JP6031221B2

JP6031221B2 - 皮膚感作性物質の評価方法

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Publication number: JP6031221B2
Application number: JP2011045061A
Authority: JP
Inventors: 祐子額田; 宮澤　正明; 正明宮澤; 斉坂口
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2016-11-24
Anticipated expiration: 2031-03-02
Also published as: JP2012179020A

Description

本発明は、物質の皮膚感作性をインビトロで評価する方法に関する。

皮膚感作とは、原因となる物質が皮膚に接触し、皮膚中に浸透することにより起こる免疫反応である。皮膚感作のメカニズムは大きく２つの過程に分けられ、最初の過程が「感作誘導過程」、後の過程が「感作誘発過程」と呼ばれている（図１）。感作誘導過程は、皮膚に最初に感作性物質が接触したときに生じる。ここでは、皮膚に接触された感作性物質は、経皮吸収され、タンパク質と結合して抗原を形成した後、表皮のケラチノサイトを活性化するとともに、ランゲルハンス細胞（Langerhans cell：ＬＣ）に認識されてこれを活性化する。活性化したＬＣはリンパ節に移動し、Ｔリンパ球に抗原を提示し、該感作性物質に特異的に応答するＴリンパ球が増殖する。この皮膚に、再び同じ感作性物質が接触したとき、感作誘発過程が生じる。ここでは、抗原は既に記憶されているため、既に増殖していた特異的なＴリンパ球が直ちに応答し、炎症性サイトカインの放出などを経て、紅斑、浮腫等の炎症反応が起こる。

「化学品の分類および表示に関する世界調和システム」（The Globally Harmonized System for Classification and Labeling of Chemicals：ＧＨＳ）によれば、「皮膚感作性物質」とは「皮膚への接触によりアレルギー反応を誘発する物質」と定義され、相当数のヒトに皮膚接触により過敏症を誘発し得る物質、あるいは動物試験により陽性結果が得られている物質は「皮膚感作性物質」として分類される。

医薬、化粧料や各種化学物質等の皮膚感作性を試験することは、人体の安全のために重要である。従来、化学物質の皮膚感作性は主にマウスやモルモットの生体を用いてインビボで評価されてきた。しかし、近年の動物愛護への関心の高まりや、「ＥＵ化粧品指令第７次改正」を受け、動物を用いない試験法（動物実験代替法）の開発が喫緊な課題となっている。

動物の生体を用いない皮膚感作性試験法を確立するためには、皮膚感作過程をインビトロで再現することが重要である。しかし、皮膚感作過程をインビトロで完全に再現することは難しく、特に感作誘導過程の再構築は困難である。そのため、感作誘導過程の中から、鍵となるプロセスに焦点を当てて皮膚感作性物質を評価する方法が開発されている。このような方法としては、物質のタンパクとの結合プロセスを調べるPeptide reactivity assay (PRA)（P&G社）及びLC-MS Assay（Givaudan）；ならびにケラチノサイト活性化や樹状細胞活性化プロセスを調べるKeratinoSens（Givaudan）、SenCeeTox（CEETOX）、h-CLAT（資生堂&花王）、MUSST（L'Oreal）が知られている。

培養細胞を用いて感作性物質曝露に対する遺伝子発現の変化を調べた報告がある。例えば、非特許文献１では、ＭＣＦ−７細胞由来の培養細胞株ＡＲＥｃ３２において転写調節領域ＡＲＥ（antioxidant response element）と結合させたレポーター遺伝子の発現を調べることで、感作性物質曝露後の細胞の遺伝子発現を調べている。非特許文献２〜３ではマイクロアレイ法を用いて、単球様細胞株ＴＨＰ−１において感作性物質曝露後に遺伝子発現が変化し得ることを報告している。非特許文献４では、培養表皮細胞を用いて感作物質曝露後の遺伝子発現を調べている。

しかし、表皮由来の細胞を用いていない系では、インビボでの皮膚感作過程が充分に再現されない可能性がある。さらに、上記の系で用いられている細胞は、いずれも単層（２Ｄ）培養細胞であるため、インビボの皮膚感作過程のモデルとしては不十分である。生体の皮膚は多層構造を有している一方、単層培養ではこの構造を構築できないので、実際の生体の表皮の感作応答を充分に再現できていない可能性があるからである。さらに、２Ｄ培養細胞を物質に曝露するためには当該物質を培地に溶解させなければならないため、感作源を低濃度でしか含有していない組成物の感作性を２Ｄ培養細胞で調べるためには、当該組成物を培地に大量に溶解させなければならない。しかし、そのような大量添加は細胞毒性をもたらす可能性がある。また、培地に溶解しない難溶又は不溶性物質は２Ｄ培養細胞では評価することはできないという問題があった。

あらゆる物質の皮膚感作性試験に適用でき、且つインビボ皮膚感作過程をより正確に再現することができるインビトロ皮膚感作性試験法が所望されている。

Natsch and Emter, Toxicol Sci, 2008, 102(1):110-119 Verstraelen et al, Toxicology in Vitro, 2008, 22:1107-1114 Hirota and Moro, Toxicology in Vitro, 2006、20：736-742 Yoshikawa et al, J Biochem Mol Toxicol, 2010, 24(1):10-20

本発明は、３次元培養皮膚中の遺伝子発現を指標に物質の皮膚感作性をインビトロで評価する方法に関する。

本発明者らは、生体の皮膚における物質の皮膚感作性をインビボ試験と同様に精度良く評価することができるインビトロモデルの開発を試みた結果、３次元培養皮膚細胞における特定の遺伝子の発現を指標とすることによって、動物試験の代替法となり得る高精度な物質の皮膚感作性評価試験が可能となることを見出した。

すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）３次元培養皮膚細胞を被験物質に曝露する工程；
該細胞におけるＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＳＲＸＮ１及びＤＮＡＪＡ４、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現を測定する工程；及び
測定された該発現に基づいて該被験物質の皮膚感作性を評価する工程、
を含む物質の皮膚感作性の評価方法。
（２）ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４及びＨＳＰＡ６、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現が測定される、（１）記載の方法。
（３）ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４及びＨＳＰＡ６、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも２の発現が測定される、（２）記載の方法。
（４）上記測定された上記発現に基づいて上記被験物質の皮膚感作性を評価する工程が、該測定された該発現のレベルを該被験物質への曝露後と対照物質への曝露後との間で比較して、該被験物質への曝露後の発現レベルが高い場合に該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）上記測定された上記発現に基づいて上記被験物質の皮膚感作性を評価する工程が、該測定された該発現のレベルを該被験物質への曝露前後で比較して、該被験物質への曝露後の発現レベルが高い場合に該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（６）上記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して２倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、（４）又は（５）記載の方法。
（７）上記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して３倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、（４）又は（５）記載の方法。
（８）上記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して５倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、（４）又は（５）記載の方法。
（９）上記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して１０倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、（４）又は（５）記載の方法。
（１０）上記３次元培養皮膚細胞が３次元培養表皮細胞である、（１）〜（９）のいずれか１に記載の方法。
（１１）上記３次元培養皮膚細胞が３次元培養ヒト由来表皮細胞である、（１）〜（９）のいずれか１に記載の方法。
（１２）測定される発現がｍＲＮＡ発現である、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の方法。

本発明によれば、高精度且つ動物試験の代替法となり得る、物質の皮膚感作性評価のためのインビトロ試験方法を提供することができる。

皮膚感作過程の概要。３次元培養表皮細胞における被験物質曝露による遺伝子発現変化。３次元培養表皮細胞における被験物質曝露による遺伝子発現変化。

本明細書において、「皮膚感作性物質」（skin sensitizer）とは、「化学品の分類および表示に関する世界調和システム」（The Globally Harmonized System for Classification and Labeling of Chemicals：ＧＨＳ）に準拠して定義され、すなわち「皮膚への接触によりアレルギー反応を誘発する物質」をいう。
すなわち、本明細書において、「皮膚感作性」（skin sensitization）とは、皮膚との接触によりその皮膚に炎症やアレルギー等の過剰な免疫応答を誘発し得る性質をいう。
本明細書において、「皮膚感作性物質」及び「皮膚感作性」は、「接触感作性物質」（contact sensitizer）及び「接触感作性」（contact sensitization）とそれぞれ同義に使用され得る。

本明細書において、ＡＴＦ３(Activating transcription factor 3)、ＧＣＬＭ(Glutamate-cysteine ligase, modifier subunit)、ＤＮＡＪＢ４(DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 4)、ＨＳＰＡ６(Heat-shock 70-kD Protein 6)、ＨＳＰＡ１Ａ(Heat-shock 70-kD Protein 1A)、ＨＳＰＨ１(Heat-shock 105/110 kD Protein 1)、ＺＦＡＮＤ２Ａ(Zinc finger, AN-1type, domain-containing protein 2A)、ＳＲＸＮ１(Sulfiredoxin 1)、及びＤＮＡＪＡ４(DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 4)は、それぞれＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のヌクレオチドデータベース［http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/］にそのｍＲＮＡの配列が登録されているタンパク質である。［登録番号］ＡＴＦ３：NM_001030287、NM_001040619、NM_001674、ＧＣＬＭ：NM_002061、ＤＮＡＪＢ４：NM_007034、ＨＳＰＡ６：NM_002155、ＨＳＰＡ１Ａ：NM_005345、ＨＳＰＨ１：NM_006644、ＺＦＡＮＤ２Ａ：NM_182491、ＳＲＸＮ１：NM_080725、及びＤＮＡＪＡ４：NM_001130182。また、ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１及びＺＦＡＮＤ２Ａは、は、それぞれＮＣＢＩのヒトのメンデル遺伝データベースＯＭＩＭ（Online Mendelian Inheritance in Man）[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/]に登録されているタンパク質である。［登録番号］ＡＴＦ３：MIM ID *603148、ＧＣＬＭ：MIM ID +601176、ＤＮＡＪＢ４：MIM ID *611327、ＨＳＰＡ６：MIM ID *140555、ＨＳＰＡ１Ａ：MIM ID *140550、ＨＳＰＨ１：MIM ID *610703、ＺＦＡＮＤ２Ａ：MIM ID *610699。
ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１、ＤＮＡＪＡ４は熱ショックタンパク質で分子シャペロンとして機能する。ＧＣＬＭはグルタチオン生合成に関与する。ＺＦＡＮＤ２Ａは転写因子である。ＳＲＸＮ１はペルオキシレドキシンの活性化を解して抗酸化反応に関与している。

本発明は、物質の皮膚感作性の評価方法を提供する。本発明の方法は、３次元培養皮膚細胞を被験物質に曝露する工程；該細胞におけるＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＳＲＸＮ１及びＤＮＡＪＡ４、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現を測定する工程；及び、測定された該発現に基づいて該被験物質の皮膚感作性を評価する工程、を包含する。

本発明の方法で用いられる３次元培養皮膚細胞とは、好ましくは３次元培養表皮細胞であり、より好ましくは３次元培養ヒト由来表皮細胞である。このような３次元培養皮膚細胞は、培養系を構築してもよいが、市販されているものを購入することもできる。市販の３次元培養皮膚細胞の例としては、EpiDerm^TM（MatTek Corporation社製）、EpiSkin（SkinEthic社製）、RHE（SkinEthic社製）、Labcyteエピモデル（J-TEC社製）等が挙げられる。３次元培養皮膚細胞の構築は、例えば、特開2000-201695や特開2005-13717に記載の方法に従って、コラーゲンゲルに包埋した繊維芽細胞と表皮細胞とを共培養することや、Ponecらの方法(J Invest Dermatol 109:348-355,1997)に従って、表皮細胞を気液界面培養することによって行うことができる。また、本発明の方法で用いられる３次元培養皮膚細胞は、分化した表皮細胞を含むものであればよいが、角層を含むものが好ましく、基底層、有棘層、顆粒層及び角層を含むものがより好ましい。

本発明の方法に用いられる被験物質としては、特に制限されず、任意の動物、植物、又は微生物に由来する化合物；合成化合物；ならびにそれらの混合物及びそれらを含む組成物等が挙げられる。被験物質の形態も特に制限されず、固体、半固形、ゲル、液体、気体等いずれの形態であってもよいが、液体が好ましい。

上記３次元培養皮膚細胞を被験物質に曝露する手段としては、当該分野で公知の手段であればよく、例えば、当該被験物質の細胞培養培地への添加、または細胞への直接的な添加（例えば、滴下、塗布、散布、噴霧、パッチ等）が挙げられる。被験物質の濃度及び曝露量は、被験物質の形態、化学的性質、細胞毒性、予想される皮膚感作性の強度等に基づいて適宜設定すればよい。好ましくは、適当な濃度に希釈した被験物質の所定量を、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で６時間、該細胞に適用する。具体的には、３次元培養皮膚の気層表面に形成された角層部に被験物質を滴下することにより曝露する。単位面積当たりの曝露量は１０〜４０μＬ／０．６ｃｍ²がより好ましい。また適用する被験物質を溶解させる際の溶媒としては、アセトンとオリーブ油の混合物（比率は３：１が好ましい）、エタノール、水などが好ましい。

本発明の方法においては、上記３次元培養皮膚細胞におけるＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＳＲＸＮ１及びＤＮＡＪＡ４、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現が測定される。発現は、上記タンパク質及びそれらをコードする遺伝子うちのいずれか１について測定すればよいが、複数（例えば任意の２つ、３つ、４つ、若しくは５つ以上）について測定してもよい。タンパク質発現と遺伝子発現を組み合わせて測定してもよいが、その場合、同じ種類のタンパク質と遺伝子との組み合わせ（例えば、ＡＴＦ３タンパク質とＡＴＦ３遺伝子との組み合わせ）ではなく、異なる種類のタンパク質と遺伝子の組み合わせが好ましい。本発明の方法においては、ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４及びＨＳＰＡ６、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現を測定するのが好ましく、これらのうち二つ以上を含む組み合わせがより好ましい。

ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＳＲＸＮ１及びＤＮＡＪＡ４、ならびにそれらをコードする遺伝子の発現は、当該タンパク質の発現、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現、又は当該遺伝子のプロモーターの活性化等を指標として測定することができる。
測定は、指標とするパラメータ（例えば、タンパク質発現、遺伝子又はｍＲＮＡ発現、プロモーター活性化等）の測定方法として当該分野で公知の方法に従って行えばよい。例えば、遺伝子又はｍＲＮＡ発現の測定方法としては、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、レポーター遺伝子を用いたプロモーター活性や転写活性の蛍光・光学的測定（レポーターアッセイ）等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。タンパク質発現の測定方法の例としては、アガロースゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クロマトグラフィー法、免疫学的測定法（例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降等）、比色定量法、質量分析、電子顕微鏡観察等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

次いで、本発明の方法においては、上記のとおり測定された発現に基づいて、被験物質の皮膚感作性を評価する。評価は、例えば、上記のとおりタンパク質又は遺伝子の発現を測定し、必要に応じて測定値を定量化した後、測定された発現レベルを、被験物質への曝露の前後で、又は被験物質曝露群と被験物質非曝露群若しくは対照物質曝露群との間で、比較することによって行われ得る。あるいは、評価は、上記のとおり測定された発現レベルを、種々の濃度の被験物質間で比較することによって行われ得る。
ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＳＲＸＮ１、ＤＮＡＪＡ４、又はそれらをコードする遺伝子の発現レベルに影響を与えた物質を皮膚感作性物質として選択することができる。好ましくは、上記タンパク質又は遺伝子の発現レベルを増強した物質を、皮膚感作性物質として選択する。

例えば、本発明の方法においては、上記のとおり測定されたタンパク質又は遺伝子の発現レベルを被験物質への曝露後と対照物質への曝露後との間で比較して、該被験物質への曝露後の発現レベルが対照物質への曝露後に対して高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択することができる。
また例えば、本発明の方法においては、上記のとおり測定されたタンパク質又は遺伝子の発現レベルを被験物質への曝露前と曝露後との間で比較して、曝露後の発現レベルが曝露前に対して高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択することができる。
また例えば、本発明の方法においては、被験物質の濃度を段階的に変えて上記タンパク質又は遺伝子の発現レベルを測定し、より高濃度の被験物質への曝露後により高い発現レベルが観察された場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択することができる。
また、本発明の方法においては、被験物質の濃度を段階的に変えて細胞毒性を測定し、細胞毒性が示されない濃度範囲において、上記タンパク質又は遺伝子の発現レベルを測定するのが好ましい。なお細胞毒性の測定は、ＬＤＨ漏出を指標とした細胞生存率測定法など当該分野で公知の方法に従って行えばよい。細胞毒性が示されない濃度範囲の具体的な例としては、細胞生存率が５０％以上の濃度範囲が挙げられる。

発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、なお好ましくは１０倍以上高いことである。あるいは好ましくは、発現レベルが「高い」とは、統計学的に有意に高いことを意味し得る。

例えば、ＡＴＦ３の場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上高いことである。
また例えば、ＧＣＬＭの場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上高いことである。
また例えば、ＤＮＡＪＢ４の場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは８倍以上高いことである。
また例えば、ＨＳＰＡ６の場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは４倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上高いことである。
また例えば、ＨＳＰＡ１Ａの場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上高いことである。
また例えば、ＨＳＰＨ１の場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは８倍以上高いことである。
また例えば、ＺＦＡＮＤ２Ａの場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上高いことである。
また例えば、ＳＲＸＮ１の場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは８倍以上高いことである。
また例えば、ＤＮＡＪＡ４の場合、発現レベルが「高い」とは、被験物質への曝露後の発現レベルが、被験物質への曝露前若しくは対照物質への曝露後のそれと比較して、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは８倍以上高いことである。

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

実施例１
１）サンプルの被験物質への曝露
３Ｄ培養皮膚モデルＥｐｉＤｅｒｍ^TM（ＭａｔＴｅｋｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手）を、あらかじめ３７℃で温めておいた付属の培地５００μＬの入った２４ウェルプレートに移し、３７℃のＣＯ₂インキュベーターにて１０時間〜１８時間前培養した。前培養後、新たにあらかじめ３７℃に温めておいた付属の培地２００μＬの入った２４ウェルプレートに組織を移した。被験物質は、アセトンとオリーブ油を３：１の比率（ｖ／ｖ）で混合した溶媒（ＡＯＯ）或いは精製水にて適切な濃度に希釈した。希釈した被験物質１０μＬを組織全体に広がるように適用し、３７℃のＣＯ₂インキュベーターにて６時間培養した。被験物質としては、公知の感作性物質：強度（extreme）感作性物質であるジニトロフルオロベンゼン（1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene：ＤＮＦＢ、シグマアルドリッチ社製）；中程度（moderate）感作性物質であるフェニルアセタールアルデヒド（Phenylacetaldehyde：ＰＡＡ、シグマアルドリッチ社製）；軽度（weak）感作性物質であるエチレングリコールジメタクリレート（Ethyleneglycol dimethacrylate：ＥＧＤＭ、シグマアルドリッチ社製）、ならびに非感作性物質である塩化ベンザルコニウム（Benzalkonium chloride：ＢＡＣ、シグマアルドリッチ社製）、及び溶媒対照（ＡＯＯ）を用いた。

２）ｔｏｔａｌＲＮＡの回収
培養後、組織をＰＢＳ（−）８００μＬで３回洗浄後、組織をピンセットにて剥ぎ取り、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組織を浸漬し破砕した。ホモジナイザーにより細胞を細断し、室温で５分放置後、クロロホルム２００μＬを添加して激しく混合して、１２，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心操作を行った。上層の水層を注意深く分取し、新しいチューブに移した後、等量の７０％エタノール水を添加して、混合した。混合液はＲＮＡを精製するため、カラム（ＲＮｅａｓｙ，ＱＩＡＧＥＮ社）に添加した。その後、付属のプロトコールに従ってｔｏｔａｌＲＮＡ溶液を回収した。

３）ｃＤＮＡ合成
回収したｔｏｔａｌＲＮＡ５００ｎｇからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成にはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^TMＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、手順はキットに付属されているプロトコールに従った。まず始めに、ＲＮＡ溶液とＯｌｉｇｏ（ｄＴ）₂₀プライマー、ｄＮＴＰミックスをあらかじめ混和し、６５℃にて５分間反応させた。サンプルを２分以上氷冷後、反応バッファー、ＭｇＣｌ₂、ＤＴＴ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒを加え、５０℃で５０分反応後、８５℃で５分間反応させた。その後、ＲＮＡを分解するためＲＮａｓｅＨを添加し、３７℃にて２０分反応を行った。反応後の溶液をｃＤＮＡ溶液とし、リアルタイム発現解析に用いた。

４）リアルタイムＰＣＲ解析
３）で調製したｃＤＮＡ溶液を精製水にて２倍希釈し、そのうち２μＬをリアルタイムＰＣＲに供した。標的遺伝子としては、ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子、ＨＳＰＡ６遺伝子、ＡＴＦ３遺伝子、ＨＳＰＨ１遺伝子、ＧＣＬＭ遺伝子、ＤＮＡＪＡ４遺伝子、ＤＮＡＪＢ４遺伝子、ＺＦＡＮＤ２Ａ遺伝子、及びＳＲＸＮ１遺伝子の９遺伝子、ならびに内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。増幅用プローブ及びプライマーには、標的遺伝子特異的なリアルタイムＰＣＲ用プローブセットＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた（ＨＳＰＡ１Ａ：Ｈｓ００２７１２２９_ｓ１、ＨＳＰＡ６：Ｈｓ００２７５６８２_ｓ１，ＧＣＬＭ：Ｈｓ００９７８０７３_ｍ１、ＡＴＦ３：Ｈｓ００２３１０６９_ｍ１、ＨＳＰＨ１：Ｈｓ００９７１４７５_ｍ１、ＤＮＡＪＡ４：Ｈｓ００３８８０５５_ｍ１、ＤＮＡＪＢ４：Ｈｓ００１９９８２６_ｍ１、ＺＦＡＮＤ２Ａ：Ｈｓ００３８０８０９_ｍ１、ＳＲＸＮ１：Ｈｓ００６０７８００_ｍ１、ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ９９９９９９０５_ｍ１）。
１サンプルにつき、ｃＤＮＡ溶液２μＬ、プローブセット１μＬ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１０μＬ、精製水７μＬを専用の９６ウェルプレートにて混和し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてリアルタイムＰＣＲ解析を行った。
発現量の比較はΔΔＣｔ法にて相対比較を行った。即ち、標的遺伝子と内在性コントロ
ールのＣｔ値の差を算出した後（ΔＣｔ）、被験物質処理群のΔＣｔから溶媒対照群のΔ
Ｃｔを引くことによりΔΔＣｔ値を算出した。最後に２^-(ΔΔCt)を産出することにより、溶媒対照群の発現を１としたときの被験物質処理群の相対発現量を求めた。

５）ＬＤＨ漏出を指標とした細胞生存率測定
被験物質を曝露した後の細胞生存率は、タカラバイオ社製のＬＤＨＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて測定した。具体的には、組織を採取した後に残った培養液を回収した。一方ＬＤＨｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔに含まれるＣａｔａｌｙｓｔ溶液とＤｙｅＳｏｌｕｔｉｏｎを４５：１で混和しこれをＲｅａｃｔｉｏｎｍｉｘとした。培養液とＲｅａｃｔｉｏｎｍｉｘを５０Ｌずつ混合し、室温、遮光にて３０分反応させて後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。尚参照波長として６５０ｎｍの吸光度も測定した。
以下のような数式から、各被験物質暴露群の細胞生存率を算出した。

細胞生存率（％）
＝１００-（被験物質処理群の吸光度−未処理群の吸光度）／（５％ドデシル硫酸ナトリウム処理群の吸光度−未処理群の吸光度）×１００

５）結果
表１に被験物質曝露後の細胞の生存率を示す。データは３回の測定の平均及び標準偏差を示す。何れの物質の場合も、高濃度の曝露により細胞の生存率が低下し、高濃度では細胞毒性が現れることが分かった。

表１記載の被験物質への曝露による各遺伝子の発現の変化を調べた。被験物質の細胞毒性による影響を除外するため、表１記載の濃度のうち５０％以上の細胞生存率が維持された濃度についての遺伝子発現を調べた。結果を表２及び図２に示す。データは３回の測定の平均及び標準偏差を示す。何れの遺伝子も、感作性物質に対して濃度依存的に発現を増加させる傾向を有する一方で、非感作性物質に対しては濃度による発現の変化は見られなかった。すなわち、これらの遺伝子は皮膚感作性物質に応答して発現を増加させている。

実施例２水不溶性物質曝露評価
実施例１と同様に、３Ｄ培養皮膚モデルＥｐｉＤｅｒｍ^TM（ＭａｔＴｅｋｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手）に被験物質を曝露した。被験物質としては、感作性の有無が既知で、且つ水に不溶の物質を選定した。感作性物質としては、強度（Strong）感作性物質であるベータプロピオラクトン（beta-propiolactone：ＢＰＬ、東京化成社製）、中程度（moderate）感作性物質であるパルミトイルクロリド（palmitoyl chloride:PalC、シグマアルドリッチ社製）、非感作性物質としてはヘキサン（hexane, シグマアルドリッチ社製）を用いた。いずれの被験物質も、ＡＯＯを溶媒として適切な濃度に希釈し、希釈した被験物質１０μＬを組織全体に広がるように適用して、３７℃のＣＯ₂インキュベーターにて６時間培養した。実施例１と同様に、但し、ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子、ＨＳＰＡ６遺伝子、ＡＴＦ３遺伝子、ＨＳＰＨ１遺伝子の４遺伝子を標的遺伝子として、ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成を行い、リアルタイムＰＣＲにて発現解析を行った。

表３に被験物質曝露後の細胞の生存率を、表４及び図３に被験物質への曝露による各遺伝子の発現の変化を示す。データは２回の測定の平均を示す。何れの遺伝子も、感作性物質に対して発現を増加させる傾向を有する一方で、非感作性物質に対しては発現の変化は見られなかった。水に不溶性であり、高濃度での暴露が必要な物質であっても本発明の方法で感作性の評価が可能であることが示された。

Claims

３次元培養皮膚細胞を被験物質に曝露する工程；
該細胞におけるＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＨ１、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＳＲＸＮ１及びＤＮＡＪＡ４、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現を測定する工程；及び
測定された該発現に基づいて該被験物質の皮膚感作性を評価する工程、
を含む物質の皮膚感作性の評価方法。
ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４及びＨＳＰＡ６、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現が測定される、請求項１記載の方法。
ＡＴＦ３、ＧＣＬＭ、ＤＮＡＪＢ４及びＨＳＰＡ６、ならびにそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも２の発現が測定される、請求項２記載の方法。
前記測定された前記発現に基づいて前記被験物質の皮膚感作性を評価する工程が、該測定された該発現のレベルを該被験物質への曝露後と対照物質への曝露後との間で比較して、該被験物質への曝露後の発現レベルが高い場合に該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
前記測定された前記発現に基づいて前記被験物質の皮膚感作性を評価する工程が、該測定された該発現のレベルを該被験物質への曝露前後で比較して、該被験物質への曝露後の発現レベルが高い場合に該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
前記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して２倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、請求項４又は５記載の方法。
前記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して３倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、請求項４又は５記載の方法。
前記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して５倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、請求項４又は５記載の方法。
前記被験物質への曝露後の発現レベルが該被験物質への曝露前又は対照物質への曝露後のそれと比較して１０倍以上高い場合に、該被験物質を皮膚感作性物質として選択する工程である、請求項４又は５記載の方法。
前記３次元培養皮膚細胞が３次元培養表皮細胞である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
前記３次元培養皮膚細胞が３次元培養ヒト由来表皮細胞である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
測定される発現がｍＲＮＡ発現である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。