CN111295441B - 新颖细胞系和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供根据ATCC专利保藏号PTA‑123875的非天然存在的树突状骨髓白血病细胞，以及利用此类细胞的方法和试剂盒。

Description

新颖细胞系和其用途
技术领域
本发明提供一种非天然存在的树突状细胞系和利用此类细胞的方法和试剂盒。
背景技术
树突状细胞(DC)通过桥接先天性与适应性免疫性之间的必需连接而在免疫反应中起关键作用。通过触发，它们可以迅速产生大量介体，这些介体通过抗原呈递微调细胞反应，从而影响发炎部位其他细胞的迁移和活化，并选择性地响应各种病原体和环境因素。因此，在用敏化剂刺激期间探索和利用DC的免疫决策可充当用于预测敏化的强力测试策略。
然而，不同DC亚群的多方面表型和专用功能以及其广泛和稀少分布是复杂的因素，这妨碍使用主要DC作为测试平台。因此，存在建立准确且可靠的活体外分析的实际需要，所述活体外分析还规避例如通过利用树突状模型细胞系而与获得初级DC的可变性和困难相关的问题。
基因组过敏原快速检测(GARD)为经开发用于评估化学和蛋白敏化剂和过敏原的活体外分析。其使用来自树突状细胞样细胞系的转录谱来预测测试剂的敏化或过敏原潜力(9)。转录谱由鉴别为在区分敏化剂与非敏化剂中具有最大预测性能的基因组成。具体来说，已开发GARD来鉴别：皮肤敏化剂(WO2012/056236；Johansson等人(2017)在匿名欧洲化妆品研究中评估GARD分析(Evaluation of the GARD assay in a blind CosmeticsEurope study)。ALTEX在线(ALTEX Online)首先在2017年2月17日；Forreryd等人(2016)从全基因组阵列到定制生物标志物的读出——用GARD进行的皮肤敏化化学物质的常规分析进展(From genome-wide arrays to tailor-made biomarker readout-Progresstowards routine analysis of skin sensitizing chemicals with GARD)。活体外毒物学(Toxicolgy In Vitro)；Johansson等人(2014)，GARD室内验证——概念的证明(GARDin-house validation-A proof of concept)。Tox Sci；Johansson等人，(2011)基因组生物标志物特征可使用基于细胞的活体外替代动物测试来预测皮肤敏化剂(A genomicbiomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitroalternative to animal tests)。BMC基因组(BMC Genomics)，2011)；呼吸道敏化剂(WO2013/160882；WO 2016/083604；Forreryd等人(2015)使用GARD预测化学呼吸道敏化剂(Prediction of chemical Respiratory sensitizers using GARD)，这是基于基因组生物标志物特征的新颖活体外分析。PLoS One10(3))；皮肤敏化剂的效力(PCT/EP2017/056878；Zelle等人(2017)用于皮肤敏化化学物质的效力评估的GARD平台(The GARDplatform for potency assessment of skin sensitizing chemicals)。ALTEX在线首次于4月12日公布，第2版https://doi.org/10.14573/altex.1701101)；和蛋白的过敏原性。
发明内容
本发明人现在提供非天然存在的树突状骨髓白血病细胞系，其被称为“SenzaCell”(ATCC专利保藏号PTA-123875)，作为适合用于GARD分析的优选的树突状细胞系。SenzaCell已经与也可以用于GARD分析的MUTZ-3细胞系比较；MUTZ-3细胞是可购自德国布伦瑞克(Braunschweig)Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)的树突状细胞(www.dsmz.de；DSMZ No.ACC 295)。然而，MUTZ-3细胞拟定需要与饲养细胞系一起培养，这使所述细胞使用起来很复杂。因此，仍需要MUTZ-3的替代方案以用于例如GARD分析的方法中。
SenzaCell与MUTZ-3之间的比较包括比较一组生物标志物的表达的表型分析、比较细胞系的转录水平的转录分析、其DNA序列与功能分析的比较，其揭示表型和转录谱的许多可定量差异且在GARD分析中展示共享功能性。
因此，在本发明的第一方面，提供根据ATCC专利保藏号PTA-123875的非天然存在的树突状骨髓白血病细胞。
细胞在本文中也称为“SenzaCell”。SenzaCell(ATCC专利保藏号PTA-123875)由SenzaGen AB在2017年3月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)(USA，VA 20110,Manassas，University Blvd 10801)。
所谓“非天然存在”，我们指细胞不同于自然界中将发现的细胞、从自然界中修改的细胞和/或其变体；换句话说，其不是自然界中通常将发生的细胞。举例来说，不同于天然存在的人类骨髓白血病细胞或天然存在的树突状细胞、从天然存在的人类骨髓白血病细胞或天然存在的树突状细胞进行修饰，和/或天然存在的人类骨髓白血病细胞或天然存在的树突状细胞的变体。
在本发明的第二方面，提供一种细胞培养物，其包含根据第一方面的细胞群。
在一个实施例中，细胞或细胞群包含无限增殖或永生化细胞或由无限增殖或永生化细胞组成。所谓“无限增殖”，我们指细胞不受一定点的限制，在所述点细胞不能再继续分裂，否则可能是由于DNA损伤或缩短的端粒。在另一或替代性实施例中，细胞或细胞群包含未分化细胞或由未分化细胞组成。
在本发明的第三方面，提供一种鉴别能够诱发哺乳动物的敏化和/或过敏原性的药剂的活体外方法，其包含或其组成为以下步骤：
a)将根据第一或第二方面的树突状细胞群暴露于测试剂；和
b)在细胞中测量一种或多种生物标志物的表达，所述生物标志物选自表A、B、C、D及E中的一个或多个中所定义的组；
其中步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物的细胞中的表达指示所述测试剂的敏化和/或过敏作用。
在本发明的第四方面，提供一种鉴别能够诱发哺乳动物皮肤敏化的药剂的活体外方法，其包含以下步骤或由以下步骤组成：
a)将根据所述第一或第二方面的所述树突状细胞群暴露于测试剂；和
b)在所述细胞中测量一种或多种生物标志物的表达，所述生物标志物选自表A中所定义的组；
其中步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物的细胞中的表达指示所述测试剂的皮肤敏化作用。
在实例1的功能分析部分中描述了能够诱发哺乳动物皮肤敏化的可利用根据本发明的树突状细胞的药剂的方法。WO 2012/056236；Johansson等人(2017)在匿名欧洲化妆品研究中评估GARD分析(Evaluation of the GARD assay in a blind Cosmetics Europestudy)中所描述的方法。ALTEX在线首先在2017年2月17日；Forreryd等人(2016)从全基因组阵列到定制生物标志物的读出--用GARD进行的皮肤敏化化学物质的常规分析进展(Fromgenome-wide arrays to tailor-made biomarker readout-Progress towards routineanalysis of skin sensitizing chemicals with GARD)。活体外毒物学(Toxicolgy InVitro)；Johansson等人(2014)，GARD室内验证——概念的证明。Tox Sci；Johansson等人，(2011)基因组生物标志物特征可使用基于细胞的活体外替代动物测试来预测皮肤敏化剂(A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests)。还可使用BMC基因组(BMC Genomics)2011，其全部以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，所述方法用于鉴别能够诱发人皮肤的超敏反应的药剂。优选地，超敏反应为细胞介导的超敏反应，例如IV型超敏反应。优选地，超敏反应为哺乳动物中的IV型超敏反应。优选地，IV型迟发型超敏反应是DC介导的。优选地，所述方法用于鉴别能够诱发过敏接触性皮炎(ACD)(即超敏反应为ACD)的药剂。
在一个实施例中，“能够诱发哺乳动物皮肤敏化的药剂”为能够在哺乳动物的表皮接触部位诱发和触发IV型迟发型超敏反应的药剂。
在本发明的第五方面，提供一种用于鉴别能够在哺乳动物中诱发呼吸道敏化的药剂的方法，其包含以下步骤或由以下步骤组成：
a)将根据第一或第二方面的树突状细胞群暴露于测试剂；和
b)在所述细胞中测量选自表B中所定义的组的一种或多种生物标志物的表达；
其中步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物的细胞中的表达指示所述测试剂的呼吸道敏化作用。
在本发明的第六方面，提供一种用于鉴别能够在哺乳动物中诱发呼吸道敏化的药剂的方法，其包含以下步骤或由以下步骤组成：
a)将根据第一或第二方面的树突状细胞群暴露于测试剂；和
b)在所述细胞中测量选自表C中所定义的组的一种或多种生物标志物的表达；
其中步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物的细胞中的表达指示所述测试剂的呼吸道敏化作用。
可以组合第五和第六方面的方法，使得步骤(b)包含在所述细胞中测量选自表B和/或C中定义的组的一种或多种生物标志物的表达。
在实例2中论述了在可使用根据本发明的树突状细胞的哺乳动物中鉴别能够诱发呼吸道敏化的药剂的方法。在WO 2013/160882；WO 2016/083604；和Forreryd等人(2015)使用GARD预测化学呼吸道敏化剂(Prediction of chemical Respiratory sensitizersusing GARD)中描述的方法。还可使用所有以引用的方式并入本文中的PLoS One 10(3)。
所谓“能够诱发呼吸道敏化的药剂”，我们指能够诱发和触发哺乳动物的呼吸道中I型立即超敏反应的任何药剂。优选地，I型立即超敏反应是DC介导的和/或涉及T细胞分化到Th2细胞中。优选地，I型立即超敏反应产生体液免疫性和/或呼吸道过敏。
在一个实施例中，“能够诱发哺乳动物皮肤敏化的药剂”为能够在哺乳动物中的肺上皮部位诱发和触发I型立即超敏反应的药剂。优选地，肺上皮部位处在肺的呼吸区中，但可替代地或另外地处于肺的传导区中。
在本发明的第七方面，提供一种用于测定药剂的皮肤敏化效力的方法，其包含以下步骤或由以下步骤组成：
(a)根据第一或第二方面提供树突状细胞的群；
(b)将步骤(a)中提供的细胞暴露于测试剂；和
(c)在步骤(b)的细胞中测量选自表D中所定义的组的一种或多种生物标志物的表达；
其中步骤(c)中测量的所述一种或多种生物标志物的表达指示步骤(b)的所述测试剂的皮肤敏化效力。
在实例3中论述确定可以使用根据本发明的树突状细胞的药剂的皮肤敏化效力的方法。Zeller等人(2017)用于皮肤敏化化学物质的效力评估的GARD平台(The GARDplatform for potency assessment of skin sensitizing chemicals)中描述的方法。还可使用首先公布于2017年4月12日的ALTEX在线，第2版https://doi.org/10.14573/altex.1701101和PCT/EP2017/056878，其以引用的方式并入本文中。
在本发明的第八方面，提供一种鉴别哺乳动物的过敏原性蛋白的方法，其包含以下步骤或以下步骤组成：
(a)根据第一或第二方面提供树突状细胞的群；
(b)将步骤(a)中提供的细胞暴露于测试蛋白；和
(c)在步骤(b)的所述细胞中测量选自表E中所定义的所述组的一种或多种生物标志物的表达；
其中步骤(c)中测量的所述一种或多种生物标志物的表达指示步骤(b)的所述测试蛋白的过敏原性。
在实例4中详细论述了可使用根据本发明的树突状细胞的用于鉴别引起哺乳动物过敏的蛋白的方法。
在一个实施例中，根据本发明任一方面的方法还包含：
d)将根据第一或第二方面的树突状细胞的单独群暴露于一种或多种不诱发哺乳动物敏化和/或过敏的阴性对照药剂；和
e)在步骤(d)的细胞中测量在步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达
其中步骤(e)中测量的所述一种或多种生物标志物的表达不同于步骤(b)或(c)中测量的所述一种或多种生物标志物的表达的情况下，所述测试剂鉴别为敏化剂和/或是过敏的。
媒介物对照可以用作阴性对照药剂。媒介物对照可包含DMSO和/或蒸馏水。
在另一或替代实施例中未受刺激的细胞可以被用作阴性对照。对于“未受刺激的细胞”，我们包括或指的是未暴露于特定测试剂的细胞。
在另一或替代实施例中，一种或多种阴性对照药剂可包含一种或多种选自由以下组成的组的药剂或由一种或多种选自由以下组成的组的药剂组成：1-丁醇；2-氨基苯酚；丙烯酸丙烯酸2-羟乙酯；2-硝基-1,4-苯二胺；4-氨基苯甲酸；氯苯；二甲基甲酰胺；乙基香兰素；甲醛醛；异丙醇；Kathon CG*；水杨酸甲酯；青霉素G；丙二醇；重铬酸钾；高锰酸钾；Tween80；和硫酸锌。
在另一或替代实施例中，在步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达在暴露于测试剂之前和之后，在步骤(a)中提供的细胞中测量，并且其中在暴露于测试剂之前和之后一种或多种生物标志物之间的表达差异指示测试剂的过敏原性和/或敏化作用。因此，步骤(a)中提供的细胞可以提供阴性对照和测试结果。
所谓“不同于在步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达”和“表达的差异”我们包括第一样品(例如，测试剂样品)中的存在和/或量不同于第二样品(例如，对照药剂样品)的存在和/或量。
例如，测试样品中的存在和/或量可以以统计学上显着的方式不同于一种或多种阴性对照样品的存在和/或量。优选地，一种或多种生物标志物在暴露于测试剂的细胞群中的表达为：
小于或等于暴露于阴性对照药剂的细胞群的存在和/或量的80％，例如不超过暴露于阴性对照或阴性对照药剂的细胞群的存在和/或量的79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％；或
暴露于阴性对照药剂的细胞群的存在和/或量的至少120％，例如暴露于阴性对照或阴性对照药剂的细胞群的存在和/或量的至少121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％或至少500％。
所谓“不同于在步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达”，我们可替代地或另外包括将测试样品分类为属于与一种或多种阴性对照样品不同的组。举例来说，在使用SVM的情况下，测试样品在决策阈值(decision value threshold)的另一侧上作为一个或多个阴性对照样品(例如，如果将测试剂分类为蛋白过敏原，如果一个或多个测试(或其复制)的SVM决策值≤0，则一个或多个阳性对照样品(或其大部分)的SVM决策值还应≤0)。
在另一或替代实施例中，根据本发明的任何方面的方法还包含：
f)使根据第一或第二方面的树突状细胞的单独群暴露于在哺乳动物中诱发敏化和/或过敏原性的一种或多种阳性对照药剂；和
g)在步骤(f)的所述细胞中测量在步骤(b)或(c)中测量的所述一种或多种生物标志物的表达
其中步骤(f)中测量的一种或多种生物标志物的表达对应于步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达的情况下，所述测试剂鉴别为敏化剂和/或是过敏的。
在另一或替代实施例中，步骤(f)中提供的一种或多种阳性对照药剂包含一种或多种选自由Der p 1和Der p 7组成的组的药剂或由所述一种或多种药剂组成。
在另一或替代实施例中，一种或多种阳性对照药剂可包含一种或多种选自由以下组成的组的药剂或由所述一种或多种药剂组成：六氯铂酸盐、过硫酸铵、乙二胺、戊二醛、六甲基二异氰酸酯、马来酸酐、亚甲基二苯酚二异氰酸酯、邻苯二甲酸酐、甲苯二异氰酸酯和偏苯三酸酐。
所谓“对应于在步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达”，我们指暴露于测试剂的细胞群中的一种或多种生物标志物的表达与暴露于一种或多种阳性对照药剂的细胞群的表达相同，或不显著不同于暴露于一种或多种阳性对照药剂的细胞群的表达。优选地，一种或多种生物标志物在暴露于测试剂的细胞群中的表达为暴露于一种或多种阳性对照药剂的细胞群的81％和119％之间，例如，大于或等于暴露于一种以上阳性对照药剂的细胞群的82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99，且小于或等于暴露于一种以上阳性对照药剂的细胞群的细胞群的101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％或119％。
所谓“对应于在步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达”，我们可替代地或另外地包括将测试样品分类为与一种或多种阳性对照样品属于同一组。例如，在使用SVM的情况下，测试样品与一种或多种阳性对照样品在决策阈值的同一侧(例如，如果将一种或多种测试剂分类是过敏的如果一个或多个测试(或其复制)将测试试剂归类为敏化物质)的SVM决策值>0，则一个或多个阳性对照样本(或其大部分)的SVM决策值也应>0)。
在另一或替代实施例中，所述方法指示待测试剂的过敏和/或敏化效力。举例来说，与阳性对照和/或与一种或多种另外的测试剂相比，所述方法可以用于预测测试剂的相对过敏和/或敏化效力。
在另一或替代实施例中，所述方法包含以下另外的步骤：
(h)鉴别测试剂的过敏和/或敏化作用。
举例来说，步骤(h)可将测试剂鉴别为过敏原或非过敏原和/或鉴别为敏化剂或非敏化剂。可替代地或另外地，与阳性对照和/或一种或多种另外的测试剂相比，步骤(h)可以鉴别相对过敏原性或过敏效力和/或敏化作用或敏化效力。
可以使用所属领域中已知的任何合适的统计方法或机器学习算法来进行鉴别，诸如随机森林(RF)、支持向量机(SVM)、主成分分析(PCA)、普通最小平方(OLS)、偏最小平方回归(PLS)、正交偏最小平方回归(O-PLS)和其它多变量统计分析(例如后向逐步逻辑回归模型)。关于多元统计分析的综述，参见例如Schervish，Mark J.(1987年11月)。“多变量分析综述(AReviewofMultivariateAnalysis)”,《统计科学(StatisticalScience)》2(4):396-413，其以引用的方式并入本文中。优选地，使用支持向量机(SVM)。
通常，使用支持向量机(SVM)鉴别过敏或敏化剂，例如可购自http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html(例如e1071 1.5-24)。然而，也可使用任何其他合适的手段。SVM也可用于确定包含本文定义的一种或多种生物标志物或由本文定义的一种或多种生物标志物组成的生物标志物特征的ROC AUC。
支持向量机(SVM)是一组用于分类和回归的相关监督学习方法。给定一组训练实例，每个实例标记为属于两个类别之一，SVM训练算法构建模型，所述模型预测新实例是否落入一个类别或另一个类别之中。直观地，SVM模型将实例表示为空间中的点，映射使得单独类别的实例除以尽可能宽的明显空位。然后将新实例映射到同一空间，并基于所述新实例落入的空位的一侧预测属于一个类别。
更正式地，支持向量机在高维或无限维空间中构造超平面或超平面集，其可以用于分类、回归或其他任务。直观地，通过与最近的任何类型训练数据点具有最大距离(所谓的功能容限)的超平面来实现良好的分离，因为通常容限越大，分类器的泛化误差越低。有关SVM的更多信息，参见例如Burges，1998,《数据挖掘和知识发现(DataMiningandKnowledgeDiscovery)》，2:121-167。
在本发明的一个实施例中，在使用已知药剂(即已知过敏/敏化剂或非过敏/非敏化剂)的生物标志物谱进行本发明的方法之前，SVM“经受训练”。通过运行此类训练样品，SVM能够了解何种生物标志物谱与能够诱发过敏和/或敏化的药剂相关。一旦训练过程完成，SVM随后能够预测所测试的生物标志物样品是否来自过敏或非过敏/敏化或非敏化试剂。
本领域技术人员可以根据具体情况确定各个SVM的决策值。在一个实施例中，如果一种或多种测试(或其复制)的SVM判定值＞0，则将测试剂分类为敏化剂和/或敏化剂。在一个实施例中，如果一种或多种测试(或其复制)的SVM判定值≤0，则将测试剂分类为非过敏和/或非敏化剂。这允许将测试试剂分类为过敏或非过敏/敏化或非敏化。
但是，可以通过利用必要的训练参数对SVM进行预编程来绕过这种训练程序。举例来说，基于表A-E中的一个或多个中列出的所有生物标志物的测量值，可以使用WO 2012/056236、WO 2013/160882或WO 2016/083604中所描述的SVM算法根据已知SVM参数鉴别过敏和/或敏化剂。
技术人员应了解，可通过用适当选择数据(即，来自暴露于已知过敏和/或非过敏药剂或敏化和/或非敏化药剂的细胞的生物标志物测量值)训练SVM机来确定表A-E中列出的生物标志物的任何组合的适合的SVM参数。或者，表A-E生物标志物可以用于根据本领域中已知的任何其它适合的统计方法鉴别过敏蛋白和/或敏化剂。
或者，表A-E数据可用于根据所属领域中已知的任何其它合适的统计方法(例如ANOVA、ANCOVA、MANOVA、MANCOVA、多变量回归分析、主成分分析(PCA)、因子分析、矩阵数据分析法、典型相关性分析、典型相关性分析、冗余分析对应性分析(CA；互逆平均化)、多维判别分析、线性判别分析(LDA)、团簇技术体系、递归划分和人工神经网络。
优选地，本发明的方法在活体外进行。
在另一个或替代的实施例中，本发明方法的步骤(b)、(c)、(e)和/或(g)包含以下步骤或由以下步骤组成：测量表A，B，C或E中所列的两种或更多种生物标志物的表达，例如，表A、B、C或E中所列的生物标志物的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、or 391。例如，步骤(b)、(c)、(e)和/或(g)可以包含测量所有在表A、B、C、D或E中所列的生物标志物的表达或由所述步骤组成。
所谓“表达”我们指生物标志物的存在、水平和/或量。
所谓“生物标志物”，我们包括任何生物分子或其组分或片段，对其的测量可提供适用于确定测试剂的敏化作用和/或过敏原性。因此，在表A、B、C、D和E的情形下，生物标志物可以是核酸分子，如mRNA或cDNA。或者，生物标志物可以是由核酸分子或碳水化合物部分编码的蛋白，或其抗原成分或片段。
在第七方面的方法的另一或替代实施例中，测试剂已知为或疑似能够诱发皮肤敏化。举例来说，测试剂可能已知能够通过使用本领域中已知方法(例如，描述于WO 2012/056236和/或Johansson H等人《用于评估化学皮肤敏化剂的GARD分析(The GARD assayfor assessment of chemical skin sensitizers)》中的方法)诱发皮肤敏化。体外毒理学,2013中描述的方法，其以引用的方式并入本文中。在替代性或另外的实施例中，所述方法用于鉴别测试试剂的皮肤敏化物效力和皮肤敏化物/非敏化物状态(即，鉴别测试试剂是否是敏化物并且鉴别其作为皮肤敏化物的效力)。在替代性或另外的实施例中，所述方法包含使用WO2012/056236和/或JohanssonH等人中所描述的方法鉴别测试试剂是否是敏化物。
“皮肤敏化效力”包括或意指试剂的皮肤敏化能力的强度。例如，试剂的敏化能力的相对效力或强度可能引起一组测试试剂的排序从最强效到最不强效或者反之亦然，和/或其可能引起其根据一种或多种已知的规则或系统的分类。“敏化状态”包括或意指化学实体(或化学实体的混合物)是否是敏化物(例如皮肤敏化物和/或呼吸道敏化物)。
所谓“皮肤敏化”，我们指能够在哺乳动物中诱发和触发IV型迟发型超敏反应的任何药剂。优选地，IV型迟发型超敏反应是DC介导的。
在另外或替代性实施例中，通过所述方法测定的皮肤敏化效力根据欧洲分类，标签和包装(EuropeanClassification,LabellingandPackaging，CLP)法规(EC)1272/2008(http://echa.europa.eu/clp-2015)分类。所述系统以联合国全球统一系统(UnitedNations'GloballyHarmonisedSystem，GHS)并且从2015年6月开始，是唯一适用于物质和混合物的分类和标签的立法。其要求公司在将产品投放市场之前对其产品进行适当的分类、标记和包装。其提供以下类别：1A(强)、1B(弱)或无类别(无敏化物)。
例如，所述方法可以提供：
(i)一种或多种效力类别1A的试剂；
(ii)一种或多种效力类别1B的试剂；和/或
(iii)一种或多种效力类别无类别的试剂。
在另外或替代性实施例中，通过所述方法测定的皮肤过敏效力根据Basketter等人,2014,‘根据相关人类皮肤敏化效力的化学物质分类(Categorizationofchemicalsaccordingtotheirrelativehumanskinsensitizingpotency)’,《皮炎(Dermatitis)》,25(1):11-21中所描述的系统分类，即类别1(最强敏化物)、2、3、4、5或6(真正的非敏化物)(例如表4，图4)。
例如，所述方法可以提供：
(i)一种或多种效力类别1的试剂；
(ii)一种或多种效力类别2的试剂；
(iii)一种或多种效力类别3的试剂；
(iv)一种或多种效力类别4的试剂；
(v)一种或多种效力类别5的试剂；和/或
(vi)一种或多种效力类别6的试剂(例如参见本发明的表8和/或Basketter等人,2014,同上)。
在另外或替代性实施例中，根据局部淋巴结分析(LLNA)分类、豚鼠最大化测试(GPMT)或无观察效应水平(NOEL)对皮肤敏化效力进行分类。
有关LLNA的详细说明，参见Basketter,D.A.等入，局部淋巴结分析-验证，实施和实践中使用,《食品化学毒理学》，2002，40(5):第593-8页，其以引用的方式并入本文中。关于豚鼠最大化试验的详细描述，参见Magnusson,B.和A.M.Kligman,通过动物分析鉴别接触过敏原,豚鼠最大化试验,《皮肤病学研究杂志》，1969,52(3):第268-76页，其以引用的方式并入本文中。关于与皮肤敏化物效力相关的无观察效应水平(NOEL)测试的详细描述，参见Basketter等人，2005，‘通过使用现有方法和相关引发因素来评估化学物质的皮肤敏化能力’，《接触性皮炎(Contact Dermatitis)》，52(1):39-43；和Griem，P.等人，2003，‘基于敏化效力数据的皮肤敏化风险评估方法提案(Proposal for a risk assessmentmethodology for skin sensitization based on sensitization potency data)’Regul.Toxicol。和药理学(Regul.Toxicol.Pharmacol.)》,38:269-290，其以引用的方式并入本文中。有关NOEL与效力水平之间的相关性，另请参见WHO图书馆编目出版物数据(WHOLibraryCataloguing-in-PublicationData)，化学风险评估中的皮肤过敏(Skinsensitizationinchemicalriskassessment)(IPCS协调项目文件：第5号)，ISBN9789241563604(特别是第26-28页的表1)，其以引用的方式并入本文中。有关CLP的详细说明，参见(http://echa.europa.eu/clp-2015)，其以引用的方式并入本文中。
在另外或替代性实施例中，在暴露于具有预定效力的皮肤敏化物之前和之后，在步骤(a)中提供的细胞中测量步骤(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达，并且其中在暴露于测试试剂之前和之后，一种或多种生物标志物之间的表达的差异指示步骤(b)的皮肤敏化物的效力。
在另外或替代性实施例中，在暴露于具有预定效力的皮肤敏化物之前和之后，在步骤(a)中提供的细胞中测量步骤(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达，并且其中在步骤(c)之前和之后，一种或多种生物标志物之间的表达的差异指示步骤(b)的皮肤敏化物的效力。
‘表达差异’包括第一样品(例如测试试剂样品)中的存在和/或量不同于第二样品(例如对照试剂样品)中的存在和/或量。优选地，存在和/或量不超过对比样品的40％，例如不超过39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％。
在另外或替代性实施例中，在暴露于测试试剂之前和之后，在步骤(a)中提供的细胞中测量一种或多种生物标志物，并且其中在暴露于测试试剂之前和之后，一种或多种生物标志物之间的表达差异指示步骤(b)的测试试剂的皮肤敏化效力。因此，步骤(a)中提供的细胞可以提供阴性对照和测试结果。
在另外或替代性实施例中，在暴露于测试试剂之前和之后，在步骤(a)中提供的细胞中测量一种或多种生物标志物，并且其中在步骤(c)之前和之后，一种或多种生物标志物之间的表达差异指示步骤(b)的测试试剂的皮肤敏化效力。因此，步骤(a)中提供的细胞可以提供阴性对照和测试结果。
在另外或替代性实施例中，所述方法包括以下其它步骤：
(i)提供根据第一或第二方面的另一树突状细胞群；
(j)将步骤(i)中提供的细胞暴露于具有预定效力的皮肤敏化剂；
(k)在步骤(j)的细胞中测量在步骤(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达；
其中步骤(c)中测量的一种或多种生物标志物与在步骤(k)中测量的一种或多种生物标志物之间的表达的对应性指示测试剂的皮肤敏化效力。
‘表达的对应性’包括第一样品(例如，测试试剂样品)中的存在和/或量与第二样品(例如，对照样品)中的存在和/或量相似或相同。优选地，存在和/或量是对照样品的至少60％，例如至少65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另外或替代性实施例中，所述方法包括以下其它步骤：
(l)鉴别所述测试试剂的皮肤敏化效力。
在另外或替代性实施例中，具有预定效力的皮肤敏化剂包含选自由1-丁醇、4-氨基苯甲酸、苯甲醛、氯苯、邻苯二甲酸二乙酯、二甲基甲酰胺、乙基香草醛、甘油、异丙醇、乳酸、水杨酸甲酯、辛酸、丙二醇、苯酚、对羟基苯甲酸、高锰酸钾、水杨酸、十二烷基硫酸钠、Tween80、硫酸锌、2,4-二硝基氯苯、噁唑酮、重铬酸钾、KathonCG(MC/MCI)、甲醛、2-氨基苯酚、2-硝基-1,4-苯二胺、对苯二胺、己基肉桂醛、丙烯酸2-羟基乙酯、2-巯基苯并噻唑、乙二醛、肉桂醛、异丁子香酚、乙二胺、间苯二酚、肉桂醇、丁香酚、青霉素G、香叶醇和DMSO组成的组的试剂或由其组成。
在本发明的任何方面的方法的优选实施例中，步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)包含或其组成为测量一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。核酸分子可以是DNA分子或cDNA分子或mRNA分子。优选地，核酸分子是mRNA分子。然而，核酸分子可以是cDNA分子。
在一个实施例中，步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中的一种或多种生物标志物的表达的测量是使用选自由南方杂交(Southern hybridisation)、北方杂交(Northernhybridisation)、聚合成酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交组成的组的方法进行。优选地，使用DNA微阵列测量一种或多种生物标志物的表达。
在另一或替代实施例中，使用阵列(例如，DNA阵列)测量在步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中测量的一种或多种生物标志物。在另一或替代实施例中，步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中测量的一种或多种生物标志物使用全基因组阵列(例如，Affymetrix HumanGene 1.0ST阵列或Affymetrix Human Gene 2.0ST阵列)测量。在替代性或另外的实施例中，使用NanostringnCounter系统(例如基于来自全基因组阵列(例如AffymetrixHumanGene1.0ST阵列或AffymetrixHumanGene2.0ST阵列)的选择的定制NanostringnCounter代码集。
所述方法可包含使用一个或多个结合部分测量步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中的一种或多种生物标志物的表达，所述结合部分各自能够选择性结合到编码表A、B、C、D、E中的一个或多个中所鉴别的生物标志物中的一者的核酸分子。优选地，所述方法包含使用两个或更多个结合部分测量步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中两种或更多种生物标志物的表达，所述结合部分各自能够选择性地结合到编码表A、表B、表C、表D、表E中的一个或多个中所鉴别的生物标志物中的一种的核酸分子。举例来说，可使用能够选择性结合到那些生物标志物中的每一者的结合部分的等效组合测量上文所描述的生物标志物的任何特定组合的表达。
在一个实施例中，所述一个或多个结合部分各自包含核酸分子或由核酸分子组成。在另一实施例中，所述一个或多个结合部分各自包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO或由其组成。优选地，所述一个或多个结合部分各自包含DNA或由DNA组成。在一个实施例中，所述一个或多个结合部分的长度是5到100个核苷酸。然而，在替代性实施例中，其长度是15到35个核苷酸。
所述一个或多个结合部分可以包含来自HumanGene1.0STArray(Affymetrix,SantaClara,CA,USA)的一种或多种探针或由其组成。探针鉴别号在本文的表A-E中提供。
可以基于其结合既定核酸、蛋白或氨基酸主结构的能力从文库中选择或筛选合适的结合剂(也称为结合分子或结合部分)，如下所述。
在优选实施例中，结合部分包含可检测部分。
“可检测部分”包括允许直接或间接测定其存在和/或相对量和/或位置(例如阵列上的位置)的部分。
合适的可检测部分是所属领域中众所周知的。
例如，可检测部分可以是在暴露于特定条件时可以检测的荧光和/或发光和/或化学发光部分。这类荧光部分可能需要以特定波长和强度暴露于辐射(即光)以引起荧光部分的激发，从而使其能够在可检测的特定波长下发射可检测荧光。
或者，可检测部分可以是能够将(优选不可检测的)底物转化成可以可视化和/或检测的可检测产物的酶。在下文中关于例如ELISA测定更详细地论述合适的酶的实例。
可检测部分可以是放射性部分，并且包含放射性原子或由放射性原子组成。放射性原子可选自由以下组成的组：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。
因此，可检测部分可以选自由以下组成的组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如放射性原子)；或酶部分。
显然，待检测的试剂(例如本文中所述的测试样本和/或对照样本中的一种或多种生物标志物和/或用于检测所选蛋白的抗体分子)必须具有足够的适合的原子同位素以便使可检测部分易于检测。
在替代性优选实施例中，结合部分的可检测部分是荧光部分。
可以按已知的方式将放射性标记或其它标记并入本发明方法的样品和/或本发明的结合部分中存在的生物标志物中。例如，如果结合剂是多肽，则其可以是生物合成的，或者可以通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体合成，所述氨基酸前体包括例如氟-19代替氢。例如，如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In等标记可以通过结合部分中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基附接。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80，49-57)可以用于并入123I。参考文献“(免疫闪烁成像中的单克隆抗体(MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy)”,J-FChatal,CRCPress,1989)详细描述其它方法。用于使其它可检测部分(如酶促、荧光、发光、化学发光或放射性部分)与蛋白结合的方法是所属领域中众所周知的。
所属领域的技术人员将理解，待测试样品中的生物标志物可以用间接有助于测定所述蛋白的存在、量和/或位置的部分标记。因此，所述部分可以构成多组分可检测部分的一个组分。例如，待测试样品中的生物标志物可以用生物素标记，这允许其随后使用融合或以其它方式连接到可检测标记的链霉抗生物素蛋白进行检测。
在步骤(c)中，本发明的第一方面提供的方法可以包含测定表A中定义的一种或多种生物标志物的蛋白的表达或由其组成。所述方法可包含使用一个或多个结合部分测量步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中的一种或多种生物标志物的表达，所述结合部分各自能够选择性结合到表A-E中的一或多戈中鉴别的生物标志物中的一种。所述一个或多个结合部分可以包含抗体或其抗原结合片段或由其组成，例如单克隆抗体或其片段。
术语“抗体”包括任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交物，如(但不限于)通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变区和/或恒定区的噬菌体呈现产生的单链抗体分子，或所属领域技术人员已知的能够以免疫分析形式结合抗原的其它免疫活性分子。还包括使用抗体样结合剂，如亲和抗体和适体。
一种或多种蛋白结合部分可以包含可检测部分。可检测部分可以选自由以下组成的组：荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分和酶部分。
在本发明的方法的另一个实施例中，步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)可以使用包含能够结合到一种或多种蛋白的第二结合剂的分析法进行，所述第二结合剂还包含可检测部分。以上关于第一结合剂详细描述了合适的第二结合剂。
因此，可以首先使用第一结合剂分离和/或固定待测试样品中的相关蛋白，随后可以使用第二结合剂测定所述生物标志物的存在和/或相对量。
在一个实施例中，第二结合剂是抗体或其抗原结合片段；通常是重组抗体或其片段。便利地，抗体或其片段选自由以下组成的组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结构域。或者，第二结合剂可以是抗体样结合剂，如亲和抗体或适体。
或者，当待测试的样品中蛋白上的可检测部分包含特异性结合对(例如生物素)的成员或由其组成时，第二结合剂可以包含特异性结合对的互补成员或由其组成(例如链霉抗生物素蛋白)。
在使用检测分析的情况下，优选可检测部分选自由以下组成的组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶部分。以上描述了用于本发明方法中的合适的可检测部分的实例。
用于检测血清或血浆蛋白的优选测定包括酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫辐射测量测定(IRMA)和免疫酶促测定(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定。例示性夹心测定由David等人在美国专利第4,376,110号和第4,486,530号中所描述，其以引用的方式并入本文中。载玻片上细胞的抗体染色可用于细胞学实验室诊断测试中熟知的(如本领域技术人员熟知的)方法中。
因此，在一个实施例中，分析是ELISA(酶联免疫吸附分析)，其通常涉及使用产生有色反应产物的酶，通常在固相分析中。已经广泛使用如辣根过氧化物酶和磷酸酶等酶。扩增磷酸酶反应的一种方式是使用NADP作为底物以产生NAD，其现充当第二酶系统的辅酶。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供良好的结合物，因为酶不存在于组织中、稳定并且产生良好的反应颜色。也可以使用基于酶(如荧光素酶)的化学发光系统。
经常使用与维生素生物素的结合，因为这可以通过其与酶连接的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的反应容易地检测到，其以极大的特异性和亲和力与其结合。
在替代性实施例中，用于蛋白检测的分析宜是荧光分析。因此，第二结合剂的可检测部分可以是荧光部分，如Alexa荧光团(例如Alexa-647)。
优选地，使用阵列进行方法的步骤(b)(c)、(e)、(g)和/或(k)。阵列可以是基于珠粒的阵列或基于表面的阵列。所述阵列可以选自由以下组成的组：宏阵列；微阵列；纳米阵列。
阵列本身在所属领域中是众所周知的。通常，其由线性或二维结构形成，所述线性或二维结构具有间隔开的(即离散的)域(“斑点”)，每个域具有有限面积，形成在固体支持物的表面上。阵列也可以是珠粒结构，其中每个珠粒可以通过分子代码或颜色代码鉴别或以连续流动鉴别。还可以顺序进行分析，其中样本通过一系列斑点，每个斑点从溶液中吸附一类分子。固体支持物通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可呈以下形式：管状物、珠粒、盘状物、硅片、微孔板、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、硝化纤维素膜、尼龙膜、其他多孔膜、无孔膜(尤其例如塑料、聚合物、有机玻璃、硅)、多个聚合物针或多个微量滴定孔，或任何其他适用于固定蛋白、多核苷酸和其他合适分子和/或进行免疫测定的表面。结合过程在所属领域中是众所周知的，并且通常由交联共价结合或物理吸附蛋白分子、多核苷酸等与固体支持物组成。或者，可以使用通过亲和标签或类似构筑体进行的探针的亲和偶合。通过使用众所周知的技术，如接触或非接触印刷、掩模或光刻，可以界定每个点的位置。关于评论，参见R.E.,Pennington,S.R.(2001,蛋白组学(Proteomics),2,13-29)和Lal等人(2002,当代药物研究(DrugDiscovToday)15；7(增刊18):S143-9)。
通常，阵列是微阵列。“微阵列”包括具有至少约100/cm2，优选至少约1000/cm2的离散域密度的域阵列的含义。微阵列中的域具有典型的尺寸，例如直径，在约10-250μm之间的范围内，并且以相同的距离与阵列中的其它域分隔。或者，阵列可以是宏阵列或纳米阵列。
一旦鉴别和分离了合适的结合分子(如上所论述)，技术人员可以使用分子生物学领域中熟知的方法制造阵列。
在另一或替代实施例中，在步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中测量的一种或多种生物标志物为核酸(例如DNA、mRNA或cDNA等)。在另一或替代实施例中，在步骤(b)、(c)、(e)、(g)和/或(k)中测量的一种或多种生物标志物为蛋白或多肽。
在另外或替代实施例中，所述方法在活体外、活体内、活体外或计算机内进行。优选地，所述方法在活体外进行。
在另一或替代实施例中，所述方法包括以下步骤中的一个或多个：
(i)根据所述第一或第二方面培养树突状细胞；
(ii)优选地在稳态生长阶段，例如一个或多个多孔分析板的孔，将(i)的细胞接种于一个或多个孔中；
(iii)向(ii)的一个或多个孔中添加待测试剂；
(iv)向(ii)的一个或多个单独孔中添加阳性对照；
(v)向(ii)的一个或多个单独孔中添加(i)阴性对照；和/或使(ii)的一个或多个单独孔不受刺激以获得培养基对照物；
(vi)将细胞在(iii)-(v)的孔中培育，优选约24小时；并且任选地，从(iii)-(v)的孔中收集细胞；并且进一步任选地，去除上清液并且将其储存于TRIzol试剂中；
(vii)从(vi)的细胞分离经纯化的总RNA，并且任选地将mRNA转化成cDNA；
(viii)例如使用阵列，如Affymetrix Human Gene 1.0ST阵列，定量来自(vii)的个别mRNA转录物的表达水平；
(ix)例如使用适当算法，从(viii)导出和规范化数据；
(x)从来源于表A-E中的一个或多个的生物标志物的(ix)分离数据；
(xi)将预测模型应用于(x)的数据，例如先前建立和训练的冷冻的SVM模型，以预测测试剂和阴性/阳性对照的过敏原性或敏化剂状态(例如，分类为过敏原/非过敏原和/或敏化剂/非敏化剂)。
所谓“测试蛋白”，我们包括确定过敏原性或敏化状态的任何蛋白或蛋白实体(或蛋白或蛋白实体的混合物)。
所谓“过敏”，我们在哺乳动物中包括或意指为过敏原和/或能够诱发过敏反应的蛋白(或蛋白的混合物)。
在另一或替代实施例中，过敏原性包含超敏反应(例如，细胞介导的超敏反应)。在另一或替代实施例中，超敏反应为I型超敏反应。在另一或替代实施例中，超敏反应为呼吸过敏。
在另一或替代实施例中，第八方面的方法用于鉴别哺乳动物中的蛋白的敏化状态。举例来说，在步骤(b)或(c)中测量的一种或多种生物标志物的表达可以指示测试蛋白的敏化状态。所谓“敏化状态”，我们包括或不包括测试蛋白(或测试蛋白的混合物)是否为敏化剂(例如，皮肤敏化剂和/或呼吸道敏化剂)。在另一或替代实施例中，所述方法用于鉴别能够在哺乳动物中诱发呼吸道敏化的蛋白。举例来说，在步骤(c)中测量的两种或更多种生物标志物的表达可以指示测试蛋白的呼吸道敏化作用。在一个实施例中，所述方法用于鉴别能够诱发呼吸超敏反应的蛋白。优选地，超敏反应为体液超敏反应，例如I型超敏反应。在一个实施例中，所述方法用于鉴别能够诱发呼吸过敏的药剂。
所谓“指示测试蛋白的呼吸道敏化作用”，我们包括确定测试蛋白是否为呼吸道敏化剂和/或确定测试蛋白作为呼吸道敏化剂的效力。所谓“能够诱发呼吸道敏化的蛋白”，我们指能够诱发和触发哺乳动物的呼吸道中I型立即超敏反应的任何蛋白。优选地，哺乳动物为人类。优选地，I型立即超敏反应是DC介导的和/或涉及T细胞分化到Th2细胞中。优选地，I型立即超敏反应产生体液免疫性和/或呼吸道过敏。
哺乳动物肺的传导区含气管、支气管、细支气管和末端细支气管。呼吸区含呼吸细支气管、肺泡管和肺泡。传导区由气道组成，与血液之间没有气体交换，并通过软骨加固以保持气道畅通。传导区将吸入的空气加湿并将其加热到37℃(99°F)。它还通过经由位于所有通道壁上的纤毛去除颗粒来净化空气。呼吸区是与血液进行气体交换的场所。
在一个实施例中，“能够诱发呼吸道敏化”的蛋白是能够在哺乳动物的肺上皮部位诱发和触发I型立即超敏反应的蛋白。优选地，肺上皮部位在肺的呼吸域中，但是可以可替代地或另外地在肺的传导区中。
在另一个或替代的实施例中，所述方法用于鉴别哺乳动物中敏化的食物蛋白。例如，在步骤(c)中测量的两种或更多种生物标志物的表达可以指示食物蛋白的敏化。优选地，食物蛋白的敏化归因于1型超敏反应。
哺乳动物可为任何家养或农场动物。优选地，哺乳动物是大鼠、小鼠、豚鼠、猫、狗、马或灵长类动物。最优选地，哺乳动物是人。
在本发明的另一方面，提供了根据第一或第二方面的树突状细胞群在确定测试剂的敏化作用和/或过敏原性中的用途。
在本发明的另一方面，提供了一种分析试剂盒，其包括：
i.包含一个或多个结合部分的阵列；和
ii.一个或多个第一或第二方面所定义的细胞或细胞培养物；和
iii.(任选地)一种或多种对照药剂；和
iv.(任选地)使用说明。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于本发明方法的分析试剂盒，其包含：
i.包含一个或多个如本文所定义的结合部分的阵列；和
ii.第一或第二方面所定义的一个或多个细胞或细胞培养物；和
iii.(任选地)一种或多种对照药剂，
iv.(任选地)用于进行本发明的方法的说明书。
技术人员将理解，可以组合使用所有非冲突的实施例。因此，根据本发明的一个方面的实施例可同等地应用于本发明的另一方面。
在本说明书中对明显先前已出版文献的列举或论述未必应视为承认所述文献是目前先进技术的一部分或是公共常识。
附图说明
现在将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选、非限制性实施例：
图1.不同表面标记物的表达水平用于分级集群以比较细胞系。标签中的数字代表实验。团簇组将细胞分为两个单独的团簇。
图2.SenzaCell；与预测受独特变体的较高或适度影响的基因相关的生物过程的分布。
图3.MUTZ-3；与预测受所鉴别的变体的较高或适度影响的基因相关的生物过程的分布。
图4.A)RNA-seq数据的分级集群展示出实验3处所获得的样本的单独团簇。来自实验1和实验2的细胞形成细胞系的单独团簇。B)样品的PCA曲线展示出最大变化来源可以通过细胞系之间的差异解释。同样清楚的是，实验3制备的样品与其余样品有所不同。
图5.饼图表示使用PANTHER发现的不同表达基因(DEG)映射到分子功能的分布。
图6.当在用测试化学物质DNCB和丙烯酸2-羟乙酯刺激之后，使用获自MUTZ-3和SenzaCell的表达值时，SVM皮肤敏化剂预测。所有预测正确地对应于真实类别。
具体实施方式
实例1
论述
过敏接触性皮炎(ACD)为影响大部分群的发炎性皮肤病。它是由反复接触皮肤敏化剂引起的，并导致诸如湿疹的症状。ACD的敏化阶段需要一种皮肤敏化剂来激活免疫反应导致产生过敏原特异性效应子和记忆T细胞(1)。敏化已知机制已有很好地描述(1-4)。简单地说，皮肤敏化剂能够到达活性真皮，其中其与蛋白反应以形成半抗原蛋白复合物。这些半抗原蛋白复合物可以由施加发炎信号的不同免疫细胞或结构细胞鉴别。活化的树突状细胞处理半抗原蛋白复合物并且迁移到淋巴结，其中其将其呈现给MHC分子上的原初T细胞。随后，在重新暴露于相同敏化剂时，产生效应子和记忆T细胞，引发发炎功能，产生ACD(3)症状。用于评估在皮肤接触下诱发过敏反应的化学物质的常规方法主要使用动物模型(1)进行。立法和趋势驱动研究，使得用于评估化学敏化剂(5-7)的较好和更多的活体外方法出现。
基因组过敏原快速检测(GARD)为研发于隆德大学免疫技术部门(Department ofImmunotechnology)的用于化学增敏剂的评估的活体外分析。其使用来自树突状细胞系(8)的转录谱来预测化学物质(9)的敏化潜力。转录谱由鉴别为在区分敏化剂与非敏化剂中具有最大预测性能的基因组成。使用对来源于Affymetrix微阵列的转录数据的统计数据挖掘方法鉴别基因。GARD预测特征(GARD Prediciton Signature，GPS)中的基因的先验信息不用于其鉴别，其可已经使得对细胞系(10)具有特异性的特征。
本发明人现在提供适于在GARD分析中使用的非天然存在的树突状骨髓性白血病细胞系GMP(ATCC专利保藏号PTA-123875；于2017年3月9日保藏于ATCC处)。SenzaCell已与也可用于GARD方法中的MUTZ-3树突状细胞系比较。比较包括比较一组生物标志物的表达的表型分析、比较细胞系的转录水平的转录分析、其DNA序列与功能分析的比较，其揭示表型和转录谱的许多可定量差异且在GARD分析中展示共享功能性。
材料和方法
细胞维持
MUTZ-3(DSMZ，德国布伦瑞克(www.dsmz.de；DSMZ No.ACC 295))和树突状细胞在补充有20％(V/V)胎牛血清(FCS)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和40ng/ml颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)的最小基本培养基α(α-MEM)(GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT)中培养。在整个报告中，所述培养基称为完整培养基。将细胞维持于200 000个细胞/毫升的浓度下并且每3到4天更新培养基。将细胞维持在37℃和5％CO2下。
表型表征
收集生长细胞，计数并且在完全培养基中在200 000个细胞/毫升的浓度下接种。为了制备用于染色的细胞，将1ml细胞悬浮液转移到FACS管中。将细胞在具有1％BSA(Saveen&Werner，Limhamn，Sweden)(w/V)的洗涤缓冲液PBS(GE Healthcare LifeSciences)中洗涤两次。通过添加1ml洗涤缓冲液、在1200rpm下在4℃下离心并且去除上清液来进行所有洗涤步骤。在第二次洗涤之后，将细胞再悬浮于50μl洗涤缓冲液中。将抗体；同型PE/FITC、CD40FITC、CD54 PE、CD86 FITC(BD Pharmingen，San Diego，CA)；CD1a FITC、CD5 FITC、CD14 PE、CD19 PE(DAKO)；CD13 PE、CD123 PE、OX40L PE(Pharmingen，SanDiego，CA)；CD11b PE、CD34 FITC、CD32 FITC、CD80 PE、HLA-DR FITC、CD137 PE、CD16 PE、CD64 PE(BD，Franklin Lakes，NJ)；BDCA-3APC(Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)；CD209 PE(R&D Systems，Minneapolis，MN)；BDCA-1APC(eBioscience，San Diego，CA)；OX40PE(BD Bioscience，San Jose，CA)；CD15 FITC(Milteny)；TLR2 PE，TLR4 PE(biolegend，San Diego，CA)添加到再悬浮细胞中并且在4℃下在黑暗中培育15分钟。在染色之后，细胞在洗涤缓冲液中洗涤一次，并且然后再悬浮于200μl洗涤缓冲液中。将细胞保持在4℃中直到用流式细胞测量术分析。在具有BD DIVA软件(BD Bioscience)的FACS CANTO II(BDBioscience)上进行流式细胞测量术作为数据获取程序，其中对于每一样品记录10 000个事件。使用FACS Express V3(De Novo软件，Los Angeles，CA)分析数据。使用同型对照和未染色的细胞设置适当栅极。在三个单独实验中进行测量，其中在每个实验中，产生每个标记和细胞系的6个测量值。
使用t检验比较表达水平，其中用本亚明霍赫贝格方法(Benjamini Hochbergmethod)校正所产生的p值以控制错误发现速率。进行团簇算法以比较细胞系。使用R(15)进行团簇。进行引导算法以使用fpc(16)软件包来评估所发现的团簇的稳定性。针对5000迭代运行自举算法，且将所计算的平均杰卡德系数(Jaccard coefficients)用作团簇稳定性的指示。
DNA-全基因组测序
使用Quick-gDNATM Miniprep(Zymo Research，Irvine CA)分离来自MUTZ-3和SenzaCell细胞的DNA。分离如下进行；收集5*10^6个细胞并且离心并且去除上清液。将剩余的细胞团溶解于Quick-gDNATM基因组溶解缓冲液中并且培育10分钟。将溶解的细胞装载到提供的离心柱并洗涤。DNA在无RNAse/DNase的水中洗脱。使用NanoDrop测定DNA浓度和DNA纯度，并通过凝胶电泳评估其质量。DNA全基因组测序由SciLifeLabs(Stockholm，Sweden)进行。来自SciLifeLabs的服务包括库制备、测序和最佳实践基本分析。DNA库用Illumina无TruSeq PCR，350bp制备，并且测序在30×覆盖度下用Illumina HiSeq X v2.5，PE 2x150bp进行。
最佳实践基础分析包含使用bwa-mem将读数映射到人体组合件构建37。遵循用于最佳实践分析的基因组分析工具包(GATK)工作流程(17、18)以用于变异呼叫(variantcall)，并且基因组变异呼叫格式(genomic variant call format，gVCF)文件从SciLifeLabs传递出。合并所获得的gVCF文件并且使用GATK基因型GVCFS对其进行基因分型。如GATK工作流程所推荐，使用GATK变体质量分数再校准(Variant Quality ScoreRecalibration，VQSR)进一步处理变体。VQSR使用机器学习计算新变体质量分数和过滤预测为假阳性发现的变体。标注经再校准的变异呼叫格式(VCF)文件，且使用到人体组合件构建GRCh37.75的snpEff(19)预测变体作用。使用SnpSift(20)对照(casecontrol)鉴别对细胞系中的任一个独特的变体，且使用SnpSift过滤器过滤其它变体。通过其基因型质量分数进一步过滤独特变体的清单，去除分数<20的变体(21)。最终保留预测具有较高或中等影响的变体用于进一步分析。PANTHER分类系统(22)用于分类鉴别为受变体影响的基因的分子功能。
RNA-RNAseq
在三个实验中，将总RNA从MUTZ-3和SenzaCell细胞系分离，产生一式三份RNA样品。将200,000个细胞分离并且溶解于TRIzol reagent试剂(Thermo Scientific，Waltham，MA)中。使用Direct-zolTM RNA Miniprep(Zymo research)分离RNA。将溶解的样品与乙醇混合且添加到旋转柱。RNA经结合且用所供应的洗涤缓冲液洗涤。RNA在无RNA酶/DNA酶的水中洗脱，且用Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)控制质量。将样品在-80℃下储存直到在干冰装运到SciLifeLabs以用于RNA-seq为止。使用Illumina HiSeq快速模式v2，SR 1x50bp进行测序。通过UNK LifeLabs进行最佳实践基础分析，其包含使用topHat v2.0.4(23)对读数进行映射、用samtools(24)对所产生的bam文件进行分拣、用piccard工具标记复制和使用HTSeq(25)定量计数。
将所获得的计数表加载到R中，且使用edgeR v3.14.0(26)和DESeq2 v1.12.4(27)进行差异表达分析，其对计数数据进行负二项模型的规范化和拟合，从而实现有效的差异表达分析。对两个软件包遵循所推荐的差异表达(DE)分析工作流程。由于在分析样品的PCA图时发现了批次效应，用于假设测试的模型矩阵经设计以将实验批次并入模型中。如果edgeR和DESeq两者都被视为以低于0.05的错误发现速率显著差异地表达，那么认为转录物有差异地表达。使用PANTHER分类系统分析所鉴别的转录物映射到的分子功能和生物过程。为了鉴别在差异表达的转录物当中过度表示或表示不足的基因本体(GO)项，还使用PANTHER进行过度表示测试。提交背景参考列表作为在计数表中获得的所有非零计数，其为输入到DE分析中的相同列表。所鉴别出的GO项的p值已使用Bonferroni方法进行了校正。认为校正后的p值低于0.05的GO项明显过高或过低。另外，使用信号传递通路影响分析v2.24.0(SPIA)(28)和KEGG通路(29、30)发布79.0。通过伴随的log2倍数变化值输入显著DE转录物的清单，并且所有非零转录物作为背景输入。使用DESeq2 v1.12.4计算log2倍数变化值。
最后，对表型分析和RNA-seq分析的结果进行了一致性分析。将对应于所测量的表面标记的基因与表面标记的表达进行比较。所进行的比较类似于对分类进行评估，其中所述类别显著上调/表达、显著下调/表达或两个细胞系之间无显著差异。因此，如果RNA-seq分析和表型分析都认为转录水平或表面表达明显较高，则将其视为一致的结果。CohensKappa(31)计算为分析方法之间的一致性的指示。
功能分析
相比于SenzaCell，在GARD分析中使用MUTZ-3来评估其使用GARD预测标志区分皮肤敏化剂与非敏化剂的能力。遵循先前已详细地描述的GARD标准操作程序(9)。简单地说，以1.8ml的体积和222,000个细胞/ml的细胞浓度将细胞(MUTZ-3或SenzaCell)接种于24孔培养板中。用于刺激的化学物质为(2,4)-二硝基氯苯(DNCB)和丙烯酸2-羟乙酯。还包括未刺激样品作为阴性对照。将DNCB溶解于DMSO中，达到4mM的浓度，和将丙烯酸2-羟乙酯溶解于水中，达到100mM的浓度。然后在补充有20％FCS 100X的α-MEM中，将两种化学物质稀释，并且最后在将200μl添加到孔中时再以超过10倍稀释一次。对于DNCB和丙烯酸2-羟乙酯，用于刺激的孔中浓度分别为4μM和100μM。将200ml MEM-α添加到未受刺激的细胞中，得到每一样品200,000个细胞/ml的孔中细胞浓度。在37℃下在5％CO2下将细胞与化学物质一起培育24小时。在培育之后，将细胞收集到无RNase的艾本德试管(Eppendorf tube)中，并且溶解于TRIzol中。通过使用碘化丙锭(PI)(Thermo Fisher Scientific)染色的流式细胞测量术评估细胞活力。提取RNA并且使用Direct-zol RNA试剂盒(Zymo research)纯化。如所述提取RNA并且使用具有RNA完整性编号(RIN)≥8的Agilent Bioanalyzer 2100样品和≥20ng/μl的RNA浓度控制质量以用于定量。使用由制造商供应的方案和试剂，使用NanoStringnCounter系统(NanoString Technologies，Seattle，WA)定量GPS中的基因(参见以下表A)。基因的原始计数从NanoString导出且通过每总计数一计数标准化，其中每一基因计数除以单一样品的计数的总和。通过来自R包装e1071(32)的支持向量机，用由重复的40个化学刺激物的基因谱(10)组成的训练集进行分类。通过计算两个数据集中未受刺激样本的前4个主成分的偏移，将数据与分类之前的训练数据对齐。然后将计算出的偏移用于调节测试样本中的每个样本。
在WO 2012/056236；Johansson等人(2017)在匿名欧洲化妆品研究中评估GARD分析(Evaluation of the GARD assay in a blind Cosmetics Europe study)中还详细描述了使用GARD预测特征来区分皮肤敏化剂和非敏化剂的方法。ALTEX在线首先在2017年2月17日；Forreryd等人(2016)从全基因组阵列到定制生物标志物的读出--用GARD进行的皮肤敏化化学物质的常规分析进展(From genome-wide arrays to tailor-made biomarkerreadout-Progress towards routine analysis of skin sensitizing chemicals withGARD)。活体外毒物学(Toxicolgy In Vitro)；Johansson等人(2014)，GARD室内验证——概念的证明。Tox Sci；Johansson等人，(2011)基因组生物标志物特征可使用基于细胞的活体外替代动物测试来预测皮肤敏化剂(A genomic biomarker signature can predict skinsensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests)。BMCGenomics，2011)，每个均通过引用并入本文。
表A
表A-A
表A-B
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表A图例.基因注释，使用来自Affymetrix(www.affymetrix.com，Santa ClaraUSA)NetAffx数据库。找到后，选择Unigene(www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)ID作为基因标识符。在未报告UnigeneID的情况下，给出了最佳替代ID。
结果
表型分析
为了研究SenzaCell中与MUTZ-3相比较的表型差异的任何指示，在两个细胞系中测量表面标记物的组(表1)的表达。所选择的表面标记物与树突状细胞、骨髓细胞、造血细胞或细胞活化相关。计算正细胞的群，且使用t检验对群大小进行比较。在所测量的26个表面标记物中，当考虑到假发现速率<0.05显著时，12在细胞系之间显著差异地表达，参见表1中的阴影行。差异表达的表面标记物的CD1a、CD11b、CD14、CD34、CD15、CD32、CD40、CD54、HLA-DR、CD64、铎样受体(TLR)4和TLR-2。然而，CD54的表达在细胞系中几乎相同，并且接近可获得的最高值，应谨慎解释。如果检测到表面标记，则所述表达也被认为是二进制，+，否则为-。在细胞系之间，表面标志物的二进制表达非常相似。唯一显示出不同二进制表达的表面标记是CD80，可能还有OX40L。进一步比较细胞系，见图1进行分级聚类算法。团簇将MUTZ-3和SenzaCell分为2个单独的团簇。使用带有重采样的自举算法来评估已鉴别团簇的稳定性。SenzaCell和MUTZ-3的平均杰卡德系数分别确定为0.85和0.89，这表明团簇稳定。
表1.
表1.对于SenzaCell和MUTZ-3测定生物标志物组的表达。表达值以平均阳性细胞百分数±标准差的形式给出。进行T检验以比较表达值的平均值。使用BenjaminiHochberg校正对p值进行校正。绿色阴影行(着重阴影部分)表示校正p值低于0.05的标记(acorrected p-value below 0.05)。所述计算基于生物学三份重复的6次测量。表面表达的二进制表示形式如果表达，表示为+，或如果不表达，表示为-。给出了表面标记的相应基因的表达，显示了如果显著不同则显示最高表达的细胞系。由于其复杂的遗传，在RNA表达柱中未报告HLA-DR：
全基因组测序
进行全基因组测序以鉴别SenzaCell和MUTZ-3之间遗传差异的指标。指标可以通过仅在任一细胞系中发现的变体来表示。研究的变体由单核苷酸多态性(SNP)，插入或缺失组成。在SenzaCell和MUTZ-3细胞系中发现的原始变体数量分别为5,080,918和5,073,307。将gVCF文件合并并进行基因分型，并重新校准输出的VCF文件中的变体质量得分。筛选出质量得分较低的变体，并将其从进一步的分析中删除。对于两种细胞系，细胞系基因组和参考基因组之间的相似度经计算为99.86％，导致每约720bp的变体频率为1。通过找到一个细胞系具有已鉴别的变体而另一细胞系与参考基因组纯合的位置来鉴别任一细胞系的独特变体。通过对基因型质量得分进行过滤，进行进一步的过滤以去除纯合子确定性较低的变体。获得的变体列表由只能在SenzaCell中找到的7,977个变体和MUTZ-3细胞系独有的5,672个变体组成。尽管变体列表已大大减少，但仍需进一步过滤以鉴别可能对细胞产生影响的突变。因此，将变体过滤以去除低影响突变。表2可见被预测对SenzaCell有高或中等影响的突变，表3可见经鉴别的MUTZ-3变异。在SenzaCell中发现了14个符合上述标准的变体，在MUTZ-3中发现了28个。预期的影响范围从氨基酸取代到更严重的突变，例如获得新的终止密码子或剪接位点变化。的生物过程即是由变体影响的基因可以被映射到使用PANTHER确定，见图2和图3。
最后，进行类似的过滤策略以确定可以在细胞系中鉴别的常见变体的数量，从而鉴别出4,298,116个变体。
表2.
表2.仅在SenzaCell(S)中发现的独特变体，预测具有较高或中等的作用。使用snpEff确定了预测作用。基因：已鉴别出受变异影响的基因，CHR：称为变异的染色体，位置：变异在染色体上的位置，影响：预测的变异影响，预测作用：由snpEff预测的影响，X-GQ：各细胞系基因型质量的基于Phred的质量得分。
表3.
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表3.仅在MUTZ-3(M)中发现的独特变体，预测具有较高或中等的作用。使用snpEff确定了预测作用。.基因：已鉴别出受变异影响的基因，CHR：称为变异的染色体，位置：变异在染色体上的位置，影响：预测的变异影响，预测作用：由snpEff预测的影响，X-GQ：各细胞系基因型质量的基于Phred的质量得分(Phred based quality score for genotypequality for respective cell line)。
RNA序列分析
比较细胞系的转录组以评估正常生长期间的细胞状态并鉴别它们之间的任何差异。通过创建样本的PCA图并进行分级聚类分析，图4进行的数据的初始分析。PCA图表明批次效应的存在，因为与前两个实验的样品相比，实验3的样品在第2主成分中显示出偏差值。来自实验3的样本还在分层聚类中形成了一个单独的聚类，这进一步加强了批处理效应影响数据的观察。从前两个实验获得的样品似乎更相似，并且来自同一细胞系的样品形成了单独的组和团簇。EdgeR和DESeq用于搜索细胞系之间差异表达的转录本，其中设计了广义线性模型以说明观察到的批次效应。经鉴别，有3644个转录本显着差异表达(列于补充表1中)。使用PANTHER将鉴别的转录本定位到分子功能和生物学过程(图3)。大多数的成绩单被映射到分子功能催化活性和结合以及生物过程的细胞和代谢过程。然后进行过表达测试，以调查DE成绩单中是否有任何生物学过程明显不足或过表达。94个GO术语被确定为统计学上不足或过高，且Bonferroni校正后的p值低于0.05，请参见补充表2。为了进一步了解细胞系之间的差异，还进行了拓扑途径分析。通路分析发现，与SenzaCell相比，MUTZ-3中有19条激活和2条抑制的信号通路，表4。
在GPS中选择的基因的调节对于GARD分析中敏化剂和非敏化剂的鉴别和分离非常重要。因此，将GPS中的基因与DE转录本进行比较，结果表明在两个列表中都发现了43个转录本。这表明GPS中几乎22％的基因在细胞系之间差异表达。
在表型结果与RNA-seq数据之间进行比较，以研究分析方法，并可能使结果更具有效性。在一致性分析中比较了生物标志物组及其相应的基因。进行比较是对分类任务的评估，与SenzaCell相比，MUTZ-3中的组明显更高，明显更低或没有差异。所述分析导致0.44CohensKappa值为，提示这两种方法之间的一致性，看到表达为在表1每个标记。在RNAseq分析中，表达增加的10个表面标记物中有8个也表达增加。CD54显示MUTZ-3中的基因表达增加，与表面标志物表达相反。TLR2的基因不被称为差异表达。14个表面标记中的8个没有被称为显着标记，也没有差异表达的基因。然而，发现其余6种标记的基因表达水平是差异表达的。CD34是唯一被发现在转录水平和表面表达上均在MUTZ-3中具有明显较低表达水平的标记。HLA-DR由于其复杂的遗传学而被排除在这一比较之外。
表4
表4.使用Bonferroni方法p值校正之后的自SPIA的显著不同信号通路。SPIA计算的全局p值同时考虑了所述通路中受影响的基因数量和信号通路的扰动。
功能分析
MUTZ-3和SenzaCell在化学暴露后分析GARD预测特征(GPS)中基因表达的能力时，通过使用完善的测定工作流程中的细胞来评估其区分皮肤敏化剂的能力。丙烯酸丙烯酸2-羟乙酯和DNCB被用于刺激细胞，未刺激的样品被用作阴性对照。对RNA进行定量，并使用在SenzaCell的遗传谱上训练的SVM模型对样品进行分类。使用MUTZ-3和SenzaCell将化学物质正确分类为敏化剂，将未刺激的样品正确分类为非敏化剂，图6。此外，MUTZ-3与使用SenzaCell获得的预测模式相似，其中丙烯酸丙烯酸2-羟乙酯的预测值比DNCB高的预测模式。
论述
过敏接触性皮炎是一种患病率不断上升的疾病，给社会造成巨大的代价。与皮肤的敏化剂的接触可触发免疫反应的攻击的化学和生物分子之间形成的复合物，导致对健康组织的攻击(1)。评估化学品诱发ACD的能力对于减少受ACD影响的人数非常重要。敏化测试的金标准，局部淋巴结测定(LLNA)(33)，依靠动物试验和活体外测定法正在被淘汰由更多的道德(6、7、34)。GARD分析是一种活体外分析，通过分析GARD预测特征中基因的基因表达来区分敏化剂和非敏化剂。从已经暴露于测试化学品的树突状细胞样细胞系中分离出转录本。所述试验依赖于先天决策的细胞系以鉴别敏化剂并调节其基因表达，使得可以量化的变化，学习鉴别敏化剂(9)。MUTZ-3和SenzaCell由于类似于树突状细胞的能力而非常适合此任务，这对于鉴别抗原和协调免疫反应非常重要。
通过表征SenzaCell的表型，基因型并评估细胞系在分析中使用时区分敏化剂和非敏化剂的能力，将它们与MUTZ-3进行了比较。确定了两种细胞系的一组表面标志物的表达水平。结果表明，与SenzaCell相比，MUTZ-3中26个表面标记中有12个具有不同的表达水平。具有自举的分层聚类算法还显示了将细胞系分为不同的稳定团簇的可能性，这指在实验过程中，细胞系比其他细胞系更类似于自身。在MUTZ-3中具有较高表达值的表面标记为CD1a，CD11b，CD14，CD15，CD32，CD40，CD64，TLR2和TLR4，而CD34，CD54和HLA-DR具有较低的表达值。根据CD14和CD34的表达，MUTZ-3细胞可以分为三个亚群CD34+CD14-、CD34-CD14-和CD34-CD14+。先前对所述群的分析揭露了CD34+CD14-为产生其它群(35)的增殖群。一些SenzaCell和MUTZ-3之间的差异可能因此可能通过亚群之间的差异，例如，CD14+细胞在MUTZ-3的增加量可能可以解释增加的CD11b+表达(35)。但是，考虑到可用数据，仅由于亚群的大小不同，无法解释表达的不同水平。CD1a在两个细胞系中表达，其在未分化的MUTZ-3(8，35、36)中沉淀地尚未记录。因此，CD1a的表达可能表明MUTZ-3细胞向更树突状细胞的表型分化。MUTZ-3显示出较大的CD1a阳性细胞群，这可能表明它比SenzaCell更具分化能力。证据表明，进一步指，MUTZ-3可以更分化的来自增加的CD40表达，这是一个标记，在表达随着细胞向DC分化表型(37)。尽管CD1a和CD40在MUTZ-3中均以较高的水平表达，但其他表面标记的表达却显示出相反的证据。HLA-DR为另一标记物，其表达已经显示随着在西班牙细胞中更表达的分化适度地增加，使得难以绘制关于细胞系(37)之间的不等水平的分化的任何结论。。此外，细胞系的形态均未显示出随MUTZ-3分化而形成的特征性树突(数据未显示)。考虑到差异表达下述表面标志物的作用，许多都涉及到骨髓细胞分化，例如，FC-γ受体CD32和CD64(38)，病原体鉴别受体(PRR)TLR2和TLR4(39-41)或碳水化合物粘附分子CD15(42)。这可能表明存在某种形式的差异，这是观察到的差异的原因。然而，仅使用获得的表达值难以确定分化过程的性质。
进行全基因组测序以比较细胞系的基因组并寻找遗传差异的迹象。鉴别变体的数目位于4.1万至5百万个站点的预期范围作为一个典型的人的不同之内相对于参照基因组(43)。鉴别出两种细胞系中唯一的变体，并评估了其预期的影响。总共在SenzaCell中发现了7,977个独特变体，在MUTZ-3中发现了5,672个独特变体。将发现的独特变体的数量与常见变体的数量进行比较，使观察到的差异显得很小。但是，当过滤具有低影响的变体并评估预测具有中等或高影响的变体时，情况就相反了。在SenzaCell中发现了14个变体，在MUTZ-3中发现了28个突变。这些结果的原因之一可能是由于用于鉴别变体的方法不灵敏。全基因组测序是一种高通量方法，可产生数十亿个读数。将读段转化为可解释的结果的过程是困难的，并且是持续的挑战。但是，如果假设发现的变体不是细胞系所特有的，而是细胞系所特有的，则它们可能是其他生物学过程的产物。当细胞系生长时，选择性压力会导致遗传差异。如果MUTZ-3在其基因组中包含具有不同变体的亚群，则其中的一些可能已在SenzaCell中丢失。遗传异质性先前已经在细胞系(44)中被证明。另一个可能性是MUTZ-3已与SenzaCell并行扩展，这可能会生成发现的变体。MUTZ-3细胞系的平行扩增可能会导致发现SenzaCell细胞中不存在的独特变体，但将要求这些突变具有较高或较高的影响频率。持续的平行扩展可能会在细胞系之间引入其他差异。映射到预测会受到突变影响的基因的生物学过程是笼统的术语，很难从中得出功能性结论。考虑到突变的影响，例如错义变体的影响，将蛋白中的氨基酸改变为另一个氨基酸时，这就变得更加困难。但是，研究基因列表会发现有趣的变异。MYB基因中MUTZ-3中发现的高影响变异可能是一个相关发现。的MYB被鉴别的癌基因，在干细胞和祖细胞(45)的调节通常具有重要的功能。另一个有趣的发现是WISP1基因以及MUTZ-3中的突变。在具有在介导细胞-细胞相互作用重要作用和干细胞调节的WNT信号通路WISP1功能(46-48)。这两个突变对于细胞系的功能和调节都可能很重要，而SenzaCell中缺少这些变体可能会对功能产生影响。
细胞转录组的分析是通过在普通培养过程中使用RNA-seq定量转录水平来进行的。表达水平的比较显示，差异表达了3644个转录物，接近去除零计数转录物后分析的所有转录物的10％。大量差异表达基因表明，在分子水平上可以观察到细胞系之间的巨大差异。进行了过表达测试和拓扑通路分析，以更好地了解已鉴别基因可能对细胞产生的潜在影响。94个生物学过程GO术语在确定的转录本中被鉴别为代表过多或不足。由于对鉴别细胞系之间差异的比较分析，最常见的术语是最重要的。代表性不足的术语在其他类型的分析中可能很有趣，例如，确定细胞功能所必需的关键生物学过程。但是，大多数已确定的GO术语都被过度代表。要简要提及一些GO术语，已将髓样白细胞活化和白细胞趋化性鉴别为预期和观察到的转录物数量之间具有最大倍数变化的生物学过程。这两个术语的指示响应外部刺激(49)。MAP激酶活性的积极调节也与许多相关的GO术语一起被鉴别。MAP激酶参与控制重要细胞过程(如细胞分化、细胞增殖和细胞死亡)的信号传导途径(50)。还鉴别出不同的发炎反应和免疫过程被过度代表，这可能由于SenzaCell在GARD分析中的功能作用而具有重要意义。继续分析RNA-seq数据，进行了途径分析以进一步了解细胞系之间的差异。通路分析发现，与SenzaCell相比，MUTZ-3细胞中有19条信号通路被显着激活，有2条受抑制。MAP激酶信号传导途径被鉴别为在MUTZ-3中被激活。MAP激酶活性也被认为是生物过程的过度代表，为细胞系之间细胞过程的变化提供了额外的证据。NF-κB信号是另一个有趣的通路作为激活时被发现，这是密切相关的发炎反应(51)。这些观察结果与激活的铎样受体信号转导可能是发炎反应的结果。
功能分析表明，MUTZ-3能够产生与在测定中使用SenzaCell所获得的预测相似的预测。通过评估GPS中基因的转录水平，可以正确地将敏化剂DNCB和丙烯酸丙烯酸2-羟乙酯预测为敏化剂。预测的决策值在两个细胞系之间也显示出相似的模式。然而，分离化学物质的能力并不能直接给出相似性的任何度量。细胞有可能与刺激反应类似，并且GPS可以很好地捕获这些变化。
总结比较，我们已经完成了一个表型分析，揭示了MUTZ-3和SenzaCell之间26个表面标志物中有12个差异表达。对表达值的聚类分析形成两个单独的聚类，它们将细胞系分开。当评估所有发现的变异时，全基因组测序在SenzaCell细胞系中鉴别出更多独特的变异。当滤除低影响的变体时，MUTZ-3细胞系包含28个变体，而SenzaCell细胞系中只有14个。一些确定的变体可能对细胞的功能产生重要影响。RNA-seq分析发现了3644个差异表达的转录本。代表性测试和途径分析表明，许多生物过程和信号传导途径均被差异激活。最后，MUTZ-3和SenzaCell已用于GARD分析中，以评估其鉴别敏化剂和产生预测的能力。样品的分类对所有化学物质产生了正确的预测，表明尽管观察到差异，但两种细胞系均可用于分析。
总之，我们在表型和基因型分析中发现了SenzaCell和MUTZ-3之间的众多差异。总体而言，差异表明SenzaCell具有独特的表面分子表达和细胞功能，但两种细胞系均可用于GARD分析。
补充表1。
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补充表1.使用DESeq2和edgeR-进行DE分析后，鉴别出的差异表达转录本的列表。
补充表2
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补充表2使用DE转录本(transcripts)在过表达分析中确定为过表达(overrepresented)的GO生物过程。Bonferroni校正的P值低于0.05，提出的GO项被称为显著。校正后的p值报告如下。参考中映射的ID数：14774，参考中未映射的ID：12854；DE转录本的映射ID数：3298，DE转录本的未映射ID：346。
实例2
SenzaCell细胞系还可与基因组生物标志物特征一起使用以利用GARD平台来分类呼吸道敏化剂，即，用于鉴别能够诱发哺乳动物的呼吸道敏化的药剂。
可以根据以上实施例1的功能分析部分中讨论的用于鉴别皮肤敏化剂但适于使用下表B和/或表C的生物标志物特征的方法来实施所述方法。还参见在WO 2013/160882中描述的，专门描述的用于鉴别能够引起呼吸道敏化的试剂的详细方法。WO 2016/083604；和Forreryd等。(2015)使用GARD预测化学呼吸道敏化剂，这是一种基于基因组生物标志物特征的新颖活体外测定方法。PLoS One 10(3))。
表B
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表B.在发现的基因上添加了Entrez基因ID的注释(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)。提供了用于Human ST 1.0阵列的Affymetrix探针组ID。验证呼叫频率(％)是在交叉验证过程中获得的20个验证生物标志物特征中每个基因的出现。
表C
表C(i)-核心生物标志物
表C(ii)-优选生物标志物
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表C(iii)-任选生物标志物
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所述表展示GRPS中的预测子基因，通过单向方差分析(ANOVA)p值过滤和向后消除鉴别。如果可能，将Ensembl笔录ID用作基因标识符。提供用于人类ST 1.0阵列的Affymetrix探针组ID。
1验证呼叫频率(％)描述了通过交叉验证获得的20个生物标志物特征中每个预测子转录物的发生。
实例3
SenzaCell细胞系还可以用于使用GARD平台对皮肤敏化剂的效力进行分类，即用于确定测试剂的皮肤敏化效力。
可以按照上述实施例1的功能分析部分中描述的用于鉴别皮肤敏化剂的方法进行上述方法，但也可以使用表D的生物标志物标记来确定效力。另请参见Zeller等人中详细描述的特定方法。(2017)用于皮肤敏感性化学物质效力评估的GARD平台。ALTEX在线首次发布于2017年4月12日，第2版https://doi.org/10.14573/altex.1701101，并在WO 2017/162773中进行了描述。
表D
表D(i)
表D(ii)
表D(iii)
表D.生物标记物标记(Biomarker signature)
实例4
SenzaCell细胞系还可以用于鉴别在哺乳动物中过敏的蛋白。
可以根据以上实施例1的功能分析部分进行所述方法，以鉴别皮肤敏化剂，但是适于使用表E的生物标志物特征以鉴别敏化蛋白。另请参见Zeller等人中描述的方法。一种基于生物标志物的替代方法，用于预测已知会刺激呼吸道的蛋白。《活体外毒理学(ToxicolIn Vitro)》，2017Oct 7；46:155-162。
如下提供对蛋白进行变应原性预测的可能方法。它基于表E的GARD蛋白过敏原预测特征(以下称为”GARD PAPS”)。GARD的读数是一组基因组预测因子，称为GARD预测特征(GPS)。
从受试物质刺激的细胞样品中分离出细胞的遗传物质。通过使用多元统计预测模型对GARD PAPS的转录水平进行定量，并将其与参考数据集进行比较。根据每个样品的GARDPAPS转录水平(由Affymetrix微阵列技术测量)，为其分配一个决策值。最终预测是基于一式三份生物样品的平均值。
筛选所有蛋白的细胞毒性作用，并确定每种蛋白的GARD输入浓度。
LPS可用作阴性对照，以确保样品产生的观察信号不是由于内毒素污染引起的。样品中的内毒素含量可以使用LAL测试定量。可以将用作阴性对照的LPS浓度设置为对应于样品中存在的最高内毒素浓度。
所有测试蛋白和物质均一式三份进行测定。如上所述，使用GARD PAPS预测模型为测试物质的所有重复样品分配决策值(请参见下面的材料和方法)。
材料和方法
下面包括用于根据此示例生成数据的GARD测试策略的综合材料和方法。
与标准协议的偏差
可以在1-25μg/ml的浓度范围内监测测试蛋白的细胞毒性作用。25μg/ml可以用作GARD输入浓度。
用测试物质刺激细胞时，可以先将蛋白溶解于PBS中，浓度为1000μg/ml。然后将50μl溶解的蛋白添加到1.95ml的接种细胞中。LPS可以在PBS中稀释至0.1μg/ml的终浓度，然后将2μl加入到1.998ml细胞悬液中。
刺激细胞24小时，然后在TRIzol试剂中裂解细胞。RNA被纯化，标记并与Affymetrix阵列杂交。
定量的转录水平是单链阵列规范化(SCAN)，从数据集提取的GARD PAPS。来自用于构建预测模型的测试样品和参考样品中的未刺激样品可用于消除数据集之间的批次效应。
使用支持向量机(SVM)进行最终分类，所述向量机已经过用于建立GARD PAPS的参考样品的培训。
细胞系维持和接种细胞以进行刺激
SenzaCell细胞系可以维持于补充有20％(体积/体积)胎牛血清(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)和40ng/ml rhGMCSF(Bayer HealthCare Pharmaceuticals，Seattle，WA)的α-MEM(Thermo Scientific Hyclone，Logan，UT)中，如描述于(Johansson等人，2011)。每3-4天或当细胞密度超过5-600.000个细胞/ml时，在扩增过程中进行培养基更换。增殖祖细胞用于测定，无需应用进一步的分化步骤。在培养基交换过程中，对细胞计数并悬浮至200.000细胞/ml。解冻后最多可培养20个传代或两个月的工作培养基。为了化学刺激细胞，将1.8ml浓度为222.000个细胞/ml的种子接种到24孔板中。用于刺激的化合物的加入量为200μl，在孵育过程中将细胞密度稀释至200.000个细胞/ml。
表型分析
在任何化学刺激之前，进行定性表型分析以确保增殖细胞处于未成熟阶段。所有细胞表面染色和洗涤步骤均在含1％BSA(w/v)的PBS中进行。将细胞与特异性小鼠单克隆抗体(mAb)在4℃孵育15分钟。以下mAb用于流式细胞测量术:FITC-结合的CD1a(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)、CD34、CD86和HLA-DR(BD Biosciences，San Diego，CA)、PE-conjugated CD14(DakoCytomation)、CD54和CD80(BD Biosciences)。与FITC或PE偶联的小鼠IgG1被用作同工型对照(BD Biosciences)，碘化丙锭(PI)(BD Biosciences)被用于评估细胞活力。FACSDiva软件用于通过FACSCanto II仪器(BD Bioscience)进行数据采集。采集了10,000个事件，根据光散射属性设置门以排除碎片和无效细胞，并根据来自同型对照的信号设置象限。使用FCS Express V3(加利福尼亚州洛杉矶的De Novo软件)进行进一步的数据分析。有关未刺激细胞的参考表型，请参见Johansson等人，2011年。
化学处理和细胞毒性评估
为了确保化合物的稳定性，所有化学药品均按照供应商的说明进行存储。如有可能，将化学物质溶于水，或将DMSO溶解于疏水性化合物中。由于许多化学物质都会对细胞产生毒性作用，因此应监测受试物质的细胞毒性作用。一些化学物质很难溶解在细胞培养基中。因此，也要评估最大可溶性浓度。待测化学品的滴定浓度范围为1μM至细胞培养基中的最大可溶浓度。对于易溶化合物，将500μM设置为滴定范围的上限。对于细胞刺激，将化学药品溶解于适当的溶剂中，作为1000倍目标孔内浓度的储备液(称为储备液A)。通过将10μl储备液A加入990μl细胞培养基中来制备10x储备液(称为储备液B)。然后将200μl的原液B添加到含1.8ml接种细胞的孔中。因此，对于溶解在DMSO中的样品，DMSO的孔内浓度将为0.1％。在37℃和5％CO2下孵育24小时后，将收获的细胞用PI染色并用流式细胞仪进行分析。PI阴性细胞被定义为有活力，并且在滴定范围内每种浓度刺激的细胞的相对活力计算为
对于有毒化合物，将产生90％相对活力(Rv90)的浓度用于GARD分析，原因是所述浓度证明了用于刺激的化合物的生物利用度，而不损害免疫反应。对于无毒化合物，如果可能，使用500μM的浓度。对于在细胞培养基中不溶于500μM的无毒化合物，使用最高可溶浓度。满足这三个标准中的任何一个，仅一种浓度将用于基因组测定。用于任何给定化学品的浓度称为”GARD输入浓度”。
细胞对GARD的化学暴露
一旦确定了待分析化学物质的GARD输入浓度，就如上所述再次刺激细胞，这次仅使用GARD输入浓度。对测试物质的所有评估均一式三份进行，在不同的时间点并使用不同的细胞培养进行。在37℃和5％CO2下孵育24小时后，将一个孔中的细胞溶解在0.5mlTRIzol试剂(Life Technologies)中，并在-20℃下保存直至提取RNA。同时，取少量刺激细胞样品进行PI染色，并用流式细胞仪进行分析，以确保达到预期的刺激细胞相对活力。
准备基准控制
除了活动中要测试的任何测试物质外，还进行一组基准控件，以进行预测模型校准和预测性能估计。有关每个特定活动中使用的基准控件的详细信息，请参见本附录所附的主要文档。
使用Nanostring nCounter系统分离RNA和GPS定量
使用市售试剂盒(Direct-Zol RNAMiniPrep，Zymo Research，Irvine，CA)从裂解的细胞中分离RNA。使用BioAnalyzer设备(加利福尼亚州圣克拉拉，安捷伦)对总RNA进行定量和质量控制。在与GPS特定报告基因探针CodeSet(Nanostring，Seattle，WA)进行的杂交测定中，总共100ng RNA被用作样品输入。使用nCounter Prepstation在芯片上制备杂交的RNA-CodeSet样品，并使用Nanostring Digital Analyzer(Nanostring)对GPS的单个转录物进行定量。
数据采集与规范化
原始数据从Digital Analyzer导出，GPS的每个笔录计数均通过单芯片规范化(每总计数算法)。规范化数据由S×V矩阵组成，其中S表示GARD运动中的样品数，V表示GPS的量化转录物数。
数据分析-生成校准的支持向量机决策值
所有进一步的下游分析均使用在开源统计环境R中开发的基于应用程序的软件进行。支持向量机(SVM)使用用于GPS建立的历史数据进行训练(Johansson等人，2011)。使用受过训练的SVM预测来自特定GARD活动的测试物质的所有样品和基准控件，并为每个样品分配SVM决策值。预测器性能是通过鉴别基准控制的预测类的接收器工作特性(ROC AUC)下的面积来估计的。
GARD测试物质分类
GARD预测模型定义如下:
如果测试物质的所有可用生物学复制的平均判定值均大于零，则将测试物质归为敏化剂。
脚本
下面列出了用R代码编写的脚本的详细信息，可用于进行所述方法:
#所需文件:
#-GARD_PAPS.R
#-子目录下的测试样品的原始affymetrix文件:raw_affy/
#-描述未受刺激的样品raw_affy/annotation.rds的新数据的注释。
#-历史数据存储在trainingset.rds中
#加载所需的依赖项
来源('～/GARD_PAPS.R)
#读取训练数据
训练＝readRDS('～/trainingset.rds')
#读取新数据和注释
new_data＝read_raw_affy('～/raw_affy/*.CEL')
new_data_ref＝readRDS('～/raw_affy/annotation.rds')
#规范化新数据
normalized_data＝normalize_train_test(train＝train，test＝new_data，test_reference＝new_data_ref)
#根据历史数据训练模型
模型＝train_svm(normalized_data$train)
#预测新样品
预测＝predict_test_samples(模型＝模型，数据＝normalized_data$test)
表E
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Claims (32)

1.一种ATCC专利保藏号为PTA-123875的非天然存在的树突状骨髓白血病细胞。
2.一种细胞培养物，其包含根据权利要求1所述的细胞的群。
3.一种用于鉴别能够诱发哺乳动物皮肤敏化的药剂的体外方法，其包含以下步骤或由以下步骤组成：
(a)将根据权利要求1或2所述的树突状骨髓白血病细胞或树突状骨髓白血病细胞的群暴露于测试剂；和
(b)测量所述细胞中表A-A中所定义的所有的生物标志物的表达；
其中步骤(b)中细胞中测量的所述生物标志物的表达指示所述测试剂的皮肤敏化作用。
4.一种用于测定药剂的皮肤敏化效力的方法，其包含以下步骤或由以下步骤组成：
(a)将根据权利要求1所述的树突状骨髓白血病细胞或根据权利要求2所述的树突状骨髓白血病细胞的群暴露于测试剂；和
(b)测量步骤(a)的所述细胞中表D中所定义的所有生物标志物的表达；
其中步骤(b)中测量的细胞中的所述生物标志物的表达指示所述测试剂的皮肤敏化效力。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其进一步包含：
(c)将根据权利要求1所述的树突状骨髓白血病细胞的单独群或根据权利要求2所述的树突状骨髓白血病细胞的群的单独群暴露于一种或多种在哺乳动物中不诱发敏化和/或过敏的阴性对照药剂；和
(d)测量在步骤(b)测量的所述生物标志物在步骤(c)的所述细胞中的表达,
其中步骤(d)中测量的所述生物标志物的表达不同于步骤(b)中测量的所述生物标志物的表达的情况下，所述测试剂鉴别为敏化剂和/或是引起过敏的；和/或进一步包含：
(e)将根据权利要求1所述的树突状骨髓白血病细胞的单独群或根据权利要求2所述的树突状骨髓白血病细胞的群的单独群暴露于一种或多种在哺乳动物中诱发敏化和/或是引起过敏的阳性对照药剂；和
(f)在步骤(e)的所述细胞中测量在步骤(b)中测量的所述生物标志物的表达,
其中步骤(f)中测量的所述生物标志物的表达对应于步骤(b)中测量的所述生物标志物的表达的情况下，所述测试剂鉴别为敏化剂和/或是引起过敏的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)包含测量所述生物标志物的核酸分子的表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸分子为cDNA分子或mRNA分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸分子为mRNA分子。
9.根据权利要求5所述的方法，其中使用选自由以下组成的组的方法对步骤(b)、(d)和/或(f)中所述生物标志物的表达进行测量：Southern hybridisation、Northernhybridisation、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交。
10.根据权利要求5所述的方法，其中使用DNA微阵列测定步骤(b)、(d)和/或(f)中所述生物标志物的表达。
11.根据权利要求5所述的方法，其中使用一种或多种结合部分对步骤(b)、(d)和/或(f)中所述生物标志物的表达进行测量，所述结合部分各自能够选择性地结合到编码所述生物标志物之一的核酸分子，所述生物标志物在表A或D中的一个或多个中鉴别出。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种结合部分各自包含核酸分子或由所述核酸分子组成。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种结合部分各自包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO或由其组成。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种结合部分的长度是5到100个核苷酸。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述结合部分包含可检测部分。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述可检测部分选自由以下组成的组：发光部分；放射性部分；或酶促部分。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述可检测部分选自由以下组成的组：荧光部分；或化学发光部分。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述放射性部分为选自由以下组成的组的放射性原子：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。
19.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(b)、(d)、和/或(f)包含测量所述生物标志物的蛋白的表达或其由测量所述生物标志物的蛋白的表达组成。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)中测量所述生物标志物的表达使用一种或多种结合部分进行，其中每种所述结合部分能够选择性结合到表A或D中的一个或多个中所鉴别的所述生物标志物中的一种。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种结合部分包含抗体或其抗原结合片段或由所述抗体或其抗原结合片段组成。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种结合部分包含可检测部分。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述可检测部分选自由以下组成的组：发光部分、放射性部分和酶促部分。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述可检测部分选自由以下组成的组：荧光部分和化学发光部分。
25.根据权利要求5所述的方法，其中使用阵列进行步骤(b)、(d)和/或(f)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述阵列是基于珠粒的阵列。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述阵列为基于表面的阵列。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述阵列选自由以下组成的组：宏阵列；微阵列；纳米阵列。
29.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)包含测量表A-A、和表D中的任一个中列出的所有所述生物标志物的表达或由测量表A-A、和表D中的任一个中列出的所有所述生物标志物的表达组成。
30.一种根据权利要求1所述的树突状骨髓白血病细胞或根据权利要求2所述的树突状骨髓白血病细胞的群的用途，其用于测定测试剂的敏化作用和/或过敏原性。
31.一种分析试剂盒，其包含：
(i)包含一种或多种结合部分的阵列；和
(ii)根据权利要求1所定义的树突状骨髓白血病细胞或权利要求2所定义的细胞培养物；和
(iii)一种或多种对照药剂；和
(iv)使用说明书。
32.一种适用于根据权利要求3到29中任一项所述的方法的分析试剂盒，其包含：
(i)包含一种或多种根据权利要求11到24中任一项所述的结合部分的阵列；和
(ii)根据权利要求1所定义的树突状骨髓白血病细胞或权利要求2所定义的细胞培养物；和
(iii)一种或多种对照药剂；和
用于进行根据权利要求3到28中任一项所定义的方法的说明书。
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