KR20200057013A - 신규 세포주 및 이의 용도 - Google Patents

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맬린 마리 린즈텟
칼 에이 케이 보레백
헨릭 요한슨
로빈 그라딘
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센자겐 아베
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Abstract

본 발명은 ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875에 따른 비-천연 발생 수지상-유사 골수성 백혈병 세포, 및 이러한 세포를 이용하는 방법 및 키트를 제공한다.

Description

신규 세포주 및 이의 용도
본 발명은 비-천연 발생 수지상-유사 세포주 및 이러한 세포를 이용하는 방법 및 키트를 제공한다.
수지상 세포(DC)는 내재성 면역력과 적응성 면역력 사이에서 필수적인 연결을 가교(bridge)함으로써 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 이들 수지상 세포는 촉발 시 다량의 매개자들을 신속하게 생성할 수 있으며, 이들 매개자는 항원-제시를 통해 세포성 반응을 미세-조율함으로써 염증 부위에서 다른 세포의 이동 및 활성화에 영향을 주고, 다양한 병원체들 및 환경적 인자들에 선택적으로 반응한다. 따라서, 감작제를 이용한 자극 동안 DC에 의한 면역학적 의사-결정을 탐구하고 이용하는 것은 감작의 예측을 위한 강력한 시험 전략으로서 역할을 할 수 있다.
그러나, 상이한 DC 하위집단들의 다면적인 표현형 및 특수 기능, 뿐만 아니라 이들 하위집단의 광범위하고 희박한(scarce) 분포는 시험 플랫폼으로서의 1차 DC의 이용을 방해하는 복잡한 인자이다. 따라서, 예컨대 수지상-유사 모델 세포주를 이용함으로써, 1차 DC를 수득하는 데 있어서의 변동성 및 어려움과 연관된 문제점들을 또한 회피하는 정확하고 신뢰 가능한 시험관내 검정법을 확립하는 현실적인 필요성이 존재한다.
유전체성 알레르기원 신속 검출(GARD; Genomic Allergen Rapid Detection)은 화학물질 및 단백질 감작제 및 알레르기원의 평가를 위해 개발된 시험관내 검정법이다. 상기 검정법은 수지상 세포-유사 세포주로부터의 전사 프로파일을 사용하여, 시험 작용제의 감작화 또는 알레르기원성 잠재력을 예측한다(9). 전사 프로파일은, 감작제를 비-감작제로부터 구별하는 데 있어서 가장 큰 예측 성능을 갖는 것으로 식별된 유전자로 구성된다. 구체적으로는, GARD는 하기를 식별하도록 개발되어 왔다: 피부 감작제(WO 2012/056236; 문헌[Johansson et al. (2017) Evaluation of the GARD assay in a blind Cosmetics Europe study. ALTEX Online first February 17, 2017; Forreryd et al. (2016) From genome-wide arrays to tailor-made biomarker readout - Progress towards routine analysis of skin sensitizing chemicals with GARD. Toxicolgy In Vitro; Johansson et al. (2014) GARD in-house validation - A proof of concept. Tox Sci; Johansson et al., (2011) A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics, 2011]); 호흡기 감작제(WO 2013/160882; WO 2016/083604; 문헌[Forreryd et al. (2015) Prediction of chemical Respiratory sensitizers using GARD, a novel in vitro assay based on a genomic biomarker signature. PLoS One 10(3)]); 피부 감작제의 약효(PCT/EP2017/056878; 문헌[Zeller et al. (2017) The GARD platform for potency assessment of skin sensitizing chemicals. ALTEX Online first published April 12, 2017, version 2 https://doi.org/10.14573/altex.1701101]); 및 단백질의 알레르기원성.
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현재, 본 발명자들은, "SenzaCell"(ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875)라고 하는 비-천연 발생 수지상-유사 골수성 림프종 세포주를, GARD 검정법에서 사용하기에 적합한 바람직한 수지상 세포-유사 세포주로서 제공한다. SenzaCell는 GARD 검정법에서 또한 사용될 수 있는 MUTZ-3 세포주와 비교되어 왔으며; MUTZ-3 세포는 독일 브라운슈바이크 소재의 미생물 및 세포 배양을 위한 독일어 모음 GmbH(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)로부터 입수 가능한 수지상-유사 세포이다(www.dsmz.de; DSMZ No. ACC 295). 그러나, MUTZ-3 세포는 공급자 세포주와 함께 배양될 필요가 있도록 프로토콜화되며, 이는 이들 세포의 용도를 복잡하게 한다. 따라서, GARD 검정법과 같은 방법에 사용하기 위한, MUTZ-3에 대한 대안에 대한 필요성이 남아 있다.
SenzaCell와 MUTZ-3 사이의 비교는, 바이오마커의 패널의 발현이 비교되는 표현형 분석, 세포주의 전사 수준이 비교되는 전사 분석, 표현형 프로파일 및 전사 프로파일에서 많은 정량화 가능한 차이들을 드러내고 GARD 검정법에서 공유된 기능성을 보여준 이들의 DNA 서열과 기능적 분석의 비교를 포함하였다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875에 따른 비-천연 발생 수지상-유사 골수성 림프종 세포가 제공된다.
이러한 세포는 또한, 본원에서 "SenzaCell"로 지칭된다. SenzaCell(ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875)는 2017년 3월 9일에 SenzaGen AB에 의해 미국 버지니아주 20110 머내서스 10801 유니버시티로 소재의 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC; American Type Culture Collection)에 기탁되었다.
"비-천연 발생"이란, 본 발명자들은 세포가 자연상에서 밝혀질 것들과 상이하며, 이로부터 변형되는, 및/또는 이의 변이체이며; 다시 말해, 이들 세포가 자연상에서 정상적으로 발생할 세포가 아님을 의미한다. 예를 들어, 천연 발생 인간 골수성 림프종 세포 또는 천연 발생 수지상 세포와 상이하며, 이로부터 변형되며, 및/또는 이의 변이체이다.
본 발명의 제2 양태에서, 제1 양태에 따른 세포의 집단을 포함하는 세포 배양물이 제공된다.
일 구현예에서, 세포 또는 세포의 집단은 불멸의 또는 불멸화된 세포를 포함하거나 이로 구성된다. "불멸의"이란, 본 발명자들은, 이들이 더 이상 분열을 계속할 수 없는 지점(point)에 의해 제한되지 않는 세포를 의미하고, 이러한 세포는 그렇지 않으면 DNA 손상 또는 짧아진 텔로미어로 인한 것일 것이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 세포 또는 세포의 집단은 미분화된 세포를 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 제3 양태에서, 포유류에서 감작 및/또는 알레르기원성을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 시험관내 방법이 제공되며, 상기 방법은:
a) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
b) 표 A, B, C, D, E 중 하나 이상에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계
를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (b)에서 측정되는, 세포에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 작용제의 감작화 및/또는 알레르기원성 효과를 나타낸다.
제4 양태에서, 포유류 피부에서 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 시험관내 방법이 제공되며, 상기 방법은:
a) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
b) 표 A에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계
를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (b)에서 측정되는, 세포에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 작용제의 피부 감작화 효과를 나타낸다.
도 1. 상이한 표면 마커들에 대한 발현 수준을 계층적 클러스터링에 사용하여, 세포주들을 비교하였다. 표지 내의 숫자는 실험을 나타낸다. 클러스터링은 세포들을 2개의 개별 클러스터들로 그룹화한다.
도 2. SenzaCell; 독특한 변이체에 의해 높은 또는 중간 정도의 영향을 받을 것으로 예측되는 유전자와 연관되었던 생물학적 과정의 분포이다.
도 3. MUTZ-3; 식별된 변이체에 의해 높은 또는 중간 정도의 영향을 받을 것으로 예측되는 유전자와 연관되었던 생물학적 과정의 분포이다.
도 4. a) RNA-seq 데이터의 계층적 클러스터링은 실험 3에서 수득된 시료에 대한 개별 클러스터를 보여준다. 실험 1 및 2로부터의 세포는 세포주에 대한 개별 클러스터를 형성한다. b) 시료의 PCA 그림은, 변동의 가장 큰 소스가 세포주들 사이에서의 차이에 의해 설명될 수 있음을 보여준다. 또한, 실험 3에서 제조된 시료는 잔여 시료로부터 벗어나는 것이 분명하다.
도 5. 파이 차트(pie chart)는, 발견된 차별적으로 발현되는 유전자(DEG; Differentially Expressed Gene)가 PANTHER를 사용하여 맵핑되었던 분자 기능의 분포를 나타낸다.
도 6. 시험 화학물질 DNCB 및 2-하이드록시에틸아크릴레이트로 자극된 후 MUTZ-3 및 SenzaCell로부터 수득된 발현값을 사용하는 경우의 SVM 피부 감작제 예측이다. 모든 예측들은 진(true) 부류에 올바르게 상응한다.
본 발명에 따른 수지상-유사 세포를 사용할 수 있는, 포유류 피부의 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법은 실시예 1의 기능적 분석 섹션에 기재된다. WO 2012/056236; 문헌[Johansson et al. (2017) Evaluation of the GARD assay in a blind Cosmetics Europe study. ALTEX Online first February 17, 2017; Forreryd et al. (2016) From genome-wide arrays to tailor-made biomarker readout - Progress towards routine analysis of skin sensitizing chemicals with GARD. Toxicolgy In Vitro; Johansson et al. (2014) GARD in-house validation - A proof of concept. Tox Sci; Johansson et al., (2011) A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics, 2011]이 또한, 사용될 수 있으며, 이들은 모두 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 피부에서 과민성 반응을 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 것이다. 바람직하게는, 과민성 반응은 세포-매개 과민성 반응, 예를 들어, 유형 IV 과민성 반응이다. 바람직하게는, 상기 과민성 반응은 포유류에서 유형 IV 지연(delayed)-유형 과민성 반응이다. 바람직하게는, 유형 IV 지연-유형 과민성 반응은 DC-매개이다. 바람직하게는, 상기 방법은 알레르기 접촉 피부염(ACD; allergic contact dermatitis)(즉, 과민성 반응은 ACD임)을 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 것이다.
일 구현예에서, "포유류 피부의 감작을 유도할 수 있는 작용제"는 포유류에서 상피 접촉 부위에서 유형 IV 지연-유형 과민성 반응을 유도하고 촉발할 수 있는 작용제이다.
본 발명의 제5 양태에서, 포유류에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
a) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
b) 표 B에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계
를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (b)에서 측정되는, 세포에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 작용제의 호흡기 감작화 효과를 나타낸다.
본 발명의 제6 양태에서, 포유류에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
a) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
b) 표 C에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계
를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (b)에서 측정되는, 세포에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 작용제의 호흡기 감작화 효과를 나타낸다.
제5 양태 및 제6 양태의 방법들은, 단계 (b)가 표 B 및/또는 C에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계를 포함하도록 조합될 수 있다.
본 발명에 따른 수지상-유사 세포를 사용할 수 있는, 포유류에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법이 실시예 2에서 고찰된다. WO 2013/160882; WO 2016/083604; 및 문헌[Forreryd et al. (2015) Prediction of chemical Respiratory sensitizers using GARD, a novel in vitro assay based on a genomic biomarker signature. PLoS One 10(3)]에 기재된 방법들이 또한, 사용될 수 있으며, 이들은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
"호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제"란, 본 발명자들은 포유류의 기도에서 유형 I 즉시 과민성 반응을 유도하고 촉발할 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. 바람직하게는, 유형 I 즉시 과민성 반응은 DC-매개이고/이거나 T 세포로부터 Th2 세포로의 분화를 수반한다. 바람직하게는 유형 I 즉시 과민성 반응은 체액성 면역력 및/또는 호흡기 알레르기를 초래한다.
일 구현예에서, "포유류 피부의 감작을 유도할 수 있는 작용제"는 포유류에서 폐 상피 부위에서 유형 I 즉시 과민성 반응을 유도하고 촉발할 수 있는 작용제이다. 바람직하게는, 폐 상피 부위는 폐의 호흡기 구역에 있지만, 대안적으로 또는 추가로 폐의 전도성(conductive) 구역에 있을 수 있다.
본 발명의 제7 양태에서, 작용제의 피부 감작화 약효(potency)를 결정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(a) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 제공하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 제공된 세포를 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
(c) 표 D에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (b)의 세포에서 측정하는 단계
를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 상기 시험 작용제의 피부 감작화 약효를 나타낸다.
본 발명에 따른 수지상-유사 세포를 사용할 수 있는, 작용제의 피부 감작화 약효를 결정하는 방법이 실시예 3에 고찰된다. 문헌[Zeller et al. (2017), The GARD platform for potency assessment of skin sensitizing chemicals. ALTEX Online first published April 12, 2017, version 2 https://doi.org/10.14573/altex.1701101] 및 PCT/EP2017/056878에 기재된 방법이 또한, 사용될 수 있으며, 이들은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 제8 양태에서, 포유류에서 알레르기원성인 단백질을 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(a) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 제공하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 제공된 세포를 시험 단백질에 노출시키는 단계; 및
(c) 표 E에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (b)의 세포에서 측정하는 단계
를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 상기 시험 단백질의 알레르기원성을 나타낸다.
본 발명에 따른 수지상-유사 세포를 사용할 수 있는, 포유류에서 알레르기원성인 단백질을 식별하는 방법이 실시예 4에서 상세히 고찰된다.
일 구현예에서, 본 발명의 임의의 양태에 따른 방법은:
d) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 개별 집단을, 포유류에서 감작 및/또는 알레르기를 유도하지 않는 하나 이상의 음성 제어제(control agent)에 노출시키는 단계; 및
e) 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (d)의 세포에서 측정하는 단계
를 추가로 포함하고, 시험 작용제는, 상기 단계 (e)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현이 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현과 상이한 사건(event)에서 감작제로서 및/또는 알레르기원으로서 식별된다.
비히클 대조군은 음성 제어제로서 사용될 수 있다. 비히클 대조군은 DMSO 및/또는 증류수를 포함할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 비자극된 세포는 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. "비자극된 세포"란, 본 발명자들은 특이적인 시험 작용제에 노출되지 않았던 세포를 포함하거나 이를 의미한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 음성 제어제는 1-부탄올; 2-아미노페놀; 2-하이드록시에틸 아크릴레이트; 2-니트로-1,4-페닐렌디아민; 4-아미노벤조산; 클로로벤젠; 디메틸 포름아미드; 에틸 바닐린; 포름알데하이드; 제라니올; 헥실신나믹 알데하이드; 이소프로판올; Kathon CG*; 메틸 살리실레이트; 페니실린 G; 프로필렌 글리콜; 칼륨 디크로메이트; 칼륨 퍼망가네이트; Tween 80; 및 아연 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (a)에서 제공된 세포에서 시험 작용제에 노출되기 전과 노출된 후 측정되고, 시험 작용제에 노출되기 전과 노출된 후 하나 이상의 바이오마커 사이에서 발현의 차이는 상기 시험 작용제의 알레르기원성 및/또는 감작화 효과를 나타낸다. 따라서, 단계 (a)에서 제공된 세포는 음성 대조군과 시험 결과 둘 모두를 제공할 수 있다.
"단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현과 상이하다" 및 "발현 차이"란, 본 발명자들은, 제1 시료(예를 들어, 시험 작용제 시료)에서 존재 및/또는 양이 제2 시료(예를 들어, 제어제 시료)의 존재 및/또는 양과 상이함을 포함한다.
예를 들어, 시험 시료 내 존재 및/또는 양은 하나 이상의 음성 대조군 시료의 존재 및/또는 양과 통계학적으로 유의한 방식으로 상이할 수 있다. 바람직하게는, 시험 작용제에 노출된 세포 집단에서 하나 이상의 바이오마커의 발현은:
음성 제어제에 노출된 세포 집단의 80% 이하, 예를 들어, 음성 대조군 또는 음성 제어제에 노출된 세포 집단의 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0% 이하이거나;
음성 제어제에 노출된 세포 집단의 적어도 120%, 예를 들어, 음성 대조군 또는 음성 제어제에 노출된 세포 집단의 적어도 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 또는 적어도 500%이다.
"단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현과 상이하다"란, 본 발명자들은 대안적으로 또는 추가로, 시험 시료가 하나 이상의 음성 대조군 시료와 상이한 군에 속하는 것으로 분류되는 것을 포함한다. 예를 들어, SVM이 사용되는 경우, 시험 시료는 하나 이상의 음성 대조군 시료와 결정값 역치의 다른 측면(side)에 있다(예를 들어, 시험 작용제가 단백질 알레르기원으로서 분류된다면, 하나 이상의 시험(또는 이의 복제물)이 0 이하의 SVM 결정값을 갖는다면, 하나 이상의 양성 대조군 시료(또는 이의 대부분)는 0 이하의 SVM 결정값을 가져야 함).
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 본 발명의 임의의 양태에 따른 방법은:
f) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 개별 집단을, 포유류에서 감작을 유도하고/하거나 알레르기원성인 하나 이상의 양성 제어제에 노출시키는 단계; 및
g) 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (f)의 세포에서 측정하는 단계
를 추가로 포함하고, 시험 작용제는, 상기 단계 (f)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현이 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현에 상응하는 사건에서 감작제로서 및/또는 알레르기원으로서 식별된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (f)에서 제공되는 하나 이상의 양성 제어제는 Der p 1; 및 Der p 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함하거나 이로 구성된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 양성 제어제는 암모늄 헥사클로로플라티네이트; 암모늄 퍼설페이트; 에틸렌디아민; 글루타르알데하이드; 헥사메틸렌 디이소시아네이트; 말레산 무수물; 메틸렌 디페놀 디이소시아네이트; 프탈산 무수물; 톨루엔디이소시아네이트; 및 트리멜리트산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
"단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현에 상응한다"란, 본 발명자들은 시험 작용제에 노출된 세포 집단 내 하나 이상의 바이오마커의 발현이 하나 이상의 양성 제어제에 노출된 세포 집단과 동일하거나 유의하게 상이함을 의미한다. 바람직하게는, 시험 작용제에 노출된 세포 집단 내 하나 이상의 바이오마커의 발현은 하나 이상의 양성 제어제에 노출된 세포 집단의 81% 내지 119%, 예를 들어, 하나 이상의 양성 제어제에 노출된 세포 집단의 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이고, 하나 이상의 양성 제어제에 노출된 세포 집단의 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118% 또는 119% 이하이다.
"단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현에 상응한다"란, 본 발명자들은 대안적으로 또는 추가로, 시험 시료가 하나 이상의 양성 대조군 시료와 동일한 군에 속하는 것으로 분류됨을 포함한다. 예를 들어, SVM이 사용되는 경우, 시험 시료는 하나 이상의 양성 대조군 시료와 결정값 역치의 동일한 측면에 있다(예를 들어, 시험 작용제가 알레르기원성으로서 분류된다면, 하나 이상의 시험(또는 이의 복제물)이 0 초과의 SVM 결정값을 갖는다면, 하나 이상의 양성 대조군 시료(또는 이의 대부분)는 0 초과의 SVM 결정값을 가져야 함).
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 시험되려는 작용제의 알레르기원성 및/또는 감작화 약효를 나타낸다. 예를 들어, 상기 방법은 양성 대조군과 비교하여 및/또는 하나 이상의 추가의 시험 작용제와 비교하여, 시험 작용제의 상대 알레르기원성 및/또는 감작화 약효를 예측하는 데 사용될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은
(h) 시험 작용제의 알레르기원성 및/또는 감작화 효과를 식별하는 단계인 추가의 단계를 포함한다.
예를 들어, 단계 (h)는 시험 작용제를 알레르기원 또는 비-알레르기원으로서 및/또는 감작제 또는 비-감작제로서 식별할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단계 (h)는 양성 대조군 및/또는 하나 이상의 추가의 시험 작용제와 비교하여, 시험 작용제의 상대 알레르기원성 또는 알레르기원성 약효 및/또는 감작화 효과 또는 감작화 약효를 식별할 수 있다.
식별은 당업계에 알려진 임의의 적합한 통계학적 방법 또는 기계 학습 알고리즘(machine learning algorithm), 예컨대 랜덤 포레스트(RF; Random Forest), 서포트 벡터 머신(SVM), 주성분 분석(PCA), 최소자승추정법(OLS; ordinary least squares), 부분최소제곱회귀(PLS; partial least squares regression), 직교 부분최소제곱회귀(O-PLS) 및 다른 다변량 통계학적 분석(예를 들어, 후진 단계별 로지스틱 회귀 모델(backward stepwise logistic regression))을 사용하여 수행될 수 있다. 다변량 통계학적 분석의 검토에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Schervish, Mark J. (November 1987). "A Review of Multivariate Analysis". Statistical Science 2 (4): 396-413]을 참조하며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 바람직하게는, 서포트 벡터 머신(SVM)이 사용된다.
전형적으로, 알레르기원성 또는 감작화 작용제는 http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html(예를 들어, e1071 1.5-24)로부터 입수 가능한 것들과 같은 서포트 벡터 머신(SVM)을 사용하여 식별된다. 그러나, 임의의 다른 적절한 수단이 또한 사용될 수 있다. SVM은 또한, 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 바이오마커를 포함하거나 이로 구성되는 바이오마커 서명의 ROC AUC를 결정하는 데 사용될 수 있다.
서포트 벡터 머신(SVM)은 분류 및 회귀에 사용되는 관련 감독된 학습 방법의 세트이다. SVM 훈련 알고리즘은 두 가지 범주 중 하나에 속하는 것으로 표시된 일련의 학습 예제가 주어지면 새로운 예제가 한 범주에 속하는지 아니면 다른 범주에 속하는지 예측하는 모델을 작성한다. 직관적으로, SVM 모델은 공간의 점으로 예제를 나타낸 것이고, 별도 카테고리의 예제가 가능한 한 광범위한 분명한 갭에 의해 나뉘어져 있도록 맵핑된다. 다음으로 새로운 예제가 해당 동일한 공간에 맵핑되고, 갭이 속하는 측에 기초하는 카테고리에 속할 것으로 예측된다.
보다 공식적으로, 서포트 벡터 머신은 분류, 회귀 또는 기타 작업에 사용될 수 있는 고밀도 또는 무한 차원 공간에서 초평면 또는 초평면 집합을 제작한다. 직관적으로, 임의의 부류의 가장 가까운 훈련 데이터 포인트(소위 기능적 마진)와의 거리가 가장 먼 초평면에 의해 양호한 분리가 달성되는데, 일반적으로 마진이 더 클수록 분류 기준의 일반화 오차가 더 작기 때문이다. SVM에 대한 더 많은 정보에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121-167]을 참조한다.
본 발명의 일 구현예에서, SVM은 본 발명의 방법을 수행하기 전에 기지의(known) 작용제(즉, 기지의 알레르기원성/감작제 또는 비-알레르기원성/비-감작제 작용제)의 바이오마커 프로파일을 사용하여 '훈련'된다. 이러한 훈련 시료를 진행함으로써, SVM은, 바이오마커 프로파일이 알레르기 및/또는 감작을 유도할 수 있는 작용제와 연관이 있는 것을 학습할 수 있다. 일단 훈련 과정이 완료되면, 다음으로 SVM은, 시험되는 바이오마커 시료가 알레르기원성 또는 비-알레르기원성/감작화 또는 비-감작화 작용제로부터의 것인지 아닌지 예측할 수 있다.
개별적인 SVM에 대한 결정값은 당업자에 의해 사례별로 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 시험(또는 이의 복제물)이 0 초과의 SVM 결정값을 갖는다면, 시험 작용제는 알레르기원성 및/또는 감작제로서 분류된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 시험(또는 이의 복제물)이 0 이하의 SVM 결정값을 갖는다면, 시험 작용제는 비-알레르기원성 및/또는 비-감작제로서 분류된다. 이는, 시험 작용제를 알레르기원성 또는 비-알레르기원성 / 감작화 또는 비-감작화로서 분류될 수 있게 한다.
그러나, 이 훈련 과정은 SVM을 필요한 훈련 매개변수로 미리 프로그램화하여 우회될 수 있다. 예를 들어, 알레르기원성 및/또는 감작화 작용제는 표 A 내지 E 중 하나 이상에 열거된 모든 바이오마커들의 측정에 기초하여, WO 2012/056236, WO 2013/160882 또는 WO 2016/083604에 기재된 SVM 알고리즘을 사용하여 기지의 SVM 매개변수에 따라 식별될 수 있다.
당업자는, 적합한 SVM 매개변수가 SVM 기계를 데이터(즉, 기지의 알레르기원성 및/또는 비-알레르기원성 작용제 또는 감작화 및/또는 비-감작화 작용제에 노출된 세포로부터의 바이오마커 측정)의 적절한 선택으로 훈련함으로써 표 A 내지 E에 열거된 바이오마커들의 임의의 조합에 대해 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 대안적으로, 표 A 내지 E 바이오마커는 당업계에 알려진 임의의 다른 적합한 통계학적 방법에 따라 알레르기원성 단백질 및/또는 감작화 작용제를 식별하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, 표 A 내지 E 데이터는 당업계에 알려진 임의의 다른 적합한 통계학적 방법(예를 들어, ANOVA, ANCOVA, MANOVA, MANCOVA, 다변량 회귀 분석, 주성분 분석(PCA), 인자 분석, 정준 상관 분석(canonical correlation analysis), 정준 상관 분석, 중복 분석 대응 분석(CA; 상호평균법(reciprocal averaging)), 다차원 척도법(multidimensional scaling), 판별 분석, 선형 판별 분석(LDA), 클러스터링 시스템, 재귀 분할(recursive partitioning) 및 인공 신경망(artificial neural network))에 따라 알레르기 및/또는 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 데 사용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 방법은 시험관내에서 수행된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 본 발명의 방법의 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)는 표 A, B, C, D 또는 E에 열거된 2개 이상의 바이오마커들, 예를 들어, 표 A, B, C, D 또는 E에 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390 또는 391개의 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 구성된다. 예를 들어, 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)는 표 A, B, C, D 또는 E에 열거된 모든 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
"발현"이란, 본 발명자들은 바이오마커의 존재, 수준 및/또는 양을 의미한다.
"바이오마커"란, 이의 측정이 시험 작용제의 감작화 효과 및/또는 알레르기원성을 결정하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있는 임의의 생물학적 분자, 또는 이의 구성성분이나 단편을 포함한다. 따라서, 표 A, B, C, D 및 E의 맥락에서, 바이오마커는 핵산 분자, 예컨대 mRNA 또는 cDNA일 수 있다. 대안적으로, 바이오마커는 핵산 분자 또는 탄수화물 모이어티에 의해 인코딩되는 단백질, 또는 이의 항원성 구성성분 또는 단편일 수 있다.
제7 양태의 방법의 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 시험 작용제는 피부의 감작을 유도하는 것으로 이미 알려져 있거나, 유도하는 것으로 의심되거나, 유도할 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제는 당업계에 이미 알려진 방법, 예를 들어 WO 2012/056236 및/또는 문헌[Johansson H et al. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro 2013]에 기재된 방법을 사용하여 피부의 감작을 유도할 수 있는 것으로 이미 알려져 있을 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 대안적인 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 시험 작용제의 피부 감작제 약효 및 피부 감작제/비-감작제 상태를 식별하기 위한(즉, 시험 작용제가 감작제인지 아닌지 식별하고, 피부 감작제로서의 이의 약효를 식별하기 위한) 것이다. 대안적인 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 WO 2012/056236 및/또는 Johansson H 등에서 기재된 방법을 사용하여 시험 작용제가 감작제인지 식별하는 단계를 포함한다.
"피부 감작화 약효"란, 본 발명자들은 작용제의 피부 감작화 능력의 강도를 포함하거나 이를 의미한다. 예를 들어, 작용제의 피부 감작화 능력의 상대 약효 또는 강도는 시험 작용제 군을 가장 강력한 것으로부터 최소로 강력한 것까지 또는 그 반대로 순서화하는 것을 유발할 것이고/것이거나, 하나 이상의 알려진 조절 또는 시스템에 따라 이들의 범주화를 유발할 것이다. "감작 상태"란, 본 발명자들은 화학적 엔터티(또는 화학적 엔터티들의 혼합물)가 감작제(예를 들어, 피부 감작제 및/또는 호흡기 감작제)인지 아닌지 포함하거나 의미한다.
"피부 감작화"란, 본 발명자들은 포유류에서 유형 IV 지연-유형 과민성 반응을 유도하고 촉발할 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. 바람직하게는, 유형 IV 지연-유형 과민성 반응은 DC-매개이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법에 의해 결정되는 피부 감작 약효는 유럽 분류, 표지화 및 포장(CLP; Labelling and Packaging) 규제(EC) 1272/2008(http://echa.europa.eu/clp-2015)에 따라 범주화된다. 이러한 시스템은 국제 연합의 국제 조화 시스템(GHS; Globally Harmonised System)과 2015년 6월부터는 성분과 혼합물 둘 다의 분류 및 표지화에 적용하기 위한 하나의 법령에 기초한다. 이는 회사들이 이들을 시장에 내놓기 전에 이들의 제품을 적절하게 분류하고, 표지하고 포장하는 것을 필요로 한다. 이는 범주를 제공한다: 1A(강함), 1B(약함), 또는 무범주(감작제 없음).
예를 들어, 상기 방법은 하기를 제공할 수 있다:
(i) 약효 범주 1A의 하나 이상의 작용제;
(ii) 약효 범주 1B의 하나 이상의 작용제; 및/또는
(iii) 약효 범주 무범주(no category)의 하나 이상의 작용제.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법에 의해 결정된 피부 감작 약효는 문헌[Basketter et al., 2014, 'Categorization of chemicals according to their relative human skin sensitizing potency,' Dermatitis, 25(1):11-21]에 기재된 시스템에 따라, 즉, 범주 1(가장 강한 감작제), 2, 3, 4, 5 또는 6(진(true) 비-감작제)(예를 들어, 표 4, 도 4)에 따라 범주화된다.
예를 들어, 상기 방법은 하기를 제공할 수 있다:
(i) 약효 범주 1의 하나 이상의 작용제;
(ii) 약효 범주 2의 하나 이상의 작용제;
(iii) 약효 범주 3의 하나 이상의 작용제;
(iv) 약효 범주 4의 하나 이상의 작용제;
(v) 약효 범주 5의 하나 이상의 작용제; 및/또는
(vi) 약효 범주 6의 하나 이상의 작용제(예를 들어, 본 표 8 및/또는 상기 Basketter 등, 2014를 참조).
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 피부 감작 약효는 국소 림프절 검정법(LLNA) 분류, 기니피그 최대화 시험(GPMT) 또는 무관찰-효과 수준(NOEL; no observed-effect level)에 따라 범주화된다.
LLNA의 상세한 설명에 대해서는, 문헌[Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice. Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8]을 참조하며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 기니피그 최대화 시험의 상세한 설명에 대해서는, 문헌[Magnusson, B. and A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76]을 참조하며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 피부 감작제 약효와 관련된 무관찰-효과 수준(NOEL) 시험의 상세한 설명에 대해서는, 문헌[Basketter et al., 2005, 'Evaluation of the skin sensitizing potency of chemicals by using the existing methods and considerations of relevance for elicitation' Contact Dermatitis, 52(1):39-43; 및 Griem, P., et al., 2003, 'Proposal for a risk assessment methodology for skin sensitization based on sensitization potency data.' Regul. Toxicol. Pharmacol., 38:269-290]을 참조하며, 이들은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. NOEL과 약효 수준 사이의 상관관계에 대해, 문헌[WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. Skin sensitization in chemical risk assessment. (IPCS 조화 프로젝트 문서: no. 5), ISBN 978 92 4 156360 4(특히, 페이지 26 내지 28의 표 1)]를 또한 참조하며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. CLP의 상세한 설명에 대해서는, (http://echa.europa.eu/clp-2015)를 참조하며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (a)에서 제공된 세포에서 사전결정된 약효의 피부 감작화 작용제에 노출되기 전과 노출된 후에 측정되고, 시험 작용제에 노출되기 전과 노출된 후에 하나 이상의 바이오마커 사이의 발현 차이는 단계 (b)의 피부 감작화 작용제의 약효를 나타낸다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (a)에서 제공된 세포에서 사전결정된 약효의 피부 감작화 작용제에 노출되기 전과 노출된 후에 측정되고, 단계 (c) 전과 후에 하나 이상의 바이오마커 사이의 발현 차이는 단계 (b)의 피부 감작화 작용제의 약효를 나타낸다.
'발현 차이'란, 본 발명자들은 제1 시료(예를 들어, 시험 작용제 시료)에서의 존재 및/또는 양이 제2 시료(예를 들어, 제어제 시료)와 상이함을 포함한다. 바람직하게는, 존재 및/또는 양은 비교 시료의 40% 이하, 예를 들어 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0% 이하이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 단계 (a)에서 제공된 세포에서 시험 작용제에 노출되기 전과 노출된 후에 측정되고, 하나 이상의 바이오마커 사이의 발현 차이는 단계 (b)의 시험 작용제의 피부 감작화 약효를 나타낸다. 따라서, 단계 (a)에서 제공된 세포는 음성 대조군과 시험 결과 둘 모두를 제공할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 단계 (a)에서 제공된 세포에서 시험 작용제에 노출되기 전과 노출된 후에 측정되고, 단계 (c) 전과 후의 하나 이상의 바이오마커 사이의 발현 차이는 단계 (b)의 시험 작용제의 피부 감작화 약효를 나타낸다. 따라서, 단계 (a)에서 제공된 세포는 음성 대조군과 시험 결과 둘 모두를 제공할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은:
(i) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 추가 집단을 제공하는 단계;
(j) 상기 단계 (i)에서 제공된 세포를 사전결정된 약효의 피부 감작화 작용제에 노출시키는 단계;
(k) 상기 단계 (j)의 세포에서 상기 단계 (c)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계
의 추가의 단계를 포함하고, 단계 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커와 단계 (k)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커 사이의 발현의 상응도(correspondence)는 시험 작용제의 피부 감작화 약효를 나타낸다.
'발현의 상응도'란, 본 발명자들은 제1 시료(예를 들어, 시험 작용제 시료)에서의 존재 및/또는 양이 제2 시료(예를 들어, 대조군 시료)에서의 존재 및/또는 양과 유사하거나 동일함을 포함한다. 바람직하게는, 존재 및/또는 양은 대조군 시료의 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은:
(l) 시험 작용제의 피부 감작화 약효를 식별하는 단계인 추가의 단계를 포함한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 사전결정된 약효의 피부 감작화 작용제는 1-부탄올, 4-아미노벤조산, 벤즈알데하이드, 클로로벤젠, 디에틸 프탈레이트, 디메틸 포름아미드, 에틸 바닐린, 글리세롤, 이소프로판올, 락트산, 메틸 살리실레이트, 옥탄산, 프로필렌 글리콜, 페놀, p-하이드록시벤조산, 칼륨 퍼망가네이트, 살리실산, 소듐 도데실 설페이트, Tween 80, 아연 설페이트, 2,4-디니트로클로로벤젠, 옥사졸론, 칼륨 디크로메이트, Kathon CG(MC/MCI), 포름알데하이드, 2-아미노페놀, 2-니트로-1,4-페닐렌디아민, p-페닐렌디아민, 헥실신나믹 알데하이드, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-머캅토벤조티아졸, 글리옥살, 신남알데하이드, 이소유게놀, 에틸렌디아민, 레조르시놀, 신나믹 알코올, 유게놀, 페니실린 G, 제라니올 및 DMSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제를 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 임의의 양태의 방법의 바람직한 구현예에서, 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)는 하나 이상의 바이오마커의 핵산 분자의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 구성된다. 핵산 분자는 DNA 분자, cDNA 분자 또는 mRNA 분자일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 mRNA 분자이다. 그러나, 핵산 분자는 cDNA 분자일 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현의 측정은 서던 혼성화, 노던 혼성화, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리버스 트랜스크립타제 PCR(RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 방사능사진촬영 및 인 시추(in situ) 혼성화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 측정된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커는 어레이(예를 들어, DNA 어레이)를 사용하여 측정된다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커는 전장 유전체 어레이(예를 들어, Affymetrix 인간 유전자 1.0 ST 어레이 또는 Affymetrix 인간 유전자 2.0 ST 어레이)를 사용하여 측정된다. 대안적인 또는 추가의 구현예에서, Nanostring nCounter 시스템이 사용된다(예를 들어, 전장 유전체 어레이(예를 들어, Affymetrix 인간 유전자 1.0 ST 어레이 또는 Affymetrix 인간 유전자 2.0 ST 어레이)로부터의 선택에 기초한 커스텀 Nanostring nCounter 코드 세트).
상기 방법은 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 각각의 결합 모이어티는 표 A, B, C, D, E 중 하나 이상에서 식별된 바이오마커들 중 하나를 인코딩하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 2개 이상의 바이오마커들의 발현을 2개 이상의 결합 모이어티들을 사용하여 측정하는 단계를 포함하고, 각각의 결합 모이어티는 표 A, B, C, D, E 중 하나 이상에서 식별된 바이오마커들 중 하나를 인코딩하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 바이오마커들의 임의의 특정 조합의 발현은 이들 바이오마커 각각에 선택적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티들의 동등한 조합을 사용하여 측정될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성된다. 추가의 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA를 포함하거나 구성된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개 뉴클레오타이드 길이이다. 그러나, 대안적인 구현예에서, 이들 결합 모이어티는 15 내지 35개 뉴클레오타이드 길이이다.
하나 이상의 결합 모이어티는 인간 유전자 1.0 ST 어레이(Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)로부터의 하나 이상의 프로브를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 프로브 식별 번호는 본원에서 표 A 내지 E에 제공된다.
적합한 결합제(또한 결합 분자 또는 결합 모이어티로서 지칭됨)는 하기 고찰된 바와 같이 주어진 핵산, 단백질 또는 아미노산 모티프에 결합하는 이들 결합제의 능력에 기초하여 라이브러리로부터 선택되거나 스크리닝될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함한다.
"검출 가능한 모이어티"란, 본 발명자들은 이의 존재 및/또는 상대 양 및/또는 장소(예를 들어, 어레이 상 장소)가 직접적으로 또는 간접적으로 결정되게 하는 모이어티를 포함한다.
적합한 검출 가능한 모이어티는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 특이적인 조건에 노출된 경우 검출될 수 있는 형광 및/또는 발광 및/또는 화학발광 모이어티일 수 있다. 이러한 형광 모이어티는 특이적인 파장 및 강도에서 방사선(즉, 광)에 노출되어 형광 모이어티의 여기를 야기함으로써, 검출될 수 있는 특이적인 파장에서 상기 형광 모이어티가 검출 가능한 형광을 방출할 수 있게 할 필요가 있을 수 있다.
대안적으로, 검출 가능한 모이어티는 (바람직하게는 검출 불가능한) 기질을 시각화 및/또는 검출될 수 있는 검출 가능한 생성물로 전환시킬 수 있는 효소일 수 있다. 적합한 효소의 예는 예를 들어 ELISA 검정법과 관련하여 하기에 보다 상세하게 고찰된다.
검출 가능한 모이어티는 방사성 모이어티일 수 있고, 방사성 원자를 포함하거나 이로 구성된다. 방사성 원자는 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 듀테륨, 트리튬, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티 (예를 들어, 방사성 원자); 또는 효소적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
명백하게, 검출되려는 제제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 시험 시료 및/또는 대조군 시료에서 하나 이상의 바이오마커 또는 선택된 단백질을 검출하는데 사용하기 위한 항체 분자)는 검출 가능한 모이어티가 쉽게 검출될 수 있도록 적절한 원자 동위원소를 충분히 가져야 한다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티이다.
방사성 표지 또는 다른 표지는 본 발명의 방법의 시료에 존재하는 바이오마커 및/또는 본 발명의 결합 모이어티 내로, 알려진 방식으로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 결합제가 폴리펩타이드인 경우, 이러한 결합제는 생합성될 수 있거나, 예를 들어, 수소 대신에 불소-19를 수반하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh 및 111In과 같은 표지는, 예를 들어 결합 모이어티에서 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법(문헌[Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57])은 123I를 혼입하는 데 사용될 수 있다. 참고문헌(문헌["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989])이 다른 방법을 자세하게 기재한다. 다른 검출 가능한 모이어티(효소적, 형광성, 발광성, 화학발광성 또는 방사성 모이어티와 같음)를 단백질에 컨쥬게이션시키는 방법은 당업계에 잘 알려져있다.
당업자는, 시험되려는 시료(들) 내 바이오마커는 상기 단백질의 존재, 양 및/또는 장소를 결정하는 것을 간접적으로 돕는 모이어티로 표지될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 모이어티는 다성분 검출 가능한 모이어티의 하나의 구성성분을 이룰 수 있다. 예를 들어, 시험되려는 시료(들) 내 바이오마커는 비오틴으로 표지될 수 있으며, 이는 검출 가능한 표지에 융합되거나 그렇지 않으면 접합된 스트렙타비딘을 사용하여 이들 바이오마커의 후속적인 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 제1 양태에 제공된 방법은 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서, 표 A 내지 E 중 하나 이상에서 정의된 하나 이상의 바이오마커의 단백질의 발현을 결정하는 단계를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 각각의 결합 모이어티는 표 A 내지 E 중 하나 이상에서 식별된 바이오마커들 중 하나에 선택적으로 결합할 수 있다. 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
용어 "항체"는 임의의 합성 항체, 재조합 항체 또는 항체 하이브리드, 예컨대 비제한적으로, 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 가변 및/또는 불변 영역의 파지-디스플레이에 의해 생성되는 단쇄 항체 분자, 또는 당업자에게 알려진 면역검정법 포맷에서 항원에 결합할 수 있는 다른 면역반응성 분자를 포함한다. 본 발명자들은 또한, 항체-유사 결합제, 예컨대 아피바디(affibody) 및 앱타머(aptamer)의 용도를 포함한다.
하나 이상의 단백질-결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티, 발광 모이어티, 화학발광 모이어티, 방사성 모이어티 및 효소적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가의 구현예에서, 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)는 하나 이상의 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합제를 포함하는 검정법을 사용하여 수행될 수 있으며, 상기 제2 결합제 또한, 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 적합한 제2 결합제는 제1 결합제와 관련하여 상기에서 상세히 기재되어 있다.
따라서, 시험되려는 시료 내 관심 단백질은 우선, 제1 결합제를 사용하여 단리되고/되거나 부동화될 수 있고, 그 후에, 상기 바이오마커의 존재 및/또는 상대 양은 제2 결합제를 사용하여 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 제2 결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 전형적으로 재조합 항체 또는 이의 단편이다. 편리하게는, 항체 또는 이의 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 제2 결합제는 항체-유사 결합제, 예컨대 아피바디 또는 앱타머일 수 있다.
대안적으로, 시험되려는 시료 내 단백질 상의 검출 가능한 모이어티가 특이적인 결합 짝(pair)의 구성원(예를 들어, 비오틴)을 포함하거나 이로 이루어진 경우, 제2 결합제는 특이적인 결합 짝의 상보적 구성원(예를 들어, 스트렙타비딘)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
검출 방법이 사용되는 경우, 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티; 효소적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 검출 가능한 모이어티의 예는 상기에 기재되어 있다.
혈청 또는 혈장 단백질을 검출하기에 바람직한 검정법은 모노클로날 항체 및/또는 폴리클로날 항체를 사용하는 샌드위치 검정법을 포함하여, 효소 연결 면역흡착 검정법(ELISA), 방사성면역 검정법(RIA), 면역방사선측정 검정법(IRMA) 및 면역효소적 검정법(IEMA)을 포함한다. 예시적인 샌드위치 검정법은 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 데이비드 등에 의해 미국 특허 4,376,110 및 4,486,530에 기재되어 있다. 슬라이드 상에서 세포의 항체 염색은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 세포학 실험실 진단 시험에서 잘 알려진 방법에 사용될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 상기 검정법은 ELISA(효소 연결 면역흡착 검정법)으로서, 이는 전형적으로, 보통 고체상 검정법에서 착색된 반응 생성물을 제공하는 효소의 사용을 수반한다. 양고추냉이 퍼옥시다제 및 포스파타제와 같은 효소가 널리 사용되어 왔다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방식은 NADP를 기질로서 사용하여, 이제 제2 효소 시스템의 조효소로서 작용하는 NAD를 발생시키는 것이다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 피로포스파타제는, 이 효소가 조직에 존재하지 않고 안정하며 양호한 반응 색상을 제공하기 때문에 양호한 컨쥬게이트를 제공한다. 루시퍼라제와 같은 효소에 기초한 화학발광 시스템이 또한, 사용될 수 있다.
비타민 비오틴과의 컨쥬게이션이 빈번하게 사용되는데, 왜냐하면 비오틴이 우수한 특이성 및 친화성으로 결합하는 효소-연결 아비딘 또는 스트렙타비딘과 상기 비오틴과의 반응에 의해 쉽게 검출될 수 있기 때문이다.
대안적인 구현예에서, 단백질 검출에 사용되는 검정법은 편리하게는 형광측정 검정법이다. 따라서, 제2 결합제의 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티, 예컨대 Alexa 형광단(예를 들어 Alexa-647)일 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법의 단계 (b) (c), (e), (g) 및/또는 (k)는 어레이를 사용하여 수행된다. 상기 어레이는 비드-기초 어레이 또는 표면-기초 어레이일 수 있다. 상기 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
어레이 자체는 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이들은 고체 지지체의 표면 상에 형성된, 각각이 유한 영역을 갖는, 이격된(즉, 별개의) 영역("스폿")을 갖는 선형 또는 2차원 구조로 형성된다. 어레이는 또한, 각각의 비드가 분자적 코드 또는 색상 코드에 의해 식별되거나 연속적 유동에서 식별될 수 있는 비드 구조일 수 있다. 분석은 또한, 각각의 스폿이 용액으로부터 분자 부류를 흡착하는 일련의 스폿에 걸쳐 시료가 통과되는 곳에서 순차적으로 수행될 수 있다. 고체 지지체는 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 보편적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 디스크, 실리콘 칩, 마이크로플레이트, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막, 니트로셀룰로스 막, 나일론 막, 다른 다공성 막, 비-다공성 막(예를 들어, 무엇보다도 플라스틱, 중합체, 퍼스펙스(perspex), 실리콘), 복수의 중합체 핀들 또는 복수의 미세적정 웰들, 또는 단백질, 폴리뉴클레오티드 및 다른 적합한 분자를 부동화시키고/거나 면역검정법을 수행하기에 적합한 임의의 다른 표면 형태일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 잘 알려져 있고, 일반적으로 단백질 분자, 폴리뉴클레오타이드 등을 고체 지지체에 가교, 공유 결합 또는 물리적 흡착시키는 것으로 구성된다. 대안적으로, 친화도-태그 또는 유사한 구축물을 통한 프로브의 친화도 커플링이 이용될 수 있다. 접촉식 또는 비-접촉식 프린팅, 마스킹 또는 포토리소그래피와 같은 잘 알려진 기법을 사용함으로써, 각각의 스폿의 장소가 정의될 수 있다. 검토를 위해 문헌[Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29) 및 Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9)]를 참조한다.
전형적으로 어레이는 마이크로어레이이다. "마이크로어레이"란, 본 발명자들은 적어도 약 100/cm2, 바람직하게는 적어도 약 1000/cm2의 별개의 영역의 밀도를 갖는 영역들의 어레이의 의미를 포함한다. 마이크로어레이 내 영역은 약 10 내지 250 μm 범위의 전형적인 치수, 예를 들어, 직경을 가지고, 대략 동일한 거리만큼 어레이에서 다른 영역들로부터 분리된다. 어레이는 대안적으로, 마크로어레이 또는 나노어레이일 수 있다.
일단 적합한 결합 분자(상기 고찰됨)가 식별되고 단리되면, 당업자는 분자생물학 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 어레이를 제작할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 또는 cDNA 등)이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (b), (c), (e), (g) 및/또는 (k)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커는 단백질 또는 폴리펩타이드이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 시험관내, 생체내, 생체외 또는 인 실리코(in silico)에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 방법은 시험관내에서 수행된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포를 배양하는 단계;
(ii) (i)의 세포를, 바람직하게는 정상 상태 성장기에서, 하나 이상의 웰에, 예를 들어, 하나 이상의 멀티-웰 검정법 플레이트의 웰에 접종하는 단계;
(iii) (ii)의 하나 이상의 웰(들)에 시험되려는 작용제(들)를 첨가하는 단계;
(iv) (ii)의 하나 이상의 개별 웰(들)에 양성 대조군(들)을 첨가하는 단계;
(v) (ii)의 하나 이상의 개별 웰(들)에 음성 대조군(들)을 첨가하는 단계; 및/또는 (ii)의 하나 이상의 개별 웰(들)을 비자극된 채로 두어, 배지 대조군을 수득하는 단계;
(vi) (iii) 내지 (v)의 웰 내의 세포를, 바람직하게는 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계; 선택적으로, (iii) 내지 (v)의 웰로부터 세포를 수합하는 단계; 및 더 선택적으로, 상층액을 제거하고 TRIzol 시약에 저장하는 단계;
(vii) 정제된 총 RNA를 (vi)의 세포로부터 단리하고, 선택적으로, mRNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
(viii) (vii)로부터의 개별적인 mRNA 전사체의 발현 수준을 예를 들어 어레이, 예컨대 Affymetrix 인간 유전자 1.0 ST 어레이를 사용하여 정량화하는 단계;
(ix) (viii)로부터의 데이터를 예를 들어, 적절한 알고리즘을 사용하여 엑스포트하고 정규화하는 단계;
(x) 표 A 내지 E 중 하나 이상의 바이오마커로부터 기원하는 (ix)로부터 데이터를 단리하는 단계;
(xi) 예측 모델, 예를 들어, 기왕 데이터(historical data) 상에서 이전에 확립되고 훈련된 프로즌(frozen) SVM 모델을 (x)의 데이터에 적용하여, 시험되는 작용제(들) 및 음성/양성 대조군(들)의 알레르기원성 또는 감작제 상태를 예측하는(예를 들어, 알레르기원/비-알레르기원 및/또는 감작제/비-감작제로서 분류하는) 단계.
"시험 단백질"이란, 본 발명자들은 알레르기원성 또는 감작 상태가 결정되려는 임의의 단백질 또는 단백질성 엔터티(또는 단백질 또는 단백질성 엔터티들의 혼합물)를 포함한다.
"알레르기원성"이란, 본 발명자들은 포유류에서 알레르기원이고/이거나 알레르기 반응을 유도할 수 있는 단백질(또는 단백질들의 혼합물)을 포함하거나 이를 의미한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 알레르기원성은 과민성 반응(예를 들어, 세포-매개 과민성 반응)을 포함한다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 과민성 반응은 유형 I 과민성 반응이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 과민성 반응은 호흡기 알레르기이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 제8 양태의 방법은 포유류에서 단백질의 감작 상태를 식별하기 위한 것이다. 예를 들어, 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 시험 단백질의 감작 상태를 나타낼 수 있다. "감작 상태"란, 본 발명자들은 시험 단백질(시험 단백질들의 혼합물)이 감작제(예를 들어, 피부 감작제 및/또는 호흡기 감작제)인지 또는 아닌지를 포함하거나 이를 의미한다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 포유류에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 단백질을 식별하기 위한 것이다. 예를 들어, 단계 (c)에서 측정되는 2개 이상의 바이오마커의 발현은 시험 단백질의 호흡기 감작화 효과를 나타낼 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은 호흡기 과민성 반응을 유도할 수 있는 단백질을 식별하기 위한 것이다. 바람직하게는, 과민성 반응은 체액성 과민성 반응, 예를 들어, 유형 I 과민성 반응이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 호흡기 알레르기를 유도할 수 있는 단백질을 식별하기 위한 것이다.
"시험 단백질의 호흡기 감작화 효과를 나타내는"이란, 본 발명자들은, 시험 단백질이 호흡기 감작제인지 아닌지 결정하고/하거나 호흡기 감작제로서의 시험 단백질의 약효를 결정하는 것을 포함한다. "호흡기 감작을 유도할 수 있는" 단백질이란, 본 발명자들은, 포유류의 기도에서 유형 I 즉시 과민성 반응을 유도하고 촉발시킬 수 있는 임의의 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다. 바람직하게는, 유형 I 즉시 과민성 반응은 DC-매개이고/이거나 T 세포로부터 Th2 세포로의 분화를 수반한다. 바람직하게는 유형 I 즉시 과민성 반응은 체액성 면역력 및/또는 호흡기 알레르기를 초래한다.
포유류 폐의 전도성(conducting) 구역은 기관(trachea), 기관지, 세기관지 및 종말 세기관지를 함유한다. 호흡기 구역은 호흡기 세기관지, 폐포관 및 폐포를 함유한다. 전도성 구역은 기도로 이루어져 있으며, 혈액과의 기체 교환을 갖지 않고, 기도를 개방한 채로 두기 위해 연골이 보강되어 있다. 전도성 구역은 흡입된 공기를 적시고, 이 공기를 37℃(99℉)까지 가온시킨다. 이는 또한, 모든 통로들의 벽 상에 놓인 섬모를 통해 입자를 제거함으로써 공기를 세정한다. 호흡기 구역은 혈액과의 기체 교환 부위이다.
일 구현예에서, "호흡기 감작을 유도할 수 있는" 단백질은 포유류에서 폐 상피 부위에서 유형 I 즉시 과민성 반응을 유도하고 촉발시킬 수 있는 단백질이다. 바람직하게는, 폐 상피 부위는 폐의 호흡기 구역에 있지만, 대안적으로 또는 추가로 폐의 전도성 구역에 있을 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 포유류에서 알레르기원성인 식품 단백질을 식별하기 위한 것이다. 예를 들어, 단계 (c)에서 측정되는 2개 이상의 바이오마커들의 발현은 식품 단백질의 알레르기원성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 식품 단백질의 알레르기원성은 유형 1 과민성 반응으로 인한 것이다.
포유류는 임의의 가축 또는 사육동물일 수 있다. 바람직하게, 포유류는 래트, 마우스, 기니피그, 고양이, 개, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게, 포유류는 인간이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 시험 작용제의 감작화 효과 및/또는 알레르기원성을 결정하기 위한, 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 수지상-유사 세포의 집단의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 분석용 키트가 제공되며, 상기 키트는:
i. 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는 어레이; 및
ii. 제1 양태 또는 제2 양태에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 세포 배양물; 및
iii. (선택적으로) 하나 이상의 제어제; 및
iv. (선택적으로) 사용 설명서를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 분석용 키트가 제공되며, 상기 키트는
i. 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어를 포함하는 어레이; 및
ii. 제1 양태 또는 제2 양태에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 세포 배양물; 및
iii. (선택적으로) 하나 이상의 제어제; 및
iv. (선택적으로) 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다.
당업자는 모든 비-상충적인 구현예들이 조합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 일 양태로부터의 구현예는 본 발명의 또 다른 양태에 동등하게 적용될 수 있다.
명세서에서 명확하게 선행-공개된 문서의 목록 또는 고찰은 상기 문서가 당업계의 일부이거나 보편적인 일반적 지식임을 인정하는 것으로 필수적으로 간주되어서는 안 된다.
이제, 본 발명의 소정의 양태를 구현하는 바람직한 비제한적인 실시예가 하기 도면을 참조로 기재될 것이다.
실시예 1
배경기술
알레르기 접촉 피부염(ACD)은 집단 중 대부분에 영향을 주는 염증성 피부병이다. 상기 알레르기 접촉 피부염은 피부 감작제에의 반복된 노출에 의해 야기되고, 습진과 같은 증상을 초래한다. ACD의 감작기는 피부 감작제가 면역 반응을 활성화시켜, 알레르기원 특이적인 효과기 T-세포 또는 기억 T-세포의 생성을 유발하는 것을 필요로 한다(1). 감작에 대한 알려진 기전은 잘 기재되어 왔다(1-4). 간략하게 말해서, 피부 감작제는 생존성 피부에 접근하며, 이 피부에서 상기 피부 감작제는 단백질과 반응하여 합텐(hapten)-단백질 복합체를 형성한다. 이들 합텐-단백질 복합체는 면역 신호를 발휘하는 상이한 면역 세포들 또는 구조 세포들에 의해 인지될 수 있다. 활성화된 수지상 세포는 합텐-단백질 복합체를 가공하고, 림프절로 이동하여, 이 림프절에서 상기 복합체를 MHC-분자 상에서 미접촉(naive) T-세포에 제시한다. 후속하여, 효과기 및 기억 T-세포들이 생성되고, 이들은 동일한 감작제에 재개된(renewed) 노출 시 염증 기능을 끌어 내어, ACD의 증상을 유발한다(3). 피부 접촉에서 알레르기 반응을 유도하는 화학물질의 능력을 평가하는 종래의 방법은 주로 동물 모델을 사용하여 수행되어 왔다(1). 법령 및 동향은 화학적 감작제의 평가를 위한 보다 양호하고 더 윤리적인 시험과내 방법을 제시하는 연구를 이끈다(5-7).
유전체 알레르기원 신속 검출(GARD)은 화학적 감작제의 평가를 위해 룬드 대학교 면역기술부에서 개발된 시험관내 검정법이다. 상기 검정법은 수지상 세포-유사 세포주로부터의 전사 프로파일을 사용하여(8), 화학물질의 감작화 잠재력을 예측한다(9). 전사 프로파일은 감작제를 비-감작제로부터 구별하는 데 있어서 가장 큰 예측 성능을 갖는 것으로 식별된 유전자로 구성된다. 유전자는 Affymetrix 마이크로어레이로부터 기원하는 전사 데이터 상에서 통계학적 데이터 마이닝(mining) 방법을 사용하여 식별되었다. GARD 예측 서명(GPS)에서 유전자의 어떠한 선험적(priori) 정보도 이들의 식별에 사용되지 않았으며, 이는 세포주에 특이적인 서명을 만들 수 있었다(10).
이제, 본 발명자들은 GARD 검정법에서 사용하기에 적합한 비-천연 발생 수지상-유사 골수성 림프종 세포주 "SenzaCell"(ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875; 2017년 3월 9일에 ATCC에 기탁됨)를 제공한다. SenzaCell는 GARD 방법에 또한 사용될 수 있는 MUTZ-3 수지상-유사 세포주와 비교되어 왔다. 이러한 비교는, 바이오마커의 패널의 발현이 비교되는 표현형 분석, 세포주의 전사 수준이 비교되는 전사 분석, 표현형 프로파일 및 전사 프로파일에서 많은 정량화 가능한 차이들을 드러내었던 이들의 DNA 서열과 기능적 분석의 비교를 포함하였다.
재료 및 방법
세포 유지
MUTZ-3(DSMZ, 독일 브라운슈바이크 소재(www.dsmz.de; DSMZ No. ACC 295)) 및 SenzaCell 세포를, 20% (V/V) 태아 소 혈청(FCS)(Thermo Fisher Scientific, 미국 메사추세츠주 월섬 소재) 및 40 ng/ml 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(Miltenyi Biotec, 독일 베르기슈 글라트바흐 소재)가 보충된 최소 필수 배지 알파(α-MEM)(GE Healthcare Life Sciences, 미국 유타주 로건 소재)에서 배양하였다. 이 보고서 전체에 걸쳐, 배지는 완전 배지로 지칭된다. 세포를 200,000개 세포/ml의 농도로 유지시키고, 배지를 3일 내지 4일마다 새로 교체하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다.
표현형 특징화
성장중인 세포를 수합하고, 계수하고, 완전 배지에서 200,000개 세포/ml의 농도로 접종하였다. 염색용 세포를 준비하기 위해, 1 ml의 세포 현탁액을 FACS 튜브로 옮겼다, 세포를 세척 완충제, 1% BSA(Saveen & Werner, 스웨덴 림함 소재)(w/V)와 함께 PBS(GE Healthcare Life Sciences)에서 2 세척하였다. 1 ml의 세척 완충제의 참가, 4℃, 1200 rpm에서의 원심분리 및 상층액의 제거에 의해 모든 세척 단계들을 수행하였다. 모든 제2 세척 후, 세포를 50 μl 세척 완충제에 재현탁시켰다. 항체; 이소타입 PE/FITC, CD40 FITC, CD54 PE, CD86 FITC(BD Pharmingen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재); CD1a FITC, CD5 FITC, CD14 PE, CD19 PE(DAKO); CD13 PE, CD123 PE, OX40L PE(Pharmingen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재); CD11b PE, CD34 FITC, CD32 FITC, CD80 PE, HLA-DR FITC, CD137 PE, CD16 PE, CD64 PE(BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재); BDCA-3 APC(Miltenyi, 독일 베르기슈 글라트바흐 소재); CD209 PE(R&D Systems, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재); BDCA-1 APC(eBioscience, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재); OX40 PE(BD Bioscience, 미국 캘리포니아주 산호세 소재); CD15 FITC(Milteny); TLR2 PE, TLR4 PE(biolegend, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 재현탁된 세포에 첨가하고, 암실에서 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 염색 후, 세포를 세척 완충제로 1회 더 세척한 다음, 200 μl의 세척 완충제에 재현탁시켰다. 세포를 유세포분석으로 분석할 때까지 4℃에 보관하였다. 데이터 획득 프로그램으로서 BD DIVA 소프트웨어(BD Bioscience)가 있는 FACS CANTO II(BD Bioscience) 상에서 유세포분석을 수행하였으며, 이때, 10,000개 사건이 각각의 시료에 대해 기록되었다. FACS Express V3(De Novo 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 이소타입 대조군 및 비염색된 세포를 사용하여 적절한 게이트(gate)를 설정하였다. 각각에서 기법 2벌 중복(duplicate)을 이용하여 3개의 개별 실험들에서 측정을 수행하였고, 각각의 실험은 각각의 마커 및 세포주에 대해 6개의 측정치를 발생시켰다.
발현 수준을 t-검정을 사용하여 비교하였으며, 이때, 발생된 p-값은 벤자미니 호흐베르크(Benjamini Hochberg) 방법을 이용하여 교정하여, 위발견율을 제어하였다. 클러스터링 알고리즘을 수행하여, 세포주들을 비교하였다. R(15)을 사용하여 클러스트링을 수행하였다. 부트스트랩 알고리즘을 수행하여, 발견된 클러스터의 안정성을 fpc(16) 패키지를 사용하여 평가하였다. 부트스트랩 알고리즘을 5000회 반복(iteration) 동안 진행시키고, 계산된 평균 자카드(Jaccard) 계수를 클러스터 안정성에서 지표로서 사용하였다.
DNA - 전장 유전체 시퀀싱
Quick-gDNATM 미니프렙(Zymo Research, 미국 캘리포니아주 어바인 소재)을 사용하여 MUTZ-3 및 SenzaCell 세포 둘 모두로부터의 DNA를 단리하였다 단리를 하기와 같이 수행하였다: 5*10^6개 세포를 수합하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 잔여 세포 펠렛을 Quick-gDNATM 유전체 용해 완충제에서 용해시키고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 용해된 세포를 공급된 스핀 컬럼에 로딩하고, 세척하였다. DNA를 RNAse/DNase 무함유 물에서 용출하였다. NanoDrop을 사용하여 DNA 농도 및 DNA 순도를 결정하였고, 품질을 젤 전기영동에 의해 평가하였다. DNA 전장 유전체 시퀀싱을 SciLifeLabs(스웨덴 스톡홀름 소재)에 의해 수행하였다. SciLifeLabs로부터의 서비스는 라이브러리 제조, 시퀀싱 및 최상 수행 기본 분석(best practice basic analysis)을 포함하였다. Illumina TruSeq PCR-프리, 350 bp를 이용하여 DNA 라이브러리를 제조하고, Illumina HiSeq X v2.5, PE 2x150 bp를 30X 커버리지에서 이용하여 시퀀싱을 수행하였다.
최상 수행 기본 분석은 bwa -mem을 사용하여 판독을 인간 조립체 빌드(build) 37로 맵핑하는 것을 포함하였다. 최상 수행 분석을 위한 유전체 분석 Toolkit(GATK) 작업 흐름(17, 18)은 변이체 콜링(calling)을 위해 뒤따랐고, 유전체 변이체 콜 포맷(gVCF) 파일을 SciLifeLabs로부터 전달받았다. 수득된 gVCF 파일을 병합하고, GATK 유전자형GVCFS를 사용하여 유전자형화하였다. GATK 작업 흐름에 의해 권고된 바와 같이 GATK 변이체 품질 점수 재보정(VQSR)을 사용하여 변이체를 추가로 가공하였다. VQSR은 새로운 변이체 품질 점수를 계산하고, 기계 학습을 사용하여 위양성 발견인 것으로 예측되는 변이체를 필터링한다. 재보정된 변이체 콜 포맷(VCF) 파일에 주석을 달고, 인간 조립 빌드 GRCh37.75에 대해 snpEff(19)를 사용하여 변이체 효과를 예측하였다. SnpSift(20) 사례제어(casecontrol)을 사용하여 어느 세포주에 독특한 변이체를 식별하고, SnpSift 필터를 사용하여 다른 변이체를 필터링하였다. 독특한 변이체의 목록을 이들의 유전자형 품질 점수에 의해 추가로 필터링하고, 20 미만의 점수를 갖는 변이체를 제거하였다(21). 마지막으로, 높은 또는 중간 정도의 영향을 갖는 것으로 예측된 변이체를 추가의 분석을 위해 보유하였다, PANTHER 분류 시스템(22)을, 변이체에 의해 영향을 받는 것으로 식별된 유전자의 분자 기능의 분류에 사용하였다.
RNA - RNAseq
총 RNA를 MUTZ-3와 SenzaCell 세포주 둘 모두로부터 단리하여, 3벌 중복의 RNAseq 시료를 발생시켰다. 200,000개 세포를 단리하고, TRIzol 시약(Thermo Scientific, 미국 메사추세츠주 월섬 소재)에 용해시켰다. Direct-zolTM RNA 미니프렙(Zymo research)을 사용하여 RNA를 단리하였다. 용해된 시료를 에탄올과 혼합하고, 스핀 컬럼에 첨가하였다. RNA가 결합되었고, 공급된 세척 완충제로 세척되었다. RNA를 RNase/DNase 무함유 물에서 용출시키고, Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)을 이용하여 품질 관리하였다. 시료를 RNA-seq를 위해 SciLifeLabs에 드라이 아이스 상에서 운송하기 전에 -80℃에 저장하였다. Illumina TruSeq 가닥 mRNA, 폴리-A 선택을 사용하여 라이브러리를 제조하였다. Illumina HiSeq Rapid 모드 v2, SR 1x50bp를 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. topHat v2.0.4(23)를 사용한 판독의 맵핑, 샘툴(samtools)(24)을 이용한 발생된 bam 파일의 소팅, 피카드-툴(piccard-tool)을 이용한 2벌 중복의 표시, 및 HTSeq(25)를 사용한 계수의 정량화를 포함하는 SciLifeLabs에 의해 최상 수행 기본 분석을 수행하였다.
수득된 계수 표를 R 내로 로딩하고, edgeR v3.14.0(26) 및 DESeq2 v1.12.4(27)를 사용하여 차별적인 발현 분석을 수행하였으며, 이는 정규화 및 음성 이항식(binomial) 모델을 계수 데이터에 맞추는 것을 수행하여, 효과적인 차별적인 발현 분석을 가능하게 하였다. 차별적인 발현(DE) 분석에 대한 권고된 작업 흐름을 두 패키지 모두에 대해 뒤따랐다. 시료의 PCA 그림을 분석할 때 발견된 배치 효과로 인해 실험 배치를 모델에 혼입하기 위해, 가설 시험에 사용되는 모델 매트릭스를 설계하였다. edgeR과 DESeq 둘 모두가 이를 0.05 미만의 위발견율로 유의하게 차별적으로 발현된 것으로 일컬어진다면 전사체는 차별적으로 발현되는 것으로 여겨졌다. 식별된 전사체가 맵핑된 분자 기능 및 생물학적 과정을, PANTHER 분류 시스템을 사용하여 분석하였다. 차별적으로 발현되는 전사체들 중에서 과표시(overrepresented) 또는 과소표시된(underrepresented) 유전자 종양학(GO) 텀(term)을 식별하기 위해, PANTHER만 사용하여 과표시 시험을 수행하였다. 계수 표에서 수득된 모든 비-제로 계수로서 배경 참조 목록을 제출하였으며, 이는 DE 분석 내로 도입된 동일한 목록이다. 식별된 GO 텀의 p-값은 본페로니 방법을 이용하여 교정하였다. 0.05 미만의 교정된 p-값을 갖는 GO 텀은 유의하게 과표시 또는 과소표시된 것으로 여겨졌다. 추가로, 신호전달 경로 영향 분석 v2.24.0(SPIA)(28) 및 KEGG 경로(29, 30) 릴리스 79.0을 사용하여 경로 분석을 수행하였다. 유의한 DE 전사체의 목록을 첨부된 log2-배수 변화 값과 함께 도입하였고, 모든 비-제로 전사체를 배경으로서 도입하였다. DESeq2 v1.12.4를 사용하여 log2-배수 변화 값을 계산하였다.
마지막으로, 표현형 분석 및 RNA-seq 분석의 결과에 대해 일치도(concordance) 분석을 수행하였다. 측정된 표면 마커에 상응하는 유전자를 표면 마커 발현과 비교하였다. 2가지 세포주들 사이에서 유의하게 상향조절/발현, 유의하게 하향조절/발현 또는 유의한 차이가 없음이라는 부류를 갖는 분류의 평가와 유사한 비교를 수행하였다. 따라서, RNA-seq 분석 및 표현형 분석이 전사체 발현 또는 표면 발현을 유의하게 더 높게 요구한다면, 이는 일치하는 결과인 것으로 여겨질 것이다. Cohens 카파(31)를 분석 방법들 사이에서 일치도의 지표로서 계산하였다.
기능적 분석
MUTZ-3을 GARD 검정법에 사용하여, SenzaCell과 비교하여 GARD 예측 서명을 사용하여 비-감작제로부터 피부 감작제를 구별하는 이의 능력을 평가하였다. GARD 표준 작동 절차는 (9)에서 상세히 이전에 기재되었던 것을 따랐다. 간략하게 말하자면, 세포(MUTZ-3 또는 SenzaCell)를 24-웰 플레이트에 1.8 ml의 부피 및 222,000개 세포/ml의 세포 농도로 접종하였다. 자극에 사용된 화학물질은 (2, 4)-디니트로클로로벤젠(DNCB) 및 2-하이드록시에틸아크릴레이트였다. 비자극된 시료를 또한, 음성 대조군으로서 포함시켰다. DNCB를 DMSO에 4 mM의 농도까지 용해시키고, 2-하이드록시에틸아크릴레이트를 물에 100 mM의 농도까지 용해시켰다. 그 후에, 두 화학물질 모두를 20% FCS가 보충된 α-MEM에서 100X 희석시키고, 마지막으로 한번 더 10X 희석시키고 200 μl를 웰에 첨가하였다. 자극을 위한 웰-내 농도는 DNCB 및 2-하이드록시에틸아크릴레이트에 대해 각각 4 μM 및 100 μM이었다. 200 μl의 MEM-알파를 비자극된 세포에 첨가하여, 모든 시료에 대해 200,000개 세포/ml의 웰-내 세포 농도를 제공하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 화학물질과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 RNase 무함유 에펜도르프 튜크 내로 수합하고, TRIzol에 용해시켰다. 프로피디움 요오다이드(PI)(Thermo Fisher Scientific) 염색을 사용하는 유세포분석에 의해 세포 생존력을 평가하였다. RNA를 추출하고, Direct-zol RNA 키트(Zymo research)를 사용하여 정제하였다. RNA를 기재된 바와 같이 추출하고, 8 이상의 RNA 온전성 수(RIN; RNA integrity number)와 함께 Agilent Bioanalyzer 2100Samples를 사용하여 품질 관리하였고, 20 ng/μl 이상의 RNA 농도를 정량화에 사용하였다. NanoString nCounter 시스템(NanoString Technologies, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여, 제조업체에 의해 공급되는 프로토콜 및 시약을 사용하여 GPS(하기 표 A 참조) 내 유전자를 정량화하였다. 유전자의 원(raw) 계수를 NanoString으로부터 엑스포트하고, 총 계수 당 계수 정규화에 의해 정규화하였으며, 이때, 각각의 유전자의 계수를 단일 시료에 대한 계수의 합계로 나눈다. 복제물(10) 내 40가지의 화학적 자극의 유전자 프로파일로 이루어진 훈련 세트와 함께 R 패키지 e1071(32)로부터의 서포트 벡터 머신에 의해 분류를 수행하였다. 두 데이터 세트 모두에서 비자극된 시료에 대한 처음 4개 주성분에서의 이동(shift)을 계산함으로써 분류 전에 데이터를 훈련 데이터와 정렬시켰다. 그 후에, 계산된 이동을 사용하여, 시험 시료들로부터의 모든 시료를 조정하였다.
GARD 예측 서명을 사용하여 비-감작제로부터 피부 감작제를 구별하는 방법은 또한, WO 2012/056236; 문헌[Johansson et al. (2017) Evaluation of the GARD assay in a blind Cosmetics Europe study. ALTEX Online first February 17, 2017; Forreryd et al. (2016) From genome-wide arrays to tailor-made biomarker readout - Progress towards routine analysis of skin sensitizing chemicals with GARD. Toxicolgy In Vitro; Johansson et al. (2014) GARD in-house validation - A proof of concept. Tox Sci; Johansson et al., (2011) A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics, 2011)]에 상세히 기재되어 있으며, 이들은 각각 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
결과
표현형 분석
MUTZ-3과 비교하여 SenzaCell에서 표현형 차이의 임의의 지표를 조사하기 위해, 표 I, 표면 마커 패널의 발현을 두 세포주 모두에서 측정하였다. 선택된 표면 마커는 수지상 세포, 골수 세포, 조혈모 세포 또는 세포 활성화와 연관이 있다. 양성 세포의 집단을 계산하고, 집단 크기를 t-검정을 사용하여 비교하였다. 측정된 26개의 표면 마커 중에서, 12개는 0.05 미만의 위발견율이 유의한 것으로 여겨지는 경우 세포주들 사이에서 유의하게 차별적으로 발현되었으며, 표 I에서 음영 처리된 열을 참조한다. 차별적으로 발현된 표면 마커는 CD1a, CD11b, CD14, CD34, CD15, CD32, CD40, CD54, HLA-DR, CD64, 톨 유사 수용체(TLR) 4 및 TLR-2이었다. 그러나, CD54의 발현은 세포주에서 거의 동일하고, 최고 수득 가능한 값에 근접하며, 주의해서 해석되어야 한다. 발현은 또한, 바이너리(binary)으로서 여겨졌는데, 표면 마커가 검출된 경우 +로, 그리고 검출되지 않은 경우 -로 여겨졌다. 표면 마커의 바이너리 발현은 세포주들 사이에서 매우 유사하였다. 상이한 바이너리 발현을 보여준 유일한 표면 마커는 CD80 및 가능하게는 OX40L이었다. 계층적 클러스터링 알고리즘을 수행하여, 세포주를 더 비교하였으며, 도 1을 참조한다. 클러스터링을 2개의 개별 클러스터에서 MUTZ-3 및 SenzaCell을 그룹화한다. 재시료화와 함께 부트스트랩 알고리즘을 수행하여, 식별된 클러스터의 안정성을 평가하였다. SenzaCell 및 MUTZ-3에 대한 평균 자카드 계수는 각각 0.85 및 0.89인 것으로 결정되었으며, 이는 안정한 클러스터를 나타낸다.
Figure pct00005
전장 유전체 시퀀싱
전장 유전체 시퀀싱을 수행하여, SenzaCell과 MUTZ-3 사이에서 유전적 차이의 지표를 식별하였다. 지표는 어느 세포주에서만 발견된 변이체로 표현될 수 있었다. 조사되는 변이체는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 삽입 또는 결실로 구성되었다. 세포주에서 발견된 원 변이체의 수는 SenzaCell 및 MUTZ-3에서 각각 5,080,918 및 5,073,307이었다. gVCF 파일을 병합하고 발생시켰으며, 출력된 VCF 파일에서 변이체 품질 점수를 재보정하였다. 낮은 품질 점수를 갖는 변이체를 필터링하고, 추가의 분석으로부터 제거하였다. 세포주 유전체와 기준 유전체 사이의 유사성은 두 세포주 모두에 대해 99.86%인 것으로 계산되었으며, 대략 720 bp 당 1개 변이체의 변이체 빈도를 초래하였다. 하나의 세포주가 식별된 변이체를 갖는 위치 및 다른 세포주가 기준 유전체와 상동성인 위치를 밝힘으로써, 세포주 중 어느 것에 독특한 변이체를 식별하였다. 추가의 필터링을 수행하여, 유전자형 품질 점수에서 필터링에 의해 동형접합성 콜의 확실성이 낮은 변이체를 제거하였다. 수득된 변이체 목록은 SenzaCell에서만 밝혀질 수 있었던 7,977개 변이체 및 MUTZ-3 세포주에 독특한 5,672개 변이체로 구성되었다. 변이체 목록이 유의하게 저하되었긴 하지만, 세포에 영향을 가질 수 있는 돌연변이를 식별하기 위해서는 추가의 필터링이 필요하였다. 따라서, 변이체를 필터링하여, 낮은 영향 돌연변이를 제거하였다. SenzaCell에서 높은 또는 중간 정도의 영향을 갖는 것으로 예측되었던 돌연변이는 표 2에서 알 수 있고, MUTZ-3에 대해 식별된 변이체는 표 3에서 알 수 있다. 14개의 변이체를 기재된 기준과 매칭한 SenzaCell에서 발견하였고, 28개를 MUTZ-3에서 발견하였다. 예측되는 효과는 아미노산 치환으로부터 보다 심각한 돌연변이, 예컨대 스플라이스 부위에서 새로운 정지 코돈 또는 변화를 얻는 것까지의 범위였다. 변이체에 의해 영향을 받았던 유전자를 맵핑할 수 있는 생물학적 과정을 PANTHER를 사용하여 결정하였고, 도 2 및 도 3을 참조한다.
마지막으로, 유사한 필터링 전략을 수행하여, 세포주에서 식별될 수 있는 보편적인 변이체의 수를 결정하였으며, 이는 4,298,116개 변이체의 식별을 초래하였다.
Figure pct00006
Figure pct00007
RNA-seq 분석
세포주의 전사물들을 비교하여, 정상적인 성장 동안 세포 상태를 평가하고, 이들 사이에서 임의의 차이를 식별하였다. 시료의 PCA 그림을 생성하고 계층적 클러스터링 분석, 도 4를 수행함으로써 데이터의 초기 분석을 수행하였다. 시료 3으로부터의 시료가 처음 2개의 실험으로부터의 시료와 비교하여 제2 주성분에서 편차값을 나타내었으므로 PCA 그림은 배치 효과의 존재를 나타내었다. 실험 3으로부터의 시료는 또한, 계층적 클러스트링에서 개별 클러스터를 형성하였으며, 이는 배치 효과가 데이터에 영향을 주었다는 관찰을 추가로 강화한다. 처음 2개의 실험으로부터 수득된 시료는 더 유사한 것으로 보였고, 동일한 세포주로부터의 시료는 개별 군 및 클러스터를 형성하였다. EdgeR 및 DESeq를 사용하여, 세포주들 사이에서 차별적으로 발현된 전사체에 대해 검색하였으며, 이때, 관찰된 배치 효과를 설명하기 위해 일반화된 선형 모델을 지정하였다. 3644개의 전사체는 유의하게 차별적으로 발현되는 것으로 식별되었다(부록 표 1에 열거됨). 식별된 전사체를 PANTHER를 사용하여 분자 기능 및 생물학적 과정에 대해 맵핑하였다(도 3). 대부분의 전사체를 분자 기능, 촉매적 활성, 및 결합 및 생물학적 과정, 세포성 과정 및 대사 과정에 대해 맵핑하였다. 그 후에, 과표시 시험을 수행하여, 임의의 생물학적 과정이 DE 전사체들 중에서 유의하게 과소표시 또는 과표시되었는지 조사하였다. 94개의 GO 텀은 0.05 미만의 본페로니 보정된 p-값과 함께 통계학적으로 과소표시 또는 과표시로서 식별되었으며, 부록 표 2를 참조한다. 세포주들 사이에서 차이에 대한 추가의 이해(insight)를 얻기 위해, 위상학적 경로 분석을 또한 수행하였다. 경로 분석은 SenzaCell, 표 4와 비교하여 MUTZ-3에서 19개의 활성화된 신호전달 경로 및 2개의 저해된 신호전달 경로를 발견하였다.
GPS에서 선택된 유전자의 조절은 GARD 검정법에서 감작제 및 비-감작제의 식별 및 분리에 중요하다. 따라서, GPS에서의 유전자를 DE 전사체와 비교하였으며, 이는 두 목록 모두에서 43개 전사체가 밝혀졌음을 드러내었다. 이는, GPS 내 유전자의 거의 22%가 세포주들 사이에서 차별적으로 발현되었음을 실증하였다.
표현형에서의 결과와 RNA-seq 데이터 사이의 비교를 수행하여, 분석 방법을 조사하고, 가능하게는 발견사항에 더 많은 타당성을 주었다. 바이오마커 패널 및 이들의 상응하는 유전자를 일치도 분석에서 비교하였다. 비교는, SenzaCell과 비교하여 MUTZ-3에서 유의하게 더 높은 그룹, 유의하게 더 낮은 그룹 또는 상이하지 않은 그룹으로 분류 태스크의 평가로서 수행되었다. 분석은 0.44의 Cohens 카파 값을 초래하였으며, 이는 2가지 방법들 사이에서 일치도를 제시하고, 표 1에서 각각의 마커에 대한 발현을 참조한다. 증가된 발현을 보여준 10개의 표면 마커 중 8개는 또한, RNAseq 분석에서 증가된 발현을 보여주었다. CD54는 MUTZ-3에서 증가된 유전자 발현을 보여주었으며, 이때 표면 마커 발현에 반대된다. TLR2에 대한 유전자는 차별적으로 발현된 것이라고 지칭되지 않는다. 콜 유의하지 않은 14개의 표면 마커 중 8개는 차별적으로 발현된 유전자를 갖지 않았다. 그러나, 나머지 6개 마커에 대한 유전자 발현 수준은 차별적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. CD34는 전사 수준과 표면 발현 둘 모두에서 MUTZ-3에서 유의하게 더 낮은 발현 수준을 갖는 것으로 밝혀진 유일한 마커이다. HLA-DR은 이의 복잡한 유전학으로 인해 이 비교에서 배제되었다.
Figure pct00008
기능적 분석
잘-확립된 검정법 작업 흐름에서 세포를 사용함으로써, 화학적 노출 후 GARD 예측 서명(GPS)에서 유전자의 발현을 분석하는 경우 피부 감작제를 구별하는 MUTZ-3 및 SenzaCell의 능력을 평가하였다. 2-하이드록시에틸아크릴레이트 및 DNCB를 사용하여 세포를 자극시켰고, 비자극된 시료를 음성 대조군으로서 사용하였다. RNA를 정량화하고, SenzaCell로부터의 유전자 프로파일 상에서 훈련된 SVM 모델을 사용하여 시료를 분류하였다. MUTZ-3과 SenzaCell 둘 모두를 사용하여 화학물질을 감작제로서, 그리고 비자극된 시료를 비-감작제로서 올바르게 분류하였다, 도 6. 나아가, 2-하이드록시에틸아크릴레이트가 DNCB보다 더 높은 예측값을 갖는 예측 패턴은 SenzaCell을 이용하여 수득된 것처럼 MUTZ-3에 대해 유사하다.
고찰
알레르기 접촉 피부염은 사회에 대해 상당한 비용을 야기하는 점점 만연하고 있는 질환이다. 피부 감작제와의 접촉은 화학물질과 생물분자 사이에서 형성되는 복합체를 공격하는 면역 반응을 촉발시켜, 건강한 조직(1) 상에서 공격을 초래할 수 있다. ACD를 유도하는 화학물질의 능력의 평가는 ACD에 의해 영향을 받는 사람의 수를 감소시키기 위해 중요하다. 감작 시험에 대한 금본위, 국소 림프절 검정법(LLNA)(33)은 동물 시험에 의존하고, 보다 윤리적인 시험관내 검정법(6, 7, 34)에 의해 사라지고 있다. GARD 검정법은 GARD 예측 서명에서 유전자의 유전자 발현을 분석함으로써 감작제와 비-감작제를 구별하는 시험관내 검정법이다. 전사체는 시험 화학물질에 노출되었던 수지상 세포-유사 세포주로부터 단리된다. 상기 검정법은 감작제(9)를 인지하며 이의 유전자 발현을 적응시켜, 변화를 정량화하고 감작제를 인지하는 것을 학습하게 할 수 있는 세포주의 내재적(innate) 의사 결정에 의존한다. MUTZ-3 및 SenzaCell은 수지상 세포를 닮은 이들의 능력으로 인해 이러한 임무에 적합하며, 이는 항원을 인지하고 면역 반응을 조화롭게 하는 데 중요하다.
SenzaCell을 MUTZ-3과, 이들의 표현형, 유전자형을 특징화하고, 검정법에 사용된 경우 비-감작제로부터 감작제를 구별하는 세포주의 능력을 평가함으로써 비교하였다. 표면 마커 패널의 발현 수준을 두 세포주 모두에 대해 결정하였다. 그 결과는, 26개의 표면 마커 중 12개가 SenzaCell과 비교하여 MUTZ-3에서 상이한 발현 수준을 가졌음을 실증하였다. 브투스트래핑과 함께 계층적 클러스터링은 또한, 세포주를 상이한 안정한 클러스터로 그룹화하는 확률을 보여주었으며, 이는, 세포주가 실험 과정에 걸쳐 다른 세포주보다 그 자체와 더 유사함을 내포한다. MUTZ-3에서 더 높은 발현값을 가진 표면 마커는 CD1a, CD11b, CD14, CD15, CD32, CD40, CD64, TLR2 및 TLR4인 한편, CD34, CD54 및 HLA-DR은 더 낮은 발현값을 가졌다. MUTZ-3 세포는 CD14 및 CD34 발현에 기초하여, 3개의 하위집단; CD34+ CD14-, CD34- CD14- 및 CD34- CD14+로 나뉠 수 있다. 집단에 대한 이전의 분석은, CD34+ CD14- 가 다른 집단(35)을 유발하는 증식중인 집단임을 드러내었다. 따라서, SenzaCell과 MUTZ-3 사이에서 일부 차이는 가능하게는 하위집단들 사이에서의 차이에 의해 설명될 수 있었으며, 예를 들어, MUTZ-3에서 CD14 + 세포의 증가된 양은 가능하게는 증가된 CD11b+ 발현(35)을 설명할 수 있었다. 그러나, 이용 가능한 데이터를 고려하여, 발현에서 상이한 수준들은 하위집단의 상이한 크기들로 인해 단독으로 설명될 수는 없다. CD1a는 두 세포주 모두에서 발현되고, 이는 미분화된 MUTZ-3 (8, 35, 36)에서는 기록된 적이 없었다. 따라서, CD1a의 발현은 보다 수지상 세포 유사 표현형으로 향하는 MUTZ-3 세포의 분화를 나타낼 수 있었다. MUTZ-3은 더 큰 CD1a 양성 세포의 집단을 나타내었고, 이는 MUTZ-3가 SenzaCell보다 더 분화된 것임을 나타낼 수 있었다. MUTZ-3이 더 분화될 수 있다는 것을 추가로 내포하는 증거는 증가된 CD40 발현으로부터 나오며, 상기 CD40은 세포가 DC 표현형(37)으로 분화함에 따라 발현이 증가하는 마커이다. CD1a와 CD40 둘 모두가 MUTZ-3에서 더 높은 수준으로 발현되긴 하지만, 다른 표면 마커의 발현은 대조(contrary)의 증거를 보여준다. HLA-DR은, 이의 발현이 분화와 함께 중간 정도 증가하는 것으로 보여진 또 다른 마커이고, HLA-DR은 SenzaCell에서 더 발현되어, 세포주들(37) 사이에서 분화의 동등하지 않은 수준에 관하여 임의의 결론을 도출하는 것을 어렵게 만든다. 나아가, 세포주의 형태 중 어느 것도, MUTZ-3가 분화함에 따라 형성되는 특징적인 수상돌기를 나타내지 않는다(데이터는 제시되지 않음). 차별적으로 발현되는 표면 마커, 예를 들어, FC-감마 수용체 CD32 및 CD64(38), 병원체 인지 수용체(PRR) TLR2 및 TLR4 (39-41) 또는 탄수화물 접착 분자 CD15(42)의 역할을 고려하면, 많은 것들은 골수 세포 분화와 관련이 있다. 이는, 관찰된 차이를 책임지는 일부 형태의 분화가 존재함을 나타낼 수 있었지만; 분화 과정의 성질은 수득되는 발현값만 사용하여 결정하기에는 어렵다.
전장 유전체 시퀀싱을 수행하여, 세포주의 유전체를 비교하고 유전적 차이의 지표를 검색하였다. 식별된 변이체의 수는, 전형적인 사람은 기준 유전체(43)와 비교하여 410만 내지 500만 부위에서 상이한 것으로 예상되는 범위 내에 있다. 세포주에 독특한 변이체를 식별하였고, 이들의 예측되는 영향을 평가하였다. 종합하여, SenzaCell에서는 7,977개의 독특한 변이체들이 발견되었고, MUTZ-3에서는 5,672개가 발견되었다. 발견된 독특한 변이체의 수를 보편적인 변이체의 수와 비교하는 것은 관찰된 차이가 작게 보이게 만든다. 그러나, 낮은 영향을 갖는 변이체를 필터링하고 중간 또는 높은 영향을 갖는 것으로 예측되는 변이체를 평가하는 경우, 상황은 역전되었다. 14개의 변이체가 SenzaCell에서 발견되었고, 28개의 돌연변이가 MUTZ-3에서 발견되었다. 이들 결과에 대한 원인들 중 하나는 변이체를 식별하는 데 사용된 방법의 무감응(insensitivity)으로 인한 것일 수 있다. 전장 유전체 시퀀싱은 10억개의 판독을 발생시키는 고 처리량 방법이다. 판독을 해독 가능한 결과로 변환시키는 과정은 어렵고 진행중인 과제이다. 그러나, 발견된 변이체가 세포주에 독특하고 검출로부터의 인공물(artifact)이 아님을 가정하면, 이들 변이체는 다른 생물학적 과정의 생성물일 수 있을 것이다. 유전적 차이는 세포주가 성장함에 따라 선택적인 압력에 의해 야기될 수 있다. MUTZ-3가 이의 유전체에서 상이한 변이체들을 갖는 하위집단을 함유한다면, 이들 중 일부가 SenzaCell에서 상실되었다는 것은 가능하다. 유전적 이종성은 세포주(44)에서 이미 제시되었다. 또 다른 가능성은, MUTZ-3가 SenzaCell과 병행하여 확장되었으며, 이는 발견된 변이체를 발생시킬 수 있었다는 것이다. MUTZ-3 세포주의 병행 팽창은 SenzaCell 세포에서는 부재하는 독특한 변이체의 발견을 초래할 수 있을 것이지만, 높은 또는 중간 정도의 영향을 더 높은 빈도로 갖기 위해서는 돌연변이를 필요로 할 것이다. 계속된 병행 팽창은 세포주들 사이에서 추가의 차이를 가능하게는 도입할 수 있을 것이다. 돌연변이에 의해 영향을 받는 것으로 예측된 유전자에 대해 맵핑된 생물학적 과정은 일반적인 텀이고, 이로부터 기능적인 결론을 도출하는 것은 어렵다. 이는, 돌연변이가 갖는 영향, 예를 들어, 생성된 단백질에서 아미노산이 또 다른 아미노산으로 변하는 미스센스 변이체의 효과를 고려할 때 훨씬 더 어려워진다. 그러나, 유전자 목록의 연구는 흥미로운 변이체를 드러낸다. MYB 유전자에서 MUTZ-3에서 밝혀진 높은 영향 변이체는 관련 발견일 수 있을 것이다. MYB는 줄기세포 또는 전구 세포(45)의 조절에서 통상적으로 중요한 기능을 갖는 식별된 발암유전자이다. 또 다른 흥미로운 관찰은 WISP1 유전자에서 그리고 MUTZ-3에서의 돌연변이이다. WISP1은, 세포-세포 상호작용 및 줄기세포 조절과 제어(46-48)를 매개하는 데 있어서 중요한 역할을 갖는 WNT 신호전달 경로에서 작용한다. 이들 돌연변이 둘 모두는 세포주의 기능 및 조절에 중요할 수 있을 것이고, SenzaCell에서 이들 변이체의 결여는 기능적인 영향을 가질 수 있을 것이다.
통상적인 배양 동안 RNA-seq를 사용한 전사 수준의 정량화에 의해 세포 전사물의 분석을 수행하였다. 발현 수준의 비교는, 3644개의 전사체가 차별적으로 발현되었음을 드러내었고, 이는 제로 계수 전사체를 제거한 후 분석되었던 모든 전사체들 중 10%에 근접한다. 높은 수의 차별적으로 발현된 유전자는, 세포주들 사이에서 큰 차이가 분자 수준에서 관찰될 수 있음을 시사한다. 과표시 시험 및 위상학적 경로 분석을 수행하여, 식별된 유전자가 세포 상에서 가질 수 있을 잠재적인 영향의 보다 양호한 이해를 얻었다. 94개의 생물학적 과정 GO 텀은 식별된 전사체들 중에서 과표시 또는 과소표시로서 식별되었다. 세포주들 사이에서 차이를 식별하는 비교 분석으로 인해, 과표시 텀은 가장 중요하다. 과소표시 텀은 예를 들어, 세포 기능에 필요한 중추적인 생물학적 과정을 식별하기 위해 다른 유형의 분석에서 흥미로울 수 있다. 그러나, 대부분의 식별된 GO 텀은 과표시되었다. 일부 GO 텀을 간략하게 언급하기 위해, 골수성 백혈구 활성화 및 백혈구 화학주성은 예상되는 수의 전사체와 관찰된 수의 전사체 사이에서 가장 큰 배수 변화를 갖는 생물학적 과정으로서 식별하였다. 이들 텀 둘 모두는 외부 자극(49)에 대한 반응을 나타낸다. MAP 키나제 활성의 양성 조절은 또한, 많은 관련된 GO 텀들을 이용하여 식별되었다. MAP 키나제는, 세포 분화, 세포 증식 및 세포 사멸(50)과 같은 중요한 세포성 과정을 제어하는 신호전달 경로에 수반된다. 상이한 염증 반응 및 면역 과정들 또한, 과표시되는 것을 식별되었고, 이는 GARD 검정법에서 SenzaCell의 기능적 역할로 인해 중요할 수 있을 것이다. RNA-seq 데이터의 분석을 계속하여, 경로 분석을 수행하여, 세포주들 사이의 차이에 대한 추가의 지식을 얻었다. 경로 분석은, SenzaCell와 비교하여 MUTZ-3 세포에서 유의하게 활성화된 19개의 신호전달 경로 및 저해된 2개 경로를 발견하였다. MAP 키나제 신호전달 경로는 MUTZ-3에서 활성화되는 것으로 식별되었다. MAP 키나제 활성은 또한, 과표시된 생물학적 과정으로서 식별되어, 세포주들 사이에서 세포 과정에서의 변화의 추가 증거를 제공하였다. NF-카파 B 신호화는 활성화된 것으로 발견된 또 다른 흥미로운 경로로서, 염증 반응에 긴밀하게 연관되어 있다(51). 활성화된 톨-유사 수용체 신호화와 더불어 이들 관찰은 염증 반응의 결과일 수 있을 것이다.
기능적 분석은 MUTZ-3가, 검정법에서 SenzaCell을 사용한 경우 달성되는 것과 유사한 예측을 생성할 수 있었음을 보여주었다. 감작제 DNCB 및 2-하이드록시에틸아크릴레이트는, GPS에서 유전자의 전사 수준을 평가함으로써 감작제로서 올바르게 예측되었다. 예측된 결정값은 또한, 2개의 세포주들 사이에서 유사한 패턴을 보여주었다. 그러나, 화학물질을 분리하는 능력은 유사성의 임의의 측정치를 직접적으로 제공하지 않는다. 세포는 자극에 유사하게 반응하고 GPS는 이들 변화를 잘 포착한다는 것이 가능하다.
비교들을 요약하자면, 본 발명자들은 표현형 분석을 완성하였고, 상기 분석은 26개의 표면 마커 중 12개가 MUTZ-3과 SenzaCell 사이에서 차별적으로 발현되었음을 드러내었다. 발현값 상에서의 클러스터 분석은 세포주들을 분리하는 2개의 개별 클러스터들을 형성한다. 전장 유전체 시퀀싱은, 모든 발견된 변이체들을 평가하였을 때 SenzaCell 세포주에서 더 독특한 변이체를 식별하였다. 낮은 영향 변이체를 필터링하는 경우, MUTZ-3 세포주는 SenzaCell 세포주에서 14개의 변이체와 비교하여 28개의 변이체를 함유하였다. 일부 식별된 변이체는 세포의 기능에 중요한 영향을 가질 수 있을 것이다. RNA-seq 분석은 차별적으로 발현된 3644개의 전사체를 밝혀내었다. 과표시 시험 및 경로 분석은, 많은 생물학적 과정들 및 신호전달 경로들이 차별적으로 활성화되었음을 드러내었다. 마지막으로, MUTZ-3 및 SenzaCell은 GARD 검정법에서 사용되어, 감작제를 인지하고 예측을 생성하는 이들의 능력을 평가하였다. 시료의 분류는 모든 화학물질들에 대한 올바른 예측을 초래하였으며, 이는 두 세포주 모두가 관찰된 차이에도 불구하고 검정법에 사용될 수 있을 것임을 나타낸다.
결론적으로, 본 발명자들은 표현형 및 유전형 분석에서 SenzaCell과 MUTZ-3 사이에서 많은 차이를 식별하였다. 종합하여, 이러한 차이는, SenzaCell이 표면 분자의 독특한 발현 및 세포 기능을 가짐을 나타내며, 두 세포주 모두는 GARD 검정법에 사용될 수 있다.
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실시예 2
SenzaCell 세포주는 또한, GARD 플랫폼을 사용하여 호흡기 감작제를 분류하기 위해, 즉, 포유류에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위해 유전체성 바이오마커 서명과 함께 사용될 수 있다.
이러한 방법은 피부 감작제를 식별하기 위한 상기 실시예 1의 기능적 분석 섹션에서 고찰되지만 하기 표 B 및/또는 표 C의 바이오마커 서명을 사용하도록 적응된 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, WO 2013/160882; WO 2016/083604; 및 문헌[Forreryd et al. (2015) Prediction of chemical respiratory sensitizers using GARD, a novel in vitro assay based on a genomic biomarker signature. PLoS One 10(3))]에 기재된 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하기 위해 구체적으로 기재된 상세한 방법을 참조한다.
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표는 일원 ANOVA p-값 여과 및 백워드 삭제에 의해 식별된, GRPS에서 예측자 유전자를 보여준다. 가능하다면, Ensembl 전사체 ID가 유전자 식별자로서 사용되었다. 인간 ST 1.0 어레이에 대한 Affymetrix 프로브 세트 ID가 제공된다.
1검증 콜 빈도(%)는 교차 검증에 의해 수득된 20개의 바이오마커 서명들 중에서 각각의 예측자 전사체의 발생율을 기재한다.
실시예 3
SenzaCell 세포주는 또한, GARD 플랫폼을 사용하여 피부 감작제의 약효를 분류하기 위해, 즉, 시험 작용제의 피부 감작 약효를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 방법은 피부 감작제를 식별하기 위한 상기 실시예 1의 기능적 분석 섹션에서 고찰되지만 하기 표 B 및/또는 표 C의 바이오마커 서명을 사용하도록 적응된 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, 문헌[Zeller et al. (2017) The GARD platform for potency assessment of skin sensitizing chemicals. ALTEX Online first published April 12, 2017, version 2 https://doi.org/10.14573/altex.1701101] 및 또한 WO 2017/162773에 기재된 구체적인 방법을 참조한다.
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실시예 4
SenzaCell 세포주는 또한, 포유류에서 알레르기원성인 단백질을 식별하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 방법은 알레르기원성 단백질을 식별하기 위해 피부 감작제를 식별하기 위한 상기 실시예 1의 기능적 분석 섹션에 따르지만 표 E의 바이오마커 서명을 사용하도록 적응된 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, 문헌[Zeller et al. An alternative biomarker-based approach for the prediction of proteins known to sensitize the respiratory tract. Toxicol In Vitro, 2017 Oct 7;46:155-162]에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
단백질에서 알레르기원성 예측을 수행하는 가능한 방법은 하기로서 제공된다. 이는 표 E의 GARD 단백질 알레르기원 예측 서명(본원에서 "GARD PAPS"로 지칭됨)에 기초한다. GARD의 판독을 GARD 예측 서명(GPS)으로 지칭되는 유전체 예측자 세트이다.
세포의 유전 물질을 시험 성분으로 자극된 세포 시료로부터 단리한다. GARD PAPS의 전사 수준을 정량화하고, 다변량 통계 예측 모델을 사용하여 설정된 기준 데이터와 비교한다. 각각의 시료에, Affymetrix 마이크로어레이 기술에 의해 측정된 바와 같이 GARD PAPS의 시료의 전사 수준에 기초한 결정값을 지정한다. 최종 예측은 생물학적 3벌 중복 시료들로부터의 평균값에 기초한다.
모든 단백질들을 각각의 단백질에 대해 확립된 세포독성 효과 및 GARD 투입 농도에 대해 스크리닝한다.
LPS를 음성 대조군으로서 사용하여, 시료에 의해 발생된 관찰된 신호가 내독소 오염물질로 인한 것이 아님을 보장할 수 있다. 시료의 내독소 함량을 LAL 시험을 사용하여 정량화할 수 있다. 음성 대조군으로서 사용되는 LPS 농도를, 시료에 존재하는 최고 내독소 농도에 상응하도록 설정할 수 있다.
모든 시험 단백질들 및 성분들을 생물학적 3벌 중복으로 검정한다. 시험 성분의 모든 복제물들에, 기재된 바와 같이(하기 재료 및 방법 참조) GARD PAPS 예측 모델을 사용하여 결정값을 지정한다.
재료 및 방법
이 실시예에 따라 데이터를 생성하는 데 사용되는 GARD 시험 전략에 대한 포괄적인 재료 및 방법은 하기에 포함된다.
표준 프토토콜로부터의 편차(deviation)
시험 단백질의 세포독성 효과를 1 내지 25 μg/ml의 농도 범위에서 모니터링할 수 있다. 25 μg/ml를 GARD 투입 농도로서 사용할 수 있다.
세포를 시험 성분으로 자극시키는 경우, 우선, 단백질을 PBS에서 1000 μg/ml의 농도까지 용해시킬 수 있다. 그 후에, 50 μl의 용해된 단백질을 1.95 ml의 접종된 세포에 첨가한다. LPS를 PBS에서 0.1 μg/ml의 최종 농도까지 희석시키고, 1.998 ml의 세포 현탁액에 2 μl를 첨가할 수 있다.
세포를 24시간 동안 자극시키고, 그 후에 이들 세포를 TRIzol 시약에서 용해(lyse)시킨다. RNA를 정제하고, 표지화하고, Affymetrix 어레이에 혼성화시킨다.
정량화된 전사 수준을 단일 사슬 어레이 정규화(SCAN; single chain array normalized)시키고, GARD PAPS를 데이터 세트로부터 추출한다. 예측 모델을 구축하기 위해 사용된 시험 시료 및 기준 시료로부터 비자극된 시료를 사용하여, 데이터 세트들 사이에서 배치(batch) 효과를 제거할 수 있다.
GARD PAPS를 확립하는 데 사용된 기준 시료 상에서 훈련되었던 서포트 벡터 머신(SVM; support vector machine)을 사용하여 최종 분류를 수행한다.
세포주 유지 및 자극을 위한 세포의 접종
SenzaCell 세포주를, 기재된 바와 같이(Johansson 등., 2011) 20% (부피/부피) 태아 소 혈청(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 및 40 ng/ml rhGM-CSF(Bayer HealthCare Pharmaceuticals, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)이 보충된 α-MEM (Thermo Scientific Hycyclone, 미국 유타주 로건 소재)에서 유지시킬 수 있다. 확장(expansion) 동안 배지 교환을 3~4일마다 수행하거나, 세포-밀도가 5~600.000 세포/ml를 초과할 때 수행한다. 증식하는 전구체 세포를 검정법에 사용하고, 이때 추가의 분화 단계를 적용하지 않는다. 배지 교환 동안, 세포를 계수하고, 200.000 세포/ml로 현탁시킨다. 배양물의 워킹 스탁(working stock)을 해동 후 최대 20회 계대배양 또는 2개월 동안 성장시킨다. 세포의 화학적 자극을 위해, 1.8 ml을 24-웰 플레이트에 222.000 세포/ml의 농도로 접종한다. 자극에 사용되는 화합물을 200 μl의 부피로 첨가하고, 인큐베이션 동안 세포 밀도를 200.000 세포/ml까지 희석시킨다.
표현형 분석
임의의 화학적 자극 전에, 증식중인 세포가 미성숙 단계에 있음을 보장하기 위해 정성적 표현형 분석을 수행한다. 모든 세포 표면 염색 및 세척 단계를 1% BSA(w/v)를 함유하는 PBS에서 수행한다. 세포를 특이적인 마우스 모노클로날 항체(mAb)와 함께 4℃에서 15분 동안 인큐베이션한다. 하기 mAb를 유세포분석에 사용한다: FITC-컨쥬게이션된 CD1a(DakoCytomation, 덴마크 글로스트럽 소재), CD34, CD86, 및 HLA-DR(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), PE-컨쥬게이션된 CD14(DakoCytomation), CD54 및 CD80(BD Biosciences). FITC 또는 PE에 컨쥬게이션된 마우스 IgG1을 이소타입(isotype) 대조군(BD Biosciences)으로서 사용하고, 프로피디움 요오다이드(PI)(BD Biosciences)를 사용하여 세포 생존력을 평가한다. FACSCanto II 장비(BD Bioscience)를 이용한 데이터 획득에 FACSDiva 소프트웨어를 사용한다. 10,000 사건(event)을 획득하며, 게이트(gate)를 광 산란 특성에 기초하여 데브리스(debris) 및 비-생존성 세포를 배제하도록 설정하고, 4분면을 이소타입 대조군으로부터의 신호에 따라 설정한다. FCS Express V3(De Novo 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)를 사용하여 추가의 데이터 분석을 수행한다. 비자극된 세포의 기준 표현형에 대해서는, Johansson 등, 2011을 참조한다.
화학물질 취급 및 세포독성의 평가
화합물의 안정성을 보장하기 위해, 모든 화학물질들을 공급업체로부터의 설명에 따라 저장한다. 화학물질을, 가능한 경우 물에 또는 소수성 화합물의 경우 DMSO에 용해시킨다. 많은 화학물질들이 세포에 대해 독성 효과를 가질 것이므로, 시험 성분의 세포독성 효과를 모니터링한다. 일부 화학물질은 세포 배지에서 불량하게 용해되며; 따라서, 최대 가용성 농도가 마찬가지로 평가된다. 시험되려는 화학물질을, 세포 배지 중 1 μM 내지 최대 가용성 농도 범위의 농도까지 적정한다. 자유롭게 가용성인 화합물의 경우, 500 μM를 적정 범위의 상한으로서 설정한다. 세포 자극을 위해, 화학물질을 스탁 A라고 하는, 표적 웰-내 농도의 1000x 스탁으로서 이의 적절한 용매에 용해시킨다. 10 μl의 스탁 A를 990 μl의 세포 배지에 첨가함으로써 스탁 B라고 하는 10x 스탁을 제조한다. 그 후에, 1.8 ml의 접종된 세포를 함유하는 웰에 200 μl의 스탁 B를 첨가한다. 따라서, DMSO에 용해되는 시료의 경우, DMSO의 웰-내 농도는 0.1%일 것이다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 수합된 세포를 PI로 염색하고, 유세포분석에 의해 분석한다. PI-음성 세포를 생존성인 것으로 정의하고, 적정 범위 내의 각각의 농도로 자극된 세포의 상대 생존력을 하기로서 계산한다:
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독성 화합물의 경우, 90% 상대 생존력(Rv90)을 산출하는 농도를 GARD 검정법에 사용하는데, 그 이유는 이 농도가 면역학적 반응을 약화시키지 않으면서도 자극에 사용되는 화합물의 생체이용률을 실증하기 때문이다. 무독성 화합물의 경우, 500 μM의 농도가 가능하다면 사용된다. 세포 배지 중 500 μM에서 불용성인 무독성 화합물의 경우, 최고 가용성 농도가 사용된다. 이들 3가지 기준 중 어느 것이 충족되든지 간에, 단지 하나의 농도가 유전체 검정법에 사용될 것이다. 임의의 주어진 화학물질에 사용되는 농도를 "GARD 투입 농도"라고 한다.
GARD에 대한 세포의 화학물질 노출
일단 검정되는 화학물질에 대한 GARD 투입 농도가 확립되면, 세포를 상기 기재된 바와 같이 다시 자극시키고, 이때 GARD 투입 농도만 사용한다. 시험 성분의 모든 평가들을, 상이한 시점들에서 상이한 세포 배양물들을 사용하여 수행된 생물학적 3벌 중복에서 검정한다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 1개 웰 당 세포를 0.5 ml TRIzol 시약(Life Technologies)에서 용해(lyse)시키고, RNA가 추출될 때까지 -20℃에 저장한다. 병행하여, 소량의 자극된 세포 시료를 PI 염색 및 유세포분석을 이용한 분석을 위해 채택하여, 자극된 세포의 예상되는 상대 생존력이 도달되는 것을 보장한다.
벤치마크 대조군의 제조
캠페인 내에서 검정되려는 임의의 시험 성분(들) 외에도, 예측 모델 보정 및 예측 성능의 추정을 위해 벤치마크 대조군 세트를 수행한다. 각각의 특이적인 캠페인에 사용되는 벤치마크 대조군에 관한 세부사항에 대해서는, 이 부록이 첨부된 주요 문헌을 참조한다.
RNA의 단리 및 Nanostring nCounter 시스템을 사용한 GPS 정량화
용해(lyse)된 세포로부터의 RNA 단리를 상업적으로 입수 가능한 키트(Direct-Zol RNA MiniPrep, Zymo Research, 미국 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 수행한다. BioAnalyzer 장비(Agilent, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)를 사용하여 총 RNA를 정량화하고 품질을 제어한다. 총 100 ng의 RNA를, GPS 특이적인 리포터 프로브 CodeSet(Nanostring, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)를 이용하는 혼성화 검정법에서 시료 투입으로서 사용한다. 혼성화된 RNA-CodeSet 시료를 nCounter Prepstation을 사용하여 칩 상에서 제조하고, GPS의 개별 전사체를 Nanostring 디지털 분석기(Nanostring)를 사용하여 정량화한다.
데이터 획득 및 정규화
원(raw) 데이터를 디지털 분석기로부터 엑스포트(export)하고, GPS의 개별 전사체의 계수는 총 계수 당 계수(count per total counts) 알고리즘을 이용하여 정규화된 단일-칩이다. 정규화된 데이터는 S 바이(by) V 매트릭스로 구성되며, 이때, S는 GARD 캠페인 내 시료의 수를 나타내고, V는 GPS의 정량화된 전사체의 수를 나타낸다.
데이터 분석 - 보정된 서포트 벡터 머신 결정값의 발생
오픈 소스 통계학적 환경 R에서 개발된 어플리케이션-기반 소프트웨어를 사용하여 모든 추가의 다운스트림 분석을 수행한다. GPS 확립에 사용되는 기왕 데이터(historical data)를 사용하여 서포트 벡터 머신(SVM)을 훈련시킨다(Johansson 등, 2011). 훈련된 SVM을 사용하여 시험 성분으로부터의 모든 시료들 및 특이적인 GARD 캠페인으로부터의 벤치마크 대조군을 예측하여, 각각의 시료에 SVM 결정값을 지정한다. 예측된 부류의 벤치마크 대조군의 수신자 조작 특성 아래 면적(ROC AUC)의 식별에 의해 전구체 성능을 추정한다.
시험 성분(들)의 GARD 분류
GARD 예측 모델을 하기와 같이 정의한다:
시험 성분의 모든 이용 가능한 생물학적 복제물들의 평균 결정값이 0보다 크다면, 시험 성분을 감작제로서 분류한다.
스크립트
R 코드로 작성된 스크립트의 세부사항이 하기에 열거되어 있으며, 이를 방법을 수행하는 데 사용할 수 있다:
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American Type Culture Collection (ATCC) PTA-123875 20170309

Claims (38)

  1. ATCC 특허 기탁 지정 PTA-123875에 따른 비-천연 발생 수지상-유사 골수성 백혈병 세포.
  2. 제1항에 따른 세포의 집단을 포함하는 세포 배양물.
  3. 포유류에서 감작 및/또는 알레르기원성을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
    (b) 표 A, B, C, D, E 중 하나 이상에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계
    를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (b)에서 측정되는, 세포에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 작용제의 감작화 및/또는 알레르기원성 효과를 나타내는, 방법.
  4. 포유류 피부에서 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
    (b) 표 A에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계
    를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (b)에서 측정되는, 세포에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 작용제의 피부 감작화 효과를 나타내는, 방법.
  5. 포유류에서 호흡기 감작을 유도할 수 있는 작용제를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
    (b) 표 B 또는 C에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 단계
    를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (b)에서 측정되는, 세포에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 작용제의 호흡기 감작화 효과를 나타내는, 방법.
  6. 작용제의 피부 감작화 약효(potency)를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 제공하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 제공된 세포를 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
    (c) 표 D에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (b)의 세포에서 측정하는 단계
    를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 상기 시험 작용제의 피부 감작화 약효를 나타내는, 방법.
  7. 포유류에서 알레르기원성인 단백질을 식별하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 집단을 제공하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 제공된 세포를 시험 단백질에 노출시키는 단계; 및
    (c) 표 E에서 정의된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (b)의 세포에서 측정하는 단계
    를 포함하거나 이들로 구성되고, 상기 단계 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 상기 시험 단백질의 알레르기원성을 나타내는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (d) 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 개별 집단을, 포유류에서 감작 및/또는 알레르기를 유도하지 않는 하나 이상의 음성 제어제(control agent)에 노출시키는 단계; 및
    (e) 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (d)의 세포에서 측정하는 단계
    를 추가로 포함하고, 시험 작용제는, 상기 단계 (e)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현이 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현과 상이한 사건(event)에서 감작제로서 및/또는 알레르기원으로서 식별되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (f) 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 개별 집단을, 포유류에서 감작을 유도하고/하거나 알레르기원성인 하나 이상의 양성 제어제에 노출시키는 단계; 및
    (g) 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 상기 단계 (f)의 세포에서 측정하는 단계
    를 추가로 포함하고, 시험 작용제는, 상기 단계 (g)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현이 상기 단계 (b) 또는 (c)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현에 상응하는 사건에서 감작제로서 및/또는 알레르기원으로서 식별되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)는 하나 이상의 바이오마커의 핵산 분자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA 분자인, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계는 서던(Southern) 혼성화, 노던(Northern) 혼성화, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리버스 트랜스크립타제 PCR(RT-PCR; reverse transcriptase PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 방사능사진촬영 및 인 시추(in situ) 혼성화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용하여 수행되는, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계는 DNA 마이크로어레이를 사용하여 결정되는, 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되고, 각각의 결합 모이어티는 표 A 내지 E 중 하나 이상에서 식별되는 바이오마커들 중 하나를 인코딩하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 15 내지 35개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 검출 가능한 모어이티를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 검출 가능한 모어이티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티(예를 들어, 방사성 원자); 또는 효소적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 방사성 모이어티는 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 듀테륨, 트리튬, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 원자인, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티인, 방법.
  25. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)는 하나 이상의 바이오마커의 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되고, 상기 결합 모이어티는 각각 표 A 내지 E 중 하나 이상에서 식별되는 바이오마커들 중 하나에 선택적으로 결합할 수 있는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 검출 가능한 모어이티를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 검출 가능한 모어이티는 형광 모이어티, 발광 모이어티, 화학발광 모이어티, 방사성 모이어티 및 효소적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)는 어레이를 사용하여 수행되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 어레이는 비드-기초 어레이인, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 어레이는 표면-기초 어레이인, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b), (c), (e) 및/또는 (g)는 표 A, B, C, D 및 E 중 임의의 하나에서 열거된 모든 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  35. 시험 작용제의 감작화 효과 및/또는 알레르기원성을 결정하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 수지상-유사 세포의 집단의 용도.
  36. 분석용 키트로서, 상기 키트는
    (i) 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는 어레이; 및
    (ii) 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 세포 배양물; 및
    (iii) (선택적으로) 하나 이상의 제어제; 및
    (iv) (선택적으로) 사용 설명서를 포함하는, 키트.
  37. 제3항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 분석용 키트로서, 상기 키트는
    (i) 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어를 포함하는 어레이; 및
    (ii) 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 세포 배양물; 및
    (iii) (선택적으로) 하나 이상의 제어제; 및
    (iv) (선택적으로) 제3항 내지 제34항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  38. 본원에서 실질적으로 정의된 바와 같은 세포, 세포 배양물, 방법 또는 키트.
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