CN102625853A - 表皮分化微小rna标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于测定人表皮样品中人角质形成细胞的表皮分化状态的方法，包括：测定从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种微小RNA在所述角质形成细胞中的表达水平；以及将所选微小RNA(s)的表达水平与所选微小RNA(s)在处于培养中的未分化角质形成细胞、或已分化的表皮角质形成细胞中的平均表达水平进行比较，所述角质形成细胞优选来源于相同细胞株或相同种群。本发明还涉及用于测定表皮分化状态的方法的不同用途，并且涉及药物或化妆品组合物。

Description

表皮分化微小RNA标记及其应用
技术领域
本发明涉及化妆且适用于皮肤。更具体地讲，本发明涉及对于皮肤的表皮分化状态的表征、以及对于与皮肤分化有关的病变、疾病或病理的处理。
背景技术
表皮由多层上皮细胞组成，对环境和刺激起到保护屏障作用。其主要由角质形成细胞组成，这些细胞在表皮的最深层增生，然后开始分化，并从表皮的深层迁移到表面。在表皮的表面，大部分已经分化的角质形成细胞，已知为角化细胞，形成角质层，具有较高的保护性。因此，表皮既是在基底层内部发生的细胞增生的场所，还是在中间层细胞分化的场所，最终形成一种完全分化的保护结构，即角质层。完成该循环大概需要20天。该过程对应于多种特定基因按照一定的顺序和协调的方式接连地被激活、随后被抑制的表达。该过程涉及多种转录因子、酶、脂质以及结构蛋白。多种生长因子、钙、维生素A和D3衍生物是角质形成细胞增生和分化的重要调节物质。
特定的生理或病理状态，以及对皮肤表面或通过血液循环的特定刺激，会导致在时间和空间上原本协调的表皮分化过程发生异常。
在与调控表皮分化过程相关的皮肤疾病中，已观察到许多疾病可能是或可能不是遗传性的[14-15]，例如：牛皮癣、异位性皮炎、痤疮、鱼鳞病、鱼鳞病样红皮病、毛发红糠疹、毛发角化病、毛囊角化病(Darier’s disease)、掌跖角化病和汗孔角化病。
与调控表皮分化相关的生理环境的具体例子还有：老化、具有终末分化异常和屏障功能下降[17]、特征为表皮的内稳态(增生、迁移、终末分化的再表皮化和修复)变化阶段的疤痕、以及与年龄相关的或冬季引起的干燥疾病(皮肤干燥、鳞状积累过程)[18]。
由于外界因素导致表皮分化过程紊乱而引起的混乱的具体例子有[19]：暴露于太阳紫外线照射、热、导致片状剥落的药物、导致脱皮的药物、导致脱脂药物或机械损伤。
在症状较轻时，建议使用润肤剂和角质软化剂。像这样的处理并不能对增生/分化的平衡起作用，而只是使患者身体能够忍耐，通常仅仅是一种暂时的效果。
对于更为严重的症状，维甲酸及其衍生物、维生素D3可以调节角质形成细胞的增生与分化，已被使用多年。有时，还可以建议使用氨甲喋呤和环孢菌素。所有这些治疗都存在较大的副作用，对于患者来说是烦累的。
为了表征皮肤的表皮分化或“再生皮肤”型培养表皮的状态，以及为了能够评估可调控表皮分化过程的分子，目前可选择以下技术手段：
●表皮分化阶段的形态学分析和生化标记(免疫组织化学法)。该技术或者只能用来非常泛泛地分析(局部组织学)、或者逐个标记地分析(免疫组织化学)已知正在分化的主要蛋白质，而不能产生一种皮肤状态的标记。所以该技术不太实用，需要具有某些适用的手段，比如对所研究的这些标记具有特异性的抗体，但情况并不总是如此。此外，该技术还不能进行定量。
●转录组分析：该方法广泛用于获得健康或疾病组织的分子标记。该技术以分析样品中mRNA转录的表达作为基础。常见的是，使用包含多大12000个基因的DNA芯片。然而，其受限于许多缺点，尤其是需要昂贵的装置(如AffymetrixTM系统)，而且，特别是会产生极其大量难以处理的数据，这要求一台性能优越的生物信息设备来处理。
●蛋白质组分析：可以提供一个组织中所有蛋白质通常位置的全图。这也要求大量使用双向电泳凝胶技术，因此在操作上非常不便。此外，精确地鉴定蛋白质需要更多的后续步骤和昂贵的设备，还要求具备特殊技能和专业经验才能操作。
因此，需要一种简单快速的方法来表征皮肤或培养表皮的表皮分化状态。
发明内容
本发明人惊奇地发现，完全出乎意料地，存在一种微小RNA标记(microRNA signature)，其不但可以用来表征表皮分化的状态，而且还可以用于设计与上述分化状态异常相关的多种疾病的治疗。
微小RNA(miRNA)发现于1993年，是一种内生的小片段RNA，其涉及被RNA干扰：它们能够靶向信使RNA(mRNA)并导致其降解或终止其翻译。像这样的微小RNA因而在细胞中起着非常重要的调控作用。而且，它们形成最大种类的调节分子当中的一群。它们是内源性的，来源于由基因组编码的初级微小RNA(pri-miRNA)。迄今为止，已鉴定了大约700种人微小RNA。它们的功能和靶标还没有得到完整的解释或证实。
它们对于多种细胞路径的调控起着关键作用，还可能与人的病理有关。微小RNA对发育调节、分化、增殖以及细胞凋亡起着重要作用(参见[1]和[3])。例如，人体中，miR-17-5p和miR-20是增殖的调节剂[4]，miR-223参与粒细胞的生成[5]。
miRNAs的表达异常可能会导致人体病变。有些miRNAs具有肿瘤抑制剂的功能，还有一些具有致癌基因的功能。
目前对于皮肤miRNAs的研究寥寥无几，尤其是对人的皮肤。
在动物皮肤上，最初是在小鼠，已经克隆了表达的miRNAs。它们对于表皮和皮毛的形态建成起着重要作用[8]。近年来，发现miRNAs与山羊和绵羊的皮毛增长有关[10]。最近，在小鼠的皮肤中，miRNA中的miR203已被鉴定，其在表皮分化诱导中通过降低细胞增殖潜力发挥着重要作用[11]。
在人体中，有研究将正常皮肤与牛皮癣皮肤和湿疹皮肤中的miRNAs的表达进行了比较。miRNA中的miR203在皮肤中高表达(相对于其它器官)而且仅通过角质形成细胞表达。它已被证实是属于在牛皮癣皮肤中过表达的一种miRNA[12]。
最后，已知在人体中，特定的miRNAs(miR-221和miR-222)与控制黑色素瘤的发展有关[13]。
假设如果每种miRNA存在几十个靶基因，本发明人提议：
●使用miRNAs作为分化的标记。相比于mRNA其数量少得多，意味着可以制成某个部位或组织的miRNA图谱，这比传统的全转录组方法更为简单、快速和廉价；
●使用表皮分化的miRNA分子标记来确认调节剂，以用来处理与表皮分化异常相关的良性或恶性疾病。“调节剂”一词是指化学个体或天然提取的实体、复合物配方、siRNAs、miRNA抑制剂如拮抗剂(antagomirs)、而且还包括使用光的仪器系统、对皮肤的物理刺激、或注射；
●使用miRNAs或所述miRNAs的调节剂，可用于化妆或治疗处理与表皮分化或增生相关的疾病；
●使用上述miRNA标记来评价化妆的效果或对表皮分化的治疗处理；
●使用表皮分化的miRNA分子标记对正常或病变的表皮实施诊断。
因此，发明者提议对某些特定miRNA的表达进行分析。
令人惊奇的是，通过对表皮角质形成细胞中miRNAs的表达进行系统分析，本发明人发现当表皮分化过程被启动，结果导致角质层的形成，人miRNAs中的miR-141、miR-148a、miR-182、miR-224、miR-26a、miR-26b、miR-361-5p、miR-425、miR-455-3p、miR-92b会在已分化表皮的角质形成细胞中过表达，而相比于处于增生而未分化的角质形成细胞中没有表达，且没有形成角化细胞。这10种miRNAs因而可作为角质形成细胞分化的分子标记。
与此相反，在高度未分化且处于增生的角质形成细胞中，人miRNAs中的let-7i、miR-22、miR-221、miR-222、miR-29a、miR-29b、miR-663、miR-30a、miR-30c，相比于已分化的表皮，它们在未分化的角质形成细胞中过表达。这9种miRNAs相反可以反映出表皮的未分化而处于快速增生的状态。
因此，本发明涉及表皮分化的所述miRNA标记以及所述标记的各种用途，尤其是用来评价或确定表皮分化的状态，可作为一种新颖的诊断工具用于生理或病理的分化紊乱，还可以作为一种靶标来矫正表皮分化的错误，或作为一种生物标记和筛选工具来检验调节表皮分化的试剂。本发明还涉及所述标记miRNAs的应用，或所述miRNAs的调节剂，以及在治疗和化妆中(特别是以组分的形式)的应用。
尤其是，在本发明的上下文中对下述用语有如下说明：
微小RNA(或microRNA或miRNA)：微小RNA是单链RNA，长度约为20～25核苷酸，更多的是21～24核苷酸。miRNA是基因转录成mRNA后发挥作用的阻遏物：实际上是与mRNA配对，引导其降解或抑制其翻译成蛋白质。
miRNAs的产生受到转录和后转录调控的严格控制。miRNA基因由RNA聚合酶II转录成较长的初级转录物或已知为“pri-miRNA”的前体的形式。前体miRNAs在细胞核内被一类2RNAaseIII酶(Drosha酶)酶切形成“pre-miRNA”。“pre-miRNA”是长度约70核苷酸的RNA，通过第一个半段和第二个半段序列之间的配对碱基，折叠成不完整的茎-环结构。然后pre-miRNAs被释放到细胞质中，被另外一种核酸酶(Dicer酶)和RISC复合物(RNA诱导的沉默复合物)结合，所述RISC复合物包括蛋白质TRBP(转活易感RNA结合蛋白)和Ago2(Argonaute家族蛋白2)。结合之后，Ago2蛋白切掉miRNA前体的3’末端，从而形成成熟的miRNA双链结构。只有当miRNA的靶标mRNA的特定链被复合物结合(热力学反应)时，另一条链才会被移除和降解。
随后靶标mRNA被载入RISC复合物并被降解。
虽然在动物细胞中对翻译的抑制观察到最多的是沉默路径，但最近的研究认为miRNAs也会影响靶标mRNA的数量。
hsa-miRxx：这是对已被鉴定的人miRNAs的命名方式(hsa意思是(智)人)。所有已知的miRNAs序列都记录于基因库中，如miRBase或microRNAdb数据库，它们通过唯一的登录号被识别(xx)。在下述列举中hsa-miRxx编号是指成熟miRNA序列。
下面具体列举了miRNAs的序列：
hsa-miR-141：成熟miRNA：UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID NO：1)
hsa-miR-148a：成熟miRNA：UCAGUGCACUACAGAACUUUGU(SEQ ID NO：2)
hsa-miR-182：成熟miRNA：UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU(SEQ ID NO：3)
hsa-miR-224：成熟miRNA：CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU(SEQ ID NO：4)
hsa-miR-26a(hsa-miR-26a-1和hsa-miR-26a-2)：成熟miRNA：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU(SEQ ID NO：5)
hsa-miR-26b：成熟miRNA：UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU(SEQ ID NO：6)
hsa-miR-361-5p：成熟miRNA：UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC(SEQ ID NO：7)
hsa-miR-425：成熟miRNA：AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA(SEQ ID NO：8)
hsa-miR-455-3p：成熟miRNA：GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC(SEQ ID NO：9)
hsa-miR-92b：成熟miRNA：UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC(SEQ ID NO：10)
hsa-let-7i：成熟miRNA：UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU(SEQ ID NO：11)
hsa-miR-22：成熟miRNA：AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU(SEQ ID NO：12)
hsa-miR-221：成熟miRNA：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(SEQ ID NO：13)
hsa-miR-222：成熟miRNA：AGCUACAUCUGGCUACUGGGU(SEQ ID NO：14)
hsa-miR-29a：成熟miRNA：UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA(SEQ ID NO：15)
hsa-miR-29b：成熟miRNA：UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU(SEQ ID NO：16)
hsa-miR-663：成熟miRNA：AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC(SEQ ID NO：17)
hsa-miR-30a：成熟miRNA：UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG(SEQ ID NO：18)
hsa-miR-30c：成熟miRNA：UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC(SEQ ID NO：19).
本说明书中有时省略“hsa”。但同样是指上述19种miRNAs。
表皮分化(角质化或角化)：是人皮肤持续更新提供表皮的现象。表皮分化包含所有分子的、生化的及形态学的现象，通过表皮分化的不同阶段，将表皮干细胞转化为无核角膜细胞或角质细胞。
所述终末分化可形成一种特殊的结构构成，如角质层，其为机体抵御外界环境提供有效的屏障。在表皮分化过程中，位于表皮深层的角质形成细胞分化成相同的两个子细胞，其中一个子细胞停留于原处，而另一个向上层转移，成为分化层，同时发生形态学变化和生化变化。
未分化角质形成细胞(或不分化角质形成细胞)，或底层角质形成细胞(或在基底层)：角质形成细胞表达角蛋白K5和K14，并具有核分裂能力。
已分化角质形成细胞：角质形成细胞不再具有核分裂能力且已经开始进行终末分化，特别是通过生成角蛋白K1和K10而进行终末分化。
拮抗剂Antagomir：是一类化学合成的寡聚核苷酸的新类别。常用来阻遏内生miRNAs的作用而使其沉默。Antagomir是短片段的合成RNA分子，它与靶标miRNA完全互补，有一个或数个碱基被修饰以防止被Ago2酶切(此外还经常引入其它修饰使antagomir难以降解)。
Antagomirs常用来从结构上抑制特定miRNAs的活性。已有多种antagomirs被发表公开。所有miRNAs都可以被antagomir专一性地阻遏。
唯一需要的信息仅是靶标miRNA的序列，就能够生产出可阻抑所述靶标miRNA活性的antagomir。
miRNA抑制剂的例子有：miRCURY LNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)或Qiagen公司的miScript miRNA抑制剂。
本发明涉及表皮分化的miRNA标记，具体是指示增生与分化之间平衡的标记。
在第1方面，本发明更具体地说，涉及一种测定方法，用于确定人表皮样品中人角质形成细胞的表皮分化状态。该方法优选包括测定所述角质细胞中至少1种miRNA的表达水平的步骤。
本发明中，所述miRNA是选自由本发明人鉴定的下述miRNAs：hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c。这19种miRNAs在本发明中称为微小RNA或miRNAs。
在未分化角质形成细胞中，具体说是在培养中的未分化角质形成细胞、或已分化的表皮角质形成细胞中，将所选出的miRNA的表达水平与所述miRNA的平均表达水平进行比较。
对于技术人员来说，有很多成熟的检测和定量miRNAs的方法。实例3中具体所述为应用最广的技术。
优选该方法包括测定从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少2种不同miRNAs的水平，比较这两种miRNAs在未分化角质形成细胞，具体是在培养中的未分化角质形成细胞、或已分化的表皮角质形成细胞中对应的平均水平。
可选地，该方法还包括测定本发明的19种miRNAs中的几种miRNAs的水平，例如至少3种或5种、甚至8种、10种、15种，更甚至测定本发明中所有19种miRNAs的表达水平，然后与未分化的角质形成细胞，如培养细胞、或已分化的角质形成细胞中所对应的miRNAs的平均表达水平进行比较。
术语“未分化的角质形成细胞，具体是培养的角质形成细胞、或已分化的角质形成细胞中的miRNAs的平均表达水平”是指在这类细胞中通常观察到的表达水平，优选对应于在至少5个不同角质形成细胞中测定的平均表达水平，有代表性的所述角质形成细胞是培养中的未分化角质形成细胞株、或已分化的表皮角质形成细胞群。优选10个样品的平均值，更优选20或100个不同样品的平均值。
所述及的培养中的未分化角质形成细胞或已分化表皮角质形成细胞优选是所研究的同株或同种角质形成细胞。
在实施上述方法的方案中，如果从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种miRNAs的表达水平统计上地高于未分化角质形成细胞、例如培养中的未分化角质形成细胞中相应miRNA的平均表达水平，则可认为所研究的角质形成细胞已分化或正在分化。
“统计上地高于”意思是指从统计学观点看，观察到的差异显著，尤其是高于标准偏差值。如果这两个值之间的差异大于测量的不确定度，则认为该值统计上地高于另一个。
优选与平均水平相比偏差水平大于20％，更优选大于50％。根据特别优选的实施方式，所选择的miRNA或miRNAs的表达水平至少相当于相应miRNA或miRNAs的平均表达水平的1.5倍、更优选所选miRNA或miRNAs平均水平的2倍以上。
优选从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种miRNA的表达水平统计上地高于在所有已被用于产生所述miRNA表达平均水平的培养中的未分化角质形成细胞中所述miRNA的表达水平的所有数值。
根据本发明方法中的一个优选方式，从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少2种miRNAs的平均水平高于未分化角质形成细胞中所述miRNAs的平均表达水平。更优选从hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-455-3p和hsa-miR-92b所构成的群组中选出至少3种、甚至5种或8种，更甚至是所有这些miRNAs。
可选地，若从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNAs的表达水平基本上等于在已分化的表皮角质形成细胞中所述miRNA的表达水平，则也能推断为所研究的角质形成细胞已分化或正在分化。更优选是指从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出至少2种、甚至3种、5种、8种或所有这些miRNAs的情况。
“基本上相同水平”意思是指所观察到的水平差异在统计学上不显著，例如其低于所述miRNA表达水平测量值的不确定度。
相反，在实施本发明方法的方案中，若从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达水平，统计上地高于在已分化表皮角质形成细胞中所述miRNA的平均表达水平，则认为所研究的角质形成细胞处于未分化或少量分化状态。
在优选的实施方式中，从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少2种miRNAs的平均水平高于在已分化的表皮角质形成细胞中所述miRNAs的平均表达水平。更优选是指从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出3种、甚至5种或8种、乃至所有这些miRNAs的情况。
可选地，若从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种miRNAs的表达水平基本上等同于在未分化表皮角质形成细胞中所述miRNA的表达水平，则可得出所研究的角质形成细胞处于未分化状态，也称不分化、或处于微量分化的状态的结论。优选是指从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少2种、乃至3种、5种、8种或所有这些miRNAs的情况。
本发明还涉及一种评价人表皮样品中存在的表皮分化状态差异的方法。通过使用该方法，可以表征所述样品的分化状态，例如，用来确定人健康表皮是否处于正常分化状态、或处于病理学特征状态。
根据本发明的方法，可以测定所述表皮的两层角质形成细胞之间的表皮分化状态的差异，即，表皮分化期这两层之间的差异状态，因而可定义所述表皮中的一层是否比另一层处于更深度的分化状态，或者相反处于更深度的增生状态。
本发明中评价表皮分化差异的方法，包含下述步骤：比较所述表皮中的两层角质形成细胞之间从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达水平。
实际上，如上所述，本发明人发现了本发明的这19种miRNAs在高度分化的角质形成细胞以及未分化的角质形成细胞中表达水平的差异。因而研究这些miRNAs表达水平的差异意味着可以推断所研究的表皮中，角质形成细胞的其中一层与另一层相比，表皮分化的水平存在差异。
虽然可以建立这两层之间几种miRNAs表达水平的差异，但是本发明的miRNAs中至少1种若在一层与另一层之间存在显著的表达水平差异能立即揭示出表皮分化的差异。
根据该方法，两层之间表皮分化的差异尤其可通过从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种miRNA在一层中的表达明显高于另一层而被表征。选取的所述miRNA表达的差异必须是从统计学角度讲存在显著的一个数量级的差异值。
优选所选择的miRNA的表达水平上的差异用系数表示，优选1.3以上，更优选1.5以上，进一步优选2以上。
本发明的优选方式中，可通过从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少2种不同miRNAs在一层中的表达高于另外一层来表征，更优选通过从所列miRNAs中选出至少3种、或者至少5种或8种、乃至这10种miRNAs的更高表达来表征表皮中的两层之间表皮分化的差异。其中一层中miRNAs的表达水平与另一层的差异，对于所有所列miRNAs不必采用同一系数来表征。
根据该方法，两层中表皮分化的差异还可以通过从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA在一层中的表达高于另一层而被表征。重复一次，表达水平的差异是指从统计学角度讲差异显著。
所选miRNA表达水平的差异优选系数在1.3以上，更优选1.5以上，进一步优选2以上。
本发明更优选方式中，表皮中的两层之间表皮分化的差异可通过从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少2种miRNAs在一层中的表达高于另一层来表征，优选通过至少其中3种、或者至少5种或8种、甚至是所列9种miRNAs的表达。其中一层中miRNAs的表达水平与另一层的差异对于所有所列miRNAs不必采用同一系数。
本发明说明书中，对于表皮样品，所述及的皮肤或表皮可能来源不同，可能来源于培养中的表皮，如“再生皮肤”型的再生表皮；或来自同一个体的样品，如来自同一个活检组织。所述样品可以是源自人的皮肤。
所研究的表皮样品的任意两层之间，可进行本发明的miRNAs中至少1个的表达水平的比较。若是人皮肤，比较优选在相向两侧的角质形成细胞之间进行，如在基底层和表皮角质层的角质形成细胞之间进行比较。应注意，在这一点，最近的研究显示角质形成细胞会产生或包含miRNAs。
还可以在样品中邻接的相同两层之间进行表达水平的比较，例如为了突出分化的不同阶段。
本发明还涉及上述表征方法的多种不同应用，本发明人强调该miRNA标记的各种用途，尤其是作为生理或病理分化紊乱的诊断工具，或是作为表皮分化中纠正错误的标靶，或作为用于检测表皮分化调节试剂的生物标记和筛选工具。
在第2方面，本发明因而涉及用于确定对表皮实施处理的效果的方法。该方法包括在处理前后，对表皮的表皮分化miRNA标记进行比较。即，该方法包括比较在处理前后从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA在所述表皮的角化形成细胞中的表达水平。
实际上本发明人已经揭示了发生于表皮中的表皮分化期间这19种miRNAs的表达水平的变化。所述miRNAs中至少1种的表达水平的改变因此反应出响应于检测处理的分化状态的改变。再次重申，表达水平的改变意味着统计学角度上的显著变化，这种变化程度是充分的并具有再现性，可以在大量的所研究的表皮上的有代表性的角质形成细胞中观察到。
可选地，本发明的说明书中，对施用于表皮的处理效果的测定方法还可以包括比较在检测处理前后表皮的表皮分化差异。根据该方法中的变化，因此，在处理前确定表皮中两层之间存在的表皮分化差异，然后，将得到的结果与在处理后相同两层之间存在的表皮分化差异进行比较。这样，可以确定该处理是否已经改变了对两层之间存在的差异，例如，减少了两层之间分化状态的差异，即，减少了两层之间的本发明miRNAs表达程度上的差异；或者增加了表皮分化的差异。
该方法中所检测的处理方式可以包括任何处理方式。优选该处理涉及通过覆用或注射将一种分子进行局部施用，优选皮下注射。所使用的分子可以是单一化学个体或不同实体的组合物和复合物，所述分子包括有效成分、天然分子、蛋白质、RNA、DNA、精油、天然提取物中的化学个体、复合物配方、DNA分子、miRNA、siRNA、miRNA抑制剂尤其antagomir等。
本发明的检测处理方案中特别优选的特定分子是RNAs，尤其是miRNAs、或能改变天然miRNAs表达的分子，如miRNA抑制剂，尤其是antagomirs。
还可以涉及各种波长的电磁幅射处理，例如可见光、UV(紫外光)、IR(红外光)或X射线。本发明的处理还包括各种机械作用的施用。
若能引起所研究的表皮中本发明miRNAs中至少1种的表达水平有所改变，则认为本发明的方法是有效果的。优选地，如果可引起在表皮中所述miRNAs中至少2种、或者至少5种的表达发生改变，则所述处理认为是有效果的。所述处理还可能会引起本发明中至少10种、15种、甚至全部19种miRNAs的表达水平的改变。本发明miRNAs表达水平的改变不必要求所有的miRNAs发生同一程度的变化。
优选地，在本发明的上下文中，若引起从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少一种miRNA表达水平的改变，伴随着引起从上述hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达水平沿相反方向发生改变，则认为该检测处理是有效果的。因此，在本发明的的上下文中，有效处理可以是，例如导致从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少一种miRNA表达水平的增加，同时导致从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA表达水平的减少。
通过使用用于检测本发明中处理效果的方法，还可能用来对一种试剂、尤其是化妆类产品如化妆品组合物的有效作用进行定量，检验其对于皮肤表皮分化状态的作用。上述体外检测方法实际上可被用于一种检测方案，该方案被用来测定可能会作为一种试剂而被定量的产品，其中所述试剂对皮肤的角质形成细胞的增生或分化的状态具有影响。
此外，采用该检测，通过使用本发明的测定方法，向用户提供用该产品获得的结果，有可能向用户推介该产品。基于对本发明miRNAs表达的研究，可对表皮分化状态的影响做出评价。因此，本发明还可以提供一种用于推荐产品的方法，通过如上所述测定方法，可显示出其在该检验方案中的效果。该发明还涉及一种推介化妆类产品的方法，包含通过施行如上所述的至少一种检验来测定所述产品的功效、作用量及特性。
可使用任何通讯渠道来推介这种产品。尤其是通过销售助理，针对该买点，或通过收音机和电视，特别是在广告中。还可以通过报刊或使用任意文件，尤其是用于宣传目的的材料(说明书)。还可以通过互联网或通过任何适合的计算机网络来推介这种产品。还可直接在产品上，尤其是在用于包装或任何与其相关的说明注意事项上进行推介。
在第3方面，本发明还涉及用于筛选能作用于表皮分化过程的分子的各种方法。
尤其是，本发明涉及筛选表皮中表皮分化过程调节剂的方法，包括在施用待被筛选的调节剂之前和之后，评价所述表皮中角质形成细胞的表皮分化状态。
这种筛选过程例如可在处于培养中的表皮或表皮样品上在体内进行，或在体外进行、或试管中进行。
可使用本发明第1方面中的一种方法来评价所述表皮中角质形成细胞的表皮分化状态。
如上所述，此处的表皮可能指的是处于培养中的表皮，例如一种“再生皮肤”型的再生表皮，其或得自于人的样品，如活检组织样品。
可选地，本发明还涉及筛选表皮中表皮分化过程调节剂的方法，包括在施用待被筛选的调节剂之前和之后，评价所述表皮中角质形成细胞的表皮分化状态。使用本发明第1方面中的一种方法，进行所述表皮中角质形成细胞的表皮分化差异评价。
所述及的调节剂可以是任意一种化学个体，如来自天然提取物或合成的物质，也可能是复合物配方、DNA分子、miRNA、siRNA，或miRNA抑制剂例如antagomir。显然，此处并未列举出所有调节剂。
可选地，调节剂还可以是一种使用电磁幅射的仪器系统，优选可见光、紫外线、红外线或X射线，或是一种利用机械作用的系统。
在第4方面，本发明涉及一种通过使用本发明人发现的miRNA标记来诊断表皮状态的方法。该诊断方法包括测定在基层与角质层之间存在于所述表皮中的表皮分化的差异，以及比较存在于相同类型的正常表皮中的在基层与角质层之间的表皮分化差异。
优选使用根据本发明第1方面中的多种方法来测定表皮分化的差异。优选对待诊断的皮肤中表皮样品进行诊断。
存在于同一类型的正常表皮中在基层与角质层之间的表皮分化的平均差异，对应于在具有同一类型皮肤的健康个体的数个表皮样品多次测量值的平均值，作为待诊断的表皮的平均值。术语“同一类型”是指年龄相仿、肤色相仿、和同一种族。平均值是指与表皮无任何病变或损伤的“正常”或“健康”状态对应的平均值。
使用该诊断方法，可建立待诊断的皮肤的miRNA分布图，并通过比较，可用于诊断罹患早熟衰老症、由太阳辐射引起的光老化或损伤、由压力引起的老化或损伤、痤疮或其它生理或病理的疾病。
根据另一方面，本申请还涉及从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA在角质形成细胞中的表达分析在人表皮样品中的用途，用来确定所述角质形成细胞的表皮分化状态。
本发明人实际上已指出该分析可获取表皮分化的miRNA标记。
在特别优选的用途中，分析本发明的19种miRNAs中至少2种不同的miRNAs，更优选至少分析5种、8种、10种、12种或15种。例如，对本发明的19种miRNAs的分析可用来确定所研究的角质形成细胞的表皮分化状态。
在另一方面，本申请涉及从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选取的至少1种miRNA、以及/或者至少1种所述miRNAs的表达调节剂、更具体是miRNA抑制剂如antagomir的各种用途、化妆及治疗。
实际上，由于皮肤中在表皮分化过程时所述miRNAs的重要性，调节它们在角质形成细胞中的表达水平可影响表皮分化，例如通过使其减缓、或反过来使其加速，可减慢或加快角质层的再生过程。更优选通过导入本发明miRNAs中的一种或多种，来进行角质形成细胞内本发明的miRNAs水平的调节，以便借此提高其在角质形成细胞中的数量，特别是使用miRNAs来矫正miRNAs的内源性失调。优选通过导入所述miRNAs调节剂来进行调节，优选通过导入至少1种miRNA抑制剂例如antagomir，其可靶向本发明miRNAs中的一种，以便借此减少其在角质形成细胞中的水平。本发明说明书中具体可想到的其它miRNA抑制剂还有miRCURY LNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)以及Qiagen公司的miScript miRNA抑制剂。
在优选的实施方式中，本发明涉及从本发明的19种miRNAs中选取的一种miRNA、或所述miRNA的一种调节剂，尤其是miRNA抑制剂，如可靶向所述miRNA的antagomir，用于处理与表皮分化过程相关的皮肤病变的治疗用途。优选相关病变为表皮分化中引起功能障碍的病变。
更具体地，本发明的上下文中涉及的病变为牛皮癣、异位性皮炎、酒刺、鱼鳞病、鱼鳞病样红皮病、毛发红糠疹、毛发角化病、毛囊角化病、掌跖角化病以及汗孔角化病。
优选本发明涉及的组合物中包含至少2种、甚至3种、更优选至少5种、10种、15种或全部19种本发明的miRNAs，或miRNA的抑制剂，尤其是这些miRNAs中的一些的antagomirs，用于上述治疗的应用。
对于本发明的治疗应用，若期望治疗效果包括增加所处理皮肤中表皮分化的状态，则在优选的实施方式中，本发明涉及的组合物包括从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种miRNA，以用于治疗，优选用于处理与表皮分化过程有关的皮肤疾病，尤其是用于治疗牛皮癣、异位性皮炎、酒刺、鱼鳞病、鱼鳞病样红皮病、毛发红糠疹、毛发角化病、毛囊角化病、掌跖角化病以及汗孔角化病。本发明涉及的组合物除了上述提到的miRNAs之外、或替代上述一种以上miRNA地，还包括至少1种抑制剂，如antagomir，其可靶向从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的1种miRNA，以用于治疗上述病变。本发明上下文中其它可想到的更具体的miRNA抑制剂有miRCURY LNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)和Qiagen公司的miScriptmiRNA抑制剂。
可以从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b所构成的群组中选出至少2种miRNAs，优选5种、8种或全部10种miRNAs。
出于对终末分化形成必要刺激的目的，用于所述治疗应用的组合物或产品包括：
■从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种、优选至少2种、3种、5种或全部这些miRNAs，或能引起这些miRNAs表达增加的调节剂；以及/或者任选地
■miRNA抑制剂，如antagomirs，其可靶向从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的1种miRNA，或能抑制miRNAs表达的这些miRNAs的调节剂。
本发明上下文中可想到的更具体的miRNA抑制剂有：antagomirs、miRCURY LNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)以及Qiagen公司的miScript miRNA抑制剂。
相反，若期望的治疗效果是，例如，减慢处理表皮角质形成细胞的表皮分化或促进增生潜力，则在另一种实施方式中，本发明涉及的组合物包括从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA，用于治疗用途，优选用于治疗与表皮分化过程有关的皮肤病变，更优选牛皮癣、异位性皮炎、酒刺、鱼鳞病、鱼鳞病样红皮病、毛发红糠疹、毛发角化病、毛囊角化病、掌跖角化病以及汗孔角化病。本发明涉及的组合物，除了所述miRNA或miRNAs之外或者替代地，还包括至少1种miRNA抑制剂，如antagomir，其可靶向从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b选出的1种miRNA，用于处理所述病变。
可从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c所构成的群组中选出至少2种miRNAs，优选至少4种、7种或全部9种miRNAs。
在需要减少终末分化时，用于所述的治疗应用的组合物或产品包含：
■从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出至少1种，优选2种、3种、5种或所有这些miRNAs，或能提高这些miRNAs的表达的调节剂；以及/或者可选地
■miRNA抑制剂，如antagomirs，其可靶向从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的1种miRNA，或者能抑制这些miRNAs表达的调节剂。
本发明的上下文中具体可想到的miRNA抑制剂有antagomirs、miRCURY LNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)以及Qiagen公司的miScriptmiRNA抑制剂。
优选地，根据本发明用于治疗用途的组合物可与药物用赋形剂一起配制，用于局部施用或口服。
本发明还可想到下述物质在用于非病变人皮肤的化妆中的用途：从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的miRNA，或所述miRNAs的调节剂，优选miRNA抑制剂例如可靶向所述miRNAs中之一的antagomir。
所述用于治疗用途或化妆用途的各种用途优选涉及局部施用miRNAs、或含有所述miRNAs的组合物、或所述miRNAs的抑制剂例如antagomirs。因为其分子小，miRNAs及其抑制剂可穿过角质形成细胞的细胞膜，并可改变所述miRNAs在被处理的角质形成细胞中的数量。进一步，因为其物理化学性质，它们不太可能达到皮肤的深层，因此其作用被限制于表皮。
miRNAs及其抑制剂尤其是antagomirs的稳定性显示，它们的作用是暂时的，因此本发明可想到在皮肤或化妆中的应用涉及到对待处理的皮肤重复施用。
因此，本发明具体可想到使用生理学的或非病变化妆来处理与表皮分化有关的疾病的方法，包括对个体皮肤的局部施用从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的miRNA、以及/或者调节这些miRNAs当中1种的表达的调节剂、优选miRNA抑制剂例如可靶向这些miRNAs当中1种的antagomir。
根据所述方法的优选实施方式，为了提高所处理的皮肤中角质形成细胞的表皮分化状态，从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出miRNA。
可从由hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-923和hsa-miR-92b构成的群组中至少选出2种，优选至少选出5种、8种或所有10种miRNAs。
此外还有，可以选择用于靶向从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的1种或多种miRNAs的至少1种甚至几种miRNA抑制剂。本发明中具体可想到的miRNA抑制剂有antagomirs、miRCURY LNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)以及Qiagen公司的miScript miRNA抑制剂。
相反，若预期效果是，例如降低所处理的皮肤中角质形成细胞的表皮分化、或者促进其增生潜力，则根据本发明的另外一种实施方式，本发明涉及一种处理方法，其中所述miRNA选自hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c。
可从由hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c构成的群组中至少选出2种miRNAs，优选至少选出4种、7种或全部9种miRNAs。
可选地或者另外，可选择至少1种甚至多种miRNA抑制剂，该抑制剂可靶向从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-923和hsa-miR-92b中选出的1种或多种miRNAs。本发明上下文中具体可想到的miRNA抑制剂有antagomirs、miRCURYLNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)以及Qiagen公司的miScript miRNA抑制剂。
就化妆而言，特定的表皮分化病变涉及到下述因素：自然老化、光老化、疤痕、皮肤干燥或干燥症、或者化学品尤其是去角质试剂、剥落试剂、脱脂试剂的侵袭，或者机械刺激。这些病变不是病理性疾病，并且该处理不属于治疗方法，而仅是一种化妆处理，对于这些病变的处理本质上是为了改进皮肤的外观以及为个人带来方便。
更具体地说，与老化相关的病变包括实际年龄所对应的表皮分化被改变。实际上，在老化过程中，表皮会经历多种蜕变，其影响表皮分化过程以及功能性角质层的形成。具体可观察到表皮变薄，所述表皮具有数量更有限的基底细胞层，并且增生区室随着克隆原细胞数量减少而缩小，表皮更新也在减少。常规分化标记例如角质层表达图谱开始改变，具体是年轻人中可表达角蛋白16和17，此为健康的皮肤。颗粒层主要成分角蛋白K1和K15、以及细丝聚集素(Filaggrin)的数量减少。随着年龄，转谷酰胺酶1的数量也减少。伴随透过性的增加，屏障功能在改变。
与光老化相关的病变，或“光老化”，是由于暴露于阳光中而使表皮分化趋于改变。“光老化”皮肤的具体特征类似于皮革制品，其表面有很多明显的皱褶，这种皮肤也是因为表皮的水平随着角蛋白K6、K16、K17过表达以及细丝聚集素和转谷酰胺酶减少而被改变。这些变化与皱纹形成有关。与角质层形成有关的SPRR蛋白质同样也被UV改变。已知强烈暴晒于阳光会导致表皮的改变，影响了其屏障功能和表皮的自我恢复能力。
与疤痕相关的病变是由于随着疤痕形成及修复，表皮分化受到影响。在受伤后表皮再生过程中，整个表皮蛋白的表达方式被改变。完全修复分三个阶段：初始迁移阶段、然后是增生阶段以及最后的分化阶段。增生阶段使伤口愈合，紧接着是在角质形成细胞的分层化及分化中进行表皮的形态再建，在健康的情形下可再生出功能性角质层。
与干燥或干燥症相关的病变主要是起因于如下事实：干燥的表皮实质上的特征是表皮中油脂减少以及角质层的变化。角蛋白1和10减少，而角质形成细胞K6和K14增加。细丝聚集素以及外皮蛋白的表达水平紊乱。
化学品尤其是去角质试剂、剥落试剂、脱脂试剂的侵袭刺激，以及机械刺激可改变表皮的内稳态，并导致角质层提供的屏障功能的改变。正常表皮分化的过程可重新建立表皮的内稳态和正常屏障功能。
在应用于化妆时，优选局部施用本发明的miRNAs中的至少1种、优选至少2种，或施用所述miRNAs的特异性抑制剂，可以用来处理上述各种非病理性病变。
因此，本发明可直接用于化妆品组合物或产品，该组合物或产品包含至少1种本发明的miRNAs，或实际上包含至少一种调节本发明miRNAs当中的1种miRNA的表达的调节剂，来矫正或改进皮肤的外观，及其皱纹、光泽、瑕疵或微创伤。调节本发明的miRNAs当中1种miRNA的表达的调节剂是一种可增加或抑制所述miRNAs当中1种的表达的活性成分。所述可调节miRNAs当中1种的表达的活性成分，例如，可通过如上所述的筛选法来确认，或者是本发明中1种miRNA的antagomir。
所述及的化妆品产品或配方可以呈任意一种植物制剂形式，例如可配制成乳剂、霜剂、凝胶、喷雾剂或肥皂，用于局部施用，或可成口服摄取形式。
特别是可以为多种活性成分的混合物，例如至少2种本发明的miRNAs的混合物，或本发明的1种miRNA与本发明的1种miRNA调节剂的混合物、或者本发明的2种miRNA调节剂的混合物。还可以是1种活性成分与一种设备的混合、具体可列举机械、光学或电子、电磁治疗型设备。
本发明具体可想到涉及已知为“抗衰老”产品的化妆品，其可减少因分化紊乱导致的表面瑕疵以及老龄化皮肤的皮革化。可想到特定的美容产品适应于被太阳辐射的老化皮肤，借助于本发明的miRNAs或所述miRNAs的调制剂，可改善增生与分化之间的平衡来恢复皮肤的品质。
本发明还可用于晒后用化妆品，来反向平衡由于暴晒引起的分化变动。可想到该产品能通过促进表皮分化以及角质形成细胞的脱落，来调节色素紊乱，以便更快地清除因色素紊乱带来的多余黑色素。
其它化妆产品具体可列举干性皮肤用产品，其具有保湿功能，还可以调节表皮分化的末端过程。本发明还包括在瘢疤形成期间为改善皮肤修复过程的修护产品。还包括配制产品，用于被刺激的皮肤，或用于特定过程(剥落术后、激光术后产品等)或者用于日常情况，如污染、家用产品等。
在需要刺激终末分化的情况下，为了提高屏障作用和增加角质层，本发明的化妆品组合物或产品包括：
●从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种、优选至少2种、3种、5种或所有这些miRNAs，或者可提高这些miRNAs表达的miRNAs调节剂；以及/或者任选地
●从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的miRNAs抑制剂，或者可抑制这些miRNAs表达的miRNAs调节剂。本发明的上下文中具体可想到的miRNA抑制剂有antagomirs、miRCURY LNATM微小RNA敲除探针(Exiqon公司)以及Qiagen公司的miScript miRNA抑制剂。
在需要减少终末分化或减少角质层形成的情况时，本发明的化妆品成分或产品包含：
●从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种、优选至少2种、3种、5种或者所有这些miRNAs，或者能增加这些miRNAs表达的miRNAs调节剂；以及/或者任选地
●miRNAs如hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b的抑制剂、或能抑制这些miRNAs表达的miRNA调节剂。本发明的上下文中具体可想到的miRNA抑制剂有：antagomirs、miRCURY LNATM microRNA Knockdown Probes(Exiqon公司)以及Qiagen公司的miScript miRNA抑制剂。
本发明还涉及用于检测人角质形成细胞分化状态的试剂盒，包括：用于测定从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达的手段，以及可为所述miRNA或者miRNAs的表达提供一种参考水平的信息。
本发明上下文中特别优选的试剂盒是这样一种试剂盒：其中参考水平是所述miRNA或miRNAs在正在培养的未分化角质细胞中表达的平均水平。
可选地，根据本发明的试剂盒还可以与参考水平一起使用，该参考水平相当于在已分化的表皮细胞中所述miRNA或miRNAs表达的平均水平。
本发明所述的各种优选方式只是具体描述了某些方面，同样还适用于其它方面。尤其是，按照本发明中的方法、处理过程、试剂盒、组合物以及用途的提示，优选测定从本发明所列举的19种miRNAs中选出至少2种以上、更优选至少3种、5种、9种、10种、15种甚至全部19种本发明的miRNAs的表达水平，所述本发明的19种miRNAs为hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c。
具体实施方式
实验部分
材料和方法
人角质形成细胞的单层培养
正常人表皮角质形成细胞来源于乳房成形术，并且按照Rheinwald和Green’s方法在用丝裂霉素处理过的Swiss 3T3成纤维细胞营养层上进行常规培养。
再生皮肤
用正常人角质形成细胞和正常人皮肤成纤维细胞生产出包括具有角质层的已层化和已分化的表皮和活体等效真皮的体外再生皮肤。
简单地说，用牛胶原蛋白I和一百万人真皮成纤维细胞生产出等效真皮。正常角质形成细胞收缩成每格500000个角质形成细胞后进行移植，并在常规培养基中培养7天。然后将培养物载于滤膜(screen)上进入浮出阶段(emersion phase)(气-液界面，7天)。
在该阶段末期，皮肤的形态非常接近正常人皮肤。然后将培养基保持在皮肤下，通过毛细作用的滋养，可用于各项实验。
角质形成细胞总RNA的提取
细胞裂解：
将单层培养的角质形成细胞用TriReagent缓冲液于培养皿中裂解。
用镊子将来自于再生皮肤的再生表皮与等效真皮分离。用玻璃匀浆器在TriReagent缓冲液中将表皮手工研磨。
总RNA的提取
使用常规方法在异硫氰酸胍(guanidium isothiocyanate)溶液中裂解，然后使用苯酚/氯仿混合液进行抽提来提取总RNA。
在μParaflo TM “MiRHuman 10.0”芯片上进行miRNA杂交
将小片段RNA从总RNA(微过滤，Millipore)中分离，并使用polyA尾巴延伸3’末端。荧光标记的寡聚核苷酸连接于polyA尾巴。被标记的小片段RNA然后被杂交于μParafloTM“MiRHuman 10.0”芯片上(Atactic Technologies公司，LC Sciences)。它们包含了miRBase10.0数据库中所有人miRNAs的互补序列(711种成熟miRNAs)。使序列沉积于芯片5次。对荧光进行定量并校准信号。荧光数值可反映出样品中各miRNA的表达水平。
统计分析
用统计学方法Student t(p＜0.05)检验来比较“培养角质形成细胞”样品与“再生表皮角质形成细胞”样品之间各miRNA的表达。
实例1：与未分化的单层培养角质形成细胞相比，所列10种miRNA在已分化的再生表皮角质形成细胞中过表达。
本研究使用的是来源于乳房成形术的3个初级正常人角质形成细胞株(PH202、PH64以及PH63)。在单层培养角质形成细胞中，即未分化的角质形成细胞(2D)以及同时在再生表皮样品的这些相同角质形成细胞(3D)中，对所有已知的人miRNAs的表达进行定量。
用统计学的方法比较“培养中的角质形成细胞”样品与“再生表皮角质形成细胞”样品之间各miRNA的表达，并用可给出概率p的Student t检验来比较。对于所研究的各细胞株，表1中列出的各miRNA在表皮中的表达水平从统计学上讲是显著高于在未分化角质形成细胞中的表达水平(p＜0.05)。对于每个细胞株，给出了表达比值3D/2D。例如，在来源于再生表皮的角质形成细胞中的miR-141平均要比单层培养角质形成细胞中多2.3倍。
Table 1：相比于单层培养的角质形成细胞(2D)即未分化的角质形成细胞，miRNAs在再生表皮的角质形成细胞(3D)即已分化的角质形成细胞中过表达。
Figure BPA00001516453200221
实例2：所列9种miRNA在未分化的单层培养角质形成细胞中与在已分化的再生表皮角质形成细胞中相比过表达。
本研究使用的是来源于乳房成形术的3个初级正常人角质形成细胞株(PH202、PH64以及PH63)。在单层培养角质形成细胞中，即未分化的角质形成细胞(2D)以及同时在再生表皮样品的这些相同角质形成细胞(3D)中，对所有已知的人miRNAs的表达进行定量。用统计学的方法比较“培养的角质形成细胞”样品与“再生的表皮角质形成细胞”样品之间各miRNA的表达，并用可得到概率p的Student t检验来比较。对于所研究的各细胞株，表1中列出的各miRNA在表皮中的表达水平从统计学上讲高于在未分化角质形成细胞中的表达水平(p＜0.05)。对于每个细胞株给出了表达比值3D/2D。例如，在来源于单层培养角质形成细胞中的miR-29b平均要比在再生表皮的角质形成细胞中多6.7倍。
Table 2：miRNAs在单层培养的角质形成细胞(2D)即未分化的角质形成细胞中相比于在再生表皮的角质形成细胞(3D)即已分化的角质形成细胞中过表达。
Figure BPA00001516453200241
实例3：检测miRNAs的方法。
Northern Blot：
用常规方法进行定性及定量。可以在同一个实验中分析多个miRNAs。该方法要求使用5～50μg总RNA。
RT Q-PCR
该方法可以研究miRNAs的前体并且适用于研究成熟miRNAs。该方法为一种商用方法(Applied Biosystems公司的TaqMan MicroRNA Assays)，并在多篇文章中有描述[23]。
miRNA微阵列分析(Microarray)
该方法类似于常规mRNA的微阵列分析，是基于样品的miRNAs的互补cDNA的荧光标记，并将这些已标记的cDNA固定，在已经加载固定了miRNA序列的载玻片上进行杂交[25]。
有些作者认为，如果来源于miRBase数据库的miRNAs的新颖序列是完整的，则该miRNA微阵列技术对于分析miRNAs的全表达图谱是一种选择。
另外，对于本发明的某些情况，miRNAs的表达图谱要比信使RNA表达图谱得到的信息更多。
miRNAs的原位杂交
由于使用常规结合方法，该技术要比mRNA的常规原位杂交困难得多，短片段RNAs比长片段RNAs更易扩散且在杂交及洗涤过程中容易丢失。克服这些问题的技术已经诞生，另外，miRNA探针为市售品(Exiqon公司，丹麦)[27]。
miRNA报道转导基因
该技术中，GFP或LacZ报道基因被置于启动子的下游并包含miRNA的互补3’UTR部分。
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Figure IPA00001516452700011
Figure IPA00001516452700021
Figure IPA00001516452700031
Figure IPA00001516452700041

Claims (20)

1.一种用于测定人表皮样品中人角质形成细胞的表皮分化状态的方法，包括：
测定从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA在所述角质形成细胞中的表达水平；以及
将所选miRNA或miRNAs的表达水平与所选miRNA或miRNAs在培养中的未分化角质形成细胞中、或已分化的表皮角质形成细胞中的平均表达水平进行比较，所述角质形成细胞优选来源于相同细胞株或相同种群。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
若从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种miRNA的表达水平统计上地高于所述miRNA在处于培养中的未分化角质形成细胞中的平均表达水平，则认为所述角质形成细胞已经分化。
3.如权利要求1所述的方法，其中，
若从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达水平统计上地高于所述miRNA在已分化的表皮角质形成细胞中的平均表达水平，则认为所述角质形成细胞未分化。
4.一种评价人表皮样品中存在的表皮分化差异的方法，包括：比较在所述表皮的两层角质形成细胞之间的从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达水平。
5.如权利要求4所述的方法，其中，通过从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425和hsa-miR-92b中选出的至少1种miRNA的表达水平为较高的那一层中的表达水平相比于在另一层中的表达水平的系数大于1.3、优选大于1.5来表征两层之间的表皮分化的差异。
6.如权利要求4所述的方法，其中，通过从hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达水平为较高的那一层中的表达水平相比于另一层中的表达水平的系数大于1.3、优选大于1.5来表征两层之间的表皮分化的差异。
7.如权利要求1～7中之一所述的方法，其中，所述样品来源于人皮肤或“再生皮肤”型培养表皮。
8.一种测定表皮处理的效果的方法，包括比较在所述表皮的角质形成细胞中的从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA在处理前后的表达水平。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述处理包括通过应用射线或应用机械刺激来进行局部施用或分子注射。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，若可引起表皮中至少1种、优选至少2种或5种的所述miRNAs的表达水平发生变化，则认为所述处理是有效的。
11.一种筛选表皮中表皮分化过程的调节剂的方法，包括：采用如权利要求1～3中任一项所述的方法来评价在施用待筛选的调节剂之前和之后的所述表皮中角质形成细胞的表皮分化状态。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述调节剂是来源于天然提取物的化学个体、复合配方、DNA分子、miRNA、siRNA、miRNA抑制剂、antagomir或使用射线、优选可见光、紫外光、红外光或X射线的仪器系统。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中，若能引起表皮中至少2种、优选至少5种所述miRNAs的表达水平发生改变，则确认为调节剂。
14.一种诊断表皮状态的方法，包括：
使用如权利要求4～7中任一项所述一种方法，测定存在于所述表皮内的在基底层与角质层之间的表皮分化的差异；以及
将所述差异与存在于同型正常表皮中的在基底层与角质层之间的表皮分化的平均差异进行比较。
15.对人上皮样品内角质形成细胞中的从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达的分析的应用，用于测定所述角质形成细胞的表皮分化状态。
16.从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的miRNA、或者所述miRNAs中之一的抑制剂、优选antagomir用于治疗的应用，用来处理与表皮分化过程有关的皮肤病变例如牛皮癣、异位性皮炎、酒刺、鱼鳞病、鱼鳞病样红皮病、毛发红糠疹、毛发角化病、毛囊角化病、掌跖角化病以及汗孔角化病。
17.从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的miRNA、或所述miRNAs中之一的miRNA抑制剂、antagomir的用途，作为非病变人皮肤的化妆应用。
18.一种处理在非病理学化妆情形下与表皮分化有关的病变的方法，包括对个体皮肤局部施用从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的miRNA、或所述miRNAs中之一的miRNA抑制剂、优选所述miRNAs中之一的antagomir。
19.如权利要求18所述的方法，其中，在化妆情形下所述与表皮分化有关的病变包括：自然老化，光老化，疤痕，皮肤干燥或干燥症，或者化学品尤其是通过去角质试剂、剥落试剂、或脱脂试剂的侵袭，或者机械刺激。
20.一种用于测定人角质形成细胞的分化状态的试剂盒，包括：用于分析从hsa-miR-455-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-148a、hsa-miR-182、hsa-miR-224、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-92b、hsa-let-7i、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-663、hsa-miR-30a和hsa-miR-30c中选出的至少1种miRNA的表达的手段，以及可为所述miRNA或miRNAs的表达提供参考水平的信息。
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