BR112021013121A2 - Métodos analíticos e matrizes para uso nos mesmos - Google Patents

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Abstract

métodos analëticos e matrizes para uso nos mesmos. a presente invenção se refere a um método para identificar agentes que são capazes de induzir a sensibilização respiratória em um mamífero e matrizes e kits analíticos para uso em tais métodos.

Description

M TODOS ANAL TICOS E MATRIZES PARA USO NOS MESMOS CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a um método para identificar agentes capazes de induzir sensibilização respiratória e matrizes e kits analíticos para uso em tais métodos.
ANTECEDENTES
[002] A sensibilização química, também conhecida como alergia química, é um estado de doença induzido pelo sistema imunológico humano em resposta a sensibilizadores químicos. Essa categoria de substâncias (geralmente fragrâncias, aditivos cosméticos, corantes e íons metálicos) exerce seus efeitos prejudiciais ao desencadear uma grande variedade de mecanismos celulares intrincados, já que muitas vezes são capazes de penetrar nos tecidos. A sensibilização ocorre quando as células T aprendem a reconhecer um sensibilizador químico específico. Após a exposição subsequente, as células T reagem rapidamente para induzir um estado de inflamação. Isso, por sua vez, leva a sintomas associados a doenças, tais como coceira, bolhas e danos aos tecidos em caso de contato com a pele, e tosse, respiração ofegante e sintomas semelhantes aos da asma em caso de inalação.
[003] É bem conhecido que a via de exposição pode ter impacto nos sintomas observados (Kimber et al., 2011). No entanto, também está se tornando cada vez mais claro que os compostos químicos podem ter propriedades intrínsecas que levam preferencialmente à sensibilização da pele ou do trato respiratório, também conhecida como dermatite alérgica de contato (DAC) e asma ocupacional (OA), respectivamente (Dearman et al., 2011).
[004] Em ambos os casos, as avaliações de segurança de produtos químicos têm sido realizadas historicamente por meio de experimentos com animais. Embora seja o padrão de ouro atual, o Ensaio de Linfonodo Local (LLNA) murino (TG 429) tende a classificar os dois tipos de sensibilizadores químicos como positivos, é inadequado para diferenciar os dois
(Dearman et al., 2011). Além disso, a opinião pública, a preocupação com a saúde ambiental humana e os interesses econômicos levaram a legislações na UE que proíbem o uso de experimentos em animais para realizar avaliações de segurança em cosméticos e quaisquer ingredientes dos mesmos, uma tendência que atualmente está se espalhando globalmente e nos segmentos do mercado e da indústria. Levando tudo em conta, há uma necessidade urgente de desenvolver métodos sem animais para avaliação de sensibilizadores químicos.
[005] Para atender a essa demanda, muitas pesquisas durante a última década se concentraram no desenvolvimento de métodos dos chamados ensaios in vitro, in chemico e in silico, ou seja, métodos preditivos que podem classificar produtos químicos testados como sensibilizadores ou não sensibilizadores sem o uso de experimentos com animais. Embora uma série de ensaios para avaliação de sensibilizadores de pele tenham sido propostos, alguns dos quais foram submetidos a validação formal e estão, portanto, aprovados para implementação industrial (ou seja, OECD TG 442C, 442D e 442E), a demanda por um ensaio que preveja e classifique de forma precisa e específica os sensibilizadores respiratórios químicos permanece não atendida.
[006] Um fator que contribui para a ausência de métodos preditivos para sensibilizadores respiratórios químicos é a grande lacuna de conhecimento que atualmente proíbe uma compreensão detalhada dos mecanismos imunobiológicos envolvidos na sensibilização respiratória. Em comparação com o caso de sensibilização da pele, uma via de resultado adverso (AOP) não está prontamente disponível. No entanto, o trabalho para criar tal AOP está progredindo e muitas etapas fundamentais da via mecanística são amplamente aceitas (por exemplo, Kimber et al., 2014, Sullivan et al., 2017).
[007] Resumidamente, o evento molecular inicial e eventos-chave subsequentes são amplamente análogos à AOP da sensibilização da pele, com algumas áreas-chave de incertezas, bem como a discrepância aparente relacionada à realocação específica ao órgão de eventos celulares para a periferia do trato respiratório. No entanto, embora a elicitação normalmente exija exposição respiratória, deve-se notar que a sensibilização respiratória também pode ocorrer por meio da exposição cutânea (Kimber et al., 2002), corroborando ainda mais a noção de que os sensibilizadores respiratório e cutâneo são intrinsecamente diferentes, levando preferencialmente a um resultado adverso ou outro, e muito raramente ambos.
[008] Semelhante ao caso da sensibilização da pele, a AOP proposta é sugerida para começar com uma ligação de proteína covalente, provavelmente a nucleófilos de lisina no pulmão ou na pele após exposição respiratória ou dérmica a um produto químico orgânico de baixo peso molecular. A ligação dessa proteína causa a ativação das vias de resposta ao estresse e sinais de perigo celular, incluindo estresse oxidativo, citocinas e quimiocinas liberadas pelas células epiteliais, levando à maturação das células dendríticas (DC) e migração para os linfonodos de drenagem. Haptenos também podem contribuir diretamente para a ativação de DC. As DCs apresentadoras de antígenos nos linfonodos de drenagem sinalizam a ativação e maturação das células T que caracterizam a fase de sensibilização, resultando em alergia respiratória química.
[009] Assim, a AOP para a sensibilização respiratória química inclui um evento de iniciação molecular (evento chave (KE) 1), respostas inflamatórias celulares no epitélio pulmonar (KE 2) e DCs (KE 3), e respostas de órgãos (por exemplo, respostas de células T (KE 4)). Embora se acredite que os sensibilizadores respiratórios induzem preferencialmente uma resposta imune do tipo Th2, em oposição às células T citotóxicas e Th1 induzidas principalmente por sensibilizadores de pele, uma área chave de incerteza envolve a localização exata, subconjuntos celulares envolvidos e mecanismo molecular pelo qual essa inclinação para Th2 ocorre (Paul & Zhu, 2010). Além disso, não é totalmente compreendido se os anticorpos IgE são necessários para a elicitação de efeitos adversos (Isola et al., 2008). No entanto, é hipotetizado que as DCs estão envolvidas e que a inclinação para Th2 ocorre em associação com a apresentação do antígeno, por meio do perfil coestimulatório exibido pelas DCs na sinapse imunológica. Por essas razões, um sistema de células in vitro de DCs são alvos candidatos para o desenvolvimento do ensaio.
[010] A plataforma Genomic Allergen Rapid Detection (GARDTM) demonstrou anteriormente a capacidade de classificar sensibilizadores respiratórios com o uso de diferentes assinaturas de genes, cada uma com base em mais de 300 biomarcadores (Forreryd et al., 2015, WO 2013/160882; WO 2016/083604). No entanto, há uma necessidade contínua e urgente de estabelecer ensaios in vitro precisos e confiáveis sem animais para identificar especificamente sensibilizadores respiratórios.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
[011] Os inventores produziram agora uma nova estratégia de teste baseada em células para avaliação de sensibilizadores respiratórios com base em uma nova assinatura de biomarcador genômico que compreende surpreendentemente um novo pequeno conjunto de genes que podem ser usados em combinação como uma alternativa a testes em animais. Os inventores demonstram a funcionalidade do ensaio, doravante referido como GARDair , fornecendo dados de classifica o gerados a partir de classifica es de amostras em um conjunto de dados de teste externo.
[012] Por conseguinte, um primeiro aspecto da presente invenção fornece um método para identificar agentes capazes de induzir a sensibilização respiratória em um mamífero que compreende ou consiste nas etapas de:
[013] (a) fornecer uma população de células dendríticas ou uma população de células semelhantes a dendríticas;
[014] (b) expor as células fornecidas na etapa (a) a um agente de teste; e
[015] (c) medir nas células da etapa (b) a expressão de dois ou mais biomarcadores selecionados do grupo definido na Tabela A;
[016] em que a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) é indicativa do efeito de sensibilização respiratória do agente de teste da etapa (b).
[017] Em uma modalidade adicional ou alternativa, um ou mais dos biomarcadores para os quais a expressão é medida na etapa (c) são selecionados do grupo definido na Tabela A(i).
[018] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de um ou mais biomarcadores selecionados do grupo definido na Tabela A(i), por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 dos biomarcadores listados na Tabela A(i). Por exemplo, a etapa (c) pode compreender ou consistir na medição da expressão de todos os biomarcadores listados na Tabela A(i).
[019] O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de CRLF2. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de FSCN1. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de AES. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de ALOX5AP. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de RAB27B. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de ZFP36L1. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de SLC44A2. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de ATL1. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de FAM30A. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de CTSH. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de NINJ1. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de RALGAPA2. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de RNF220. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de OSBPL3. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de CACNA2D2. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de HNRNPC. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de PIK3C3. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de HOPX. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de VCAN. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de RUFY1. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de GNA15. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de ADAM8. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de NRIP1. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de CTCF. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de PLCXD1.
[020] O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de MYCN. O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de IL7R . O método pode incluir ou excluir a medição da expressão de RALA.
[021] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de um ou mais biomarcadores selecionados do grupo definido na Tabela A(ii), por exemplo, 2 ou 3 dos biomarcadores listados na Tabela A(ii). Por exemplo, a etapa (c) pode compreender ou consistir na medição da expressão de todos os biomarcadores listados na Tabela A(ii).
[022] Em uma modalidade adicional ou alternativa, CRLF2 está incluído na Tabela A(ii) e não na Tabela A(i).
[023] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de três ou mais dos biomarcadores selecionados do grupo definido na Tabela A, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28 dos biomarcadores listados na Tabela A. Por exemplo, a etapa (c) pode compreender ou consistir na medição da expressão de todos os biomarcadores listados na Tabela A.
[024] Assim, a expressão de todos os biomarcadores definidos na Tabela A(i) e/ou todos os biomarcadores definidos na Tabela A(ii) pode ser medida na etapa (c). Portanto, o método pode compreender ou consistir na medição na etapa (c) de todos os biomarcadores definidos na Tabela A.
[025] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1.
[026] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES.
[027] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP.
[028] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B.
[029] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, IL7R.
[030] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A.
[031] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3,
[032] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3, CACNA2D2, HNRNPC, PIK3C3, IL7R.
[033] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3, CACNA2D2, HNRNPC, PIK3C3, IL7R, HOPX.
[034] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de cada um dos seguintes biomarcadores: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3, CACNA2D2, HNRNPC, PIK3C3, IL7R, HOPX, VCAN, RALA, RUFY1, GNA15, ADAM8, NRIP1, CTCF, PLCXD1.
[035] Por e press o , entende-se a presença, nível e/ou quantidade do biomarcador.
[036] Por biomarcador inclu da qualquer molécula biológica, ou componente ou fragmento da mesma, cuja medição pode fornecer informações úteis para determinar se um agente de teste é um sensibilizador respiratório. Assim, no contexto da Tabela A, o biomarcador pode ser uma molécula de ácido nucleico, tal como um mRNA ou cDNA. Alternativamente, o biomarcador pode ser uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico, ou porção química de carboidrato, componente antigênico ou fragmento do mesmo.
[037] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o método compreende as etapas adicionais de:
[038] d) expor uma população separada das células dendríticas ou células semelhantes a dendríticas a um ou mais agentes de controle negativo que não é um sensibilizador respiratório em um mamífero; e
[039] e) medir nas células da etapa (d) a expressão de dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c)
[040] em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório no caso de a expressão de dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e) ser diferente da expressão de dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c).
[041] Em uma modalidade adicional ou alternativa, DMSO pode ser usado como controle negativo. Um controle de veículo pode ser usado como o agente de controle negativo. O controle do veículo pode compreender DMSO.
[042] Em uma modalidade adicional ou alternativa, células não estimuladas podem ser usadas como controle negativo. Por c lulas n o estimuladas se incluem ou se quer di er as c lulas que n o foram e postas a nenhum agente de teste. Em outras palavras, a população separada de células na etapa (d) não é exposta a um agente de teste. Em uma modalidade adicional ou alternativa, células não estimuladas podem ser usadas como uma amostra de referência para o alinhamento de conjuntos de dados para fins de normalização.
[043] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) é medida nas células fornecidas na etapa (a) antes e após a exposição ao agente de teste, e em que a diferença na expressão entre os dois ou mais biomarcadores antes e após a exposição ao agente de teste é indicativa do efeito de sensibilização do agente de teste da etapa (b). Portanto, as células fornecidas na etapa (a) podem fornecer o controle negativo e o resultado do teste.
[044] Por difere da e press o de dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) e diferen a na e press o inclu do que a presença e/ou quantidade em uma primeira amostra (por exemplo, uma amostra de agente de teste) diferem daquelas de uma segunda amostra (por exemplo, uma amostra do agente de controle).
[045] Por exemplo, a presença e/ou quantidade na amostra de teste podem diferir daquelas das uma ou mais amostras de controle negativo de uma maneira estatisticamente significativa. De preferência, a expressão dos dois ou mais biomarcadores na população de células exposta ao agente de teste é:
[046] menor ou igual a 80% daquela da população de células exposta ao agente de controle negativo, por exemplo, não mais que 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou 0% daquela da população de células exposta ao controle negativo ou agente de controle negativo; ou
[047] pelo menos 120% daquela da população de células exposta ao agente de controle negativo, por exemplo, pelo menos 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% ou pelo menos 500% daquela da população de células exposta ao controle negativo ou agente de controle negativo
[048] Por difere da e press o dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) , alternativamente ou adicionalmente incluído que a amostra de teste é classificada como pertencente a um grupo diferente daquele das uma ou mais amostras de controle negativo. Por exemplo, quando uma SVM é usada, a amostra de teste está do outro lado do limiar do valor de decisão como as uma ou mais amostras de controle negativo (por exemplo, se o agente de teste for classificado como um sensibilizador respiratório se um ou mais testes (ou replicado dos mesmos) tiverem um valor de decis o de SVM 0, ent o as uma ou mais amostras de controle positivo (ou a maioria delas) tamb m devem ter um valor de decis o de SVM de 0).
[049] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle negativo fornecidos na etapa (d) são selecionados do grupo que consiste em: DMSO; células não estimuladas; meios celulares; controle de veículo; água destilada.
[050] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle negativo podem compreender ou consistir em um ou mais agentes selecionados a partir do grupo que consiste em DMSO; 1- butanol; 2-aminofenol; acrilato de 2-hidroxietila; 2-nitro-1,4-fenilenodiamina; Ácido 4-aminobenzoico; Clorobenzeno; Dimetilformamida; etilvanilina; Formaldeído; Geraniol; Aldeído hexilcinâmico; Isopropanol; Kathon CG*; Salicilato de metila; Penicilina G; Propilenoglicol; Dicromato de Potássio; Permanganato de potássio; Tween 80; Sulfato de zinco; 2-mercaptobenzotiazol; Ácido 4-hidroxibenzoico; Benzaldeído; Ácido octanoico; Álcool cinamílico; Ftalato de dietila; DNCB; Eugenol; Glicerol; Glioxal; Isoeugenol; Fenol; PPD; Resorcinol; Ácido salicílico; SDS; e Clorobenzeno.
[051] Em uma modalidade particular adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle negativo podem compreender ou consistir em DMSO e/ou Clorobenzeno.
[052] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle negativo podem compreender ou consistir em um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste naqueles não sensibilizadores e/ou sensibilizadores não respiratórios listados na Tabela 1 e/ou Tabela 3.
[053] O agente de controle negativo pode ser um solvente para uso com os agentes de teste ou controle da invenção.
[054] O método pode compreender ou consistir no uso de pelo menos 2 agentes de controle negativo (ou seja, agentes não sensibilizadores), por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 100 agentes de controle negativo.
[055] Alternativa ou adicionalmente, a expressão dos um ou mais biomarcadores medidos na etapa (b) das células dendríticas ou células semelhantes a dendríticas antes da exposição ao agente de teste é usada como um controle negativo.
[056] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o método compreende as etapas adicionais de:
[057] f) expor uma população separada das células dendríticas ou células semelhantes a dendríticas a um ou mais agentes de controle positivo que são um sensibilizador respiratório em um mamífero; e
[058] g) medir nas células da etapa (f) a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c)
[059] em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório no caso de a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (f) corresponder à expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c).
[060] Corresponde e press o dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) significa que a e press o dos dois ou mais biomarcadores na população de células exposta ao agente de teste é idêntica ou não difere significativamente daquela da população de células exposta ao mais um agente de controle positivo. De preferência, a expressão dos dois ou mais biomarcadores na população de células exposta ao agente de teste está entre 81% e 119% daquela da população de células exposta ao mais um agente de controle positivo, por exemplo, maior ou igual a 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % da população de células exposta a mais um agente de controle positivo e menor ou igual a 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118% ou 119% daquela da população de células exposta ao mais um agente de controle positivo.
[061] Por corresponde e press o dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) , alternativa ou adicionalmente é incluído que a amostra de teste é classificada como pertencente ao mesmo grupo que as uma ou mais amostras de controle positivo. Por exemplo, quando uma SVM é usada, a amostra de teste está do mesmo lado do limiar do valor de decisão que as uma ou mais amostra de controle positivo (por exemplo, se o agente de teste for classificado como um sensibilizador respiratório se um ou mais testes (ou replicado dos mesmos) tiverem um valor de decisão de SVM de >0, então as uma ou mais amostras de controle positivo (ou a maioria delas) também deve ter um valor de decisão de SVM de >0).
[062] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle positivo fornecidos na etapa (f) compreendem ou consistem em um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em: Hexacloroplatinato de amônio; Persulfato de amônio; Etilenodiamina; Glutaraldeído; Di-isocianato de hexametileno; Anidrido maleico; Metileno difenol di-isocianato; Anidrido ftálico; Tolueno di-isocianato; Anidrido trimelítico; Hidrato de cloramina-T; Di-isocianato de isoforona; Piperazina; Laranja reativo 16; Anidrido maleico; Isocianato de fenila (MDI); Anidrido ftálico; Di-isocianato de tolueno; e Anidrido trimelítico.
[063] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle positivo fornecidos na etapa (f) compreendem ou consistem em um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em: Laranja reativo 16; Piperazina; Cloramina T; e Anidrido trimelítico.
[064] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle positivo fornecidos na etapa (f) compreendem ou consistem em um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em: Laranja reativo 16; e Piperazina.
[065] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle positivo podem compreender ou consistir em um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste naqueles sensibilizadores respiratórios listados na Tabela 1 e/ou Tabela 3.
[066] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais agentes de controle positivo podem compreender ou consistir em Metileno difenol di-isocianato.
[067] O método pode compreender ou consistir no uso de pelo menos 2 controles positivos (ou seja, agentes de sensibilização), por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 100 agentes de controle positivo.
[068] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o método é indicativo da potência de sensibilização do agente a ser testado. Por exemplo, o método pode ser usado para prever a potência de sensibilização relativa de um agente de teste em comparação com um controle positivo e/ou em comparação com um ou mais agentes de teste adicionais.
[069] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o método compreende a etapa adicional de:
[070] (h) identificar se o agente de teste é um sensibilizador respiratório.
[071] Portanto, em uma modalidade, o método é indicativo de se o agente de teste é ou não um agente de sensibilização respiratória. Em uma modalidade alternativa ou adicional, o método é indicativo da potência de sensibilização respiratória relativa do agente de teste.
[072] Assim, em uma modalidade, o método é indicativo da potência de sensibilizador do agente de teste (isto é, que o agente de teste é um não sensibilizador, um sensibilizador fraco, um sensibilizador moderado, um sensibilizador forte ou um sensibilizador extremo). De preferência, o valor de decisão e a distância em PCA se correlacionam com a potência do sensibilizador.
[073] Alternativamente ou adicionalmente, a potência do agente de teste pode ser determinada, na etapa (d), fornecendo-se:
[074] (i) um ou mais agentes de controle positivo de sensibilizador respiratório extremo;
[075] (ii) um ou mais agentes de controle positivo de sensibilizador respiratório forte;
[076] (iii) um ou mais agentes de controle positivo de sensibilizador respiratório moderado; e/ou
[077] (iv) um ou mais agentes de controle positivo de sensibilizador respiratório fraco,
[078] em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório extremo no caso de a presença e/ou quantidade na amostra de teste dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) corresponderem à presença e/ou quantidade na amostra de controle positivo extremo (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e); e/ou serem diferentes da presença e/ou quantidade na amostra de controle forte, moderado, fraco e/ou negativo (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e) e/ou (g),
[079] em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório forte no caso de a presença e/ou quantidade na amostra de teste dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) corresponderem à presença e/ou quantidade na amostra de controle positivo forte (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e); e/ou serem diferentes da presença e/ou quantidade na amostra de controle extremo, moderado, fraco e/ou negativo (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e) e/ou (g),
[080] em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório moderado no caso de a presença e/ou quantidade na amostra de teste dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) corresponderem à presença e/ou quantidade na amostra de controle positivo moderada (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e); e/ou serem diferentes da presença e/ou quantidade na amostra de controle extrema, forte, fraca e/ou negativa (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e) e/ou (g), e
[081] em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório fraco no caso de a presença e/ou quantidade na amostra de teste dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) corresponderem à presença e/ou quantidade na amostra de controle positivo fraco (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e); e/ou serem diferentes da presença e/ou quantidade na amostra de controle extremo, forte, moderado e/ou negativo (quando presente) dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e) e/ou (g).
[082] Portanto, a etapa (d) pode compreender ou consistir em fornecer as seguintes categorias de controle positivo de sensibilizador respiratório:
[083] (a) extremo, forte, moderado e fraco;
[084] (b) forte, moderado e fraco;
[085] (c) extremo, moderado e fraco;
[086] (d) extremo, forte e moderado;
[087] (e) extremo e forte;
[088] (f) forte e moderado;
[089] (g) moderado e fraco;
[090] (h) forte e fraco;
[091] (i) extremo e moderado;
[092] (j) extremo e fraco;
[093] (k) extremo;
[094] (l) forte;
[095] (m) moderado;
[096] (n) fraco.
[097] Os controles negativos e positivos podem ser classificados como não sensibilizadores respiratórios ou sensibilizadores respiratórios, respectivamente, com base em observações clínicas em humanos.
[098] Alternativa ou adicionalmente, o método pode compreender comparar a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) com um ou mais valores de referência predeterminados que representam a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e) e/ou etapa (g).
[099] Pela seleção apropriada de alguns ou de todos os biomarcadores na Tabela A, opcionalmente em conjunto com um ou mais biomarcadores adicionais, os métodos da invenção exibem alta precisão preditiva para a identificação de sensibilizadores respiratórios.
[100] Geralmente, os agentes de sensibilização respiratória são determinados com uma AUC de ROC de pelo menos 0,55, por exemplo, com uma AUC de ROC de pelo menos 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99 ou com uma AUC de ROC de 1,00. De preferência, os agentes de sensibilização respiratória são determinados com uma AUC de ROC de pelo menos 0,85, e mais preferencialmente com uma AUC de ROC de 1.
[101] A identificação pode ser realizada usando qualquer método estatístico ou algoritmo de aprendizado de máquina adequados conhecidos na técnica, tal como Floresta aleatória (RF), Máquina de Vetores de Suporte (SVM), Análise de Componentes Principais (PCA), mínimos quadrados ordinários (OLS), regressão por mínimos quadrados parciais (PLS), regressão por mínimos quadrados parciais ortogonais (O-PLS) e outras análises estatísticas multivariadas (por exemplo, modelo de regressão logística backward stepwise). Para uma revisão da análise estatística multivariada, consulte, por exemplo, Schervish, Mark J. (Novembro de 1987). A Review of Multivariate Anal sis . Statistical Science 2 (4): 396 a 413, que está incorporado no presente documento por referência. Preferencialmente, Máquina de Vetores de Suporte é usada.
[102] Normalmente, os sensibilizadores respiratórios são identificados com o uso de uma máquina de vetor de suporte (SVM), tal como as disponíveis em http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html (por exemplo, e1071 1.5-24). Contudo, qualquer outro meio adequado pode também ser usado. SVMs também podem ser usadas para determinar as AUCs de ROC de assinaturas de biomarcadores que compreendem ou consistem em um ou mais biomarcadores da Tabela A, conforme definido neste documento.
[103] Máquinas de vetor de suporte (SVMs) são um conjunto de métodos de aprendizado supervisionados relacionados usados para classificação e regressão. Dado um conjunto de exemplos de treinamento, cada um marcado como pertencente a uma das duas categorias, um algoritmo de treinamento de SVM constrói um modelo que é previsto um novo exemplo que se enquadra em uma ou outra categoria. Intuitivamente, um modelo de SVM é uma representação dos exemplos como pontos no espaço, mapeados de forma que os exemplos das categorias separadas sejam divididos por uma lacuna clara que seja o mais ampla possível. Novos exemplos são então mapeados no mesmo espaço e previstos para pertencer a uma categoria com base em qual lado da lacuna eles caem.
[104] Mais formalmente, uma máquina de vetores de suporte constrói um hiperplano ou conjunto de hiperplanos em um espaço de alta ou infinita dimensão, que pode ser usado para classificação, regressão ou outras tarefas. Intuitivamente, uma boa separação é alcançada pelo hiperplano que possui a maior distância até os pontos de dados de treinamento mais próximos de qualquer classe (a chamada margem funcional), pois, em geral,
quanto maior a margem menor o erro de generalização do classificador. Para obter mais informações sobre SVMs, consultar, por exemplo, Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121 a 167.
[105] Em uma modalidade da invenção, a SVM é treinada antes de reali ar os m todos da inven o com o uso de perfis de biomarcadores de agentes conhecidos (nomeadamente, sensibilizadores respiratórios ou não sensibilizadores conhecidos). Ao executar essas amostras de treinamento, a SVM é capaz de aprender quais perfis de biomarcadores estão associados a agentes capazes de induzir sensibilização respiratória. Uma vez concluído o processo de treinamento, a SVM pode então prever se a amostra do biomarcador testada é ou não de um sensibilizador ou não sensibilizador respiratório.
[106] Os valores de decisão para SVMs individuais podem ser determinados pelo especialista caso a caso. Em uma modalidade, o agente de teste é classificado como um sensibilizador respiratório se um ou mais testes (ou sua réplica) tiverem um valor de decisão de SVM > 0. Em uma modalidade, o agente de teste é classificado como um não sensibilizador respiratório se um ou mais testes (ou sua réplica) tiverem um valor de decisão de SVM 0. Isso permite que os agentes de teste sejam classificados como um sensibilizador ou não sensibilizador respiratório.
[107] No entanto, este procedimento de treinamento pode ser ignorado pré-programando o SVM com os parâmetros de treinamento necessários. Por exemplo, os sensibilizadores respiratórios podem ser identificados de acordo com os parâmetros de SVM conhecidos com o uso do algoritmo de SVM descrito no Exemplo, com base na medição de dois ou mais dos biomarcadores listados na Tabela A.
[108] Será observado por pessoas versadas que os parâmetros de SVM adequados podem ser determinados para qualquer combinação dos biomarcadores listados na Tabela A através do treino de uma máquina SVM com a seleção apropriada de dados (isto é, medições de biomarcadores de células expostas a sensibilizadores e/ou não sensibilizadores respiratórios conhecidos). Alternativamente, os biomarcadores da Tabela A podem ser usados para identificar sensibilizadores respiratórios de acordo com qualquer outro método estatístico adequado conhecido na técnica.
[109] Alternativamente, os dados da Tabela A podem ser usados para identificar agentes capazes de induzir sensibilização respiratória de acordo com qualquer outro método estatístico adequado conhecido na técnica (por exemplo, ANOVA, ANCOVA, MANOVA, MANCOVA, Análise de regressão multivariada, Análise de componentes principais (PCA), Análise fatorial, Análise de correlação canônica, Análise de correlação canônica, Análise de redundância, Análise de correspondência (CA; média recíproca), Escala multidimensional, Análise discriminante, Análise discriminante linear (LDA), Sistemas de agrupamento, Partição recursiva e Redes neurais artificiais).
[110] De preferência, os métodos da invenção têm uma precisão de pelo menos 60%, por exemplo, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de precisão. Em uma modalidade preferida, os métodos da invenção têm uma precisão de pelo menos 89%.
[111] De um modo preferido, os métodos da invenção têm uma sensibilidade de pelo menos 60%, por exemplo, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sensibilidade. Em uma modalidade preferida, os métodos da invenção têm uma sensibilidade de pelo menos 89%.
[112] Preferivelmente, os métodos da invenção têm uma especificidade de pelo menos 60%, por exemplo, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de especificidade. Em uma modalidade preferida, os métodos da invenção têm uma especificidade de pelo menos 89%.
[113] Por precis o entende-se a proporção de resultados corretos de um m todo, por sensibilidade entende-se a proporção de todos os agentes positivos que são corretamente classificados como positivos, e por especificidade entende-se a proporção de todos os agentes negativos que são corretamente classificados como negativos.
[114] Em uma modalidade preferida, a etapa (c) compreende ou consiste na medição da expressão de uma molécula de ácido nucleico de um ou mais dos biomarcadores. A molécula de ácido nucleico pode ser uma molécula de DNA ou uma molécula de cDNA ou uma molécula de mRNA. De preferência, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de mRNA. No entanto, a molécula de ácido nucleico pode ser uma molécula de cDNA.
[115] Em uma modalidade, a medição da expressão de um ou mais dos biomarcadores na etapa (c) é realizada com o uso de um método selecionado a partir do grupo que consiste em hibridização Southern, hibridização Northern, reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR por transcriptase reversa (RT-PCR), PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), nanomatriz, micromatriz, macromatriz, autorradiografia e hibridização in situ. De preferência, a expressão de um ou mais biomarcadores é medida usando uma micromatriz de DNA.
[116] Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) são medidos usando uma matriz (por exemplo, uma matriz de DNA). Em uma modalidade adicional ou alternativa, os um ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) são medidos usando uma matriz de genoma completo (por exemplo, a matri Aff metri Human Gene 1.0 ST ou a matri Aff metri Human Gene 2.0 ST). Em uma modalidade alternativa ou adicional, o sistema Nanostring nCounter® é usado (por exemplo, conjuntos de códigos Nanostring nCounter® personalizados com base na seleção de uma matriz de genoma completo (por exemplo, a matriz Affymetrix Human Gene 1.0 ST ou a matriz Affymetrix Human Gene 2.0 ST). Esses sistemas podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante, usando kits e reagentes recomendados. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o conjunto de códigos contém sondas para um ou mais dos 28 genes definidos na Tabela A.
[117] O método pode compreender a medição da expressão de um ou mais biomarcadores na etapa (c) usando uma ou mais porções químicas de ligação, cada uma capaz de se ligar seletivamente a uma molécula de ácido nucleico que codifica um dos biomarcadores identificados na Tabela A. De preferência, o método compreende a medição da expressão de dois ou mais biomarcadores na etapa (c) usando duas ou mais porções químicas de ligação, cada uma capaz de se ligar seletivamente a uma molécula de ácido nucleico que codifica um dos biomarcadores identificados na Tabela A. Por exemplo, a expressão de qualquer combinação particular de biomarcadores descritos acima pode ser medida usando uma combinação equivalente de porções químicas de ligação capazes de se ligar seletivamente a cada um desses biomarcadores.
[118] Em uma modalidade, as uma ou mais porções químicas de ligação compreendem ou consistem, cada uma, em uma molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, as uma ou mais porções químicas de ligação compreendem ou consiste, cada uma, em DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA ou PMO. De preferência, as uma ou mais porções químicas de ligação compreendem ou consistem, cada uma, em DNA. Vantajosamente, as uma ou mais porções químicas de ligação têm 5 a 100 nucleotídeos de comprimento. No entanto, em uma modalidade alternativa, elas têm 15 a 35 nucleotídeos de comprimento.
[119] As uma ou mais porções químicas de ligação podem compreender ou consistir em uma ou mais sondas da matriz Human
Gene 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Os números de identificação das sondas são fornecidos na Tabela A deste documento.
[120] Os agentes de ligação adequados (também referidos como moléculas de ligação ou porções químicas de ligação) podem ser selecionados ou triados a partir de uma biblioteca com base na sua capacidade para se ligar a um determinado ácido nucleico, proteína ou motivo de aminoácido, conforme discutido abaixo.
[121] Em uma modalidade preferida, a porção química de ligação compreende uma porção química detectável.
[122] Por uma por o qu mica detect vel inclui-se uma porção química que permite que sua presença e/ou quantidade relativa e/ou localização (por exemplo, a localização em uma matriz) seja determinada, direta ou indiretamente.
[123] Porções químicas detectáveis adequadas são bem conhecidas na técnica.
[124] Por exemplo, a porção química detectável pode ser uma porção química fluorescente e/ou luminescente e/ou quimioluminescente que, quando exposta a condições específicas, pode ser detectada. Tal porção química fluorescente pode necessitar ser exposta a radiação (isto é, luz) em um comprimento de onda e intensidade específicos para causar excitação da porção química fluorescente, permitindo deste modo que ela emita fluorescência detectável em um comprimento de onda específico que pode ser detectado.
[125] Alternativamente, a porção química detectável pode ser uma enzima que é capaz de converter um substrato (preferivelmente indetectável) em um produto detectável que pode ser visualizado e/ou detectado. Exemplos de enzimas adequadas são discutidos em maior detalhe abaixo em relação, por exemplo, a ensaios de ELISA.
[126] A porção química detectável pode ser uma porção química radioativa e compreende ou consiste em um átomo radioativo. O átomo radioativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em tecnécio-99m, iodo-123, iodo-125, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, fósforo-32, enxofre-35, deutério, trítio, rênio-186, rênio-188 e ítrio-90.
[127] Assim, a porção química detectável pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em: uma porção química fluorescente; uma porção química luminescente; uma porção química quimioluminescente; uma porção química radioativa (por exemplo, um átomo radioativo); ou uma porção química enzimática.
[128] Claramente, o agente a ser detectado (tal como, por exemplo, o um ou mais biomarcadores na amostra de teste e/ou amostra de controle aqui descrita e/ou uma molécula de anticorpo para uso na detecção de uma proteína selecionada) deve ter o suficiente dos isótopos atômicos apropriados para que a porção química detectável seja facilmente detectável.
[129] Em uma modalidade alternativa preferida, a porção química detectável da porção química de ligação é uma porção química fluorescente.
[130] Os radiomarcadores ou outros marcadores podem ser incorporados nos biomarcadores presentes nas amostras dos métodos da invenção e/ou porções químicas de ligação da invenção de maneiras conhecidas. Por exemplo, se o agente de ligação for um polipeptídeo, ele pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor- 99m 123 186 188 111 19 em vez de hidrogênio. Marcadores tais como Tc, I, Rh, Rh e In podem, por exemplo, ser ligados por meio de resíduos de cisteína na porção química de ligação. O ítrio-90 pode ser ligado por meio de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49 a 57) pode ser usado para incorporar 123I. A refer ncia ( Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraph , J-F Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em detalhes. Os métodos para conjugar outras porções químicas detectáveis
(tais como porções enzimáticas, fluorescentes, luminescentes, quimioluminescentes ou radioativas) com proteínas são bem conhecidos na técnica.
[131] Será apreciado por pessoas versadas na técnica que os biomarcadores na amostra a ser testada (ou nas amostras a serem testadas) podem ser marcados com uma porção química que indiretamente auxilia na determinação da presença, quantidade e/ou localização das referidas proteínas. Assim, a porção química pode constituir um componente de uma porção química detectável multicomponente. Por exemplo, os biomarcadores na amostra a ser testada (ou nas amostras a serem testadas) podem ser marcados com biotina, o que permite sua detecção subsequente usando estreptavidina fundida ou de outra forma unida a um marcador detectável.
[132] O método fornecido no primeiro aspecto da presente invenção pode compreender ou consistir em, na etapa (c), determinar a expressão da proteína de um ou mais biomarcadores definidos na Tabela A. O método pode compreender a medição da expressão de um ou mais biomarcadores na etapa (c) usando uma ou mais porções químicas de ligação, cada uma capaz de se ligar seletivamente a um dos biomarcadores identificados na Tabela A. As uma ou mais porções de ligação podem compreender ou consistir em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tal como um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo.
[133] O termo anticorpo inclui quaisquer anticorpos sintéticos, anticorpos recombinantes ou híbridos de anticorpos, tais como, mas não limitados a, uma molécula de anticorpo de cadeia única produzida por exibição de fagos de regiões variáveis e/ou constantes de cadeia leve e/ou pesada de imunoglobulina, ou outra molécula imunointerativa capaz de se ligar a um antígeno em um formato de imunoensaio que é conhecido pelos versados na técnica.
[134] É também incluído o uso de agentes de ligação semelhantes a anticorpos, como affibodies e aptâmeros.
[135] Uma revisão geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpos que retêm os seus locais de ligação específicos pode ser encontrada em Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293 a
299.
[136] Adicionalmente, ou alternativamente, uma ou mais das primeiras moléculas de ligação podem ser um aptâmero (consultar Collett et al., 2005, Methods 37: 4 a 15).
[137] Bibliotecas moleculares, tais como bibliotecas de anticorpos (Clackson et al, 1991, Nature 352, 624 a 628; Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581 a 597), bibliotecas de peptídeos (Smith, 1985, Science 228 (4705): 1.315 a 1.317), bibliotecas de DNAc expressas (Santi et al. (2000) J Mol Biol 296 (2): 497 a 508), bibliotecas de suportes diferentes da estrutura principal de anticorpo tal como os affibodies (Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4.134 a 4.140) ou bibliotecas baseadas em aptâmeros (Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 118, 217 a 231) podem ser utilizadas como uma fonte a partir da qual moléculas de ligação que são específicas para um dado motivo são selecionados para utilização nos métodos da invenção.
[138] As bibliotecas moleculares podem ser expressas in vivo em células procarióticas (Clackson et al, 1991, op. cit.; Marks et al, 1991, op. cit.) ou células eucarióticas (Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651 a 5656) ou podem ser expressas in vitro sem envolvimento de células (Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937 a 4942; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132 a 5134; Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405 a 408).
[139] Nos casos em que as bibliotecas baseadas em proteínas são usadas, os genes que codificam as bibliotecas de moléculas de ligação potenciais são frequentemente empacotados em vírus e a molécula de ligação potencial exibida na superfície do vírus (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra; Smith, 1985, supra).
[140] Talvez o sistema de exibição mais comumente usado seja o bacteriófago filamentoso que exibe fragmentos de anticorpos em suas superfícies, os fragmentos de anticorpos sendo expressos como uma fusão com a proteína de revestimento menor do bacteriófago (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra). No entanto, outros sistemas adequados para exibição incluem o uso de outros vírus (EP 39578), bactérias (Gunneriusson et al, 1999, supra; Daugherty et al, 1998, Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613 a 621), e levedura (Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5):949 a 956).
[141] Além disso, os sistemas de exibição foram desenvolvidos utilizando a ligação do produto polipeptídico ao seu mRNA de codificação nos chamados sistemas de exibição de ribossomo (Hanes & Pluckthun, 1997, supra; He & Taussig, 1997, supra; Nemoto et al, 1997, supra), ou, alternativamente, a ligação do produto polipeptídico ao DNA codificador (consultar a Patente norte-americana nº 5.856.090 e WO 98/37186).
[142] Os domínios variável pesado (VH) e variável leve (VL) do anticorpo estão envolvidos no reconhecimento do antígeno, um fato inicialmente reconhecido por experimentos iniciais de digestão com protease. Uma confirma o adicional foi encontrada pela humani a o de anticorpos de roedores. Domínios variáveis de origem de roedor podem ser fundidos a domínios constantes de origem humana de modo que o anticorpo resultante retenha a especificidade antigênica do anticorpo parental de roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 a 6855).
[143] Essa especificidade antigênica é conferida por domínios variáveis e é independente dos domínios constantes, é conhecida a partir de experimentos envolvendo a expressão bacteriana de fragmentos de anticorpos, todos contendo um ou mais domínios variáveis. Por exemplo, o termo fragmento de anticorpo inclui moléculas semelhantes a Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas de Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas de Fv de cadeia simples (scFv) em que os domínios parceiros VH e VL estão ligados através de um oligopeptídeo flexível (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) e anticorpos de domínio único (dAbs) que compreendem domínios V isolados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Uma revisão geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpos que retêm os seus locais de ligação específicos pode ser encontrada em Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293 a 299.
[144] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em anticorpos intactos, fragmentos Fv (por exemplo, Fv de cadeia simples e Fv ligado por dissulfureto), fragmentos semelhantes a Fab (por e emplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab e fragmentos F(ab)2), domínios variáveis únicos (por exemplo, domínios VH e VL) e anticorpos de domínio (dAbs, que incluem formatos simples e duplos [isto é, dAb-ligante-dAb]). De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um Fv de cadeia simples (scFv).
[145] Uma ou mais porções químicas de ligação podem, alternativamente, compreender ou consistir em um agente de ligação semelhante a um anticorpo, por exemplo, um affibody ou aptâmero.
[146] Mol culas scFv significam mol culas em que os domínios parceiros VH e VL estão ligados por meio de um oligopeptídeo flexível.
[147] As vantagens potenciais de usar fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros, são inúmeras. O tamanho menor dos fragmentos pode resultar em propriedades farmacológicas melhoradas, tais como melhor penetração de tecido sólido. As funções efetoras de anticorpos inteiros, tais como a ligação do complemento, são removidas. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv, ScFv e dAb podem ser todos expressos em e secretados a partir de E. coli, assim, se permite a produção fácil de grandes quantidades dos ditos fragmentos.
[148] Anticorpos inteiros e fragmentos F(ab')2 são bivalentes . Bivalente significa que os ditos anticorpos e fragmentos F(ab') 2 têm dois sítios de combinação de antígeno. Em contraste, os fragmentos Fab,
Fv, ScFv e dAb são monovalentes, tendo apenas um sítio de combinação de antígeno.
[149] Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Anticorpos monoclonais adequados podem ser preparados por t cnicas conhecidas, por e emplo, aquelas descritas em Monoclonal Antibodies: A manual of techniques , H Zola (CRC Press, 1988) e em Monoclonal H bridoma Antibodies: Techniques and applications , J G R Hurrell (CRC Press, 1982), ambos dos quais são incorporados neste documento por referência.
[150] Quando as moléculas de ligação potencial são selecionadas de bibliotecas, um ou mais peptídeos seletores tendo motivos definidos são geralmente empregados. Resíduos de aminoácidos que fornecem estrutura, diminuindo a flexibilidade no peptídeo ou nas cadeias laterais carregadas, polares ou hidrofóbicas, permitindo a interação com a molécula de ligação, podem ser usados na concepção de motivos para peptídeos seletores. Por exemplo:
[151] (i) A prolina pode estabilizar a estrutura de um peptídeo já que sua cadeia lateral está ligada tanto ao carbono alfa quanto ao nitrogênio;
[152] (ii) A fenilalanina, a tirosina e o triptofano têm cadeias laterais aromáticas e são altamente hidrofóbicas, enquanto a leucina e a isoleucina têm cadeias laterais alifáticas e também são hidrofóbicas;
[153] (iii) A lisina, arginina e histidina têm cadeias laterais básicas e serão carregadas positivamente em pH neutro, enquanto o aspartato e o glutamato têm cadeias laterais ácidas e serão carregados negativamente em pH neutro;
[154] (iv) A asparagina e a glutamina são neutras em pH neutro, mas contêm um grupo amida que pode participar de ligações de hidrogênio;
[155] (v) As cadeias laterais de serina, treonina e tirosina contêm grupos hidroxila, que podem participar de ligações de hidrogênio.
[156] Normalmente, a seleção de moléculas de ligação pode envolver o uso de tecnologias e sistemas de matriz para analisar a ligação a pontos correspondentes a tipos de moléculas de ligação.
[157] As uma ou mais porções químicas de ligação de proteína podem compreender uma porção química detectável. A porção química detectável pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma porção química fluorescente, uma porção química luminescente, uma porção química quimioluminescente, uma porção química radioativa e uma porção química enzimática.
[158] Em uma modalidade adicional dos métodos da invenção, a etapa (c) pode ser realizada utilizando um ensaio que compreende um segundo agente de ligação capaz de se ligar às uma ou mais proteínas, em que o segundo agente de ligação também compreende uma porção química detectável. Segundos agentes de ligação adequados são descritos em detalhes acima em relação aos primeiros agentes de ligação.
[159] Assim, as proteínas de interesse na amostra a ser testada podem primeiro ser isoladas e/ou imobilizadas usando o primeiro agente de ligação, após o que a presença e/ou quantidade relativa dos ditos biomarcadores podem ser determinadas usando um segundo agente de ligação.
[160] Em uma modalidade, o segundo agente de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; tipicamente um anticorpo recombinante ou fragmento do mesmo. Convenientemente, o anticorpo ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em: scFv; Fab; um domínio de ligação de uma molécula de imunoglobulina. Anticorpos e fragmentos adequados, e métodos para produzir os mesmos, são descritos em detalhes acima.
[161] Alternativamente, o segundo agente de ligação pode ser um agente de ligação semelhante a um anticorpo, tal como um affibody ou aptâmero.
[162] Alternativamente, quando a porção química detectável na proteína na amostra a ser testada compreende ou consiste em um membro de um par de ligação específico (por exemplo, biotina), o segundo agente de ligação pode compreender ou consistir no membro complementar do par de ligação específico (por exemplo estreptavidina).
[163] Quando um ensaio de detecção é usado, é preferido que a porção química detectável seja selecionada a partir do grupo que consiste em: uma porção química fluorescente; uma porção química luminescente; uma porção química quimioluminescente; uma porção química radioativa; uma porção química enzimática. Exemplos de porções químicas detectáveis adequadas para uso nos métodos da invenção são descritos acima.
[164] Ensaios preferidos para a detecção de proteínas séricas ou plasmáticas incluem ensaios imunoenzimátgicos (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ensaios imunoradiométricos (IRMA) e ensaios imunoenzimáticos (IEMA), incluindo ensaios em sanduíche utilizando anticorpos monoclonais e/ou policlonais. Exemplos de ensaios em sanduíche são descritos por David et al. nas Patentes números U.S. 4.376.110 e 4.486.530, incorporadas neste documento por referência. A coloração de anticorpos de células em lâminas pode ser utilizada em modos bem conhecidos em testes de diagnóstico laboratoriais de citologia, bem conhecidos pelos versados na técnica.
[165] Assim, em uma modalidade o ensaio é um ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática), que envolve tipicamente o uso de enzimas que fornecem um produto de reação colorido, usualmente em ensaios de fase sólida. Enzimas como a peroxidase de rábano e a fosfatase têm sido amplamente empregadas. Uma maneira de amplificar a reação da fosfatase é usar o NADP como substrato para gerar o NAD, que agora atua como uma coenzima para um segundo sistema enzimático. A pirofosfatase de Escherichia coli fornece um bom conjugado porque a enzima não está presente nos tecidos, é estável e dá uma boa cor de reação. Sistemas quimioluminescentes baseados em enzimas tais como a luciferase também podem ser usados.
[166] A conjugação com a vitamina biotina é frequentemente utilizada, uma vez que esta pode ser prontamente detectada pela sua reação com a avidina ou estreptavidina ligada a enzima à qual se liga com grande especificidade e afinidade.
[167] Em uma modalidade alternativa, o ensaio usado para a detecção de proteínas é convenientemente um ensaio fluorométrico. Assim, a porção química detectável do segundo agente de ligação pode ser uma porção química fluorescente, como um fluoróforo Alexa (por exemplo Alexa - 647).
[168] De preferência, as etapas (c), (e) e/ou (g) dos métodos descritos no primeiro aspecto são realizadas usando uma matriz. A matriz pode ser uma matriz com base em microesfera ou uma matriz com base em superfície. A matriz pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em: macromatriz; micromatriz; nanomatriz.
[169] As matrizes, per se, são bem conhecidas na técnica. Tipicamente, elas são formadas por uma estrutura linear ou bidimensional tendo regi es ( pontos ) separadas (isto , distintas), cada uma tendo uma área finita, formada na superfície de um suporte sólido. Uma matriz também pode ser uma estrutura de microesferas, onde cada microesfera pode ser identificada por um código molecular ou código de cores ou identificada em um fluxo contínuo. A análise também pode ser realizada sequencialmente, onde a amostra é passada por uma série de pontos, cada um absorvendo a classe de moléculas da solução. O suporte sólido é tipicamente vidro ou um polímero, sendo os polímeros mais vulgarmente utilizados celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno. Os suportes sólidos podem estar na forma de tubos, microesferas, discos, chips de silício, microplacas, membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF), membrana de nitrocelulose,
membrana de nylon, outra membrana porosa, membrana não porosa (por exemplo, plástico, polímero, perspex, silício entre outros), uma pluralidade de pinos poliméricos, ou uma pluralidade de poços de microtitulação, ou qualquer outra superfície adequada para imobilizar proteínas, polinucleotídeos e outras moléculas adequadas e/ou conduzir um imunoensaio. Os processos de ligação são bem conhecidos na técnica e consistem geralmente em reticulação de ligação covalente ou adsorção física de uma molécula de proteína, polinucleotídeo ou semelhante ao suporte sólido. Alternativamente, o acoplamento por afinidade das sondas via etiquetas de afinidade ou construções semelhantes pode ser empregado. Utilizando técnicas bem conhecidas, como impressão de contato ou sem contato, mascaramento ou fotolitografia, a localização de cada ponto pode ser definida. Para revisões, consultar Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13 a 29) e Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9).
[170] Normalmente, a matriz é uma micromatriz. Por micromatri inclui-se o significado de uma matriz de regiões que têm uma densidade de regiões distintas de, pelo menos, cerca de 100/cm 2, e de preferência pelo menos cerca de 1.000/cm2. As regiões em uma micromatriz têm dimensões típicas, por exemplo, diâmetros, na faixa de cerca de 10 a 250 m e são separadas de outras regiões na matriz por aproximadamente a mesma distância. A matriz também pode ser uma macromatriz ou uma nanomatriz.
[171] Uma vez que as moléculas de ligação adequadas (discutidas acima) tenham sido identificadas e isoladas, a pessoa versada na técnica pode fabricar uma matriz utilizando métodos bem conhecidos na técnica da biologia molecular.
[172] Em uma modalidade adicional ou alternativa, um ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) compreendem ou consistem em um ou mais produtos de genes homólogos expressos por células humanas. Em uma modalidade adicional ou alternativa, um ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) são uma proteína ou polipeptídeo. Em uma modalidade adicional ou alternativa, um ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) é um ácido nucleico (por exemplo, DNA, mRNA ou cDNA, etc.).
[173] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o método é realizado in vitro, in vivo, ex vivo ou in silico. Por exemplo, o método pode, em particular, ser realizado in vitro.
[174] Por agente de teste inclui-se qualquer substância, composto, composição e/ou entidade (ou mistura dos mesmos) para o/a qual o status de sensibilização respiratória deve ser determinado.
[175] Por estado de sensibili a o inclui-se ou significa que um agente de teste (ou mistura de agente de teste) é ou não um sensibilizador (por exemplo, um sensibilizador respiratório).
[176] Em uma modalidade, o método é para identificar agentes capazes de induzir uma resposta de hipersensibilidade respiratória. De preferência, a resposta de hipersensibilidade é uma resposta de hipersensibilidade humoral, por exemplo, uma resposta de hipersensibilidade tipo I. Em uma modalidade, o método é para identificar agentes capazes de induzir alergia respiratória.
[177] Por indicativo do efeito de sensibili a o respirat ria do agente de teste inclui-se determinar se o agente de teste é ou não um sensibilizador respiratório e/ou determinar a potência do agente de teste como um sensibilizador respiratório.
[178] Por agentes capa es de indu ir sensibili a o respirat ria entende-se qualquer agente capaz de induzir e desencadear uma reação de hipersensibilidade imediata do Tipo I no trato respiratório de um mamífero. De preferência, o mamífero é um humano. De preferência, a reação de hipersensibilidade imediata do Tipo I é mediada por DC e/ou envolve a diferenciação de células T em células Th2. De preferência, a reação de hipersensibilidade imediata do Tipo I resulta em imunidade humoral e/ou alergia respiratória.
[179] A zona condutora do pulmão dos mamíferos contém a traqueia, os brônquios, os bronquíolos e os bronquíolos terminais. A zona respiratória contém os bronquíolos respiratórios, os dutos alveolares e os alvéolos. A zona condutora é formada por vias aéreas, não tem trocas gasosas com o sangue e é reforçada com cartilagem para manter as vias aéreas abertas. A zona condutora umedece o ar inalado e o aquece a 37 ° C (99 °F). Ela também limpa o ar removendo partículas por meio dos cílios localizados nas paredes de todas as passagens. A zona respiratória é o sítio da troca gasosa com o sangue.
[180] Em uma modalidade, o agente capa de indu ir sensibili a o respirat ria um agente capa de indu ir e desencadear uma reação de hipersensibilidade imediata do Tipo I em um local do epitélio pulmonar em um mamífero. De preferência, o local do epitélio pulmonar está na zona respiratória do pulmão, mas pode, alternativa ou adicionalmente, estar na zona condutora do pulmão.
[181] O mamífero pode ser qualquer animal doméstico ou agrícola. De preferência, o mamífero é um rato, camundongo, porquinho-da- Índia, gato, cão, cavalo ou um primata. Mais preferencialmente, o mamífero é humano.
[182] As células dendríticas (DCs) são células imunológicas que fazem parte do sistema imunológico dos mamíferos. Sua principal função é processar o material do antígeno e apresentá-lo na superfície para outras células do sistema imunológico (ou seja, elas funcionam como células apresentadoras de antígeno), criando uma ponte entre os sistemas imunológico inato e adaptativo.
[183] As células dendríticas estão presentes nos tecidos em contato com o ambiente externo, tal como a pele (onde existe um tipo de célula dendrítica especializada chamada células de Langerhans) e o revestimento interno do nariz, pulmões, estômago e intestinos. Elas também podem ser encontradas em um estado imaturo no sangue. Uma vez ativadas, elas migram para os nódulos linfáticos, onde interagem com as células T e B para iniciar e dar forma à resposta imune adaptativa. Em certos estágios de desenvolvimento, elas desenvolvem projeções ramificadas, os dendritos. Embora semelhantes em aparência, são estruturas distintas dos dendritos dos neurônios. As células dendríticas imaturas também são chamadas de células veladas, pois possuem grandes "véus" citoplasmáticos em vez de dendritos.
[184] Por c lulas semelhantes a dendr ticas entende- se que células não dendríticas que exibem características funcionais e fenotípicas específicas a células dendríticas, tais como características morfológicas, expressão de moléculas coestimulatórias e moléculas de MHC de classe II e a capacidade de executar pinocitose de macromoléculas e ativar células T em repouso.
[185] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a população de células dendríticas ou população de células semelhantes a dendríticas compreende ou consiste em células imortais. Por imortal entende- se células que não são limitadas por um ponto em que não podem mais continuar a se dividir, o que, do contrário, poderia ser devido a danos no DNA ou telômeros encurtados.
[186] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a população de células dendríticas ou população de células semelhantes a dendríticas compreende ou consiste em células de ocorrência não natural. Por c lulas de ocorr ncia n o natural entende-se que as células são diferentes, modificadas ou variantes daquelas que seriam encontradas na natureza; em outras palavras, não são células que normalmente ocorreriam na natureza. Por exemplo, as células são diferentes, modificadas de e/ou uma variante de uma célula de leucemia mieloide humana de ocorrência natural ou uma célula dendrítica de ocorrência natural.
[187] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a população de células dendríticas ou população de células semelhantes a dendríticas é uma população de células semelhantes a dendríticas. Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células semelhantes a dendríticas são células semelhantes a dendríticas mieloides. Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células semelhantes a dendríticas mieloides são derivadas de células dendríticas mieloides. Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células derivadas de células dendríticas mieloides são células derivadas de leucemia mieloide. Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células derivadas de leucemia mieloide são selecionadas do grupo que consiste em KG- 1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193, MUTZ-3, e SenzaCell.
[188] Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células semelhantes a dendríticas são células MUTZ-3. As células MUTZ-3 são células de leucemia mielomonocítica aguda humana que estão disponíveis na Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemanha (www.dsmz.de; DMSZ No. ACC 295).
[189] Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células semelhantes a dendríticas são células de leucemia mieloide semelhantes a dendríticas de ocorrência não natural de acordo com a designação de depósito de patente ATCC PTA-123875. Essas células também são chamadas de Sen aCell . SenzaCell (ATCC Patent Deposit Designation PTA-123875) está depositado na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110, EUA.
[190] Em uma modalidade adicional ou alternativa, as células derivadas de leucemia mieloide são MUTZ-3 ou SenzaCell.
[191] Em uma modalidade, as células dendríticas, após estimulação com citocina, apresentam antígenos através de CD1d, MHC de classe I e II e/ou induzem proliferação de células T específicas.
[192] Em uma modalidade, as células semelhantes a dendríticas são progenitores de células dendríticas CD34+. Opcionalmente, os progenitores de células dendríticas CD34+ podem adquirir, mediante estimulação de citocinas, os fenótipos de apresentação de antígenos através de CD1d, MHC classe I e II, induzir a proliferação de células T específicas e/ou exibir um perfil transcricional e fenotípico maduro após estimulação com mediadores inflamatórios (isto é, fenótipos semelhantes a células dendríticas imaturas ou células dendríticas semelhantes a Langerhans).
[193] Em uma modalidade, as células semelhantes a dendríticas expressam pelo menos um dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 e CD1a, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos marcadores. Em uma outra modalidade, as células semelhantes a dendríticas expressam os marcadores CD54, CD86, CD80, HLA- DR, CD14, CD34 e CD1a.
[194] Em uma modalidade, a população de células dendríticas ou população de células semelhantes a dendríticas é uma população de células dendríticas. De preferência, as células dendríticas são células dendríticas primárias. De preferência, as células dendríticas são células dendríticas mieloides.
[195] As células dendríticas podem ser reconhecidas pela função, pelo fenótipo e/ou pelo padrão de expressão gênica, particularmente pelo fenótipo da superfície celular. Essas células são caracterizadas por sua morfologia distinta, altos níveis de expressão de superfície MHC de classe II e capacidade de apresentar antígeno para células T CD4+ e/ou CD8+, particularmente para células T naïve (Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271).
[196] A superfície celular das células dendríticas é incomum, com projeções semelhantes a véus características, e é caracterizada pela expressão dos marcadores de superfície celular CD11c e MHC classe II. A maioria das DCs é negativa para marcadores de outras linhagens de leucócitos, incluindo células T, células B, monócitos/macrófagos e granulócitos. Subpopulações de células dendríticas também podem expressar marcadores adicionais, incluindo 33D1, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CD1a-d, CD4, CD5, CD8alpha, CD9, CD11b, CD24, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD91, CD117, CD123 (IL3Ra), CD134, CD137, CD150, CD153, CD162, CXCR1, CXCR2, CXCR4, DCIR, DC-LAMP, DC-SIGN, DEC205, E-
caderina, Langerina, receptor de manose, MARCO, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9 e várias lectinas.
[197] Os padrões de expressão desses marcadores de superfície celular podem variar junto com a maturidade das células dendríticas, seu tecido de origem e/ou sua espécie de origem. As células dendríticas imaturas expressam baixos níveis de MHC de classe II, mas são capazes de executar endocitose de proteínas antigênicas e processá-las para apresentação em um complexo com moléculas de MHC de classe II. As células dendríticas ativadas expressam altos níveis de MHC classe 11, ICAM-1 e CD86, e são capazes de estimular a proliferação de células T alogênicas naive, por exemplo, em uma reação leucocitária mista (MLR).
[198] Funcionalmente, as células dendríticas ou células semelhantes a dendríticas podem ser identificadas por qualquer ensaio conveniente para a determinação da apresentação do antígeno. Tais ensaios podem incluir testar a capacidade de estimular células T iniciadas com antígeno e/ou naive pela apresentação de um antígeno de teste, seguido da determinação da proliferação de células T, liberação de IL-2 e semelhantes.
[199] Em uma modalidade, as células semelhantes a dendríticas incluem células epiteliais e/ou células semelhantes a epiteliais, tais como BEAS-2B [28], WT 9-7 e A549[29]. De preferência, as células epiteliais são células epiteliais do pulmão. De preferência, as células semelhantes a epiteliais são células semelhantes a epiteliais do pulmão. Em uma modalidade alternativa, as células semelhantes a dendríticas incluem células epiteliais e/ou células semelhantes a epiteliais.
[200] Os métodos de detecção e/ou medição da concentração de proteína e/ou ácido nucleico são bem conhecidos pelos versados na técnica, consultar por exemplo Sambrook e Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[201] Os métodos preferidos para a detecção e/ou medição da proteína incluem Western blot, North-Western blot, ensaios de imunoabsorção (ELISA), micromatriz de anticorpo, micromatriz de tecido (TMA), imunoprecipitação, hibridização in situ e outras técnicas de imuno-histoquímica, radioimunoensaio (RIA), ensaios imunorradiométricos (IRMA) e ensaios imunoenzimáticos (IEMA), incluindo ensaios em sanduíche usando anticorpos monoclonais e/ou policlonais. Exemplos de ensaios em sanduíche são descritos por David et al. nas Patentes nºs U.S. 4.376.110 e 4.486.530, incorporadas neste documento por referência. A coloração de anticorpos de células em lâminas pode ser utilizada em modos bem conhecidos em testes de diagnóstico laboratoriais de citologia, bem conhecidos pelos versados na técnica.
[202] Normalmente, o ELISA envolve o uso de enzimas que dão um produto de reação colorido, geralmente em ensaios de fase sólida. Enzimas como a peroxidase de rábano e a fosfatase têm sido amplamente empregadas. Uma maneira de amplificar a reação da fosfatase é usar o NADP como substrato para gerar o NAD, que agora atua como uma coenzima para um segundo sistema enzimático. A pirofosfatase de Escherichia coli fornece um bom conjugado porque a enzima não está presente nos tecidos, é estável e dá uma boa cor de reação. Sistemas quimioluminescentes baseados em enzimas como a luciferase também podem ser usados.
[203] A conjugação com a vitamina biotina é frequentemente utilizada, uma vez que esta pode ser prontamente detectada pela sua reação com a avidina ou estreptavidina ligada a enzima à qual se liga com grande especificidade e afinidade.
[204] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o método compreende uma ou mais das seguintes etapas:
[205] (i) cultivar células dendríticas ou semelhantes a dendríticas;
[206] (ii) semear células de (i) em um ou mais poços, de preferência na fase de crescimento de estado estacionário, por exemplo, poços de uma ou mais placas de ensaio de múltiplos poços;
[207] (iii) adicionar o agente (ou os agentes) a ser testado (a serem testados) a um ou mais poços de (ii);
[208] (iv) adicionar a um ou mais poços separados de (ii) controle positivo (ou controles positivos) de (ii), por exemplo, Laranja reativo 16, Piperazina, Cloramina T e/ou Anidrido Trimelítico ;
[209] (v) adicionar a um ou mais poços separados de (ii) controle negativo (ou controles negativos), por exemplo, DMSO; e/ou deixando um ou mais poços separados de (ii) não estimulados para obter um controle de meio e/ou para fins de normalização;
[210] (vi) incubar células em poços de (iii) a (v), de preferência durante cerca de 24 horas; e, opcionalmente, colher células dos poços de (iii) a (v); e, ainda opcionalmente, remover o sobrenadante e armazenar no reagente TRIzol;
[211] (vii) isolar RNA total purificado das células de (vi) e, opcionalmente, converter mRNA em cDNA;
[212] (viii) quantificar os níveis de expressão de transcritos de mRNA individuais de (vii), por exemplo, usando uma matriz, tal como uma matriz Affymetrix Human Gene 1.0 ST, ou usando sondas de análise de expressão gênica personalizadas, tal como um conjunto de códigos Nanostring;
[213] (ix) exportar e normalizar dados de (viii), por exemplo, usando algoritmos apropriados, como descrito na Tabela 4;
[214] (x) isolar dados de (ix) provenientes de biomarcadores da Assinatura de Predição Respiratória GARD (ou seja, os biomarcadores da Tabela A);
[215] (xi) aplicar um modelo de predição aos dados de (x), por exemplo, um modelo de SVM congelado previamente estabelecido e treinado em dados históricos, por exemplo, dados obtidos no Exemplo 1, consultar também codificação na Tabela 4, para prever o estado de sensibilização respiratória dos agentes testados e controle (ou controles) negativo/positivo;
[216] (xii) identificar se o agente testado é um agente capaz de induzir sensibilização respiratória em um mamífero.
[217] Um segundo aspecto da invenção fornece uma matriz para uso no método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, em que a matriz compreende uma ou mais porções químicas de ligação conforme definido no primeiro aspecto da invenção.
[218] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a matriz compreende uma ou mais porções químicas de ligação para cada um dos biomarcadores conforme definido no primeiro aspecto da invenção. Em uma modalidade adicional ou alternativa, uma ou mais porções químicas de ligação são imobilizadas.
[219] Em uma modalidade adicional ou alternativa, a matriz é uma matriz com base em microesfera. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a matriz é uma matriz baseada em superfície. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a matriz é selecionada do grupo que consiste em: macromatriz; micromatriz; nanomatriz.
[220] A matriz do segundo aspecto da invenção pode compreender uma ou mais, de preferência duas ou mais, porções químicas de ligação, em que cada uma das porções de ligação é capaz de se ligar seletivamente a um biomarcador conforme definido no primeiro aspecto. Portanto, a matriz pode compreender ou consistir em uma seleção particular de porções químicas de ligação específicas a biomarcador que se correlaciona com qualquer seleção particular de biomarcadores, conforme definido no primeiro aspecto.
[221] Por exemplo, em uma modalidade adicional ou alternativa, a matriz compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28 porções químicas de ligação diferentes, em que as diferentes porções químicas de ligação são, cada uma,
capazes de se ligar seletivamente a um biomarcador diferente listado na Tabela A. Por exemplo, a matriz pode compreender ou consistir em 28 porções de ligação diferentes, cada uma capaz de se ligar seletivamente a um biomarcador diferente listado na Tabela A. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a matriz compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 porções de ligação diferentes, em que as diferentes porções de ligação são, cada uma, capazes de se ligar seletivamente a um biomarcador diferente listado na Tabela A(i). Por exemplo, a matriz pode compreender ou consistir em 25 porções químicas de ligação diferentes, cada uma capaz de se ligar seletivamente a um biomarcador diferente listado na Tabela A(i).
[222] Um terceiro aspecto da invenção fornece o uso de dois ou mais biomarcadores conforme definido no primeiro aspecto da invenção para determinar o efeito de sensibilização respiratória de um agente de teste.
[223] Em uma modalidade adicional ou alternativa, é fornecido o uso de dois ou mais biomarcadores selecionados do grupo definido na Tabela A para determinar o efeito de sensibilização respiratória de um agente de teste, de preferência em que um ou mais dos biomarcadores são selecionados do grupo definido em Tabela A(i).
[224] Em uma modalidade adicional ou alternativa, é fornecido o uso de duas ou mais porções químicas de ligação, cada uma com especificidade para um biomarcador selecionado do grupo definido na Tabela A para determinar o efeito de sensibilização respiratória de um agente de teste, de preferência em que uma ou mais das porções de ligação têm especificidade para um biomarcador selecionado do grupo definido na Tabela A(i).
[225] Um quarto aspecto da invenção fornece um kit analítico para uso em um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, que compreende:
[226] (a) uma matriz de acordo com o segundo aspecto da invenção; e
[227] (b) instruções para realizar o método como definido no primeiro aspecto da invenção (opcional).
[228] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o kit analítico compreende ainda um ou mais agentes de controle conforme definido no primeiro aspecto da invenção.
[229] Um quinto aspecto da invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma reação de hipersensibilidade respiratória tipo I (tal como asma respiratória) em um paciente que compreende as etapas de:
[230] (a) fornecer um ou mais agentes de teste aos quais o paciente está ou foi exposto;
[231] (b) determinar se os um ou mais agentes de teste fornecidos na etapa (a) são um sensibilizador respiratório com o uso de um método fornecido em um primeiro aspecto da invenção; e
[232] (c) quando um ou mais agentes de teste são identificados como um sensibilizador respiratório, reduzir ou prevenir a exposição do paciente aos um ou mais agentes de teste e/ou fornecer tratamento apropriado para os sintomas de sensibilização.
[233] De preferência, os um ou mais agentes de teste a que o paciente está ou foi exposto são um agente a que o paciente é atualmente exposto pelo menos uma vez por mês, por exemplo, pelo menos uma vez a cada duas semanas, pelo menos uma vez por semana, ou pelo menos uma vez por dia.
[234] Os tratamentos dos sintomas de sensibilização podem incluir agonistas beta2-adrenoceptores de ação curta (SABA), tais como salbutamol; medicamentos anticolinérgicos, tais como brometo de ipratrópio; outros agonistas adrenérgicos, tais como epinefrina inalada; corticosteroides tais como beclometasona; agonistas beta-adrenoceptores de longa ação (LABA), tais como salmeterol e formoterol; antagonistas de leucotrieno, tais como montelucaste e zafirlucaste; e/ou estabilizadores de mastócitos (tais como cromoglicato de sódio) são outra alternativa não preferida aos corticosteroides.
[235] De preferência, o método de tratamento é consistente com o método descrito no primeiro aspecto da invenção e uma ou mais das modalidades nele descritas.
[236] Um sexto aspecto da invenção proporciona um programa de computador para operar os métodos da invenção, por exemplo, para interpretar os dados de expressão da etapa (c) (e subsequentes etapas de medição da expressão) e, assim, determinar se um ou mais agentes de teste são alergênicos. O programa de computador pode ser uma SVM programada. O programa de computador pode ser gravado em um carreador adequado para leitura por computador, conhecido pelos versados na técnica. Portadores adequados legíveis por computador podem incluir discos compactos (incluindo CD-ROMs, DVDs, Blu-ray e similares), disquetes, unidades de memória flash, ROM ou unidades de disco rígido. O programa de computador pode ser instalado em um computador adequado para executar o programa de computador.
[237] O versado na técnica apreciará que todas as modalidades não conflitantes podem ser usadas em combinação. Portanto, as modalidades de um aspecto da invenção podem igualmente ser aplicadas a um segundo aspecto da invenção. A listagem ou discussão de um documento aparentemente publicado anteriormente neste relatório descritivo não deve necessariamente ser tomada como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da técnica ou é de conhecimento geral comum.
[238] Exemplos preferidos não limitativos que incorporam certos aspectos da invenção serão agora descritos, com referência às seguintes figuras:
[239] Figura 1. PCA de conjunto de dados de treinamento definidos em um espaço compactado de 28 variáveis, provenientes de uma assinatura de biomarcador otimizado.
[240] Figura 2. Visualização dos resultados da classificação do conjunto de teste 1, usando o modelo de predição GARDair finalizado.
[241] Uma substância de teste é classificada como um sensibilizador respiratório se o valor de decisão médio de SVM (n=3) for maior que 0.
[242] Figura 3. Visualização dos resultados da classificação do conjunto de teste 2, usando o modelo de predição GARDair finalizado.
[243] Uma substância de teste é classificada como um sensibilizador respiratório se o valor de decisão médio de SVM (n=3) for maior que 0. EXEMPLO 1
RESULTADOS FUNDAMENTAÇÃO DO MODELO DE PREDIÇÃO
[244] GARDTM é uma plataforma de metodologia de última geração para avaliação de sensibilizadores químicos. É baseado em uma linhagem celular semelhante a uma célula dendrítica (DC), imitando assim o tipo de célula envolvido na iniciação da resposta que leva à sensibilização. As DCs cultivadas são expostas a substâncias de teste de interesse. Após a incubação, as alterações transcricionais induzidas pela exposição são medidas a fim de estudar o estado de ativação das células. Essas mudanças estão associadas com a ponte de respostas imunes inatas e adaptativas e o papel de tomada de decisão das DCs in vivo e constituem, por exemplo, regulação crescente de moléculas coestimulatórias, indução de vias de estresse celular e oxidativo e um fenótipo alterado associado com funções migratórias e de comunicação entre células. Ao usar tecnologias de expressão gênica de última geração, são gerados dados de alto conteúdo informativo, que permitem ao usuário obter uma visão holística da resposta celular induzida pela substância de teste.
Simplificada, a tecnologia descrita permite a avaliação da substância de teste como sensibilizador ou não sensibilizador.
[245] O GARD é considerado uma plataforma de estratégia de teste, na qual se baseia uma série de aplicações. O termo plataforma neste documento indica que todos as aplicações são baseadas na mesma estratégia experimental e protocolos experimentais semelhantes. O termo aplica o neste documento indica diferentes ensaios para diferentes pontos finais biológicos.
[246] O ensaio GARDair descrito neste documento é um novo ensaio baseado na plataforma GARD que aqui demonstra ter a capacidade de classificar com precisão os sensibilizadores respiratórios. Assim, o GARDair tem a capacidade de ser o método de teste preferido que classifica especificamente os produtos químicos como sensibilizadores respiratórios, um ponto final para o qual não existem modelos de previsão validados ou mesmo amplamente aceitos e usados atualmente. DESCOBERTA DE BIOMARCADOR GARDair
[247] SenzaCells (depósito ATCC nº PTA-123875) foram expostas a um painel de referência de produtos químicos, compreendendo 10 sensibilizadores respiratórios bem caracterizados e 20 sensibilizadores não respiratórios, conforme definido pela literatura disponível e consenso de especialistas (Chan-Yeung & Malo, 1994, Dearman et al., 1997, Dearman et al., 2012, Lalko et al., 2012). É importante notar que o conjunto de sensibilizadores não respiratórios inclui sensibilizadores de pele sem qualquer capacidade registrada de induzir sensibilização respiratória. Esse conjunto de produtos químicos de referência foi usado para criar o que é normalmente referido como um conjunto de dados de treinamento e está listado na Tabela 1. Todas as exposições foram realizadas em experimentos repetidos em triplicata em um ambiente controlado, gerando assim um conjunto de dados coerente com alto poder estatístico otimizado para subsequente descoberta de biomarcador.
[248] O RNA purificado de culturas de células quimicamente expostas foi isolado e a análise de expressão gênica foi realizada usando micromatrizes de Affymetrix, gerando assim um conjunto de dados de expressão do genoma completo para mineração de informações, referido como conjunto de dados de treinamento. O poder estatístico do conjunto de dados de treinamento foi ainda aumentado pela aplicação de um algoritmo Surrogate Variable Analysis (SVA), que identifica e subsequentemente elimina sinais de ruído originados de variáveis substitutas que são estatisticamente não relacionadas ao ponto final biológico de interesse. Em seguida, a análise de variância (ANOVA) foi aplicada para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs). Usar um valor p ajustado (ou seja, o valor q, um valor p corrigido para testes de múltiplas hipóteses usando o método de Benjamini- Hochberg) de <0,05 como uma definição de significância estatística, 28 DEGS atenderam aos critérios de seleção. As identidades dos 28 DEGs, doravante denominadas coletivamente como assinatura da predição respiratória GARD (GRPS), são apresentadas na Tabela 2. Além disso, o conjunto de dados de treinamento é visualizado com o uso da análise de componente principal (PCA) na Figura 1.
[249] As respectivas ponderações dos 28 genes no modelo SVM são indicadas na Tabela 5. A SVM é um algoritmo que define um modelo de predição. Uma vez que o modelo é definido (ou seja, treinado), o modelo de predição real pode ser representado por uma equação linear, da seguinte forma: DV = K1*X2 + K2*X3 + + KN*XN + M
[250] Em que DV é o valor de decisão (a saída do modelo quando aplicado), Ks são constantes, Xs são variáveis independentes e M é uma constante que representa uma interceptação. Nesse caso, N é 28. Os níveis de expressão de 28 genes (ou seja, Xs) foram medidos e uma equação definida usada com 28 Ks e M fixos para calcular DV.
[251] Os pesos fornecidos são os Ks, ou seja, a constante com a qual cada nível de expressão gênica é multiplicado. Assim, quanto maior o K, maior o impacto do gene correspondente X no DV. Como um exemplo simplificado, considere o caso em que N=1. Isso dará a equação comumente conhecida para uma linha reta, ou seja, Y = KX + M.
TRANSFERÊNCIA DE PLATAFORMA DE TECNOLOGIA E DEFINIÇÃO DE MODELO DE PREDIÇÃO
[252] Após o estabelecimento do GRPS, as sondas de hibridização foram projetadas para medições padronizadas da GRPS usando o sistema Nanostring nCounter (Geiss et al., 2008). Esse trabalho foi realizado em uma analogia próxima à transferência de tecnologia do GARDskin, progresso que foi publicado anteriormente (Forreryd et al., 2016). A utilização de protocolos celulares idênticos ao ensaio mencionado anteriormente facilita um ensaio robusto, simples e com recursos eficazes. Um modelo de predição foi treinado e congelado, baseado em uma Máquina de Vetor de Suporte (SVM), usando as amostras do conjunto de dados de treinamento com uma fun o em estudo binária (sensibilizador respiratório/sensibilizador não respiratório) como a variável dependente, e os valores de expressão gênica da GRPS como as variáveis independentes (ou seja, preditores), consultar também a Tabela 4. PROVA DE CONCEITO - CLASSIFICAÇÕES DE DADOS DE TESTE EXTERNOS.
[253] Tendo estabelecido um modelo de predição otimizado e protocolos associados, o ensaio foi desafiado com dois conjuntos de amostras externas, referidos como conjuntos de dados de teste. As identidades químicas das amostras incluídas nos conjuntos de teste, seu verdadeiro pertencimento de grupo (sensibilizadores respiratórios ou não respiratórios) e os resultados da classificação GARDair estão listados na Tabela 3. As representações gráficas das classificações, conforme definido pelos valores de decisão GARDair gerados, são mostradas nas Figuras 2 e 3, para os conjuntos de teste 1 e 2, respectivamente.
[254] Estimando o desempenho preditivo do GARDair com base nos dados disponíveis, a precisão preditiva foi calculada em 89%, bem equilibrada entre sensibilidade e especificidade. Além disso, com base nas poucas exposições repetidas disponíveis em experimentos independentes, a reprodutibilidade foi de 100%, indicativo de um ensaio robusto.
DISCUSSÃO
[255] Com base nos dados apresentados neste documento, concluiu-se que o conceito de utilização da plataforma GARD, por exemplo, expor células semelhantes a DC a substâncias de teste e interrogar o padrão de transcrição induzido para classificação assistida por aprendizado de máquina é uma estratégia funcional para avaliação de sensibilizadores respiratórios químicos.
[256] O GARDair é, até o momento, um ensaio finalizado, baseado em uma leitura genômica, medida por uma plataforma de última geração, de células semelhantes a DC quimicamente expostas in vitro. O ensaio demonstrou ser funcional e robusto. O ensaio é proposto para monitorar mudanças transcricionais em DCs, como induzidas especificamente por sensibilizadores respiratórios, relacionadas à formação de ponte de funções imunes inatas e adaptativas e inclinação para respostas imunes do tipo Th2. Primeiramente, isso é demonstrado pela identificação baseada em dados dos genes IL7R e CRLF2, que como proteínas traduzidas formam juntos o receptor para linfopoietina do estroma timoide (TSLP). A ligação do ligante de TSLP ao receptor de TSLP de células apresentadoras de antígeno demonstrou anteriormente conduzir a diferenciação Th2 (Paul & Zhu, 2010, Soumelis et al., 2002). No entanto, não foi anteriormente descrito em relação à indução de sensibilização respiratória a produtos químicos.
MATERIAL E MÉTODOS MANUTENÇÃO DE LINHAGEM CELULAR E SEMEADURA DE CÉLULAS PARA ESTIMULAÇÃO
[257] A linhagem celular derivada de leucemia mieloide humana SenzaCell (disponível através da ATCC), atuando como um modelo in vitro de c lula dendr tica humana (DC), mantida em -MEM (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT) suplementada com 20% de (volume/volume) soro fetal de bezerro (Life Technologies, Carlsbad, CA) e 40 ng/ml de fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos humanos recombinantes (rhGM-CSF) (Miltenyi Biotec, Alemanha). Uma mudança de meio durante a expansão é realizada a cada 3 a 4 dias. Os estoques de culturas de trabalho são cultivados por no máximo 16 passagens ou dois meses após o descongelamento. Para estimulação química das células, as células expostas são incubadas por 24 h a 37 °C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
MANUSEIO DA SUBSTÂNCIA DE TESTE E AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE
[258] Todas as Substâncias de Teste foram armazenadas de acordo com as instruções do fornecedor, para garantir a estabilidade das Substâncias de Teste. As Substâncias de Teste foram dissolvidas em DMSO ou água, com base nas propriedades físicas. Como muitas Substâncias de Teste têm um efeito tóxico sobre as células, os efeitos citotóxicos das Substâncias de Teste foram monitorados. Algumas Substâncias de Teste foram mal dissolvidas no meio celular; portanto, a concentração solúvel máxima também foi avaliada. A Substância de Teste a ser testada foi titulada em concentrações que variam de 1 µM à concentração solúvel máxima em meio celular. Para Substâncias de Teste livremente solúveis, 500 µM foram definidos como o limite superior da faixa de titulação. Para as Substâncias de Teste dissolvidas em DMSO, a concentração de DMSO no poço foi de 0,1%. Após incubação por 24 h a 37 °C, 5% de CO2 e 95% de umidade, as células colhidas foram coradas com o marcador de viabilidade Iodeto de Propídio (PI) (BD Bioscience, EUA) e analisadas por citometria de fluxo. As células PI negativas foram definidas como viáveis, e a viabilidade relativa das células estimuladas com cada concentração na faixa de titulação foi calculada como
Viabilidade relativa=(fração de células estimuladas vi veis)/(fra o de c lulas n o estimuladas vi veis) 100
[259] Para as Substâncias de Teste tóxicas, a concentração que rendeu 90% de viabilidade relativa (Rv90) foi usada para o ensaio GARD, a razão sendo que essa concentração demonstra biodisponibilidade da Substância de Teste usada para estimulação, embora não prejudique as respostas imunológicas. Para Substâncias de Teste não tóxicas, uma concentração de 500 µM foi usada, se possível. Para as Substâncias de Teste não tóxicas que eram insolúveis a 500 µM no meio celular, foi usada a concentração solúvel mais alta. Independentemente de qual desses três critérios foi atendido, apenas uma concentração será usada para análise de expressão gênica. A concentração a ser usada para qualquer produto químico foi denominada concentração de entrada GARD .
ESTIMULAÇÃO PRINCIPAL GARD
[260] Uma vez que a concentração de entrada de GARD para as Substâncias de Teste a serem testadas foi estabelecida, as células foram estimuladas novamente como descrito acima, desta vez usando apenas a concentração de entrada de GARD. Todas as avaliações de Substâncias de Teste e Controles de Referência foram testadas em triplicatas biológicas, realizadas em diferentes pontos no tempo e usando diferentes culturas de células. Após incubação por 24 h a 37 °C, 5% de CO2 e 95% de umidade, a cultura celular foi lisada em reagente TRIzol (Life Technologies) e armazenada a -20 °C até a extração do RNA. Em paralelo, uma pequena amostra de células estimuladas foi retirada para coloração com PI e análise com citometria de fluxo, para garantir que a viabilidade relativa esperada das células estimuladas fosse alcançada.
ISOLAMENTO DE RNA
[261] O isolamento de RNA de células lisadas foi realizado usando kits disponíveis comercialmente (Direct-Zol RNA MiniPrep,
Zymo Research, Irvine, CA). O RNA total foi quantificado e teve sua qualidade controlada usando o equipamento BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, CA).
ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA COM O USO DE MICROMATRIZES
[262] A preparação do cDNA e a hibridização a micromatrizes HuGene ST 1.0 foram realizadas pelo Swegene Center for Integrative Biology da Lund University (SCIBLU, Lund, Suécia), de acordo com os protocolos, kits e reagentes recomendados pelo fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA).
AQUISIÇÃO E NORMALIZAÇÃO DE DADOS DE MICROMATRIZ
[263] Micromatrizes hibridizadas foram lavadas e digitalizadas de acordo com os protocolos recomendados. Arquivos .cell de dados brutos foram importados para o ambiente R para computação estatística (www.r-project.org). Os dados brutos foram normalizados e convertidos em sinais de expressão gênica com o uso do pacote R SCAN. ANÁLISE DE DADOS - SELEÇÃO DE RECURSOS DE ASSINATURA DE BIOMARCADOR DE SENSIBILIZAÇÃO GARDair
[264] Dados normalizados que contêm triplicatas biológicas de amostras de SenzaCell estimuladas com o painel de produtos químicos listados na Tabela 1 foram minerados para genes regulados diferencialmente, capazes de discriminar entre sensibilizadores respiratórios e não sensibilizadores respiratórios. A variação indesejada de fontes indefinidas foi removida usando Surrogate Variable Analysis, disponível no pacote R SVA. Os genes regulados foram identificados com o uso de uma ANOVA do pacote R Limma. Genes com uma taxa de descoberta falsa (ou seja, o valor q, um valor p corrigido para testes de múltiplas hipóteses usando o método de Benjamini- Hochberg) <0,05 foram considerados estatisticamente significativos. 28 genes únicos atenderam aos critérios de seleção e são apresentados na Tabela 2.
TRANSFERÊNCIA DE PLATAFORMA DE TECNOLOGIA
[265] As sondas de transcrição do sistema Nanostring nCounter exclusivas foram sintetizadas pela equipe de Bioinformática da Nanostring (Nanostring, Seattle, WA). Seguindo protocolos do fornecedor (Nanostring), os dados de expressão gênica Nanostring foram gerados a partir das amostras de RNA produzidas para a descoberta de biomarcadores, ou seja, uma reprodução completa do conjunto de dados de treinamento (Tabela 1), cobrindo os 28 genes de interesse.
ESTABELECIMENTO DE MODELO DE PREDIÇÃO E TESTE DE PRODUTOS QUÍMICOS DE TESTE EXTERNOS
[266] Uma Máquina de Vetores de Suporte (SVM) foi treinada em dados de expressão Nanostring gerados pelo conjunto de dados de treinamento (Tabela 1), usando a Fun o em estudo como vari vel dependente (ou seja, parâmetro a ser previsto) e os 28 genes da assinatura do biomarcador como variáveis independentes (ou seja, preditores), usando o ambiente estatístico R (R Core Team) e pacotes adicionais (consultar a Tabela 4). Para o teste de produtos químicos de teste externos, os dados de expressão gênica foram gerados de acordo com os protocolos descritos acima. O modelo de SVM treinado foi aplicado para classificar cada amostra como sensibilizador respiratório ou sensibilizador não respiratório, conforme determinado pelo valor de decisão médio de SVM (n=3). Valores de decisão positivos denotam uma classificação positiva.
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TABELAS TABELA A
TABELA 1. CONSTITUINTES QUÍMICOS DO CONJUNTO
DE DADOS DE TREINAMENTO Nome Químico CAS Função em estudo hexacloroplatinato de amônio 16919-58-7 RS persulfato de amônio 7727-54-0 RS etilenodiamina 107-15-3 RS / SS glutaraldeído 111-30-8 RS di-isocianato de hexametileno 822-06-0 RS anidrido maleico 108-31-6 RS metileno difenol di-isocianato 101-68-8 RS anidrido ftálico 85-44-9 RS di-isocianato de tolueno 584-84-9 RS anidrido trimelítico 552-30-7 RS 2-aminofenol 95-55-6 SS / NRS acrilato de 2-hidroxietila 818-61-1 SS / NRS 2-nitro-1,4-fenilenodiamina 5307-14-2 SS / NRS formaldeído 50-00-0 SS / NRS geraniol 106-24-1 SS / NRS aldeído hexilcinâmico 101-86-0 SS / NRS kathon CG 96118-96-6 SS / NRS penicilina G 61-33-6 SS / NRS dicromato de potássio 7778-50-9 SS / NRS 1-butanol 71-36-3 NS ácido 4-aminobenzoico 150-13-0 NS clorobenzeno 108-90-7 NS dimetilformamida 68-12-2 NS etilvanilina 121-32-4 NS isopropanol 67-63-0 NS salicilato de metila 119-36-8 NS permanganato de potássio 7722-64-7 NS propilenoglicol 57-55-6 NS tween 80 9005-65-6 NS sulfato de zinco 7733-02-0 NS RS; Sensibilizador respiratório, SS; Sensibilizador de pele, NRS; Sensibilizador não respiratório, NS; Não sensibilizador.
TABELA 2. IDENTIDADES DOS 28 GENES DA GRPS.
TABELA 3. RESULTADOS DE PREDIÇÃO DE
CONJUNTOS DE DADOS DE TESTE EXTERNOS USANDO O MODELO DE PREDIÇÃO GARDAIR FINALIZADO.
TABELA 4. Listados abaixo estão os detalhes do script do algoritmo, escrito em código R, usado para executar o método:
#Este código descreve o uso típico da GRPS em sua aplicação pretendida como constituinte #preditores em um modelo de predição computacional. As dependências das funções padrão são #armazenadas em GARD_GRPS.R.
# Arquivos necessários: # - GARD_GRPS.R # - arquivos brutos de affymetrix de amostras de teste no subdir: raw_affy/ # - Anotação dos novos dados que descrevem as amostras não estimuladas raw_affy/annotation.rds # - Dados históricos armazenados em trainingset.rds # Carregar dependências necessárias source('~/GARD_GRPS.R') # Carregar dados de treinamento treinamento = readRDS('~/trainingset.rds') # Ler novos dados e anotações new_data = read_raw_affy('~/raw_affy/*.CEL') new_data_ref = readRDS('~/raw_affy/annotation.rds') # Normalizar os novos dados normalized_data = normalize_train_test(train = train, test = new_data, test_reference = new_data_ref) # Treinar o modelo com base em dados históricos model = train_svm(normalized_data) # Predição de novas amostras predições = predict_test_samples(model = model, data=normalized_data)
TABELA 5. PONDERAÇÕES

Claims (57)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para identificar agentes capazes de induzir sensibilização respiratória em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste nas etapas de: (a) fornecer uma população de células dendríticas ou uma população de células semelhantes a dendríticas; (b) expor as células fornecidas na etapa (a) a um agente de teste; e (c) medir nas células da etapa (b) a expressão de dois ou mais biomarcadores selecionados do grupo definido na Tabela A; em que a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) é indicativa do efeito de sensibilização respiratória do agente de teste da etapa (b).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos biomarcadores para os quais a expressão é medida na etapa (c) são selecionados a partir do grupo definido na Tabela A(i).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de dois ou mais biomarcadores selecionados a partir do grupo definido na Tabela A(i) , por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 dos biomarcadores listados na Tabela A(i).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de todos os biomarcadores listados na Tabela A(i).
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de um ou mais biomarcadores selecionados a partir do grupo definido na Tabela A(ii), por exemplo, 2 ou 3 dos biomarcadores listados na Tabela A(ii).
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de todos os biomarcadores listados na Tabela A(ii).
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de três ou mais dos biomarcadores selecionados do grupo definido na Tabela A, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dos biomarcadores listados na Tabela A.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão de todos os biomarcadores listados na Tabela A.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: d) expor uma população separada de células dendríticas ou células tipo dendríticas a um ou mais agentes de controle negativo que não é um sensibilizador respiratório em um mamífero; e e) medir nas células da etapa (d) a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório no caso de a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (e) ser diferente da expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c).
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:
f) expor uma população separada das células dendríticas ou células semelhantes a dendríticas a um ou mais agentes de controle positivo que são um sensibilizador respiratório em um mamífero; e g) medir nas células da etapa (f) a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c) em que o agente de teste é identificado como um sensibilizador respiratório no caso de a expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (f) corresponder à expressão dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (c).
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende a medição da expressão de uma molécula de ácido nucleico de um ou mais dos biomarcadores.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é uma molécula de cDNA ou uma molécula de mRNA.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNAm.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a medição da expressão de um ou mais dos biomarcadores na etapa (c) é realizada com o uso de um método selecionado do grupo que consiste em hibridização Southern, hibridização Northern, reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR de transcriptase reversa (RT-PCR), PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), nanomatriz, micromatriz, macromatriz, autorradiografia e hibridização in situ.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que a medição da expressão de um ou mais dos biomarcadores na etapa (c) é determinada com o uso de uma micromatriz de DNA.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a medição da expressão de um ou mais dos biomarcadores na etapa (c) é realizada com o uso de uma ou mais porções químicas de ligação, cada uma capaz de se ligar seletivamente a uma molécula de ácido nucleico que codifica um dos biomarcadores identificados na Tabela A.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre as uma ou mais porções químicas de ligação compreende ou consiste em uma molécula de ácido nucleico.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre as uma ou mais porções químicas de ligação compreende ou consiste em DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA ou PMO.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre as uma ou mais porções químicas de ligação compreende ou consiste em DNA.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais porções químicas de ligação têm 5 a 100 nucleotídeos de comprimento.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais porções químicas de ligação têm 15 a 35 nucleotídeos de comprimento.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que a porção química de ligação compreende uma porção química detectável.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a porção química detectável é selecionada do grupo consistindo em: uma porção química fluorescente; uma porção química luminescente; uma porção química quimioluminescente; uma porção química radioativa (por exemplo, um átomo radioativo); ou uma porção química enzimática.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a porção química detectável compreende ou consiste em um átomo radioativo.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o átomo radioativo é selecionado do grupo que consiste em tecnécio-99m, iodo-123, iodo-125, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, fósforo-32, enxofre-35, deutério, trítio, rênio-186, rênio-188 e ítrio-90.
27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a porção química detectável da porção química de ligação é uma porção química fluorescente.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende ou consiste em medir a expressão da proteína de um ou mais dos biomarcadores.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a medição da expressão de um ou mais dos biomarcadores na etapa (c) é realizada com o uso de uma ou mais porções químicas de ligação, cada uma capaz de se ligar seletivamente a um dos biomarcadores identificados na Tabela A.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais porções químicas de ligação compreendem ou consistem em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 30, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais porções químicas de ligação compreendem uma porção química detectável.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a porção química detectável é selecionada do grupo que consiste em uma porção química fluorescente, uma porção química luminescente, uma porção química quimioluminescente, uma porção química radioativa, uma porção química enzimática.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é realizada utilizando uma matriz.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a matriz é uma matriz à base de microesferas.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a matriz é uma matriz baseada em superfície.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que a matriz é selecionada do grupo que consiste em: macromatriz; micromatriz; nanomatriz.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método é realizado in vitro, in vivo, ex vivo ou in silico.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o método é realizado in vitro.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a população de células dendríticas ou população de células semelhantes a dendríticas compreende ou consiste em células imortais e/ou de ocorrência não natural.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a população de células dendríticas ou população de células semelhantes a dendríticas é uma população de células semelhantes a dendríticas.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que as células semelhantes a dendríticas são células semelhantes a dendríticas mieloides.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que as células semelhantes a dendríticas mieloides são derivadas de células dendríticas mieloides.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de células dendríticas mieloides são células derivadas de leucemia mieloide, tais como aquelas selecionadas a partir do grupo que consiste em KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193, MUTZ-3, e SenzaCell.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para identificar agentes capazes de induzir uma resposta de hipersensibilidade respiratória.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a resposta de hipersensibilidade é uma resposta de hipersensibilidade humoral.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para identificar agentes capazes de induzir uma resposta de hipersensibilidade do tipo I em um mamífero.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para identificar agentes capazes de induzir alergia respiratória.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 47, caracterizado pelo fato de que os um ou mais agentes de controle negativo fornecidos na etapa (d) são selecionados a partir do grupo que consiste em: células não estimuladas; meio celular; controle de veículo; DMSO; 1-butanol; 2-aminofenol; Acrilato de 2-hidroxietila; 2-nitro-1,4-fenilenodiamina; Ácido 4-aminobenzoico; Clorobenzeno; Dimetilformamida; Etilvanilina;
Formaldeído; Geraniol; Aldeído hexil cinâmico; Isopropanol; Kathon CG*; Salicilato de metila; Penicilina G; Propilenoglicol; Dicromato de Potássio; Permanganato de potássio; Tween 80; Sulfato de zinco; 2-mercaptobenzotiazol; Ácido 4-hidroxibenzoico; Benzaldeído; Ácido octanoico; Álcool cinamílico; Ftalato de dietila; DNCB; Eugenol; Glicerol; Glioxal; Isoeugenol; Fenol; PPD; Resorcinol; Ácido salicílico; SDS; e clorobenzeno.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 48, caracterizado pelo fato de que os um ou mais agentes de controle positivo fornecidos na etapa (f) compreendem ou consistem em um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em: hexacloroplatinato de amônio, persulfato de amônio, glutaraldeído, di-isocianato de hexametileno, anidrido maleico, metileno difenol di-isocianato, anidrido ftálico, toluendi- isocianato; anidrido trimelítico; hidrato de cloramina-T; di-isocianato de isoforona; Piperazina; Laranja reativo 16; Anidrido maleico; Isocianato de fenila (MDI); Anidrido ftálico; di-isocianato de tolueno; e anidrido trimelítico.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método é indicativo da potência de sensibilização relativa da amostra a ser testada.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende uma ou mais das seguintes etapas: (i) cultivar células dendríticas ou semelhantes a dendríticas; (ii) semear células de (i) em um ou mais poços, por exemplo, poços de uma ou mais placas de ensaio de múltiplos poços; (iii) adicionar a um ou mais poços de (ii) o agente (ou agentes) a ser testado; (iv) adicionar a um ou mais poços separados de (ii) um ou mais controles positivos;
(v) adicionar a um ou mais poços separados de (ii) um ou mais controles negativos; (vi) incubar células em poços de (iii) a (v), de preferência durante cerca de 24 horas; (vii) isolar RNA total purificado das células de (vi) e, opcionalmente, converter mRNA em cDNA; (viii) quantificar os níveis de expressão de transcritos de mRNA individuais de (vii), por exemplo, usando uma matriz, tal como uma matriz Affymetrix Human Gene 1.0 ST e/ou um conjunto de códigos Nanostring; (ix) exportar e normalizar dados de expressão de (viii); (x) isolar dados de (ix) provenientes de biomarcadores da Assinatura de Predição GARD (ou seja, os biomarcadores da Tabela A); (xi) aplicar um modelo de previsão aos dados de (x), por exemplo, um modelo SVM congelado previamente estabelecido e treinado em dados históricos, por exemplo, dados obtidos no Exemplo 1, para prever o efeito de sensibilização respiratória dos agentes testados e controle (ou controles) negativo/positivo.
52. Matriz para uso no método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, em que a matriz é caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais porções químicas de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 27 e 29 a 32.
53. Matriz, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a matriz compreende uma ou mais porções químicas de ligação para cada um dos biomarcadores, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
54. Uso de dois ou mais biomarcadores selecionados a partir do grupo definido na Tabela A, caracterizado pelo fato de que é para a identificação de agentes de sensibilização respiratória, de preferência em que um ou mais dos biomarcadores são selecionados do grupo definido na Tabela A(i).
55. Uso de duas ou mais porções químicas de ligação, cada uma com especificidade para um biomarcador selecionado do grupo definido na Tabela A, caracterizado pelo fato de que é para a identificação de agentes de sensibilização respiratória, de preferência em que uma ou mais das porções químicas de ligação têm especificidade para um biomarcador selecionado do grupo definido na Tabela A(i).
56. Kit analítico, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, que compreende: (a) uma matriz, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 53; e (b) (opcionalmente) um ou mais agentes de controle. (c) (opcionalmente) instruções para realizar o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51.
57. Uso de método, matriz ou kit, caracterizados pelo fato de que são substancialmente como descritos neste documento.
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