WO2014001734A2 - SIGNATURE microARN DE L'ETAT D'ACTIVATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE INNEE ET INFLAMMATOIRE EPIDERMIQUE ET UTILISATIONS - Google Patents

SIGNATURE microARN DE L'ETAT D'ACTIVATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE INNEE ET INFLAMMATOIRE EPIDERMIQUE ET UTILISATIONS Download PDF

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Definitions

  • the present invention is in the cosmetic field, it relates to the skin. It is more generally part of the characterization of the activation state of the innate and inflammatory epidermal immune response of a cultured skin or epithelium and the treatment of disorders, affections or related pathologies. to epidermal inflammation.
  • the epidermis is a pluristratified epithelium that exerts a protective barrier function against its environment and its aggressions. Among its many physiological functions, the epidermis has the ability to provide a barrier at the same time biological, physical and chemical against the invasion of the body by microorganisms.
  • the physical barrier properties of the epidermis are, in particular, related to its structural organization.
  • the epidermis is conventionally divided into a basal layer of keratinocytes constituting the germinal layer of the epidermis, a so-called spinous layer consisting of several layers of polyhedral cells and finally, a set of upper layers called horny layers (or stratum corneum), consisting of end-stage keratinocytes of their differentiation called corneocytes.
  • the chemical barrier properties of the epidermis depend, in particular, on the release on the surface of the latter of numerous antimicrobial proteins such as cathelicidines, dermcidin or proteins of the [beta] defensin family.
  • a dysfunction of the epidermal cell structural organization, or a defect in the chemical barrier function of the epidermis may result in an inflammatory skin condition.
  • Inflammation is one of the first responses of the immune system to infection, irritation, burning or injury. Inflammation is induced by chemical factors released by damaged cells and helps establish a barrier effective against the spread of possible infectious agents, and to initiate tissue repair processes after the elimination of pathogens.
  • Inflammation is induced by cells initially present in most tissues, such as macrophages, dendritic cells, histiocytes, Kupffer cells or mast cells. These cells express on their surface molecular pattern recognition receptors. These receptors recognize molecules, called molecular patterns associated with pathogens, which are expressed by microbial organisms, but distinct from the molecules of the body. At the onset of infection, burns, or tissue damage, the recognition of molecular patterns associated with pathogens by the molecular pattern recognition receptors expressed by these cells leads to their activation and secretion of different mediators responsible for the clinical signs of inflammation (pain, redness, warmth and swelling).
  • the chemical factors produced during inflammation increase the sensation of pain, locally induce vasodilatation of the blood vessels and the recruitment of phagocytes, especially neutrophils.
  • Neutrophils can also produce soluble factors that contribute to the mobilization of other leukocyte populations.
  • the cytokines produced by macrophages and other cells of the innate immune system are a relay of the immune response. These cytokines include TNFa, HMGB1, and interleukin-1.
  • -Transcriptomic analysis it is a method very used to obtain molecular signatures of a healthy or pathological tissue. This technique is based on the analysis of the expression of the transcripts AR m of a sample. It can be very global, with the use of microarrays that can hold up to 12,000 genes. However, it has certain drawbacks, in particular it requires expensive equipment (Affymetrix (TM) system type) but especially generates a very large amount of data often difficult to exploit that must be supported by a powerful bioinformatics service.
  • TM Affymetrix
  • an inflammatory skin condition can lead to numerous disorders or pathologies of the skin or the scalp, in connection with a microbial infection (in particular a bacterial infection such as atopic dermatitis or fungi, such as seborrheic dermatitis), or without a link with a microbial infection.
  • a microbial infection in particular a bacterial infection such as atopic dermatitis or fungi, such as seborrheic dermatitis
  • psoriasis, eczema or sensitivity and / or excessive reactivity of the skin.
  • the present invention aims to satisfy all of these needs.
  • the present inventors have demonstrated, in a perfectly unexpected manner, the existence of a microRNA signature of the innate and inflammatory epidermal immune response, allowing not only to characterize the inflammatory state of the skin, but also to consider various treatments. disorders related to the disturbance of this inflammatory state.
  • miRNAs The microRNAs (miRNAs) discovered since 1993 are small endogenous RNAs that are involved in RNA interference: they can target messenger RNAs (mRNAs) and generate their degradation or prevent their translation. These miRNAs therefore play very important regulatory roles in the cell. In addition, they constitute one of the most abundant classes of regulatory molecules. They have an endogenous origin, derived from pri-miRNA coded by the genome. To date, more than 1000 human microRNAs have been identified. Their functions and targets have not all been elucidated or demonstrated. They play a crucial role in the regulation of various cellular pathways and can be involved in human pathologies. MiRNAs play an important role in the regulation of development, differentiation, proliferation and apoptosis.
  • miR-17-5p and miR-20 are proliferation regulators
  • miR-223 is involved in granulopoiesis.
  • Deregulation of miRNA expression can contribute to human pathologies.
  • Some miRNAs work as tumor suppressors or others as oncogenes.
  • microRNAs as markers of the innate and inflammatory epidermal immune response. They allow by their number much less important than the messenger RNAs to make microRNA profiles of a situation, of a tissue, in a simpler, faster and less expensive way than the conventional global methods of transcriptomics; - to use the microRNA molecular signature of the innate and epidermal inflammatory immune response to identify modulators for the treatment of benign or more serious disorders associated with disorders of the innate and inflammatory epidermal immune response.
  • modulators are meant chemical entities or extracts of natural extracts, complex formulations, siRNAs, miRNA inhibitors such as antagomirs, but also instrumental systems using light, mechanical effects on the skin, injections;
  • miRNAs or modulators of these miRNAs for cosmetic or therapeutic treatments in the affections of epidermal inflammation
  • this signature miRNAs to evaluate the efficacy of a cosmetic or therapeutic treatment of the activation of the innate and inflammatory epidermal immune response; - to use the micro-RNA molecular signature of the innate and inflammatory epidermal immune response to perform a diagnosis of a normal or pathological epidemic;
  • microRNAs For this purpose, it is proposed to use the expression assay of certain identified microRNAs.
  • the inventors have shown that during the recognition process of a microorganism by specific molecular signs recognized by receptors of the TLR family, the human microRNAs miR-146, miR-203, miR-155 , miR-886-3p were overexpressed in epidermal keratinocytes stimulated by TLR2, TLR3 and TLR5 receptor-specific ligands, whereas miR-221, miR-365, miR-590-5p, miR-26b microRNAs, and let7 were under expressed in these same keratinocytes, as compared to keratinocytes that were not stimulated. These nine microRNAs therefore represent a molecular signature of the innate immune response.
  • the present invention thus relates to this microRNA signature of the innate immune response and various uses of this signature, in particular for evaluating or qualifying an activation state of the innate immune response and epidermal inflammation, as a new diagnostic tool for inflammation or physiological or pathological immune response, as a target for correcting a defect in epidermal immune response or as a biomarker and screening tool for testing agents modulating epidermal inflammation.
  • the present invention also relates to the use of microRNAs of this signature, or modulators of these microRNAs, in therapeutic and cosmetic applications, especially in the form of compositions.
  • MicroRNA or microRNA or miRNA
  • Single-stranded RNAs about 20 to 25 nucleotides long, more generally 21 to 24 nucleotides.
  • the miRNAs are repressors that act after the transcription of a gene into mRNA: indeed, by pairing with messenger RNAs, they guide their degradation, or the repression of their translation into protein.
  • the production of miRNAs is under tight control of transcriptional and post-transcriptional regulation.
  • the miRNA genes are transcribed by RNA polymerase II in the form of long primary transcripts or precursors called "pri-miRNA".
  • the precursor miRNAs are enzymatically cleaved into the cell nucleus by Class II RNase III (Drosha) to form the "pre-miRNAs".
  • the "pre-miRNA” is a long RNA of about 70 nucleotides, folded imperfect stem-loop by complementarity of bases between the first half and the second half of its sequence.
  • the pre-miRNAs are then exported to the cytoplasm where they bind to another nuclease (Dicer) and the RISC complex (RNA-induced silencing complex) which contains the transactivation-responsive RNA binding protein (TRBP) and Ago2 (Argonaute 2) proteins. ).
  • the Ago2 protein cleaves the 3 'ends of the miRNA precursor, thereby generating the mature miRNA duplex. Only the specific strand of the miRNA target mRNA is kept (thermodynamic reaction) within the complex, the other strand is removed and degraded. The target AR m is then loaded into the RISC complex and degraded.
  • Hsa-miRxx is meant according to the present invention the name of microRNAs identified in humans (hsa meaning homo sapiens).
  • the sequences of all known microRNAs are listed in databases such as miRBase or microRNAdb, where they are uniquely identified by their accession number (xx).
  • accession number xx
  • the hsa-miRxx number is used to refer to the mature miRNA sequence.
  • hsa-miR-146 mature miRNA: CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG (SEQ ID NO: 1)
  • hsa-miR-886-3p mature miRNA: CGGGUCGGAGUUAGCUCAAGCGG
  • hsa -miR-155 mature miRNA: UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU
  • hsa-miR-203 mature miRNA: GUG AAAUGUUUAGG AC C ACUAG
  • hsa-let-7 mature miRNA: UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU (SEQ ID # 5)
  • hsa-miR-221 mature miRNA: ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU (SEQ ID NO: 6)
  • hsa-miR-26b mature miRNA: UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU (SEQ ID NO: 1)
  • innate immune system is meant a system comprising cells and mechanisms for the defense of the body against infectious agents immediately, in contrast to the adaptive immune system that provides protection later but more durable. While the adaptive immune system exists only in gnathostomes, the innate immune system exists in all organisms of the plant and animal kingdom. The main functions of the innate immune system of vertebrates are: to constitute a physical and chemical barrier against infectious agents; detect infectious agents and induce the recruitment of immune cells at the site of the infection; to activate the complement cascade allowing the activation of the cells and the elimination of dead cells or immune complexes; the identification and elimination of foreign bodies present in the body, tissues, blood and lymph, by white blood cells; activation of adaptive immunity through antigen presentation.
  • Toll receptors or Toll-like receptors or TLRs
  • TLRs Toll-like receptors
  • Antagomir is meant according to the present invention a new class of oligonucleotides synthesized chemically. They are used to quench ("silencing") the action of endogenous microRNAs.
  • An antagomir is a small synthetic RNA that is perfectly complementary to a targeted microRNA, with one or more basic modifications (s) to inhibit Ago2 cleavage (other modifications are also often introduced in addition for the antagomir to be more resistant to degradation).
  • Antagomirs are frequently used to constitutively inhibit the activity of specific microRNAs. Numerous antagomirs have been published. All miRNAs are likely to be specifically inhibited by an antagomir.
  • miRNA inhibitors are, for example, miRCURY LNA (TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) or miScript miRNA inhibitors from Qiagen.
  • the present invention relates to a microRNA signature of the epidermal innate immune response, and therefore a signature representative of the epidermal inflammatory state.
  • the present invention more specifically relates to a method for determining the activation state of the innate and inflammatory immune response of a human keratinocyte within a human epithelium sample.
  • a method for determining the activation state of the innate and inflammatory immune response of a human keratinocyte within a human epithelium sample preferably comprises a step of determining the level of expression of at least one microRNA within said keratinocyte.
  • the present invention preferably relates to a method for determining the activation state of the innate and inflammatory immune response of a human keratinocyte in connection with infection or excessive colonization by fungus, more preferably with infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta.
  • the selected microRNA is from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p.
  • These 9 miRNAs are called microRNAs or miRNAs or miRNAs of the invention.
  • the level of expression of the microRNA (s) chosen is compared with the average level of expression of the microRNA (s) selected in unstimulated keratinocytes, preferably from the same strain or population.
  • the method comprises determining the level of at least two distinct microRNAs selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsamR-203, hsa-let-7. , hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p, and the comparison of these two levels with the corresponding average levels of the two microRNAs chosen from unstimulated keratinocytes, in particular in keratinocytes in culture that are not stimulated
  • the method may comprise determining the level of expression of a plurality of microRNAs among the 9 microRNAs of the invention, for example at least 3 at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8 or the 9 microRNAs of the invention and the comparison of the levels thus determined with the average expression levels of the corresponding microRNAs in unstimulated keratinocytes.
  • level of expression of a microRNA within unstimulated keratinocytes is meant the level of expression generally observed in this type of cells, preferably corresponding to the average of the level of expression determined within at least 5 different keratinocytes, representative of the population of keratinocytes in unstimulated culture. Preferably, it is the average of at least 10 measurements, or even 20 or 100 different measurements.
  • the unstimulated cultured keratinocytes are keratinocytes originating from the same strain or from the same population as the keratinocyte under study.
  • the keratinocyte under study is considered to be in a state of activation of the innate or stimulated immune response or in a state of inflammation, if the level of expression of at least one of the microRNAs selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, is statistically higher than the average level of expression of said microRNA in keratinocytes not stimulated.
  • the upper level is at least 10% higher than the average level, preferably at least 30% higher.
  • the level of expression of the microRNA (s) chosen is at least equal to one and a half times the average level of said microRNA (s), preferably it is greater than or equal to twice the average level of the microRNA (s). selected microRNAs.
  • the level of expression of at least one of the microRNAs selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 is statistically superior to all expression levels of said microRNA in all unstimulated cultured keratinocytes which have made it possible to obtain the average level of expression of said microRNA.
  • the average level of at least two microRNAs selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 is higher or lower than the average expression level of said miRNAs in unstimulated keratinocytes.
  • the average level of at least three microRNAs selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR- 203 is greater than the average expression level of said miRNAs in unstimulated keratinocytes.
  • the average level of hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 is greater than the level of mean expression of said miRNAs in unstimulated keratinocytes.
  • the keratinocyte under study is as in a state of activation of the innate or stimulated immune response or in a state of inflammation, if the level of expression of at least one of the microRNAs chosen from hsa mR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, preferably hsa-miR-146, is substantially identical to the level of expression of said microRNA in epidermal keratinocytes stimulated with specific ligands of TLR receptors.
  • substantially identical level is meant that the difference in level observed is statistically insignificant, for example it is lower than the existing uncertainty on the level measurement of expression of said microRNA.
  • the keratinocyte under study is as in a state of activation of the innate or stimulated immune response or in a state of inflammation, if the level of expression of at least one of the microRNAs selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, and hsa-miR-590-5p, is statistically higher than the level of expression of said microRNA in epidermal keratinocytes stimulated with specific TLR receptor ligands.
  • the average level of at least two microRNAs selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa- miR -590-5p is greater than the average expression level of said miRNAs in stimulated epidermal keratinocytes.
  • this is the case of at least 3, at least 4, even all the microRNAs in the list consisting of hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa -miR-365, and hsa-miR-590-5p.
  • the keratinocyte under study is as in a state of activation of the innate or stimulated immune response or in a state of inflammation, if the level of expression of at least one of the microRNAs chosen from hsa -let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p, is substantially identical to the level of expression of said microRNA in epidermal keratinocytes stimulated with ligands specific TLR receptors.
  • the sample of epithelium, skin or epidemic referred to may be from different sources, it may be a cultured epithelium, for example a reconstituted epithelium. type "reconstructed skin” or a sample obtained from an individual, for example from a biopsy. Said sample can therefore come from human skin.
  • the comparison of the level of expression of at least one of the microRNAs of the invention may be carried out between any two layers of the epithelium sample under study. If it is a sample of human skin, the comparison is preferably made between two layers of opposite keratinocytes, for example between the keratinocytes of the basal layer and those of the stratum corneum of the epithelium. It should be noted in this connection that recent studies indicate that comedocytes produce or contain microRNAs.
  • the comparison of the level of expression can also be carried out between two layers quite close to the sample, for example in order to highlight different activation states of the innate and inflammatory immune response of one layer compared to the other. layer of keratinocytes of the epithelium under study.
  • the present invention also relates to various applications of the characterization methods described above, and therefore various uses of the signature microRNAs demonstrated by the inventors, particularly as a tool for diagnosing inflammatory disorders, physiological or pathological, as a target for to correct an epidermal immune defect or as a biomarker and screening tool to test agents that modulate the epidermal immune response.
  • the invention therefore relates to a method for determining the effectiveness of a treatment carried out on an epithelium.
  • a method for determining the effectiveness of a treatment carried out on an epithelium includes comparing, before and after treatment, the microRNA signature of the immune response and the level of inflammation of the epithelium.
  • the method therefore comprises comparing the level of expression of at least one microRNA selected from hsa- miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7 , hsa-miR-221, hsa- miR-26b, hsa-miR-365, hsa-miR-590-5p within keratinocytes of this epithelium, before and after treatment.
  • the inventors have demonstrated the variation of the level of expression of these 9 microRNAs during the process of innate immune response taking place in the epidemic.
  • the modification of the level of expression of at least one of these microRNAs is therefore representative of a change in the state of inflammation in response to the treatment under test.
  • the modification of the level of expression means a significant modification from a statistical point of view, therefore of sufficient and reproducible intensity, observable on a significant number of keratinocytes representative of the helium epitope under study. .
  • the method for determining the effectiveness of a treatment applied to an epithelium within the meaning of the present invention may also comprise the comparison, before and after the test treatment, of the epidermal inflammation differential of this epithelium.
  • the difference in epidermal inflammation existing between two samples is thus determined before treatment, and the result obtained is compared with the differential activation of epidermal immune response existing between these two same samples after treatment. It is thus determined whether or not the tested treatment has modified the existing difference in terms of inflammation between these two samples, for example by reducing the difference in the state of inflammation between the two samples, that is to say by reducing the differences in expression levels of the microRNAs of the invention between the two samples, or by increasing the epidermal immune response differential.
  • the treated epithelium undergoes an infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta.
  • the treatment tested by this method may consist of any treatment.
  • it is the topical application of a molecule, by coating or by injection, preferably subcutaneously.
  • the applied molecule may be a single chemical entity or the combination or combination of different entities, it may be active ingredients, natural molecules, proteins, RNA, DNA, essential oil, d chemical entity derived from natural extracts, a complex formulation, a DNA molecule, a microRNA, a siRNA, a miRNA inhibitor, in particular an antagomir, etc. .
  • Particularly preferred molecules in the context of the test treatment according to the invention are, in particular, RNAs, in particular microRNAs, or molecules modifying the expression of natural microRNAs, such as miRNA inhibitors and in particular antagomirs.
  • the treatment in the sense of the present invention also includes the application of different mechanical effects.
  • the method of the invention is considered effective if it causes a change in the level of expression of at least one of the microRNAs of the invention within the epithelium under study.
  • said treatment is considered effective if it causes the modification of the level of expression of at least two, preferably at least three, preferably at least four, preferably at least five, preferably at least six, preferably at least seven, preferably at least 8, preferably all of said microRNAs within the epithelium.
  • the modifications generated on the level of expression of the microRNAs of the invention are not necessarily of identical amplitude for all microRNAs.
  • a test treatment will be considered effective if it causes a modification of the level of expression of at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, concomitantly with a modification of the level of expression in the opposite direction to the preceding one of at least one microRNA selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa- miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p.
  • an effective treatment within the meaning of the invention will for example result in an increase in the level of expression of at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa- miR-203, and, simultaneously, also decreasing the level of expression of at least one microRNA selected from hsa-let-7, hsa- miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa. -mir-590-5p.
  • the present invention therefore also provides a method for recommending a product by signaling its effect in a test protocol consisting of a determination method as described above.
  • the invention therefore also relates to a method for the promotion of a cosmetic product consisting in reporting an efficacy, action or property of said product demonstrated by at least one test operated as described above.
  • promotion of the product can be done by any communication channel. It may be made by the seller, directly on the point of sale, by radio and television, particularly in the context of commercials. It may also be done through the press, or through any other document, especially for advertising purposes (prospectus). It can also be done via the Internet, or any other appropriate computer network. It may also be made directly on the product, in particular on its packaging or on any explanatory note that may be associated with it.
  • the present invention also relates to various methods of screening molecules for their action on the process of activating the innate immune response and epidermal inflammation.
  • the invention relates to the screening of molecules for their action on the activation process of the innate immune response and epidermal inflammation in connection with infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization by Malassezia. , and more particularly Malassezia restricta.
  • the invention relates to a method for screening modulators of the process of the innate and inflammatory immune response in an epithelium comprising the evaluation of the epidermal inflammation state of keratinocytes in this epithelium, before and after application of the modulator to be screened.
  • screening methods may be carried out in vivo, or ex-vivo, or in vitro, for example on cultured epithelia or epithelium samples.
  • the evaluation of the epidermal inflammation state of keratinocytes in this epithelium is carried out by one of the methods according to the first aspect of the invention.
  • the epithelium referred to may be a cultured epithelium, for example a reconstituted epithelium, "reconstructed skin” type or a sample obtained from a human being, for example during a biopsy.
  • the epithelium to which reference is made has previously undergone infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta.
  • the invention also relates to a method for screening modulators of the process of the innate and inflammatory immune response in an epithelium, comprising the evaluation of the epidermal inflammation differential of this epithelium, before and after application of the modulator to screened.
  • the evaluation of the epidermal inflammation differential of keratinocytes in this epithelium is carried out by one of the methods according to the first aspect of the invention.
  • the modulator in question may be any chemical entity, for example derived from natural extracts or from synthesis, it may be a complex formulation, a DNA molecule, a microRNA, a siRNA or a miRNA inhibitor such as an antagomir for example. This list is of course not exhaustive.
  • the modulator may be an instrumental system using electromagnetic radiation, preferably visible, UV, IR or X-ray radiation, or a system using mechanical effects.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing the state of an epidemic, by virtue of the use of the microRNA signature demonstrated by the inventors.
  • a diagnostic method comprises the determination of the epidermal inflammation differential existing within this epidermis between the basal layer and the stratum corneum, and the comparison with the average epidermal inflammation differential existing within a normal epidermis of the same type. between the basal layer and the stratum corneum.
  • the determination of the epidermal inflammation differential is preferably carried out using the different methods according to the first aspect of the invention. It is preferably carried out on a skin epidermis sample to be diagnosed.
  • the epidermal inflammation possibly existing within this epidermis referred to is in connection with an infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization with Malassezia, and more particularly Malassezia restricta.
  • the average epidermal inflammation differential existing within a normal epidermis of the same type, between the basal layer and the stratum corneum, corresponds to an average value of several measurements carried out on several epidemics from subjects whose skin is healthy and same type as that of the epidemic to be diagnosed. By the same type, we mean comparable age, ethnicity and identical colors. It is an average value that corresponds to a "normal” or "healthy” state, free from any pathology or injury to the epidemic.
  • microRNA profile of the skin it is thus established the microRNA profile of the skin to be diagnosed and by comparison, it can be diagnosed possibly a Premature aging, photoaging or damage caused by solar radiation, aging or damage caused by stress, acne, or any other physiological or pathological disorder.
  • the present application also relates to the use of the expression assay of at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p, in keratinocytes within a sample of human epithelium for determining the activation state of the innate immune response and epidermal inflammation of said keratinocytes.
  • the activation of the innate immune response and epidermal inflammation possibly existing within this sample referred to is in connection with infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta.
  • this assay gives access to the microRNA signature of the inflammation and the activation state of the epidermal innate immune response.
  • it is carried out the assay of at least 2 distinct microRNAs among the 9 microRNAs of the invention, preferably at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
  • the assay of the 9 microRNAs of the invention for the determination of the activation state of the epidermal innate immune response and the inflammation of the keratinocytes under study is used.
  • the subject of the application is various uses, in cosmetics and in therapy, of at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR -203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa- miR-590-5p and / or at least one modulator of the expression of said microRNAs .
  • at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR -203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa- miR-590-5p and
  • the modulation of their level within keratinocytes is likely to influence epidermal inflammation. for example, to slow or accelerate it in order to slow or accelerate the inflammatory process in a preferred manner in connection with infection or excessive colonization by fungus, preferably excessive infection or colonization by Malassezia, and more especially Malassezia restricta.
  • the level modulation of the microRNAs of the invention within keratinocytes is most preferably carried out by introducing one or other of the microRNAs of the invention, in order to increase its level within the keratinocytes, in particular, the use of microRNAs to correct endogenous dysregulations of microRNAs.
  • the modulation can also be carried out by introducing a modulator of said microRNAs, preferably it is the introduction of at least one miRNA inhibitor, for example an antagomir, targeting one of the microRNAs of the invention in order to reduce its level within keratinocytes.
  • miRNA inhibitors that are particularly contemplated in the context of this invention include the miRCURY LNATM microRNA Knockdown Probes (Exiqon) and miScript miRNA inhibitors from Qiagen.
  • the invention relates to a microRNA selected from the 9 microRNAs of the invention, or a modulator of this microRNA for a therapeutic use for treating cutaneous pathologies associated with the epidermal inflammatory state, preferably in connection with infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta.
  • the invention relates to a microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 or a modulator of this microRNA resulting in a increased expression or a miRNA inhibitor, such as antagomirs, targeting at least one microRNA selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, and hsa-miR -590-5p or modulators of a microRNA selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p resulting in a repression of their expression.
  • a miRNA inhibitor such as antagomirs
  • Pathologies that are particularly considered in the context of this invention are atopic dermatitis, seboreal dermatitis, acne, ichthyoses, Netherton syndrome, pityriasis rubra pilaire, keratosis pilaris, Darier's disease, palmoplantar keratoderma, psoriasis and porokeratosis.
  • Pathologies that are particularly considered in the context of this invention are pathologies presenting an inflammatory state associated with a microbial condition, preferably atopic dermatitis and seborrheic dermatitis.
  • the invention relates to compositions comprising at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 and / or at least one modulator thereof.
  • miRNA inhibitor such as antagomirs
  • compositions according to the invention comprise at least two, preferably at least 3, preferably 4 microRNAs selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa- miR-203 and / or at least one modulator of at least two, preferably at least 3, preferably 4, of said microRNAs resulting in an increase in their expression and / or at least one miRNA inhibitor, such as antagomirs, targeting at least at least two, preferably at least 3, preferably at least 4, preferably 5 microRNAs selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, and hsa-miR- 590-5p and / or at least one modulator of at least two, of preferably at least 3, preferably at least 4, preferably 5 microRNAs selected from hsa-let-7, hsa-miR-886-3p
  • the invention relates to compositions comprising at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, for use in therapy, preferably for treating cutaneous pathologies associated with the activation state of the innate and inflammatory immune response of the skin, especially to treat psoriasis, atopic dermatitis, acne, ichthyoses, Netherton's syndrome, pityriasis rubra pilaris, keratosis pilaris, the disease of Darier, palmoplantar keratoderma and porokeratosis.
  • the therapeutic applications of the invention are in connection with an infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta.
  • the use according to the invention is for treating sebboreic dermatitis.
  • the invention also relates to compositions comprising, in addition to or instead of, the hsA-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 microRNA (s), at least one miRNA inhibitor. , such as an antagomir, targeting a microRNA selected from hsa- let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p, for use in the treatment of said pathologies.
  • miRNA inhibitor such as an antagomir, targeting a microRNA selected from hsa- let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p, for use in the treatment of said pathologies.
  • miRNA inhibitors particularly contemplated within the scope of this invention include miRCURY LNA (TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) and miScript miRNA inhibitors from Qiagen. At least two microRNA inhibitors can be selected, preferably 3, preferably 4, preferably 5 microRNAs from the list consisting of hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR- 365, and hsa-miR-590-5p.
  • composition or product for the mentioned therapeutic application therefore comprises:
  • miRNA inhibitors such as antagomirs, targeting at least one, and preferably at least 2, 3, 4 or all the hs-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR microRNAs; -26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p; and or
  • miRNA inhibitors within the scope of this invention include antagomirs, miRCURY LNA (TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) and miScript miRNA inhibitors from Qiagen.
  • the present invention it is preferable according to the present invention to reduce the innate immune response and epidermal inflammation, in some cases it is advantageous, conversely, to increase the activation of the innate immune response and the episermic inflammation. Indeed, it allows to increase the innate defenses of the host (especially via the production of antimicrobial peptides), which may be the goal when trying, for example, to fight against microbial attack.
  • composition or product for the therapeutic or cosmetic application mentioned therefore comprises:
  • miRNA inhibitors such as antagomirs, targeting at least one, and preferably at least 2, 3, or all of said microRNAs resulting in a repression of their expression;
  • compositions according to the invention for use in therapy are formulated with pharmaceutically acceptable excipients, for topical application or by ingestion.
  • the present invention also relates to the use of a microRNA selected from hsa- miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa- miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p, or a modulator of said microRNAs, targeting one of said microRNAs, for cosmetic applications on non-pathological human skin.
  • a microRNA selected from hsa- miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa- miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p,
  • microRNAs or compositions comprising said microRNAs, or modulators of said miRNAs, for example antagomirs.
  • microRNAs and their modulators are in fact capable of crossing the keratinocyte membrane and modifying the level of said microRNAs within the treated keratinocytes.
  • antagomirs because of their physicochemical nature, it is unlikely that they reach the deep layers of the skin, thus limiting their action to the epidemic.
  • the stability of microRNAs and their modulators, in particular antagomirs suggests that their action is transient, and the present invention therefore aims for uses in therapy or in cosmetics involving renewed applications on the skin to be treated.
  • the invention aims in particular at a method of treating disorders related to the activation of the innate immune response and epidermal inflammation in physiological, non-pathological cosmetic situations, preferably in connection with an infection or colonization.
  • excessively per fungus preferably an infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta
  • the microRNA is selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, in order to decrease the state of the immune response. innate and inflammatory state of the keratinocytes of the treated skin.
  • microRNAs can be chosen at least two microRNAs, preferably at least 3, preferably the 4 microRNAs from the list consisting of hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203. .
  • miRNA inhibitors are considered in the context of This invention includes Antagomirs, miRCURY LNA (TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) and miScript miRNA inhibitors from Qiagen.
  • Epidermal inflammation disorders in cosmetic situations are linked in particular to dermatoheliosis, scarring, cutaneous dryness of the elderly (senile xerosis), or chemical aggressions, especially by exfoliants, desquamating, delipidants, or mechanical aggression.
  • These disorders are not pathological and their treatment is not to be considered as a therapeutic treatment, but only a cosmetic treatment, the treatment of these disorders having the essential purpose of improving the appearance of the skin and the comfort of the person.
  • Healing disorders are defined as changes in epidermal differentiation with the process of healing and repair. Indeed, during the process of reepithelialization occurring after an injury, the entire repertoire of expression of epidermal proteins is modified. The complete repair is done in three phases, first a migration phase, then a proliferation phase and finally a differentiation phase.
  • the proliferation phase allows the recovery of the wound, it is followed by a process of epidermal neo-morphogenesis involving the actors of stratification and keratinocyte differentiation, which, in a healthy situation allows to reform a functional stratum corneum .
  • the disorders related to drought or xerosis are mainly due to the fact that dry skin is essentially characterized by a decrease in the lipid content of the epidemic and an alteration of the stratum corneum. Keratin 1 and 10 are decreased and keratin K5 and K14 increased. The expression level of fibaggrin is disturbed, as is that of involucrine.
  • the epidermal inflammation disorder in cosmetic situations is in connection with an infection or excessive colonization by fungus, preferably an infection or excessive colonization by Malassezia, and more particularly Malassezia restricta, and is characterized by a pellicular state of the scalp.
  • the present invention consists in particular in treating the aesthetic disorders of the films by the topical application to the skin of an individual of a microRNA according to the invention.
  • Excessive colonization in the context of a cosmetic anti-dandruff application is meant according to the present invention subjects for which Malassezia represents more than 46% of the scalp microflora and less than 83%, preferably about 74% ("Quantitative microbiology of the scalp in non-dandruff, dandruff, and seborrheic dermatitis, McGinley K. et al., The Journal of Investigational Dermatology, 64: 401-405, 1975).
  • Chemical aggressions in particular by exfoliants, desquamating, delipidants, and mechanical aggression are responsible for modifications of the epidermal homeostasis and induce an alteration of the barrier function ensured by the stratum corneum, and an epidermal inflammation.
  • the present invention is therefore also directed to cosmetic compositions or products comprising at least one of the microRNAs of the invention or comprising at least one modulator of the expression of one of the microRNAs of the invention.
  • These compositions or cosmetic products make it possible to correct or improve the appearance of the skin, its grain, its brightness, its imperfections or its microrelief, to improve skin tolerance, to reduce the sensitivity and reactivity of the skin.
  • a modulator of the expression of one of the microRNAs of the invention is an active agent causing the increase or the repression of the expression of one of said microRNAs.
  • Such an active modulator of the expression of one of the microRNAs is for example identified by the screening methods described above, or it may for example be an antagomir of a microRNA of the invention.
  • the cosmetic compositions or products according to the invention comprise at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa- miR-203 and / or at least one modulators of this microRNA resulting in an increase in their expression and / or at least one miRNA inhibitor, such as antagomirs, targeting at least one microRNA selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, and hsa-miR-590-5p and / or at least one modulator of a microRNA selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365 , and hsa-miR-590-5p resulting in a repression of their expression, for the aforementioned
  • compositions according to the invention comprise at least two, preferably at least 3, preferably 4 microRNAs selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa- miR-203 and / or at least one modulator of at least two, preferably at least 3, preferably 4, of said microRNAs resulting in an increase in their expression and / or at least one miRNA inhibitor, such as antagomirs, targeting at least at least two, preferably at least 3, preferably at least 4, preferably 5 microRNAs selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, and hsa-miR- 590-5p and / or at least one modulator of at least two, of preferably at least 3, preferably at least 4, preferably 5 microRNAs selected from hsa-let-7, hsa-miR-886-3p
  • the cosmetic product or composition in question may be in any galenical form, for example formulated in the form of milk, cream, gel, spray or soap, to be administered topically, or in an ingestible form for the oral route.
  • It may in particular be a combination of different actives, for example a combination of at least two microRNAs of the invention, or a microRNA of the invention and a microRNA modulator of the invention, or two modulators microRNAs of the invention. It can also be the combination of an asset and an instrument, in particular an instrument of the mechanical, light, electrical or electromagnetic treatment type.
  • the microRNAs and / or modulators of the microRNAs of the invention are used to reduce the inflammatory or aeration-like side effects of the skin barrier function of cosmetic active ingredients used in cosmetic compositions and products. such as coloring, straightening, shampoo, hydro-alcoholic lotion.
  • compositions or cosmetic products having inflammatory or aeration-like side effects of the skin barrier function may comprise one or more microRNAs and / or modulators of microRNAs of the invention.
  • compositions and cosmetic products may comprise at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 and / or at least one modulator of this microRNA resulting in an increase in their expression and / or at least one miRNA inhibitor, such as antagomirs, targeting at least one microRNA selected from hsa-let-7, hsa- miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR -365, and hsa-miR-590-5p and / or at least one modulators of a microRNA selected from hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, and hsa-miR-590-5p resulting in repression of their expression.
  • miRNA inhibitor such as antagomirs, targeting
  • microRNAs of the invention it is also envisaged specific cosmetic products for sensitive and / or reactive skin, by restoring a better quality, and this by reducing the epidermal inflammation and the innate immune response, thanks to microRNAs of the invention or modulators of said microRNAs .
  • Repairing products to improve the skin repair process during healing are also contemplated within the scope of this invention. It is also possible to formulate products for damaged skin, either in the context of specific procedures (post-peelings, post-lasers, ...) or in everyday situations, such as pollution, household, etc.
  • composition or product for the cosmetic application mentioned therefore comprises:
  • miRNA inhibitors within the scope of this invention include antagomirs, miRCURY LNATM microRNA Knockdown Probes (Exiqon) and miScript miRNA inhibitors from Qiagen.
  • the present invention also relates to a kit for determining the activation state of the innate and inflammatory immune response of a human keratinocyte, comprising a means for assaying the expression of at least one microRNA selected from hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, and hsa-miR-590-5p and the mention of a reference level for the expression of said microRNA (s).
  • a particularly preferred kit in the context of the present invention is a kit such that the reference level is the average level of expression of said microRNA or microRNAs in keratinocytes in non-stimulated culture.
  • FIG. 1 Expression level of miRNAs in keratinocytes treated or not with ligands specific for different TLR receptors (TLR2-Zymosan, TLR3-PolyI: C, TLR5- ⁇ Flagellin) for 6 or 24h under conditions of low or high calcium
  • FIG. 2 Expression level of mRNA of genes linked to the inflammatory response (IL-8, CCL20, TNF ⁇ and HBD2) in keratinocytes overexpressing a miRNA control (pre-) or miR146 (pre 146a), treated for 6 hours or 24h with a control medium (med) or zymosan (Zym).
  • the units in ordinates are Arbitrary Units (AU).
  • Normal human epidermal keratinocytes are derived from mammary plasty and are conventionally cultured according to the method of Rheinwald and Green, on a feeder layer of previously mitomycinated Swiss 3T3 fibroblasts.
  • In vitro reconstructed skin comprising a stratified and differentiated epidermis with corneal layers and a living equivalent dermis are made with normal human keratinocytes and normal human dermis fibroblasts.
  • equivalent dermas are made with bovine collagen I and one million human dermal fibroblasts.
  • Normal keratinocytes are inoculated after contraction of the lattices at 500,000 keratinocytes and cultured in the conventional medium for 7 days. The culture is then mounted on a grid for the emergence phase (air-liquid interface, 7 days).
  • the skins have a morphology very close to normal human skin. They can then be used for different experiments by maintaining the culture medium under the skin that is nourished by capillarity.
  • the keratinocytes in monolayer culture are lysed on a culture dish in the Tri Reagent buffer.
  • the reconstructed epidermis of the reconstructed skin is separated from the equivalent dermis using forceps. These skins are manually ground in glass pots, in lysis buffer Tri Reagent.
  • the total RNAs are extracted by the conventional lysis technique in solution of guanidium isothiocyanate and extraction with a phenol / chloroform mixture.
  • the small RNAs are extracted from the total RNAs (Microcon filter, Millipore) and are extended in 3 'with a polyA tail. A fluorescently labeled oligonucleotide is ligated to the polyA tail. The labeled small RNAs are then hybridized to [mu] [Rho] 3 [Gamma] 8 [iota] [Iota] [omicron] (TM) "MiRHuman 10.0" chips (Atactic)
  • TLR2-Zymosan, TLR3-PolyI: C, TLR5- ⁇ Flagellin TLR2-Zymosan, TLR3-PolyI: C, TLR5- ⁇ Flagellin
  • the values obtained from ⁇ array were normalized in comparison with a housekiping RNA U6, U44 and U48 and were retained miRNA for which a difference of expression> 1.8 was observed.
  • mRNA expression levels of the IL-8, CCL20, TNF? And HBD2 immune response markers were quantified by qPCR in keratinocytes overexpressing a miRNA control (pre-) or miR146 (prel46a), treated for 6h or 24h with a control medium (med) or zymosan (Zym). It is observed in FIG. 2 that the induction of the genes linked to the inflammatory response induced by zymosan is inhibited by the overexpression of miR146.
  • This classic technique is qualitative and quantitative. It allows the analysis of some miRNAs during an experiment. This method requires the use of 5 to 50 ⁇ s of total RNA.
  • This method is based on the fluorescent labeling of the complementary cDNAs of the miRNAs of a sample, and the hybridization of these labeled ANDc on a slide on which are previously deposited sequences of known miRNAs.
  • this miRNA microarray technology if it regularly integrates miRBase-derived miRNA sequences, would be the method of choice for miRNAs global expression profile analysis.
  • the miRNA expression profile is more informative than the expression profile of the messenger RNAs.
  • a reporter gene GFP or LacZ is placed under the control of a promoter including the 3'UTR complementary part of a miRNA.

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Abstract

La présente invention concerne une signature microARN de la réponse immunitaire innée et diverses utilisations de cette signature, notamment pour évaluer ou qualifier un état d'activation de la réponse immunitaire innée et de l'inflammation épidermique, comme nouvel outil de diagnostic de désordre de l'inflammation ou de la réponse immunitaire physiologique ou pathologique, comme cible pour corriger un défaut de réponse immunitaire épidermique ou comme biomarqueur et outil de screening pour tester des agents modulateurs de la l'inflammation épidermique. La présente invention concerne également l'utilisation de microARNs de cette signature, ou de modulateurs de ces microARNs, dans des applications thérapeutiques et cosmétiques, notamment sous forme de compositions.

Description

SIGNATURE microARN DE L'ETAT D'ACTIVATION DE LA REPONSE
IMMUNITAIRE INNEE ET INFLAMMATOIRE EPIDERMIQUE ET UTILISATIONS
La présente invention est dans le domaine cosmétique, elle est relative à la peau. Elle s'inscrit plus généralement dans le cadre de la caractérisation de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique d'une peau ou d'un épithélium de culture et du traitement de troubles, d'affections ou pathologies liées à l'inflammation épidermique.
L'épiderme est un épithélium pluristratifîé qui exerce une fonction barrière de protection contre son environnement et ses agressions. Parmi ses nombreuses fonctions physiologiques, l'épiderme possède celle de constituer une barrière à la fois biologique, physique et chimique contre l'invasion de l'organisme par les microorganismes.
Les propriétés de barrière physique de l'épiderme sont, notamment, liées à son organisation structurelle. Ainsi l'épiderme est conventionnellement divisé en une couche basale de kératinocytes constituant la couche germinative de l'épiderme, une couche dite épineuse constituée de plusieurs couches de cellules polyédriques et enfin, un ensemble de couches supérieures appelées couches cornées (ou stratum corneum), constituées de kératinocytes au stade terminal de leur différenciation appelés cornéocytes. Les propriétés de barrière chimique de l'épiderme dépendent, notamment, de la libération à la surface de ce dernier de nombreuses protéines antimicrobiennes telles que des cathélicidines, la dermcidine ou les protéines de la famille des [beta]- défensines. Un dysfonctionnement de l'organisation structurelle cellulaire épidermique, ou un défaut de la fonction barrière chimique de l'épiderme, peut se traduire par un état inflammatoire cutané.
L'inflammation est l'une des premières réponses du système immunitaire contre une infection, une irritation, une brûlure ou une blessure. L'inflammation est induite par des facteurs chimiques relargués par les cellules abîmées et permet d'établir une barrière efficace contre la dissémination d'éventuels agents infectieux, et d'initier les processus de réparation tissulaire après l'élimination des agents pathogènes.
L'inflammation est induite par les cellules initialement présentes dans la plupart des tissus, comme les macrophages, les cellules dendritiques, les histiocytes, les cellules de Kupffer ou les mastocytes. Ces cellules expriment à leur surface des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires. Ces récepteurs reconnaissent des molécules, appelées motifs moléculaires associés aux pathogènes, qui sont exprimées par les organismes microbiens, mais distinctes des molécules de l'organisme. Au début d'une infection, d'une brûlure, ou d'une altération des tissus, la reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes par les récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires exprimés par ces cellules conduit à leur activation et à la sécrétion de différents médiateurs responsables des signes cliniques de l'inflammation (douleur, rougeur, chaleur et gonflement).
Les facteurs chimiques produits durant l'inflammation (histamine, bradykinine, sérotonine, leucotrienes et prostaglandines) augmentent la sensation de douleur, induisent localement la vasodilatation des vaisseaux sanguins et le recrutement de phagocytes, en particulier les neutrophiles. Les neutrophiles peuvent également produire des facteurs solubles contribuant à la mobilisation d'autres populations de leucocytes. Les cytokines produites par les macrophages et les autres cellules du système immunitaire inné constituent un relai de la réponse immunitaire. On compte, parmi ces cytokines, le TNFa, HMGB1, et l'interleukine-1.
Afin de caractériser au mieux l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique d'une peau ou d'un épithélium de culture de type " peau reconstruite ", et de pouvoir évaluer des molécules pouvant moduler le processus de d'inflammation épidermique, les outils techniques disponibles à ce jour sont les suivants :
- Analyse morphologique et marqueurs biochimiques des stades d'inflammation épidermique. C'est une technique qui ne permet d'analyser, que soit très globalement (histologie topographique), soit marqueur par marqueur (immunohistochimie), les acteurs protéiques connus de l'inflammation. Elle ne permet pas d'avoir une signature de l'état de la peau. Elle est lourde et nécessite de disposer de certains outils comme des anticorps qui soient spécifiques de marqueurs recherchés, ce qui n'est pas toujours le cas. D'autre part, c'est une technique difficilement quantitative.
-Analyse transcriptomique : c'est une méthode très utilisée pour obtenir des signatures moléculaires d'un tissu sain ou pathologique. Cette technique est basée sur l'analyse de l'expression des transcrits AR m d'un échantillon. Elle peut être très globale, avec l'utilisation des puces à ADN qui peuvent contenir jusqu'à 12 000 gènes. Cependant elle présente certains inconvénients, notamment elle nécessite des appareillages coûteux (type système Affymétrix(TM)) mais surtout génère une quantité de données très importante souvent difficilement exploitables qu'il faut prendre en charge par un service de bio informatique performant.
- Analyse protéomique : elle permet de faire un état des lieux global de l'ensemble des protéines présentes dans un tissu. Elle utilise encore beaucoup les techniques de gels d'électrophorèse bi-dimensionnelle et est donc très lourde à mettre en oeuvre. De plus l'identification précise des protéines nécessite des étapes supplémentaires et des appareils très coûteux et requérant une expertise particulière.
II existe donc un besoin d'une méthode permettant facilement et rapidement de caractériser l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique d'une peau ou d'un épithélium de culture.
A ce jour, on ne dispose que de peu de marqueurs biologiques permettant de déterminer efficacement et précisément l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique de la peau, et notamment de relier un trouble cutané ou du cuir chevelu à un tel état inflammatoire de l'épidémie.
Ainsi, il existe un besoin de disposer de marqueurs biologiques permettant de caractériser précisément un état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique de la peau.il existe également un besoin de disposer d'un marqueur biologique qui puisse être utilisé de manière fiable dans un procédé de diagnostic d'un trouble cutané ou du cuir chevelu lié à l'activation de la réponse immunitaire innée et l'état d'inflammation épidermique.
En outre, un état inflammatoire cutané peut entraîner de nombreux troubles ou pathologies cutanés ou du cuir chevelu, en liaison avec une infection microbienne (en particulier bactérienne comme les dermatites atopiques ou par champignons comme les dermatites séborrhéiques), ou sans liaison avec une infection microbienne comme le psoriasis, l'eczéma, ou encore une sensibilité et/ou une réactivité exagérée de la peau.
Dans les cas des affections légères, des émollients et des kératolytiques sont préconisés. Ces traitements ont pour but de rendre les lésions tolérables pour le malade et ils n'ont souvent qu'un effet suspensif.
Pour les affections plus sévères, ce sont des anti-inflammatoires ou des corticoïdes susceptibles de réguler l'inflammation des kératinocytes, qui sont utilisés depuis plusieurs années. Tous ces traitements ont des effets secondaires importants, très lourds pour les patients.
Du fait des effets secondaires importants des traitements existants précités pour les troubles cutanés ou du cuir chevelu résultant de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique de la peau, il existe également un besoin de disposer de nouveaux actifs cosmétiques ou thérapeutiques et de nouvelles compositions cosmétiques ou thérapeutiques utilisables pour le traitement desdits troubles cutanés ou du cuir chevelu.
Il existe également un besoin de disposer de nouveaux outils de criblage de molécules susceptibles d'exercer une action cosmétique ou thérapeutique sur l'épidémie ou les matières kératiniques en général. Au sens de l'invention, on entend désigner par
"épidémie" aussi bien la peau que le cuir chevelu.
La présente invention a pour objet de satisfaire à l'ensemble de ces besoins. Les présents inventeurs ont mis en évidence, de manière parfaitement inattendue, l'existence d'une signature microARN de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique, permettant non seulement de caractériser l'état inflammatoire de la peau, mais également d'envisager divers traitements des troubles liés au dérèglement de cet état inflammatoire.
Les microARNs (miRNAs) découverts depuis 1993 sont des petits ARNs endogènes qui sont impliqués dans l'interférence par ARN : ils peuvent cibler des ARN messagers (ARNm) et générer leur dégradation ou empêcher leur traduction. Ces miRNAs jouent donc des rôles de régulation très importants dans la cellule. De plus, ils constituent une des classes de molécules régulatrices les plus abondantes. Ils ont une origine endogène, issus de pri-miRNA codés par le génome. A ce jour, plus de 1000 microARN humains ont été identifiés. Leurs fonctions et leurs cibles n'ont pas toutes été élucidées ou démontrés. Ils jouent un rôle crucial dans la régulation de diverses voies cellulaires et peuvent être impliqués dans des pathologies humaines. Les miRNAs ont un rôle primordial dans la régulation du développement, de la différenciation, de la prolifération et de l'apoptose. Par exemple chez l'homme, miR-17-5p et miR-20 sont des régulateurs de la prolifération, miR-223 est impliqué dans la granulopoïèse. La dérégulation de l'expression des miRNA peut contribuer à des pathologies humaines. Certains miRNAs fonctionnent comme des suppresseurs de tumeurs ou d'autres comme des oncogènes. A l'heure actuelle, il existe très peu d'études sur les microARN dans la peau, et tout particulièrement dans la peau humaine.
Dans la mesure où, pour chaque microARN, il existe plusieurs dizaines de gènes cibles, les présents inventeurs proposent :
- d'utiliser les microARNs comme marqueurs de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique. Ils permettent de part leur nombre beaucoup moins important que les ARN messagers de réaliser des profils microARN d'une situation, d'un tissu, de manière plus simple, plus rapide et moins coûteuse que les méthodes classiques globales de transcriptomique ; - d'utiliser la signature moléculaire micro ARN de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique pour identifier des modulateurs en vue de traitements des affections bénignes ou plus graves associées à des désordres de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique. Par modulateurs il faut entendre des entités chimiques ou issues d'extraits naturels, des formulations complexes, des siRNA, des inhibiteurs de miRNAs tels que des antagomirs, mais aussi des systèmes instrumentaux utilisant la lumière, des effets mécaniques sur la peau, des injections ;
- d'utiliser les miRNAs ou des modulateurs de ces miRNAs en vue de traitements cosmétiques ou thérapeutiques dans les affections de l'inflammation épidermique ;
-d'utiliser cette signature miRNAs pour évaluer l'efficacité d'un traitement cosmétique ou thérapeutique de l'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique; - d'utiliser la signature moléculaire micro ARN de la réponse immunitaire innée et inflammatoire épidermique pour effectuer un diagnostic d'un épidémie normal ou pathologique ;
A cet effet, il est proposé d'utiliser le dosage de l'expression de certains microARNs identifiés. En effet, de manière étonnante, les inventeurs ont montré que lors du processus de reconnaissance d'un microorganisme par des signes moléculaires spécifiques reconnus par des récepteurs de la famille des TLR, les microARNs humains miR-146, miR-203, miR-155, miR-886-3p étaient surexprimés dans des kératinocytes d'épiderme stimulés par des ligands spécifiques des récepteurs TLR2, TLR3 et TLR5, alors que les microARNs miR-221, miR-365, miR-590-5p, , miR-26b, et let7 étaient sous exprimés dans ces mêmes kératinocytes, par rapport à des kératinocytes n'ayant pas été stimulés. Ces neuf microARNs représentent donc une signature moléculaire de la réponse immunitaire innée.
La présente invention concerne donc cette signature microARN de la réponse immunitaire innée et diverses utilisations de cette signature, notamment pour évaluer ou qualifier un état d'activation de la réponse immunitaire innée et de l'inflammation épidermique, comme nouvel outil de diagnostic de désordre de l'inflammation ou de la réponse immunitaire physiologique ou pathologique, comme cible pour corriger un défaut de réponse immunitaire épidermique ou comme biomarqueur et outil de screening pour tester des agents modulateurs de la l'inflammation épidermique. La présente invention concerne également l'utilisation de microARNs de cette signature, ou de modulateurs de ces microARNs, dans des applications thérapeutiques et cosmétiques, notamment sous forme de compositions.
Par MicroARN (ou micro ARN ou miRNA) on entend selon la présente invention des ARN simple-brin, longs d'environ 20 à 25 nucléotides, plus généralement de 21 à 24 nucléotides. Les miRNAs sont des répresseurs qui agissent après la transcription d'un gène en ARNm : en effet, en s'appariant à des ARN messagers, ils guident leur dégradation, ou la répression de leur traduction en protéine. La production de miRNAs est sous le contrôle étroit d'une régulation transcriptionnelle et post- transcriptionnelle. Les gènes de miRNA sont transcrits par l'ARN polymérase II sous la forme de longs transcrits primaires ou précurseurs appelés " pri-miRNA ". Les miRNAs précurseurs sont clivés par voie enzymatique dans le noyau de la cellule par une ARNase III de classe 2 (Drosha), pour former les " pre-miRNA ". Le " pre-miRNA " est un ARN long d'environ 70 nucléotides, replié en tige-boucle imparfaite par complémentarité de bases entre la première moitié et la deuxième moitié de sa séquence. Les pre-miRNAs sont ensuite exportés vers le cytoplasme où ils se lient à une autre nucléase (Dicer) et au complexe RISC (RNA-induced silencing complex) qui contient les protéines TRBP (transactivation-responsive RNA binding protein) et Ago2 (Argonaute 2). Du fait de la liaison, la protéine Ago2 clive les extrémités 3' du précurseur miRNA, générant ainsi le duplex miRNA mature. Seul le brin spécifique de l'ARNm cible du miRNA est gardé (réaction thermodynamique) au sein du complexe, l'autre brin est enlevé et dégradé. L'AR m cible est alors chargé au sein du complexe RISC et dégradé.
Bien que la répression traductionnelle soit la voie d'extinction (" silencing ") la plus observée dans les cellules animales, de récentes études montrent que les miRNAs peuvent également affecter le taux dARNm cible.
Par Hsa-miRxx on entend selon la présente invention la dénomination des microARNs identifiés chez l'homme (hsa signifiant homo sapiens). Les séquences de tous les microARNs connus sont répertoriées dans des bases telles que miRBase ou microRNAdb, où ils sont identifiés de manière unique par leur numéro d'accession (xx). Dans ce qui suit, le numéro hsa-miRxx est utilisé pour faire référence à la séquence miARN mature.
En particulier, les microARNs ci-dessous ont la séquence suivante : hsa-miR-146 : miRNA mature : CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG (SEQ ID N°l) hsa-miR-886-3p : miRNA mature : CGGGUCGGAGUUAGCUCAAGCGG (SEQ ID N°2) hsa-miR-155 : miRNA mature : UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU (SEQ ID N°3) hsa-miR-203 : miRNA mature : GUG AAAUGUUUAGG AC C ACUAG (SEQ ID N°4) hsa-let-7: miRNA mature : UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU (SEQ ID N°5) hsa-miR-221 : miRNA mature : ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU (SEQ ID N°6) hsa-miR-26b : miRNA mature : UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU (SEQ ID N°7) hsa-miR-365a : miRNA mature : AGGGACUUUUGGGGGCAGAUGUG (SEQ ID N°8) hsa-miR-590-5p : miRNA mature : GAGCUUAUUCAUAAAAGUGCAG (SEQ ID Le suffixe 'hsa' a parfois été omis dans le cadre de cette description, il s'agit toutefois de désigner ces mêmes 9 microARNs, décrits ci-dessus.
Par système immunitaire inné on entend un système comprenant les cellules et les mécanismes permettant la défense de l'organisme contre les agents infectieux de façon immédiate, à l'inverse du système immunitaire adaptatif qui confère une protection plus tardive mais plus durable. Alors que le système immunitaire adaptatif existe uniquement chez les gnathostomes, le système immunitaire inné existe dans tous les organismes du règne végétal et animal. Les principales fonctions du système immunitaire inné des vertébrés sont : de constituer une barrière physique et chimique contre les agents infectieux ; de détecter les agents infectieux et d'induire le recrutement de cellules immunitaires sur le site de l'infection ; d'activer la cascade du complément permettant l'activation des cellules et l'élimination de cellules mortes ou de complexes immuns ; l'identification et l'élimination de corps étrangers présents dans l'organisme, les tissus, le sang et la lymphe, par les globules blancs ; l'activation de l'immunité adaptative à travers la présentation antigénique. Les récepteurs de type Toll (ou Toll-like receptors ou TLR) appartiennent à la famille des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires. En tant que tels, ils interviennent au cours des mécanismes de l'immunité innée en reconnaissant des « motifs moléculaires conservés » chez de nombreux pathogènes. Ces motifs moléculaires associés aux pathogènes sont d'origines très diverses (bactérie, virus, parasite) et de natures variées (protéine, ose, acide nucléique).
Par Antagomir on entend selon la présente invention une nouvelle classe d'oligonucléotides synthétisés chimiquement. Ils sont utilisés pour éteindre (" silencing ") l'action des microARNs endogènes. Un antagomir est un petit ARN synthétique qui est parfaitement complémentaire à un microARN ciblé, avec une ou des modifïcation(s) de base pour inhiber le clivage par Ago2 (d'autres modifications sont également souvent introduites en plus pour que l'antagomir soit plus résistant à la dégradation). Les antagomirs sont utilisés de manière fréquente pour inhiber de façon constitutive l'activité de microARNs spécifiques. De très nombreux antagomirs ont été publiés. Tous les miRNAs sont susceptibles d'être inhibés spécifiquement par un antagomir. Seule l'information de la séquence du microARN ciblé est nécessaire pour l'élaboration d'un antagomir capable d'inhiber l'activité dudit microARN ciblé. D'autres inhibiteurs de miRNAs sont par exemple des miRCURY LNA(TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) ou des miScript miRNA inhibitors de Qiagen.
La présente invention concerne une signature microARN de la réponse immunitaire innée épidermique, et donc une signature représentative de l'état inflammatoire épidermique.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne plus spécifiquement une méthode de détermination de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire d'un kératinocyte humain au sein d'un échantillon d'épithélium humain. Une telle méthode comprend de préférence une étape de détermination du niveau d'expression d'au moins un microARN au sein dudit kératinocyte.
Selon la présente invention, la présente invention concerne de manière préférée une méthode de détermination de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire d'un kératinocyte humain en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière encore préférée avec une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
Selon la présente invention, le microARN choisi l'est parmi hsa-miR-146, hsa-miR- 886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR- 365, et hsa-miR-590-5p. Ces 9 miARNs sont appelés microARNs ou miRNAs ou miARNs de l'invention.
Le niveau d'expression du ou des microARN choisi(s) est comparé au niveau d'expression moyen du ou des microARN choisis dans des kératinocytes non stimulés, de préférence provenant de la même souche ou de la même population.
Les méthodes de détection et de quantification des miRNAs sont multiples et bien connues de l'homme du métier. L'exemple 3 détaille les techniques les plus utilisées.
De préférence, la méthode comprend la détermination du niveau d'au moins deux microARNs distincts choisis parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa- miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p, et la comparaison de ces deux niveaux aux niveaux moyens correspondants des deux microARNs choisis dans des kératinocytes non stimulés, notamment dans des kératinocytes en culture non stimulés
Alternativement, la méthode peut comprendre la détermination du niveau d'expression de plusieurs microARNs parmi les 9 microARNs de l'invention, par exemple au moins 3 au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8 ou les 9 microARNs de l'invention et la comparaison des niveaux ainsi déterminés avec les niveaux d'expression moyens des microARNs correspondants dans des kératinocytes non stimulés.
Par niveau moyen d'expression d'un microARN au sein de kératinocytes non stimulés, on entend le niveau d'expression généralement observé dans ce type de cellules, de préférence correspondant à la moyenne du niveau d'expression déterminé au sein d'au moins 5 kératinocytes différents, représentatifs de la population de kératinocytes en culture non stimulée. De préférence, il s'agit de la moyenne d'au moins 10 mesures, voire 20 ou 100 mesures différentes. De préférence, les kératinocytes en culture non stimulés sont des kératinocytes provenant de la même souche ou de la même population que le kératinocyte sous étude.
Dans le cadre de la mise en oeuvre de la méthode telle que mentionnée plus haut, le kératinocyte sous étude est considéré comme sous état d'activation de la réponse immunitaire innée ou stimulé ou en état d'inflammation, si le niveau d'expression d'au moins l'un des microARNs choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, est statistiquement supérieur au niveau d'expression moyen dudit microARN dans des kératinocytes non stimulés.
Par niveau statistiquement supérieur, on entend que la différence observée est significative d'un point de vue statistique, notamment qu'elle est supérieure à l'écart- type. Une valeur est dite statistiquement supérieure à une autre si la différence entre les deux valeurs est plus importante que l'incertitude existant sur les mesures. De préférence, le niveau supérieur est au moins supérieur de 10% au niveau moyen, de préférence, il est au moins supérieur de 30%. Selon des mises en oeuvre particulièrement préférées, le niveau d'expression du ou des microARNs choisis est au moins égal à une fois et demi le niveau moyen du ou desdits microARNs, de préférence il est supérieur ou égal à deux fois le niveau moyen du ou des microARNs choisis.
De préférence, le niveau d'expression d'au moins l'un des microARNs choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, est statistiquement supérieur à tous les niveaux d'expression dudit microARN dans tous les kératinocytes en culture non stimulés ayant permis d'obtenir le niveau moyen d'expression dudit microARN.
Selon une mise en œuvre préférée de la méthode de l'invention, le niveau moyen d'au moins deux microARNs choisis parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 est supérieur ou inférieur au niveau d'expression moyen desdits miRNAs dans des kératinocytes non stimulés. Selon une mise en œuvre encore préférée de la méthode de l'invention, le niveau moyen d'au moins trois microARNs choisis parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR- 155, hsa-miR-203 est supérieur au niveau d'expression moyen desdits miRNAs dans des kératinocytes non stimulés.
Selon une mise en œuvre encore préférée de la méthode de l'invention, le niveau moyen de hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 est supérieur au niveau d'expression moyen desdits miRNAs dans des kératinocytes non stimulés.
Alternativement, on pourra également conclure que le kératinocyte sous étude est comme sous état d'activation de la réponse immunitaire innée ou stimulé ou en état d'inflammation, si le niveau d'expression d'au moins l'un des microARNs choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, de préférence hsa-miR-146, est sensiblement identique au niveau d'expression dudit microARN dans des kératinocytes épidermiques stimulés avec des ligands spécifiques de récepteurs TLR. Par niveau sensiblement identique, on entend que la différence de niveau observée n'est statistiquement pas significative, par exemple elle est inférieure à l'incertitude existant sur la mesure de niveau d'expression dudit microARN.
A l'inverse, dans le cadre de la mise en oeuvre de la méthode de l'invention, il sera considéré que le kératinocyte sous étude est comme sous état d'activation de la réponse immunitaire innée ou stimulé ou en état d'inflammation, si le niveau d'expression d'au moins l'un des microARNs choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p, est statistiquement supérieur au niveau d'expression dudit microARN dans des kératinocytes épidermiques stimulés avec des ligands spécifiques de récepteurs TLR.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le niveau moyen d'au moins deux microARNs choisis parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa- miR-590-5p, est supérieur au niveau d'expression moyen desdits miRNAs dans des kératinocytes épidermiques stimulé. De préférence, c'est le cas d'au moins 3, d'au moins 4, voire l'intégralité des microARNs de la liste consistant en hsa-let-7, hsa-miR-221 , hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p.
Alternativement, on pourra également conclure que le kératinocyte sous étude est comme sous état d'activation de la réponse immunitaire innée ou stimulé ou en état d'inflammation, si le niveau d'expression d'au moins l'un des microARNs choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p, est sensiblement identique au niveau d'expression dudit microARN dans des kératinocytes épidermiques stimulés avec des ligands spécifiques de récepteurs TLR. De préférence, c'est le cas d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4 ou l'intégralité des microARNs choisis parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p. Par niveau sensiblement identique, on entend que la différence de niveau observée n'est statistiquement pas significative, par exemple elle est inférieure à l'incertitude existant sur la mesure de niveau d'expression dudit microARN. Dans le cadre de la présente invention, l'échantillon d'épithélium, de peau ou d' épidémie dont il est question peut être de différentes sources, il peut s'agir aussi bien d'un épithélium de culture, par exemple un épithélium reconstitué, type " peau reconstruite " ou bien d'un échantillon obtenu d'un individu, par exemple à partir d'une biopsie. Ledit échantillon peut donc provenir d'une peau humaine.
La comparaison du niveau d'expression d'au moins un des microARNs de l'invention peut être réalisée entre deux couches quelconques de l'échantillon d'épithélium sous étude. S'il s'agit d'un échantillon de peau humaine, la comparaison est de préférence opérée entre deux couches de kératinocytes opposées, par exemple entre les kératinocytes de la couche basale et ceux de la couche cornée de l'épithélium. Il est à noter à ce propos que des études récentes indiquent en effet que les coméocytes produisent ou contiennent des microARNs.
La comparaison du niveau d'expression peut également être réalisée entre deux couches assez proches de l'échantillon, par exemple afin de mettre en évidence différents état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire d'une couche par rapport à l'autre couche de kératinocytes de l'épithélium sous étude.
La présente invention concerne également diverses applications des méthodes de caractérisation décrites ci-dessus, et donc diverses utilisations de la signature microARNs mise en évidence par les inventeurs, notamment comme outil de diagnostic de désordres de l'inflammation, physiologiques ou pathologiques, comme cible pour corriger un défaut de réponse immunitaire épidermique ou comme biomarqueur et outil de screening pour tester des agents modulateurs de la réponse immunitaire épidermique.
Selon un second aspect, l'invention concerne donc un procédé de détermination de l'efficacité d'un traitement effectué sur un épithélium. Un tel procédé comprend la comparaison, avant et après traitement, de la signature microARN de la réponse immunitaire et du niveau d'inflammation de l'épithélium. Le procédé comprend donc la comparaison du niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa- miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa- miR-26b, hsa-miR-365, hsa-miR-590-5p au sein de kératinocytes de cet épithélium, avant et après traitement. En effet, les inventeurs ont mis en évidence la variation du niveau d'expression de ces 9 microARNs au cours du processus de réponse immunitaire innée se déroulant dans l'épidémie. La modification du niveau d'expression d'au moins l'un de ces microARNs est donc représentative d'une modification de l'état d'inflammation en réponse au traitement testé. Une nouvelle fois, la modification du niveau d'expression s'entend d'une modification significative d'un point de vue statistique, donc d'intensité suffisante et reproductible, observable sur un nombre conséquent de kératinocytes représentatifs de l'épit hélium sous étude.
Alternativement, le procédé de détermination de l'efficacité d'un traitement appliqué sur un épithélium au sens de la présente invention peut également comprendre la comparaison, avant et après le traitement testé, du différentiel d'inflammation épidermique de cet épithélium. Selon cette variante du procédé, on détermine donc, avant traitement, le différentiel d'inflammation épidermique existant entre deux échantillons et on compare le résultat obtenu au différentiel d'activation de réponse immunitaire épidermique existant entre ces deux mêmes échantillons après traitement. Il est ainsi déterminé si le traitement testé a modifié ou non le différentiel existant en termes d'inflammation entre ces deux échantillons, par exemple en réduisant la différence de l'état d'inflammation entre les deux échantillons, c'est-à-dire en réduisant les différences de niveaux d'expression des microARNs de l'invention entre les deux échantillons, ou bien en augmentant le différentiel de répons immunitaire épidermique.
De manière préférée, Γ épithélium traité subi une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
Le traitement testé par ce procédé peut consister en n'importe quel traitement. De préférence, il s'agit de l'application topique d'une molécule, par enduction ou bien par injection, de préférence sous-cutanée. La molécule appliquée peut être une entité chimique simple ou la combinaison ou l'association de différentes entités, il peut s'agir de principes actifs, de molécules naturelles, de protéines, d'ARN, d'ADN, d'huile essentielle, d'entité chimique issue d'extraits naturels, d'une formulation complexe, d'une molécule d'ADN, d'un micro ARN, d'un siRNA, d'un inhibiteur de miRNA, notamment d'un antagomir, etc. .. Des molécules particulièrement préférées dans le cadre de traitement à tester selon l'invention, sont notamment les ARN, tout particulièrement des microARNs, ou des molécules modifiant l'expression de microARNs naturels, tels que des inhibiteurs de miRNA et notamment les antagomirs.
Il peut s'agir également de l'application d'un rayonnement électromagnétique, quelque soit la longueur d'onde, par exemple de longueur d'ondes visibles, UV, IR ou X. Le traitement au sens de la présente invention englobe également l'application de différents effets mécaniques.
Le procédé de l'invention est considéré comme efficace s'il engendre une modification du niveau d'expression d'au moins un des microARNs de l'invention au sein de l'épithélium sous étude. De préférence, ledit traitement est considéré comme efficace s'il engendre la modification du niveau d'expression d'au moins deux, de préférence d'au moins trois, de préférence d'au moins quatre, de préférence d'au moins cinq, de préférence d'au moins six, de préférence d'au moins sept, de préférence d'au moins moins 8, de préférence de la totalité desdits microARNs au sein de l'épithélium. Les modifications engendrées sur le niveau d'expression des microARNs de l'invention ne sont pas nécessairement d'amplitude identique pour tous les microARNs. De préférence, au sens de la présente invention, un traitement testé sera considéré comme efficace s'il engendre une modification du niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, concomitamment avec une modification du niveau d'expression dans le sens inverse à la précédente d'au moins un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR- 26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p.
Ainsi un traitement efficace au sens de l'invention engendrera par exemple une augmentation du niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR- 146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, et, simultanément, également la diminution du niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa- miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p.
II est également possible, par les méthodes de détermination de l'efficacité d'un traitement de la présente demande, d'objectiver l'action bénéfique d'un agent, notamment d'un produit cosmétique, par exemple d'une composition cosmétique, quant à son action sur l'état inflammatoire de la peau.
Les méthodes de détermination décrites plus haut in vitro peuvent en effet être utilisées dans un protocole de test permettant de déterminer les produits susceptibles d'être qualifiés d'agent ayant un effet sur l'état inflammatoire et d'activation de la réponse immunitaire innée des kératinocytes de la peau.
Par ailleurs, au moyen de ce test, il est possible de promouvoir le produit auprès de consommateurs, en mettant en avant les résultats obtenus avec ce produit dans les méthodes de détermination décrites dans la présente invention. L'évaluation de l'effet sur l'état de d'activation de la réponse immunitaire innée ou en état d'inflammation épidermique sera basée sur l'étude de l'expression des microARNs de l'invention.
La présente invention fournit donc également une méthode permettant de recommander un produit en signalant son effet dans un protocole de test constitué par une méthode de détermination telle que décrite précédemment.
L'invention a donc également pour objet une méthode pour la promotion d'un produit cosmétique consistant à faire état d'une efficacité, action ou propriété dudit produit démontrée par au moins un test opéré tel que décrit précédemment. Une telle promotion du produit pourra se faire par n'importe quel canal de communication. Elle pourra être faite notamment par la vendeuse, directement sur le point de vente, par la radio et la télévision, notamment dans le cadre de spots publicitaires. Elle pourra être faite également par le canal de la presse écrite, ou par le biais de tout autre document, en particulier à des fins publicitaires (prospectus). Elle pourra se faire également par Internet, ou par tout autre réseau informatique adéquat. Elle pourra être faite également directement sur le produit, notamment sur son packaging ou sur toute notice explicative qui peut lui être associée.
La présente invention, selon un troisième aspect, concerne également divers procédés de criblage de molécules pour leur action sur le processus d'activation de la réponse immunitaire innée et d'inflammation épidermique. De manière préférée l'invention concerne le criblage de molécules pour leur action sur le processus d'activation de la réponse immunitaire innée et d'inflammation épidermique en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
Notamment, l'invention concerne un procédé de criblage de modulateurs du processus de la réponse immunitaire innée et inflammatoire au sein d'un épithélium comprenant l'évaluation de l'état d'inflammation épidermique de kératinocytes au sein de cet épithélium, avant et après application du modulateur à cribler.
De tels procédés de criblage peuvent être mis en oeuvre in vivo, ou bien ex-vivo, ou encore in vitro, par exemple sur des épithéliums de culture ou des échantillons d'épithélium.
L'évaluation de l'état d'inflammation épidermique de kératinocytes au sein de cet épithélium est réalisée par une des méthodes selon le premier aspect de l'invention.
Comme précisé dans ce qui précède, l'épithélium auquel il est fait référence peut être un épithélium de culture, par exemple un épithélium reconstitué, type " peau reconstruite " ou bien un échantillon obtenu d'un être humain, par exemple lors d'une biopsie.
De manière préférée, l'épithélium auquel il est fait référence subi préalablement une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
Alternativement, l'invention concerne également un procédé de criblage de modulateurs du processus de la réponse immunitaire innée et inflammatoire au sein d'un épithélium, comprenant l'évaluation du différentiel d'inflammation épidermique de cet épithélium, avant et après application du modulateur à cribler.
L'évaluation du différentiel d'inflammation épidermique de kératinocytes au sein de cet épithélium est réalisée par une des méthodes selon le premier aspect de l'invention.
Le modulateur dont il est question peut être toute entité chimique, par exemple issue d'extraits naturels ou bien de synthèse, il peut s'agir d'une formulation complexe, d'une molécule d'ADN, d'un micro ARN, d'un siRNA ou d'un inhibiteur de miRNA tel qu'un antagomir par exemple. Cette liste n'est bien entendu pas exhaustive.
Alternativement, le modulateur peut être un système instrumental utilisant un rayonnement électromagnétique, de préférence un rayonnement d'ondes visibles, UV, IR ou X, ou bien un système utilisant des effets mécaniques.
Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne également un procédé de diagnostic de l'état d'un épidémie, grâce à l'utilisation de la signature microARN mise en évidence par les inventeurs. Un tel procédé de diagnostic comprend la détermination du différentiel d'inflammation épidermique existant au sein de cet épiderme entre la couche basale et la couche cornée, et la comparaison au différentiel d'inflammation épidermique moyen existant au sein d'un épiderme normal de même type, entre la couche basale et la couche cornée.
La détermination du différentiel d'inflammation épidermique est de préférence effectuée à l'aide des différentes méthodes selon le premier aspect de l'invention. Elle est de préférence effectuée sur un échantillon d' épiderme de la peau à diagnostiquer.
De manière préférée, l'inflammation épidermique existant éventuellemnt au sein de cet épiderme auquel il est fait référence est en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
Le différentiel d'inflammation épidermique moyen existant au sein d'un épiderme normal de même type, entre la couche basale et la couche cornée, correspond à une valeur moyenne de plusieurs mesures effectuée sur plusieurs épidémies provenant de sujets dont la peau est saine et de même type que celle de l'épidémie à diagnostiquer. Par même type, on entend âge comparable, ethnie et couleurs identiques. Il s'agit d'une valeur moyenne qui correspond à un état " normal " ou " sain ", exempt de toute pathologie ou lésion de l'épidémie.
Par ce procédé de diagnostic, il est ainsi établi le profil microARNs de la peau à diagnostiquer et par comparaison, il peut être diagnostiqué éventuellement un vieillissement prématuré, un photovieillissement ou des dommages causés par le rayonnement solaire, un vieillissement ou des dommages causés par le stress, l'acné, ou tout autre trouble physiologique ou pathologique.
Selon encore un autre aspect, la présente demande a aussi pour objet l'utilisation du dosage de l'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR- 886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR- 365, et hsa-miR-590-5p , dans des kératinocytes au sein d'un échantillon d'épithélium humain pour la détermination de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et d'inflammation épidermique desdits kératinocytes. De manière préférée, l'activation de la réponse immunitaire innée et d'inflammation épidermique existant éventuellement au sein de cet échantillon auquel il est fait référence est en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
En effet, les présents inventeurs ont montré que ce dosage donne accès à la signature microARN de l'inflammation et de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée épidermique. Selon une utilisation particulièrement préférée, il est réalisé le dosage d'au moins 2 microARNs distincts parmi les 9 microARNs de l'invention, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Par exemple, il peut être utilisé le dosage des 9 microARNs de l'invention pour la détermination de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée épidermique et de l'inflammation des kératinocytes sous étude.
Selon encore un autre aspect, la demande a pour objet diverses utilisations, cosmétiques et en thérapie, d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa- miR-590-5p et / ou d'au moins un modulateur de l'expression desdits microARNs. En effet, du fait de l'importance de ces microARNs dans le processus d'activation de la réponse immunitaire innée et d'inflammation épidermique de la peau, la modulation de leur niveau au sein de kératinocytes est susceptible d'influencer l'inflammation épidermique, par exemple de la ralentir ou au contraire de l'accélérer afin de ralentir ou d'accélérer le processus inflammatoire de manière préférée en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
La modulation du niveau des microARNs de l'invention au sein de kératinocytes est de manière toute préférentielle effectuée en introduisant l'un ou l'autre des microARNs de l'invention, afin d'en augmenter son niveau au sein des kératinocytes, notamment, l'utilisation de microARNs pour corriger des dysrégulations endogènes des microARNs.
La modulation peut également être réalisée par l'introduction d'un modulateur desdits microARNs, de préférence il s'agit de l'introduction d'au moins un inhibiteur de miRNA, par exemple d'un antagomir, ciblant l'un des microARNs de l'invention afin d'en diminuer son niveau au sein des kératinocytes. D'autres inhibiteurs de miRNA tout particulièrement envisagés dans le cadre de cette invention sont notamment les miRCURY LNATM microRNA Knockdown Probes (Exiqon) et les miScript miRNA inhibitors de Qiagen.
Selon une mise en oeuvre préférée, l'invention concerne un microARN choisi parmi les 9 microARNs de l'invention, ou bien un modulateur de ce microARN pour une utilisation thérapeutique pour traiter des pathologies cutanées associées à l'état inflammatoire épidermique, de manière préférée en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta.
De préférence, l'invention concerne un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR- 886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 ou un modulateurs de ce microARN entraînant une augmentation de leur expression ou un inhibiteur de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p ou un modulateurs d'un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression.
Des pathologies tout particulièrement considérées dans le cadre de cette invention sont la dermatite atopique, la dermatite seborréique, l'acné, les ichthyoses, le syndrome de Netherton, le pityriasis rubra pilaire, la kératose pilaire, la maladie de Darier, les kératodermies palmoplantaires, le psoriasis et les porokératoses. Des pathologies tout particulièrement considérées dans le cadre de cette invention sont les pathologies présentant un état inflammatoire associé à une affection microbienne, de préférence la dermatite atopique et la dermatite seborréique.
De préférence, l'invention concerne des compositions comprenant au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 et/ou au moins un modulateurs de ce microARN entraînant une augmentation de leur expression et/ou au moins un inhibiteur de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p et/ou au moins un modulateurs d'un microARN choisi parmi hsa-let- 7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression, pour les applications thérapeutiques visées plus haut.
De manière encore préférée, les compositions selon l'invention comprennent au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence 4 microARNs choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 et/ou au moins un modulateurs d'au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence 4 desdits microARNs entraînant une augmentation de leur expression et/ou au moins un inhibiteur de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence au moins 4, de préférence 5 microARNs choisis parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p et/ou au moins un modulateurs d'au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence au moins 4, de préférence 5 microARNs choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression, pour les applications thérapeutiques visées plus haut.
Concernant les applications thérapeutiques de l'invention, si l'effet thérapeutique souhaité consiste en la diminution de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire de la peau à traiter, selon une mise en oeuvre préférée, l'invention concerne des compositions comprenant au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, pour une utilisation en thérapie, de préférence pour traiter des pathologies cutanées associées à l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire de la peau, notamment pour traiter le psoriasis, la dermatite atopique, l'acné, les ichthyoses , le syndrome de Netherton, le pityriasis rubra pilaire, la kératose pilaire, la maladie de Darier, les kératodermies palmoplantaires et les porokératoses. De manière préférée les applications thérapeutiques de l'invention sont en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta. De manière particulièrement préférée l'utilisation selon l'invention est pour traiter la dermatite sebboreique.
L'invention concerne également des compositions comprenant en sus ou à la place du ou des microARNs hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, au moins un inhibiteur de miRNA, tel qu'un antagomir, ciblant un microARN choisi parmi hsa- let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p, pour une utilisation dans le traitement desdites pathologies. D'autres inhibiteurs de miRNA tout particulièrement envisagés dans le cadre de cette invention5 sont notamment les miRCURY LNA(TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) et les miScript miRNA inhibitors de Qiagen. Il peut être choisi au moins deux inhibiteurs de microARNs, de préférence 3, de préférence 4, de préférence 5 microARNs de la liste consistant en hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p.
Pour les situations nécessitant une diminution de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire de la peau à traiter, une composition ou produit pour l'application thérapeutique mentionnée, comprend donc :
- au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, ou l'ensemble des microARNs hsa-miR- 146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 ; et/ou
- un ou plusieurs modulateurs d'au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, ou de l'ensemble desdits microARNs hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR- 203 entraînant une augmentation de leur expression ; et / ou
- un ou plusieurs inhibiteurs de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, 4 ou l'ensemble des microARNs hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p ; et/ou
- un ou plusieurs modulateurs d'au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, 4, ou de l'ensemble desdits microARNs hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression.
Des inhibiteurs de miRNA tout particulièrement envisagés dans le cadre de cette invention sont notamment les antagomirs, les miRCURY LNA(TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) et les miScript miRNA inhibitors de Qiagen.
Si de manière préférée selon la présente invention il est recherché une diminution de la réponse immunitaire innée et de l'inflammation épidermique, dans certains cas il est intéressant, à l'inverse, d'augmenter l'activation de la réponse immunitaire innée et l'inflammation épisermique. En effet, cela permet d'augmenter les défenses innées de l'hôte (notamment via la production de peptides anti-microbiens), ce qui peut être le but recherché lorsque l'on cherche par exemple à lutter contre une attaque microbienne.
Ainsi, pour les situations nécessitant une augmentation de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire de la peau à traiter, une composition ou produit pour l'application thérapeutique ou cosmétique mentionnée, comprend donc :
- un ou plusieurs modulateurs d'au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, ou l'ensemble des microARNs hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 entraînant une diminution de leur expression ; et / ou
- un ou plusieurs inhibiteurs de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, ou de l'ensemble desdits microARNs entraînant une répression de leur expression ;
- au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, 4, ou l'ensemble des microARNs hsa-let-
7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p.
De préférence, les compositions selon l'invention pour une utilisation en thérapie sont formulées avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, pour une application topique ou par ingestion.
La présente invention vise également l'utilisation d'un microARN choisi parmi hsa- miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa- miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p, ou bien d'un modulateur desdits microARNs, ciblant l'un desdits microARNs, pour des applications cosmétiques sur une peau humaine non pathologique.
Les différentes utilisations mentionnées en thérapie ou en cosmétique, impliquent de préférence l'application topique, locale de microARNs ou de composition comprenant lesdits microARNs, ou des modulateurs desdits miRNAs, par exemple des antagomirs. Du fait de leur petite taille, les microARNs et leurs modulateurs sont en effet susceptibles de traverser la membrane des kératinocytes et de modifier le niveau desdits microARNs au sein des kératinocytes traités. Par ailleurs, du fait de leur nature physico-chimique, il est peu probable qu'ils atteignent les couches profondes de la peau, limitant donc leur action à l'épidémie. La stabilité des microARNs et de leurs modulateurs, notamment antagomirs, laisse penser que leur action est transitoire, et la présente invention vise donc des utilisations en thérapie ou en cosmétique impliquant des applications renouvelées sur la peau à traiter.
De ce fait, l'invention vise notamment une méthode de traitement de troubles liés à la l'activation de la réponse immunitaire innée et de l'inflammation épidermique dans des situations cosmétiques physiologiques, non pathologiques, de préférence en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta, comprenant l'application topique sur la peau d'un individu d'un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 ou un modulateurs de ce microARN entraînant une augmentation de leur expression ou un inhibiteur de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa- miR-590-5p ou un modulateurs d'un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression.
Selon une mise en oeuvre préférée de ladite méthode, le microARN est choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, afin diminuer l'état de la réponse immunitaire innée et l'état inflammatoire des kératinocytes de la peau traitée.
Il peut être choisi au moins deux microARNs, de préférence au moins 3, de préférence les 4 microARNs de la liste consistant en hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203.
Alternativement ou en plus, il peut être choisi au moins un, voire plusieurs modulateurs de miRNA ciblant un ou plusieurs microARNs choisis parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p, entraînant une répression de leur expression. Des inhibiteurs de miRNA tout particulièrement envisagés dans le cadre de cette invention sont notamment les antagomirs, les miRCURY LNA(TM) microRNA Knockdown Probes (Exiqon) et les miScript miRNA inhibitors de Qiagen.
Les troubles de l'inflammation épidermique dans des situations cosmétiques sont liés notamment à la dermatohéliose, à la cicatrisation, à la sécheresse cutanée des personnes âgées (xérose sénile), ou à des agressions chimiques, notamment par des agents exfoliants, desquamants, délipidants, ou des agressions mécaniques. Ces troubles ne sont pas pathologiques et leur traitement n'est pas à considérer comme un traitement thérapeutique, mais uniquement un traitement à visée cosmétique, le traitement de ces troubles ayant pour but essentiel d'améliorer l'apparence de la peau et le confort de la personne.
Les troubles liés à la dermatohéliose, ou 'photo-aging', s'entendent de modifications de la différenciation épidermique avec l'exposition chronique à la lumière solaire. La peau dite " photoâgée " est caractérisée notamment par l'aspect de cuir tanné, et la présence de rides plus prononcées, cette peau est également modifiée au niveau épidermique, avec une surexpression des kératines K6, Kl 6, Kl 7 et une diminution de la filaggrine et de la transglutaminase. Ces altérations ont été associées à la formation des rides. Les protéines SPRR impliquées dans la formation des couches cornées sont aussi altérées par les UV. Il est aussi connu que l'exposition aiguë au soleil entraîne des modifications épidermiques affectant la fonction barrière et l'homéostasie épidermique.
Les troubles liés à la cicatrisation s'entendent de modifications de la différenciation épidermique avec le processus de cicatrisation et de réparation. En effet, lors du processus de ré- épithélialisation survenant après une blessure, l'ensemble du répertoire d'expression des protéines épidermiques est modifié. La réparation complète se fait en trois phases, d'abord une phase de migration, puis une phase de prolifération et enfin une phase de différenciation. La phase de prolifération permet le recouvrement de la plaie, elle est donc suivie d'un processus de néo morphogénèse épidermique faisant intervenir les acteurs de la stratification et de la différenciation kératinocytaire, ce qui, dans une situation saine permet de reformer une couche cornée fonctionnelle. Les troubles liés à la sécheresse ou xérose sont principalement dus au fait qu'une peau sèche se caractérise essentiellement par une diminution du contenu lipidique de l'épidémie et une altération du stratum corneum. Les kératines 1 et 10 sont diminuées et les kératines K5 et K14 augmentées. Le niveau d'expression de la fïlaggrine est perturbé, de même que celui de l'involucrine.
De manière préférée, le trouble de l'inflammation épidermique dans des situations cosmétiques est en en liaison avec une infection ou colonisation excessive par champignon, de manière préférée une infection ou colonisation excessive par Malassezia, et plus particulièrement Malassezia restricta, et se caractérise par un état pelliculaire du scalp. La présente invention consiste notamment à traiter les désordres esthétiques des pellicules par l'application topique sur la peau d'un individu d'un microARN selon l'invention.
Par « colonisation excessive », dans le cadre d'une application cosmétique antipelliculaire on entend selon la présente invention des sujets pour lesquels Malassezia représente plus de 46 % de la microflore du scalp et moins de 83%, preférentiellemnt environ 74% (« Quantitative microbiology of the scalp in non- dandruff, dandruff, and seborrheic dermatitis », McGinley K. et al, The Journal of investigate dermatology, 64 :401-405, 1975).
Par « colonisation excessive », dans le cadre d'une application thérapeutique de dermatite sebboreique on entend selon la présente invention des sujets pour lesquels Malassezia représente plus de 83 %> de la microflore du scalp (« Quantitative microbiology of the scalp in non-dandruff, dandruff, and seborrheic dermatitis », McGinley K. et al, The Journal of investigate dermatology, 64 :401-405, 1975)
Les agressions chimiques, notamment par des agents exfoliants, desquamants, délipidants, et les agressions mécaniques sont responsables de modifications de l'homéostasie épidermique et induisent une altération de la fonction barrière assurée par le stratum corneum, et une inflammation épidermique.
Par l'application, de préférence topique, d'au moins l'un des microARNs de l'invention, et de préférence au moins 2, ou d'un inhibiteur spécifique de ces miRNAs, il est possible de traiter les différents troubles non pathologiques mentionnés ci-dessus, dans des applications cométiques.
La présente invention est donc également dirigée vers des compositions ou produits cosmétiques, comprenant au moins l'un des microARNs de l'invention ou bien comprenant au moins un modulateur de l'expression d'un des microARNs de l'invention. Ces compositions ou produits cosmétiques permettent de corriger ou améliorer l'aspect de la peau, son grain, son éclat, ses imperfections ou son microrelief, d'améliorer la tolérance cutanée, de diminuer la sensibilité et la réactivité de la peau.
Un modulateur de l'expression d'un des microARNs de l'invention est un actif entraînant l'augmentation ou la répression de l'expression d'un desdits microARNs.
Un tel actif modulateur de l'expression d'un des microARNs est par exemple identifié par les procédés de criblage décrits précédemment, ou il peut par exemple s'agir d'un antagomir d'un microARN de l'invention.
De préférence, les compositions ou produits cosmétiques selon l'invention comprennent au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa- miR-203 et/ou au moins un modulateurs de ce microARN entraînant une augmentation de leur expression et/ou au moins un inhibiteur de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p et/ou au moins un modulateurs d'un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression, pour les applications cosmétiques précitées.
De manière encore préférée, les compositions selon l'invention comprennent au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence 4 microARNs choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 et/ou au moins un modulateurs d'au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence 4 desdits microARNs entraînant une augmentation de leur expression et/ou au moins un inhibiteur de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence au moins 4, de préférence 5 microARNs choisis parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p et/ou au moins un modulateurs d'au moins deux, de préférence au moins 3, de préférence au moins 4, de préférence 5 microARNs choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression, pour les applications cosmétiques précitées.
Le produit ou composition cosmétique dont il est question peut être sous toute forme galénique, par exemple formulé sous forme de lait, de crème, de gel, de spray ou de savon, pour être administré par voie topique, ou bien sous forme ingérable pour la voie orale.
Il peut notamment s'agir d'une combinaison de différents actifs, par exemple une combinaison d'au moins deux microARNs de l'invention, ou d'un microARN de l'invention et d'un modulateur de microARN de l'invention, ou bien de deux modulateurs des microARNs de l'invention. Il peut également s'agir de la combinaison d'un actif et d'un instrument, notamment d'un instrument de type traitement mécanique, lumineux, électrique ou électromagnétique.
De manière préférée selon l'invention, les microARNs et/ou modulateurs des microARNs de l'invention sont utilisés pour réduire les effets secondaires de type inflammatoire ou aération de la fonction barrière de la peau d'actifs cosmétiques utilisés dans les compositions et produits cosmétiques tels que de coloration, défrisage, shampoing, lotion hydro-alcoolique.
Ainsi de telles compositions ou produits cosmétiques présentant des effets secondaires de type inflammatoire ou aération de la fonction barrière de la peau, telles que des compositions ou produits de coloration, défrisage, shampoing, ou encore lotion hydroalcoolique peuvent comprendre un ou plusieurs microARNs et/ou modulateurs des microARNs de l'invention. En particulier, ces compositions et produits cosmétiques pourront comprendre au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886- 3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 et/ou au moins un modulateurs de ce microARN entraînant une augmentation de leur expression et/ou au moins un inhibiteur de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa- miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p et/ou au moins un modulateurs d'un microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression.
Dans le cadre de la présente invention, il est notamment envisagé des produits cosmétiques pour réduire les imperfections de surface liées aux désordres de l'inflammation épidermique.
Il est également envisagé des produits cosmétiques spécifiques pour les peaux sensibles et/ou réactives, en restaurant une meilleure qualité, et ce en réduisant l'inflammation épidermique et la réponse immunitaire innée, grâce aux microARNs de l'invention ou à des modulateurs desdits microARNs.
Dans le cadre de la présente invention, il est notamment envisagé des produits cosmétiques pour réduire ou éliminer les désordres esthétiques des pellicules.
Des produits réparateurs pour améliorer le processus de réparation cutanée lors de la cicatrisation sont également envisagés dans le cadre de cette invention. Il est également possible de formuler des produits destinés à des peaux agressées, soit dans le cadre de procédures spécifiques (produits post-peelings, post-lasers,...), soit dans des situations quotidiennes, telles que par la pollution, les produits ménagers, etc..
Pour les situations nécessitant une diminution de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire de la peau à traiter, une composition ou produit pour l'application cosmétique mentionnée, comprend donc :
- au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, ou l'ensemble des microARNs hsa-miR- 146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203 ; et/ou
- un ou plusieurs modulateurs d'au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, ou de l'ensemble desdits microARNs entraînant une augmentation de leur expression ; et / ou - un ou plusieurs inhibiteurs de miRNA, tels que des antagomirs, ciblant au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, 4 ou l'ensemble des microARNs hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p ; et/ou
- un ou plusieurs modulateurs d'au moins un, et de préférence, au moins 2, 3, 4, ou de l'ensemble desdits microARNs hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p entraînant une répression de leur expression.
Des inhibiteurs de miRNA tout particulièrement envisagés dans le cadre de cette invention sont notamment les antagomirs, les miRCURY LNATM microRNA Knockdown Probes (Exiqon) et les miScript miRNA inhibitors de Qiagen.
La présente invention a aussi pour objet un kit pour la détermination de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire d'un kératinocyte humain, comprenant un moyen pour le dosage de l'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p et la mention d'un niveau de référence pour l'expression dudit ou desdits microARN. Un kit particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention est un kit tel que le niveau de référence est le niveau d'expression moyen dudit ou desdits microARN dans des kératinocytes en culture non stimulé.
Les différentes mises en oeuvre préférées décrites plus spécifiquement pour l'un ou l'autre des aspects de l'invention, sont également applicables aux autres aspects de l'invention. Notamment, il est toujours préféré, selon les méthodes, procédés, kits, compositions et utilisations de l'invention de déterminer le niveau d'expression d'au moins deux microARNs choisis parmi la liste des 9 microARNs de l'invention, de préférence au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou bien même les 9 microARNs de l'invention, à savoir hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Niveau d'expression de miRNAs dans kératinocytes traités ou non avec des ligands spécifiques de différents récepteurs TLR (TLR2- Zymosan, TLR3- PolyI :C, TLR5-^Flagellin) pendant 6 ou 24h dans des conditions de bas ou hau calcium
Figure 2 : Niveau d'expression de ARNm de gènes liés à la réponse inflammatoire (IL-8, CCL20, TNFa et HBD2) dans des kératinocytes surexprimant un miRNA contrôle (pre-) ou le miR146 (pre 146a), traités pendant 6h ou 24h avec un milieu contrôle (med) ou du zymosan (Zym). Les unités en Ordonnées sont des Arbitrary Units (AU).
EXEMPLES :
MATERIEL ET METHODES
Culture de kératinocytes humains en monocouche
Les kératinocytes épidermiques humains normaux sont issus de plastie mammaire et sont cultivés classiquement selon la méthode de Rheinwald et Green, sur une couche nourricière de fîbroblastes Swiss 3T3 préalablement mitomycinés.
Peaux reconstruites
Des peaux reconstruites in vitro comprenant un épiderme stratifié et différencié avec des couches 25 cornées et un derme équivalent vivant, sont réalisées avec des kératinocytes humains normaux et des fîbroblastes humains normaux de derme.
Brièvement, des dermes équivalents sont réalisés avec du collagène I bovin et un million de fîbroblastes humains de derme. Les kératinocytes normaux sont ensemencés après contraction des lattices à raison de 500000 kératinocytes et cultivés dans le milieu classique pendant 7 jours. La culture est ensuite montée sur grille pour la phase d'émersion (interface air-liquide, 7 jours).
A la fin de cette période, les peaux présentent une morphologie très proche de la peau humaine normale. Elles peuvent être alors utilisées pour différentes expériences en maintenant le milieu de culture sous la peau qui est nourrie par capillarité.
Extraction des ARN totaux des kératinocytes Lyse cellulaire :
Les kératinocytes en culture monocouche sont lysés sur boite de culture dans le tampon Tri Reagent. Les épidermes reconstruits des peaux reconstruites sont séparés du derme équivalent à l'aide de pinces. Ces épidermes sont broyés manuellement dans des potters en verre, en tampon de lyse Tri Reagent.
Extraction des ARN totaux
Les ARN totaux sont extraits par la technique classique de lyse en solution de guanidium isothiocyanate puis extraction grâce à un mélange phénol/chloroforme.
Hybridation des microARN sur les puces uParaflo(TM) " MiRHuman 10.0 ".
Les petits ARN sont extraits des ARN totaux (filtre Microcon, Millipore) et sont étendus en 3' avec une queue polyA. Un oligonucléotide marqué en fluorescence est ligué à la queue polyA. Les petits ARN marqués sont ensuite hybridés sur les puces [mu][Rho]3[Gamma]8[iota][Iota][omicron](TM) " MiRHuman 10.0 " (Atactic
Technologies, LC Sciences). Elles contiennent les séquences complémentaires de tous les microARN humains répertoriés dans miRBase 10.0 (71 1 microARN matures). Les séquences ont été déposées 5 fois sur la puce. La fluorescence est quantifiée et les signaux sont normalisés. Le taux de fluorescence reflète le taux d'expression de chaque microARN dans l'échantillon.
Analyse statistique L'expression de chaque microARN est comparée statistiquement entre l'échantillon " kératinocytes en culture " et l'échantillon " kératinocyte en épiderme reconstruit " en utilisant le test t de student (p<0.05).
EXEMPLE 1 : Niveau d'expression de miRNA dans des kératinocytes traités ou non avec des ligands spécifiques de différents récepteurs TLR
Les niveau d'expression de miRNA dans des kératinocytes traités ou non avec des ligands spécifiques de différents récepteurs TLR (TLR2- Zymosan, TLR3- PolyI :C, TLR5-^Flagellin) pendant 6 ou 24h ont été mesurée par puce.
Sur les 754 miRNA analysés, c'est-à-dire l'ensemble de miRNA humain présents sur un array complet désigné à cet effet, 9 ont été signifïcativement sur- ou sous- exprimés dans des kératinocytes stimulés avec des ligans de récepteurs TLR. : hsa-miR-146, hsa- miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p.
Les valeurs obtenues de Γ array ont été normalisées en comparaison à un ARN « housekiping » U6, U44 et U48 et ont été retenu les miRNA pour lesquels une différence d'expression > 1,8 a été observée.
Les niveau d'expression de miRNA dans des kératinocytes traités ou non avec des ligands spécifiques de différents récepteurs TLR (TLR2- Zymosan, TLR3- PolyI :C, TLR5-^Flagellin) pendant 6 ou 24h dans des conditions de bas ou haut calcium ont été confirmés par PCR (Figure 1)
EXEMPLE 2 : Effet de miR146 sur la réponse inflammatoire
Les niveau d'expression de ARNm des marqueur de réponse immunitaire IL-8, CCL20, TNFa et HBD2 ont été quantifiés par qPCR dans des kératinocytes surexprimant un miRNA contrôle (pre-) ou le miR146 (prel46a), traités pendant 6h ou 24h avec un milieu contrôle (med) ou du zymosan (Zym). On observe sur la figure 2 que l'induction des gènes liés à la réponse inflammatoire induite par le zymosan est inhibée par la surexpression de miR146.
Les unités en ordonnées sont des unités arbitraires, comme pour la figure 1. EXEMPLE 3 : Méthodes de détection des miRNAs.
Northern Blot :
Cette technique classique est qualitative et quantitative. Elle permet l'analyse de quelques miRNAs lors d'une expérimentation. Cette méthode requiert l'utilisation de 5 à 50 μ§ d'ARN total.
RT Q-PCR :
Cette méthode permet l'étude des précurseurs de miRNAs et a été adaptée pour l'étude des miRNAs matures. Celle-ci est commercialisée (Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Assays) et est décrite dans plusieurs articles. miRNA Microarray
Cette méthode, comme celle des microarrays pour ARNm classiques, est basée sur le marquage fluorescent des ADNc complémentaires des miRNAs d'un échantillon, et l'hybridation des ces ANDc marqués sur une lame sur laquelle sont déposées au préalable des séquences de miRNAs connus.
D'après certains auteurs, cette technologie miRNA microarray, si elle intègre régulièrement les nouvelles séquences de miRNAs issues de miRBase, serait la méthode de choix pour l'analyse de profil global d'expression de miRNAs.
De plus, dans certaines situations comme la présente invention, le profil d'expression des miRNAs est plus informatif que le profil d'expression des ARN messagers.
Hybridation in situ des microARNs
Cette technique est plus délicate que l'hybridation in situ classique des ARNm, car par la méthode de fixation classique, les petits ARNs diffusent plus que les longs ARNs et sont perdus lors d'étapes d'hybridation et de lavage. Des techniques ont été mises au point pour pallier à cet inconvénient ; de plus, des sondes miRNAs sont disponibles dans le commerce (Exiqon, Denmark). MiRNA transgène rapporteur
Dans cette technique, un gène reporteur GFP ou LacZ est placé sous le contrôle d'un promoteur incluant la partie 3'UTR complémentaire d'un miRNA.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détermination de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire sur un kératinocyte humain au sein d'un échantillon d'épithélium humain, comprenant la détermination du niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p au sein dudit kératinocyte et la comparaison du niveau d'expression du ou des microARN choisis au niveau d'expression moyen du ou des microARN choisis dans des kératinocytes non stimulés, de préférence provenant de la même souche ou de la même population.
2. Méthode selon la revendication 1, où ledit kératinocyte est considéré comme ayant une réponse immunitaire innée activée et un état inflammatoire si le niveau d'expression d'au moins l'un des microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, et hsa- miR-203, est statistiquement supérieur au niveau d'expression moyen dudit microARN dans des kératinocytes en culture non stimulés.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, où ledit kératinocyte est considéré comme ayant une réponse immunitaire innée activée et un état inflammatoire si le niveau d'expression de hsa-miR-146 est statistiquement supérieur au niveau d'expression moyen dudit microARN dans des kératinocytes en culture non stimulés.
4. Méthode selon la revendication 1, où ledit kératinocyte est considéré comme ayant une réponse immunitaire innée activée et un état inflammatoire si le niveau d'expression d'au moins l'un des microARN choisi parmi hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p est statistiquement inférieur au niveau d'expression moyen dudit microARN dans des kératinocytes en culture non stimulés.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 où l'on détermine et compare le niveau d'expression d'au moins un des microARNs choisi parmi hsa-miR-886-3p, hsa-miR-590-5p, et hsa-miR-221.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 où l'on détermine et compare le niveau d'expression de hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-
203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p au sein dudit kératinocyte.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, où ledit échantillon provient d'une peau humaine ou d'un épithélium de culture type " peau reconstruite ".
8. Procédé de détermination de l'efficacité d'un traitement d'un épithélium, comprenant la comparaison, avant et après traitement, du niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR- 221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p au sein de kératinocytes de cet épithélium.
9. Procédé selon la revendication 8, où ledit microARN est hsa-miR-146.
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, où ledit traitement consiste en l'application topique ou par injection d'une molécule, en l'application d'un rayonnement ou bien en l'application d'effets mécaniques.
11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, où ledit traitement est considéré comme efficace s'il engendre une modification du niveau d'expression d'au moins un, de préférence d'au moins deux desdits microARNs au sein de l'épithélium.
12. Procédé de criblage de modulateurs du processus de la réponse immunitaire innée et inflammatoire au sein d'un épithélium, comprenant l'évaluation de l'état d'inflammation de kératinocytes au sein de cet épithélium par une méthode selon l'une des revendications 1 à 7, avant et après application du modulateur à cribler.
13. Procédé selon la revendication 12, où ledit modulateur est une entité chimique, issue d'extraits naturels, une formulation complexe, une molécule d'ADN, un microARN, un siRNA, un inhibiteur de microARN, un antagomir ou un système instrumental utilisant un rayonnement, de préférence un rayonnement d'ondes visibles, UV, IR ou X.
14. Procédé selon l'une des revendications 12 à 13, où un modulateur est identifié s'il engendre une modification du niveau d'expression d'au moins un, de préférence au moins deux, de préférence d'au moins trois desdits microARNs au sein de l'épithélium.
15. Procédé de diagnostic de l'état d'un épiderme, comprenant : la détermination du différentiel d'activation de la réponse immunitaire innée et d'inflammation épidermique existant au sein de cet épiderme entre la couche basale et la couche cornée, et sa comparaison au différentiel d'activation de la réponse immunitaire innée et d'inflammation épidermique moyen existant au sein d'un épiderme normal de même type, entre la couche basale et la couche cornée.
16. Utilisation du dosage de l'expression d'au moins un microARN choisi parmi hsa-miR- 146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p, dans des kératinocytes au sein d'un échantillon d'épithéhum humain pour la détermination de l'état d'activation de la réponse immunitaire innée et inflammatoire desdits kératinocytes.
17. MicroARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p, ou modulateur de l'un de ces microARNs, pour une utilisation thérapeutique pour traiter des pathologies cutanées associées au programme de différenciation épidermique telles que la dermatite atopique, la dermatite seborréique, l'acné, les ichthyoses , le syndrome de Netherton, le pityriasis rubra pilaire, la kératose pilaire, la maladie de Darier, les kératodermies palmoplantaires, le psoriasis et les porokératoses.
18. Utilisation d'un microARN choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p, ou d'un modulateur de l'un de ces microARNs, pour des applications cosmétiques sur une peau humaine non pathologique.
19. Méthode de traitement de troubles liés à l'inflammation et l'activation de la réponse immunitaire innée épidermique dans des situations cosmétiques non pathologiques, comprenant l'application topique sur la peau d'un individu d'un microARN choisi hsa-miR- 146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa- miR-365, et hsa-miR-590-5p, ou bien d'un modulateur de l'un de ces microARNs.
20. Méthode selon la revendication 19, où lesdits troubles liés à l'inflammation et l'activation de la réponse immunitaire innée épidermique dans des situations cosmétiques sont liés à des états physiologiques, comprenant la dermatohéliose, la cicatrisation, la sécheresse cutanée ou xérose, ou les agressions chimiques, notamment par des agents exfoliants, desquamants, délipidants, ou les agressions mécaniques.
21. Kit pour la détermination de l'état d'inflammation et d'activation de la réponse immunitaire innée épidermique d'un kératinocyte humain, comprenant un moyen pour le dosage de l'expression d'au moins un microAR choisi parmi hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa-miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR- 590-5p, et la mention d'un niveau de référence pour l'expression dudit ou desdits microARN.
22. Set de microARNs consistant en hsa-miR-146, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-155, hsa- miR-203, hsa-let-7, hsa-miR-221, hsa-miR-26b, hsa-miR-365, et hsa-miR-590-5p pour la détermination de l'état d'inflammation et d'activation de la réponse immunitaire innée épidermique d'un kératinocyte humain.
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