KR20170102874A - 분석 방법 및 이 분석 방법에서 사용하기 위한 어레이 - Google Patents

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맬린 린즈텟
칼 에이. 케이. 보레백
헨릭 요한슨
앤-소피 알브렉트
앤드루 포레뤼드
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센자겐 아베
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Abstract

본 발명은 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 어레이 및 진단학적 키트에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은 시험 물질에 노출된 세포에서 표 A(i), 표 A(ii) 및/또는 표 A(iii)에 기재된 바이오마커의 발현의 측정을 포함한다.

Description

분석 방법 및 이 분석 방법에서 사용하기 위한 어레이{ANALYTICAL METHODS AND ARRAYS FOR USE IN THE SAME}
본 발명은 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 어레이 및 분석 키트에 관한 것이다.
호흡 감작(respiratory sensitization)은 환경적 단백질 또는 소정의 저분자량(low molecular weight: LMW) 화학 화합물에 대한 면역 반응에 의해 발생한 상부 및 하부 호흡기의 알레르기 I형 초감작 반응이다. 천명, 기관지수축 및 천식 발작을 포함하는 호흡 감작의 임상 증상은 동일한 화합물에 대한 반복 노출 시 감수성인 개인 및 이전에 감작된 개인에서 발생한다[1]. 기계론적으로, 호흡 감작은 CD4+ Th2 세포의 활성화에 의해 개시되고, 알레르겐 특이적 IgE 항체의 생성 증가를 통해 B 림프구의 분화에 의해 매개된다[1 내지 3].
호흡 알레르기가 일반적으로 단백질 알레르겐에 의해 유도되지만, LMW 화학 화합물은 주로 CD8+ T 세포 및 CD4+ Th1 세포를 포함하는 IV형 초감작 반응의 유도 및 피부 병태, 예컨대 알레르기성 접촉 피부염(Allergic Contact Dermatitis: ACD)의 발병과 연관된다. 그러나, LMW 화학 화합물, 예컨대 다이아이소사이아네이트[4], 산 언하이드라이드[5], 백금염[6], 반응성 염료[7] 및 클로르아민 T[8]의 소정의 클래스는 또한 호흡기를 감작시킬 수 있다. 이 LMW 화학 화합물에 대한 노출은 일반적으로 직업 환경으로 제한되고, 연장된 기간 동안 반복 노출은 결과적으로 직업성 천식(occupational asthma: OA)을 발생시킬 수 있다[3, 9]. 접촉성 피부염을 야기하는 것과 비교하여, 호흡 알레르기를 야기하는 더 적은 화학물질(100개 미만의 공지 물질)이 공지되어 있지만[10], 건강 효과는 더욱 형편없을 수 있다. 예를 들어, 후천성 OA는 만성 염증, 기도 과민반응성[11], 광범위한 기도 개형[12]을 발생시키고 이에 따라 이환된 개인에 대한 삶의 질에 심각하게 영향을 미칠 수 있다. OA와 연관된 만만찮은 건강 노력, 및 작업 환경에 대한 새로운 화합물(예를 들어, 세정제 및 건강관리 제품[9, 13 내지 15])의 도입은 잠재적 호흡 감작인자(respiratory sensitizer)의 위험 분류에 대한 정확하고 신뢰할만한 시험 전략의 필요를 강조한다. 이 화합물의 사전 확인 및 규명은 따라서 높은 중요성의 구역으로 있다.
그러나, 이와 관련한 도전은 호흡 감작을 유도하는 화학물질의 위험 평가를 위한 방법이 매우 뒤져있다는 것이다[16]. 현재의 접근법은 생체내 및 시험관내 시험 전략 둘 다를 포함한다. 최근까지, 현장은 동물 기반 생체내 모델에 의존한다. 이 동물 기반 접근법 중에서, 기니아 피그 시험[17], 마우스 IgE 시험[18, 19], 래트 Ig E 시험[20, 21] 및 마우스 사이토카인 핑거프린팅[22, 23]이 대부분의 주의를 얻었다. 또한, 피부 감작인자로부터 호흡 감작인자를 구별하는 것을 목표로 하는 화학적으로 유도된 천식의 여러 쥣과 모델은 문헌에 기재되어 있다[24,25]. 이 접근법이 의심할 여지없이 호흡 감작의 전개와 연관된 세포 과정 및 면역생물학적 기전의 현재의 이해에 기여하지만, 어떤 방법도 조절 목적을 위한 일상적 검정으로서 사용되기에 충분히 신뢰할만한 것으로 입증되지 않았다. 추가적으로, 스크리닝 도구로서 동물 기반 방법의 사용과 연관된 상당한 경제적 및 윤리적 단점이 존재한다.
따라서, 호흡기의 감작에 대한 세포 기반 시험관내 검정을 개발하기 위해 상당한 노력이 이루어졌고, 이것은 Directive 201/63/EU에 기재된 동물 실험의 감소(reduction), 강화(refinement) 및 대체(replacement)에 대한 3개의 R의 원칙과 상관된다[26]. 최근의 세포 기반 접근법은 감작 과정에서의 상이한 단계에 대한 모델로서 단일 세포주, 예컨대 수지상 세포주 THP-1[27] 및 상피 세포주 BEAS-2B[28] 및 A549[29]의 사용을 포함한다. 호흡 감작인자에 대한 노출의 생체내 경로를 모방하기 위해 더 진전된 시도는 인간 기도 상피의 3D 세포 모델로서 Epithelix가 개발한 상업적으로 구입 가능한 MucilAir(상표명)를 사용하여 또한 수행되었다[30]. 또한, 화학 반응성에 기초한 비세포 기반 인실리코 예측 모델은 호흡 감작 내에 조사되고 있다[31].
호흡 감작에 대한 검정의 결여와 반대로, 문헌은 피부 감작 화학물질의 확인을 위한 몇몇 예측 모델을 기재하고([34]에서 검토됨), 동물 기반 국소 림프절 검정(Local Lymph Node Assay: LLNA)[35]은 역사적으로 바람직한 방법이다. 몇몇 시험관내 모델은 인간 세포주 활성화 시험(human Cell Line Activation Test: h-CLAT)[36,37], 직접 펩타이드 활성화 시험(Direct Peptide Activation Test: DRPA)[38] 및 KeratinoSens(등록상표) 시험[39, 40]을 포함하는 피부 감작의 종점에 대해 또한 기재되어 있다. 최근에, 본 발명자들은 또한 이 방법에 대한 정확한 대안으로서 본 발명자들의 인하우스 개발된 게놈 알레르겐 신속 검출(Genomic Allergen Rapid Detection: GARD)[41, 42] 시험관내 검정을 제시하였다. GARD 검정은 전사체 방식 DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 골수성 인간 세포주 MUTZ-3[43-45]에서 200개의 유전자를 포함하는 게놈 바이오마커 서명(GARD 예측 서명, 또는 GPS)의 전사 수준의 측정에 기초한다. 26개의 맹검 화합물 및 11개의 비맹검 화합물을 포함하는 코호트를 사용한 최근의 연구에서 예측력의 면에서 GARD 검정의 기능을 평가하였다. 검정의 정확도는 89%로 예측되었고[46], 이것은 LLNA에 대한 72%와 비교될 수 있다[47]. 피부 감작 검정, 예컨대 LLNA가 호흡 감작인자를 또한 분류하도록 적용될 수 있는 것으로 제안되어 있으므로, 피부 감작 모델은 흥미롭다[48, 49]. LLNA 검정에서의 종점은 시험 화학물질에 대한 마우스의 국소 노출 시 배수 림프절에서 측정된 촉발된 증식성 반응이다[50, 51]. 그러나, 이 증식성 반응은 호흡 감작인자 및 피부 감작인자 둘 다에 의해 유도된다. 결과적으로, LLNA가 비감작인자로부터의 감작인자의 계층화를 위해 사용될 수 있지만, 피부 감작인자와 호흡 감작인자 사이를 정확히 구별할 수 없다[1].
그러므로, 호흡 감작인자를 특이적으로 확인하기 위한 정확하고 신뢰할만한 시험관내 검정을 확립하고자 하는 수요가 계속있다.
본 발명은 동물 시험에 대한 신규한 대안으로서 게놈 바이오마커 서명에 기초한 호흡 감작인자의 평가를 위한 세포 기반 시험 전략에 관한 것이다. 본 발명자들은 세포의 완전한 전사체를 분석하는 것을 수반한 큰 융통성을 이용하고, GARD 검정의 개념을, GARD 호흡 예측 서명(GRPS)이라 불리는, 별개의 게놈 바이오마커 서명의 확인에 의한 호흡 감작인자의 예측을 포함하도록 확대하였다. 이것은 호흡 감작인자를 분류하도록 사용될 수 있다. 확인된 바이오마커 서명의 의도된 용도는 피부 감작 화학물질의 분류를 위해 GPS와 조합될 것이다. 따라서, GARD 개념은 미공지 화학물질의 피부 감작 및 호흡 감작 특성 둘 다의 위험 평가 및 위험 분류를 위해 동시에 사용될 수 있는 시험 플랫폼에 대한 독특한 기회를 나타낸다.
그러므로, 본 발명의 제1 양태는,
a) 수지상 세포의 집단 또는 수지상 유사 세포의 집단을 시험 물질에 노출시키는 단계; 및
b) 세포에서 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계(여기서, 세포에서의 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 발현은 시험 물질의 호흡 감작 효과를 나타냄)를 포함하거나 이들로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법을 제공한다.
"시험 물질의 호흡 감작 효과를 나타내는"에 의해, 본 발명자들은 시험 물질이 호흡 감작인자인지 또는 아닌지를 결정하는 것 및/또는 호흡 감작인자로서 시험 물질의 효력을 결정하는 것을 포함한다.
"호흡 감작을 유도할 수 있는 물질"에 의해, 본 발명자들은 포유류의 호흡기에서 I형 즉각적 초감작 반응을 유도하고 촉발할 수 있는 임의의 물질을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다. 바람직하게는, I형 즉각적 초감작 반응은 DC 매개이고/이거나, Th2 세포로의 T 세포의 분화를 포함한다. 바람직하게는, I형 즉각적 초감작 반응은 체액 면역 및/또는 호흡 알레르기를 발생시킨다.
포유류 폐의 안내 구역은 기도, 기관지, 세기관지 및 종말 세기관지를 함유한다. 호흡 구역은 호흡세기관지, 폐포관 및 허파꽈리를 함유한다. 안내 구역은 기도로 이루어지고, 혈액과 가스 교환을 가지지 않고, 기도가 열리게 유지하기 위해 연골에 의해 강화된다. 안내 구역은 흡입 공기를 촉촉하게 하고, 이것을 37℃(99℉)로 가온시킨다. 이것은 또한 모든 통로의 벽에 위치한 섬모를 통해 입자를 제거함으로써 공기를 깨끗하게 한다. 호흡 구역은 혈액과의 가스 교환의 부위이다.
일 실시형태에서, "포유류 피부의 감작을 유도할 수 있는 물질"은 포유류에서 폐 상피의 부위에서 I형 즉각적 초감작 반응을 유도하고 촉발할 수 있는 물질이다. 바람직하게는, 폐 상피의 부위는 폐의 호흡 구역에 있지만, 대안적으로 또는 추가적으로 폐의 안내 구역에 있을 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
포유류는 임의의 가축 또는 농장 동물일 수 있다. 바람직하게는, 포유류는 래트, 마우스, 기니아 피그, 고양기, 개, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
수지상 세포(DC)는 포유류 면역계의 일부를 형성하는 면역 세포이다. 이의 주기능은 항원 물질을 처리하고 면역계의 다른 세포에 표면에서 이것을 제시하여(즉, 이것은 항원 제시 세포로서 작용함), 선천성 면역계 및 후천성 면역계를 세우는 것이다.
수지상 세포는 외부 환경, 예컨대 피부와 접촉 시 조직(여기서, 랑게르한스 세포라 불리는 특별한 수지상 세포 유형이 존재함) 및 코, 폐, 위 및 창자의 내면에 존재한다. 이것은 또한 혈액에서 미성숙 상태로 또한 발견될 수 있다. 활성화되면, 이것은 이것이 T 세포 및 B 세포와 상호작용하는 림프절로 이동하여 후천성 면역 반응을 개시하고 형성한다. 소정의 발생 단계에서, 이것은 수상돌기인 가지가 있는 돌출부로 성장한다. 외관이 유사하지만, 이것은 뉴런의 수상돌기와 구별되는 구조이다. 미성숙 수지상 세포는 수상돌기라기보다는 큰 세포질 '베일'을 보유하므로 베일 세포(veiled cell)라 또한 불린다.
"수지상 유사 세포"에 의해, 본 발명자들은 수지상 세포에 특이적인 기능적 특징 및 표현형 특징, 예컨대 형태학적 특징, 동시자극 분자 및 MHC 클래스 II 분자의 발현, 및 거대분자를 음세포작용시키고 휴지 T 세포를 활성화는 능력을 나타내는 비수지상 세포를 의미한다.
일 실시형태에서, 수지상 유사 세포는 CD34+ 수지상 세포 전구자이다. 임의로, CD34+ 수지상 세포 전구자는, 사이토카인 자극 시, CD1d, MHC 클래스 I 및 II를 통해 항원을 제시하는 표현형을 획득하고/하거나, 특이적 T 세포 증식을 유도하고/하거나, 염증 매개자에 의한 자극 시 성숙 전사 및 표현형 프로필(즉, 미성숙 수지상 세포 또는 랑게르한스 유사 수지상 세포와 유사한 표현형)을 디스플레이할 수 있다.
수지상 세포는 기능, 표현형 및/또는 유전자 발현 패턴, 특히 세포 표면 표현형에 의해 인식될 수 있다. 이들 세포들은 이의 구별되는 형태, 높은 수준의 표면 MHC-클래스 II 발현 및 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, 특히 미경험 T 세포에 항원을 제시하는 능력을 특징으로 한다(Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271).
수지상 세포의 세포 표면은 특징적인 베일 유사 돌출부로 특이하고, 세포 표면 마커 CD11c 및 MHC 클래스 lI의 발현을 특징으로 한다. 대부분의 DC는 T 세포, B 세포, 단핵구/대식세포 및 과립구를 포함하는 다른 백혈구 계통의 마커에 음성이다. 수지상 세포의 하위집단은 33D1, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CD1a-d, CD4, CD5, CD8알파, CD9, CD11b, CD24, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD91, CD117, CD123(IL3Ra), CD134, CD137, CD150, CD153, CD162, CXCR1, CXCR2, CXCR4, DCIR, DC-LAMP, DC-SIGN, DEC205, E-카데린, 랑게린, 만노스 수용체, MARCO, TLR2, TLR3 TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, CD14, CD34, HLA-DR 및 몇몇 렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가적인 마커를 또한 발현할 수 있다.
이 세포 표면 마커의 발현의 패턴은 수지상 세포의 성숙, 이의 조직 기원 및/또는 이의 종 기원에 따라 변할 수 있다. 미성숙 수지상 세포는 낮은 수준의 MHC 클래스 II를 발현하지만, 항원 단백질을 세포이물흡수하고 MHC 클래스 II 분자와의 복합체에서 이를 제시에 대해 처리할 수 있다. 활성화 수지상 세포는 높은 수준의 MHC 클래스 11, ICAM-1 및 CD86을 발현하고, 예를 들어 혼합 백혈구 반응(mixed leukocyte reaction: MLR)에서 미경험 동종이계 T 세포의 증식을 자극할 수 있다.
기능적으로, 수지상 세포 또는 수지상 유사 세포는 항원 제시를 검출하기 위한 임의의 편리한 검정에 의해 확인될 수 있다. 이러한 검정은 시험 항원의 제시에 의해 항원 프라이밍된 및/또는 미경험 T 세포를 자극하는 능력의 시험, 이후 T 세포 증식의 결정, IL-2의 방출 등을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 수지상 유사 세포는 상피 세포 및/또는 상피 유사 세포, 예컨대 BEAS-2B[28], WT 9-7 및 A549를 포함한다[29]. 바람직하게는, 상피 세포는 폐 상피 세포이다. 바람직하게는, 상피 유사 세포는 폐 상피 유사 세포이다. 대안적인 실시형태에서, 수지상 유사 세포는 상피 세포 및/또는 상피 유사 세포를 포함한다.
"발현"에 의해, 본 발명자들은 유전자 생성물, 예컨대 mRNA 또는 단백질의 수준 또는 양을 의미한다.
단백질 및/또는 핵산의 농도를 검출하고/하거나 측정하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다.
단백질의 검출 및/또는 측정을 위한 바람직한 방법은, 단일클론 및/또는 다중클론 항체를 사용한 샌드위치 검정을 포함하는, 웨스턴 블롯, 노쓰-웨스턴 블롯, 면역흡착 검정(immunosorbent assay: ELISA), 항체 마이크로어레이, 조직 마이크로어레이(tissue microarray: TMA), 면역침전, 동일계내 혼성화 및 다른 면역조직화학 기법, 방사면역검정(radioimmunoassay: RIA), 면역방사측정 검정(immunoradiometric assay: IRMA) 및 면역효소 검정(immunoenzymatic assay: IEMA)을 포함한다. 예시적인 샌드위치 검정은 데이비드(David) 등에 의해 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호(본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 슬라이드에서의 세포의 항체 염색은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 바대로 세포학 실험실 진단학적 시험에서 널리 공지된 방법에서 이용될 수 있다.
통상적으로, ELISA는 보통 고상 검정에서 색상 반응 생성물을 제공하는 효소의 사용을 수반한다. 겨자무과산화효소 및 포스파타제와 같은 효소는 널리 사용된다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방식은 제2 효소 시스템에 대한 조효소로서 현재 작용하는 NAD를 생성하는 기질로서 NADP를 사용하는 것이다. 에스체리치아 콜라이로부터의 피로포스파타제는 우수한 접합체를 제공하는데, 왜냐하면 이 효소가 조직에 존재하지 않고 안정하고 우수한 반응 색상을 제공하기 때문이다. 루시퍼라제와 같은 효소에 기초한 화학발광성 시스템을 또한 사용할 수 있다.
비타민 바이오틴과의 접합이 흔히 사용되는데, 왜냐하면 이것이 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 효소 연결 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 이의 반응에 의해 이것이 용이하게 검출될 수 있기 때문이다.
핵산(예를 들어, mRNA)의 검출 및/또는 측정을 위한 바람직한 방법은 써던 블롯(southern blot), 노던 블롯(northern blot), 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사효소 PCR(reverse transcriptase PCR: RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR: qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 방사선자동사진법(autoradiography) 및 동일계내 혼성화를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은,
c) 포유류에서 수지상 세포 또는 수지상 유사 세포의 별개의 집단을 호흡 감작인자가 아닌 하나 이상의 음성 대조군 물질에 노출시키는 단계; 및
d) 세포에서 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계(여기서, 시험 물질은 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (d)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 대조군 샘플에서의 존재 및/또는 양과 다른 경우 호흡 감작인자로서 확인됨)를 추가로 포함한다.
"단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 단백질의 대조군 샘플에서의 존재 및/또는 양과 다른"에 의해, 본 발명자들은 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 통계적으로 유의적인 방식으로 하나 이상의 음성 대조군 샘플의 것과 다르다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 시험 물질에 노출된 세포 집단에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은,
음성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것의 80% 이하, 예를 들어 음성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것의 79% 이하, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%; 또는
음성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것의 적어도 120%, 예를 들어 음성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것의 적어도 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 또는 적어도 500%이다.
"단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 단백질의 대조군 샘플에서의 존재 및/또는 양과 다른"에 의해, 본 발명자들은 대안적으로 또는 추가적으로 시험 샘플이 하나 이상의 음성 대조군 샘플과 다른 군에 속하는 것으로 분류된다는 것을 포함한다. 예를 들어, SVM이 이용되는 경우, 시험 샘플은 하나 이상의 음성 대조군 샘플과 결정 값 한계치의 다른 측에 있다(예를 들어, 하나 이상의 시험(또는 이의 반복검증)이 0 이하의 SVM 결정 값을 가지는 경우 시험 물질이 호흡 감작인자로 분류되는 경우, 하나 이상의 양성 대조군 샘플(또는 이의 대부분)은 또한 0 이하의 SVM 결정 값을 가져야 한다).
하나 이상의 음성 대조군 물질은 1-뷰탄올; 2-아미노페놀; 2-하이드록시에틸 아크릴레이트; 2-나이트로-1,4-페닐렌다이아민; 4-아미노벤조산; 클로로벤젠; 다이메틸 폼아마이드; 에틸 바닐린; 폼알데하이드; 게라니올; 헥실신남산 알데하이드; 아이소프로판올; 카톤(Kathon) CG*; 메틸 살리실레이트; 페니실린 G; 프로필렌 글라이콜; 중크롬산칼륨; 과망간칼륨; Tween 80; 및 황산아연으로 이루어진 군(즉, 표 1에 정의된 호흡 비감작인자의 군)으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 하나 이상의 음성 대조군 물질은 표 1에 정의된 음성 대조군 물질의 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
음성 대조군 물질은 본 발명의 시험 또는 대조군 물질과 사용하기 위한 용매일 수 있다. 그러므로, 음성 대조군은 DMSO 및/또는 증류수일 수 있다.
상기 방법은 적어도 2개의 음성 대조군 물질(즉, 비감작 물질), 예를 들어 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 적어도 100개의 음성 대조군 물질의 사용을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 시험 물질 노출 전에 수지상 세포 또는 수지상 유사 세포의 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 발현은 음성 대조군으로서 사용된다.
추가의 실시형태는,
e) 포유류에서 수지상 세포 또는 수지상 유사 세포의 별개의 집단을 호흡 감작인자인 하나 이상의 양성 대조군 물질에 노출시키는 단계; 및
f) 세포에서 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계(여기서, 시험 물질은 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 하나 이상의 양성 대조군 샘플에서의 존재 및/또는 양에 상응하는 경우 호흡 감작인자로서 확인됨)를 포함한다.
"하나 이상의 양성 대조군 샘플에서의 발현에 상응한다"에 의해, 본 발명자들은 시험 물질에 노출된 세포 집단에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현이 하나 초과의 양성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것과 동일하거나, 이것과 상당히 다르지 않다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 시험 물질에 노출된 세포 집단에서의 하나 이상의 바이오마커의 발현은 하나 초과의 양성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것의 81% 내지 119%, 예를 들어 하나 초과의 양성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것의 82% 이상, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 및 하나 초과의 양성 대조군 물질에 노출된 세포 집단의 것의 101% 이하, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118% 또는 119%이다.
"하나 이상의 양성 대조군 샘플에서의 발현에 상응한다"에 의해, 본 발명자들은 대안적으로 또는 추가적으로 시험 샘플이 하나 이상의 양성 대조군 샘플과 동일한 군에 속하는 것으로 분류된다는 것을 포함한다. 예를 들어, SVM이 사용되는 경우, 시험 샘플은 하나 이상의 양성 대조군 샘플과 결정 값 한계치의 동일한 측에 있다(예를 들어, 하나 이상의 시험(또는 이의 반복검증)이 0 초과의 SVM 결정 값을 가지는 경우 시험 물질이 호흡 감작인자로 분류되는 경우, 하나 이상의 양성 대조군 샘플(또는 이의 대부분)은 또한 0 초과의 SVM 결정 값을 가져야 한다).
하나 이상의 양성 대조군 물질은 암모늄 헥사클로로플라티네이트; 과황산암모늄; 에틸렌다이아민; 글루타르알데하이드; 헥사메틸렌 다이아이소사이아네이트; 말레산 무수물; 메틸렌 다이페놀 다이아이소사이아네이트; 프탈산 무수물; 톨루엔다이아이소사이아네이트; 및 트라이멜리트산 무수물로 이루어진 군(즉, 표 1에 정의된 호흡 감작인자의 군)으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 하나 이상의 양성 대조군 물질은 표 1에 정의된 양성 대조군 물질의 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
상기 방법은 적어도 2개의 양성 대조군(즉 감작 물질), 예를 들어 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 적어도 100개의 양성 대조군 물질의 사용을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 방법은 TNFRSF19의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있다. 상기 방법은 SNORA74A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있다. 상기 방법은 SPAM1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있다.
상기 방법은 Ensembl 전사체 확인 번호(ETID): ENST00000364621의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 HOMER3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CD1C의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 IGHD /// IGHM의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SNRPN /// SNORD116-26의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000364678의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 STRAP의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 DIABLO의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000411349의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385497의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR51A2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MRPL21의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PPP1R14A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 DEFB127의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C9orf130의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PRO2012의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC399898의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000387701의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 WDR68의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 NEU2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000386677의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SPARC의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000390342의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CRNN의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MMP12의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ACVRL1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 EIF4E2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 RP11-191L9.1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PDCD6 /// AHRR의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ARRDC3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 VWDE의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ZBTB34의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ITGB1BP2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR10K2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FLJ22596의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000306515의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ACVR2A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385690의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000386018의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C6orf201의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385583의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385719의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 GPR20의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000364357의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ZCCHC13의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 GPR64의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CD1D의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 DUSP12의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 KLHL33의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PSMB6의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TMEM95의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C1QBP의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 EMILIN2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CD8A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C20orf152의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 KCNJ4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000364163의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FAM19A1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000384601의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 POLR2H의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 AK000420의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000363354의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 Affymetrix 프로브 세트 확인 번호(APID): 8121483의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 EGFL6의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 POU3F4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385841의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR52A5의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TIMM8B의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PEBP1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR4F6의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CDH15의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TMEM199의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ABI3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FLJ42842의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MC4R의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000410673의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ISM1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC440957의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 KLB의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 GM2A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ANXA6의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TAS2R40의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APID: 8142880의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 RARRES2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SH2D4A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PLP1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ATP1A2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000386800의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MAT1A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TSGA10IP의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PRDM7의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000390847의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000255183의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MRPL39의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000386327의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TIPARP의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 HES1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000363502의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PRDM9의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000390917의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 KIAA1688의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000391219의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000387973의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC100129534의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SLC2A1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 AF116714의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 EPS8L2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MGC3196의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 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상기 방법은 ETID: ENST00000363919의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000335621의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SOX1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CTSG의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000362344의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FLJ37464의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 RAX의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 IL29의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CEACAM20의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ETID: ENST00000365557의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SEC14L3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C3orf52의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FETUB의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PIGY의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CDH12의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LGSN의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000391031의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 HGC6.3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 tcag7.873의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 T1560의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 EXOSC4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TRAM1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 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상기 방법은 WDR8의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC100131195의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR4D10의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C12orf63의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ELA1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 DNAJC14 /// CIP29의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FLJ40176의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000410207의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PSME3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000405656의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 HN1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000335523의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CYP2A7 /// CYP2A7P1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ATXN10의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ZMAT5의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000362493의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FHIT의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FRG2 /// FRG2B /// FRG2C의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SNX18의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000362433의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 DTX2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ASB4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000365242의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000364204의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 COL5A1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LCAP의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APOO의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PTPRU의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 IL28RA의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 NEUROG3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 VAX1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC440131의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C13orf31의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ADAMTS7의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SMTNL2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC284112의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETV2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FUT2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C2orf39의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC200383 /// DNAH6의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385676의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CCDC108의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APID: 8065011의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C22orf27의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000364444의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PDLIM3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000330110의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000384539의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000390214의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MGC72080의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C9orf128의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 RGAG4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PIP5K1A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 GPR161의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385353의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR56A3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR5A2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 WNT11의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APID: 7960259의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 RAB37의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LAIR1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000388385의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CHAC2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000387574의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000387884의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 BCL2L1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 KDELR3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TMEM108의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SPATA16의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 BTC의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SUPT3H의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 EIF4B의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CHMP4C의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 H2BFM의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APID: 8180392의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 NR5A2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TRIM49의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MS4A6A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C11orf10의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 HSPC152의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 RASAL1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000387531의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PLDN의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PER1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ALS2CR12의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C20orf142의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000386848의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LOC100129113의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CERK의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000385783의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PROS1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PCDHGA의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MUC3B /// MUC3A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000365355의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APID: 8156969의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000358047의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FAM47C의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 NXF4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PIWIL4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000384727의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ALDH6A1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 TMEM64의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000364816의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있다.
상기 방법은 C11orf73의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OR5B21의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 NOX5 /// SPESP1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 AMICA1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000387422의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SERPINB1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000387396의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CD1A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 RAB9A의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 C10orf90의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 LPXN의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 GGTLC2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000384680의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 PNPLA4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CAMK1D의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000410754의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CDC123의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 WDFY1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 hCG_1749005의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CD48의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 MED19의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 DRD5의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APID: 7967586의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 VAPA의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FAM71F1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 APID: 8141421의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 HCCS의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CNR2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 OIT3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 BMP2K의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ZNF366의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 SYT17의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 CALM2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 XK의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ART4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000332418의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ZFP36L2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 GSTA3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 COL21A1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000332418의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 FUCA1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 ETID: ENST00000386628의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 AZU1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있고; 상기 방법은 IL7R의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 배제할 수 있다.
상기 방법은 단계 (b)에서 표 A(i)에 정의된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어 표 1A에 정의된 바이오마커 중 적어도 2개 또는 3개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 그러므로, 상기 방법은 TNFRSF19의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 SNORA74A의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 SPAM1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 TNFRSF19, SNORA74 및 SPAM1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
상기 방법은 추가적으로 또는 대안적으로 단계 (b)에서 표 A(ii)에 정의된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어 표 A(ii)에 정의된 바이오마커 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 163개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 192개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개, 201개, 202개, 203개, 204개, 205개, 206개, 207개, 208개, 209개, 210개, 211개, 212개, 213개, 214개, 215개, 216개, 217개, 218개, 219개, 220개, 221개, 222개, 223개, 224개, 225개, 226개, 227개, 228개, 229개, 230개, 231개, 232개, 233개, 234개, 235개, 236개, 237개, 238개, 239개, 240개, 241개, 242개, 243개, 244개, 245개, 246개, 247개, 248개, 249개, 250개, 251개, 252개, 253개, 254개, 255개, 256개, 257개, 258개, 259개, 260개, 261개, 262개, 263개, 264개, 265개, 266개, 267개, 268개, 269개, 270개, 271개, 272개, 273개, 274개, 275개, 276개, 277개, 278개, 279개, 280개, 281개, 282개, 283개, 284개, 285개, 286개, 287개, 288개, 289개, 290개, 291개, 292개, 293개, 294개, 295개, 296개, 297개, 298개, 299개, 300개, 301개, 302개, 303개, 304개, 305개, 306개, 307개, 308개, 309개, 310개, 311개, 312개, 313개, 314개, 315개, 316개, 317개, 318개, 319개, 320개, 321개, 322개, 323개, 324개, 325개, 326개, 327개, 328개, 329개, 330개, 331개, 332개, 333개, 334개, 335개, 336개, 337개, 338개, 339개, 340개, 341개 또는 342개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
상기 방법은 추가적으로 또는 대안적으로 단계 (b)에서 표 1C에 정의된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어 표 A(iii)에 정의된 바이오마커 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43 또는 44개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
따라서, 표 A(i)에 정의된 모든 바이오마커 및/또는 표 A(ii)에 정의된 모든 바이오마커 및/또는 표 A(iii)에 정의된 모든 바이오마커의 발현은 단계 (b)에서 측정될 수 있다. 그러므로, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 A에 정의된 모든 바이오마커를 측정하는 것을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 단계 (b)는 하나 이상의 바이오마커(들)를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 mRNA 분자이다. 그러나, 핵산 분자는 cDNA 분자일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 (b)에서의 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현은 써던 혼성화, 노던 혼성화, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 방사선자동사진법 및 동일계내 혼성화로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 수행된다. 바람직하게는, 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현은 DNA 마이크로어레이를 이용하여 측정된다.
상기 방법은 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 단계 (b)에서 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 각각은 표 A에서 확인된 바이오마커 중 하나를 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이들로 이루어진다. 바람직하게는, 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 5개 내지 100개 길이의 뉴클레오타이드이다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 이들은 15개 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드이다.
하나 이상의 결합 모이어티는 인간 유전자 1.0 ST 어레이(Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)로부터의 하나 이상의 프로브를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 프로브 확인 번호는 본 명세서에서 표 A에 제공되어 있다.
적합한 결합제(또한 결합 분자라 칭함)는 하기 기재된 바와 같은 소정의 핵산, 단백질 또는 아미노산 모티프에 결합하는 이의 능력에 기초하여 라이브러리로부터 선택되거나 스크리닝될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함한다.
"검출 가능한 모이어티"에 의해, 본 발명자들은 존재 및/또는 상대 양 및/또는 위치(예를 들어, 어레이에서의 위치)가 직접적으로 또는 간접적으로 결정되게 하는 모이어티를 포함한다.
적합한 검출 가능한 모이어티는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 형광성 및/또는 발광성 및/또는 화학발광성 모이어티일 수 있고, 이것은 특정한 조건에 노출될 때 검출될 수 있다. 이러한 형광성 모이어티는, 형광성 모이어티를 여기시켜서 검출하고자 하는 특정한 파장에서 검출 가능한 형광을 이것이 방출하게 하는, 특정한 파장 및 강도에서 방사선(즉, 광)에 노출되는 것이 필요할 수 있다.
대안적으로, 검출 가능한 모이어티는 (바람직하게는, 검출 불가능한) 기질을 가시화되고/되거나 검출될 수 있는 검출 가능한 생성물로 전환할 수 있는 효소일 수 있다. 적합한 효소의 예는 예를 들어 ELISA 검정과 관련하여 하기 자세히 기재되어 있다.
그러므로, 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티; 발광성 모이어티; 화학발광성 모이어티; 방사성 모이어티(예를 들어, 방사성 원자); 또는 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 검출 가능한 모이어티는 방사성 원자를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 방사성 원자는 테크네튬-99m, 아이오딘-123, 아이오딘-125, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
명확하게, 검출하고자 하는 물질(예컨대, 본 명세서에 기재된 시험 샘플 및/또는 대조군 샘플 및/또는 선택된 단백질을 검출하는 데 사용하기 위한 항체 분자에서의 하나 이상의 바이오마커 등)은 검출 가능한 모이어티가 용이하게 검출 가능하게 하도록 적절한 원자 동위원소를 충분히 가져야 한다.
대안적인 바람직한 실시형태에서, 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티이다.
방사- 또는 다른 라벨은 공지된 방식으로 본 발명의 방법의 샘플 및/또는 본 발명의 결합 모이어티에 존재하는 바이오마커로 도입될 수 있다. 예를 들어, 결합제가 폴리펩타이드인 경우, 이것은 바이오합성될 수 있거나 수소 대신에 예를 들어 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh 및 111In과 같은 라벨은 예를 들어 결합 모이어티에서의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법(Fraker et al (1978) Biochem . Biophys . Res . Comm . 80, 49-57)은 123I를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 참고문헌("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989)은 다른 방법을 자세히 기재한다. 단백질에 다른 검출 가능한 모이어티(예컨대 효소, 형광성, 발광성, 화학발광성 또는 방사성 모이어티)를 접합하기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
시험하고자 하는 샘플(들)에서의 바이오마커가 상기 단백질의 존재, 양 및/또는 위치를 결정하는 것을 간접적으로 돕는 모이어티에 의해 표지될 수 있는 것으로 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 모이어티는 다성분 검출 가능한 모이어티의 일 성분을 구성할 수 있다. 예를 들어, 시험하고자 하는 샘플(들)에서의 바이오마커는 바이오틴에 의해 표지될 수 있고, 이것은 검출 가능한 라벨에 융합되거나 달리 결합된 스트렙타비딘을 사용하여 이의 후속하는 검출을 허용한다.
본 발명의 제1 양태에서 제공된 방법은 단계 (b)에서 표 A에 정의된 하나 이상의 바이오마커의 단백질의 발현을 결정하는 것을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 하나 이상의 결합 모이어티(각각 표 A에서 확인된 바이오마커 중 하나에 선택적으로 결합할 수 있음)를 사용하여 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 단일클론 항체 또는 이의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
용어 "항체"는 임의의 합성 항체, 재조합 항체 또는 항체 하이브라이드, 예컨대 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 불변 및/또는 가변 구역의 파지 디스프레이에 의해 생성된 단쇄 항체 분자, 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 면역검정 포맷에서 항원에 결합할 수 있는 다른 면역상호작용 분자(이들로 제한되지는 않음)를 포함한다.
본 발명자들은 또한 항체 유사 결합제, 예컨대 아피바디(affibody) 및 앱타머(aptamer)의 용도를 포함한다.
특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 관여되는 기법의 일반 검토는 문헌[Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299]에서 발견된다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 제1 결합 분자 중 하나 이상은 앱타머일 수 있다(문헌[Collett et al., 2005, Methods 37:4-15] 참조).
분자 라이브러리, 예컨대 항체 라이브러리(Clackson et al, 1991, Nature 352, 624-628; Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581-97), 펩타이드 라이브러리(Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7), 발현된 cDNA 라이브러리(Santi et al (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508), 아피바디와 같은 항체 프레임워크가 아닌 다른 스캐폴드에서의 라이브러리(Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134-40) 또는 앱타머에 기초한 라이브러리(Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 118, 217-31)는 소정의 모티프에 특이적인 결합 분자가 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 선택된 공급원으로서 사용될 수 있다.
분자 라이브러리는 원핵생물 세포(Clackson et al, 1991, op. cit.; Marks et al, 1991, op . cit .) 또는 진핵생물 세포(Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651-6)에서 생체내 발현될 수 있거나, 세포의 관여 없이 시험관내 발현될 수 있다(Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4; Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8).
단백질 기반 라이브러리를 사용하는 경우, 잠재적 결합 분자의 라이브러리를 암호화하는 유전자는 대개 바이러스 및 바이러스의 표면에서 디스플레이된 잠재적 결합 분자에서 패키징된다(상기 Clackson 등의 문헌(1991); 상기 Marks 등의 문헌(1991); 상기 Smith의 문헌(1985)).
아마도, 가장 흔히 사용되는 디스플레이 시스템은 표면에서 항체 단편을 디스플레이하는 섬질 박테리오파지이고, 항체 단편은 박테리오파지의 작은 외피 단백질에 대한 융합으로서 발현된다(상기 Clackson 등의 문헌(1991); 상기 Marks 등의 문헌(1991)). 그러나, 디스플레이를 위한 다른 적합한 시스템은 다른 바이러스(EP 39578), 박테리아(상기 Gunneriusson 등의 문헌(1999); Daugherty 등의 문헌(1998), Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613-21) 및 효모(Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5):949-56)를 사용하는 것을 포함한다.
또한, 디스플레이 시스템은 소위 리보솜 디스플레이 시스템에서의 암호화 mRNA에 대한 폴리펩타이드 생성물의 연결(상기 Hanes 및 Pluckthun의 문헌(1997); 상기 He 및 Taussig의 문헌(1997); Nemoto 등의 문헌(1997)), 또는 대안적으로 암호화 DNA에 대한 폴리펩타이드 생성물의 연결(미국 특허 제5,856,090호 및 WO 제98/37186호 참조)을 이용하여 개발되었다.
항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 사실 초기 프로테아제 분해 실험에 의해 처음에 인식된 항원 인식에 관여된다. 추가의 확인은 설치류 항체의 "인간화"에 의해 발견되었다. 설치류 기원의 가변 도메인은 생성된 항체가 설치류 부모인 항체의 항원 특이성을 보유하도록 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).
이 항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되고, 모두 하나 이상의 가변 도메인을 함유하는 항체 단편의 박테리아 발현을 수반하는 실험으로부터 공지된 불변 도메인과 독립적이다. 이 분자는 Fab 유사 분자(Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자(Skerra et al (1988) Science 240, 1038); 단쇄 Fv(ScFv) 분자(여기서, VH 및 VL 파트너 도메인은 가요성 올리고펩타이드를 통해 연결됨)(Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85, 5879) 및 단리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체(dAb)(Ward et al (1989) Nature 341, 544)를 포함한다. 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 관여되는 기법의 일반 검토는 문헌[Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299]에서 발견된다.
항체 또는 항원 결합 단편은 무손상 항체, Fv 단편(예를 들어, 단쇄 Fv 및 다이설파이드 결합 Fv), Fab 유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 포맷 및 이중 포맷[즉, dAb-링커-dAb]을 포함하는 dAb)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 단쇄 Fv(scFv)이다.
하나 이상의 결합 모이어티는 대안적으로 항체 유사 결합제, 예를 들어 아피바디 또는 앱타머를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
"scFv 분자"에 의해, 본 발명자들은 VH 및 VL 파트너 도메인이 가요성 올리고펩타이드를 통해 연결된 분자를 의미한다.
전체 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것의 이점은 수배이다. 더 작은 크기의 단편은 개선된 약리학적 특성, 예컨대 고형 조직의 더 우수한 침투를 발생시킬 수 있다. 전체 항체의 이팩터 기능, 예컨대 보체 결합은 제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비되어서, 다량의 상기 단편의 손쉬운 생성을 허용할 수 있다.
전체 항체, 및 F(ab')2 단편은 "2가"이다. "2가"에 의해, 본 발명자들은 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 조합 부위를 가진다는 것을 의미한다. 반대로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 오직 하나의 항원 조합 부위를 가지는 1가이다.
항체는 단일클론 또는 다중클론일 수 있다. 적합한 단일클론 항체는 공지된 기법, 예를 들어 문헌["Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)](이들 둘 다 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 것에 의해 제조될 수 있다.
잠재적 결합 분자가 라이브러리로부터 선택될 때, 한정된 모티프를 가지는 하나 이상의 선택자 펩타이드가 보통 사용된다. 펩타이드에서의 가요성을 감소시키는 구조를 제공하는 아미노산 잔기, 또는 결합 분자와의 상호작용을 허용하는 하전, 극성 또는 소수성 측쇄는 선택자 펩타이드에 대한 모티프의 설계에서 사용될 수 있다. 예를 들어,
(ⅰ) 프롤린은 이의 측쇄가 알파 탄소 및 질소 둘 다에 결합하면서 펩타이드 구조를 안정화시킬 수 있다;
(ⅱ) 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판은 방향족 측쇄를 가지고 매우 소수성인 반면, 류신 및 아이소류신은 지방족 측쇄를 가지고 또한 소수성이다;
(ⅲ) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘은 염기성 측쇄를 가지고 중성 pH에서 양으로 하전되는 반면, 아스파르테이트 및 글루타메이트는 산성 측쇄를 가지고 중성 pH에서 음으로 하전될 것이다;
(ⅳ) 아스파라긴 및 글루타민은 중성 pH에서 중성이지만, 수소 결합에 참여할 수 있는 아마이드기를 함유한다;
(ⅴ) 세린, 트레오닌 및 타이로신 측쇄는 수소 결합에 참여할 수 있는 하이드록실기를 함유한다.
통상적으로, 결합 분자의 선택은 결합 분자의 유형에 상응하는 스팟에 대한 결합을 분석하도록 어레이 기술 및 시스템의 사용을 수반할 수 있다.
하나 이상의 단백질-결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티, 발광성 모이어티, 화학발광성 모이어티, 방사성 모이어티 및 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가의 실시형태에서, 단계 (b)는 하나 이상의 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합제를 포함하는 검정을 이용하여 수행될 수 있고, 제2 결합제는 또한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 적합한 제2 결합제는 제1 결합제와 관련하여 상기 자세히 기재되어 있다.
따라서, 시험하고자 하는 샘플에서의 관심 있는 단백질은 처음에 제1 결합제를 사용하여 단리되고/되거나 부동화될 수 있고, 이후 상기 바이오마커의 존재 및/또는 상대 양은 제2 결합제를 사용하여 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 통상적으로 재조합 항체 또는 이의 단편이다. 편리하게는, 항체 또는 이의 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 항체 및 단편, 및 이의 제조 방법은 상기 자세히 기재되어 있다.
대안적으로, 제2 결합제는 항체 유사 결합제, 예컨대 아피바디 또는 앱타머일 수 있다.
대안적으로, 시험하고자 하는 샘플에서의 단백질 상의 검출 가능한 모이어티가 특이적 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 바이오틴)을 포함하거나 이것으로 이루어진 경우, 제2 결합제는 특이적 결합 쌍의 상보성 구성원(예를 들어, 스트렙타비딘)을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
검출 검정을 이용하는 경우, 검출 가능한 모이어티가 형광성 모이어티; 발광성 모이어티; 화학발광성 모이어티; 방사성 모이어티; 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 적합한 검출 가능한 모이어티의 예는 상기 기재되어 있다.
혈청 또는 혈장 단백질을 검출하기 위한 바람직한 검정은, 단일클론 및/또는 다중클론 항체를 사용한 샌드위치 검정을 포함하는, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 면역방사측정 검정(IRMA) 및 면역효소 검정(IEMA)을 포함한다. 예시적인 샌드위치 검정은 데이비드 등에 의해 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호(본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 슬라이드에서의 세포의 항체 염색은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 바대로 세포학 실험실 진단학적 시험에서 널리 공지된 방법에서 이용될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 검정은 보통 고상 검정에서 색상 반응 생성물을 제공하는 효소의 사용을 통상적으로 수반하는 ELISA(효소 연결 면역흡착 검정)이다. 겨자무과산화효소 및 포스파타제와 같은 효소는 널리 사용된다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방식은 제2 효소 시스템에 대한 조효소로서 현재 작용하는 NAD를 생성하는 기질로서 NADP를 사용하는 것이다. 에스체리치아 콜라이로부터의 피로포스파타제는 우수한 접합체를 제공하는데, 왜냐하면 이 효소가 조직에 존재하지 않고 안정하고 우수한 반응 색상을 제공하기 때문이다. 루시퍼라제와 같은 효소에 기초한 화학발광성 시스템을 또한 사용할 수 있다.
비타민 바이오틴과의 접합이 흔히 사용되는데, 왜냐하면 이것이 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 효소 연결 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 이의 반응에 의해 이것이 용이하게 검출될 수 있기 때문이다.
대안적인 실시형태에서, 단백질 검출에 이용된 검정은 편리하게는 형광 검정이다. 따라서, 제2 결합제의 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티, 예컨대 알렉사(Alexa) 형광단(예를 들어, 알렉사-647)일 수 있다.
바람직하게는, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)는 어레이를 사용하여 수행된다. 어레이는 비드 기반 어레이 또는 표면 기반 어레이일 수 있다. 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 호흡 초감작 반응(respiratory hypersensitivity response)을 유도할 수 있는 물질을 확인하기 위한 것이다. 바람직하게는, 초감작 반응은 체액 초감작 반응, 예를 들어 I형 초감작 반응이다. 바람직하게는, 상기 방법은 호흡 알레르기를 유도할 수 있는 물질을 확인하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 수지상 세포의 집단 또는 수지상 유사 세포의 집단은 수지상 세포의 집단이다. 바람직하게는, 수지상 세포는 1차 수지상 세포이다. 바람직하게는, 수지상 세포는 골수성 수지상 세포이다.
수지상 세포 또는 수지상 유사 세포의 집단은 바람직하게는 기원이 포유류이다. 바람직하게는, 포유류는 래트, 마우스, 기니아 피그, 개, 고양이, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
실시형태에서, 수지상 세포의 집단 또는 수지상 유사 세포의 집단은 수지상 유사 세포의 집단, 바람직하게는 골수성 수지상 유사 세포이다.
일 실시형태에서, 수지상 유사 세포는 CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 및 CD1a로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 마커 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개를 발현한다. 추가의 실시형태에서, 수지상 유사 세포는 마커 CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 및 CD1a를 발현한다.
추가의 실시형태에서, 수지상 유사 세포는 골수성 수지상 세포로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 수지상 유사 세포는 골수성 백혈병 유래 세포이다. 바람직하게는, 골수성 백혈병 유래 세포는 KG-1, THP-1, U-937, HL-60, 모노막(Monomac)-6, AML-193, 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC) 및 MUTZ-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 수지상 유사 세포는 MUTZ-3 세포이다. MUTZ-3 세포는 1995년 5월 15일에 수탁 번호 ACC 295 하에 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(독일 브라운슈바이 인호펜슈트라쎄 7B(www.dsmz.de))로부터 구입 가능한 인간 급성 골수단핵구 백혈병 세포이다.
일 실시형태에서, 수지상 유사 세포는, 사이토카인에 의한 자극 후, CD1d, MHC 클래스 I 및 II를 통해 항원을 제시하고/하거나, 특이적 T 세포 증식을 유도한다.
그러므로, 일 실시형태에서, 상기 방법은 시험 물질이 호흡 감작 물질인지 또는 아닌지를 나타낸다. 대안적인 또는 추가적인 실시형태에서, 상기 방법은 시험하고자 하는 샘플의 호흡기 감작 효력을 나타낸다.
따라서, 일 실시형태에서, 상기 방법은 시험 물질의 감작인자 효력을 나타낸다(즉, 시험 물질이 비감작인자, 약한 감작인자, 보통의 감작인자, 강한 감작인자 또는 극도의 감작인자이라는 것). 결정 값 및 PCA의 거리는 감작인자 효력과 상관된다.
대안적으로 또는 추가적으로, 시험 물질 효력은 단계 (e)에서
(ⅰ) 하나 이상의 극도의 호흡 감작인자 양성 대조군 물질;
(ⅱ) 하나 이상의 강한 호흡 감작인자 양성 대조군 물질;
(ⅲ) 하나 이상의 보통의 호흡 감작인자 양성 대조군 물질; 및/또는
(ⅳ) 하나 이상의 약한 호흡 감작인자 양성 대조군 물질을 제공함으로써 결정될 수 있고,
단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 극도의 양성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 강한, 보통의, 약한 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양과 다른 경우, 시험 물질은 극도의 호흡 감작인자로서 확인되고,
단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 강한 양성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 극도의, 보통의, 약한 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양과 다른 경우, 시험 물질은 강한 호흡 감작인자로서 확인되고,
단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 보통의 양성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 극도의, 강한, 약한 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양과 다른 경우, 시험 물질은 보통의 호흡 감작인자로서 확인되고,
단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 약한 양성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양에 상응하고/하거나; 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 극도의, 강한, 보통의 및/또는 음성 대조군 샘플(존재하는 경우)에서의 존재 및/또는 양과 다른 경우, 시험 물질은 약한 호흡 감작인자로서 확인된다.
그러므로, 단계 (e)는 호흡 감작인자 양성 대조군의 하기 카테고리를 제공하는 것을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다:
(a) 극도의, 강한, 보통의 및 약한;
(b) 강한, 보통의 및 약한;
(c) 극도의, 보통의 및 약한;
(d) 극도의, 강한 및 보통의;
(e) 극도의 및 강한;
(f) 강한 및 보통의;
(g) 보통의 및 약한;
(h) 강한 및 약한;
(i) 극도의 및 보통의;
(j) 극도의 및 약한;
(k) 극도의;
(l) 강한;
(m) 보통의;
(n) 약한.
음성 및 양성 대조군은 인간에서의 임상 관찰에 기초하여 각각 호흡 비감작인자 또는 호흡 감작인자로 분류될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 방법은 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 단계 (c) 및/또는 단계 (e)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 나타내는 하나 이상의 선결정된 기준값과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로, 호흡 감작 물질은 적어도 0.55의 ROC AUC, 예를 들어 적어도, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99의 ROC AUC 또는 1.00의 ROC AUC로 결정된다. 바람직하게는, 피부 감작 물질은 적어도 0.85의 ROC AUC, 가장 바람직하게는 1의 ROC AUC로 결정된다.
통상적으로, 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질은 지지 벡터 머신(support vector machine: SVM), 예컨대 http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html(예를 들어, e1071 1.5-24)로부터 구입 가능한 것을 이용하여 확인된다. 그러나, 임의의 다른 적합한 수단이 또한 이용될 수 있다. SVM은 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 표 1 바이오마커를 포함하거나 이것으로 이루어진 바이오마커 서명의 ROC AUC를 결정하기 위해 또한 이용될 수 있다.
지지 벡터 머신(SVM)은 분류 및 회귀에 사용된 일련의 관련 지도식 학습 방법이다. 각각 2개의 카테고리 중 하나에 속하는 것으로 표시된, 일련의 교사 예를 고려하여, SVM 교사 알고리즘은 새로운 예가 하나의 카테고리 또는 다른 카테고리에 속하는지를 예측하는 모델을 만든다. 직감적으로, SVM 모델은, 별개의 카테고리의 예가 가능한 한 넓은 명확한 갭에 의해 나눠지도록 맵핑된, 공간에서의 점으로서 예의 표시이다. 이후, 새로운 예가 이 동일한 공간으로 맵핑되고, 이것이 해당하는 갭의 어떠한 측에 기초하여 카테고리에 속하도록 예측된다.
더 공식적으로, 지지 벡터 머신은 고차원 또는 무한차원 공간에서 초평면 또는 일련의 초평면을 구성하고, 이것은 분류, 회귀 또는 다른 업무에 사용될 수 있다. 직감적으로, 임의의 클래스의 가장 가까운 교사 데이터점에 대해 가장 긴 거리를 가지는 초평면(소위 기능 여유도)에 의해 우수한 분리가 달성되는데, 일반적으로 여유도가 더 클수록 분류기의 일반화 오류가 더 낮기 때문이다. SVM에 대한 더 많은 정보를 위해, 예를 들어, 문헌[Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121-167]을 참조한다.
본 발명의 일 실시형태에서, SVM은 공지된 물질(즉, 공지된 감작 물질 또는 비감작 물질)의 바이오마커 프로필을 이용하여 본 발명의 방법을 수행하기 전에 "교사"된다. 이러한 교사 샘플을 실행함으로써, SVM은 어떠한 바이오마커 프로필이 감작을 유도할 수 있는 물질과 연관되는지를 학습할 수 있다. 교사 과정이 완료되면, SVM은 이후 시험된 바이오마커 샘플이 감작 물질 또는 비감작 물질로부터인지를 예측할 수 있다.
개별 SVM에 대한 결정 값은 사례별 기준으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 시험(또는 이의 반복검증)이 0 초과의 SVM 결정 값을 가지는 경우 시험 물질은 호흡 감작인자로 분류된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 시험(또는 이의 반복검증)이 0 이하의 SVM 결정 값을 가지는 경우 시험 물질은 비호흡 감작인자로 분류된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 어떤 물질이 또한 피부 감작인자인지와 무관하게 호흡 감작인자인 그 물질을 확인하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 호흡 감작인자이지만 피부 감작인자가 아닌 물질을 확인하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 호흡 감작인자 및 피부 감작인자인 물질을 확인하기 위한 것이다.
이것은 시험 물질이 감작성 또는 비감작성으로 분류되게 한다. 더구나, 일 실시형태에서, 공지된 효력의 감작 물질(즉, 비감작인자, 약한, 보통의, 강한 또는 극도의 감작 물질)에 의해 SVM을 교사함으로써, 시험 물질의 효력은 또한 비교되어 확인될 수 있다.
그러나, 이 교사 절차는 필요한 교사 매개변수에 의해 SVM을 미리 프로그래밍함으로써 우회될 수 있다. 예를 들어, 감작을 유도할 수 있는 물질은 표 A에 기재된 모든 바이오마커의 측정 및/또는 표 B에 기재된 발현 데이터에 기초하여 표 5에 기재된 SVM 알고리즘을 이용하여 공지된 SVM 매개변수에 따라 확인될 수 있다.
적합한 SVM 매개변수가 데이터의 적절한 선택에 의해 SVM 머신을 교사시킴으로써 표 A에 기재된 바이오마커의 임의의 조합에 대해 결정(즉, 공지된 감작인자 및/또는 비감작 물질에 노출된 세포로부터의 바이오마커 측정)될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 대안적으로, 표 A 바이오마커는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 통계 방법에 따라 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, 표 A 데이터 및/또는 표 B 데이터는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 통계 방법(예를 들어, ANOVA, ANCOVA, MANOVA, MANCOVA, 다변량 회귀 분석, 주성분 분석(Principal components analysis: PCA), 인자 분석, 정중 상관 분석, 정중 상관 분석, 가외성 분석 대응 분석(Redundancy analysis Correspondence analysis)(CA: 상호 평균화), 다차원 척도법, 판별 분석, 선형 판별 분석(Linear discriminant analysis: LDA), 클러스터링 시스템, 회귀적 분할 및 인공 신경 회로망)에 따라 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하기 위해 이용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 65%의 정확성, 예를 들어 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 정확성을 가진다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 65%의 민감도, 예를 들어 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 민감도를 가진다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 65%의 특이성, 예를 들어 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 특이성을 가진다.
"정확성"에 의해, 본 발명자들은 방법의 정확한 결과의 비율을 의미하고, "민감도"에 의해, 본 발명자들은 양성으로 정확히 분류되는 모든 양성 화학물질의 비율을 의미하고, "특이성"에 의해, 본 발명자들은 음성으로 정확히 분류되는 모든 음성 화학물질의 비율을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 제1 양태의 방법은 PCT 공보 제WO 2012/056236호(본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)(특히, 본 발명의 양태 및 실시형태, 및 청구항)에 기재된 포유류 피부의 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법을 동시에 또는 연속하여 수행하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 포유류 피부의 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법은 본 발명의 제1 양태의 방법과 동시에 수행된다(즉, 시험 물질에 노출된 동일한 세포 샘플(들)에서 관련 마커 발현을 측정함으로써 시험 화합물이 피부 및/또는 호흡 감작인자인지를 결정).
본 발명의 제2 양태는 본 발명의 제1 양태(또는 임의의 실시형태 또는 이의 실시형태의 조합)의 방법에서 사용하기 위한 어레이를 제공하고, 어레이는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 결합 모이어티는 (총체적으로) 표 A(i)에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 결합 모이어티는 (총체적으로) 표 A(ii)에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 결합 모이어티는 (총체적으로) 표 A(iii)에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 결합 모이어티는 (총체적으로) 표 A에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있다.
결합 모이어티는 부동화될 수 있다.
어레이는 특히 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 통상적으로, 이것은 고체 지지체의 표면에 형성된 한정된 구역을 각각 가지는 이격된(즉, 별개의) 구역("스팟")을 가지는 직선 또는 2차원 구조로 형성된다. 어레이는 또한 비드 구조일 수 있고, 여기서 각각의 비드는 분자 코드 또는 색상 코드에 의해 확인되거나 연속 흐름에서 확인될 수 있다. 분석은 또한 순차적으로 수행될 수 있고, 여기서 샘플은 용액으로부터 분자의 클래스를 각각 흡착하는 일련의 스팟에 걸쳐 통과한다. 고체 지지체는 통상적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 흔히 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 나일론, 폴리스타이렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 관, 비드, 디스크, 실리콘 칩, 마이크로플레이트, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막, 나이트로셀룰로스 막, 나일론 막, 다른 다공성 막, 비다공성 막(예를 들어, 무엇보다도 플라스틱, 중합체, 퍼스펙스(perspex), 실리콘), 복수의 중합체 핀, 또는 복수의 미량적정 웰, 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 다른 적합한 분자를 부동화하고/하거나 면역검정을 수행하기에 적합한 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 결합 과정은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 고체 지지체에 단백질 분자, 폴리뉴클레오타이드 등을 공유로 결합을 가교결합시키거나 물리적으로 흡착시키는 것으로 이루어진다. 대안적으로, 친화도 태그 또는 유사한 구성체를 통한 프로브의 친화도 커플링이 이용될 수 있다. 널리 공지된 기법, 예컨대 접촉 또는 비접촉 인쇄, 차폐 또는 포토리소그래피를 이용함으로써, 각각의 스팟의 위치가 한정될 수 있다. 검토를 위해, 문헌[Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29) 및 Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9)]을 참조한다.
통상적으로, 어레이는 마이크로어레이이다. "마이크로어레이"에 의해, 본 발명자들은 적어도 약 100/㎠, 바람직하게는 적어도 약 1000/㎠의 별개의 구역의 밀도를 가지는 구역의 어레이를 측정하는 것을 포함한다. 마이크로어레이에서의 구역은 통상적인 치수, 예를 들어 약 10 내지 250㎜의 범위의 직경을 가지고, 거의 동일한 거리로 어레이에서의 다른 구역으로부터 분리된다. 어레이는 대안적으로 마크로어레이 또는 나노어레이일 수 있다.
(상기 기재된) 적합한 결합 분자가 확인되고 단리되면, 당업자는 분자 생물학의 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 어레이를 제조할 수 있다.
바람직하게는, 어레이는 본 발명의 제1 양태, 및 여기에 기재된 실시형태 중 하나 이상에 기재된 방법과 일치한다.
본 발명의 제3 양태는 초감작 반응 감작 물질을 확인하기 위해 조합된 표 A(i) 표 A(ii) 및/또는 표 A(iii)에 정의된 군으로부터 선택된 1개 이상(바람직하게는, 2개 이상)의 바이오마커의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 표 A(i) 및 표 A(ii)에서 확인된 모든 바이오마커는 총체적으로 초감작 반응 감작 물질을 확인하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 용도는 본 발명의 제1 양태, 및 여기에 기재된 실시형태 중 하나 이상에 기재된 방법과 일치한다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 1개 이상(바람직하게는, 2개 이상)의 결합 모이어티의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 표 A(i) 및 표 A(ii)에 정의된 모든 바이오마커에 대한 결합 모이어티는 총체적으로 초감작 반응 감작 물질을 확인하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 용도는 본 발명의 제1 양태, 및 여기에 기재된 실시형태 중 하나 이상에 기재된 방법과 일치한다.
본 발명의 제5 양태는,
A) 본 발명의 제2 양태에 따른 어레이 및/또는 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티; 및
B) 본 발명의 제1 양태에 따른 방법을 수행하기 위한 설명서(임의)를 포함하거나 이들로 이루어진 본 발명의 제1 양태에 따른 방법에서 사용하기 위한 분석 키트를 제공한다.
분석 키트는 하나 이상의 조절물질을 포함할 수 잇다. 바람직하게는, 분석 키트는 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 하나 이상의 음성 대조군 물질 및/또는 하나 이상의 양성 대조군 물질과 함께 상기 특징을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 바람직하게는, 분석 키트는 본 발명의 제1 양태, 및 여기에 기재된 실시형태 중 하나 이상에 기재된 방법과 일치한다.
본 발명의 제6 양태는,
(a) 환자가 노출되거나 노출되었던 하나 이상의 시험 물질을 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)에 제공된 하나 이상의 시험 물질이 본 발명의 제1 양태에 제공된 방법을 이용하여 호흡 감작인자인지를 결정하는 단계; 및
(c) 하나 이상의 시험 물질이 호흡 감작인자로서 확인된 경우, 호흡 감작인자로서 확인된 하나 이상의 시험 물질에 대한 환자의 노출을 감소시키거나 예방하고/하거나, 감작의 증상에 대한 적절한 치료를 제공하는 단계를 포함하는, 환자에서 호흡기 I형 초감작 반응(예컨대, 호흡기 천식)을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 환자가 노출된 하나 이상의 시험 물질은 환자가 1개월에 적어도 1회, 예를 들어 2주마다 적어도 1회, 1주마다 적어도 1회 또는 1일마다 적어도 1회로 곧 노출되는 물질이다.
감작의 증상의 치료는 단기작용 베타2-아드레날린수용체 작용제(short-acting beta2-adrenoceptor agonist: SABA), 예컨대 살부타몰; 항콜린성 약제, 예컨대 이프라트로피움 브로마이드; 다른 아드레날린 작용제(adrenergic agonist), 예컨대 흡입성 에피네프린; 코티코스테로이드, 예컨대 베클로메타손; 장기작용 베타-아드레날린수용체 작용제(long-acting beta-adrenoceptor agonist: LABA), 예컨대 살메테롤 및 포르모테롤; 류코트리엔 길항제, 예컨대 몬테루카스트 및 자피르루카스트; 및/또는 비만 세포 안정화제(예컨대, 크로몰린 나트륨)을 포함할 수 있고, 코티코스테로이드에 대한 또 다른 바람직하지 않은 대안이다.
바람직하게는, 치료 방법은 본 발명의 제1 양태, 및 여기에 기재된 실시형태 중 하나 이상에 기재된 방법과 일치한다.
본 발명의 제7 양태는 본 발명의 제1 양태의 방법을 운영하기 위한, 예를 들어 단계 (b), (d) 및/또는 (f)의 발현 데이터를 해석하고 이로써 하나 이상의 시험 물질이 호흡 감작인자인지를 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다. 컴퓨터 프로그램은 프로그래밍된 SVM일 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 당해 분야의 당업자에게 공지된 적합한 컴퓨터 판독 가능한 매체에 기록될 수 있다. 적합한 컴퓨터 판독 가능한 매체는 컴팩트 디스크(CD-ROM, DVD, Blue Ray 등), 플로피 디스크, 플래시 기억 드라이브, ROM 또는 하드 디스크 드라이브를 포함할 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 프로그램을 실행하기에 적합한 컴퓨터에 설치될 수 있다.
본 발명의 소정의 양태를 구현하는 바람직한 비제한적인 예가 하기 도면을 참조하여 이제 기재될 것이다:
도 1. 화학 자극 후의 MUTZ -3 세포의 CD86 발현. 표시된 데이터는 화학 자극, (n = 3), 4-아미노벤조산, DMSO 및 비자극 세포(n = 6) 및 과망간산칼륨, 2-아미노페놀, 헥실신남산 알데하이드 및 2-하이드록시에틸 아크릴레이트(n = 2)의 평균이고, 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. 각각의 자극을 이의 상응하는 비히클과 비교하는 스튜던트 t-시험에 의해 통계 유의성을 결정하였고, p < 0.05는 *로 표시된다.
도 2. 호흡 감작의 예측을 위한 예측 바이오마커 서명의 확립. (A) 데이터세트의 표시를 구축하도록 비지도식 학습을 이용하였다. 호흡 감작인자(청색, n = 29)와 호흡 비감작인자(녹색, n = 74) 사이의 일방향 ANOVA p-값 필터링에 의해 확인된 999개의 전사물에 기초하여 PCA를 사용하여 상기 방법을 가시화하였다. (B) 후진 제거(backward elimination)를 위한 알고리즘으로의 입력으로서 p-값 필터링에 의해 확인된 999개의 전사물을 사용하였다. 610개의 전사물의 제거 후 쿨백-라이블러 발산(Kullback-Leibler divergence)에서의 종단점이 관찰되었다. (C) PCA로의 입력 변수로서 남은 389개의 전사물을 사용하였다. 도면에 예시된 바대로, 교사 데이터에서 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 완전한 분리를 달성하였다.
도 3. GARD 호흡 예측 서명, GRPS를 사용한 독립적인 시험 화합물의 시각 분류. (A) 비지도식 표시로의 입력으로서 GRPS의 389개의 유전자를 이용하여 바이오마커 서명 확인에 사용된 일련의 기준 화학물질(n = 103)로부터 3개의 제1 PCA 성분으로부터 PCA 공간을 구축하였다. 화합물이 PCA 성분에 영향을 미치게 하지 않으면서, 시험 데이터세트(n = 92)에서의 각각의 화학물질을 PCA 공간으로 작도하였다. (B) 호흡 감작인자(어두운 청색) 또는 호흡 비감작인자(어두운 녹색)로서의 감작 특성에 따라 시험 데이터세트에서의 샘플을 색상표시하였다. 교사 데이터 및 시험 데이터 둘 다에 대한 제1 PCA 성분과 함께 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 분리가 보일 수 있다. (C) 교사 데이터세트의 깨끗한 그림을 얻기 위해 교사 데이터세트를 제거하였다.
도 4. 시험 데이터세트의 지지 벡터 머신 ( SVM ) 분류. 지도식 머신 학습을 위해 SVM을 이용하여 GRPS의 예측변수 성능을 검증하였다. SVM 알고리즘은 교사 데이터세트(n = 103)에서의 화합물에 대한 경험에 의해 귀납적으로 학습되고, 후속하여 시험 데이터세트(n = 70, 비히클 대조군 배제됨)에서의 각각의 개별 샘플을 예측하기 위해 적용되었다. 예측력은 ROC 곡선 분석에 의해 평가되고, 0.97의 곡선 하 면적(AUC)으로 예상되었다.
도 5. 독립적인 시험 데이터세트에서의 호흡 감작인자의 분류 및 유전자 발현. SVM 알고리즘은 교사 데이터세트(n = 103)에서의 샘플에서 다시 한번 교사되고, 후속하여 독립적인 시험 데이터세트(n = 70, 비히클 대조군 배제됨)에서의 샘플을 분류하도록 적용되었다. 독립적인 시험 데이터세트에서의 각각의 개별 샘플에 대한 SVM 결정 값은 내림 차순으로 작도되고 감작 능력에 따라 색상표시되었다(호흡 감작인자 = 자주색, 호흡 비감작인자 = 어두운 녹색). 산점도에서의 점선은 호흡 감작인자(0 초과의 SVM 결정 값) 또는 호흡 비감작인자(0 미만의 SVM 결정 값)로서의 분류에 대한 한계치 수준을 나타낸다. GRPS 내의 전사물의 상대 발현은 열 지도로 표시된다.
실시예
도입
배경: 소정의 저분자량(LMW) 화학 화합물에 대한 반복 노출은 피부 또는 호흡기에서 알레르기 반응을 전개시킬 수 있다. 대부분의 경우에, 소정의 LMW 화합물은 피부(알레르기성 접촉 피부염(ACD)을 발생시킴) 또는 호흡기(직업상 천식(OA)을 발생시킴)를 선택적으로 감작시킨다. 알레르기 질환의 발생을 제한하기 위해, 이러한 반응을 유도할 수 있는 화학물질을 정확히 확인하는 예측 검정을 개발하기 위해 노력이 현재 이루어지고 있다. 그러나, 피부 감작의 예측을 위한 몇몇 유망한 방법이 기재되어 있지만, 현재까지 화학물질을 호흡 감작인자로서 정확히 분류할 수 있는 시험관내 또는 생체내 검증된 방법이 존재하지 않는다.
결과: 최근에, 본 발명자들은 게놈 바이오마커 서명의 측정에 기초하여 피부 감작 화학물질의 분류를 위한 신규한 시험 전략으로서 시험관내 기반 게놈 알레르겐 신속 검출(GARD) 검정을 제시하였다. 본 발명자들은, 호흡 비감작인자와 비교하여, 호흡 감작인자에 대한 389개의 상이하게 조절된 유전자를 함유하는 별개의 바이오마커 서명을 확인함으로써, 호흡 감작인자를 또한 분류하는, GARD 검정의 적용범위 도메인을 확대시켰다. 지도식 머신 학습과 조합되어 독립적인 데이터세트를 사용함으로써, 본 발명자들은 확인된 게놈 바이오마커가 호흡 감작인자를 정확히 분류할 수 있다는 것을 보여주는 검정을 검증하였다.
결론: 본 발명자들은 호흡 감작인자의 분류를 위한 게놈 바이오마커 서명을 확인하였다. 이 새롭게 확인된 바이오마커 서명을 피부 감작인자의 분류를 위한 본 발명자들의 이전에 확인된 바이오마커 서명과 조합하여, 본 발명자들은 동일한 샘플에서 피부 감작 및 호흡 감작 둘 다를 예측하는 강력한 능력을 가지는 신규한 시험관내 시험 전략을 개발하였다.
재료 및 방법
화학물질
예측적 게놈 바이오마커 서명을 확립하기 위해 교사 데이터세트라 총체적으로 칭하는 10개의 훌륭히 규명된 호흡 감작인자 및 22개의 호흡 비감작인자의 선택을 포함하는 일련의 32개의 기준 화학물질을 사용하였다. 호흡 감작인자는 암모늄 헥사클로로플라티네이트, 과황산암모늄, 에틸렌다이아민, 글루타르알데하이드, 헥사메틸렌 다이아이소사이아네이트, 말레산 무수물, 메틸렌 다이페닐 다이아이소사이아네이트, 프탈산 무수물, 톨루엔 다이아이소사이아네이트 및 트라이멜리트산 무수물이었다. 호흡 비감작인자는 1-뷰탄올, 2-아미노페놀, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-나이트로-1,4-페닐렌다이아민, 4-아미노벤조산, 클로로벤젠, 다이메틸 폼아마이드, 에틸 바닐린, 폼알데하이드, 게라니올, 헥실신남산 알데하이드, 아이소프로판올, 카톤 CG, 메틸 살리실레이트, 페니실린 G, 중크롬산칼륨, 과망간산칼륨, 프로필렌 글라이콜, Tween 80, 아연 설페이트 및 비히클 대조군 다이메틸 설폭사이드 및 물이었다. 추가적으로, 확인된 예측적 게놈 바이오마커 서명의 검증을 위한 독립적인 시험세트를 형성하기 위해 독립적인 시험 데이터세트라 총체적으로 칭하는 6개의 호흡 감작인자 및 19개의 호흡 비감작인자를 포함하는 일련의 25개의 화학물질을 세포 자극에 사용하였다. 독립적인 교사 데이터세트는 모델의 교사 동안 포함된 대조군 화학물질, 및 모델의 교사 동안 이전에 보이지 않은 화학물질 둘 다를 포함하였다. 호흡 감작인자는 클로르아민 T, 에틸렌다이아민, 아이소포론 다이아이소사이아네이트, 프탈산 무수물, 피페라진 및 반응성 오렌지이었다. 호흡 비감작인자는 1-뷰탄올, 2,4-다이나이트로클로로벤젠, 2-머캅토벤조티아졸, 벤즈알데하이드, 클로로벤젠, 신나밀 알콜, 다이에틸 프탈레이트, 유게놀, 글라이세롤, 글라이옥살, 아이소유게놀, 락트산, 옥탄산, 페놀, p-하이드록시벤조산, p-페닐렌다이아민, 레소르시놀, 살리실산 및 황산 도데실 나트륨이었다. 모든 화학물질을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 화학물질을 세포의 자극 전에 물 또는 DMSO 중에 GARD 입력 농도로 용해시키고 희석시켰다. DMSO 중에 용해된 화학물질에 대해, DMSO의 웰 중 농도는 0.1%이었다. 이전에 기재된 바대로[41,42] 각각의 화학 화합물에 대한 화학물질 세포독성의 모니터링 및 GARD 입력 농도의 확립을 수행하였다. 요약하면, 하기 결정 스케줄에 따라 GARD 입력 농도를 결정하였다: 비독성의 가용성 화합물을 500μM에 상응하는 농도로 사용하였다. 500μM에서 불용성인 비독성의 난용성 화합물을 최고 가용성 농도로 사용하였다. 독성 화합물을 90% 상대 생존능력(Rv90)을 생성하는 농도로 사용하였다. 처음에 만족한 기준은 각각의 화합물에 대한 GARD 입력 농도를 결정한다. GARD 입력 농도, 감작 효력 및 용매가 예측적 게놈 바이오마커 서명을 확립하기 위해 사용된 화합물에 대해 표 1에 제시되어 있고, 예측적 게놈 바이오마커 서명을 검증하기 위해 사용된 화합물에 대해 표 2에 제시되어 있다.
세포 배양, 표현형 분석, 화학 노출, 세포 수확 및 mRNA 단리
인간 급성 골수단핵구 백혈병 세포주 MUTZ-3[68,69]을 Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ, 독일 브라운슈바이크)으로부터 얻었다. 이전에 기재된 바대로[41,42] 세포의 유지, MUTZ-3의 화학 자극 및 mRNA의 모든 후속하는 단리 및 cDNA의 준비를 수행하였다. 요약하면, 세포가 미성숙 상태에 있다는 것을 보장하기 위해 화학 자극 전에 유세포분석법을 이용하여 MUTZ-3의 표현형 제어 수행하였다. 하기 FITC 접합 마우스 단일클론 항체(mAb)를 사용하였다: CD1a(DakoCytomation, 덴마크 글로스트럽), CD34, CD86, HLA-DR, IgG1(BD Biosciences, 뉴저지주 프랭클린 레이크스). 하기 PE 접합 마우스 단일클론 항체를 사용하였다: CD14(DakoCytomation), CD54, CD80, IgG1(BD Biosciences). 프로피듐 요오다이드(BD Biosciences) 염색을 이용하여 세포 생존능력을 결정하였다. FACSCanto II 장치에서 샘플을 실행하였다. FACS Diva 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 데이터를 획득하고, FCS Express V4(De Novo Software, 캘리포니아주 로스앤젤레스)를 사용하여 분석하였다. 전방 및 측방 산란 특성 및 아이소타입-대조군을 사용하여 확립된 사분면에 기초하여 세포 부스러기 및 생존불가 세포를 배제하도록 게이팅을 수행하였다. 화학 노출 동안, 세포를 24웰 플레이트에서 200.000개 세포/㎖로 시딩하고, GARD 입력 농도에서 화학 화합물에 노출시켰다. 자극된 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간 항온처리 후 수확하고, 제조사가 제공한 표준화 프로토콜을 이용하여 RNA를 TRIzol(등록상표) 시약(Life Technologies, 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 단리하였다. 동시에, 세포의 성숙 상태의 제어를 CD86의 유세포분석법에 의해 수행하였다. 제조사가 제공한 표준화 프로토콜에 따라 cDNA의 준비 및 인간 유전자 1.0 ST 어레이(Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)의 혼성화, 세척 및 스캐닝을 수행하였다(Affymetrix).
마이크로어레이 데이터 분석 및 통계 방법
단일-채널 어레이 정규화(Single-Channel array normalization: SCAN) 알고리즘[70]을 이용하여 인간 유전자 1.0 ST 어레이로부터 얻은 유전자 발현 데이터를 정규화하고, ComBat[71] 경험적 베이스 방법을 이용하여 실험의 상이한 세트 사이의 잠재적 배취 효과(potential batch effect)를 조정하였다. 오픈 소프트웨어 Bioconductor v2.14[73]를 추가적인 소프트웨어 패키지 SCAN.UPC[70] 및 sva[74]와 함께 사용하여 R 통계 소프트웨어[72]에서 정규화 및 배취 조정을 수행하였다. 정규화 데이터를 Qlucore Omics Explorer 3.0(Qlucore AB, 스웨덴 룬드)으로 가져오기하고, 주성분 분석(PCA)[75]을 이용하여 가시화하였다. 호흡 감작인자 및 호흡 비감작인자를 비교하는 다중 가설 시험을 조정하기 위해 거짓 발견율(false discovery rate: FDR)[76]을 이용하여 일방향 ANOVA p-값 필터링으로부터 예측변수를 선택하였다. 바이오마커 서명 크기를 더 감소시키고 개선하기 위해 상위 999개의 예측변수에 후진 제거를 위한 래퍼 알고리즘(wrapper algorithm)[41,52]을 적용하였다. AUC ROC가 1.0에 도달하는 경우에 서명 최적화가 가능하게 하도록 수신기 작동 특성 하 곡선(Area Under the Receiver Operating Characteristic: AUC ROC)[77]을 최대화하기보다는 쿨백-라이블러 오류[53]를 최소화하기 위해 후진 제거 알고리즘을 변형시켰다. 후진 제거 후 선택된 상위 389개의 예측변수를 총체적으로 "GARD 호흡 예측 서명"이라 칭한다. 후진 제거에 대한 스크립트가 추가적인 패키지 e1071[78]을 가지는 R에서 프로그래밍된다. 이전에 기재된 바대로[41] 선형 커넬(kernel)에 기초하여 지지 벡터 머신(SVM)[79]에 기초한 교차 검증을 이용하여 예측적 게놈 바이오마커 서명이 확립되는 방법을 검증하였다. 요약하면, 교사 데이터세트를 70%의 자극을 포함하는 새로운 교차 검증 교사 데이터세트 및 30%의 자극을 포함하는 교차 검증 시험 데이터세트로 무작위로 나눴다. 또한, 완전한 교사 데이터세트에서처럼 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 동일한 비율을 유지하도록 주의가 취해졌다. 상기 기재된 바와 같은 일방향 ANOVA p-값 필터링을 이용하여 교차 검증 교사 데이터세트로부터 새로운 예측적 게놈 바이오마커 서명을 확인하였다. 교차 검증 교사 데이터세트에서의 정보에 기초하여 SVM을 교사하도록 확인된 예측 바이오마커 서명을 이용하였다. SVM은 추가적인 패키지 e1071을 가지는 R 통계 소프트웨어에서 편집되었다. 후속하여 교차 검증 시험 데이터세트의 샘플을 예측하기 위해 SVM 모델을 이용하였다. 바이오마커 확인의 과정은 20회 반복되고, 각각의 개별 전사물이 20개의 교사 데이터세트에 포함된 빈도(VCF의 검증 콜 빈도이라 칭함)를 계산함으로써 피쳐 선택 과정의 견고성을 평가하였다. [46]에 기재된 바와 같은 독립적인 시험 데이터세트를 이용하여 미지의 샘플의 예측의 면에서 GRPS의 예측력을 예상하였다. 요약하면, SVM은 변수 입력으로서 GRPS를 이용하여 교사 데이터세트에서 교사되었다. 후속하여, 이후 SVM을 이용하여 상기 교차 검증에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 교사 데이터세트에서 샘플을 예측하고, 추가적인 패키지 ROCR[80]을 이용하여 R 통계 환경에서 결정된 AUC ROC을 이용하여 모델의 예측력을 평가하였다. 호흡 감작인자 또는 호흡 비감작인자로서의 샘플의 분류는 반복검증 수준에서 SVM 결정 값에 기초한다. 그러므로, 소정의 화학 자극으로부터의 임의의 반복검증 자극이 0 초과의 SVM 결정 값을 가지는 경우 화학물질은 호흡 감작인자로서 분류된다. 쿠퍼 통계학(cooper statistic)[81]을 이용하여 검정의 정확성, 민감도 및 선택도를 결정하였다. 기능적 심화를 수행함으로써 MetaCoreTM(Thomson Reuters, 뉴욕주 뉴욕)을 이용하여 GRPS의 생물학적 관련성이 조사되었다. MetaCore(상표명) 알고리즘으로의 입력으로서 p-값 필터링으로부터 상위 999개의 예측변수를 이용하였고, 입력 분자와 연관된 정규 경로를 조사함으로써 생물학적 관련성을 확립하였다. 어레이 데이터는 수탁 번호 E-MEXP-3773에 의해 ArrayExpress(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)에 업로딩되었다.
결과
비자극된 및 화학적으로 자극된 MUTZ -3 세포의 표현형 분석
화학 시험감염 전에, 유세포분석법을 이용하여 공통 골수성 및 수지상 세포 마커의 세포 발현을 측정함으로써 세포를 품질 제어하였다. 이 마커는 CD1a, CD14, CD34, CD54, CD80, CD86 및 HLA-DR을 포함하였다. 결과는 이전에 공개된 표현형 프로필[41]과 상관되고, 이것은 세포가 미성숙 상태로 성공적으로 유지된다는 것을 보장한다. 화학 자극 후, 10개의 호흡 감작인자 및 20개의 호흡 비감작인자 및 비히클 대조군(표 1)을 포함하는 일련의 기준 화학물질을 사용하여, 동시자극 마커 CD86의 세포 표면 발현의 수준을 측정함으로써 세포의 일반 성숙 상태를 다시 검증하였고, 결과가 도 1에 제시되어 있다. 비자극 세포와 비교하여 각각의 자극에 대한 CD86의 화학적으로 유도된 상향조절은 다수의 자극 후 세포에서 명확하였다. 그러나, 반복검증 자극 사이의 큰 표준 편차로 인해, 호흡 감작인자 암모늄 헥사클로로플라티네이트 및 글루타르알데하이드에 의해 유도된 유일한 조절은 통계 유의성으로 확인될 수 있었다(스튜던트 t-시험, p<0.05). 결과적으로, 호흡 감작의 분류를 위한 단일 바이오마커로서 CD86을 이용한 검정은 불과 20%의 민감도를 생성할 것이다. 추가적으로, CD86의 상향조절은 호흡 비감작 자극 2-아미노페놀 및 카톤 CG에서 또한 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 호흡 화학 감작인자를 분류하기 위해 MUTZ-3 세포주에서 단일 바이오마커로서 이용되지 않을 수 있다고 결론지었다. 그러나, 호흡 감작인자의 대부분이 세포 배지에서 불량한 용해도를 가지고, 따라서 세포독성을 유도하기에 충분한 농도로 사용될 수 없으므로, CD86의 발현은 화학물질 자극의 생체이용률을 보장하기 위해 보완적인 품질 제어로서 작용할 수 있다.
화학적으로 자극된 MUTZ -3의 전사 프로파일링에 의한 예측적 게놈 바이오마커 서명의 확인
호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 가장 구별되는 전사물을 확인하기 위해 MUTZ-3 세포에서의 화학적으로 유도된 변화를 전사 방식 기준으로 조사하였다. 일련의 기준 화학물질에 의한 세포 자극의 24시간 후, 전사 프로파일링에 의해 mRNA를 수집하였다. 자극은 10개의 상이한 호흡 감작인자, 20개의 호흡 비감작인자(음성 대조군) 및 비히클 대조군(DMSO, 증류수)을 포함하였다. 내부 제어로 인해 6개의 반복검증에서 분석된 4-아미노벤조산 및 결점 있는 어레이로 인해 오직 2개의 반복검증에서 분석된 과망간산칼륨을 제외하고, 생물학적 3중 반복검증에서 모든 자극을 수행하였다. 또한, 각각 6개의 반복검증에서 비히클 대조군(DMSO 및 증류수)을 분석하였다. 샘플의 품질 제어는 과황산암모늄의 반복검증 자극 중 하나가 유의미한 이상점이고 바이오마커 발견을 방해하지 않도록 제거되어야 한다는 것을 밝혀냈다. 요약하면, 분석에 준비된 데이터세트는 각각 29,141개의 전사물의 측정으로 103개의 어레이로 이루어진다.
유전자 발현 데이터는 Qlucore Omics Explorer로 가져오기되고, 주성분 분석(PCA)을 이용하여 가시화되었다. 본 발명자들은 피쳐 선택에 대한 계단식 접근법을 적용하여서, 데이터세트에서의 노이즈를 감소시키고 고유 특성에 기초하여 예측변수를 선택하기 위한, 필터링 방법, 및 각각의 개별 예측변수가 총체적으로 전체 서명에 의해 어떻게 수행하는지를 고려함으로써 서명에서의 유전자의 수를 감소시키기 위한, 후진 제거에 의한 래퍼 방법을 조합하였다. 필터링 방법은 전부, 호흡 감작인자 및 호흡 비감작인자를 비교하는, 일방향 ANOVA 분석에 의해 결정된 바와 같은, p-값에 기초한다. 래퍼 방법은 반복된 지도식 학습에 기초한다. 후진 제거에 대한 알고리즘은 인하우스 개발되었고[52], 단일 잔류(leave-one-out) 교차 검증 절차를 이용하여 지지 벡터 머신(SVM)의 교사 및 시험에 의해 후속하여 평가된, 전사물의 하위세트를 반복하여 추출되었다. 최소 정보제공 변수를 제거하고, 분류 모델의 최고 성능이 달성될 때까지 과정을 반복하였다. 컴퓨터적 제한으로 인해, 대략 1000개의 유전자는 후진 제거를 위한 알고리즘에서 입력으로 사용하기 위한 잠재적 예측변수의 적절한 양이다. 본 데이터세트에서, 예측변수 후보물질의 이 예비선택은 0.024 이하의 p-값으로 999개의 유전자를 생성시켰다. 도 2A에 예시된 바대로, 이 유전자는 총체적으로 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 분할을 달성할 수 있지만, 2개의 군 사이에 약간의 중첩이 발생했다. 데이터가 10-6으로 감소한 p-값으로 예측변수 후보물질을 함유하더라도, p-값에 의해 주어진 순위에 의해 추가로 예측변수의 수의 감소는 명확한 분리를 달성하지 못했다. 후진 제거를 위한 인하우스 개발된 알고리즘을 적용하여, 최소 정보에 기여하는 예측변수(유전자)를 제거하였다. 쿨백-라이블러 발산(KLD)[53]에서의 국소 최소가 610개의 예측변수가 예상될 때 관찰되었다(도 2B). 남은 389개의 유전자는 총체적으로 "GARD 호흡 예측 서명"(GRPS)이라 칭해지고, 교사 데이터세트에서의 호흡 화학 감작인자와 호흡 비감작인자 사이를 구별하는 이의 능력은 도 2C에 예시되어 있다. 유전자의 정체는 표 A에 기재되어 있다. 바이오마커 서명이 확립되는 방법을 검증하기 위해, 본 발명자들은 바이오마커 발견 동안 사용된 샘플을 본 발명자들이 방법에 기재된 바와 같은 교사 세트 및 시험 세트로 무작위로 구별하는 교차 검증 절차를 수행하였다. 과정을 20회 반복하고, 20개의 새로운 바이오마커 서명 중에 각각의 예측변수 전사물의 빈도를 견고함의 측정으로 사용하였다. 이 실행으로부터의 결과가 검증 콜 빈도(VCF)로서 표에 기재되어 있고, 표 A에 요약되어 있다.
예측력의 예상치로서 GARD 호흡 예측 서명을 이용한 독립적인 시험 화합물의 시각 분류
호흡 감작인자에 대한 예측 검정으로서 게놈 바이오마커 서명의 관련성을 예시하기 위해 호흡 감작인자, 및 호흡 비감작인자 둘 다를 포함하는 독립적인 시험 데이터세트를 이용하여 GRPS의 예측력을 검증하였다. 독립적인 시험 데이터세트에 포함된 화학 화합물은 표 2에 기재되어 있다. 1-뷰탄올, 클로로벤젠, 에틸렌다이아민, 프탈산 무수물 및 비히클 대조군(DMSO, 증류수)을 포함하는 모델의 교사 동안 사용된 화합물 중 몇몇은 대조군으로서 사용되는 독립적인 시험 데이터세트에 또한 포함되었다. 남은 화학물질은 샘플의 분류 전에 모델에 의해 보이지 않았다. 독립적인 시험 데이터세트에서의 모든 화학물질은 교사 데이터세트를 포함하는 자극으로부터 시간상 분리된 추가적인 자극에 기초한다. 따라서, GRPS의 확인 동안 보이지 않은 화합물, 및 모델에 의해 보인 화합물 둘 다는 모델을 과최적화시키는 위험 없이 분류될 수 있었다. 세포 자극의 24시간 후, mRNA를 수집하고 cDNA로 전환하고 마이크로어레이로 혼성화하였다. 자극은 6개의 호흡 감작인자, 19개의 호흡 비감작인자 및 비히클 대조군(DMSO, 증류수)을 포함하였다. 호흡 비감작 자극은 이전의 세트의 실험[41]으로부터 재사용되고, 생물학적 3회 반복검증에서 수행되었다. 호흡 비감작인자 1-뷰탄올과 함께 호흡 감작인자에 의해 수행된 자극은 새로운 회차의 자극을 포함하고, 생물학적 2회 반복검증에서 수행되었다. 화학 클로로벤젠은 내부 제어로 인해 세트 둘 다에 포함되었고, 그러므로 전체 5개의 자극을 포함하였다. 또한, 비히클 대조군 DMSO 및 증류수는 각각 13개 및 9개의 반복검증에서 분석되었다. 요약하면, 독립적인 시험 데이터세트는 92개의 어레이를 포함하였다. 미지의 샘플의 가시화된 분류를 수행하는 과정은 방법론을 강조하기 위해 시험 데이터세트를 이용하여 도 3에 순차적으로 예시되어 있다. 초기 단계에서, 예측적 GRPS 게놈 바이오마커 서명을 확인하기 위해 사용된 교사 데이터세트, 즉 일련의 기준 화학물질은 변수 입력으로서 GRPS에서의 389개의 유전자를 사용하여 PCA 공간을 생성하도록 처음에 사용되었다. PCA는 이후 공간에서 고정되고, 시험 데이터세트에서의 화합물의 각각은 이들이 PCA 성분에 영향을 미치지 않게 하면서 이 공간으로 작도된다(도 3A). 도 3B에서 입증된 바대로, 시험 데이터세트에서의 샘플의 진정한 정체의 확인 시, 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 명확한 분리가 교사 데이터 및 시험 데이터 둘 다에 대한 제1 PCA 성분에 따라 보일 수 있고, 이것은 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 GPRS에서의 유전자 발현의 구조에서의 유사성 및 차이가 시험 데이터세트에 또한 존재한다는 것을 나타낸다. 도 3C는 시험 데이터세트가 교사 데이터세트에 의해 생성된 고정된 PCA 공간으로 작도되지만, 이해를 수월하게 하도록 교사 데이터세트가 제거된다는 것을 예시한다. 도면에서 볼 수 있는 것처럼, 호흡 감작인자 및 호흡 비감작인자는 제2 및 제3 주성분에 의해 생성된 초평면에 의해 분리되는 것으로 보이고, 이것은 GRPS가 독립적인 시험 데이터세트에서 이전에 보이지 않은 샘플에서 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 구별을 달성하도록 관련한 정보를 명확히 함유한다는 것을 나타낸다.
SVM 분류 및 GRPS의 예측력
독립적인 시험 데이터세트에서 샘플을 분류하기 위한 연속적인 단계에서, 시각 분류는 지도식 머신 학습을 위해 SVM을 이용하여 2원 분류 모델에 의해 도전되었다. SVM은 GRPS 내에 호흡 감작인자와 호흡 비감작인자 사이의 유전자 발현 구조의 차이를 인식하도록 교사 데이터세트에서 교사되었다. 교사된 SVM 모델은 호흡 감작인자 또는 호흡 비감작인자로서 각각의 개별 반복검증의 수준에서 독립적인 시험 데이터세트에서 각각의 샘플을 분류하도록 적용되었다. SVM으로부터의 출력인, SVM 결정 값은 시험 데이터세트에서 샘플의 진정한 정체와 비교되고, 예측변수의 성능은 도 4에 예시된 결과에 의해 ROC AUC 분석을 이용하여 평가되었다. SVM 분류는 2개의 군을 분리시키는 불편 최대-여유도 초평면을 가지는 선형 커넬, 그러므로, 호흡 감작인자가 0 초과의 SVM 결정 값에 상응하면서, 분류에 대한 한계치에 기초한다. 도면에 도시된 바대로, 개별 자극의 수준에서의 GRPS의 예측변수 성능은 0.97의 ROC 곡선 하 면적으로 예상되었다. 시험 데이터세트에서의 각각의 화학 화합물에 대한 SVM 분류로부터 얻은 결정 값은 표 3(n = 70, 비히클 대조군 배제됨)에 제시되어 있다. 이 표에 제시된 데이터는 도 5에 추가로 요약되어 있다. 도면에서, 샘플은 최고로부터 최저의 SVM 값의 내림 순서로 분류되고, 시험 데이터세트에서의 각각의 화합물에 대한 SVM 결정 값은 GRPS에서의 389개의 전사물의 개별 발현 프로필과 상관되었다. 이해를 수월하게 하도록, 도면에서의 샘플은 감작 능력에 따라 색상표시되고(호흡 감작인자 = 보라색, 호흡 비감작인자 = 어두운 녹색), 분류에 대한 한계치 값은 점선으로 예시된다. 도면에 예시된 바대로, 약간의 중첩이 관찰되지만, 대부분의 호흡 감작인자는 호흡 비감작인자에 배정된 상응하는 값보다 더 높은 SVM 결정 값으로 배정되었고, 이것은 또한 각각의 군 내에 대부분의 화합물 사이의 발현 프로필의 차이와 상관되었다. 각각의 화학물질에 대한 감작 능력에 대한 의사 결정 및 분류를 위해, 본 발명자들은, 이전에 공개된 프로토콜[42]에 의해 결정된 바대로, 임의의 반복검증 자극이 0 초과의 SVM 결정 값을 가지는 경우 시험 데이터세트에서의 임의의 소정의 샘플이 호흡 감작인자로 분류되어야 한다는 것을 기술하는 컷오프를 이용하도록 선택하였다. 이 기준에 기초하여, GRPS의 정확성, 민감도 및 특이성은 각각 84%, 67%, 및 89%로 쿠퍼 통계학을 이용하여 예상되었다.
호흡 감작인자와 연관된 정규 경로 및 GARD 예측 서명
MUTZ-3 세포에서 호흡 화학 감작인자에 의해 개시된 생물학적 반응을 조사하도록 목표하여, Metacore(상표명)에서 기능적 심화 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다. Metacore(상표명)로의 입력으로서 p-값 필터링에 의해 선택된 상위 999개의 유전자를 사용하였다. 999개의 유전자 중에서, Metacore(상표명)는 독특한 식별번호로 948개를 맵핑할 수 있다. 상당히 조절된 경로(p<0.01)는 표 4에 기재되어 있고, 로그(p-값)로 순위화되고, 통계 유의성의 차수로 분류된다. GRPS에 존재하는 유전자는 볼드체로 표시된다. 이 확인되고 상당히 조절된 경로의 절대 다수는 주로 제한된 세트의 분자에 의해 만들어진다. 가장 높게 설명된 경로는 산화적 인산화(26개 분자) 및 유비퀴논 대사(19 분자)를 포함하여서, 산화-환원 과정 및 호흡 전자 전달계 기능과 같은 세포 사건이 연구된 화학물질에 의해 매우 영향을 받는다는 것을 보여준다. 또한, T 세포에서의 저해 PD-1 신호전달, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II에 의한 항원 제시, 기억 CD4+ T 세포의 생성, IL-33 신호전달 경로를 포함하는 덜 상당히 조절된 경로 중 몇몇은 면역학적 관점으로부터 관련 있다. 중요하게는, 이 경로 중 대부분에 대한 중심은 선천성 면역과 후천성 면역 사이의 브릿지, 및 수지상 세포 성숙 및 특이적 T 세포 반응의 활성화를 발생시키는, 외래 물질의 인식에 의해 개시된 선천성 면역 반응의 참여이다. 이 과정의 중요한 양태는 훌륭히 모니터링되고, 항원 제시 연관 분자, 예컨대 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 복합체의 상향조절, 동시자극 분자, 예컨대 CD80 및 CD86의 상향조절, 및 면역 반응을 추진시키는 것을 담당하는 경로의 개시 및 조정을 통해 중요한 플레이어, 예컨대 T 세포와의 누화(cross-talk)를 포함하여, MUTZ-3 세포주에서 상당히 조절된다. 흥미롭게는, 활성화된 경로는 매우 제한된 정도로만 MUTZ-3[54](그랜자임 B 및 그랜자임 A 신호전달)에서의 피부 감작인자에 의해 활성화된 경로와 중첩하고, 이것은 호흡 감작인자 및 피부 감작인자가 상이한 신호전달 경로의 참여에 관여된다는 것을 나타낸다.
결론
다양한 화학물질은 피부 및 호흡기 둘 다에서 알레르기 초감작 반응을 유도할 수 있어서, 결국 알레르기성 접촉 피부염(ACD) 또는 직업성 천식(OA)의 임상 증상을 생성한다. 호흡 감작을 유도할 수 있는 화학물질의 수가 피부 감작을 야기하는 것과 비교하여 훨씬 더 적지만, 호흡 화학 감작인자의 확인 및 위험 분류는 후천성 OA와 연관된 건강 및 삶의 질에 대한 심각한 영향으로 인해 가장 중요한 영역으로 남아 있다. 호흡 감작인자를 정확히 확인하는 신뢰할만한 검정의 개발, 및 피부 감작인자로부터 이것을 구별하는 것은 도전적인 것으로 입증되었다. 이전의 연구에서, 본 발명자들은 피부 감작 화학물질의 확인 및 위험 평가를 위한 동물 시험에 대한 시험관내 대안으로서 게놈 알레르겐 신속 검출(GARD) 검정의 개발 및 적용을 기술하였다. GARD 검정에서, 미지의 시험 화학물질은, 게놈 방식 전사 프로파일링에 의해 측정된, 선결정된 게놈 바이오마커 서명으로부터의 판독에 기초하여 분류된다. 완전한 전사체를 분석하는 것을 수반한 높은 융통성을 이용하여, 본 발명자들은 대안적인 게놈 바이오마커 서명의 확인을 통해 호흡 감작인자의 위험 분류를 또한 다루도록 GARD의 적용범위 도메인이 확대될 수 있다는 것을 가설하였다.
현재의 연구에서, 본 발명자들은, GARD 호흡 예측 서명(GRPS)이라 칭하는, 상이한 바이오마커 서명을 이용한 호흡 감작 화학물질의 분류를 허용하는 GARD의 추가의 개발을 제시한다. 한정된 GRPS의 의도된 용도는 따라서 신규한 조합된 시험관내 검정에 있을 것이고, 여기서 MUTZ-3 세포는 분류되는 미지의 화합물에 의해 자극된다. 흥미롭게도, 2개의 구별되는 바이오마커 서명을 이용하여, 화합물은 피부 감작인자, 호흡 감작인자 또는 비감작인자로 분류될 수 있다. 호흡 감작 및 피부 감작 둘 다를 유도할 수 있는 화학물질은 구체적으로 이렇게 또한 분류될 것이다.
호흡 감작인자 또는 호흡 비감작인자인 것으로 알려진 일련의 기준 화학물질을 이용하여 GRPS를 확인하였다. 이 2개의 군에서의 상이하게 조절된 유전자는 이후 ANOVA p-값 필터링에 의해 확인되었고, 후진 제거를 위한 인하우스 개발된 래퍼 알고리즘을 이용하여 추가로 최적화되었다. 본 발명자들은 GRPS에서의 389개의 유전자가 호흡 감작 화학물질과 호흡 감작 화학물질을 구별하기 위해 게놈 바이오마커 서명으로서 작용할 수 있다는 것을 제안한다. GRPS의 예측력의 평가는 호흡 감작인자의 확립을 위한 게놈 바이오마커 서명의 신뢰성을 확립하기 위해 중요하다. 이 연구에서, 본 발명자들은 지도식 머신 학습을 위해 지지 벡터 머신(SVM) 알고리즘을 이용하였다. 본 발명자들은 확인된 GRPS 게놈 바이오마커 서명에서의 유전자 발현 데이터에서의 구조 및 유사성을 인식하도록 모델을 교사하고, 모델에 의해 이전에 보이지 않은 화학물질을 포함하는 독립적인 시험 세트에 의해 모델을 도전시켰다. 후속하여, 본 발명자들은 보이지 않은 화학 화합물을 호흡 감작인자 또는 호흡 비감작인자로 2원 분류하는 모델을 이용하였다. 이 활동을 수행하여, 본 발명자들은 정확한 예측을 달성하기 위한 GRPS의 가능성을 입증하였다. 0.97의 ROC 곡선 하 면적 및 각각 67%, 89% 및 84%의 민감도, 특이성 및 정확성을 달성하는, ROC AUC 분석 및 쿠퍼 통계학을 이용하여, GRPS의 예측력을 예상하였다. 이것은 호흡 감작을 유도하는 화학물질의 위험 분류를 위한 가장 높은 보고된 정확성이다.
현재까지, 본 발명자들은 예측에서 피부 감작인자에 대한 GPS와 동일한 높은 민감도에 도달하지 않는지에 대한 가능한 설명을 추측할 수 있을 뿐이다[46]. 이것은 부분적으로 GPS와의 비교 시 검정 개발 동안 사용된 GRPS의 더 적은 수의 기준 화합물로 인할 수 있지만, 또 다른 가능한 설명은 아마도 분자 수준에서 발견될 수 있고, 즉 피부 감작인자는 MUTZ-3 세포에서 유전자 발현의 더 강력한 조절물질이다. 무관하게, 분류에 대한 판독으로서 전체 게놈 어레이의 사용은 여전히 GRPS가 더 융통성 있게 만든다. 더 많은 샘플이 분석되면서, 민감도, 특이성 및 정확성을 개선하고 구입 가능한 화학 화합물의 다양성을 반영하기 위해 방법론을 미세 조율하기 위해 검정으로 추가적인 정보가 용이하게 실행될 수 있다.
MUTZ-3에 대한 과민반응 화학물질의 생물학적 효과를 추가로 조사하기 위해, 심화 분석을 수행하였다. 데이터에서의 충분한 유의성을 획득하기 위해, GRPS의 상위 389개의 유전자가 아니라 p-값 필터링으로부터의 상위 999개의 유전자를 Metacore(상표명) 소프트웨어에서 입력으로서 사용하였다. 의심 없이, 호흡 감작인자에 의해 개시된 매우 높게 설명된 경로가 세포 사건, 예컨대 산화-환원 과정 및 호흡 전자 전달계에 관여된다(표 4 참조). 이 분자는 p-값 필터링 절차로부터 상위 유전자 중에 있고, GRPS 서명에 존재하지 않는다. 이와 관련하여, 전사물의 생물학적 관련성을 기술하는 데 목표하는 경우에 기능과 독립적인 샘플의 정확한 분류를 수행하는 데 목표하는 경우에 GRPS 예측 프로필 사이를 구별하는 것이 중요하다. 산화적 인산화 및 유비퀴논 대사 경로에 관여한 분자 중 몇몇은 단백질 복합체의 아단위이고, 따라서 공간상 일시적으로 연결된다. 이 연구에서 피쳐 선택 동안 적용된 후진 제거 절차는 변수의 직각 선택에 기초하고, 따라서 직각 정보에 기여하지 않는 피쳐는 이 과정 동안 제거되었다. 따라서, 분자 복합체에서의 예를 들어 아단위가 유사한 발현 패턴을 가질 것이므로, 상당히 조절된 경로 중 일부는 GRPS 서명으로부터 전사물을 함유하지 않거나 오직 적은 수의 전사물을 함유한다는 것은 놀랍지 않고, 오히려 예상되었다. 덜 활성인 경로 중 몇몇에 기초하여, 화학 호흡 알레르겐에 대한 MUTZ-3에서의 생물학적 반응은 궁극적으로 세포 성숙을 발생시켜, 증대된 항원 제시 및 다른 면역 세포와의 상호작용을 발생시키는 선천성 면역 반응 신호전달 경로의 조절을 또한 수반한다. 더욱이, 단백질 알레르겐에 대한 호흡 감작과 이전에 연관된 신호전달 경로의 사용의 신규한 발견은 화학 알레르겐에 반응하여 호흡기의 과민반응을 발생시키는 생물학적 과정을 해명할 것이다. 따라서, GRPS는 실제로 면역학적으로 기계론적 관점과 관련되고, 호흡 감작을 발생시키는 생물학적 사건을 모니터링하는 전사물의 측정을 제공한다.
추가로, GARD 검정에 제시된 결과와 함께 심화 분석로부터의 결과는 MUTZ-3이 피부 감작인자 및 호흡 감작인자 둘 다의 예측을 위한 적합한 모델이라는 것을 나타낸다. 면역생물학적 기전에서의 약간의 유사성에도 불구하고, 피부 감작과 호흡 감작 사이에 중요한 기계론적 차이가 존재한다. 피부 감작은 주로 Th1 세포의 유도와 연관되어, 세포독성 CD8+ T 세포 반응 및 IL-2 및 인터페론(IFN)-γ의 분비를 촉진하지만, 호흡 감작은 일반적으로 CD4+ Th2 세포를 포함하고 높은 수준의 IL-4, IL-10 및 IL-13을 특징으로 한다. 단백질 항원에 대한 호흡 감작이 특이적 IgE 항체의 생성에 의해 추진되지만, 화학 알레르겐에 대한 호흡 알레르기의 전개 동안 IgE 항체가 어떠한 역할을 가지는지, 및 호흡 감작이 IgE 항체 생성과 독립적으로 달성될 수 있는 기전이 있는지에 대해 여전히 불투명하다[55,56]. IgE의 필요 없이, 호흡 감작의 전개를 지지하기 위해 이것이 유도된 Th2 반응에 의해 충분할 수 있다는 것이 제안된다[57]. T 세포 반응에서의 명확한 차이에도 불구하고, 수지상 세포(DC)의 활성화는 피부 감작 및 호흡 감작 둘 다에 흔하다. 결과적으로, DC는 생체이물 화합물에 반응하여 면역 반응의 개시, 조절 및 분극화 동안의 이의 생리학적 역할로 인해 피부 감작 및 호흡 감작 둘 다의 면에서 검정 개발에 대한 천연 표적이다. MUTZ-3 세포주는 발현 프로필 및 특이적 T 세포 반응을 활성화하는 능력의 면에서 1차 수지상 세포(DC)를 닮았다[45]. 1차 DC와 비교하여, MUTZ-3은 표준화 프로토콜을 이용하여 성장하기 쉽고, 지속 가능한 세포 공급원을 제공하여, 검정을 고출력 포맷으로 규모확장하는 기회를 제공한다.
피부 감작 및 호흡 감작 둘 다에 대한 검정의 전개의 맥락에서, 명명법 뒤에 공식적인 의미론을 인정하는 것이 중요하다. 다른 것[24,58-60]과 비슷하게, 본 발명자들은 이 연구에서 초기 노출의 경로가 아니고 면역학적 반응의 국소 부위를 나타내도록 전문용어를 사용한다. 예를 들어, 호흡기의 과민반응이 관련 화학물질에 대한 피부 노출 후 또한 발생할 수 있는 것으로 나타났다[61-63]. 일반적으로, 소정의 화학 화합물은 피부 또는 호흡기 중 어느 하나를 선택적으로 과민반응시킨다. 그러나, 소정의 상황 동안 면역학적 감수성 개인에서, 여러 화학물질은 과민반응의 유형 둘 다를 발생시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 화학물질 트라이글라이시딜아이소사이아네이트(TGIC)는 OA 및 ACD 둘 다를 발생시키는 것으로 나타났다[64].
마지막으로, GARD 검정의 접근법은 다른 대안적인 방법과 비교하여 여러 이점을 가진다. 본 발명자들의 데이터 추진 방법론을 이용하여, 본 발명자들은 호흡 감작인자가 감수성 개인에서 면역학적 반응을 어떻게 유발하는지에 의해 정확한 기전에 관한 지식에서의 현재의 단점과 연관된 문제점을 피할 수 있었다. 둘째로, 전사체 방식 접근법에 의해 얻어진 다량의 정보는 호흡 감작의 과정에 관여되는 특정한 신호전달 또는 대사 경로와 같은 분자 기전을 설명할 추가적인 기회를 제공한다.
이 연구의 주요 목적은 호흡 감작의 예측에 대한 동물 실험의 감소, 강화 및 대체에 대한 3개의 R 원칙에 따라 시험관내 방법을 개발하는 것이다. 일련의 기준 화학물질을 가지는 교사 모델을 가지면서, 본 발명자들은 미지의 화학물질이 호흡 비감작인자 또는 호흡 감작인자로서 행동할 것인지를 결정하기 위한 도구를 제시한다. 미래에, 화학물질이 호흡기에서 과민반응을 어떻게 야기하는지의 현재의 지식에서의 갭이 계속해서 채워지면서, 피부 감작을 위한 불리한 결과 경로(Adverse Outcome Pathway: AOP)의 형성과 유사한 합의[67]는 또한 호흡 감작인자의 시험을 위한 현실일 수 있다. GRPS는 이후 DC 성숙의 평가에 유용한 통합 시험 전략(Integrated Testing Strategy: ITS)의 매력적인 부분일 것이다.
결론으로, 이 연구는 피부 감작인자의 평가를 위한 이전에 기재된 GARD 검정을 보완하는 MUTZ-3 세포에서의 호흡 화학 감작인자의 분류를 위한 예측 바이오마커 서명을 제시한다. 동일한 샘플에서의 2개의 상이한 종점을 시험하는 능력은 동물 실험의 감소, 강화 및 대체에 대한 3개의 R 원칙에 부합하는 시험관내 시험 전략에서 화학물질의 안정성 평가를 위한 매력적이고 지금까지 독특한 검정을 제공한다.
참고문헌
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Claims (81)

  1. 포유류에서 호흡 감작(respiratory sensitization)을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법으로서,
    a) 수지상 세포의 집단 또는 수지상 유사 세포의 집단을 시험 물질에 노출시키는 단계; 및
    b) 상기 세포에서 표 A(i) 및/또는 표 A(ii)에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나, 이들 단계로 이루어지고,
    상기 세포에서의 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 물질의 호흡 감작 효과를 나타내는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    c) 포유류에서 상기 수지상 세포 또는 수지상 유사 세포의 별개의 집단을 호흡 감작인자(respiratory sensitizer)가 아닌 하나 이상의 음성 대조군 물질에 노출시키는 단계; 및
    d) 상기 세포에서 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 시험 물질은, 단계 (d)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 대조군 샘플에서의 존재 및/또는 양과 다른 경우에, 호흡 감작인자로서 확인되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    e) 포유류에서 상기 수지상 세포 또는 수지상 유사 세포의 별개의 집단을 호흡 감작인자인 하나 이상의 양성 대조군 물질에 노출시키는 단계; 및
    f) 상기 세포에서 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 시험 물질은, 단계 (f)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 시험 샘플에서의 존재 및/또는 양이 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 양성 대조군 샘플에서의 존재 및/또는 양에 상응하는 경우에, 호흡 감작인자로서 확인되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 A(ii)에 정의된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어 표 1A에 정의된 바이오마커 중 적어도 2개 또는 3개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 TNFRSF19의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 SNORA74A의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 SPAM1의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 TNFRSF19, SNORA74A 및 SPAM1의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 단계 (b)에서 표 A(ii)에 정의된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어 표 A(ii)에 정의된 바이오마커 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 163개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 192개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개, 201개, 202개, 203개, 204개, 205개, 206개, 207개, 208개, 209개, 210개, 211개, 212개, 213개, 214개, 215개, 216개, 217개, 218개, 219개, 220개, 221개, 222개, 223개, 224개, 225개, 226개, 227개, 228개, 229개, 230개, 231개, 232개, 233개, 234개, 235개, 236개, 237개, 238개, 239개, 240개, 241개, 242개, 243개, 244개, 245개, 246개, 247개, 248개, 249개, 250개, 251개, 252개, 253개, 254개, 255개, 256개, 257개, 258개, 259개, 260개, 261개, 262개, 263개, 264개, 265개, 266개, 267개, 268개, 269개, 270개, 271개, 272개, 273개, 274개, 275개, 276개, 277개, 278개, 279개, 280개, 281개, 282개, 283개, 284개, 285개, 286개, 287개, 288개, 289개, 290개, 291개, 292개, 293개, 294개, 295개, 296개, 297개, 298개, 299개, 300개, 301개, 302개, 303개, 304개, 305개, 306개, 307개, 308개, 309개, 310개, 311개, 312개, 313개, 314개, 315개, 316개, 317개, 318개, 319개, 320개, 321개, 322개, 323개, 324개, 325개, 326개, 327개, 328개, 329개, 330개, 331개, 332개, 333개, 334개, 335개, 336개, 337개, 338개, 339개, 340개, 341개 또는 342개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 A(ii)에 정의된 상기 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 A(iii)에 정의된 1개 이상의 바이오마커, 예를 들어 표 A(iii)에 정의된 바이오마커 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개 또는 44개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 A(iii)에 정의된 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 A에 정의된 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 상기 하나 이상의 바이오마커(들)를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA 분자인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA 분자인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계는 써던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사효소 PCR(reverse transcriptase PCR: RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR: qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 방사선자동사진법(autoradiography) 및 동일계내 혼성화로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 수행되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계는 DNA 마이크로어레이를 사용하여 결정되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되고, 각각은 표 A에서 확인된 바이오마커 중 하나를 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이들로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  23. 제20항 또는 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  24. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 5개 내지 100개 길이의 뉴클레오타이드인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  25. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 15개 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  26. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티; 발광성 모이어티; 화학발광성 모이어티; 방사성 모이어티(예를 들어, 방사성 원자); 또는 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 검출 가능한 모이어티는 방사성 원자를 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방사성 원자는 테크네튬-99m, 아이오딘-123, 아이오딘-125, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  31. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 단계 (b)에 정의된 상기 하나 이상의 바이오마커의 단백질의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계는 각각 표 A에서 확인된 바이오마커 중 하나에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나 이것으로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 단일클론 항체 또는 이의 단편인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 무손상 항체, Fv 단편(예를 들어, 단쇄 Fv 및 다이설파이드 결합 Fv), Fab 유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 포맷 및 이중 포맷[즉, dAb-링커-dAb]을 포함하는 dAb)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 단쇄 Fv(scFv)인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  37. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 유사 결합제, 예를 들어 아피바디(affibody) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하거나 이들로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티, 발광성 모이어티, 화학발광성 모이어티, 방사성 모이어티 및 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 어레이를 사용하여 수행되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 어레이는 비드 기반 어레이인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 어레이는 표면 기반 어레이인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이는 제20항 내지 제30항 및 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 제1 결합제를 포함하는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 총체적으로 표 1에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있는 결합제를 포함하는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 제1 결합제는 부동화된, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡 초감작 반응(respiratory hypersensitivity response)을 유도할 수 있는 물질을 확인하기 위한, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초감작 반응은 체액 초감작 반응인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 초감작 반응은 I형 초감작 반응인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡 알레르기를 유도할 수 있는 물질을 확인하기 위한, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지상 세포의 집단 또는 수지상 유사 세포의 집단은 수지상 유사 세포의 집단인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 수지상 유사 세포는 골수성 수지상 유사 세포인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 골수성 수지상 유사 세포는 골수성 수지상 세포로부터 유래한, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 골수성 수지상 세포로부터 유래한 세포는 골수성 백혈병 유래 세포인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 골수성 백혈병 유래 세포는 KG-1, THP-1, U-937, HL-60, 모노막(Monomac)-6, AML-193 및 MUTZ-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지상 유사 세포는 MUTZ-3 세포인, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  57. 제2항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 제공된 상기 하나 이상의 음성 대조군 물질은 1-뷰탄올; 2-아미노페놀; 2-하이드록시에틸 아크릴레이트; 2-나이트로-1,4-페닐렌다이아민; 4-아미노벤조산; 클로로벤젠; 다이메틸 폼아마이드; 에틸 바닐린; 폼알데하이드; 게라니올; 헥실신남산 알데하이드; 아이소프로판올; 카톤(Kathon) CG*; 메틸 살리실레이트; 페니실린 G; 프로필렌 글라이콜; 중크롬산칼륨; 과망간칼륨; Tween 80; 및 황산아연으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 적어도 2개의 대조군 비감작 물질, 예를 들어 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 적어도 20개의 대조군 비감작 물질이 제공되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  59. 제3항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)에서 제공된 상기 하나 이상의 양성 대조군 물질은 암모늄 헥사클로로플라티네이트, 과황산암모늄, 글루타르알데하이드, 헥사메틸렌 다이아이소사이아네이트, 말레산 무수물, 메틸렌 다이페놀 다이아이소사이아네이트, 프탈산 무수물, 톨루엔다이아이소사이아네이트 및 트라이멜리트산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하거나 이들로 이루어진, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 적어도 2개의 대조군 감작 물질, 예를 들어 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 적어도 10개의 대조군 감작 물질이 제공되는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시험하고자 하는 상기 샘플의 감작 효력을 나타내는, 포유류에서 호흡 감작을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 어레이로서, 상기 어레이는 제20항 내지 제30항 및 제32 내지 제39항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는, 어레이.
  63. 제62항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 표 A(i)에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있는, 어레이.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 표 A(ii)에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있는, 어레이.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 표 A(iii)에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있는, 어레이.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 표 A에 정의된 모든 바이오마커에 결합할 수 있는, 어레이.
  67. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 부동화된, 어레이.
  68. 호흡 초감작 반응 감작 물질을 확인하기 위한, 조합된 표 A에 정의된 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커의 용도.
  69. 제68항에 있어서, 표 A에 정의된 모든 바이오마커는 초감작 반응 감작 물질을 확인하기 위해 총체적으로 사용되는, 용도.
  70. 호흡 초감작 반응 감작 물질을 확인하기 위한, 제20항 내지 제30항 및 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티의 용도.
  71. 제70항에 있어서, 표 A에 정의된 모든 바이오마커는 초감작 반응 감작 물질을 확인하기 위해 총체적으로 사용되는, 용도.
  72. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 분석 키트로서,
    A) 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 어레이 및/또는 제20항 내지 제30항 및 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티; 및
    B) 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서(임의)를 포함하는, 분석 키트.
  73. 제72항에 있어서, 하나 이상의 대조군 샘플을 추가로 포함하는, 분석 키트.
  74. 제73항에 있어서, 하나 이상의 비감작 물질(들)을 포함하는, 분석 키트.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 감작 물질(들)을 포함하는, 분석 키트.
  76. 환자에서 호흡 I형 초감작 반응(예컨대, 호흡 천식)을 치료하거나 예방하는 방법으로서,
    (a) 상기 환자가 노출되거나 노출되었던 하나 이상의 시험 물질을 제공하는 단계;
    (b) 본 발명의 제1 양태에 제공된 방법을 이용하여 단계 (a)에서 제공된 상기 하나 이상의 시험 물질이 호흡 감작인자인지를 결정하는 단계; 및
    (c) 상기 하나 이상의 시험 물질이 호흡 감작인자로서 확인된 경우, 호흡 감작인자로서 확인된 하나 이상의 시험 물질에 대한 상기 환자의 노출을 감소시키거나 예방하고/하거나, 감작의 증상에 대한 적절한 치료를 제공하는 단계를 포함하는, 환자에서 호흡 I형 초감작 반응(예컨대, 호흡 천식)을 치료하거나 예방하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 감작의 증상의 치료는 단기작용 베타2-아드레날린수용체 작용제(short-acting beta2-adrenoceptor agonist: SABA), 예컨대 살부타몰; 항콜린성 약제, 예컨대 이프라트로피움 브로마이드; 다른 아드레날린 작용제(adrenergic agonist), 예컨대 흡입성 에피네프린; 코티코스테로이드, 예컨대 베클로메타손; 장기작용 베타-아드레날린수용체 작용제(long-acting beta-adrenoceptor agonist: LABA), 예컨대 살메테롤 및 포르모테롤; 류코트리엔 길항제, 예컨대 몬테루카스트 및 자피르루카스트; 및/또는 비만 세포 안정화제(예컨대, 크로몰린 나트륨)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 환자에서 호흡 I형 초감작 반응(예컨대, 호흡 천식)을 치료하거나 예방하는 방법.
  78. 본 발명의 제1 양태에 정의된 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램.
  79. 제78항에 있어서, 상기 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 판독 가능한 매체에 기록된, 컴퓨터 프로그램.
  80. 본 명세서에 실질적으로 기재된 바와 같은 방법 또는 용도.
  81. 본 명세서에 실질적으로 기재된 바와 같은 어레이, 키트 또는 컴퓨터 프로그램.
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