CN106460031B - 评价皮肤干燥的状态的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速且精确地评价皮肤干燥状态的方法、以及一种有效地搜寻用于改善干燥皮肤的物质的方法。所述评价皮肤干燥状态的方法包括测定从被试者采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平。

Description

评价皮肤干燥的状态的方法
技术领域
本发明涉及一种评价皮肤干燥的状态的方法和一种搜寻用于改善干燥皮肤的物质的方法。
背景技术
正常的皮肤具有保持水分的功能(保湿功能)。由于该保湿功能从而保持皮肤的柔软，通过维持屏障功能还可以保持良好的状态。同时，在皮肤的保湿功能降低皮肤干燥时，皮肤状态恶化，发生皮肤粗糙。
报道了在干燥皮肤中观察到角质层的水含量降低(非专利文献1)、角质层上部中角质细胞粘接结构(角化粒)的残留(非专利文献2)、以及具有不成熟的边缘带(编码角质化包膜)的角质细胞的增加(非专利文献3)。近年来，还报道了根据由胶带剥离而采集的角质层的整体蛋白质组分析(二维电泳)，干燥皮肤中角化粒、膜联蛋白A2和磷脂酰乙醇胺结合蛋白1增加(非专利文献4)。然而，至今的有关干燥皮肤的报告聚焦于已死细胞(角质层)的结构和成分，还没有对活的皮肤细胞(活的角质下细胞)进行分析。
AGR2(前梯度同源蛋白2(Anterior gradient homolog 2))和AGR3(前梯度同源蛋白3(Anterior gradient homolog 3))都是属于蛋白质二硫键异构酶(PDI)族的蛋白质。AGR2和AGR3都具有一个硫氧还蛋白结构域(CXXS)，认为其与蛋白质的S-S键部位结合并且参与蛋白质折叠和成熟(非专利文献5和6)。实际上，报道了AGR2与肠中的粘蛋白结合来参与粘蛋白的成熟，在乳腺癌细胞中表达，并且AGR3在卵巢癌细胞中表达(非专利文献7～9)。然而，至今没有报道皮肤中AGR2和AGR3的功能。
非专利文献
非专利文献1：Bioengineering of the skin:Water and the stratumcorneum.Elsner P,Berardesca E and Maibach HI(eds.),CRC Press Inc,3-12,1994
非专利文献2：J Invest Dermatol,116(1):23-30,2001
非专利文献3：Int J Cosmet Sci,25(4):157-167,2003
非专利文献4：Exp Dermatol,21(3):205-210,2012
非专利文献5：Mol Phylogenet Evol,36(3):734-740,2005
非专利文献6：J Immunol Methods,378(1-2):20-32,2012
非专利文献7：Proc Natl Acad Sci,106(17):6950-6955,2009
非专利文献8：Dev Biol,338(2):270-279,2010
非专利文献9：J Immunol Methods,378(1-2):20-32,2012
发明内容
本发明提供一种评价皮肤干燥的状态的方法，其中，所述方法包括测定从被试者采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平。
进一步，本发明提供一种评价或选择干燥皮肤改善剂的方法，其中，所述方法包括以下的(A)～(D)：
(A)将试验物质向被试者或被试动物给药；
(B)测定从被试者或被试动物中采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平；
(C)将上述(B)中测定的表达水平与从没有将所述试验物质给药的被试者或被试动物采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平比较；和
(D)基于上述(C)的结果，评价所述试验物质的提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
进一步，本发明提供一种评价或选择干燥皮肤改善剂的方法，其中，所述方法包括以下的(A’)～(D’)：
(A’)使试验物质接触能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞；
(B’)测定所述组织或细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平；
(C’)将上述(B’)中测定的表达水平与对照组中的AGR2和/或AGR3的表达水平比较；和
(D’)基于上述(C’)的结果，评价所述试验物质的提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
附图说明
图1是皮肤组织中的AGR2和AGR3的表达模式。不干燥：健康的人；干燥：有干燥皮肤的人。
图2是皮肤组织中的AGR2和AGR3mRNA的表达水平。不干燥：健康的人；干燥：有干燥皮肤的人。*：p<0.05、**：p<0.01(T-检验)。
图3是保湿剂对AGR2表达的影响。对于每个数据n＝2。
具体实施方式
在本说明书中，“皮肤干燥的状态”还可以指皮肤保湿的状态。皮肤干燥度越强，则皮肤保持越少的水分，并且被试者具有更高度的干燥皮肤。相反地，皮肤干燥度越弱，则皮肤保持越多的水分，并且被试者具有越轻度的干燥皮肤或者不具有干燥皮肤。
在本说明书中，“由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤”(在本说明书中，可以仅称为“粗糙皮肤”)是指由于皮肤的保湿功能降低而导致失去皮肤的柔软性和屏障功能，由此状态发生了恶化的皮肤。由干燥而导致的粗糙皮肤的例子，例如可以列举干性皮肤、敏感皮肤、皮肤干燥症、老年性皮肤干燥症、鱼鳞癣以及干性湿疹。
在本说明书中，“从被试者(或者被试动物)采集的皮肤细胞”包括能够表达AGR2和/或AGR3的皮肤组织中的活细胞，优选为活表皮细胞。活表皮细胞是在表皮组织中比角质层更深层中发现的细胞组。来自被试者(或者被试动物)的活表皮细胞可以通过利用通常的方法，例如钻取活组织检查，采集皮肤组织之后，利用例如中性蛋白酶处理分离表皮和真皮来进行采集。
在本说明书中，“AGR2和/或AGR3的表达”是指AGR2基因和AGR3基因的至少一者的表达或两者的表达，或者AGR2蛋白质和AGR3蛋白质的至少一者的表达或两者的表达。在以mRNA水平检测时，AGR2基因或AGR3基因的表达水平可以通过例如从细胞中提取总RNA之后利用实时RT-PCR法(Real-Time RT-PCR method)或RNA酶保护实验(RNase ProtectionAssay)来进行测定，或者利用例如Northern印迹分析对转录有AGR2基因或AGR3基因的mRNA进行检测并定量。AGR2蛋白质或AGR3蛋白质的表达水平可以通过通常的免疫分析法，例如RIA法、EIA法、ELISA、生物检定法(bioassay)、蛋白质组(proteome)和免疫印迹(Westernblot)，进行测定。其中，免疫印迹廉价并且简单。
本发明涉及提供一种快速且精确地评价皮肤干燥状态或由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的状态的方法，并且提供一种有效地搜寻用于改善由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的物质的方法。
本发明者们着眼于与皮肤的水含量相关的至今没有进行研究的活皮肤细胞(活的角质下细胞)，并且专门进行了研究以搜寻使这些细胞的活动与皮肤的水含量有联系的指标。其结果，本发明者们发现：以前没有报道在皮肤中的功能的AGR2和AGR3的表达是表明皮肤干燥的状态的良好的指标。
根据本发明，可以快速并且精确地评价被试者的皮肤干燥的状态或者由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的状态。根据本发明，还可以有效地搜寻改善干燥皮肤的状态或由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的状态的物质。
如后述的实施例所示，干燥皮肤的被试者与没有干燥皮肤的被试者相比，皮肤细胞中的AGR2和AGR3的表达水平都降低。另外，AGR2和AGR3的表达水平与作为皮肤干燥的状态的指标而为人所知的皮肤干燥得分和角质层电导系数相关。因此，AGR2和/或AGR3的表达水平可以是反映被试者皮肤干燥的状态的指标。
因此，本发明的一个实施方式是一种评价皮肤干燥的状态的方法，所述方法包括测定从被试者中采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平。在该方法的一个实施方式中，皮肤干燥的状态的评价是由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的状态的评价。适用该方法的被试者包括为了非治疗目的例如美容目的而期望预防或改善干燥皮肤或敏感皮肤或者期望知道成为干燥皮肤或敏感皮肤的风险的被试者、以及期望预防或改善由干燥，例如皮肤干燥症、老年性皮肤干燥症、鱼鳞癣以及干性湿疹，而导致的皮肤症状或状态的被试者。该方法中测定AGR2和/或AGR3的表达水平的步骤如上所述。
在上述方法中，基于测得的AGR2和/或AGR3的表达水平来评价被试者的皮肤干燥状态或粗糙皮肤的状态。优选将AGR2和AGR3两者的表达水平用作指标。
在上述评价的一个实施方式中，在被试者的皮肤细胞中AGR2和/或AGR3的表达水平低时，被试者的皮肤被评价为处于干燥状态或是粗糙皮肤。另一方面，在AGR2和/或AGR3的表达水平高时，被试者的皮肤被评价为不是处于干燥状态或不是粗糙皮肤。表达水平的程度可以通过与预先设定的参照值比较来确定。作为参照值，可以使用从干燥皮肤或粗糙皮肤的组取得的AGR2和/或AGR3的表达水平的指标(以下，参照值1)或者从不干燥皮肤或不粗糙皮肤的组取得的AGR2和/或AGR3的表达水平的指标(以下，参照值2)。参照值1的具体例子包括从干燥皮肤或粗糙皮肤的组采集的皮肤细胞(例如，活表皮细胞)中的AGR2和/或AGR3的表达水平的平均值。参照值2的具体例子包括从不干燥皮肤或不粗糙皮肤的组采集的皮肤细胞(例如，活表皮细胞)中的AGR2和/或AGR3的表达水平的平均值。不干燥皮肤或不粗糙皮肤的组的例子包括皮肤干燥得分为1.5以下的人的组，优选为皮肤干燥得分为1以下的人的组。干燥皮肤或粗糙皮肤的组的例子包括皮肤干燥得分大于2.5的人的组，优选为皮肤干燥得分大于3的人的组。在本说明书中，皮肤的“干燥得分”是通过利用5个等级(0：不干燥、1：观察到稍微脱皮、2：观察到中等脱皮和/或死皮、3：观察到明显的死皮和/或稍微开裂、4：观察到严重的死皮和/或开裂)目视评价目标位置的干燥状态而获得的值。然而，在本实施方式中，参照值不限定于上述的值，可以适当设定能够反映皮肤干燥的实际状态的适当的值。
例如，在来自被试者的AGR2和/或AGR3的表达水平的测定值等于或低于参照值1时，该被试者的皮肤被评价为处于干燥状态或是粗糙皮肤。例如，在来自被试者的AGR2和/或AGR3的表达水平的测定值等于或高于参照值2时，该被试者的皮肤被评价为不处于干燥状态或不是粗糙皮肤。例如，在来自被试者的AGR2和/或AGR3的表达水平的测定值高于参照值1且低于参照值2时，该被试者的皮肤被评价为处于稍微干燥的状态或者处于成为干燥皮肤和粗糙皮肤的风险高的状态。
例如，在来自被试者的AGR2和/或AGR3的表达水平的测定值为参照值2的50％以下、优选为30％以下、更优选为25％以下时，该被试者的皮肤被评价为处于干燥状态或是粗糙皮肤。
或者，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平等于或低于参照值1时，皮肤细胞被评价为是来源于皮肤处于干燥状态或是粗糙皮肤的被试者的皮肤细胞。另一方面，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平等于或高于参照值2时，皮肤细胞被评价为是来源于皮肤不处于干燥状态或不是粗糙皮肤的被试者的皮肤细胞。或者，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平的测定值高于参照值1且低于参照值2时，皮肤细胞被评价为是来源于皮肤处于稍微干燥的状态或具有成为干燥皮肤和粗糙皮肤的风险高的被试者的皮肤细胞。
或者，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平的测定值为参照值2的50％以下、优选为30％以下、更优选为25％以下时，皮肤细胞被评价为是来源于皮肤处于干燥状态或是粗糙皮肤的被试者的皮肤细胞。
在上述评价的其它实施方式中，经时测定被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平。经时测定的频率包括但不限定于例如每周、每二周和每月。测定的次数只能必须为二次以上，优选为三次以上。例如，在相比于上述测定时AGR2和/或AGR3的表达水平降低时，被试者的皮肤被评价为干燥变得更严重或粗糙皮肤变得更严重。另一方面，在相比于上述测定时AGR2和/或AGR3的表达水平提高时，被试者的皮肤被评价为干燥得到改善或粗糙皮肤得到改善。例如，在三次以上经时测定并且从第一次测定开始AGR2和/或AGR3的表达水平连续降低时，被试者的皮肤被评价为干燥变得更严重或粗糙皮肤变得更严重。另一方面，在从第一次测定开始AGR2和/或AGR3的表达水平连续提高时，被试者的皮肤被评价为干燥得到改善或粗糙皮肤得到改善。
或者，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3表达水平相比最近测定降低时，皮肤细胞被评价为是来源于其皮肤干燥变得更严重或粗糙皮肤变得更严重的被试者的皮肤细胞。另一方面，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3表达水平相比最近测定提高时，皮肤细胞被评价为是来源于其皮肤干燥得到改善或粗糙皮肤得到改善的被试者的皮肤细胞。或者，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平相比最初测定连续降低时，皮肤细胞被评价为是来源于其皮肤干燥变得更严重或粗糙皮肤变得更严重的被试者的皮肤细胞。另一方面，在皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平相比最初测定连续提高时，皮肤细胞被评价为是来源于其皮肤干燥得到改善或粗糙皮肤得到改善的被试者的皮肤细胞。
在上述评价的另一个实施方式中，可以将与上述参照值的比较和经时比较组合。在本实施方式中，经时测定被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平。经时测定的频率和次数与上述相同。将每次的各个测定值与通过上述步骤获得的参照值比较，进一步还将二次测定或随后测定的测定值与利用上述步骤得到的初期的测定值比较。在本实施方式中，通过综合地研究与参照值的比较结果和与初期测定值的比较结果，可以更详细地评价被试者的皮肤干燥的状态和粗糙皮肤的状态。
如上所述，AGR2和/或AGR3的表达水平的降低与皮肤干燥相关。因此，提高AGR2和/或AGR3的表达水平的物质可以提高皮肤保湿功能，改善干燥皮肤或粗糙皮肤。
因此，本发明的其它实施方式是一种评价或选择干燥皮肤改善剂或粗糙皮肤改善剂的方法，所述方法包括以下的(A)～(D)：
(A)将试验物质向被试者或被试动物给药；
(B)测定从被试者或被试动物中采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平；
(C)将上述(B)中测定的表达水平与从没有将所述试验物质给药的被试者或被试动物中采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平比较；和
(D)基于上述(C)的结果，评价所述试验物质的提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
被试动物可以包括非人动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、猪、和例如猴子的灵长类，从容易获取和操作的方面出发，优选为啮齿类，例如大鼠和小鼠。
向被试者或被试动物给药的试验物质只要是期望用作干燥皮肤改善剂或粗糙皮肤改善剂的物质，就没有特别地限定。试验物质可以是天然存在的物质或利用例如化学或生物方法人工合成的物质，并且可以是化合物或组合物或混合物。将试验物质给药的方法没有特别地限定，例如，从简便性和低侵袭的方面出发，优选为经皮给药、经口给药、照射和吸入。给药期限可以在一天至数月的范围进行设定，给药的频率可以在一天一次至一天多次的范围进行设定。
接着，测定从被试者或被试动物采集的皮肤细胞(试验组)中的AGR2和/或AGR3的表达水平。表达水平的测定步骤如上所述。
进一步，测定从没有将上述试验物质给药的被试者或被试动物采集的皮肤细胞(对照组)中的AGR2和/或AGR3的表达水平。对照组包括例如在将试验物质给药前从相同的被试者或被试动物采集的皮肤细胞、相同的被试者或被试动物中从没有将试验物质给药的皮肤区域或将对照物质给药的皮肤区域采集的皮肤细胞、从没有将试验物质给药的被试者或被试动物采集的皮肤细胞。表达水平的测定步骤如上所述。
接着，在试验组与对照组之间比较AGR2和/或AGR3的表达水平。优选比较AGR2和AGR3两者的表达水平。在试验组中AGR2和/或AGR3的表达水平相比对照组增加时，上述试验物质被评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。将被评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的试验物质选择为干燥皮肤或粗糙皮肤改善剂。
例如，在试验组中AGR2和/或AGR3的表达水平相比对照组中的表达水平统计学上显著地增加时，试验物质被评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。例如，在将对照组中的AGR2和/或AGR3的表达水平视作100％并且试验组中的表达水平为105％以上、优选为110％以上、更优选为120％以上时，试验物质被评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。将该具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果的试验物质选择为干燥皮肤或粗糙皮肤改善剂。
除了上述在体内(in vivo)进行的方法以外，本发明的评价或选择干燥皮肤改善剂或粗糙皮肤改善剂的方法也可以在体外(in vitro)或离体(ex vivo)进行。即，本发明的另一个实施方式是一种评价或选择干燥皮肤改善剂或粗糙皮肤改善剂的方法，所述方法包括以下的(A’)～(D’)：
(A’)使试验物质接触能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞；
(B’)测定所述组织或细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平；
(C’)将上述(B’)中测定的表达水平与对照组中的AGR2和/或AGR3的表达水平比较；和
(D’)基于上述(C’)的结果，评价所述试验物质的提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
在上述方法中，可以使用的试验物质的类型与上述体内方法的相同。
在上述(A’)中使用的能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞的例子包括能够表达AGR2基因或AGR3基因或者AGR2蛋白质或AGR3蛋白质的从哺乳动物中分离的组织或细胞、或其培养物。该分离的组织或细胞、或其培养物包括分离的皮肤组织或分离的皮肤细胞，优选为活表皮细胞及其培养物，例如肠细胞系、乳腺癌细胞系和卵巢癌细胞系。
或者，在上述(A’)中使用的能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞的例子包括以表达AGR2基因或AGR3基因或者AGR2蛋白质或AGR3蛋白质的方式进行了基因改变的哺乳动物的组织或细胞、或其培养物。该进行了基因改变的哺乳动物的组织或细胞、或其培养物可以通过例如将编码AGR2蛋白质和/或AGR3蛋白质的基因导入哺乳动物的任意的组织或细胞中，以表达AGR2和/或AGR3或者AGR2和/或AGR3的表达得到强化的方式进行转化来制作。将基因导入细胞中的方法包括利用例如电穿孔和脂质转染法的载体导入，但不限定于此。
本发明的方法中使用的能够表达AGR2和/或AGR3的组织或细胞的来源的哺乳动物的例子包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、猪、猴子，但不限定于此。
能够表达AGR2和/或AGR3的组织或细胞与试验物质的接触可以通过例如，预先将试验物质添加至培养液中以获得规定的浓度之后将该组织或细胞置于培养液中，或者向置有该组织或细胞的培养液中加入试验物质以获得规定的浓度来进行。优选将接触后的组织或细胞在例如室温(25℃)至37℃下通常培养3至48小时。通常所用的培养基可以用作培养上述组织或细胞的培养基。
测定上述(B’)中接触过试验物质的组织或细胞(试验组)中的AGR2和/或AGR3的表达水平。测定AGR2和/或AGR3的表达水平的步骤如上所述。
上述(C’)中的对照组包括与试验组中相同的能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞，其中，该组织或细胞没有接触过试验物质。或者，对照组包括例如天然地不具有或几乎不具有AGR2和/或AGR3表达能力的来自哺乳动物的组织或细胞；以及改变与试验组相同的组织或细胞以使AGR2和/或AGR3不表达的组织或细胞或进一步将上述组织或细胞与试验物质接触过的组织或细胞。以AGR2和/或AGR3不表达的方式进行了改变的组织或细胞包括例如利用siRNA的敲除细胞、和来自AGR2和/或AGR3敲除小鼠的组织或细胞。对照组中测定AGR2和/或AGR3的表达水平的步骤如上所述。
接着，在试验组和对照组之间比较AGR2和/或AGR3的表达水平。优选比较AGR2和AGR3两者的表达水平。在试验组中AGR2和/或AGR3的表达水平相比对照组增加时，上述实验物质被评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果，并且选择作为干燥皮肤或粗糙皮肤改善剂。试验组与对照组间的比较以及试验物质的评价和选择步骤与上述体内法中的相同。
在上述体内法和体外法或离体法的任一种中根据需要进一步筛选选择的物质。例如，将通过上述方法被评价或选择为干燥皮肤或粗糙皮肤改善剂的试验物质向被试者、被试动物和来自他们的培养皮肤给药以直接调查对皮肤的保湿能力的影响。由此，可以进一步选择具有更强的改善干燥皮肤或粗糙皮肤的作用的物质。可以基于例如经皮水分丢失量(TEWL)、皮肤干燥得分、角质层电导系数、和角质层中保湿成分的量(NMF、神经酰胺等)来测定皮肤的保湿能力。
在本说明书中进一步公开以下的组合物、制造方法、用途或方法作为本发明的示例性实施方式。但是，注意本发明不限定于这些实施方式。
<1>一种评价皮肤干燥状态的方法，其中，所述方法包括测定从被试者采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平。
<2>根据<1>所述的方法，其中，皮肤干燥的状态优选为由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的状态。
<3>根据<2>所述的方法，其中，由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤优选选自干性皮肤、敏感皮肤、皮肤干燥症、老年性皮肤干燥症、鱼鳞癣以及干性湿疹。
<4>根据<1>～<3>中任一项所述的方法，其中，被试者优选是为了非治疗目的而期望预防或改善干燥皮肤或敏感皮肤的被试者、为了非治疗目的而期望知道成为干燥皮肤或敏感皮肤的风险的被试者、或者期望预防或改善选自皮肤干燥症、老年性皮肤干燥症、鱼鳞癣以及干性湿疹的症状或状态的被试者。
<5>根据<1>～<4>中任一项所述的方法，其中，进一步优选包括作为参照值1获取从干燥皮肤或粗糙皮肤的组采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平的平均值。
<6>根据<1>～<4>中任一项所述的方法，其中，进一步优选包括作为参照值2获取从不干燥皮肤或不粗糙皮肤的组采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平的平均值。
<7>根据<5>所述的方法，其中，干燥皮肤或粗糙皮肤的组优选为皮肤干燥得分大于2.5的人的组，更优选为皮肤干燥得分大于3的人的组。
<8>根据<6>所述的方法，其中，不干燥皮肤或不粗糙皮肤的组优选为皮肤干燥得分为1.5以下的人的组，更优选为皮肤干燥得分为1以下的人的组。
<9>根据<5>～<8>中任一项所述的方法，其中，优选进一步包括将被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平与参照值1或参照值2比较。
<10>根据<9>所述的方法，其中，优选进一步包括在被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平等于或低于参照值1时，将被试者的皮肤评价为处于干燥状态或是粗糙皮肤。
<11>根据<9>所述的方法，其中，优选进一步包括在被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平等于或高于参照值2时，将被试者的皮肤评价为不处于干燥状态或不是粗糙皮肤。
<12>根据<9>所述的方法，其中，优选进一步包括在被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平为参照值2的50％以下、优选为30％以下、更优选为25％以下时，将被试者的皮肤评价为处于干燥状态或是粗糙皮肤。
<13>根据<1>～<12>中任一项所述的方法，其中，皮肤细胞优选为活表皮细胞。
<14>根据<1>～<13>中任一项所述的方法，其中，上述AGR2和/或AGR3的表达水平的测定优选为：利用实时RT-PCR法、RNA酶保护实验或Northern印迹分析的AGR2和/或AGR3的mRNA定量测定；或者利用RIA法、EIA法、ELISA、生物检定法、蛋白质组或免疫印迹的AGR2蛋白质和/或AGR3蛋白质的表达水平的测定。
<15>一种评价或选择干燥皮肤改善剂的方法，其中，所述方法包括以下的(A)～(D)：
(A)将试验物质向被试者或被试动物给药；
(B)测定从被试者或被试动物采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平；
(C)将上述(B)中测定的表达水平与从没有将所述试验物质给药的被试者或被试动物采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平比较；和
(D)基于上述(C)的结果，评价所述试验物质的提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
<16>根据<15>所述的方法，其中，所述皮肤细胞优选为活表皮细胞。
<17>根据<15>或<16>所述的方法，其中，优选进一步包括以下的(E)基于所述(D)中的评价，将所述(D)中提高AGR2和/或AGR3的表达水平的试验物质选择作为干燥皮肤改善剂。
<18>根据<15>～<17>中任一项所述的方法，其中，从没有将所述试验物质给药的被试者或被试动物采集的皮肤细胞优选选自以下：
(1)在将试验物质给药前从相同的被试者或被试动物采集的皮肤细胞；
(2)相同的被试者或被试动物中从没有将试验物质给药的皮肤区域或将对照物质给药的皮肤区域采集的皮肤细胞；和
(3)从没有将试验物质给药的其它的被试者或被试动物采集的皮肤细胞。
<19>根据<15>～<18>中任一项所述的方法，其中，优选在所述(B)中测得的表达水平相比从没有将试验物质给药的被试者或被试动物采集的皮肤细胞中的表达水平统计学上显著地增加时，将所述试验物质评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
<20>根据<15>～<18>中任一项所述的方法，其中，优选在将从没有将试验物质给药的被试者或被试动物采集的皮肤细胞中的表达水平视作100％并且上述(B)中测得的表达水平为105％以上、优选为110％以上、更优选为120％以上时，将所述试验物质评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
<21>一种评价或选择干燥皮肤改善剂的方法，其中，所述方法包括以下的(A’)～(D’)：
(A’)使试验物质接触能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞；
(B’)测定所述组织或细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平；
(C’)将上述(B’)中测定的表达水平与对照组中的AGR2和/或AGR3的表达水平比较；和
(D’)基于上述(C’)的结果，评价所述试验物质的提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
<22>根据<21>所述的方法，其中，优选进一步包括以下的(E’)基于所述(D’)中的评价，将所述(D’)中提高AGR2和/或AGR3的表达水平的试验物质选择作为干燥皮肤改善剂。
<23>根据<21>或<22>所述的方法，其中，上述能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞优选选自以下：
(1)分离的皮肤组织或分离的皮肤细胞、或其培养物；
(2)分离的活表皮细胞、或其培养物；
(3)肠细胞系、乳腺癌细胞系或卵巢癌细胞系；和
(4)以AGR2基因或AGR3基因或者AGR2蛋白质或AGR3蛋白质表达的方式进行了基因改变的哺乳动物的组织或细胞、或其培养物。
<24>根据<21>～<23>中任一项所述的方法，其中，对照组优选选自以下：
(1)能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞，其中，该组织或细胞没有接触过试验物质；
(2)天然地不具有或几乎不具有AGR2和/或AGR3表达能力的来自哺乳动物的组织或细胞；
(3)以AGR2和/或AGR3不表达的方式进行过改变的能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞；和
(4)接触过试验物质的(2)或(3)的组织或细胞。
<25>根据<21>～<24>中任一项所述的方法，其中，优选在上述(B’)中测得的表达水平相比上述对照组的表达水平统计学上显著地增加时，将所述试验物质评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
<26>根据<21>～<24>中任一项所述的方法，其中，优选在将上述对照组中表达水平视作100％并且上述(B’)中测得的表达水平为105％以上、优选为110％以上、更优选为120％以上时，将所述试验物质评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
<27>根据<15>～<26>中任一项所述的方法，其中，上述AGR2和/或AGR3的表达水平的测定优选为：利用实时RT-PCR法、RNA酶保护实验或Northern印迹分析的AGR2和/或AGR3的mRNA定量测定；或者利用RIA法、EIA法、ELISA、生物检定法、蛋白质组或免疫印迹的AGR2蛋白质和/或AGR3蛋白质的表达水平的测定。
<28>根据<15>～<27>中任一项所述的方法，其中，所述干燥皮肤改善剂是由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的改善剂。
<29>根据<28>所述的方法，其中，由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤选自干性皮肤、敏感皮肤、皮肤干燥症、老年性皮肤干燥症、鱼鳞癣以及干性湿疹。
<30>作为被试者的皮肤干燥状态的指标的AGR2和/或AGR3的用途。
<31>根据<30>所述的用途，其中，AGR2和AGR3优选组合使用。
<32>根据<30>或<31>所述的用途，其中，优选将AGR2和/或AGR3的表达水平用作指标，更优选将ARG2和/或AGR3的mRNA水平或者AGR2蛋白质和/或AGR3蛋白质的表达水平用作指标。
实施例
以下，通过其实施例来更具体地说明本发明。
(样品)
通过钻取活组织检查从居住于美国的白种健康女性(20～40岁)中的7名有干性皮肤症状的人和6名健康人的小腿部位采集皮肤组织，并用作样品。
(实施例1)
皮肤组织中的AGR2和AGR3的表达模式的比较
将作为样品采集的皮肤组织埋入OCT化合物(Sakura Tissue Tek)并冷冻。其后，用低温切片机制作厚度为7μm的切片，将组织切片用冷却的丙酮固定。其后，用ProteinBlock Serum-Free Ready to Use(Dako)抑制非特异性结合。初级抗原：将抗AGR2(Anti-AGR2)(abcam)或抗AGR3(Anti-AGR3)(abcam)稀释于Can get signal溶液(TOYOBO)中，培养1小时。其后，二次抗原：将Alexa555抗兔(Life Technologies)和Alexa555抗小鼠(LifeTechnologies)稀释于Can get signal溶液中，培育30分钟以可视化。
将结果示于图1中。AGR2和AGR3在皮肤的活表皮细胞区域的上部局部存在并表达。虽然AGR2和AGR3的局部存在区域在健康人与有干性皮肤的人之间没有差异，但是有干性皮肤的人中表达强度显著较弱。
(实施例2)
皮肤组织中的AGR2和AGR3的表达水平的比较
将作为样品采集的皮肤组织(7名有干性皮肤的人和6名健康人)浸渍于中性蛋白酶液中，分离成表皮和真皮。将得到的表皮组织浸渍于RNA later(QIAGEN)中，并保存于-80℃直至使用。其后，使用RNeasy(注册商标)Mini Kit(QIAGEN)提取总RNA。测定总RNA的浓度，使用一定量的总RNA进行逆转录反应。将高容量RNA-to-cDNA试剂盒(High capacityRNA-to-cDNA kit)(Applied Biosystems)用于逆转录反应。由得到的cDNA通过实时PCR定量测定AGR2和AGR3的mRNA表达。将Taqman(注册商标)探针(AGR2：Hs00180702_m1，AGR3：Hs00411286_m1，Applied Biosystems)用于定量测定，将PRISM 7500(AppliedBiosystems)用于检测和定量。在20μL的反应体系中进行PCR，扩增条件是95℃下15秒的变性反应，在60℃下1分钟的退火和延伸反应。每个基因的表达水平利用RPLP0(Hs99999902_m1，Applied Biosystems)的表达水平校正，作为将健康人中AGR2和AGR3的各个平均表达水平视作1的情况下的相对值来表示。
将结果示于图2中。有干性皮肤的人的皮肤中的AGR2和AGR3的表达水平相比健康人显著地降低。
(实施例3)
AGR2和AGR3的表达水平与皮肤干燥的程度的相关性
调查被试者(13人)的皮肤干燥得分和角质层电导系数。作为皮肤干燥得分，利用5个等级(0：不干燥、1：观察到稍微脱皮、2：观察到中等脱皮和/或死皮、3：观察到明显的死皮和/或稍微开裂、4：观察到严重的死皮和/或开裂)由2名评价者目视评价目标位置的干燥状态，获得平均值。通过Skicon200EX(IBS Inc.)测定角质层电导系数。利用钻取活组织检查从各个被试者采集小腿部位的皮肤组织。通过与实施例2相同的步骤，从采集的皮肤组织中分离表皮组织，提取总RNA，通过RT-PCR定量测定mRNA表达水平，用RPLP0表达水平校正测得的值，然后测定AGR2和AGR3的各表达水平。通过斯皮尔曼等级相关系数检验(Spearman’srank correlation coefficient test)，关于来自各被试者测定的AGR2和AGR3的各表达水平，分别获得皮肤干燥得分与角质层电导系数间的相关系数。将结果示于表1中。AGR2和AGR3两者的表达水平都明显与作为皮肤干燥状态的指标的皮肤干燥得分和角质层电导系数相关。因此，这表示AGR2和/或AGR3的表达水平是表明皮肤干燥状态的指标。
[表1]
Figure BDA0001140425160000171
(实施例4)
保湿剂的AGR2基因表达水平促进作用的分析
在37℃、5％CO2的条件下使用EpiLife(注册商标)(由Kurabo购得)培养正常人表皮细胞(NHEK)。将细胞以1×105细胞播种于12孔板中并培养48小时，然后，用无血清培养基交换培养基。进一步，将作为已知的干燥皮肤改善剂的维生素D3(99.5％乙醇溶液，最终浓度为1nM或10nM)(Nutrients,4(9):1213-8,2012)、桉树提取物(50％乙醇溶液，最终浓度为0.001％)(J Cosmet Dermatol,12(1):3-11,2013)、作为桉树提取物的主要生理活性物质的大果桉醛(macrocarpal)(50％乙醇溶液，最终浓度为10nM)(Int J Cosmet Sci,34(1):17-22,2012)或者99.5％乙醇或50％乙醇作为对照添加至培养基中。培养72小时之后，使用RNeasy(注册商标)Mini Kit(QIAGEN)从细胞中提取总RNA。测定总RNA的浓度，并且使用一定量的总RNA进行逆转录反应。将高容量RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)用于逆转录反应。由得到的cDNA通过实时PCR定量测定AGR2的mRNA表达。将Taqman(注册商标)探针(AGR2：Hs00180702_m1，Applied Biosystems)用于定量测定，将PRISM 7500(AppliedBiosystems)用于检测和定量测定。在20μL的反应体系中进行PCR，扩增条件是95℃下15秒的变性反应，在60℃下1分钟的退火和延伸反应。利用RPLP0(Hs99999902_m1，AppliedBiosystems)的表达水平校正mRNA表达水平，作为将对照(仅99.5％EtOH溶剂)的AGR2的平均表达水平视作1的情况下的相对值来表示。
将结果示于图3和表2中。在维生素D3、桉树提取物和大果桉醛中，相比对照AGR2表达提高。
[表2]
Figure BDA0001140425160000181

Claims (12)

1.一种非疾病诊断目的的评价皮肤干燥状态的方法，其中，
所述方法包括测定从被试者采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
进一步包括：
在被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平低时，将被试者的皮肤评价为处于干燥状态或是粗糙皮肤；或者
在被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平高时，将被试者的皮肤评价为不处于干燥状态或不是粗糙皮肤。
3.如权利要求2所述的方法，其中，
包括：
将从干燥皮肤或粗糙皮肤的组采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平作为参照值1，并将被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平与所述参照值1比较；和
在被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平等于或低于参照值1时，将被试者的皮肤评价为处于干燥状态或是粗糙皮肤。
4.如权利要求2所述的方法，其中，
包括：
将从不干燥皮肤或不粗糙皮肤的组采集的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平作为参照值2，并将被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平与所述参照值2比较；和
在被试者的皮肤细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平等于或高于参照值2时，将被试者的皮肤评价为不处于干燥状态或不是粗糙皮肤。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
皮肤干燥状态是由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的状态。
6.如权利要求5所述的方法，其中，
由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤选自干性皮肤、敏感皮肤、皮肤干燥症、老年性皮肤干燥症、鱼鳞癣以及干性湿疹。
7.一种评价或选择干燥皮肤改善剂的方法，其中，
所述方法包括以下的(A’)～(D’)：
(A’)使试验物质接触能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞；
(B’)测定所述组织或细胞中的AGR2和/或AGR3的表达水平；
(C’)将所述(B’)中测定的表达水平与对照组中的AGR2和/或AGR3的表达水平比较，其中，该对照组包括与试验组中相同的能够表达AGR2和/或AGR3的来自哺乳动物的组织或细胞，该组织或细胞没有接触过试验物质；和
(D’)基于所述(C’)的结果，评价所述试验物质的提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
8.如权利要求7所述的方法，其中，
在所述(B’)中测得的表达水平相比对照组的表达水平统计学上显著增加时或者在将对照组的表达水平视作100％并且在所述(B’)中测得的表达水平为105％以上时，将试验物质评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果。
9.如权利要求8所述的方法，其中，
进一步包括以下的(E’)：
(E’)基于所述(D’)中的评价，将所述(D’)中被评价为具有提高AGR2和/或AGR3的表达水平的效果的试验物质选择作为干燥皮肤改善剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中，
将被评价为具有提高AGR2和AGR3的表达水平的效果的试验物质选择作为干燥皮肤改善剂。
11.如权利要求7～10中任一项所述的方法，其中，
所述干燥皮肤改善剂是用于改善由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤的制剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中，
由皮肤干燥而导致的粗糙皮肤选自干性皮肤、敏感皮肤、皮肤干燥症、老年性皮肤干燥症、鱼鳞癣以及干性湿疹。
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