免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G或其功能性片段，其可以在使用前通过本领域中已知的方法来标记。诊断试剂盒在必要的情况中可以进一步包含用于降低测试中的背景干扰的试剂、用于提高信号的试剂、用于组合和内插标志物数值以产生感兴趣的临床结果的预测的软件和算法、用于进行测试的装置、校正曲线和图、标准化曲线和图等。测试试剂盒可以以任何合适的方式包装，通常具有单个容器中的所有元件及一张用于实施测试的印刷指令。
6.诊断和治疗方法
本发明的诊断方法是对于开业内科医生做出快速治疗决定(其对于新生儿的存活常常是至关重要的)有价值的工具。如此，例如，若新生儿显示新生儿败血病的症状，或者在其它方面有新生儿败血病的风险，则采用即刻步骤以治疗状况并改善新生儿存活的机会是重要的。
测量或获得本文中所鉴定的蛋白质的表达水平后，通常将测定结果、发现、诊断、预测和/或治疗推荐记录，并与例如技术人员、内科医生和/或患者通信。在某些实施方案中，会使用计算机来将此类信息与感兴趣方，诸如患者和/或主治内科医生通信。在一些实施方案中，会在与接收结果或诊断通信的国家或管辖区域不同的国家或管辖区域实施测定法或分析测定结果。
在一个优选的实施方案中，在完成测定法并产生诊断和/或预测后尽快将基于本文中所呈现的一种或多种生物标志在测试受试者中的表达水平的诊断、预测和/或治疗推荐与受试者通信。本文中所描述的方法中鉴定并量化的一种或多种生物标志可以包含在一组或多组中。构成组的生物标志的数目可以包括1种生物标志、2种生物标志、3种生物标志、4种生物标志、5种生物标志、6种生物标志、7种生物标志、8种生物标志、9种生物标志、10种生物标志、11种生物标志、12种生物标志、13种生物标志、14种生物标志、15种生物标志、16种生物标志、17种生物标志、18种生物标志、19种生物标志、20种生物标志等。受试者的治疗内科医生可以将结果和/或相关信息与受试者通信。或者，可以通过任何通信手段，包括书写(诸如通过提供书面报告)、电子形式的通信(诸如电子邮件)、或电话来将结果直接与测试受试者通信。可以通过使用计算机(诸如在电子邮件通信的情况中)来便于通信。在某些实施方案中，可以产生含有诊断测试结果和/或自测试得到的结论和/或基于测试的治疗推荐的通信，并使用电信熟练技术人员会熟悉的计算机硬件和软件的组合来将其自动投递至受试者。健康护理导向性通信系统的一个例子记载于美国专利No.6,283,761，通过提及而将其全部内容收入本文；然而，本发明不限于利用此特定通信系统的方法。在本发明方法的某些实施方案中，可以在不同(例如外国)管辖区域实施所有或一些方法步骤，包括样品的测定、疾病的诊断、和测定结果或诊断的通信。
为了便于诊断，可以将本发明的本文中所呈现的一种或多种生物标志的参照和/或受试者生物标志概况或表达水平在显示装置上显示，以电子形式包含，或者包含在机器可读介质(诸如但不限于模拟磁带，如VCR、CD-ROM、DVD-ROM、USB闪存介质等可读的)中。此类机器可读介质还可以含有别的测试结果，诸如但不限于临床参数和传统实验室风险因素的测量。或者/另外，机器可读介质还可以包含受试者信息，诸如医学史和任何相关的家族史。
从以下非限制性实施例看，本发明的进一步的详情会是显而易见的。通过提及而将贯穿整个公开内容所引用的所有参考文献及其中所引用的参考文献明确收入本文。
实施例1：使用全局蛋白质组方法来鉴定新生儿败血病的脐带血生物标志
实验方法
样品收集：分析来自20-34周妊娠的自发早产产程中的82名妇女的前瞻观察分组的脐带血样品。早期发作新生儿败血病定义为分娩的72小时内的阳性新生儿血液培养。在82名受试者中，71名在小于34周时分娩，且5名新生儿已经确认新生儿败血病(新生儿血液培养阳性)，而8名新生儿具有疑似败血病(血液培养阴性，提示感染的临床症状)的诊断。
脐带血清的免疫消减：使用IgY-12LC2蛋白质组分配系统(BeckmanCoulter，Fullerton，CA)来将用于2-DLC实验的血清样品消减12种最丰富的蛋白质(清蛋白、IgG、IgA、IgM、α-1抗胰蛋白酶、转铁蛋白、触珠蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-2巨球蛋白、血纤蛋白原、载脂蛋白A-I和A-II)。将合适的级分收集，浓缩，并与10mM Tris(pH 8.4)缓冲液交换。使用DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)来测定蛋白质浓度。
差别凝胶电泳(DIGE)：蛋白质测定法后，用CyDye DIGE Fluor最小染料(GE Lifesciences)以400pm浓度的染料标记50μg蛋白质。分别使用不同染料(Cy5、Cy3、Cy2)来标记对照、疑似败血病(SS)、或经确认的败血病(CS)脐带血血清(CBS)样品。将经标记的蛋白质在含有0.5％两性电解质的IEF缓冲液中溶解，并于室温再水合至24cm IPG条(pH 4-7)上达12小时。再水合后，将IPG条进行等电聚焦达约10小时以达到总共64000伏*小时。首先，通过用含有1％DTT的缓冲液平衡15分钟来将IPG条中聚焦的蛋白质还原，然后用含有2.5％IAA的缓冲液来烷基化。还原和烷基化步骤后，将IPG条加载至梯度(8～16％)聚丙烯酰胺凝胶(24x20cm)上，并以85V进行SDS-PAGE达18小时以第二维解析蛋白质。电泳后，以设置于600的PMT电压使用合适的激光和滤器在Typhoon 9400扫描仪(GE Lifesciences)中扫描凝胶。使用选定的颜色来覆盖不同通道中的图像，并使用ImageQuant TL软件(v7.0，GE Lifesciences)来显现差别。将原始扫描图像文件加载入Phoretix 2D Evolution(NonlinearDynamics)中，并对经确认的和疑似的败血病对对照产生差别图谱。
2-DLC样品加工：蛋白质测定法后，用胰蛋白酶消化1mg样品部分，并用强阳离子交换(SCX)层析来分离所得的肽。将样品干燥，并在105μL含有0.2M NH4HCO3和0.3％Rapigest(Waters，Milford，MA)的消化缓冲液(pH 8.5)中溶解。如下将半胱氨酸残基还原并烷基化，即于50℃在12.5μL 0.1M DTT中温育45分钟，接着在7μL 0.5M碘乙酰胺中暗室再温育30分钟。通过添加4μL0.1M CaCl2和酶与底物比率33∶1的测序级胰蛋白酶(Trypsin Gold，Promega)于37℃将蛋白质消化2小时。通过添加60μL 0.2M HCl来使消化停止，并使用C18SepPak Plus筒(Waters，Milford，MA)来纯化所得的肽。
使用100x2.1mm聚磺乙基A柱(The Nest Group，Southborough，MA)来实施SCX层析。流动相A含有10mM磷酸钾(pH 3)和25％乙腈(ACN)。流动相B是相同的，只是它含有350mM KCl。加载并在流动相A中清洗后，在45分钟里使用线性梯度0-50％B，接着在15分钟里使用线性梯度50-100％B，接着以100％A清洗20分钟来洗脱肽。收集总共95个一分钟级分，并通过真空离心来将其干燥，并通过在100μL 0.1％TFA中摇动来再溶解。使用96孔旋转柱，Vydac C18硅石(The Nest Group，Southborough，MA)来使肽级分脱盐。将经脱盐的级分合并成35个级分，蒸发，并在20μL 5％甲酸(FA)中溶解以进行LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS分析：使用Agilent 1100系列毛细管LC系统和LTQ离子阱质谱仪(Thermo Electron，San Jose，CA，USA)通过LC/MS来分析每个级分的一部分，所述质谱仪具有装备有34号金属针试剂盒(ThermoFinnigan，San Jose，CA)的Ion Max电喷射源。以20μL/分钟将样品应用于阱筒，然后使用含有0.1％FA的流动相A将其转换至0.5x250mm Zorbax SB-C18柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)上。使用Bioworks Browser软件(第3.1版，ThermoFinni gan，San Jose，CA)从原始数据产生质谱文件。自所有LC-MS/MS分析产生总共1,195,238个串联质谱。
肽和蛋白质鉴定：针对含有为人亚种选择的Swiss-Prot(第54.2版)数据库的正向和反向输入(诱饵蛋白质)的复合蛋白质数据库搜索串联质谱。使用X！串联(Fenyo 2003)搜索引擎来实施所有搜索，所述搜索引擎配置为使用母离子和碎片离子的质量公差1.8Da和0.4Da、酶胰蛋白酶特异性、对半胱氨酸残基的固定的脲甲基修饰、和数处潜在的体内和体外修饰。使用Scaffold软件(第1.6版，Proteome Software，Portland，OR)中执行的概率性蛋白质鉴定算法(Nesvizhskii 2003)来将所有样品中的肽和蛋白质鉴定结果汇编在一起以产生全面的脐带血蛋白质组。认为具有大于等于0.8的概率的肽鉴定结果有可能存在于样品中。认为具有至少两个独特的肽鉴定结果的蛋白质鉴定结果存在于脐带血中。
无标记物量化：与蛋白质匹配的串联质谱的总数(谱计数)是用于评估其在复杂的混合物中的多度的无标记物、灵敏的、且半定量的测量(Liu2004)。使用两个复杂的样品间的蛋白质谱计数的差别来量化其相对表达(Old2005)。在此研究中，考虑在一份样品中具有至少两个独特肽鉴定结果的脐带血蛋白质用于无标记物量化。将具有共享的谱计数的同源蛋白质(序列同源性大于50％)组合成单一输入。将非同源物共享的谱计数归入具有最高数目的谱匹配的蛋白质(奥克姆氏剃刀(Occam’s razor))。使用进行对照与CS新生儿受试者间的独立配对比较的安排蛋白质的谱计数来量化蛋白质的相对表达(Gravett 2007，Nagalla 2007，Pereira 2007，Zybailov 2006)。认为在配对比较中具有小于等于0.05的p值的蛋白质是样品间显著差异表达的。使用Old等2005中所描述的等式来量化差异表达的蛋白质的倍数表达变化(FC)。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)：用固相三明治式免疫测定法来测量用于检测败血病的10种候选生物标志。可用的商业抗体和抗原购自多个厂家以准备免疫测定法。使用已知数量的重组蛋白或由制造商提供的标准品来形成标准曲线，以为样品浓度提供参照。一式三份实施所有测定法，并且测定法间和测定法内变异系数范围为3-7％。
进行单因素方差分析(ANOVA)以比较经对数转化的来自没有败血病的受试者和患有经确认的败血病的受试者的样品的ELISA值。为了呈现，我们将平均对数值转化回到初始单位(调和均值)，并应用Bonferroni校正以解决多重比较。基于来自个别蛋白质比较的结果，我们使用逻辑回归模型来评估2、3或4种蛋白质的数种不同组合的分类性能。基于来自每个多蛋白质模型的风险得分来计算接收器运行特征(ROC)曲线。使用SAS软件(v9.1)来计算描述和推论统计学；使用定制的STATA模块来产生并比较ROC曲线(Pepe2003)。
对ELISA数据的统计学分析：将没有败血病的对照受试者(n＝77)，和患有经确认的败血病的受试者(n＝5)中通过ELISA实验测量的脐带血中的候选蛋白质生物标志浓度进行对照转化，之后将它们进行统计学分析。使用单因素方差分析(ANOVA)检验来实施对照对败血病间的经对数转化的蛋白质浓度的独立配对比较。为了呈现，我们将平均对数值转化回到初始单位(调和均值)，并应用Bonferroni校正以解决多重比较。基于来自个别蛋白质比较的结果，我们使用逻辑回归模型来评估2、3或4种蛋白质的数种不同组合的分类性能。基于来自每个多蛋白质模型的风险得分来计算接收器运行特征(ROC)曲线。
使用SAS软件(v9.1)来计算描述和推论统计学；使用定制的STATA模块来产生并比较ROC曲线(Pepe 2003)。
结果
新生儿败血病中的脐带血蛋白质组的蛋白质组变化：2维凝胶电泳分析：将来自对照、疑似败血病(SS)、和经确认的败血病(CS)受试者的脐带血(CB)进行亲和纯化以除去高多度血清蛋白质。分别用Cy5、Cy3、和Cy2染料标记来自对照、SS、和CS受试者的经消减的CBS。将经标记的样品在2D凝胶上解析。图1A和1B分别显示了来自对照(红色)对SS(绿色)和对照(红色)对CS(绿色)的CBS的DIGE凝胶图像。使用Phoretix 2D Evolution软件来测定在SS对对照(图1C)和CS对对照(图1D)间差异表达的点。基于总的点体积(volume)来标准化差别图谱(图1C和1D)中的点强度。差别图谱中下调大于等于2倍的点以红色突出显示，而上调大于等于2倍的点以绿色突出显示。
结论：2-D凝胶分析鉴定新生儿败血病受试者的脐带血中的多种蛋白质的差异表达。
脐带血蛋白质组：自所有2-DLC质谱术实验鉴定具有至少两个独特肽(p大于等于0.8)匹配的总共670种蛋白质。依照谱计数的降低次序来对脐带血蛋白质分级，并在补充的表1(第5栏)中显示。使用来自DAVID生物信息学资源(Dennis 2003)的基因本体论(Gene Ontology，GO)注释来实施脐带血蛋白质组的功能注释。具有代谢(21％)、免疫应答(10％)、转运(10％)、和发育(7％)功能的蛋白质构成大部分的脐带血蛋白质组。
新生儿败血病的脐带血蛋白质组中的差异表达蛋白质的聚类：与蛋白质匹配的MS/MS谱的总数与其在复杂的混合物中的多度直接相关(Liu 2004)。使用GeneMaths软件(第1.5版，Applied Maths，Austin，TX)来显现对照、SS、和CS受试者间在CB上的全局蛋白质表达变化。将在一份样品中具有至少两个蛋白质鉴定结果(p大于等于0.8)的蛋白质的谱计数个别地进行均值标准化，并通过GeneMaths软件分析。使用具有200次模拟的欧几里得距离学习方法来对在样品间具有相似表达变化的蛋白质分级聚类(图2A)。图2B和图2C中分别显示了具有在CS和对照样品中上调的蛋白质的代表性蛋白质簇。
结论：使用分级聚类来显现脐带血蛋白质组表明新生儿败血病受试者中过表达的蛋白质的特定簇。
通过2维液相层析和串联质谱术(2D LC-MS-MS)鉴定的新生儿败血病的脐带血生物标志：将来自对照和经确认的败血病(CS)样品的CB样品进行基于2-DLC的串联质谱术，接着为无标记物量化。认为以小于等于0.05的p值和大于等于±2.0的倍数变化通过无标记物量化的CB蛋白是对照和新生儿败血病受试者间显著差异表达的(表1)。使用生物信息学收获器来实施表1中的差异表达的蛋白质的生物学功能注释。下文表1列出了对照和新生儿败血病样品间的差异表达的脐带血蛋白质及其Swiss-Prot登录号、描述、倍数变化、和p值、蛋白质依照其生物学功能来分组。
表1：新生儿败血病的脐带血生物标志
Figure BDA0000086855420000271
Figure BDA0000086855420000281
结论：2D-LC MS-MS分析鉴定脐带血中的新生儿败血病的60种潜在生物标志的统计学显著性差别多度。
使用酶联免疫吸附测定法来验证潜在的新生儿败血病生物标志：使用ELISA对77名对照和5名新生儿败血病受试者的分组交叉验证来自2-DLC研究的总共10种显著差异表达的蛋白质。将测量的蛋白质浓度进行对数转化，并使用ANOVA检验在对照和败血病组间配对比较。在下文表2中显示了以小于等于0.05的p值通过比较的蛋白质。通过计算由ELISA测量的蛋白质浓度(ng/ml)的调和均值(表2中所显示)来测定各个样品组中的每种蛋白质的均值浓度。
表2：用ELISA验证潜在的新生儿败血病生物标志
结论：对个别样品的潜在生物标志的ELISA分析确认通过2D-LC-MS-MS分析观察到的候选蛋白的差异表达。
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Claims (16)

1.一种用于在哺乳动物受试者中诊断新生儿败血病的方法，包括：
(a)相对于正常的生物学流体或已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平，在自所述受试者获得的生物学流体的样品中测试一种或多种选自下组的蛋白质的水平：胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)；并
(b)若所述水平相对于所述正常的生物学流体中的水平显示统计学显著差异，或者相对于所述已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平不显示统计学显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
2.权利要求1的方法，其中所述受试者是人患者。
3.权利要求2的方法，包括若相对于正常的脐带血，所有所述测试蛋白质在脐带血样品中显示显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
4.权利要求2的方法，其中通过免疫测定法来测定所述水平。
5.权利要求2的方法，其中通过质谱术来测定水平。
6.权利要求2的方法，其中使用蛋白质阵列来测定水平。
7.权利要求1-6中任-项的方法，其另外包括测试一种或多种选自下组的蛋白质：白介素-1受体辅助蛋白前体(SEQ ID NO：2)、白介素-1受体样1前体(SEQ ID NO：4)、血清淀粉状蛋白A蛋白前体(SEQ ID NO：5)、CD5抗原样前体(SEQ ID NO：6)、骨髓蛋白聚糖前体(SEQ ID NO：8)、硒结合蛋白1(SEQ ID NO：9)、脂多糖结合蛋白前体(SEQ ID NO：10)、硫酸软骨素蛋白聚糖4前体(SEQ ID NO：11)、骨桥蛋白前体(SEQ ID NO：12)、ρGDP解离抑制剂2(SEQ ID NO：13)、碳酸酐酶2(SEQ ID NO：14)、嗜中性粒细胞明胶酶关联脂笼蛋白前体(SEQ ID NO：15)、胶原α-5(IV)链前体(SEQ ID NO：16)、结缔组织生长因子前体(SEQ ID NO：17)、巨噬细胞集落刺激因子1前体(SEQ ID NO：18)、蛋白质激酶C结合蛋白NELL2前体(SEQ ID NO：19)、Neudesin前体(SEQ ID NO：20)、蛋白质二硫化物异构酶前体(SEQ ID NO：21)、核糖核酸酶胰前体(SEQ ID NO：22)、δ样蛋白前体(SEQ ID NO：23)、嗜铬粒蛋白-A前体(SEQ ID NO：24)、骨调蛋白前体(SEQ ID NO：25)、胶原α-2(I)链前体(SEQ ID NO：26)、原低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体(SEQ ID NO：27)、层粘连蛋白亚基γ-1前体(SEQ IDNO：28)、层粘连蛋白亚基β-1前体(SEQ ID NO：29)、胶原α-1(II)链前体(SEQ ID NO：30)、蛋白FAM3C前体(SEQ ID NO：32)、α-辅肌动蛋白-1(SEQ ID NO：33)、F-肌动蛋白加帽蛋白亚基α-1(SEQ ID NO：34)、氨肽酶N(SEQ ID NO：35)、细胞粘附分子1前体(SEQ ID NO：37)、Exostosin-2(SEQ ID NO：39)、组织蛋白酶D前体(SEQ ID NO：40)、神经源性基因座notch同系物蛋白3前体(SEQ ID NO：41)、Noelin前体(SEQ ID NO：43)、内质蛋白前体(SEQ ID NO：45)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型前体(SEQ ID NO：46)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性链前体(SEQ ID NO：47)、埃兹蛋白(SEQ ID NO：48)、肝型脂肪酸结合蛋白(SEQ ID NO：49)、可能的G蛋白偶联受体116前体(SEQ ID NO：50)、Seprase(SEQ ID NO：51)、癌蛋白诱导的转录物3蛋白前体(SEQ IDNO：52)、缺氧上调型蛋白1前体(SEQ ID NO：53)、跨高尔基体网络膜内在蛋白2前体(SEQ ID NO：54)、转酮酶(SEQ ID NO：55)、受体型酪氨酸蛋白质磷酸酶F前体(SEQ ID NO：56)、细胞间粘附分子1前体(SEQ IDNO：57)、低密度脂蛋白受体前体(SEQ ID NO：58)、78kDa葡萄糖调节型蛋白前体(SEQ ID NO：59)、punc e11相邻物前体(SEQ ID NO：60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO：61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO：62)、和应激诱导的磷蛋白1(SEQ ID NO：63)。
8.权利要求2的用途，其中蛋白质组概况包含蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)水平的信息，且其中若相对于正常的生物学流体，一种或多种所述测试蛋白质在所述生物学流体样品中显示显著差异，则做出所述受试者患有新生儿败血病的诊断。
9.权利要求8的用途，其中若相对于正常的生物学流体，所有所述测试蛋白质在所述生物学流体样品中显示显著差异，则做出所述受试者患有新生儿败血病的诊断。
10.权利要求8的用途，其中通过免疫测定法来测定所述水平。
11.权利要求8的用途，其中通过质谱术来测定所述水平。
12.权利要求8的用途，其中使用蛋白质阵列来测定所述水平。
13.一种免疫测定试剂盒，其包含用于检测一种或多种选自下组的蛋白质的抗体和试剂：胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)。
14.权利要求13的免疫测定试剂盒，其包含用于检测所有所述蛋白质的抗体和试剂。
15.一份报告，其包含测试的结果和/或基于测试的诊断，包括：
(a)相对于正常的生物学流体或已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平，在自所述受试者获得的生物学流体的样品中测试一种或多种选自下组的蛋白质的水平：胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)；并
(b)若所述水平相对于所述正常的生物学流体中的水平显示统计学显著差异，或者相对于所述已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平不显示统计学显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
16.一种实体介质，其储存测试的结果和/或基于测试的诊断，包括：
(a)相对于正常的生物学流体或已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平，在自所述受试者获得的生物学流体的样品中测试一种或多种选自下组的蛋白质的水平：胰岛素样生长因子结合蛋白1前体(SEQ ID NO：36)、白介素-6前体(SEQ ID NO：3)、C-反应蛋白前体(SEQ ID NO：1)、β-2-微球蛋白前体(SEQ ID NO：7)、组织蛋白酶B前体(SEQ ID NO：38)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂M前体(SEQ ID NO：42)、胰岛素样生长因子结合蛋白2前体(SEQ ID NO：44)、基质金属蛋白酶9(SEQ ID NO：64)、金属蛋白酶抑制剂1前体(SEQ ID NO：31)、和α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO：65)；并
(b)若所述水平相对于所述正常的生物学流体中的水平显示统计学显著差异，或者相对于所述已知指明新生儿败血病的生物学流体中的水平不显示统计学显著差异，则诊断出所述受试者患有新生儿败血病。
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