KR20210111261A - 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제의 식별 방법 및 그 방법에 사용하기 위한 어레이 및 분석용 키트 - Google Patents

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스벤 헨릭 요한슨
로빈 미카엘 그라딘
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센자겐 아베
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Abstract

본 발명은 포유동물에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법, 및 이러한 방법에 사용하기 위한 어레이 및 분석용 키트에 관한 것이다.

Description

호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제의 식별 방법 및 그 방법에 사용하기 위한 어레이 및 분석용 키트
본 발명은 호흡기 감작(respiratory sensitization)을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법, 및 이러한 방법에 사용하기 위한 어레이 및 분석용 키트에 관한 것이다.
화학적 알레르기라고도 지칭되는 화학적 감작은 화학적 감작제에 대한 반응으로 인간 면역 체계에 의해 유도되는 질환 상태이다. 이러한 카테고리의 물질(종종 향료, 화장품 첨가제, 염료 및 금속 이온)은 그것이 종종 조직에 침투할 수 있기 때문에 다수의 복잡한 세포 기전을 유발함으로써 유해한 효과를 발휘한다. 감작은 T-세포가 특정 화학적 감작제를 인식하기 위해서 학습하는 경우에 발생한다. 후속 노출 후, T-세포는 빠르게 반응하여 염증 상태를 유도한다. 이것은 차례로 피부 접촉의 경우 가려움, 물집 및 조직 손상과 같은 질환-연관 증상으로 이어지고, 흡입의 경우 기침, 천명음 및 천식과 같은 증상으로 이어진다.
노출 경로가 관찰된 증상에 영향을 미칠 수 있다는 것은 널리 인식되어 있다(문헌[Kimber et al., 2011]). 그러나, 화학 화합물이 피부 또는 호흡기의 감작을 우선적으로 유도하는 고유한 특성을 가질 수 있다는 것이 점차 명백해지고 있으며, 이것은 각각 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis: ACD) 및 직업성 천식(occupational asthma: OA)이라고도 지칭된다(문헌[Dearman et al., 2011]).
두 경우 모두, 화학물질의 안전성 평가는 역사적으로 동물 실험을 사용하여 수행되었다. 현재의 금본위 제인 LLNA(murine Local Lymph Node Assay)(TG 429)는 두 유형의 화학적 감작제를 양성으로 분류하는 경향이 있지만, 그것은 둘을 구별하는 데는 부적절하다(문헌[Dearman et al., 2011]). 또한, 여론, 인간 환경 건강 및 경제적 이익에 대한 우려는 화장품 및 이의 임의의 성분에 대한 안전성 평가를 수행하기 위해 동물 실험을 사용하는 것을 금지하는 EU 내의 법률로 이어지며, 이것은 현재 전 세계적으로 그리고 시장 및 산업 부분에서 확산되고 있는 경향이다. 종합하면, 화학적 감작제를 평가하기 위해 동물을 사용하지 않는 방법을 개발해야 하는 시급한 필요성이 있다.
이러한 요구를 충족시키기 위해 지난 10년 동안 많은 연구가 소위 시험관내, 인 케미코(in chemico) 및 인 실리코(in silico) 검정의 방법, 즉, 동물 실험을 사용하지 않고 시험되는 화학물질을 감작제 또는 비-감작제로 분류할 수 있는 예측 방법에 초점을 맞춰왔다. 피부 감작제의 평가를 위한 다수의 검정이 제안되어 왔지만, 이들 중 일부는 공식적인 검증을 거침으로써, 산업적 구현을 위해 승인되었고(예를 들어, OECD TG 442C, 442D 및 442E), 화학적 호흡기 감작제를 정확하고 구체적으로 예측하고 분류하는 검정에 대한 수요는 충족되지 않았다.
화학적 호흡기 감작제에 대한 예측 방법의 부재에 대한 기여 요인은 현재 호흡기 감작과 관련된 면역생물학적 기전의 상세한 이해를 방해하는 큰 지식 격차이다. 피부 감작의 경우에 비해, 독성 발현 경로(adverse outcome pathway: AOP)를 쉽게 이용할 수 없다. 그러나, 이러한 AOP를 생성하기 위한 작업이 진행 중이며, 기계론적 경로의 많은 기본 단계가 크게 합의되었다(예를 들어, 문헌[Kimber et al., 2014, Sullivan et al., 2017]).
약술하자면, 초기 분자 사건 및 후속 주요 사건은 피부 감작의 AOP와 상당히 유사하며, 몇 가지 주요 불확실성 영역뿐만 아니라 명백한 불일치는 세포 사건의 호흡기 주변으로의 기관-특이적 재할당에 관련된다. 그러나, 요구 추출(elicitation)은 전형적으로 호흡기 노출을 필요로 할 것이지만, 호흡기 감작은 피부 노출을 통해서도 발생할 수 있다는 것을 주목해야 하고(문헌[Kimber et al., 2002]), 추가로 이는 피부 및 호흡기 감작제가 본질적으로 상이하며, 우선적으로 하나의 독성 발현 또는 다른 것 및 매우 드물게는 둘 다로 이어진다는 개념을 추가로 입증해야 한다.
피부 감작의 경우와 유사하게, 제안된 AOP는 저 분자량 유기 화학물질에 대한 호흡기 또는 피부 노출 후 폐 또는 피부에서 아마도 라이신 친핵체에 대한 공유 단백질 결합으로 시작한다고 제안되어 있다. 이러한 단백질 결합은 스트레스 반응 경로 및 산화 스트레스, 상피 세포에 의해 방출되는 사이토카인 및 케모카인을 포함한 세포 위험 신호의 활성화를 유발하는데, 이것은 수지상 세포(DC) 성숙 및 드레이닝 림프절(draining lymph node)로의 이동으로 이어진다. 합텐은 DC 활성화에 직접 기여할 수도 있다. 드레이닝 림프절에서 항원-제시 DC는 감작 단계를 특징규명하는 T 세포의 활성화 및 성숙을 신호전달하여, 화학적 호흡기 알레르기를 유발한다.
따라서, 화학적 호흡기 감작에 대한 AOP는 분자 개시 사건(주요 사건(key event: KE) 1), 폐 상피(KE 2) 및 DC(KE 3)에서의 세포 염증 반응 및 기관 반응(예를 들어, T 세포 반응(KE 4))을 포함한다. 피부 감작제에 의해 주로 유도되는 Th1 및 세포독성 T-세포와 달리, 호흡기 감작제는 Th2-타입 면역 반응을 우선적으로 유도하는 것으로 여겨지지만, 불확실성의 주요 영역은 정확한 위치, 관련된 세포 하위세트 및 Th2-왜곡(skewing)이 일어나는 분자 기전을 포함한다(문헌[Paul & Zhu, 2010]). 추가로, IgE-항체가 이상 반응의 도출에 필요한 지 그렇지 않은 지는 완전히 이해되지 않는다(문헌[Isola et al., 2008]). 그러나, 면역학적 시냅스에서 DC에 의해 나타나는 공자극성 프로파일을 통해서, DC가 관련되고 Th2-왜곡이 항원-제시와 관련하여 발생한다는 가설을 세웠다. 이러한 이유로, DC의 시험관내 세포 시스템은 검정 개발의 후보 표적이다.
Genomic Allergen Rapid Detection(GARDTM) 플랫폼은 이전에 300개 초과의 바이오마커를 기반으로 각각 상이한 유전자 시그니처를 사용하여 호흡기 감작제를 분류하는 능력을 입증하였다(문헌[Forreryd et al., 2015], 국제공개 WO 2013/160882호; 국제공개WO 2016/083604호). 그러나, 호흡기 감작제를 구체적으로 식별하기 위해 정확하고 신뢰할 수 있는 동물을 사용하지 않는 시험관내 검정을 확립해야 하는 지속적이고 긴급한 요구가 있다.
Chan-Yeung & Malo, 1994. Aetiological agents in occupational asthma. European Respiratory Journal. Dearman et al., 1997. Classification of chemical allergens according to cytokine secretion profiles of murine local lymph node cells. Journal of Applied Toxicology. Dearman et al., 2011. Inter-relationships between different classes of chemical allergens. Journal of Applied Toxicology. Dearman et al., 2012. Inter-relationships between different classes of chemical allergens. Journal of Applied Toxicology. Forreryd et al., 2015. Prediction of chemical Respiratory sensitizers using GARD, a novel in vitro assay based on a genomic biomarker signature. PLoS One 10(3). Forreryd et al., 2016. From genome-wide arrays to tailor-made biomarker readout - Progress towards routine analysis of skin sensitizing chemicals with GARD. Toxicology in vitro. Geiss et al., 2008. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. Isola et al., 2008. Chemical respiratory allergy and occupational asthma: what are the key areas of uncertainty? Journal of Applied Toxicology. Johansson et al., 2011. A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics. Kimber et al., 2002. Chemical respiratory allergy: role of IgE antibody and relevance of route of exposure. Toxicology. Kimber et al., 2011. Chemical allergy: translating biology into hazard characterization. Toxicological Sciences. Kimber et al., 2014. Chemical respiratory allergy: reverse engineering an adverse outcome pathway. Toxicology. Lalko et al., 2012. The direct peptide reactivity assay: selectivity of chemical respiratory allergens. Toxicological Sciences. Paul & Zhu, 2010. How are Th2-type immune responses initiated and amplified. Nature Reviews Immunology. Soumelis et al., 2002. Human epithelial cells trigger dendritic cell-mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol. Sullivan et al., 2017. An Adverse Outcome Pathway for Sensitization of the Respiratory Tract by Low-Molecular-Weight Chemicals: Building Evidence to Support the Utility of In Vitro and In Silico Methods in a Regulatory Context. Applied in vitro Toxicology.
본 발명자들은 본 발명에 이르러서 놀랍게도 동물 시험에 대한 대안으로서 조합하여 사용할 수 있는 새로운 작은 유전자 세트를 포함하는 새로운 게놈 바이오마커 시그니처를 기반으로 하는 호흡기 감작제의 평가를 위한 새로운 세포-기반 시험 전략을 만들었다. 본 발명자들은 외부 시험 데이터 세트에서의 샘플 분류로부터 생성된 분류 데이터를 제공함으로써, 검정(이하 "GARDair"라고 지칭함)의 기능을 입증한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 포유동물에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법을 제공하며, 이 방법은,
(a) 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단을 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 제공된 세포를 시험제(시험 agent)에 노출시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 세포에서 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 상기 단계로 이루어지고;
단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 시험제의 호흡기 감작 효과를 나타낸다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)에서 발현이 측정된 바이오마커 중 1개 이상은 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(i)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 A(i)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
방법은 CRLF2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 FSCN1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 AES의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 ALOX5AP의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 RAB27B의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 ZFP36L1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 SLC44A2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 ATL1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 FAM30A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 CTSH의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 NINJ1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 RALGAPA2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 RNF220의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 OSBPL3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 CACNA2D2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 HNRNPC의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 PIK3C3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 HOPX의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 VCAN의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 RUFY1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 GNA15의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 ADAM8의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 NRIP1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 CTCF의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 PLCXD1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다.
방법은 MYCN의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 IL7R의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다. 방법은 RALA의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 제외할 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 표 A(ii)에 정의된 군으로부터 선택된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(ii)에 열거된 바이오마커 중 2 또는 3개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 A(ii)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 CRLF2은 표 A(ii)에 포함되고, 표 A(i)에 포함되지 않는다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 바이오마커 중 3개 이상의, 예를 들어, 표 A에 열거된 바이오마커 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 A에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
따라서, 표 A(i)에 정의된 바이오마커 모두 및/또는 표 A(ii)에 정의된 바이오마커 모두의 발현은 단계 (c)에서 측정될 수 있다. 따라서, 방법은 단계 (c)에서 표 A에 정의된 바이오마커 모두를 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, IL7R 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3, CACNA2D2, HNRNPC, PIK3C3, IL7R 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3, CACNA2D2, HNRNPC, PIK3C3, IL7R, HOPX 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)는 다음 바이오마커: CRLF2, FSCN1, AES, ALOX5AP, RAB27B, MYCN, ZFP36L1, SLC44A2, ATL1, FAM30A, CTSH, NINJ1, RALGAPA2, RNF220, OSBPL3, CACNA2D2, HNRNPC, PIK3C3, IL7R, HOPX, VCAN, RALA, RUFY1, GNA15, ADAM8, NRIP1, CTCF, PLCXD1 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어질 수 있다.
"발현"이란, 본 발명자들은 바이오마커의 존재, 수준 및/또는 양을 의미한다.
"바이오마커"란, 본 발명자들은 임의의 생물학적 분자 또는 성분 또는 이의 단편을 포함하는데, 이의 측정은 시험제가 호흡기 감작제인지를 결정하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 표 A의 맥락에서, 바이오마커는 핵산 분자, 예컨대, mRNA 또는 cDNA일 수 있다. 대안적으로, 바이오마커는 핵산 분자 또는 탄수화물 모이어티, 항원성 성분 또는 이의 단편에 의해서 암호화된 단백질일 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 방법은,
d) 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 개별 집단을 포유동물에서 호흡기 감작제가 아닌 1개 이상의 음성 대조제에 노출시키는 단계; 및
e) 단계 (d)의 세포에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 더 포함하며,
여기서 시험제는 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현이 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현과 상이한 사건에서 호흡기 감작제로서 식별된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 DMSO는 음성 대조군으로 사용될 수 있다. 비히클 대조군은 음성 대조제로서 사용될 수 있다. 비히클 대조군은 DMSO를 포함할 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 비자극된 세포는 음성 대조군으로 사용될 수 있다. "비자극된 세포"란, 본 발명자들은 임의의 시험제에 노출되지 않은 세포를 포함하거나 의미한다. 즉, 단계 (d)에서 세포의 개별 집단은 시험제에 노출되지 않는다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 비자극된 세포는 정규화 목적을 위해서 데이터 세트의 정렬을 위해서 참조 샘플로서 상용될 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현은 시험제에 대한 노출 전 및 노출 후에 단계 (a)에서 제공된 세포에서 측정되며, 여기서 시험제에 대한 노출 전 및 노출 후에 2개 이상의 바이오마커 간의 발현의 차이는 단계 (b)의 시험제의 감작 효과를 나타낸다. 따라서, 단계 (a)에 제공된 세포는 음성 대조군 및 시험 결과 둘 다를 제공할 수 있다.
"단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현과 상이하다" 및 "발현의 차이"란, 본 발명자들은 제1 샘플(예를 들어, 시험제 샘플) 중의 존재 및/또는 양이 제2 샘플(예를 들어, 대조제 샘플)의 양과 상이하다는 것을 포함한다.
예를 들어, 시험 샘플 중의 존재 및/또는 양은 통계학적으로 유의한 방식으로 1개 이상의 음성 대조군 샘플의 것과 상이할 수 있다. 바람직하게는, 시험제에 노출된 세포 집단에서 2개 이상의 바이오마커의 발현은,
음성 대조제에 노출된 세포 집단의 것의 80% 이하, 예를 들어, 음성 대조군 또는 음성 대조제에 노출된 세포 집단의 것의 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0% 이하; 또는
음성 대조제에 노출된 세포 집단의 것의 적어도 120%, 예를 들어, 음성 대조군 또는 음성 대조제에 노출된 세포 집단의 것의 적어도 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 또는 적어도 500%이다.
"단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현과 상이하다"라는 것은, 본 발명자들은 시험 샘플이 1개 이상의 음성 대조군 샘플과 상이한 군에 속하는 것으로 분류되는 것을 대안적으로 또는 추가로 포함한다. 예를 들어, SVM이 사용되는 경우, 시험 샘플은 1개 이상의 음성 대조군 샘플로서 결정값 임계치의 반대측면에 존재한다(예를 들어, 시험제가 호흡기 감작제로서 분류되면, 1개 이상의 시험(또는 이의 반복)이 0 이하의 SVM 결정값을 갖는 경우, 1개 이상의 양성 대조군 샘플(또는 이의 대부분)은 0 이하의 SVM 결정값을 가져야 함).
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (d)에 제공된 1개 이상의 음성 대조제는 DMSO; 비자극된 세포; 세포 배지; 비히클 대조군; 증류수로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 1개 이상의 음성 대조제는 DMSO; 1-부탄올; 2-아미노페놀; 2-히드록시에틸 아크릴레이트; 2-니트로-1,4-페닐렌디아민; 4-아미노벤조산; 클로로벤젠; 디메틸 포름아미드; 에틸 바닐린; 포름알데히드; 제라니올; 헥실신남산 알데히드; 이소프로판올; 캐톤 CG*; 메틸 살리실레이트; 페니실린 G; 프로필렌 글리콜; 중크롬산칼륨; 과망가니즈산칼륨; Tween 80; 황산아연; 2-머캅토벤조티아졸; 4-히드록시벤조산; 벤즈알데히드; 옥탄산; 신남일 알코올; 디에틸 프탈레이트; DNCB; 유게놀; 글리세롤; 글리옥살; 이소유게놀; 페놀; PPD; 레소르시놀; 살리실산; SDS; 및 클로로벤젠으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 특정 실시형태에서 1개 이상의 음성 대조제는 DMSO 및/또는 클로로벤젠을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 1개 이상의 음성 대조제는 표 1 및/또는 표 3에 열거된 비-감작제 및/또는 비-호흡기 감작제로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 작용제를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
음성 대조제는 본 발명의 시험제 또는 대조제와 함께 사용하기 위한 용매일 수 있다.
방법은 적어도 2개의 음성 대조제(즉, 비-감작제), 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99개 또는 적어도 100개의 음성 대조제의 사용을 포함하거나 사용으로 이루어질 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 시험제 노출 전에 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 단계 (b)에서 측정된 1개 이상의 바이오마커의 발현이 음성 대조군으로서 사용된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 방법은,
f) 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 개별 집단을 포유동물에서 호흡기 감작제인 1개 이상의 양성 대조제에 노출시키는 단계; 및
g) 단계 (f)의 세포에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 더 포함하며,
여기서 시험제는 단계 (f)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현이 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현에 상응한 사건에서 호흡기 감작제로서 식별된다.
"단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현의 발현에 상응한다"라는 것은, 본 발명자들은 시험제에 노출된 세포 집단에서 2개 이상의 바이오마커의 발현이 1개 이상의 양성 대조제에 노출된 세포 집단의 것과 동일하거나 상당히 상이하지는 않다는 것을 의미한다. 바람직하게는 시험제에 노출된 세포 집단에서 2개 이상의 바이오마커의 발현은 1개 이상의 양성 대조제에 노출된 세포 집단의 것의 81% 내지 119%, 예를 들어, 1개 이상의 양성 대조제에 노출된 세포 집단의 것의 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 및 1개 이상의 양성 대조제에 노출된 세포 집단의 것의 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118% 또는 119% 이하이다.
"단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현에 상응한다"라는 것은, 본 발명자들은 시험 샘플이 1개 이상의 양성 대조군 샘플과 동일한 군에 속하는 것으로 분류되는 것을 대안적으로 또는 추가로 포함한다. 예를 들어, SVM이 사용되는 경우, 시험 샘플은 1개 이상의 양성 대조군 샘플로서 결정값 임계치의 동일한 측면에 존재한다(예를 들어, 시험제가 호흡기 감작제로서 분류되면, 1개 이상의 시험(또는 이의 반복)이 0 초과의 SVM 결정값을 갖는 경우, 1개 이상의 양성 대조군 샘플(또는 이의 대부분)은 0 초과의 SVM 결정값을 가져야 함).
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (f)에 제공된 1개 이상의 양성 대조제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 작용제를 포함하거나 이들로 이루어진다: 암모늄 헥사클로로플라티네이트; 암모늄 퍼설페이트; 에틸렌디아민; 글루타르알데하이드; 헥사메틸렌 디이소시아네이트; 말레산 무수물; 메틸렌 디페놀 디이소시아네이트; 프탈산 무수물; 톨루엔디이소시아네이트; 트리멜리트산 무수물; 클로르아민-T 수화물; 이소포론 디이소시아네이트; 피페라진; 반응성 오렌지 16; 말레산 무수물; 페닐 이소시아네이트(MDI); 프탈산 무수물; 톨루엔 디이소시아네이트; 및 트리멜리트산 무수물.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (f)에 제공된 1개 이상의 양성 대조제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 작용제를 포함하거나 이들로 이루어진다: 반응성 오렌지 16; 피페라진; 클로르아민 T; 및 트리멜리트산 무수물.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (f)에 제공된 1개 이상의 양성 대조제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 작용제를 포함하거나 이들로 이루어진다: 반응성 오렌지 16; 및 피페라진.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 1개 이상의 양성 대조제는 표 1 및/또는 표 3에 열거된 호흡기 감작제로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 작용제를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 1개 이상의 양성 대조제는 메틸렌 디페놀 디이소시아네이트를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
방법은 적어도 2개의 양성 대조군(즉, 감작제), 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99개 또는 적어도 100개의 양성 대조제의 사용을 포함하거나 사용으로 이루어질 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 방법은 시험될 작용제의 감작 효력을 나타낸다. 예를 들어, 방법은 양성 대조군에 비해서 그리고/또는 1개 이상의 추가 시험제에 비해서 시험제의 상대적인 감작 효력을 예측하는 데 사용될 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 방법은
(h) 시험제가 호흡기 감작제인지를 식별하는 추가 단계를 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 방법은 시험제가 호흡기 감작제인지 아닌지를 나타낸다. 대안적인 또는 추가의 실시형태에서, 방법은 시험제의 상대적인 호흡기 감작 효력을 나타낸다.
따라서, 일 실시형태에서, 방법은 시험제의 감작제 효력(즉, 시험제가 비-감작제인지, 약한 감작제인지, 중간 감작제인지, 강한 감작제인지 또는 극한 감작제인지)을 나타낸다. 바람직하게는, PCA에서의 결정 값 및 거리는 감작제 효력과 상관관계가 있다.
대안적으로 또는 추가로, 시험제 효력은 단계 (d)에서
(i) 1개 이상의 극한 호흡기 감작제 양성 대조제;
(ii) 1개 이상의 강한 호흡기 감작제 양성 대조제;
(iii) 1개 이상의 중간 호흡기 감작제 양성 대조제; 및/또는
(iv) 1개 이상의 약한 호흡기 감작제 양성 대조제를 제공함으로써 결정될 수 있고,
여기서 시험제는, 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 시험 샘플 중의 존재 및/또는 양이 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 극한 양성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (e) 및/또는 (g)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 강한, 중간, 약한 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양과 상이한 사건에서 극한 호흡기 감작제로서 식별되고,
여기서 시험제는, 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 시험 샘플 중의 존재 및/또는 양이 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 강한 양성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (e) 및/또는 (g)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 극한, 중간, 약한 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양과 상이한 사건에서 강한 호흡기 감작제로서 식별되고,
여기서 시험제는, 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 시험 샘플 중의 존재 및/또는 양이 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 중간 양성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (e) 및/또는 (g)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 극한, 강한, 약한 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양과 상이한 사건에서 중간 호흡기 감작제로서 식별되고,
여기서 시험제는, 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 시험 샘플 중의 존재 및/또는 양이 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 약한 양성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (e) 및/또는 (g)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 극한, 강한, 중간 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우) 중의 존재 및/또는 양과 상이한 사건에서 약한 호흡기 감작제로서 식별된다.
따라서, 단계 (d)는 호흡기 감작제 양성 대조군의 하기 카테고리를 제공하는 것을 포함하거나 제공하는 것으로 이루어질 수 있다:
(a) 극한, 강한, 중간 및 약한;
(b) 강한, 중간 및 약한;
(c) 극한, 중간 및 약한;
(d) 극한, 강한 및 중간;
(e) 극한 및 강한;
(f) 강한 및 중간;
(g) 중간 및 약한;
(h) 강한 및 약한;
(i) 극한 및 중간;
(j) 극한 및 약한;
(k) 극한;
(l) 강한;
(m) 중간;
(n) 약한.
음성 및 양성 대조군은 인간에서의 임상 관찰에 기초하여 각각 호흡기 비-감작제 또는 호흡기 감작제로서 분류될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로 방법은 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 단계 (e) 및/또는 단계 (g)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 나타내는 1개 이상의 미리 결정된 참조 값과 비교하는 단계를 포함한다.
선택적으로 1개 이상의 추가 바이오마커와 함께 표 A의 바이오마커 중 일부 또는 전부를 적절하게 선택함으로써, 본 발명의 방법은 호흡기 감작제의 식별을 위한 높은 예측 정확도를 나타낸다.
일반적으로, 호흡기 감작제는 적어도 0.55의 ROC AUC, 예를 들어, 적어도, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99의 ROC AUC 또는 1.00의 ROC AUC를 갖는 것으로 결정된다. 바람직하게는, 호흡기 감작제는 적어도 0.85의 ROC AUC, 가장 바람직하게는 1의 ROC AUC를 갖는 것으로 결정된다.
식별은 당업계에 공지된 임의의 적합한 통계 방법 또는 기계 학습 알고리즘, 예컨대, 랜덤 포레스트(Random Forest: RF), 서포터 벡터 머신(Support Vector Machine: SVM), 주 성분 분석법(Principal Component Analysis: PCA), 최소 제곱법(ordinary least squares: OLS), 부분 최소 제곱 회귀법(partial least squares regression: PLS), 직교 부분 최소 제곱 회귀법(orthogonal partial least squares regression: O-PLS) 및 다른 다변량 통계 분석법(예를 들어, 역 단계식 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 수행될 수 있다. 다변량 통계 분석의 검토에 대해서는, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Schervish, Mark J. (November 1987). "A Review of Multivariate Analysis". Statistical Science 2 (4): 396―413]을 참고하기 바란다. 바람직하게는, 서포트 벡터 머신(SVM)이 사용된다.
전형적으로, 호흡기 감작제는 서포트 벡터 머신(SVM), 예컨대, http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html(예를 들어, e1071 1.5-24)로부터 입수 가능한 것을 사용하여 식별된다. 그러나, 임의의 다른 적합한 수단이 또한 사용될 수 있다. SVM은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 1개 이상의 표 A 바이오마커를 포함하거나 이들로 이루어진 바이오마커 시그니처의 ROC AUC를 결정하는 데 사용될 수 있다.
서포트 벡터 머신(SVM)은 분류 및 회귀를 위해서 사용되는 관련 감동 학습 방법 세트이다. 각각 두 카테고리 중 하나에 속하는 표시되는 훈련 예 세트를 고려할 때, SVM 훈련 알고리즘은 새로운 예가 하나의 카테고리에 속하는지 다른 것에 속하는지를 예측하는 모델을 구축한다. 직관적으로, SVM 모델은 개별 카테고리의 예가 가능한 넓은 명확한 갭에 의해서 분할되도록 매핑된 공간에서 점으로서 예를 나타낸다. 이어서 새로운 예는 동일한 공간에 매핑되고, 그것이 속하는 갭의 측면에 기초하여 카테고리에 속하는 것으로 예측된다.
보다 공식적으로, 서포트 벡터 머신은 분류, 회귀 또는 다른 작업에 사용될 수 있는, 고차원 또는 무한한 차원의 공간에서 초평면 또는 초평면의 세트를 구축한다. 직관적으로, 임의의 클래스의 가장 가까운 훈련 데이터 지점(소위 기능성 마진)에 대해서 가장 큰 거리를 갖는 초평면에 의해서 달성되는데, 이는 일반적으로 마진이 클수록 분류자의 일반화 오차가 더 낮기 때문이다. SVM에 대한 더 자세한 정보에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121―167]을 참고하기 바란다.
본 발명의 일 실시형태에서, SVM은 공지된 작용제(즉, 공지된 호흡기 감작제 또는 비-감작제)의 바이오마커 프로파일을 사용하여 본 발명의 방법을 수행하기 전에 '훈련된다'. 이러한 훈련 샘플을 실행함으로써, SVM은 어느 바이오마커 프로파일이 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제와 연관되는 지를 학습할 수 있다. 훈련 과정이 완결되면, SVM은 시험된 바이오마커 샘플이 호흡기 감작제로부터 유래되었는지 또는 비-감작제로부터 유래되었는지를 예측할 수 있다.
개별 SVM에 대한 결정 값은 사례별로 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 시험제는 1개 이상의 시험(또는 이의 반복물)이 0 초과의 SVM 결정값을 갖는 경우 호흡기 감작제로서 분류된다. 일 실시형태에서, 시험제는 1개 이상의 시험(또는 이의 반복물)이 0 이하의 SVM 결정값을 갖는 경우 호흡기 비-감작제로서 분류된다. 이것은 시험제가 호흡기 감작제 또는 비-감작제로서 분류되도록 한다.
그러나, 이러한 훈련 절차는 필요한 훈련 파라미터와 함께 SVM을 미리 프로그래밍함으로써 우회될 수 있다. 예를 들어, 호흡기 감작제는 표 A에 열거된 바이오마커 중 2개 이상의 측정에 기초하여 실시예에 기재된 SVM 알고리즘을 사용하여 공지된 SVM 파라미터에 따라서 식별될 수 있다.
당업자는 데이터를 적절하게 선택하여 SVM 머신을 훈련시킴으로써 표 A에 열거된 바이오마커의 임의의 조합(즉, 공지된 호흡기 감작제 및/또는 비-감작제에 노출된 세포로부터의 바이오마커 측정)에 대해서 적합한 SVM 파라미터가 결정될 수 있음을 인식할 것이다. 대안적으로, 표 A 바이오마커를 사용하여 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 통계 방법에 따라서 호흡기 감작제를 식별할 수 있다.
대안적으로, 표 A 데이터를 사용하여 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 통계 방법(예를 들어, ANOVA, ANCOVA, MANOVA, MANCOVA, 다변량 회귀 분석법, 주 성분 분석법(PCA), 인자 분석법(Factor analysis), 정준 상관 분석법(Canonical correlation analysis), 정준 상관 분석법, 중복 분석법, 대응 분석법(CA; 상호 평균), 다차원 스케일링, 판별식 분석법(Discriminant analysis), 선형 판별식 분석법(LDA), 클러스터링 시스템, 재귀 분할(Recursive partitioning) 및 인공 신경 네트워크(Artificial neural network))에 따라서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 정확도, 예를 들어, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 정확도를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 적어도 89%의 정확도를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 민감도, 예를 들어, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 민감도를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 적어도 89%의 민감도를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 특이성, 예를 들어, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 특이성을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 89%의 특이성을 갖는다.
"정확도"란, 본 발명자들은 방법의 정확한 결과의 비율을 의미하고, "민감도"란, 본 발명자들은 양성으로서 올바르게 분류된 모든 양성 작용제의 비율을 의미하고, "특이성"이란, 본 발명자들은 음성으로서 올바르게 분류된 모든 음성 작용제의 비율을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 단계 (c)는 바이오마커 중 1개 이상의 핵산 분자의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진다. 핵산 분자는 DNA 분자 또는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 mRNA 분자이다. 그러나, 핵산 분자는 cDNA 분자일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 (c)에서 바이오마커 중 1개 이상의 발현을 측정하는 것은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 자기방사법(autoradiography) 및 현장 혼성화(in situ hybridisation)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 1개 이상의 바이오마커(들)의 발현은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 측정된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 단계 (c)에서 측정된 1개 이상의 바이오마커는 어레이(예를 들어, DNA 어레이)를 사용하여 측정된다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 단계 (c)에서 측정된 1개 이상의 바이오마커는 전체 게놈 어레이(예를 들어, Affymetrix Human Gene 1.0 ST 어레이 또는 Affymetrix Human Gene 2.0 ST 어레이)를 사용하여 측정된다. 대안적인 또는 추가 실시형태에서, Nanostring nCounter® 시스템이 사용된다(예를 들어, 전체 게놈 어레이(예를 들어, Affymetrix Human Gene 1.0 ST 어레이 또는 Affymetrix Human Gene 2.0 ST 어레이)로부터의 선택에 기초한 맞춤 Nanostring nCounter® 코드 세트). 이러한 시스템은 제안된 키트 및 시약을 사용하여 제조사의 설명서에 따라서 사용될 수 있다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 코드 세트는 표 A에 정의된 28개 유전자 중 1개 이상에 대한 프로브를 함유한다.
방법은 단계 (c)에서 각각 표 A에 식별된 바이오마커 중 1개를 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 결합 모이어티를 사용하여 1개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 방법은 단계 (c)에서 각각 표 A에 식별된 바이오마커 중 1개를 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 결합 모이어티를 사용하여 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기에 기재된 바이오마커의 임의의 특별한 조합물의 발현은 이들 바이오마커 각각에 선택적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티의 등가의 조합물을 사용하여 측정될 수 있다.
일 실시형태에서 1개 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 핵산 분자로 이루어진다. 추가 실시형태에서 1개 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이들로 이루어진다. 바람직하게는, 1개 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA를 포함하거나 DNA로 이루어진다. 일 실시형태에서, 1개 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 이들은 15 내지 35개 뉴클레오티드 길이이다.
1개 이상의 결합 모이어티는 Human Gene 1.0 ST 어레이(Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로부터의 1개 이상의 프로브를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 프로브 식별 번호는 본 명세서 표 A에 제공되어 있다.
적합한 결합제(결합 분자 또는 결합 모이어티라고도 지칭됨)는 하기에 논의된 바와 같이 주어진 핵산, 단백질 또는 아미노산 모티프에 결합하는 능력에 기초하여 라이브러리로부터 선택되거나 스크리닝될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함한다.
"검출 가능한 모이어티"라는 것은, 본 발명자들은 존재 및/또는 상대적인 양 및/또는 위치(예를 들어, 어레이 상의 위치)가 직접적으로 또는 간접적으로 결정되는 것을 허용하는 모이어티를 포함한다.
적합한 검출 가능한 모이어티는 당업계에 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 특정 조건에 노출될 때 검출될 수 있는 형광 및/또는 발광 및/또는 화학발광 모이어티일 수 있다. 이러한 형광 모이어티는 형광 모이어티의 여기를 유발하기 위해 특정 파장 및 강도에서 방사선(즉, 광)에 노출될 필요가 있으며, 이에 의해 검출될 수 있는 특정 파장에서 검출 가능한 형광을 방출할 수 있다.
대안적으로, 검출 가능한 모이어티는 (바람직하게는 검출 불가능한) 기질을 시각화 및/또는 검출될 수 있는 검출 가능한 생성물로 전환시킬 수 있는 효소일 수 있다. 적합한 효소의 예는 예를 들어, ELISA 분석과 관련하여 하기에 보다 상세히 논의된다.
검출 가능한 모이어티는 방사성 모이어티일 수 있고, 방사성 원자를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 방사성 원자는 테크네튬-99m, 아이오딘-123, 아이오딘-125, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티(예를 들어, 방사성 원자); 또는 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
명백하게, 검출될 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 시험 샘플 및/또는 대조군 샘플 및/또는 선택된 단백질을 검출하는 데 사용하기 위한 항체 분자 중 하나 이상의 바이오마커)는 검출 가능한 모이어티를 쉽게 검출할 수 있게 하기 위해서 충분한 적절한 원자 동위원소를 가져야 한다.
대안적인 바람직한 실시형태에서, 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티이다.
방사성-또는 다른 표지는 공지된 방식으로 본 발명의 방법의 샘플 및/또는 본 발명의 결합 모이어티에 존재하는 바이오마커에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 결합제가 폴리펩티드인 경우, 이는 예를 들어, 수소 대신 플루오린-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 생합성될 수 있거나 합성될 수 있다. 표지, 예컨대, 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh 및 111In은, 예를 들어, 결합 모이어티 내의 시스테인 잔기를 통해서 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해서 부착될 수 있다. IODOGEN 방법(문헌[Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57])을 사용하여 123I를 혼입할 수 있다. 문헌("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989)은 다른 방법을 상세하게 기재한다. 단백질에 대한 다른 검출 가능한 모이어티(예컨대, 효소, 형광, 발광, 화학발광 또는 방사성 모이어티)의 접합 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
시험될 샘플(들)의 바이오마커가 상기 단백질의 존재, 양 및/또는 위치를 결정하는 것을 간접적으로 돕는 모이어티로 표지될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 모이어티는 다성분 검출 가능한 모이어티의 한 성분을 구성할 수 있다. 예를 들어, 시험될 샘플(들) 중의 바이오 마커는 비오틴으로 표지될 수 있으며, 이는 스트렙타비딘이 융합되거나 검출 가능한 표지에 달리 결합된 것을 사용한 후속 검출을 허용한다.
본 발명의 제1 양태에서 제공된 방법은 단계 (c)에서 표 A에 정의된 하나 이상의 바이오마커의 단백질 발현을 결정하는 것을 포함하거나 결정하는 것으로 이루어질 수 있다. 방법은 단계 (c)에서 각각 표 A에 식별된 바이오마커 중 1개에 선택적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 결합 모이어티를 사용하여 1개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 1개 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대, 단클론성 항체 또는 이의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
용어 "항체"는 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 가변 및/또는 불변 영역의 파지-디스플레이에 의해 생성된 단일 쇄 항체 분자와 같지만 이에 제한되지 않는 임의의 합성 항체, 재조합 항체 또는 항체 혼성체를 포함하거나, 또는 당업자에게 공지진 면역검정 포맷으로 항원에 결합할 수 있는 다른 면역상호작용 분자를 포함한다.
본 발명자들은 또한 어피바디 및 압타머와 같은 항체-유사 결합제의 사용을 포함한다.
특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 관련된 기술에 대한 일반적인 검토는 문헌[Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299]에서 찾아볼 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 제1 결합 분자 중 하나 이상은 압타머일 수 있다(문헌[Collett et al., 2005, Methods 37:4-15] 참고).
분자 라이브러리, 예컨대, 항체 라이브러리(문헌[Clackson et al, 1991, Nature 352, 624-628]; 문헌[Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581-97]), 펩타이드 라이브러리(문헌[Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7]), 발현된 cDNA 라이브러리(문헌[Santi et al (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508]), 항체 프레임워크 이외의 다른 스캐폴드에 대한 라이브러리, 예컨대, 어피바디(문헌[Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134-40]) 또는 압타머 기반 라이브러리(문헌[Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 118, 217-31])가 주어진 모티프에 특이적인 결합 분자가 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 선택되는 기원으로서 사용될 수 있다.
분자 라이브러리는 원핵 세포(상기 문헌[Clackson et al, 1991, op. cit.; Marks et al, 1991]) 또는 진핵 세포(문헌[Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651-6])에서 생체내에서 발현될 수 있거나 또는 세포의 개입 없이 시험관내에서 발현될 수 있다(문헌[Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42]; 문헌[He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4]; 문헌[Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8]).
단백질-기반 라이브러리가 사용되는 경우, 잠재적 결합 분자의 라이브러리를 암호화하는 유전자는 종종 바이러스에 패키징되고, 잠재적 결합 분자가 바이러스의 표면에 디스플레이된다(상기 문헌[Clackson et al, 1991]; 상기 문헌[Marks et al, 1991]; 상기 문헌[Smith, 1985]).
아마도 가장 일반적으로 사용되는 디스플레이 시스템은 표면에 항체 단편을 디스플레이하는 사상 박테리오파지일 것이며, 항체 단편은 박테리오파지의 작은 외피 단백질에 대한 융합체로서 발현된다(상기 문헌[Clackson et al, 1991]; 상기 문헌[Marks et al, 1991]). 그러나, 디스플레이에 적합한 다른 시스템은 다른 바이러스(EP 39578), 박테리아(상기 문헌[Gunneriusson et al, 1999]; 문헌[Daugherty et al, 1998, Protein Eng 11(9):825-32]; 문헌[Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613-21)] 및 효모(문헌[Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5):949-56])를 포함한다.
또한, 소위 리보솜 디스플레이 시스템에서 이의 암호화 mRNA에 대한 폴리펩티드 생성물의 링키지(상기 문헌[Hanes & Pluckthun, 1997]; 상기 문헌[He & Taussig, 1997], 상기 문헌[Nemoto et al, 1997]) 또는 대안적으로 암호화 DNA에 대한 폴리펩티드 생성물의 링키지(예를 들어, 미국 특허 5,856,090호 및 국제공개 WO 98/37186호 참조)를 사용하는 디스플레이 시스템이 개발되었다.
항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 항원 인식에 관여하며, 이는 초기 프로테아제 소화 실험에 의해 처음 인식되었다. 설치류 항체의 "인간화"에 의해 추가 확인이 발견되었다. 설치류 기원의 가변 도메인은 생성된 항체가 설치류 모 항체의 항원 특이성을 유지하도록 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있다(문헌[Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855]).
항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되고, 불변 도메인과 무관하다는 것은 모두 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 항체 단편의 박테리아 발현을 포함하는 실험으로부터 공지되어 있다. 이러한 분자는 Fab-유사 분자(문헌[Better et al (1988) Science 240, 1041]); Fv 분자(문헌[Skerra et al (1988) Science 240, 1038]); VH 및 VL 파트너 도메인이 가요성 올리고펩티드를 통해서 연결된 단일-쇄 Fv(ScFv) 분자(문헌[Bird et al (1988) Science 242, 423]; 문헌[Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879]) 및 단리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체(dAb)(문헌[Ward et al (1989) Nature 341, 544])를 포함한다. 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 관련된 기술에 대한 일반적인 검토는 문헌[Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299]에서 찾아볼 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편은 온전한 항체, Fv 단편(예를 들어, 단일 쇄 Fv 및 디설파이드-결합 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 및 이중 포맷[즉, dAb-링커-dAb]을 포함하는 dAb)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편은 단일 쇄 Fv(scFv)이다.
하나 이상의 결합 모이어티는 대안적으로 항체-유사 결합제, 예를 들어, 어피바디 또는 압타머를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
"scFv 분자"라는 것은, 본 발명자들은 VH 및 VL 파트너 도메인이 가요성 올리고펩티드를 통해 연결된 분자를 의미한다.
전체 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 이점은 여러 가지이다. 단편의 더 작은 크기는 고형 조직의 더 나은 침투와 같은 개선된 약리학적 특성으로 이어질 수 있다. 보체 결합과 같은 전체 항체의 효과기 기능이 제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되고, 분비될 수 있으며, 따라서 상기 단편의 다량의 용이한 생산을 가능하게 한다.
전체 항체 및 F(ab')2 단편은 "2가"이다. "2가"라는 것은, 본 발명자들은 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 조합 부위를 갖는다는 것을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 단지 하나의 항원 결합 부위를 갖는 1가이다.
항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 적합한 단클론성 항체는 공지된 기술, 예를 들어, 문헌["Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)] 및 문헌["Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)]에 개시된 것에 의해서 제조될 수 있다.
잠재적인 결합 분자가 라이브러리로부터 선택되는 경우, 정의된 모티프를 갖는 하나 이상의 선택자 펩티드가 일반적으로 사용된다. 구조를 제공하고, 펩티드에서 유연성을 감소시키는 아미노산 잔기 또는 결합 분자와의 상호작용을 허용하는 하전된 극성 또는 소수성 측쇄가 선택자 펩티드에 대한 모티프의 설계에 사용될 수 있다. 예를 들어:
(i) 프롤린은 그 측쇄가 알파 탄소와 질소 모두에 결합되어 있기 때문에 펩티드 구조를 안정화시킬 수 있고;
(ii) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판은 방향족 측쇄를 갖고 매우 소수성인 반면, 류신 및 이소류신은 지방족 측쇄를 가지며 또한 소수성이고;
(iii) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘은 염기성 측쇄를 가지며, 중성 pH에서 양전하를 띠는 반면 아스파테이트 및 글루타메이트는 산성 측쇄를 가지며 중성 pH에서 음으로 하전될 것이고;
(iv) 아스파라긴과 글루타민은 중성 pH에서 중성이지만, 수소 결합에 참여할 수 있는 아미드기를 함유하고;
(v) 세린, 트레오닌 및 티로신 측쇄는 수소 결합에 참여할 수 있는 히드록실기를 함유한다.
전형적으로, 결합 분자의 선택은 결합 분자 유형에 해당하는 스팟에 대한 결합을 분석하기 위한 어레이 기술 및 시스템의 사용을 포함할 수 있다.
하나 이상의 단백질 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티, 발광 모이어티, 화학발광 모이어티, 방사성 모이어티 및 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가 실시형태에서, 단계 (c)는 1개 이상의 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합제, 검출 가능한 모이어티를 또한 포함하는 제2 결합제를 포함하는 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 제2 결합제는 제1 결합제와 관련하여 상기에 상세하게 기재되어 있다.
따라서, 시험될 샘플에서 관심대상 단백질은 먼저 제1 결합제를 사용하여 단리 및/또는 고정될 수 있으며, 그 후 상기 바이오마커의 존재 및/또는 상대적인 양이 제2 결합제를 사용하여 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 전형적으로 재조합 항체 또는 이의 단편이다. 편리하게는, 항체 또는 이의 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 항체 및 단편, 및 이를 제조하는 방법은 상기에 상세히 설명되어 있다.
대안적으로, 제2 결합제는 어피바디 또는 압타머와 같은 항체-유사 결합제일 수 있다.
대안적으로, 시험될 샘플 중의 단백질 상의 검출 가능한 모이어티가 특정 결합 쌍(예를 들어, 비오틴)의 구성원을 포함하거나 이것으로 이루어진 경우, 제2 결합제는 특정 결합 쌍의 상보적 구성원(예를 들어 스트렙타비딘)을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
검출 검정이 상용되는 경우, 검출 가능한 모이어티가 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티; 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 검출 가능한 모이어티의 예는 상기에 설명되어있다.
혈청 또는 혈장 단백질을 검출하기 위한 바람직한 검정은 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 방사성면역 검정(RIA), 면역방사성 검정(IRMA) 및 면역효소 검정(IEMA)을 포함하며, 단클론성 및/또는 다클론성 항체를 사용하는 샌드위치 검정을 포함한다. 예시적인 샌드위치 검정은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 David 등의 미국 특허 4,376,110호 및 4,486,530호에 의해 기재되어 있다. 슬라이드 상에서의 세포의 항체 염색은 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 세포학 실험실 진단 시험에서 널리 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
편리하게, 일 실시형태에서, 분석은 전형적으로 고체상 분석에서 착색된 반응 생성물을 제공하는 효소의 사용을 포함하는 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정)이다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 포스파타제와 같은 효소가 널리 사용되고 있다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방법은 NADP를 기질로 사용하여 이제 제2 효소 시스템에 대한 조효소 역할을 하는 NAD를 생성하는 것이다. 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)의 피로포스파타제는 효소가 조직에 존재하지 않고, 안정적이고, 양호한 반응 색상을 제공하기 때문에 양호한 접합체를 제공한다. 루시퍼라제와 같은 효소에 기반한 화학발광 시스템도 사용할 수 있다.
비타민 비오틴과의 결합은 그것이 높은 특이성과 친화도로 결합할 수 있는 효소-결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 반응에 의해 쉽게 검출될 수 있기 때문에 빈번하게 사용된다.
대안적인 실시형태에서, 단백질 검출에 사용되는 검정은 편리하게는 형광 검정이다. 따라서, 제2 결합제의 검출 가능한 모이어티는 Alexa 형광단(예를 들어, Alexa-647)과 같은 형광 모이어티일 수 있다.
바람직하게는, 제1 양태에 기재된 방법의 단계 (c), (e) 및/또는 (g)는 어레이를 사용하여 수행된다. 어레이는 비드-기반 어레이 또는 표면-기반 어레이일 수 있다. 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
어레이 그 자체는 당업계에 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이들은 고체 지지체의 표면 상에 형성된 유한 영역을 각각 갖는 이격된(즉, 별개의) 영역("스팟")을 갖는 선형 또는 2차원 구조로 형성된다. 어레이는 또한 각각의 비드가 분자 코드 또는 컬러 코드로 식별되거나 연속 흐름으로 식별되는 비드 구조일 수 있다. 시료가 용액으로부터 분자의 부류를 흡착하는 일련의 스팟을 통과할 때 순차적으로 분석을 수행할 수 있다. 고체 지지체는 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 일반적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴 아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 디스크, 실리콘 칩, 마이크로플레이트, PVDF 막, 니트로셀룰로스 막, 나일론 막, 다른 다공성 막, 비 다공성 막(예를 들어, 특히 플라스틱, 중합체, 퍼스펙스, 실리콘), 복수의 폴리머 핀, 또는 복수의 마이크로타이터 웰 또는 단백질, 폴리뉴클레오티드 및 다른 적합한 분자를 고정시키고/시키고 면역검정을 수행하기에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 공정은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 단백질 분자, 폴리뉴클레오티드 등을 고체 지지체에 공유 결합 또는 물리적 흡착시키는 가교 결합으로 이루어진다. 대안적으로, 친화성-태그 또는 유사한 작제물을 통한 프로브의 친화성 커플링이 사용될 수 있다. 접촉 또는 비접촉 인쇄, 마스킹 또는 포토리소그래피와 같은 널리 알려진 기술을 사용하여 각 지점의 위치를 정의할 수 있다. 검토는 문헌[Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29)] 및 문헌[Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9)]을 참고하기 바란다.
전형적으로 어레이는 마이크로어레이이다. "마이크로어레이"라는 것은, 본 발명자들은 적어도 약 100/㎠, 바람직하게는 적어도 약 1000/㎠의 개별 영역의 밀도를 갖는 영역의 어레이의 의미를 포함한다. 마이크로 어레이 내의 영역은 약 10 내지 250 ㎛ 범위의 전형적인 치수, 예를 들어, 직경을 가지며, 어레이의 다른 영역과 거의 동일한 거리만큼 떨어져있다. 어레이는 대안적으로 마크로어레이 또는 나노어레이일 수 있다.
적합한 결합 분자(상기에 논의됨)가 확인되고 단리되면, 당업자는 분자 생물학 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 어레이를 제조할 수 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 단계 (c)에서 측정된 1개 이상의 바이오마커는 인간 세포에 의해서 발현된 1개 이상의 상동성 유전자를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 단계 (c)에서 측정된 1개 이상의 바이오마커는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 단계 (c)에서 측정된 1개 이상의 바이오마커는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 또는 cDNA 등)이다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 방법은 시험관내, 생체내, 생체외 또는 인 실리코에서 수행된다. 예를 들어, 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다.
"시험제"라는 것은, 본 발명자들은 호흡기 감작 상태가 결정될 임의의 기질, 화합물, 조성물 및/또는 엔티티(또는 이의 혼합물)를 포함한다.
"감작 상태"라는 것은, 본 발명자들은 시험제(또는 시험제의 혼합물)가 감작제(예를 들어, 호흡기 감작제)인지 아닌지 포함하거나 의미한다.
일 실시형태에서, 방법은 호흡기 과민증 반응을 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 것이다. 바람직하게는, 과민증 반응은 체액 과민증 반응, 예를 들어, 타입 I 과민증 반응이다. 일 실시형태에서, 방법은 알레르기를 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 것이다.
"시험제의 호흡기 감작 효과를 나타냄"이라는 것은, 본 발명자들은 시험제가 호흡기 감작제인지의 여부 및/또는 호흡기 감작제로서의 시험제의 효력을 결정하는 것을 포함한다.
"호흡기 감작을 유도할 수 있는" 작용제라는 것은, 본 발명자들은 포유동물의 호흡기에서 타입 I 즉각적 과민증 반응을 유도하고, 촉발할 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. 바람직하게는 포유동물은 인간이다. 바람직하게는, 타이 I 즉각적 과민증 반응은 DC-매개되고/되거나 T 세포를 Th2 세포로 분화시키는 것을 포함한다. 바람직하게는 타입 I 즉각적 과민증 반응은 체액성 면역 및/또는 호흡기 알레르기를 일으킨다.
포유동물 폐의 전도 영역은 기관, 기관지, 세기관지 및 말단 세기관지를 함유한다. 호흡기 구역은 호흡기 기관지, 폐포관 및 폐포를 함유한다. 전도 영역은 기도로 구성되어 있으며, 혈액과 가스 교환이 없고, 기도를 개방을 유지하기 위해서 연골로 보강된다. 전도 구역은 흡입된 공기를 가습하고, 37℃(99℉)까지 가온시킨다. 또한 모든 통로의 벽에 있는 섬모를 통해 입자를 제거하여 공기를 정화한다. 호흡 구역은 혈액과 가스가 교환되는 부위이다.
일 실시형태에서, "호흡기 감작을 유도할 수 있는" 작용제는 포유동물의 폐 상피의 부위에서 타입 I 즉각적 과민증 반응을 유도하고, 촉발할 수 있는 임의의 작용제이다. 바람직하게는, 폐 상피 부위는 폐의 호흡 영역에 존재하지만, 대안적으로 또는 추가적으로 폐의 전도 영역에 존재할 수 있다.
포유동물은 가축 또는 농장 동물일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 래트, 마우스, 기니피그, 고양이, 개, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
수지상 세포(DC)는 포유동물 면역 체계의 일부를 형성하는 면역 세포이다. 이의 주요 기능은 항원 물질을 처리하여, 면역 체계의 다른 세포(즉, 항원 제시 세포로 기능함)에 표면 상에 그것을 제시하여 타고난 면역 체계와 적응 면역 체계를 연결하는 것이다.
수지상 세포는 피부(랑게르한스 세포라고 불리는 특수 수지상 세포 유형이 존재하는 경우)와 코, 폐, 위 및 내장의 내부 라이닝과 같은 외부 환경과 접촉하는 조직에 존재한다. 그것은 또한 혈액에서 미성숙한 상태에서 발견될 수 있다. 활성화되면, 그것은 림프절로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 적응 면역 반응을 시작하고 형성한다. 특정 발달 단계에서, 그들은 가지형 돌기인 수상 돌기를 성장시킨다. 모양은 유사하지만, 그것은 뉴런의 수상 돌기와는 별개의 구조이다. 미성숙 수지상 세포는 수상 돌기보다는 큰 세포질 '베일'을 가지고 있기 때문에 베일 세포라고도 불린다.
"수지상 유사-세포"는 형태학적 특성, 공동 자극 분자 및 MHC 클래스 II 분자의 발현, 거대 분자를 피노사이토시스하고 휴지 T 세포를 활성화하는 능력과 같은 수지상 세포에 특이적인 기능 및 표현형 특성을 나타내는 비-수지상 세포를 의미한다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단은 불멸 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진다. "불멸"이라는 것은, 본 발명자들은 달리는 DNA 손상 또는 단축된 텔로미어로 인한 것일 수 있는 더 이상 분열을 계속할 수 없는 지점에 의해 제한되지 않는 세포를 의미한다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단은 비-자연 발생 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진다. "비-자연 발생" 세포라는 것은, 본 발명자들은 세포가 자연에서 발견되는 세포와 상이하거나, 변형되거나, 이의 변이체라는 것을 의미하며; 즉, 이것은 자연에서 일반적으로 발생하는 세포가 아니다. 예를 들어, 세포는 자연 발생 인간 골수성 백혈병 세포 또는 자연 발생 수지상 세포와 상이하거나, 그로부터 변형 및/또는 변이체이다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단은 수지상-유사 세포의 집단이다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 수지상-유사 세포는 골수 수지상-유사 세포이다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 골수 수지상-유사 세포는 골수 수지상 세포로부터 유래된다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 골수 수지상 세포로부터 유래된 세포는 골수 백혈병-유래 세포이다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 골수 백혈병-유래 세포는 KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193, MUTZ-3 및 SenzaCell로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 수지상-유사 세포는 MUTZ-3 세포이다. MUTZ-3 세포는 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(독일 브라운슈바이크 소재)(www.dsmz.de; DMSZ No. ACC 295)로부터 입수 가능한 인간 급성 골수 단핵구 백혈병 세포이다.
대안적인 실시형태에서 수지상-유사 세포는 ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875에 따른 비-자연 발생 수지상-유사 골수 백혈병 세포이다. 이러한 세포를 "SenzaCell"이라고 지칭한다. SenzaCell(ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875)은 American Type Culture Collection(ATCC)(미국 버지니아주 20110, 매나서스, 10801 유니버시티 빌딩 소재)에 기탁되어 있다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 골수 백혈병-유래 세포는 MUTZ-3 또는 SenzaCell이다.
일 실시형태에서, 수지상-유사 세포는 사이토카인으로 자극된 후 CD1d, MHC 클래스 I 및 II를 통해 항원을 제시하고/하거나 특정 T- 세포 증식을 유도한다.
일 실시형태에서, 수지상-유사 세포는 CD34+ 수지상 세포 전구 세포이다. 선택적으로, CD34+ 수지상 세포 전구 세포는 사이토카인 자극 시 CD1d, MHC 클래스 I 및 II를 통해 항원을 제시하는 표현형을 획득하고, 특정 T 세포 증식을 유도하고/하거나 염증 매개체로 자극 시 성숙한 전사 및 표현형 프로파일을 디스플레이 할 수 있다(즉, 미성숙 수지상 세포 또는 랑게르한스-유사 수지상 세포와 유사한 표현형).
일 실시형태에서, 수지상-유사 세포는 CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 및 CD1a, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 적어도 하나를 발현한다. 추가 실시형태에서, 수지상-유사 세포는 마커 CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 및 CD1a를 발현한다.
일 실시형태에서, 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단은 수지상 세포의 집단이다. 바람직하게는, 수지상 세포는 1차 수지상 세포이다. 바람직하게는, 수지상 세포는 골수 수지상 세포이다.
수지상 세포는 기능, 표현형 및/또는 유전자 발현 패턴, 특히 세포 표면 표현형에 의해 인식될 수 있다. 이들 세포는 독특한 형태, 높은 수준의 표면 MHC- 클래스 II 발현 및 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, 특히 미경험 T 세포에 항원을 제시하는 능력을 특징으로 한다(문헌[Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271]).
수지상 세포의 세포 표면은 특이한 베일과 같은 돌출부를 가지고 있고, 세포 표면 마커 CD11c 및 MHC 클래스 II의 발현을 특징으로 한다. 대부분의 DC는 T 세포, B 세포, 단핵구/대식세포 및 과립구를 포함한 다른 백혈구 계통의 마커에 대해 음성이다. 수지상 세포의 하위집단은 또한 33D1, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CD1a-d, CD4, CD5, CD8alpha, CD9, CD11b, CD24, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD91, CD117, CD123(IL3Ra), CD134, CD137, CD150, CD153, CD162, CXCR1, CXCR2, CXCR4, DCIR, DC-LAMP, DC-SIGN, DEC205, E-카드헤린, 랑게린(Langerin), 만노스 수용체, MARCO, TLR2, TLR3 TLR4, TLR5, TLR6, TLR9 및 몇몇 렉틴을 포함하는 추가 마커를 발현할 수 있다.
이러한 세포 표면 마커의 발현 패턴은 수지상 세포의 성숙도, 기원 조직 및/또는 기원 종에 따라 달라질 수 있다. 미성숙 수지상 세포는 낮은 수준의 MHC 클래스 II를 발현하지만, 항원 단백질을 세포 내 세포 내에 주입하고 이를 MHC 클래스 II 분자와의 복합체에서 제시하기 위해 처리할 수 있다. 활성화된 수지상 세포는 높은 수준의 MHC 클래스 11, ICAM-1 및 CD86을 발현하고, 예를 들어, 혼합 백혈구 반응(MLR)에서 미경험 동종 T 세포의 증식을 자극할 수 있다.
기능적으로, 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포는 항원 제시의 결정을 위한 편리한 검정에 의해 식별될 수 있다. 이러한 검정은 시험 항원의 제시에 의해 항원-프라이밍 및/또는 미경험 T 세포를 자극하는 능력을 시험한 다음 T 세포 증식, IL-2의 방출 등을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 수지상-유사 세포는 BEAS-2B[28], WT 9-7 및 A549[29]와 같은 상피 세포 및/또는 상피-유사 세포를 포함한다. 바람직하게는 상피 세포는 폐 상피 세포이다. 바람직하게는 상피-유사 세포는 폐 상피-유사 세포이다. 대안적인 실시형태에서 수지상-유사 세포는 상피 세포 및/또는 상피-유사 세포를 포함한다.
단백질 및/또는 핵산의 농도를 검출 및/또는 측정하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참고하기 바란다.
단백질의 검출 및/또는 측정을 위한 바람직한 방법은 웨스턴 블롯, 노쓰-웨스턴 블롯, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 항체 마이크로어레이, 조직 마이크로어레이(TMA), 면역침강, 현장 혼성화 및 다른 면역조직화학 기술, 방사성면역 검정(RIA), 면역방사성 검정(IRMA) 및 면역효소 검정(IEMA)을 포함하며, 단클론성 및/또는 다클론성 항체를 사용하는 샌드위치 검정을 포함한다. 예시적인 샌드위치 검정은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 David 등의 미국 특허 4,376,110호 및 4,486,530호에 의해 기재되어 있다. 슬라이드 상에서의 세포의 항체 염색은 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 세포학 실험실 진단 시험에서 널리 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
전형적으로 ELISA는 통상적으로 고체상 분석에서 착색된 반응 생성물을 제공하는 효소의 사용을 포함한다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 포스파타제와 같은 효소가 널리 사용되고 있다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방법은 NADP를 기질로 사용하여 이제 제2 효소 시스템에 대한 조효소 역할을 하는 NAD를 생성하는 것이다. 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)의 피로포스파타제는 효소가 조직에 존재하지 않고, 안정적이고, 양호한 반응 색상을 제공하기 때문에 양호한 접합체를 제공한다. 루시퍼라제와 같은 효소를 기반으로 하는 화학발광 시스템 도 사용할 수 있다.
비타민 비오틴과의 결합은 그것이 높은 특이성과 친화도로 결합할 수 있는 효소-결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 반응에 의해 쉽게 검출될 수 있기 때문에 빈번하게 사용된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 방법은 하기 단계 중 1개 이상의을 포함한다:
(i) 수지상 또는 수지상-유사 세포를 배양하는 단계;
(ii) 바람직하게는 정상 상태 성장 단계로, 1개 이상의 웰(들), 예를 들어, 1개 이상의 다중-웰 검정 플레이트의 웰에서 (i)의 세포를 시딩하는 단계;
(iii) (ii)의 1개 이상의 웰(들)에 시험될 작용제(들)를 첨가하는 단계;
(iv) (ii)의 1개 이상의 개별 웰(들)에 양성 대조군(들), 예를 들어, 반응성 오렌지 16, 피페라진, 클로르아민 T 및/또는 트리멜리트산 무수물을 첨가하는 단계;
(v) (ii)의 1개 이상의 개별 웰(들)에 음성 대조군(들), 예를 들어, DMSO를 첨가하고/하거나 배지 대조군을 얻기 위해서 그리고/또는 정규화 목적을 위해서 (ii)의 1개 이상의 개별 웰(들)을 자극되지 않게 유지시키는 단계;
(vi) (iii) 내지 (v)의 웰에서 세포를, 바람직하게는 약 24시간 동안 배양시키고; 선택적으로, (iii) 내지 (v)의 웰로부터 세포를 수거하고; 추가로 선택적으로, 상청액을 제거하고, TRIzol 시약에 저장하는 단계;
(vii) (vi)의 세포로부터 정제된 전체 RNA를 단리하고, 선택적으로, mRNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
(viii) 예를 들어, 어레이, 예컨대, Affymetrix Human Gene 1.0 ST 어레이를 사용하여 또는 맞춤 유전자 발현 분석 프로브, 예컨대, Nanostring 코드 세트를 사용하여 (vii)로부터 개별 mRNA 전사체의 발현 수준을 정량하는 단계;
(ix) 예를 들어, 적절한 알고리즘, 예컨대, 표 4에 기재된 것을 사용하여, (viii)로부터의 데이터를 추출 및 정규화하는 단계;
(x) GARD Respiratory Prediction Signature의 바이오마커(즉, 표 A의 바이오마커)로부터 유래된 (ix)로부터 데이터를 단리하는 단계;
(xi) (x)의 데이터에 예측 모델, 예를 들어, 전통적인 데이터, 예를 들어, 실시예 1(또한 표 4에서의 코딩 참조)에서 얻은 데이터에서 이미 확립되고, 훈련된 프로즌 SVM 모델(frozen SVM model)을 적용하여, 시험된 작용제(들) 및 음성/양성 대조군(들)의 호흡기 감작 상태를 예측하는 단계;
(xii) 시험된 작용제가 포유동물에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제인지를 식별하는 단계.
본 발명의 제2 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 방법에 사용하기 위한 어레이를 제공하며, 어레이는 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 1개 이상의 결합 모이어티를 포함한다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 어레이는 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 바이오마커 각각에 대해서 1개 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 1개 이상의 결합 모이어티는 고정된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서 어레이는 비드-기반 어레이이다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 어레이는 표면-기반 어레이이다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제2 양태의 어레이는 1개 이상의, 바람직하게는 2개 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있고, 여기서 결합 모이어티는 각각 제1 양태에 정의된 바와 같은 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있다. 따라서, 어레이는 제1 양태에 정의된 바와 같은 바이오마커의 임의의 특정 선택과 상관관계가 있는 바이오마커-특이적 결합 모이어티의 특정 선택을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
예를 들어, 추가 또는 대안적인 실시형태에서, 어레이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 상이한 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 상이한 결합 모이어티 각각은 표 A에 열거된 상이한 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 어레이는 28개의 상이한 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있는데, 이들 각각은 표 A에 열거된 상이한 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있다. 추가 또는 대안적인 실시형태에서, 어레이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 상이한 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 상이한 결합 모이어티 각각은 표 A(i)에 열거된 상이한 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 어레이는 25개의 상이한 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있는데, 이들 각각은 표 A(i)에 열거된 상이한 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 제3 양태는 시험제의 호흡기 감작 효과를 결정하기 위한 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 2개 이상의 바이오마커의 용도를 제공한다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 시험제의 호흡기 감작 효과를 결정하기 위한 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커의 용도가 제공되며, 바람직하게는 바이오마커 중 1개 이상은 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택된다.
추가 또는 대안적인 실시형태에서, 시험제의 호흡기 감작 효과를 결정하기 위한 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 바이오마커에 대해서 각각 특이성을 갖는 2개 이상의 결합 모이어티의 용도가 제공되며, 바람직하게는 여기서 결합 모이어티는 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택된 바이오마커에 대한 특이성을 갖는다.
본 발명의 제4 양태는 하기를 포함하는, 본 발명의 제1 양태에 따른 방법에 사용하기 위한 분석용 키트를 제공한다:
(a) 본 발명의 제2 양태에 따른 어레이; 및
(b) 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서(선택적임).
추가 또는 대안적인 실시형태에서 분석용 키트는 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 1개 이상의 대조제를 추가로 포함한다.
본 발명의 제5 양태는 환자에서 호흡기 타입 I 과민증 반응(예컨대, 호흡기 천식)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자가 노출되거나 노출되고 있는 1개 이상의 시험제를 제공하는 단계;
(b) 본 발명의 제1 양태에 제공된 방법을 사용하여 단계 (a)에서 제공된 1개 이상의 시험제가 호흡기 감작제인지를 결정하는 단계; 및
(c) 1개 이상의 시험제가 호흡기 감작제로서 식별되는 경우, 1개 이상의 시험제에 대한 환자의 노출을 감소시키거나 예방하고/하거나 감작 증상에 대한 적절한 치료를 제공하는 단계.
바람직하게는, 환자가 노출되거나 노출되고 있는 1개 이상의 시험제는 환자가 적어도 1개월에 1회, 예를 들어, 적어도 2주에 1회, 적어도 매주 1회 또는 매일 1회 현재 노출되는 작용제이다.
감작 증상의 치료는 속효성 베타 2-아드레날린수용체 효능제(SABA), 예컨대, 살부타몰; 항콜린성 의약, 예컨대, 이프라트로피움 브로마이드; 다른 아드레날린 효능제, 예컨대, 흡입된 에피네프린; 코르티코스테로이드, 예컨대, 베클로메타손; 장기간 작용성 베타-아드레날린수용체 효능제(LABA), 예컨대, 살메테롤 및 포르모테롤; 류코트리엔 길항제, 예컨대, 몬텔루카스트(montelukast) 및 자퍼루카스트(zafirlukast); 및/또는 비만 세포 안정화제(예컨대, 크로몰린 나트륨)가 코르티코스테로이드에 대한 또 다른 비선호되는 대안이다.
바람직하게는, 치료 방법은 본 발명의 제1 양태에 기재된 방법 및 본 명세서에 기재된 실시형태 중 하나 이상에 기재된 방법과 일치한다.
본 발명의 제6 양태는 예를 들어, 단계 (c)의 발현 데이터(및 후속 발현 측정 단계)를 해석하여 1개 이상의 시험제가 알레르기성인지를 결정하기 위해 본 발명의 방법을 작동시키기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다. 컴퓨터 프로그램은 프로그래밍된 SVM일 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 공지된 적합한 컴퓨터 판독 가능한 캐리어에 기록될 수 있다. 적합한 컴퓨터 판독 가능 매체는 컴팩트 디스크(CD-ROM, DVD, 블루 레이 등), 플로피 디스크, 플래시 메모리 드라이브, ROM 또는 하드 디스크 드라이브를 포함할 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 프로그램을 실행하기에 적합한 컴퓨터 상에 설치될 수 있다.
당업자는 모든 충돌하지 않는 실시형태가 조합되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 일 양태로부터의 실시형태는 본 발명의 제2 양태에 동일하게 적용될 수 있다. 본 명세서에서 명백하게 이전에 공개된 문서의 목록 또는 논의는 문서가 최신 기술의 일부분이거나 통상적인 일반 지식이라는 인정으로 반드시 간주되어서는 안 된다.
본 발명의 특정 양태를 구현하는 바람직한 비제한적인 실시예가 다음의 도면을 참조하여 설명될 것이다:
도 1. 최적화된 바이오마커 시그니처로부터 유래한, 28개 변수의 압축된 공간에서의 훈련 데이터 세트의 PCA.
도 2. 최종 GARDair 예측 모델을 사용한, 시험 세트 1의 분류 결과의 가시화.
평균 SVM 결정 값(n=3)이 0 초과이면 시험 물질은 호흡기 감작제로서 분류된다.
도 3. 최종 GARDair 예측 모델을 사용한, 시험 세트 2의 분류 결과의 가시화.
평균 SVM 결정 값(n=3)이 0 초과이면 시험 물질은 호흡기 감작제로서 분류된다.
실시예 1
결과
예측 모델 근거
GARDTM는 화학 감작제 평가를 위한 최첨단 방법론 플랫폼이다. 이는 수지상 세포(DC)-유사 세포주를 기반으로 하므로, 감작으로 이어지는 반응의 시작에 관여하는 세포 유형을 모방한다. 배양된 DC는 관심 시험 물질에 노출된다. 배양 후, 세포의 활성화 상태를 연구하기 위해 노출 유도 전사 변화를 측정한다. 이러한 변화는 선천적 및 적응성 면역 반응의 브리징 및 생체내 DC의 의사 결정 역할과 관련이 있으며, 예를 들어, 공자극 분자의 상향 조절, 세포 및 산화 스트레스 경로의 유도 및 이동 및 세포간 소통 기능과 연관된 변경된 표현형으로 구성된다. 최첨단 유전자 발현 기술을 사용함으로써, 높은 정보 콘텐츠 데이터가 생성되는데, 이것은 사용자가 시험 물질에 의해 유도된 세포 반응을 전체적으로 볼 수 있게 한다. 단순화된 설명된 기술은, 시험 물질을 감작제 또는 비-감작제로 평가할 수 있게 한다.
GARD는 다수의 응용에 기반하는 시험 전략 플랫폼으로 간주된다. 본 명세서에서 용어 "플랫폼"은 모든 응용이 동일한 실험 전략 및 유사한 실험 프로토콜에 기초한다는 것을 나타낸다. 본 명세서에서 용어 "응용"은 상이한 생물학적 종점에 대한 서로 상이한 검정을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 "GARDair" 검정은 호흡기 감작제를 정확하게 분류할 수 있는 능력이 있는 것으로 입증된 GARD 플랫폼에 기반한 새로운 검정법이다. 따라서, GARDair는 화학 물질을 호흡기 감작제로 구체적으로 분류하는 선호되는 시험 방법인 능력을 갖고, 검증되는 종점 또는 심지어는 널리 허용되고, 사용되는 예측 모델은 현재 존재하지 않는다.
GARDair 바이오마커 발견
SenzaCells(ATCC 기탁 # PTA-123875)를 이용 가능한 문헌 및 전문가 합의에 의해 정의된 바와 같이, 10개의 양호하게 특징규명된 호흡기 감작제 및 20개의 비-호흡 감작제를 포함하는 화학 물질의 참조 패널에 노출시켰다(문헌[Chan-Yeung & Malo, 1994], 문헌[Dearman et al., 1997], 문헌[Dearman et al., 2012], 문헌[Lalko et al., 2012]). 참고로, 비-호흡기 감작제 세트는 호흡기 감작을 유발하는 기록된 능력이 없는 피부 감작제를 포함한다. 이 참조 화학 물질 세트를 사용하여 전형적으로 훈련 데이터 세트라고 지칭되는 것을 생성하였고, 표 1에 열거한다. 모든 노출은 제어된 환경에서 반복되는 3회 실험으로 수행하여, 후속 바이오마커 발견에 최적화된 높은 통계적 파워를 갖는 일관된 데이터 세트를 생성하였다.
화학적으로 노출된 세포 배양물로부터 정제된 RNA를 단리하고, Affymetrix 마이크로어레이를 사용하여 유전자 발현 분석을 수행함으로써, 훈련 데이터 세트라고 지칭되는 정보 마이닝을 위한 전체 게놈 발현 데이터 세트를 생성하였다. 훈련 데이터 세트의 통계적 파워는 관심대상의 생물학적 종점과 통계적으로 관련이 없는 대리 변수에서 발생하는 노이즈 신호를 식별하고 후속적으로 제거하는 SVA(Surrogate Variable Analysis) 알고리즘을 적용하여 추가로 증가되었다. 다음으로, 분산 분석(ANOVA)을 적용하여 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 식별하였다. 통계적 유의성의 정의로서 0.05 미만의 조정된 p-값(즉, Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 가설 검정을 위해 수정된 p-값)을 사용하여 28 DEGS는 선택 기준을 충족하였다. GARD 호흡 예측 시그니처(GRPS)로 총괄적으로 지칭되는 28 DEG의 아이덴티티를 표 2에 제시한다. 또한, 훈련 데이터 세트는 도 1의 주 성분 분석법(PCA)를 사용하여 시각화된다.
SVM 모델에서 28개 유전자의 각각의 가중치를 표 5에 제시한다. SVM은 예측 모델을 정의하는 알고리즘이다. 모델이 정의되면(즉, 훈련되면), 실제 예측 모델은 다음과 같이 선형 방정식으로 표현될 수 있다:
DV = K1*X2 + K2*X3 + … + KN*XN + M
식 중, DV는 결정값(적용하는 경우 모델의 출력)이고, K는 상수이고, X는 독립 변수이고, M은 절편을 나타내는 상수이다. 이 경우, N은 28이다. 28개 유전자의 발현 수준(즉, X)을 측정하고, 정의된 수학식을 28개의 고정 K 및 M과 함께 사용하여 DV를 계산하였다.
제공된 가중치는 K, 즉, 각각의 유전자 발현 수준이 곱해지는 상수이다. 따라서, K가 클수록 해당 유전자 X가 DV에 미치는 영향이 더 커진다. 단순화된 예로서, N=1기술 플랫폼 동 및 예측 모델 정 인 경우를 고려해야 한다. 이것은 직선에 대해 일반적으로 알려진 수학식, 즉 Y = KX + M을 제공할 것이다.
기술 플랫폼 전달 및 예측 모델 정의
GRPS를 확립한 후, Nanostring nCounter 시스템을 사용하여 GRPS의 표준화된 측정을 위해 혼성화 프로브를 설계하였다(문헌[Geiss et al., 2008]). 이 작업은 이전에 공개된 프로세스인, GARDskin의 기술 이전과 유사한 방식으로 수행되었다(문헌[Forreryd et al., 2016]). 상기에 언급된 검정과 동일한 세포 프로토콜을 활용하면, 강력하고, 간단하며, 자원 효율적인 검정이 가능하다. 예측 모델은 이진 "연구에서의 함수"(호흡기 감작제/비-호흡기 감작제)를 종속 변수로 사용하고, GRPS의 유전자 발현 값을 독립 변수(즉, 예측인자)로서 사용하는 훈련 데이터 세트의 샘플을 사용하여, 서포트 벡터 머신(SVM)을 기반으로 훈련되고, 고정되었다(또한 표 4 참고).
개념 증명 ― 외부 시험 데이터의 분류.
최적화된 예측 모델 및 관련 프로토콜을 확립한 후, 검정을 시험 데이터 세트라고 지칭되는 두 세트의 외부 샘플을 사용하여 분석에 도전하였다. 시험 세트에 포함된 샘플의 화학적 아이덴티티, 속하는 실제 군(호흡기 감작제 또는 비-호흡기 감작제) 및 GARDair 분류 결과를 표 3에 열거한다. 생성된 GARDair 결정값으로 정의된 바와 같은, 분류의 그래픽 표현을 각각 시험 세트 1 및 2에 대해서 도 2 및 도 3에 도시되어 있다.
사용 가능한 데이터를 기반으로 GARDair의 예측 성능을 추정한 결과 예측 정확도는 89%로 계산되었으며, 민감도와 특이성 간에 균형이 잘 맞았다. 추가로, 독립적인 실험으로부터 사용 가능한 몇 번의 반복된 노출에 기반하여, 재현성은 100%의 강력한 검정을 나타냅니다.
고찰
본 명세서에서 제시된 데이터에 기초하여, GARD 플랫폼을 활용하는 개념, 예를 들어, DC- 유사 세포를 시험 물질에 노출시키고, 기계-학습 보조 분류를 위해 유도된 전사 패턴을 조사하는 것은 화학적 호흡기 감작제를 평가하기 위한 기능성 전략이라고 결론내었다.
GARDair는 현재 최신 플랫폼으로 측정되는 바와 같은 게놈 판독치를 기반으로 하는 화학적으로 노출된 DC-유사 세포의 시험관내 최종 검정이다. 검정은 기능적이고 강력하다는 것이 입증되었다. 이러한 검정은 선천적 및 적응성 면역 기능의 브리징 및 Th2 유형 면역 반응에 대한 왜곡과 관련된 호흡기 감작제에 의해 특이적으로 유도된 바와 같은, DC의 전사 변화를 모니터링하기 위해 제안되어 있다. 주로, 이것은 IL7R 및 CRLF2 유전자의 데이터-기반 식별에 의해 입증되며, 번역된 단백질이 함께 흉선 기질 림포포이에틴(thymoid stromal lymphopoietin: TSLP)에 대한 수용체를 형성한다. 항원 제시 세포의 TSLP 수용체에 대한 TSLP 리간드-결합은 Th2 분화를 유도하는 것으로 이미 밝혀져 있다(문헌[Paul & Zhu, 2010, Soumelis et al., 2002]). 그러나 화학 물질에 대한 호흡기 감작 유도와 관련하여 이전에는 설명되지 않았다.
물질 및 방법
세포주 유지 및 자극을 위한 세포의 시딩
인간 수지상 세포(DC)의 시험관내 모델 역할을 하는 인간 골수 백혈병-유래 세포주 SenzaCell(ATCC를 통해 입수 가능함)을 20%(부피/부피) 우태야 혈청(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 40 ng/ml 재조합 인간 과립구 대식세포 집락 자극 인자(rhGM-CSF)(Miltenyi Biotec, 독일 소재)가 보충된 α-MEM(Thermo Scientific Hyclone, 미국 유타주 로건 소재)에서 유지시킨다. 증폭 동안 배지 변경은 3 내지 4일마다 수행된다. 배양물의 작업 스톡을 해동 후 최대 16계대 또는 2개월 동안 성장시킨다. 세포의 화학적 자극을 위해, 노출된 세포를 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 24시간 동안 배양시킨다.
시험 물질 취급 및 세포독성 평가
모든 시험 물질을 시험 물질의 안정성을 보장하기 위해 공급업체로부터의 설명서에 따라서 저장하였다. 시험 물질을 물리적 특성에 기초하여, DMSO 또는 물에 용해시켰다. 다수의 시험 물질이 세포에 독성 효과를 가질 것이기 때문에, 시험 물질의 세포독성 효과를 모니터링하였다. 일부 시험 물질은 세포 배지에 잘 용해되지 않았고; 따라서 최대 가용성 농도를 또한 평가하였다. 시험될 시험 물질을 1 μM에서 세포 배지의 최대 가해성 농도 범위의 농도로 적정하였다. 자유롭게 가용성인 시험 물질의 경우, 적정 범위의 상한으로 500 μM을 설정하였다. DMSO에 용해된 시험 물질의 경우, DMSO의 웰 내 농도는 0.1%였다. 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 24시간 동안 배양시킨 후, 수거된 세포를 생존률 마커 Propidium Iodide(PI)(BD Bioscience, 미국 소재)로 염색하고, 유세포 분석법으로 분석하였다. PI-음성 세포는 생존 가능한 것으로 정의되었고, 적정 범위의 각각의 농도로 자극된 세포의 상대 생존율을 다음과 같이 계산하였다:
상대 생존율=(생존 가능한 자극된 세포의 분율)/(생존 가능한 비자극된 세포의 분율)·100
독성 시험 물질의 경우, 90% 상대 생존율(Rv90)을 산출하는 농도를 GARD 분석에 사용했는데, 그 이유는 이 농도가 면역 반응을 손상시키지 않으면서 자극에 사용된 시험 물질의 생체 이용률을 보여주기 때문이다. 무독성 시험 물질의 경우, 가능한 경우 500 μM 농도를 사용하였다. 세포 배지에서 500 μM에서 불용성인 무독성 시험 물질의 경우, 최고 가용성 농도를 사용하였다. 이러한 3가지의 기준 중 어느 것이든 충족되는 경우, 유전자 발현 분석에 하나의 농도만을 사용할 것이다. 임의의 주어진 화학 물질에 사용될 농도를 'GARD 투입 농도'라고 지칭하였다.
GARD 주 자극
분석될 시험 물질에 대한 GARD 입력 농도가 설정되면, 상기에 기재된 바와 같이 세포를 다시 자극하였고, 이번에는 GARD 입력 농도만을 사용하였다. 시험 물질 및 벤치마크 대조군의 모든 평가를 생물학적 삼중물로 검정하였고, 상이한 시점에서 그리고 상이한 세포 배양을 사용하여 수행하였다. 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 24시간 동안 배양시킨 후, 세포 배양물을 TRIzol 시약(Life Technologies)에 용해시키고, RNA가 추출될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 동시에, 자극된 세포의 예상 상대 생존률에 도달한 것을 보장하기 위해서, PI 염색 및 유세포 분석법을 사용한 분석을 위해서 자극된 세포의 작은 샘플을 채취하였다.
RNA의 단리
용해된 세포로부터의 RNA 단리는 상업적으로 입수 가능한 키트(Direct-Zol RNA MiniPrep, Zymo Research, 미국 캘리포니아주 이르빈 소재)를 사용하여 수행하였다. 총 RNA를 BioAnalyzer 장비(Agilent, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 정량 및 품질 제어하였다.
마이크로어레이를 사용한 유전자 발현 분석
cDNA의 준비 및 HuGene ST 1.0 마이크로어레이에 대한 혼성화를 Swegene Center for Integrative Biology at Lund University(SCIBLU, 스웨덴 룬트 소재)에서 제조업체의 권장 프로토콜, 키트 및 시약(Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 따라서 수행하였다.
마이크로어레이 데이터 획득 및 정규화
혼성화된 마이크로어레이를 권장 프로토콜에 따라 세척하고 스캔하였다. 통계 컴퓨팅을 위해 원시 데이터 .셀-파일(Raw data .cell-file)을 R 환경에 임포팅하였다(www.r-project.org). 원시 데이터를 정규화하고, R-패키지 SCAN을 사용하여 유전자 발현 신호로 변환하였다.
데이터 분석 ― GARDair 감작 바이오마커 시그니처의 특징 선택
표 1에 열거된 화학 물질의 패널로 자극된 SenzaCell 샘플의 생물학적 삼중물을 함유하는 정규화된 데이터를 호흡기 감작제와 호흡기 비-감작제를 구별할 수 있는 차별적으로 조절된 유전자에 대해서 마이닝하였다. R- 패키지 SVA로부터 입수 가능한 대리 변수 분석을 사용하여 정의되지 않은 소스에서 원하지 않는 변동을 제거하였다. 조절된 유전자는 R-패키지 Limma의 ANOVA를 사용하여 식별하였다. 0.05 미만의 거짓 발견율을 갖는 유전자(즉, Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 가설 검정을 위해 수정된 p-값)는 통계학적으로 유의하다고 간주되었다. 28개의 고유한 유전자가 선택 기준을 충족했으며, 표 2에 제시한다.
기술 플랫폼 전달
고유한 Nanostring nCounter 시스템 전사체 프로브를 Nanostring Bioinformatics 팀(Nanostring, 미국 워싱톤주 시애틀 소재)에 의해 합성하였다. 공급업체(Nanostring)의 프로토콜에 따라 나노스트링 유전자 발현 데이터를 바이오마커 발견을 위해 생성된 RNA 샘플, 즉, 관심대상의 28개의 유전자를 포함하는 훈련 데이터 세트(표 1)의 완전 복제로부터 생성하였다.
외부 시험 화학물질의 예측 모델 확립 및 시험
R 통계 환경(R Core Team) 및 추가 패키지를 사용하여, "연구에서의 함수"를 종속 변수(예측될 파라미터)로 사용하고, 바이오마커 시그니처의 28개 유전자를 독립 변수(즉, 예측인자)로서 사용하는 훈련 데이터 세트(표 1)에 의해서 서포트 벡터 머신(SVM)을 생성하였다(또한 표 4 참고). 외부 시험 화학 물질의 시험을 위해서, 상기에 기재된 프로토콜에 따라서 유전자 발현 데이터를 생성하였다. 훈련된 SVM 모델을 적용하여 평균 SVM 결정값(n = 3)에 의해 결정된 바와 같이, 각각의 샘플을 호흡기 감작제 및 비-호흡기 감작제로 분류하였다. 양의 결정값은 양의 분류를 나타낸다.
표
Figure pct00001
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Claims (57)

  1. 포유동물에서 호흡기 감작(respiratory sensitization)을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법으로서,
    (a) 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단을 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 제공된 세포를 시험제(test agent)에 노출시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 세포에서 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 상기 단계로 이루어지고;
    단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 시험제의 호흡기 감작 효과를 나타내는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 발현이 측정된 바이오마커 중 1개 이상은 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (c)는 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(i)에 열거된 바이오마커 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 표 A(i)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 표 A(ii)에 정의된 군으로부터 선택된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(ii)에 열거된 바이오마커 중 2 또는 3개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 표 A(ii)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 바이오마커 중 3개 이상의, 예를 들어, 표 A에 열거된 바이오마커 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 표 A에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    d) 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 개별 집단을 포유동물에서 호흡기 감작제가 아닌 1개 이상의 음성 대조제(control agent)에 노출시키는 단계; 및
    e) 단계 (d)의 세포에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 더 포함하되,
    시험제는 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현이 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현과 상이한 사건에서 호흡기 감작제로서 식별되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    f) 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 개별 집단을 포유동물에서 호흡기 감작제인 1개 이상의 양성 대조제에 노출시키는 단계; 및
    g) 단계 (f)의 세포에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 더 포함하되,
    시험제는 단계 (f)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현이 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현에 상응하는 사건에서 호흡기 감작제로서 식별되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 바이오마커 중 1개 이상의 핵산 분자의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 핵산 분자는 mRNA 분자인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 핵산 분자는 cDNA 분자인, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 바이오마커 중 1개 이상의 발현을 측정하는 것은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 자기방사법(autoradiography) 및 현장 혼성화(in situ hybridisation)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행되는, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 바이오마커 중 1개 이상의 발현을 측정하는 것은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 결정되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 바이오마커 중 1개 이상의 발현을 측정하는 것은 각각 표 A에 식별된 바이오마커 중 1개를 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 1개 이상의 결합 모이어티 각각은 핵산 분자를 포함하거나 핵산 분자로 이루어진, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 1개 이상의 결합 모이어티 각각은 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이들로 이루어진, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 1개 이상의 결합 모이어티 각각은 DNA를 포함하거나 DNA로 이루어진, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 결합 모이어티는 15 내지 35개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티(예를 들어, 방사성 원자); 또는 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 검출 가능한 모이어티는 방사성 원자를 포함하거나 방사성 원자로 이루어진, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 방사성 원자는 테크네튬-99m, 아이오딘-123, 아이오딘-125, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티인, 방법.
  28. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 바이오마커 중 1개 이상의 단백질의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 측정하는 것으로 이루어진, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단계 (c)에서 바이오마커 중 1개 이상의 발현을 측정하는 것은 각각 표 A에 식별된 바이오마커 중 1개에 선택적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 1개 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나 이것으로 이루어진, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 1개 이상의 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티, 화학발광 모이어티, 방사성 모이어티 및 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 어레이를 사용하여 수행되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 어레이는 비드-기반 어레이인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 어레이는 표면-기반 어레이인, 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 시험관내, 생체내, 생체외 또는 인 실리코에서 수행되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 방법은 시험관내에서 수행되는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단은 불멸 및/또는 비-자연 발생 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 수지상 세포의 집단 또는 수지상-유사 세포의 집단은 수지상-유사 세포의 집단인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 수지상-유사 세포는 골수 수지상-유사 세포인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 골수 수지상-유사 세포는 골수 수지상 세포로부터 유래되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 골수 수지상 세포로부터 유래된 세포는 골수 백혈병-유래 세포, 예컨대, KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193, MUTZ-3 및 SenzaCell로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 과민증 반응을 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위한, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 과민증 반응은 체액 과민증 반응인, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 타입 I 과민증 반응을 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위한, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 알레르기를 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위한, 방법.
  48. 제9항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에 제공된 1개 이상의 음성 대조제는 비자극된 세포; 세포 배지; 비히클 대조군; DMSO; 1-부탄올; 2-아미노페놀; 2-히드록시에틸 아크릴레이트; 2-니트로-1,4-페닐렌디아민; 4-아미노벤조산; 클로로벤젠; 디메틸 포름아미드; 에틸 바닐린; 포름알데히드; 제라니올; 헥실신남산 알데히드; 이소프로판올; 캐톤 CG*; 메틸 살리실레이트; 페니실린 G; 프로필렌 글리콜; 중크롬산칼륨; 과망가니즈산칼륨; Tween 80; 황산아연; 2-머캅토벤조티아졸; 4-히드록시벤조산; 벤즈알데히드; 옥탄산; 신남일 알코올; 디에틸 프탈레이트; DNCB; 유게놀; 글리세롤; 글리옥살; 이소유게놀; 페놀; PPD; 레소르시놀; 살리실산; SDS; 및 클로로벤젠으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  49. 제10항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에 제공된 1개 이상의 양성 대조제는 암모늄 헥사클로로플라티네이트, 암모늄 퍼설페이트, 글루타르알데하이드, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 말레산 무수물, 메틸렌 디페놀 디이소시아네이트, 프탈산 무수물, 톨루엔디이소시아네이트; 트리멜리트산 무수물; 클로르아민-T 수화물; 이소포론 디이소시아네이트; 피페라진; 반응성 오렌지 16; 말레산 무수물; 페닐 이소시아네이트(MDI); 프탈산 무수물; 톨루엔 디이소시아네이트; 및 트리멜리트산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 작용제를 포함하거나 이것으로 이루어진, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 시험될 샘플의 상대적인 감작 효력(sensitizing potency)을 나타내는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (i) 수지상 또는 수지상-유사 세포를 배양하는 단계;
    (ii) 1개 이상의 웰(들), 예를 들어, 1개 이상의 다중-웰 검정 플레이트의 웰에서 (i)의 세포를 시딩하는 단계;
    (iii) (ii)의 1개 이상의 웰(들)에 시험될 작용제(들)를 첨가하는 단계;
    (iv) (ii)의 1개 이상의 개별 웰(들)에 1개 이상의 양성 대조군(들)을 첨가하는 단계;
    (v) (ii)의 1개 이상의 개별 웰(들)에 1개 이상의 음성 대조군(들)을 첨가하는 단계;
    (vi) (iii) 내지 (v)의 웰에서 바람직하게는 약 24시간 동안 세포를 배양시키는 단계;
    (vii) (vi)의 세포로부터 정제된 전체 RNA를 단리하고, 선택적으로, mRNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
    (viii) 예를 들어, 어레이, 예컨대, Affymetrix Human Gene 1.0 ST 어레이, 및/또는 Nanostring 코드 세트를 사용하여 (vii)로부터 개별 mRNA 전사체의 발현 수준을 정량하는 단계;
    (ix) (viii)로부터의 발현 데이터를 추출하고 정규화시키는 단계;
    (x) GARD Prediction Signature의 바이오마커(즉, 표 A의 바이오마커)로부터 유래된 (ix)로부터 데이터를 단리하는 단계;
    (xi) (x)로부터의 데이터에 예측 모델, 예를 들어, 전통적인 데이터, 예를 들어, 실시예 1에서 얻은 데이터에서 이미 확립되고, 훈련된 프로즌 SVM 모델(frozen SVM model)을 적용하여, 시험된 작용제(들) 및 음성/양성 대조군(들)의 호흡기 감작 효과를 예측하는 단계.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 어레이로서, 어레이는 제17항 내지 제27항 및 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 1개 이상의 결합 모이어티를 포함하는, 어레이.
  53. 제52항에 있어서, 어레이는 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 정의된 바이오마커 각각에 대해서 1개 이상의 결합 모이어티를 포함하는, 어레이.
  54. 호흡기 감작제를 식별하기 위한 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커의 용도이되, 바람직하게는 바이오마커 중 1개 이상은 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택되는, 용도.
  55. 각각 호흡기 감작제를 식별하기 위한 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 바이오마커에 대해서 특이성을 갖는 2개 이상의 결합 모이어티의 용도이되, 바람직하게는 결합 모이어티 중 1개 이상은 표 A(i)에 정의된 군으로부터 선택된 바이오마커에 대해서 특이성을 갖는, 용도.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 분석용 키트로서,
    (a) 제52항 또는 제53항에 따른 어레이;
    (b) (선택적으로) 1개 이상의 대조제; 및
    (c) (선택적으로) 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 분석용 키트.
  57. 본 명세서에 실질적으로 기재된 바와 같은 사용 방법, 어레이 또는 키트.
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0039578B1 (en) 1980-05-02 1985-04-10 Edward P. Davis Leg aid device
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US5856090A (en) 1994-09-09 1999-01-05 The Scripps Research Institute DNA-methylase linking reaction
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB201207297D0 (en) 2012-04-26 2012-06-06 Senzagen Ab Analytical methods and arrays for use in the same
GB201421207D0 (en) * 2014-11-28 2015-01-14 Senzagen Ab Analytical methods and arrays for use in the same
LU93401B1 (en) * 2016-12-27 2018-07-24 Luxembourg Inst Science & Tech List Three-dimensional in vitro lung model, process for preparing said model, and its use for determining and/or predicting the sensitizing effects of inhalable products

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chan-Yeung & Malo, 1994. Aetiological agents in occupational asthma. European Respiratory Journal.
Dearman et al., 1997. Classification of chemical allergens according to cytokine secretion profiles of murine local lymph node cells. Journal of Applied Toxicology.
Dearman et al., 2011. Inter-relationships between different classes of chemical allergens. Journal of Applied Toxicology.
Dearman et al., 2012. Inter-relationships between different classes of chemical allergens. Journal of Applied Toxicology.
Forreryd et al., 2015. Prediction of chemical Respiratory sensitizers using GARD, a novel in vitro assay based on a genomic biomarker signature. PLoS One 10(3).
Forreryd et al., 2016. From genome-wide arrays to tailor-made biomarker readout - Progress towards routine analysis of skin sensitizing chemicals with GARD. Toxicology in vitro.
Geiss et al., 2008. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology.
Isola et al., 2008. Chemical respiratory allergy and occupational asthma: what are the key areas of uncertainty? Journal of Applied Toxicology.
Johansson et al., 2011. A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics.
Kimber et al., 2002. Chemical respiratory allergy: role of IgE antibody and relevance of route of exposure. Toxicology.
Kimber et al., 2011. Chemical allergy: translating biology into hazard characterization. Toxicological Sciences.
Kimber et al., 2014. Chemical respiratory allergy: reverse engineering an adverse outcome pathway. Toxicology.
Lalko et al., 2012. The direct peptide reactivity assay: selectivity of chemical respiratory allergens. Toxicological Sciences.
Paul & Zhu, 2010. How are Th2-type immune responses initiated and amplified. Nature Reviews Immunology.
Soumelis et al., 2002. Human epithelial cells trigger dendritic cell-mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol.
Sullivan et al., 2017. An Adverse Outcome Pathway for Sensitization of the Respiratory Tract by Low-Molecular-Weight Chemicals: Building Evidence to Support the Utility of In Vitro and In Silico Methods in a Regulatory Context. Applied in vitro Toxicology.

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