JP2013503613A - 上皮分化マイクロrnaシグネチャーとその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
上皮分化の段階の形態的分析と生化学的マーカー(免疫組織化学)。この技術は、非常に一般的に(局所組織学)、又はマーカーによるマーカー(免疫組織化学)によって、分化における既知のタンパク質主働筋を、分析するためだけに使用され得る。肌の状態のシグネチャーを産生し得る。それは扱いにくく、調査におけるマーカーに特異的な抗体のような利用可能な特定のツールを有する必要とするが、必ずしもそうではない。更に、即時定量的な技術ではない;
トランスクリプトーム解析:この方法は健常又は疾患粗スキーの分子シグネチャーを得るために広く使用される。この技術は、サンプルのmRNA転写物の発現解析に基づく。それは、12000遺伝子までを含み得るDNAチップを使用し、非常に一般的であり得る。しかし、それは、特に高価な装置(アフィメトリクス(商標)システム)を必要とし、幾つかの欠点があるが、何よりもしばしば扱いが困難で、高性能のバイオインフォマティクスサービスによって処理しなければならない非常に膨大な量のデータを生じる;
プロテオーム解析:これは、組織に存在する全てのタンパク質の一般的な位置の広範囲の画像を提供する。それは複数の二次元電気泳動ゲル技術を使用し、したがって、非常に実行しづらい。更に、タンパク質の正確な同定は、補足の工程を必要とし、特殊技術と操作の専門性を要する非常に高価な装置を必要とする。
分化のマーカーとしてmiRNAを使用すること。メッセンジャーRNAと比較してそれらは非常に少数であることは、miRNAプロファイルが、慣例的な一般的なトランスクリプトーム方法よりもより単純、迅速及び安価に、位置について、又は組織について得ることができる;
上皮分化の障害に関連する良性又は深刻な疾患の治療の目的でモジュレータを同定するための上皮分化のmiRNA分子シグネチャーの使用。「モジュレータ」なる用語は、化学物質又は天然抽出物、複合体製剤、siRNA、antagomirのようなmiRNA阻害剤由来の物質だけでなく、光、皮膚における機械的効果、又は注射を用いた計測システムを意味する;
上皮分化又は増殖の疾患の美容又は治療的処置の目的でmiRNA又は前記miRNAのモジュレータの使用;
上皮分化の美容又は治療的処置の効果を評価するための前記miRNAシグネチャーの使用;
正常又は病的上皮の診断を実施するための上皮分化のmiRNA分子シグネチャーの使用
を提案する。
マイクロRNA(又はマイクロRnA又はmiRNA):マイクロRNAは、約20から25ヌクレオチド長、より一般的には21から24ヌクレオチドの一本差RNAである。miRNAは遺伝子からmRNA転写後に作用するリプレッサーであり:実際、メッセンジャーRNAと対になって、タンパク質への翻訳を阻害又は抑制する。
標的miRNAは次いでRISC複合体に搭載され、分解される。
hsa−miR−141:成熟miRNA:UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(配列番号N°1)
hsa−miR−148a:成熟miRNA:UCAGUGCACUACAGAACUUUGU(配列番号N°2)
hsa−miR−182:成熟miRNA:UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU(配列番号N°3)
hsa−miR−224:成熟miRNA:CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU(配列番号N°4)
hsa−miR−26a(hsa−miR−26a−1及びhsa−miR−26a−2):成熟miRNA:UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU(配列番号N°5)
hsa−miR−26b:成熟miRNA:UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU(配列番号N°6)
hsa−miR−361−5p:成熟miRNA:UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC(配列番号N°7)
hsa−miR−425:成熟miRNA:AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA(配列番号N°8)
hsa−miR−455−3p:成熟miRNA:GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC(配列番号N°9)
hsa−miR−92b:成熟miRNA:UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC(配列番号N°10)
hsa−let−7i:成熟miRNA:UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU(配列番号N°11)
hsa−miR−22:成熟miRNA:AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU(配列番号N°12)
hsa−miR−221:成熟miRNA:AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(配列番号N°13)
hsa−miR−222:成熟miRNA:AGCUACAUCUGGCUACUGGGU(配列番号N°14)
hsa−miR−29a:成熟miRNA:UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA(配列番号N°15)
hsa−miR−29b:成熟miRNA:UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU(配列番号N°16)
hsa−miR−663:成熟miRNA:AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC(配列番号N°17)
hsa−miR−30a:成熟miRNA:UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG(配列番号N°18)
hsa−miR−30c:成熟miRNA:UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC(配列番号N°19)
少なくとも1個、好ましくは少なくとも2、3、5又は全てのmiRNA hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425及びhsa−miR−92b、又はそれらの発現の増加を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータ;及び/又は場合によって、
miRNA hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cの1つを標的化する、例えば、antagomirのようなmiRNAの阻害剤、又はそれらの発現の抑制を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータを含む。
少なくとも1個、好ましくは少なくとも2、3、5又は全てのmiRNA hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30c、又はそれらの発現の増加を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータ;及び/又は場合によって、
miRNA hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425及びhsa−miR−92bの1つを標的化する、例えば、antagomirのようなmiRNAの阻害剤、又はそれらの発現の抑制を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータを含む。
少なくとも1個、好ましくは少なくとも2、3、5又は全てのmiRNA hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425及びhsa−miR−92b、又はそれらの発現の増加を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータ;及び/又は場合によって、
miRNA sa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cの阻害剤、又はそれらの発現の抑制を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータを含む。本発明の文脈でより具体的に想定されるmiRNAの阻害剤は、antagomir、miRCURY LNA(商標)マイクロRNAノックダウンプローブ(Exiqon)及びQiagenのmiScript miRNA阻害剤である。
少なくとも1個、好ましくは少なくとも2、3、5又は全てのmiRNA hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30c、又はそれらの発現の増加を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータ;及び/又は場合によって、
miRNA hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425及びhsa−miR−92bの阻害剤、又はそれらの発現の抑制を引き起こすこれらのmiRNAのモジュレータを含む。本発明の文脈でより具体的に想定されるmiRNAの阻害剤は、antagomir、miRCURY LNA(商標)マイクロRNAノックダウンプローブ(Exiqon)及びQiagenのmiScript miRNA阻害剤である。
ヒト角化細胞の単一層培養
正常ヒト上皮角化細胞は乳房形成に由来し、マイトマイシン処理したスイス3T3繊維芽細胞の栄養層で、Rheinwald及びGreenの方法を用いて慣例的に培養した。
角質層と生存等量表皮を伴う層化分化上皮を含むインビトロで再構築した皮膚は、正常ヒト角化細胞と正常ヒト皮膚繊維芽細胞と共に産生された。
細胞分解:
単一層培養における角化細胞は、TriReagentバッファーにおける培養皿において分解された。
再構築皮膚からの再構築上皮は、ピンセットを用いて同等の上皮から分離された。この上皮はTriReagent分解バッファーにおけるガラスホモジナイザーにおいて手動で砕いた。
全RNAをグアニジンイソチオシアネート溶液ついでフェノール/クロロホルム混合物を用いた抽出の慣例的な技術を用いて抽出した。
短鎖RNAを全RNA(マイクロコンフィルター、ミリポア)から抽出し、ポリA末端を有する3’末端で延長した。蛍光ラベル化オリゴヌクレオチドを、ポリA末端に付着させた。短鎖ラベル化RNAを次いでμParaflo(商標)「MiRHuman10.0」チップ(Atactic Technologies, LC Sciences)上でハイブリダイズさせた。それらは、miRBase10.0(711個の成熟miRNA)において記録されるヒトmiRNAの全ての相補的な配列を含んでいた。配列は、チップ上で5回沈着させた。蛍光を定量し、シグナルを正規化した。蛍光の量はサンプル中の各miRNAの発現レベルを反映していた。
各miRNAの発現は、スチューデントのt検定(p<0.05)を用いて、「培養角化細胞」サンプルと「再構築上皮角化細胞」の間で統計的に比較した。
ノザンブロット
この慣例的な技術は定性的及び定量的である。それは、1つの実験の間に幾つかのmiRNAを解析することができる。この方法は、5から50μgの全RNAの使用を要する。
この方法は、miRNAの前駆体を調査することができ、成熟miRNAを調査するために適用されている。それは商業的な方法であり(アプライド バイオシステムズ タックマン マイクロRNA アッセイ)幾つかの文献で記述されている[23]。
この方法は、慣例的なmRNAのマイクロアレイのもののように、サンプルのmiRNAの相補的なcDNAの蛍光ラベル、及び既知のmiRNA配列が置かれているスライド上のこれらのラベル化したcDNAのハイブリダイゼーションに基づく[25]。
この技術は、慣例的な結合方法を使用することで、短鎖RNAが長鎖RNAより拡散し、ハイブリダイゼーションと洗浄過程において紛失するため、慣例的なmRNAのインサイツハイブリダイゼーションよりも困難である。この問題を克服するために技術は開発されており;更に、miRNAプローブは、商業的に利用可能である(Exiqon、デンマーク)[27]。
この技術では、GFP又はLacZレポーター遺伝子は、miRNAの相補的な3’UTR部分を含むプロモーターのコントロール下に置かれた。
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Claims (20)
- ヒト上皮のサンプル中のヒト角化細胞の上皮分化の状態を決定するための方法であって、前記角化細胞中のhsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベルを決定し、選択されたmiRNAの発現レベルを、好ましくは同一の株又は同一の集団から得る、未分化角化細胞又は分化上皮角化細胞中で選択されたmiRNAの発現の平均レベルと比較することを含む方法。
- hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425及びhsa−miR−92bから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルが、培養中の未分化角化細胞中の前記RNAの発現の平均レベルよりも統計的に大きい場合、前記角化細胞は分化されたと考慮される、請求項1に記載の方法。
- hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルが、分化した上皮角化細胞中の前記miRNAの発現の平均レベルよりも統計的に大きい場合、前記角化細胞は未分化であると考慮される、請求項1に記載の方法。
- ヒト上皮のサンプル中に存在する上皮分化の差異を評価する方法であって、前記上皮の角化細胞の2層間で、hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを比較することを含む方法。
- 2層間の上皮分化の差異が、1.3よりも大きい、好ましくは1.5よりも大きい因子で、一方の層におけるhsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425及びhsa−miR−92bから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現が他方よりも大きいことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 2層間の上皮分化の差異が、1.3よりも大きい、好ましくは1.5よりも大きい因子で、一方の層におけるhsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現が他方よりも大きいことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記サンプルをヒト皮膚又は「再構築皮膚」型培養上皮から得る、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- 上皮治療の効能を決定するための方法であって、治療の前後で、前記上皮の角化細胞中のhsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択される少なくとも1つの発現レベルを比較することを含む方法。
- 前記治療が、放射線の適用によるか又は機械的効果の適用による、局所適用又は分子の注射からなる、請求項8に記載の方法。
- 上皮中の前記miRNAの少なくとも1つ、好ましくは、2又は5つのレベルの修正を引き起こす場合、前記治療は効果的であると考慮される、請求項8又は請求項9に記載の方法。
- 上皮中の上皮分化プロセスのモジュレータをスクリーニングするための方法であって、スクリーニングするモジュレータの適用前後に、請求項1から3の一項に記載の方法を用いて、前記上皮中の角化細胞の上皮分化の状態を評価することを含む方法。
- 前記モジュレータが、天然抽出物、複合体製剤、DNA分子、miRNA、siRNA、miRNA阻害剤、antagomir又は照射、好ましくは可視、UV、IR又はX照射を用いた計測システムから得る化学成分である、請求項11に記載の方法。
- 上皮中の前記miRNAの少なくとも2つ、好ましくは、5つのレベルの修正を引き起こす場合、モジュレータが同定される、請求項11又は請求項12に記載の方法。
- 請求項4から7の一項に記載の方法を用いて、基底層と角質層の間の前記上皮中に存在する上皮分化の差異を決定し;
それを、基底層と角質層の間の同一の型の正常上皮に存在する上皮分化の平均差異と比較することを含む、上皮の状態を診断するための方法。 - 角化細胞の上皮分化の状態を決定するための、ヒト上皮サンプル中の角化細胞における、hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現アッセイの使用。
- 乾癬、アトピー性皮膚炎、座瘡、魚鱗癬、ネザートン症候群、毛孔性紅色粃糠疹、毛状角化症、ダリエー病、掌蹠角皮症及び汗孔角化症のような、上皮分化プログラムに関連する皮膚病を治療するための治療的使用のための、hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択されるmiRNA、又は前記miRNAの1つの阻害剤、好ましくはantagomir。
- 非病理的なヒト皮膚への化粧品適用のための、hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a and hsa−miR−30cから選択されるmiRNA、又は前記miRNAの1つのmiRNA阻害剤、好ましくはantagomirの使用。
- hsa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択されるmiRNA、前記miRNAの1つのmiRNA阻害剤、好ましくは、前記miRNAの1つのantagomirの個体の皮膚への局所適用を含む、非病理的美容状況における上皮分化に関連する疾患の治療方法。
- 美容状況の上皮分化の前記疾患が、年齢、皮膚日射病、瘢痕化、皮膚乾燥若しくは硬化、又は、特に剥離剤、落屑剤、又は脱脂剤による化学物質負荷、又は機械的負荷を含む生理学的状態に関連する、請求項18に記載の方法。
- sa−miR−455−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−148a、hsa−miR−182、hsa−miR−224、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−361−5p、hsa−miR−425、hsa−miR−92b、hsa−let−7i、hsa−miR−22、hsa−miR−221、hsa−miR−222、hsa−miR−29a、hsa−miR−29b、hsa−miR−663、hsa−miR−30a及びhsa−miR−30cから選択される少なくとも1つのmiRNAの発現をアッセイするための手段を含む、ヒト角化細胞の分化の状態を決定するためのキット。
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